CN116348485A - 提供用于过继性细胞疗法的靶向共刺激的受体 - Google Patents

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罗伯特·霍金斯
鲁本·罗德里格斯
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Abstract

本发明涉及一种可用于过继性细胞疗法(ACT)的嵌合共刺激抗原受体(CoStAR)以及包括所述CoStAR的细胞。所述CoStAR可以起到增强对限定抗原的应答的细胞活性调节剂的作用。本发明还提供了CoStAR蛋白、编码所述CoStAR的核酸和其治疗用途。

Description

提供用于过继性细胞疗法的靶向共刺激的受体
相关申请和援引加入
本申请要求于2020年7月17日提交的美国专利申请序列号63/053,494号的优先权权益，所述美国专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。
参考了于2019年1月22日提交的GB专利申请序列号1900858.0、于2019年12月20日提交的美国专利申请序列号62/951,770、于2020年1月20日提交的国际申请PCT/GB2020/050120和于2020年7月17日提交的美国临时专利申请63/053,498。
前述申请以及其中引用或在其诉讼期间引用的所有文件(“申请引用文件”)和在申请引用文件中引用或参考的所有文件以及本文引用或参考的所有文件(“本文引用文件”)、本文引用文件中引用或参考的所有文件连同任何制造商的说明书、描述、产品规格、本文或通过引用并入本文的任何文件中提到的任何产物的产物表在此通过引用并入本文，并且可以用于本发明的实践中。更具体地，所有引用的文件通过引用并入，其程度如同每个单独的文件专门地且单独地指示为通过引用并入。
技术领域
本发明涉及一种可用于过继性细胞疗法(ACT)的嵌合共刺激抗原受体(CoStAR)以及包括所述CoStAR的细胞。所述CoStAR可以起到增强对限定抗原的应答的细胞活性调节剂的作用。本发明还提供了CoStAR蛋白、编码所述CoStAR的核酸和其治疗用途。
背景技术
使用自体T细胞来介导癌症消退的过继性细胞疗法(ACT)在早期临床试验中显示出很大前景。已经采用了几种常用方法，如使用离体扩增的天然存在的肿瘤反应性淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。另外，T细胞可以被基因修饰为将其再靶向到限定肿瘤抗原。这可以通过肽(p)-主要组织相容性复合体(MHC)特异性T细胞受体(TCR)或肿瘤特异性单链抗体片段(scFv)与T细胞信号传导结构域(例如，CD3ζ)之间的合成融合物的基因转移来完成，后者被称为嵌合抗原受体(CAR)。
TIL和TCR转移被证明在靶向黑色素瘤时特别好(Rosenberg等人2011；Morgan2006)，而CAR疗法在治疗某些B细胞恶性肿瘤方面显示出很大前景(Grupp等人2013)。
共刺激信号可用于实现强大的CAR T细胞扩增、功能、持久性和抗肿瘤活性。CAR疗法在白血病中的成功部分地归因于共刺激结构域(例如CD28或CD137)并入到CAR构建体中，来自所述CAR构建体的信号与由CD3ζ提供的信号协同作用以增强抗肿瘤活性。此观察的基础涉及T细胞激活的经典信号1/信号2范式。此处由TCR复合体提供的信号1与由如CD28、CD137或CD134等共刺激受体提供的信号2协同作用以允许细胞在没有与单独的信号1相关的激活诱导的细胞死亡(AICD)的情况下进行克隆扩增、IL-2产生和长期存活。此外，信号2的参与增强了通过信号1生成的信号，从而允许细胞对低亲合力相互作用，如在抗肿瘤应答期间遇到的那些相互作用更好地做出应答。
靶向的共刺激对非基于CAR的T细胞疗法将具有有益影响。例如，将共刺激结构域掺入到嵌合TCR中已显示出增强T细胞对pMHC(Govers公司(Govers)2014)的应答。虽然肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)利用其内源性TCR来介导肿瘤识别，但其尚不可能对内源性TCR进行工程化。因此，TIL由于肿瘤细胞表达非常少的共刺激配体而受到显著限制。诱导TIL或实际上任何其它过继性T细胞疗法产物的靶向共刺激的能力将是有益的。
本申请中对任何文件的引用或鉴定并非承认这些文件可用作本发明的现有技术。
发明内容
本发明提供了新型嵌合共刺激抗原受体(CoStAR)和包括或表达所述CoStAR的细胞，这些对于基于CAR和非基于CAR的T细胞疗法等均是有益的。本发明使用表达新型嵌合共刺激受体的细胞以在与限定疾病相关，例如肿瘤相关抗原接合时向T细胞提供共刺激信号。
已有几个使用分割信号1和信号2以驱动经工程化的T细胞中的抗原特异性应答的报告(Alvarez-Vallina&Hawkins 1996)。然而，没有人利用全长CD28分子。与截短形式相反，使用如CD28等全长受体具有特定优点。全长受体能够二聚化，使受体能够以其天然形式起作用，实际上嵌合抗原受体未能在以单体形式表达时最佳地起作用(Bridgeman等人2010)。
在一实施例中，本发明的CoStAR在与如疾病相关抗原或肿瘤相关抗原等限定抗原接合时诱导信号2。全长CD28分子含有对于其在结合B7受体家族的成员方面的天然功能至关重要的基序；尽管从串联携带CD28受体和CD3ζ受体的CAR的角度来看，这是潜在危险的，其中CAR通过B7的连接可以触发T细胞激活，但对于携带单独的信号2受体的受体是有益的。一方面，本发明提供了一种靶向嵌合共刺激受体(CoStAR)，其包括：与跨膜结构域操作性地连接的胞外抗原结合结构域、第一信号传导结构域和CD40信号传导结构域或其信号传导片段。发明人已发现包括CD40信号传导结构域的共刺激受体显示出新颖且经改进的活性谱。
在本发明的某些实施例中，所述CD40信号传导结构域包括SEQID NO:23、SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25。在某些实施例中，所述CD40信号传导片段包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：SH3基序(KPTNKAPH(SEQ ID NO:26)、PTNKAPHP(SEQ ID NO:118)或PTNKAPH(SEQ ID NO:119)、TRAF2基序(PKQE(SEQ ID NO:27)、PKQET(SEQ ID NO:120)、PVQE(SEQ ID NO:28)、PVQET(SEQ ID NO:121)、SVQE(SEQ ID NO:29)、SVQET(SEQ ID NO:122))、TRAF6基序(QEPQEINFP(SEQ ID NO:30)或QEPQEINFP(SEQ ID NO:123))、PKA基序(KKPTNKA(SEQ ID NO:31)、SRISVQE(SEQ ID NO:32)或其组合，或者为全长CD40胞内结构域。在某些实施例中，所述CD40信号传导结构域的所述SH3基序、所述TRAF2基序、所述TRAF6基序或所述PKA基序中的一者或多者发生突变。在某些实施例中，所述CD40信号传导结构域的所述SH3基序、所述TRAF2基序、所述TRAF6基序或所述PKA基序中的一者或多者以多个拷贝存在。
在某些实施例中，所述CoStAR的所述第一信号传导结构域包括受体的信号传导结构域或信号传导片段，例如肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)受体，包含但不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6。在某些实施例中，所述CoStAR包括CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6。在其中所述第一信号传导结构域包括CD40信号传导结构域的实施例中，由此所述CoStAR包括两个CD40信号传导结构域的元件。
在某些实施例中，所述CoStAR包括受体的第二信号传导结构域或信号传导片段，例如肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)受体，包含但不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6。所述第一信号传导结构域或信号传导片段、所述CD40信号传导结构域或信号传导片段和所述第二信号传导结构域或信号传导片段可以呈任何次序。示例性实施例包含但不限于包括CD28、CD137和CD40信号传导结构域、CD28、CD134和CD40信号传导结构域、CD28、CD2和CD40信号传导结构域、CD28、GITR和CD40信号传导结构域、CD28、CD29和CD40信号传导结构域或CD28、CD150和CD40信号传导结构域的CoStAR。
在某些实施例中，本发明的CoStAR被工程化为不提供信号1。因此，在某些实施例中，本发明的CoStAR不包括信号1信号传导结构域。在某些实施例中，本发明的CoStAR不包括CD3ζ信号传导结构域。
在某些实施例中，本发明的CoStAR被工程化为在细胞中提供能够在抗原结合时提供信号1(例如，T细胞受体在抗原接合时提供信号1)的信号2。在某些实施例中，本发明的CoStAR被工程化为在细胞中响应于当抗原位于靶细胞的表面上时通过所述CoStAR进行的抗原特异性结合而提供信号2。在某些实施例中，本发明的CoStAR被工程化为在细胞中响应于在抗原是可溶性的并且不附着到靶细胞的表面时通过所述CoStAR进行的抗原特异性结合而不提供信号2。
在某些实施例中，本发明的CoStAR的所述胞外结合结构域通过接头和/或间隔子与所述跨膜结构域操作性地连接。在某些实施例中，所述接头包括约5个至约20个氨基酸。在某些实施例中，所述接头包括AAAGSGGSG(SEQ ID NO:8)。
在某些实施例中，本发明的CoStAR包括将所述胞外结合结构域与所述跨膜结构域操作性地连接并且包括约10个至约250个氨基酸的间隔子。在某些实施例中，所述间隔子包括CD8或CD28的胞外序列或其片段。在某些实施例中，所述CoStAR包括第二胞外结合结构域。在某些实施例中，所述第二结合结构域包括来自CD8或CD28的胞外配体结合结构域。在某些实施例中，所述间隔子包括一个或多个免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白恒定区。在某些实施例中，所述间隔子包括SEQ ID NO:13的一个或多个免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白恒定区。
在某些实施例中，本发明的CoStAR的跨膜结构域包括TNFRSF蛋白的跨膜结构域。在某些实施例中，本发明的CoStAR的跨膜结构域包括CD28或CD8的跨膜结构域。在某些实施例中，本发明的CoStAR的跨膜结构域包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的跨膜序列。
本发明的所述CoStAR可用于刺激针对选定靶标的免疫，即免疫应答。在某些实施例中，本发明的CoStAR包括与肿瘤相关抗原结合的胞外结合结构域。在某些实施例中，本发明的CoStAR包括与肿瘤微环境相关抗原结合的胞外结合结构域。在某些实施例中，所述CoStAR包括两个或更多个胞外结合结构域。在某些实施例中，所述胞外结合结构域与CD70、CD146、FOLR1、癌胚抗原(CEA)、5T4、黑素转铁蛋白(CD228)、Her2、EGFR、GPC3、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP/CSPG4)、CD71、EPCAM、SM5-1、叶酸受体或CA125、PDL-1、CD155PD-1、间皮素、或肿瘤特异性肽(p)-主要组织相容性(MHC)复合体、或肿瘤特异性pMHC复合体抗原特异性单链T细胞受体(scTCR)、或转铁蛋白或抗体或抗原结合蛋白结合。
在其中所述结合结构域与PDL1结合的某些实施例中，所述CoStAR包括SEQ ID NO:6。在其中所述胞外结合结构域与CEA结合的某些实施例中，所述CoStAR包括SEQ ID NO:5。在其中所述胞外结合结构域与FOLR1结合的某些实施例中，所述CoStAR包括SEQ ID NO:4。在其中所述结合结构域与CD155、CD112或CD113结合的某些实施例中，所述CoStAR包括SEQID NO:7。
根据本发明，胞外结合结构域可以包括但不限于scFv、肽、抗体的抗原结合部分、抗体重链、靶受体的配体或受体的配体结合部分。
在某些实施例中，本发明的CoStAR包括例如位于C末端处的CD3ζ信号传导结构域。
在某些实施例中，本发明的CoStAR包括N末端信号肽。
在本发明的一方面，提供了一种核酸，其编码本发明的CoStAR。所述核酸可以进行优化，例如可以针对在宿主细胞中的表达而进行密码子优化。在一非限制性实施例中，所述核酸针对在人细胞中的表达而进行密码子优化。
在本发明的一方面，提供了载体，其编码且能够表达本发明的CoStAR。
在本发明的一方面，提供了一种细胞，其表达本发明的CoStAR。在某些实施例中，所述细胞表达与FOLR1结合的CoStAR。在其它实施例中，所述细胞表达与CA125结合的CoStAR。
一方面，本发明提供了一种细胞，其表达对FOLR1具有特异性的CoStAR，其中所述细胞在所述CoStAR与FOLR1在靶细胞的表面上反应或结合时被激活，但在所述CoStAR与可溶性FOLR1结合或反应时不被激活。在一实施例中，所述细胞为T细胞或表达T细胞受体或对由所述靶细胞表达的肿瘤相关抗原具有特异性的其它受体的TIL。
在其它实施例中，所述细胞表达对PDL1具有特异的CoStAR。在其它实施例中，所述细胞表达对CEA具有特异的CoStAR。在某些实施例中，所述细胞表达本发明的两个或更多个CoStAR。在一特定实施例中，所述细胞表达与FOLR1结合的CoStAR和与CA125结合的CoStAR，如但不限于抗FOLR1.CD28.CD40和抗CA125.41BB.CD40。在一特定实施例中，所述细胞表达与FOLR1结合的CoStAR和与PDL1结合的CoStAR，如但不限于抗FOLR1.CD28.CD40和PD1.CD28.CD40。
在某些实施例中，被工程化为表达本发明的CoStAR的细胞包括α-βT细胞、γ-δT细胞、T调节细胞、TIL、NKT细胞或NK细胞。在某些实施例中，被工程化为表达本发明的CoStAR的细胞共表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
一方面，本发明提供了一种制备表达CoStAR的细胞的方法，所述方法包括用编码并且能够表达本发明的CoStAR的载体转导或转染细胞。
本发明提供了一种用于通过转导或转染细胞、检测CoStAR的表达并且富集、扩增和/或选择表达所述CoStAR的细胞来制备表达本发明的所述CoStAR的细胞的群体的方法。
一方面，本发明提供了一种通过施用表达本发明的CoStAR的细胞的群体来治疗受试者的疾病的方法。
一方面，本发明提供了一种制备TIL的方法，所述方法包括对所切除的肿瘤进行解聚以获得精细化的所切除的肿瘤产物，通过在包括IL-2的细胞培养基中培养所述精细化的所切除的肿瘤产物来进行第一扩增以产生第一TIL群体，通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)培养所述第一TIL群体来进行第二扩增以产生第二TIL群体；以及收获和/或低温保存所述第二TIL群体，其中所述方法包括转染或转导所述TIL以表达本发明的CoStAR。在一实施例中，所述肿瘤包括卵巢肿瘤。在一实施例中，所述肿瘤包括肾肿瘤。在一实施例中，所述肿瘤包括肺肿瘤。
因此，本发明的目标不在于在本发明内涵盖任何先前已知的产物、制备所述产物的过程或使用所述产物的方法，使得申请人保留任何先前已知的产物、过程或方法的权利并且由此公开对所述产物、过程和方法的免责声明。进一步注意到，本发明无意在本发明的范围内涵盖任何产物、过程或所述产物的制备或使用所述产物的方法，这不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面描述和实现需求，使得申请人保留任何先前描述的产物、制备所述产物的过程或使用所述产物的方法的权利并且由此公开任何先前描述的产物、制备所述产物的过程或使用所述产物的方法的免责声明。在本发明的实践中可能有利的是遵从第53(c)条EPC以及规则28(b)和(c)EPC。明确否认申请人在本申请的谱系或任何其它谱系中或在任何第三方的任何先前提交的申请中授予的任何专利所针对的任何实施例的所有权利明确保留。本文中的任何内容均不应被解释为保证。
应当注意，在本公开中并且特别在权利要求书和/或段落中，如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”等术语可以具有在美国专利法中赋予其的含义；例如，其可以意指“包含(includes)”、“包含(included)”、“包含(including)”等；并且如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由...组成(consists essentially of)”等术语具有在美国专利法中赋予其的含义，例如，其允许没有明确引用的要素，但排除现有技术中存在的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
这些和其它实施例从以下详细描述中公开或显而易见，并且由以下详细描述涵盖。
附图说明
以下通过举例给出但不旨在将本发明仅限制于所描述的特定实施例的详细描述可以结合附图最好地进行理解。
图1-单一共刺激和融合共刺激结构域受体的结构组织。示出了权利要求中阐述的CoStAR受体的示意图。首先是基于单一共刺激受体的CoStAR，并且其次是由与第二共刺激结构域融合的全长共刺激受体信号传导结构域组成的融合物CoStAR。
图2-潜在CoStAR构型的基因组组织-CoStAR由如图中所示和权利要求书中所述的抗原结合结构域、任选间隔子结构域和共刺激结构域组成。CoStAR可以如下表达：A)由具有由单个(Ai)或融合物(Aii)共刺激受体组成的CoStAR的启动子单独表达；B)可以与位于N末端或C末端处的表位标签(例如，His标签、DYKDDDDK(SEQ ID NO:14)等)一起表达以实现CoStAR的直接染色；C)与使用2A切割序列或内部核糖体进入位点(IRES)分离的标志基因一起进行表达；D)与由第二启动子表达的标志基因一起进行表达；E)与所关注的蛋白质，如使用2A切割序列或内部核糖体进入位点(IRES)分离的嵌合抗原受体或T细胞受体一起进行表达；F)与由第二启动子表达的所关注的蛋白质，如嵌合抗原受体或T细胞受体一起进行表达。对于具有足够知识的个体来说将清楚的是CoStAR和标志基因/嵌合抗原受体/T细胞受体/其它所关注的蛋白质的个体可以在任一朝向或彼此的3'(3-prime)或5'(5-prime)中进行表达。
图3-CoStAR在T细胞中响应于LS174T和LoVo肿瘤呈递抗原的功能活性。来自供体1(A&D)、供体2(B)和供体3(C&E)的正常供体T细胞群体被慢病毒工程化为表达靶向癌胚抗原的CoStAR并且使用CD34磁选择被磁分选为针对转基因进行富集。将T细胞与野生型未工经程化的CEA+肿瘤细胞(非活化肿瘤)或被工程化为以所指示的效应子对靶比率表达细胞表面锚固的抗CD3单链抗体片段的CEA+肿瘤细胞(活化肿瘤)混合，并且通过ELISA测量上清液中的IL-2。数据是使用LS174T细胞(A、B&C)和LoVo(D&E)获得的。
图4-CoStAR对T细胞增殖的影响。将5x105个经转导的和未经转导的T细胞与6.25x103个野生型LoVo或LoVo-OKT3细胞在存在(A)或不存在(B)IL-2的情况下混合，并且三天后进行细胞计数。在以相同细胞比率进行的另一测定中，向来自两个供体的T细胞装载增殖染料，并且在六天后使用流式细胞术通过染料稀释确定细胞已经历的增殖周期的数量。
图5-CoStAR融合物受体在原代人T细胞中的IL-2活性。对来自七个供体(除对照CoStAR为三个供体之外)的正常供体CD8+T细胞用所指示的靶向CEA的CoStAR进行慢病毒转导，并且在过夜刺激后在存在LoVo-OKT3细胞的情况下评估IL-2产生。使用胞内流染色确定CD34阴性(CoStAR未转导的)群体和CD34+(CoStAR转导的)群体两者中IL-2阳性细胞的比例。星号显示了使用配对威尔科克森符号秩测试(paired Wilcoxon signed rank test)经转导的群体与未经转导的群体之间的显著差异，其中*p<0.05
图6A-6D-原代人T细胞中的CoStAR活性的多参数分析。对正常供体CD8+T细胞用所指示的靶向CEA的CoStAR进行慢病毒转导，并且在过夜刺激后在存在LoVo-OKT3细胞的情况下评估IL-2产生。在CD34阴性(CoStAR未转导的)群体和CD34+(CoStAR转导的)群体两者中使用胞内流染色确定了IL-2(七个供体)(图6A)、IFNγ(七个供体)(图6B)、bcl-xL(五个供体)(图6C)和CD107a(六个供体)(图6D)阳性细胞的比例。对照是不相关的靶向CA125的CoStAR并且在所有情况下来自三个供体。热图是所有供体的平均值，其中颜色强度与在限定条件下对特定读出呈阳性的细胞的百分比相关。
图7-CD40增强了IL-2从基于CD28的CoStAR中的产生。来自三个健康供体的原代人T细胞保持未经转导或用基于胞外结构域截短的CD28(Tr CD28)、全长CD28(FL CD28)或CD28.CD40的携带CEA特异性scFv(MFE23)的CoStAR转导。使用CD34标志基因选择经转导的细胞，并且在分析之前对所述经转导的细胞进行扩增。将T细胞以8:1效应子对靶比率与表达OKT3的CEA+LoVo细胞混合20小时，之后通过ELISA对IL-2产生进行分析。
图8-信号传导结构域和靶抗原对CoStAR介导的T细胞扩增的影响。将T细胞用DYKDDDDK(SEQ ID NO:14)表位标记的基于CD28或CD28.CD40的携带CA125、FOLR1或CEA特异性scFv的CoStAR或FOLR1特异性结合肽(C7)进行转导。将T细胞与表达OKT3的CA125+/FOLR1+/CEA-细胞系OVCAR3混合。每7天对经转导的细胞的数量进行计数，直到21天，其中在每次计数后添加新鲜的OVCAR3细胞。
图9-(A和B)基于CD40的CoStAR增强了TCR转移模型中对T细胞的共刺激。用CEA特异性TCR加上DYKDDDK标记的基于CD28或CD28.CD40的携带MFE23(空心圆形或闭合圆形)或CA125(空心方块)特异性scFv的CoStAR对来自三个健康供体的原代人T细胞进行转导。将T细胞以1:1效应子:靶比率与CEA+/CA125-H508细胞混合，并且进行胞内细胞因子染色以确定TCR+/CoStAR+、TCR+/CoStAR-、TCR-/CoStAR+和TCR-/CoStAR-群体中的应答的CD4+或CD8+T细胞的数量。进行2向ANOVA(图基测试(Tukeys test))以确定活性的显著差异：*p>0.05，**p>0.01，***p>0.001，****p>0.0001。
图10：TCR转移模型中活性的CoStAR依赖性增强。用CEA特异性TCR加上DYKDDDK标记的基于CD28或CD28.CD40的携带MFE23(空心圆形或闭合圆形)或CA125(空心方块)特异性scFv的CoStAR对来自三个健康供体的原代人T细胞进行转导。将T细胞以1:1效应子:靶比率与CEA+/CA125-H508细胞混合，并且进行胞内细胞因子染色以确定TCR+/CoStAR+群体中的应答的CD4+或CD8+T细胞的数量。进行2向ANOVA(图基测试)以确定活性的显著差异：**p>0.01，****p>0.0001。
图11描绘了被转导以表达本发明的共刺激分子的原代人T细胞的富集和扩增。MFE23是对癌胚抗原(CEA)有高亲和力的单链Fv抗体。将原代人T细胞进行模拟物转导或用MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR进行转导，所述两个CoStAR各自携带由2A切割肽分离的CD34标志基因。之后，将体外培养细胞使用MACSTM顺磁选择试剂(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))针对CD34而富集，然后使用经照射的饲养细胞使细胞的数量扩增。示出了来自三个供体之一的示例性图。
图12A-12D描绘了响应于刺激和外源IL-2用本发明的共刺激分子转导的T细胞的扩增。将细胞进行模拟物转导或用MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR进行转导并且在存在(200IU/ml)或不存在外源IL-2的情况下以8:1效应子:靶比率与LoVo-OKT3细胞一起共培养。在第1天、第4天、第7天、第11天和第18天，提取细胞，并且通过在MACSQuant流式细胞仪上使用抗CD2试剂枚举活T细胞的数量。(A)在不存在由肿瘤进行的刺激和IL-2的情况下，细胞的数量如预期的下降。(B)在不存在刺激但存在IL-2的情况下，存在更明显的细胞存活，但无特异性生长。(C)在存在肿瘤但不存在IL-2的情况下，模拟物细胞未显示出特异性存活。MFE23.CD28 CoStAR在前四天介导了扩增的表观倍增，之后是下降。MFE23.CD28.CD40直至第7天介导更大扩增，随后稳定下降。(D)在相同条件下但在存在IL-2的情况下，模拟物和MFE23.CD28转导的细胞两者都表现出在18天内20倍扩增，而MFE23.CD28.CD40细胞扩增超过60倍。因此，在刺激条件下，在存在和不存在外源IL-2的情况下，基于CD28.CD40的受体表现出优异的扩增和存活。
图13A-13M描绘了由模拟物、MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40工程化的T细胞进行的细胞因子产生。对从T细胞/肿瘤共培养物获得的上清液进行珠粒阵列分析。将经工程化的T细胞以1:1效应子:靶比率与LoVo-OKT3细胞一起温育24小时，并且收集上清液。还从相等数量的单独的T细胞或单独的LoVo-OKT3细胞中收集经调理的上清液。使用LegendplexTM人TH1/TH2细胞因子群组(百进公司(Biolegend))对细胞因子产生进行了分析。(A)IL-2；(B)IFN-γ；(C)TNFα；(D)IL-4；(E)IL-5；(F)IL-13；(G)IL-17A；(H)IL-17F；(I)IL-22；(J)IL-6；(K)IL-10；(L)IL-9；(M)IL-21。在来自单独的T细胞或肿瘤的培养基中，细胞因子极低或不可检测到。当与肿瘤一起共培养时，细胞因子产生增强。相比于模拟物，MFE23.CD28增强了IL-2、IL-5、IL-17A/17F、IL-10、IL-9和IL-21的产生。MFE23.CD28.CD40还增强了TNFα、IL-13和IL-22的产生。MFE23.CD28.CD40并且进一步增强了比由MFE23.CD28(IL-2、IL-9和IL-17F)提供的细胞因子数量的产生更大的细胞因子数量的产生，并且将一些细胞因子的产生减少到在MFE23.CD28(IL-5和IL-10)的情况下看到的水平以下。与此数据一起证明了向基于CD28的共刺激受体添加CD40增强和/或调节其在细胞因子产生方面的比活性。
图14A-14M描绘了使用LegendplexTM人促炎趋化因子群组对趋化因子的分析。(A)IL-8(CXCL8)；(B)IP-10(CSCL10)；(C)嗜酸性粒细胞趋化因子(CCL11)；(D)TARC(CCL17)；(E)MCP-1(CCL2)；(F)RANTES(CCL5)；(G)MIP-1a(CCL3)；(H)MIG(CXCL9)；(I)ENA-78(CXCL5)；(J)MIP-3α(CCL20)；(K)GROα(CXCL1)；(L)I-TAC(CXCL11)；(M)MEP-1β(CCL4)。趋化因子在来自单独的T细胞的培养基中极低或不可检测到。当与肿瘤共培养时，趋化因子产生得以增强。相比于模拟物，MFE23.CD28增强了CXCL5、CXCL10、CXCL11、CCL17和CCL20的产生。MFE23.CD28.CD40还增强了CCL2、CXCL1和CXCL9的产生。MFE23.CD28.CD40进一步增强了比由MFE23.CD28(CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL17、CCL2、CXCL9、CCL5和CCL20)提供的细胞因子数量的产生更大的细胞因子数量的产生，以及将一些细胞因子的产生减少到在MFE23.CD28(CCL4)的情况下看到的水平以下。与此数据一起证明了向基于CD28的共刺激受体添加CD40增强和/或调节其在趋化因子产生方面的比活性。
图15A-15H描绘了使用携带FolR或CA125反应性scFv(分别为MOV19&196-14)的CoStAR的卵巢CoStAR工程化细胞的功能活性。人叶酸受体α(FolR)表示许多肿瘤，包含卵巢肿瘤、头颈肿瘤、肾肿瘤和肺部肿瘤的合适靶标，并且CA125表示卵巢癌的替代性靶标。将来自六个健康供体的原代人T细胞用196-14.CD28、196-14.CD28.CD40、MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40受体工程化，所有这些受体均携带DYKDDDDK表位标签以供检测。将经转导的细胞与FolR+/CA125+OvCAR-OKT3细胞混合，之后在表位标签阳性和阴性群体中使用胞内染色对效应子活性进行分析。除了相比于MOV19.CD28.CD40未观察到的由MOV19.CD28进行的特异性BCL-xL诱导之外，在CD28和CD28.CD40工程化的细胞中观察到响应于CA125和FolR两者通过IL-2(15A和15B)、TNFα(15C和15D)、CD137(15E和15F)和BCL-xL(15G和15H)的产生确定的效应子活性的特异性增强。
图16描绘了模拟物转导或用MOV19.CD28.CD40 CoStAR工程化，然后与患者匹配的肿瘤消化物混合的三个TIL群体。供体肿瘤在消化物上显示出不同水平的FolR，其范围为阴性(A)、低表达(B)到高表达(C)。CoStAR工程化的TIL群体中对FolR阴性消化物匹配的模拟物和CoStAR阴性TIL在肿瘤共培养后表现出类似水平的CD137上调，所述上调未通过存在CoStAR(D)得到增强。在暴露于FolR低表达消化物的TIL中，相比于CoStAR-，CoStAR+细胞中的活性增强，其中CD137表达从<10％增加到>20％(E)。在暴露于FolR高肿瘤消化物的TIL中，活性从CoStAR-群体中的大约20％增加到CoStAR+群体中的大约50％(F)。
图17描绘了效应子功能的增强。响应于FolR+肿瘤消化物，靶向FolR的CoStAR使CD137表达从约20％增加至约50％(A)，TNFα产生从10％增加至15％(B)并且IL-2产生从2％增加至5％(C)。
图18描绘了可溶性配体不抑制效应子功能。将来自三个健康供体的T细胞用MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40 CoStAR工程化，并且用固定的OKT3激活，从而在不存在FolR的情况下或在OvCAR-OKT3的情况下提供刺激，以提供TCR和CoStAR活性。Bcl-XL活性在OKT3刺激后跨三个供体在10％与20％之间增加(A)，而IL-2在0％与12％之间增加(B)，并且TNFα在0％与20％之间增加。外源可溶性FolR的存在未增强这些特定效应子功能中的任何效应子功能。在存在OvCAR-OKT3的情况下，Bcl-XL诱导在CD28 CoStAR中增强了约20％，但在CD28 CD40 CoStAR中增强了约35％(D)，IL-2诱导在CD28 CoStAR中增强了约20％，但在CD28 CD40 CoStAR中增强了30-50％(E)，并且TNFα产生在CD28 CoStAR中增强了20％-30％并且在CD28.CD40 CoStAR中增强了25-50％(F)。外源可溶性FolR对这些效应子功能中的任何效应子功能不具有抑制作用。
图19描绘了示例性CoStAR构建体。MFE23：对癌胚抗原(CEA)具有特异的scFv。鉴定了共刺激结构域。CTP188：SEQ ID NO:89；CTP189：SEQ ID NO:109；CTP190：SEQ ID NO:41；CTP191：SEQ ID NO:45；CTP192：SEQ ID NO:43；CTP193：SEQ ID NO:42；CTP194：SEQ ID NO:33；CTP195：SEQ ID NO:110；CTP196：SEQ ID NO:111；CTP197：SEQ ID NO:112；CTP198：SEQID NO:113；CTP199：SEQ ID NO:114；CTP200：SEQ ID NO:115；CTP201：SEQ ID NO:116；CTP202：SEQ ID NO:117；CTP203：SEQ ID NO:49；CTP204：SEQ ID NO:59。
图20描绘了CD40 CoStAR修饰的T细胞的CD4+亚群和CD8+亚群。对四个健康供体的T细胞进行激活并且用具有CD34标志物的各种CD40 CoStAR进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对其CD34表达而富集，并且按照快速扩增方案(REP)进行扩增。在REP后10-11天使用抗人CD4-PerCP-eF710、抗人CD8-PE-Cy7和抗人CD3-FITC评估了CD4(浅灰色)和CD8(灰色)T细胞表型。数据显示为平均值+/-SD，n＝4个健康供体。
图21描绘了与模拟物转导的T细胞相比，PD-1融合物CD40CoStAR中IL-2的量增加。将用Dynabead激活并且用CTP188、CTP189、CTP194(A)转导或模拟物转导的供体细胞针对CD34(转导标志物)表达(B)而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并且冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo(来自ATCC的CCL-229TM)或LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养。24小时后，收集上清液并冷冻。LoVo和LoVo.OKT3.GFP在其表面上天然表达CEA和PD-L1，从而通过单独的(LoVo)或与信号1(LoVo.OKT3.GFP)相关的CoStAR赋予经转导的T细胞信号2。共培养一式三份进行，并且在实验中包含了对应的阴性(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)对照和阳性(PMA+离子霉素)对照。解冻后，通过ELISA检测到分泌的IL-2和IFN-γ，并且使用FLUOstar Omega微型板读取器测量了吸光度，并且随后用Omega MARS 3.42R5软件对吸光度进行分析。每个点表示一个供体的一式三份的平均值。注意，阴性对照(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)均低于检测范围(#)(C)。
图22描绘了在与LoVo.OKT3共培养时赋予CD40 CoStAR转导的T细胞轻微的增殖优势的PD-1胞外结构域。将用Dynabead激活并且用CTP188、CTP189、CTP194转导或模拟物转导的健康供体细胞针对CD34表达而富集(B)，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并且冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中静置3-4天，并且查看CD34标志基因表达确定其转导速率(右图)。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。在长期共培养结束时，测量活力和绝对计数，并且计算扩增倍数。数据显示为一式三份分析的n≤3个供体的平均值+/-SEM。
图23描绘了肿瘤攻击后PD-1融合物CD40 CoStAR转导的T细胞的耗竭谱。将健康供体T细胞用Dynabead激活并且用CTP188、CTP189、CTP194进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。将经转导的(CD34+(灰色))或未经转导的(CD34-(白色))CD4(上图)和CD8(下图)T细胞的耗竭谱(LAG-3(A)、PD-1(B)、TIM-3(C))通过流式细胞术进行评估并且显示为n≤3个供体的平均值+/-SD。
图24描绘了相比于模拟物转导的T细胞，用单独的CD28、CD137和CD40 CoStAR转导的T细胞在激活后分泌更高量的IL-2。(A)将健康供体T细胞用Dynabead进行激活，并且用CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194进行转导或进行模拟物转导。在通过流式细胞术转导后8天，评估CD34标志基因与MFE23 scFv在来自一个受试者(左下图)的经转导的T细胞的表面上的表达之间的相关性。然后将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中静置3-4天，并且查看CD34标志基因表达确定其转导速率(右下图)。(B)在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo(来自ATCC的CCL-229TM)或LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养。24小时后，收集上清液并冷冻。LoVo和LoVo.OKT3.GFP在其表面上天然表达CEA和PD-L1，从而通过单独的(LoVo)或与信号1(LoVo.OKT3.GFP)相关的CoStAR赋予经转导的T细胞信号2。共培养一式三份进行，并且在实验中包含了对应的阴性(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)对照和阳性(PMA+离子霉素)对照。解冻后，通过ELISA检测到分泌的IL-2和IFN-γ，并且使用FLUOstar Omega微型板读取器测量了吸光度，并且随后用Omega MARS 3.42R5软件对吸光度进行分析。每个点表示一个供体的一式三份的平均值。注意，阴性对照(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)均低于检测范围(#)(B)。
图25描绘了在与LoVo.OKT3共培养时赋予CD40 CoStAR转导的T细胞增殖优势的CD28和CD137内结构域。将健康供体T细胞用Dynabead进行激活，并且用CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。在长期共培养结束时，测量活力和绝对计数，并且计算扩增倍数。数据显示为一式三份分析的n≤3个供体的平均值+/-SEM。
图26描绘了在肿瘤攻击后用单独的CD28、CD2、CD137和CD40CoStAR转导的T细胞的耗竭谱。将健康供体T细胞用Dynabead进行激活，并且用CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。将经转导的(CD34+(灰色))或未经转导的(CD34-(白色))CD4(上图)和CD8(下图)T细胞的耗竭谱(LAG-3(A)、PD-1(B)、TIM-3(C))通过流式细胞术进行评估并且显示为n≤3个供体的平均值+/-SD。
图27描绘了CD40 CoStAR TRAF结合位点突变在激活后对IL-2和IFN-γ的分泌具有直接影响。(A)将三个供体的细胞用Dynabead激活，并用CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中静置3-4天，并且查看CD34标志基因表达确定其转导速率(A，下图)。(B)在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo(来自ATCC的CCL-229TM)或LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养。24小时后，收集上清液并冷冻。LoVo和LoVo.OKT3.GFP在其表面上天然表达CEA和PD-L1，从而通过单独的(LoVo)或与信号1(LoVo.OKT3.GFP)相关的CoStAR赋予经转导的T细胞信号2。共培养一式三份进行，并且在实验中包含了对应的阴性(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)对照和阳性(PMA+离子霉素)对照。解冻后，通过ELISA检测到分泌的IL-2和IFN-γ，并且使用FLUOstar Omega微型板读取器测量了吸光度，并且随后用Omega MARS 3.42R5软件对吸光度进行分析。每个点表示一个供体的一式三份的平均值。注意，阴性对照(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)均低于检测范围(#)。
图28描绘了PVQET TRAF结合基序在与LoVo.OKT3共培养时的CD28.CD40 CoStAR转导的T细胞峰长期存活和增殖中的关键作用。将三个供体的细胞用Dynabead激活，并用CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。在长期共培养结束时，测量活力和绝对计数，并且计算扩增倍数。数据显示为一式三份分析的n≤3个供体的平均值+/-SEM。
图29描绘了在肿瘤攻击后用CD28.CD40突变体CoStAR构建体转导的T细胞的耗竭谱。将三个供体的细胞用Dynabead激活，并用CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200进行转导或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。将经转导的(CD34+(灰色))或未经转导的(CD34-(白色))CD4(上图)和CD8(下图)T细胞的耗竭谱(LAG-3(A)、PD-1(B)、TIM-3(C))通过流式细胞术进行评估并且显示为n≤3个供体的平均值+/-SD。
图30描绘了相比于模拟物转导的T细胞在激活后分泌更高量的IL-2和IFN-γ的CD28突变体和IgG4 CD40 CoStAR转导的T细胞。(A)将三个供体的细胞用Dynabead激活并用CTP194、CTP201、CTP202、CTP203进行转导或模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中静置3-4天，并且查看CD34标志基因表达确定其转导速率(A，下图)。(B)在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo(来自ATCC的CCL-229TM)或LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养。24小时后，收集上清液并冷冻。LoVo和LoVo.OKT3.GFP在其表面上天然表达CEA和PD-L1，从而通过单独的(LoVo)或与信号1(LoVo.OKT3.GFP)相关的CoStAR赋予经转导的T细胞信号2。共培养一式三份进行，并且在实验中包含了对应的阴性(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)对照和阳性(PMA+离子霉素)对照。解冻后，通过ELISA检测到分泌的IL-2和IFN-γ，并且使用FLUOstar Omega微型板读取器测量了吸光度，并且随后用Omega MARS 3.42R5软件对吸光度进行分析。每个点表示一个供体的一式三份的平均值。注意，阴性对照(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)均低于检测范围(#)。
图31描绘了CD28 PYAP和YMNM基序在与LoVo.OKT3共培养时的CD40 CoStAR转导的T细胞的长期存活和增殖中的关键作用。将三个供体的细胞用Dynabead激活，并用CTP194、CTP201、CTP202、CTP203进行转导或模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。在长期共培养结束时，测量活力和绝对计数，并且计算扩增倍数。数据显示为一式三份分析的n≤3个供体的平均值+/-SEM。
图32描绘了在肿瘤攻击后用CD28突变型CD40 CoStAR构建体转导的T细胞的耗竭谱。将三个供体的细胞用Dynabead激活，并用CTP194、CTP201、CTP202、CTP203进行转导(旋转接种，MOI 5)或进行模拟物转导。将细胞针对CD34标志物表达而富集，按照快速扩增方案(REP)进行扩增，并冷冻以用于后续实验。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养6-8天，每3-4天更换一半培养基。LoVo.OKT3.GFP天然地在其表面上表达CEA和PD-L1，从而赋予经转导的细胞信号2和信号1(OKT3)。在6-8天之后，对活力和绝对计数进行评估，并且用如上所述的新鲜LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞对活T细胞再攻击另外一周。将经转导的(CD34+(灰色))或未经转导的(CD34-(白色))CD4(上图)和CD8(下图)T细胞的耗竭谱(LAG-3(A)、PD-1(B)、TIM-3(C))通过流式细胞术进行评估并且显示为n≤3个供体的平均值+/-SD。
图33描绘了来自四个健康供体的经转导的T细胞在CD34富集和扩增后的生成。将4个健康供体(NBC360、NBC362、NBC358、NBC361)的T细胞用Dynabead激活并且用CTP188、CTP189、CTP190、CTP191、CTP192、CTP193、CTP194、CTP195、CTP196、CTP197、CTP198、CTP199、CTP200、CTP201、CTP202、CTP203、CTP204进行转导或进行模拟物转导。然后将细胞针对其CD34表达而磁富集，并且按照快速扩增方案(REP)进行扩增。通过流式细胞术(Novocyte)对REP后10-11天的每个样品的活力进行评估。用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。同一供体内的每个点表示不同的构建体。
图34描绘了从来自3个健康供体的与Ba/F3靶标过夜共培养的未经转导的(NTD)T细胞或抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)进行的活化标志物的表达和细胞因子产生。确定了活化标志物4-1BB和CD69(A)的表达以及IL-2和IFNγ的产生(B)。CoStAR接合增强细胞因子分泌。(C)未经转导细胞毒性和CoStAR细胞毒性相当。在与未经转导的(NTD)T细胞和CoStAR T细胞过夜共培养后，通过流式细胞术评估Ba/F3靶标的肿瘤计数。(D)CoStAR接合增强CD4 T细胞和CD8 T细胞两者的增殖。在与Ba/F3靶标过夜或5天共培养后，通过流式细胞术对NTD T细胞和CoStAR T细胞计数以及增殖进行评估。
图35描绘了从来自3个健康供体的抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)进行的活化标志物的表达，所述细胞与可溶性叶酸受体(sFOLR1)一起预温育，随后与Ba/F3靶标过夜共培养。X轴显示了以ng/mL为单位的sFOLR1。在每个组中，条1-4是未经转导的，条5-8为CoStAR转导的。可溶性FOLR1不影响活化标志物在CoStAR T细胞上的上调。确定了活化标志物4-1BB(A)和CD69(B)的表达。(C)sFOLR1不影响CoStAR T细胞的细胞毒性。在与未经转导(NTD)的T细胞或CoStAR转导的T细胞过夜共培养后通过流式细胞术对Ba/F3靶标的肿瘤计数进行评估，所述细胞与增加浓度的sFOLR一起预温育。(D)sFOLR1不影响细胞因子分泌。在与可溶性叶酸受体(sFOLR)一起预温育之后与Ba/F3靶标过夜共培养的抗FOLR1CoStAR修饰的T细胞中示出了IL-2产生。
图36描绘了FOLR1 CoStAR需要信号1才能起作用。(A、B)分别从来自3个健康供体的与Ba/F3靶标过夜共培养的未经转导的(NTD)和抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)中进行的活化标志物的表达(A)和细胞因子产生(B)。(A)仅用信号2对活化标志物的上调最小。(B)仅用信号2未观察到细胞因子分泌。(C)在与NTD T细胞和CoStAR T细胞过夜共培养后通过流式细胞术对Ba/F3靶标的肿瘤计数进行评估。仅用信号2未观察到细胞毒性。(D)在与Ba/F3靶标过夜或5天共培养后通过流式细胞术对NTD T细胞和CoStAR T细胞计数进行评估。仅用信号2未观察到增殖。
图37描绘了在卵巢癌中具有CoStAR的TIL的功能。(A)将来自6个卵巢肿瘤的TIL通过消化释放，并且在3000U IL-2中培养。在肿瘤消化后48小时和72小时两者，在MOI为5的情况下用编码CoStAR分子和靶向人FOLR1的scFv、接头、与截短的CD40细胞质结构域融合的全长CD28的第3代慢病毒载体进行转导。在第12-23天时进行快速扩增方案。(B)使用了流式细胞术分析以确定使用抗独特型抗体表达CoStAR分子以进行表面检测的CD4和CD8 T细胞的频率。(C)使用了流式细胞术分析以确定通过流式细胞术表面染色表达TCRαβ和TCRγδ的细胞的频率。模拟物-未经转导的细胞。CoStAR-/+：经处理的细胞群体中通过流式细胞术门控确定的对CoStAR分子呈阴性或阳性的细胞。
图38描绘了在卵巢癌中具有CoStAR的TIL的功能。(A)将来自5个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与自体消化物在存在布雷菲德菌素A的情况下过夜共培养。第二天通过流式细胞术对表达IL-2或TNFα的细胞的频率进行评估。与自体消化物反应的TIL的频率通过CoStAR分子得到增强。NTD：未经转导的细胞。CoStAR-/+：经处理的细胞群体中通过流式细胞术门控确定的对CoStAR分子呈阴性或阳性的细胞。(B)将来自5个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与自体消化物一起共培养，并且对上清液的细胞因子释放进行评估。CoStAR修饰的细胞的效应子功能增加，如通过IFNγ、TNFα和IL-13释放增加所证明的。响应于用PMA(佛波12-肉豆蔻酸13-乙酸酯)和离子霉素刺激，这些分子的最大水平相似。
图39描绘了CoStAR TIL保留稳健的效应子功能且并保留对信号1和2的需求。(A)将来自5个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与BA/F3细胞或被工程化为表达OKT3、FOLR1或两者的BA/F3细胞共培养。未经修饰的和CoStAR修饰的TIL的细胞因子分泌在与未经修饰的BA/F3或表达单独的OKT3或单独的FOLR1的BA/F3共培养时相当。CoStAR修饰的TIL在与被修饰成表达FOLR1和OKT3两者的BA/F3共培养时分泌增加水平的细胞因子。(B)将来自5个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与BA/F3细胞或被工程化为表达OKT3、FOLR1或两者的BA/F3细胞一起共培养。通过小鼠CD45的细胞计数对针对BA/F3靶细胞的细胞毒性进行评估，所述细胞计数是通过流式细胞术分析确定的。未经修饰的细胞和CoStAR修饰的细胞等效地杀死表达OKT3的细胞。CoStAR修饰的TIL不杀死表达单独的FOLR1的BA/F3细胞。(C)将来自3名卵巢癌患者的模拟物或CoStAR修饰的TIL与自体肿瘤在存在无阻断、MHCI、MHC II或MHC I+MHC II阻断或抗体或同种型对照的情况下共培养。评估上清液的IFNγ释放水平。相对于在没有抗体的情况下的释放水平归一化，相对于无抗体或同种型对照条件，模拟物和CoStAR修饰的TIL的IFNγ水平类似地降低，这显示出活性是由内源TCR-MHC肽相互作用引起的。
具体实施方式
本发明人已发现包括CD40信号传导结构域的共刺激受体显示出新颖且经改进的活性谱。活性谱可以通过选择受体蛋白的胞内结构域以与CD40信号传导结构域连接和/或通过选择CD40信号传导结构域的元件以与受体蛋白的胞内结构域连接来调节。本文提供了重组共刺激抗原受体(CoStAR)，其包括：(i)疾病或肿瘤相关抗原结合结构域；(ii)包括受体蛋白的胞内信号传导结构域的第一胞内区段；以及(iii)CD40受体蛋白的第二胞内信号传导结构域或其信号转导片段。任选地，CoStAR包括刺激受体蛋白的胞外区段。在某些实施例中，刺激受体蛋白的胞外区段能够与配体结合。在某些实施例中，刺激受体蛋白的胞外区段被截断且不与配体结合。在某些实施例中，刺激受体蛋白的胞外区段作为可调长度间隔子进行操作，从而允许疾病或肿瘤相关抗原结合结构域远离其所表达的细胞的表面定位，例如以形成更优的免疫突触。在某些实施例中，刺激受体蛋白的胞外区段和第一胞内区段包括同一受体蛋白的区段。在某些实施例中，胞外区段和第一胞内区段包括不同受体蛋白的区段。CoStAR包括位于疾病或肿瘤抗原结合结构域与第一胞内结构域之间的介于中间的跨膜结构域。当刺激受体蛋白的胞外区段存在时，跨膜结构域介入胞外区段与第一胞内信号传导结构域中间。
如本文所用，“全长蛋白”或“全长受体”是指受体蛋白质，例如，CD28受体蛋白。术语“全长”涵盖在成熟受体蛋白的信号肽已被切割后在成熟受体蛋白的N末端处缺乏至多约5个或至多10个氨基酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸的受体蛋白。例如，虽然受体N末端信号肽的特定切割位点可以被限定，但是已经观察到精确切割点的可变性。术语“全长”并不意味着存在或不存在受体N末端信号肽的氨基酸。在一个实施例中，术语“全长”(例如，根据本发明的某些方面的全长CD28或全长CD40胞内结构域)涵盖缺乏N末端信号肽的在成熟受体蛋白的信号肽已被切割后在成熟受体蛋白的N末端处缺乏至多约5个，例如1个、2个、3个、4个、5个，或至多10个氨基酸的成熟受体蛋白(例如，根据本发明的某些方面的CD28)。如以上提到的，根据本发明的各个方面的“全长”CD28受体或其它受体或肿瘤抗原结合结构域不包含信号肽，并且可能在成熟受体蛋白的N末端(例如N末端残基N、K、I、L和/或V)处缺乏至多约5个，例如1个、2个、3个、4个、5个或至多10个氨基酸。这在示例性融合物，例如SEQ ID No.4-12(注意，这些可能在成熟受体蛋白的N末端处缺乏至多约5个，例如1个、2个、3个、4个、5个或至多10个氨基酸，如方框区所示)中示出。
CoStAR具有模块化形式，并且可以被构建为包括从一种或多种蛋白质获得的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，以及从与疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原结合的抗体获得的scFv。
根据本发明，在一个实施例中，CoStAR包括疾病相关，例如肿瘤相关抗原受体，如但不限于肿瘤相关抗原特异性scFv，以及能够与其同源配体结合并提供胞内信号的初级共刺激受体蛋白。在某些实施例中，初级共刺激受体可以小于全长蛋白，但足以与同源配体结合并对信号进行转导。在某些实施例中，初级共刺激受体结构域是全长的，如但不限于为全长CD28。因此，抗原特异性结合结构域和配体特异性受体两者均能够分别与同源抗原和配体结合。本文提供的氨基酸序列提供了几种CoStAR构建体的实施例。这些包含包括抗原结合结构域、任选间隔子、包括胞外配体结合区段或其片段的任选共刺激受体蛋白和胞内CD40信号传导结构域的CoStAR构建体。在另一个实施例中，CoStAR包括抗原结合结构域、任选间隔子、共刺激受体蛋白的胞外配体结合部分、跨膜结构域以及所选共刺激受体蛋白的胞内信号传导结构域和胞内CD40信号传导结构域。在某些实施例中，胞外配体结合部分包括CD28截短，例如氨基酸IEV后的C末端CD28截短，并且随后是胞内信号传导结构域。在某些实施例中，胞内信号传导结构域来自CD40。将胞外配体结合结构域和胞内信号传导结构域分离的跨膜结构域可以在受限的情况下来自CD28、CD40。在另外的实施例中，CoStAR可以包括另外的共刺激结构域，例如第三胞内共刺激信号传导结构域，并且在这方面可以类似于某些嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体已被分类为第一代(仅CD3ζ)、第二代(一个共刺激结构域+CD3ζ)或第三代(多于一个共刺激结构域+CD3ζ)。
可用于本发明的CoStAR的共刺激受体蛋白包含但不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6，这些在其天然形式下包括胞外配体结合结构域和胞内信号转导结构域。例如，CD2的特征在于存在于T细胞的表面上的细胞粘附分子，并且能够引发T细胞激活所必需的胞内信号。CD27的特征在于属于TNFR超家族(TNFRSF)的II型跨膜糖蛋白，所述糖蛋白在B细胞上的表达是通过B细胞中的抗原受体激活诱导的。CD28是T细胞上的蛋白质之一，并且是抗原呈递细胞上的CD80(B7.1)和CD86(B7.2)配体的受体。CD137(4-1BB)配体存在于大多数白细胞和一些非免疫细胞上。OX40配体在许多抗原呈递细胞，如DC2(树突状细胞)、巨噬细胞和B淋巴细胞上表达。在一个实施例中，共刺激受体蛋白是如本文定义的全长CD28。
CD40是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，并且通过替代性剪接生成几种同种型。其配体，即CD154(也被称为CD40L)，是主要在激活的T细胞上表达的蛋白质。为了进行参考，人CD40同种型1蛋白质序列在GenBank登录号NP_001241.1中阐述，其包含信号肽(氨基酸1-20)、跨膜结构域(氨基酸194-215)和细胞质结构域(氨基酸216-277)(SEQ ID NO:22)。CD40受体信号传导涉及衔接蛋白，所述衔接蛋白包含但不限于TNF受体相关因子(TRAF)，并且CD40细胞质结构域包括信号传导组分，所述信号传导组分包含与SH3基序(KPTNKAPH或PTNKAPHP或PTNKAPH)、TRAF2基序(PKQE、PKQET、PVQE、PVQET、SVQE、SVQET)、TRAF6基序(QEPQEINF或QEPQEINFP)和PKA基序(KKPTNKA、SRISVQE)匹配的氨基酸序列。本发明进一步包含包括TRAF结合氨基酸序列的经工程化的信号传导结构域，如经工程化的CD40信号传导结构域。与TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5结合的经工程化的信号传导结构域可以包括主要共有序列(P/S/A/T)X(Q/E)E或次要共有序列PXQXXD，并且可以在不受限制的情况下从TNFR家族成员，如CD30、Ox40、4-1BB和EBV癌蛋白LMP1中进行鉴定或获得。(参见，例如Ye,H等人,用于通过TRAF2识别不同受体序列的结构基础(The Structural Basis for theRecognition of Diverse Receptor Sequences by TRAF2)《分子细胞(MolecularCell)》,1999；4(3):321-30.doi:10.1016/S1097-2765(00)80334-2；Park HH,TRAF家族的结构：对受体识别的当前理解(Structure of TRAF Family:Current Understanding ofReceptor Recognition.)《微生物学前沿(Front.Immunol.)》2018；9:1999.doi:10.3389/fimmu.2018.01999；Chung,J.Y.等人,并非所有TRAF都是平等的：TRAF介导的信号转导的共同且独特的分子机制(All TRAFs are not created equal:common and distinctmolecular mechanisms of TRAF-mediated signal transduction.)《细胞科学杂志(Journal of Cell Science)》2002；115:679-688)。
本文公开的实例证明了CD40在CoStAR中作为共刺激信号传导结构域的操作，并且进一步证明了细胞因子和趋化因子表达谱通过信号传导结构域选择而改变。在某些实施例中，CoStAR的共刺激CD40信号传导结构域促进促炎细胞因子(例如，IL-2、TNFα)。在某些实施例中，CoStAR的共刺激CD40信号传导结构域减少免疫抑制细胞因子(例如，IL-5、IL-10)。相比于不具有CD40信号传导结构域或片段的第一受体信号传导结构域的活性，CD40信号传导结构域或片段的共刺激活性可以与第一受体信号传导结构域组合而被观察到，所述第一受体信号传导结构域如但不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6。在这点上，相比于共刺激信号传导结构域的单独的第一信号传导结构域活性，本发明的CD40信号传导结构域，包含包括特定因子结合位点或其中特定因子结合位点发生突变的信号传导片段与共刺激第一信号传导结构域组合能够促进或抑制特定细胞因子和/或趋化因子的相对表达。(参见例如Ahonen,CL等人,CD40-TRAF6轴控制亲和力成熟和长寿浆细胞的产生(The CD40-TRAF6 axis controlsaffinity maturation and the generation of long-lived plasma cells)《自然免疫学(Nat Immunol)》2002；3:451-456；Mackey MF等人,不同CD40 TRAF结合位点对CD154诱导的树突状细胞成熟和IL-12分泌的显著贡献(Distinct contributions of different CD40TRAF binding sites to CD154-induced dendritic cell maturation and IL-12secretion.)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》2003；33:779-789；Mukundan L等人,TNF受体相关因子6是单核细胞和巨噬细胞中CD40激活的促炎通路的必要介导子(TNFreceptor-associated factor 6is an essential mediator of CD40-activatedproinflammatory pathways in monocytes and macrophages.)《免疫学杂志(JImmunol.)》2005；174:1081-1090。
在某些实施例中，本发明的CoStAR基本上包括CD40共刺激结构域的全部。在某些实施例中，本发明的CoStAR包括两个或更多个CD40共刺激结域。在某些实施例中，本发明的CoStAR包括CD40共刺激结构域信号传导组分或基序，所述基序包含但不限于SH3基序(KPTNKAPH)、TRAF2基序(PKQE、PVQE、SVQE)、TRAF3基序、TRAF6基序(QEPQEINFP)或PKA基序(KKPTNKA、SRISVQE)以及基序的可以呈多个拷贝或以任何次序排列的两种或更多种、或三种或更多种或四种或更多种这种组分。在某些实施例中，本发明的CoStAR包括CD40共刺激结构域和CD40共刺激结构域信号传导组分或基序。在某些实施例中，SH3基序、TRAF2基序和TRAF6基序足以调节促炎和/或免疫抑制细胞因子。在某些实施例中，添加那些基序的串联拷贝和/或使某些基序突变放大了这些效应。
在某些实施例中，一个或多个共刺激结构域信号传导组分或基序的选择由其中要表达CoStAR的细胞和/或用信号传导组分或基序更紧密地鉴定的期望共刺激活性或避免用信号传导组分或基序更紧密地鉴定的共刺激活性来引导。
在某些实施例中，除了CD40共刺激结构域或其信号传导组分或基序或两个或更多个此类结构域或组分或基序或其组合之外，CoStAR信号传导结构域包括另外的全长共刺激结构域或来自所述全长共刺激结构域的信号传导组分，其不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6。
为了进行参考，在GenBank登录号NP_006130.1中阐述了人CD28蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-18)、胞外结构域(氨基酸19-152)、跨膜结构域(氨基酸153-179)和细胞质结构域(氨基酸180-200)。胞外结构域包含免疫球蛋白类结构域(氨基酸21-136)，所述免疫球蛋白类结构域含有构成抗原结合位点的氨基酸和形成同源二聚体界面的氨基酸。胞外结构域包含可以糖基化的若干个天冬酰胺残基，并且胞内结构域包括可以磷酸化的丝氨酸和酪氨酸残基。
为了进行参考，在GenBank登录号NP_001139345.1中阐述了人CD8α链蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-21)、胞外结构域(氨基酸22-182)、跨膜结构域(氨基酸183-203)和细胞质结构域(氨基酸204-235)。胞外结构域包含免疫球蛋白类结构域(氨基酸28-128)，所述免疫球蛋白类结构域含有构成抗原结合位点的氨基酸和形成同源二聚体界面的氨基酸。胞外结构域包含可以糖基化的若干个天冬酰胺残基，并且胞内结构域包括可以磷酸化的丝氨酸和酪氨酸残基。
为了进行参考，在UniProtKB/Swiss-Prot：登录号P01861.1中阐述了人IgG4恒定区序列，其包含CH1(氨基酸1-98)、铰链(氨基酸99-110)、CH2(氨基酸111-220)、CH3(氨基酸221-327)。CH2区包含位于氨基酸177处的天冬酰胺，所述天冬酰胺是糖基化的并且与Fc受体和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)相关。
为了进行参考，在GenBank登录号NP_001552.2中阐述了人CD137(4-1BB)，即另一个TNFR超家族成员，的蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-23)、胞外结构域(氨基酸24-186)、跨膜结构域(氨基酸187-213)和细胞质结构域(氨基酸214-255)。在抗原呈递细胞上表达的CD137L配体三聚体与CD137的结合导致参与T细胞反应和存活的信号传导级联的受体三聚化和激活(Li等人,4-1BB通过4-1BB配体和激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗的有限交联(Limited Cross-Linking of 4-1BB by 4-1BB Ligand and the Agonist MonoclonalAntibody Utomilumab.)《细胞报告(Cell Reports)》2018；25:909-920)。已报道了CD137与信号传导衔接子TRAF-2和TRAF-1的共免疫沉淀以及相互作用的结构基础(Ye,H等人,《分子细胞》,1999；4(3):321-30)。
为了进行参考，在GenBank登录号NP_003318.1中阐述了人CD134(OX40)蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-28)、胞外结构域(氨基酸29-214)、跨膜结构域(氨基酸215-235)和细胞质结构域(氨基酸236-277)。此受体已被示出通过其与衔接蛋白TRAF2和TRAF5的相互作用来激活NF-κB，并且研究表明此受体促进凋亡抑制剂BCL2和BCL21L1/BCL2-XL的表达。
人T细胞表面抗原CD2具有至少两个同种型。为了进行参考，在NP_001315538.1中阐述了人CD2同种型1蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-24)、胞外结构域(氨基酸25-235)、跨膜结构域(氨基酸236-261)和细胞质结构域(氨基酸262-377)。人CD2同种型2蛋白质序列在NP_001758.2中阐述。
为了进行参考，在GenBank登录号NP_004186.1中阐述了人CD357(GITR)同种型1蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-25)、胞外结构域(氨基酸26-162)、跨膜结构域(氨基酸163-183)和细胞质结构域(氨基酸184-241)。
为了进行参考，在GenBank登录号NP_596867中阐述了人CD29(β1整联蛋白)蛋白质序列，其包含信号肽(氨基酸1-20)、胞外结构域(氨基酸21-728)、跨膜结构域(氨基酸729-751)和细胞质结构域(氨基酸752-798)。
人CD150(SLAM)蛋白质序列具有几种同种型。除了CD150的跨膜形式(mCD150)之外，造血谱系的细胞表达编码CD150的分泌形式(sCD150)的缺乏30个氨基酸的整个跨膜区的mRNA。为了进行参考，在GenBank登录号NP_003028.1中阐述了人SLAM同种型b，其包含信号肽(氨基酸1-20)、胞外结构域(氨基酸21-237)、跨膜结构域(氨基酸238-258)和细胞质结构域(氨基酸259-335)。在GenBank登录号NP_001317683.1中阐述了人SLAM同种型a。
在本发明的实施例中，CoStAR可以在具有治疗活性的细胞，例如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗群体中的启动子的控制下单独表达。可替代地，CoStAR可以与例如SEQ IDNO:67-79中所述(注意，在成熟受体蛋白的N末端处可能缺乏至多约5个，例如1个、2个、3个、4个、5个或至多10个氨基酸)的治疗性转基因，如嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)一起表达。因此，一方面，本发明还涉及具有如SEQ ID NO:67-79中任一项所示的序列的CoStAR构建体，所述序列包含在成熟受体蛋白的N末端处缺乏至多约5个，例如1个、2个、3个、4个、5个或至多10个氨基酸的这些序列之一。合适的TCR和CAR在文献中是所周知的，例如，为HLA-A*02-NYESO-1特异性TCR(Rapoport等人,《自然医学(Nat Med)》2015)或抗CD19scFv.CD3ζ融合物CAR(Kochenderfer等人《临床肿瘤学杂志(JClin Oncol)》2015，这两者已分别成功用于骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。本文所述的CoStAR可以与任何已知的CAR或TCR一起表达，由此为细胞提供用于使细胞在体外或体内扩增的可调节的生长开关，以及呈TCR或CAR形式用于抗癌活性的常规活化机制。因此，本发明提供了用于过继细胞疗法的细胞，所述细胞包括如本文所述的CoStAR和与肿瘤相关抗原特异性结合的TCR和/或CAR。包括CD28的示例性CoStAR包含胞外抗原结合结构域以及胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指抗体片段，其包含但不限于双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定性双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包括一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米体、结构域抗体、双价结构域抗体或与抗原结合但不包括完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合结构域能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scFv)结合的同一抗原结合。在一些实施例中，抗原结合片段可以包括来自特定人抗体的一个或多个互补决定区(CDR)，所述特定人抗体移植到从一种或多种不同人抗体的框架(FR)。
可以使抗原结合结构域对任何疾病相关抗原具有特异性，包含但不限于肿瘤相关抗原(TAA)和传染病相关抗原。在某些实施例中，配体结合结构域是双特异性的。已在大多数人癌症中鉴定出抗原，包含伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、神经母细胞瘤、黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌。TAA包含但不限于CD19、CD20、CD22、CD24、CD33、CD38、CD123、CD228、CD138、BCMA、GPC3、CEA、叶酸受体(FRα)、间皮素、CD276、gp100、5T4、GD2、EGFR、MUC-1、PSMA、EpCAM、MCSP、SM5-1、MICA、MICB、ULBP和HER-2。TAA进一步包含新抗原、肽/MHC复合体和HSP/肽复合体。
在某些实施例中，抗原结合结构域包含与限定的肿瘤特异性肽-MHC复合体结合的T细胞受体或其结合片段。术语“T细胞受体”或“TCR”是指由在T细胞的表面上配对的αβ或γδ链构成的异二聚体受体。每条α、β、γ和δ链由两个Ig样结构域构成：通过互补决定区(CDR)赋予抗原识别的可变结构域(V)，以及之后的通过连接肽和跨膜(TM)区锚定到细胞膜的恒定结构域(C)。TM区与CD3信号传导设备的不变亚基缔合。每个V结构域具有三个CDR。这些CDR与复合体在与由主要组织相容性复合体(pMHC)编码的蛋白质结合的抗原肽之间的相互作用(Davis和Bjorkman(1988)《自然(Nature)》,334,395-402；Davis等人(1998)《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)》,16,523-544；Murphy(2012),xix,868p.)。
在某些实施例中，抗原结合结构域包括肿瘤表达的蛋白质的天然配体或其肿瘤结合片段。非限制性实例是与PDL1结合的PD1。另一实例是转铁蛋白受体1(TfRl)，其也被称为CD71，即作为细胞铁稳态和增殖的关键调节因子的同二聚体蛋白。尽管TfRl在广泛多种细胞中以低水平表达，但其在快速增殖细胞，包含其中过表达与不良预后相关的恶性细胞中以较高水平表达。在本发明的一实施例中，抗原结合结构域包括转铁蛋白或其转铁蛋白受体结合片段。
在某些实施例中，抗原结合结构域对限定肿瘤相关抗原具有特异性，如但不限于FRα、CEA、5T4、CA125、SM5-1或CD71。在某些实施例中，肿瘤相关抗原可以为肿瘤特异性肽-MHC复合体。在某些此类实施例中，肽为新抗原。在其它实施例中，肿瘤相关抗原为肽-热休克蛋白复合体。
在各个实施例中，本发明提供了包括以下的CoStAR：
i.与癌胚抗原(CEA)、CD28的间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
ii.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
iii.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列、CD137信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
iv.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列、CD134信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
v.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列、CD2信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
iii.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列、GITR信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
vii.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列、CD29信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
iv.与CEA、CD28的间隔子和跨膜序列、CD150信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
ix.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
x.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
xi.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、CD137信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xii.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、CD134信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xiii.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、CD2信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xiv.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、GITR信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xv.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、CD29信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xvi.与CEA、CD8的间隔子和跨膜序列、CD150信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xvii.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xviii.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
xix.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD137信号传导结构域以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
xx.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD134信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxi.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD2信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxii.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、GITR信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxiii.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD29信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxiv.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD150信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxv.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、第一CD40信号传导结构域和第二CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxiii.与CEA、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、第一CD40信号传导结构域和第二经突变的CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxvii.与PDL1、CD28的短间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxviii.与PDL1、CD28的短间隔子和跨膜序列和CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxix.与CD155、CD112或CD113、CD28跨膜结构域、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxx.与CD155、CD112或CD113、CD28跨膜结构域和CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxxi.与CEA结合的scFv、与PDL1、CD28的短间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxxii.与CEA结合的scFv、与PDL1、CD28的短间隔子和跨膜序列和CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxxiii.与CEA结合的scFv、与CD155、CD112或CD113、CD28的短间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域以及CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
xxxiv.与CEA结合的scFv、与CD155、CD112或CD113、CD28的短间隔子和跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的结合结构域。
在各个实施例中，本发明提供了包括i-xxxiv中的任一项的间隔子、跨膜和信号传导结构域结构并且与FOLR1结合的CoStAR。
在各个实施例中，本发明提供了包括以下的CoStAR：
i.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
ii.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
iii.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、CD137信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
iv.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、CD134信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
v.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、CD2信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
vi.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、GITR信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
vii.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、CD29信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
viii.与FOLR1、CD28的间隔子和跨膜序列、CD150信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
ix.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
x.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
xi.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、CD137信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xii.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、CD134信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xiii.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、CD2信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xiv.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、GITR信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xv.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、CD29信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xvi.与FOLR1、CD8的间隔子和跨膜序列、CD150信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xvii.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xviii.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
xix.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD137信号传导结构域以及CD40信号传导结构域结合的scFv。
xx.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD134信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxi.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD2信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxii.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、GITR信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxiii.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD29信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxiv.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、CD150信号传导结构域和CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxv.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、第一CD40信号传导结构域和第二CD40信号传导结构域结合的scFv。
xxvi.与FOLR1、包括IgG4恒定区的间隔子和CD28跨膜序列、第一CD40信号传导结构域和第二经突变的CD40信号传导结构域结合的scFv。
如本文所用，术语“特异性结合”或“对...具有特异性”是指可测量且可再现的相互作用，如靶标与确定在存在分子，包含生物分子，的异源群体的情况下存在靶标的抗体或抗体部分之间的结合。例如，与靶标(其可以是表位)特异性结合的抗体部分是以相比于其与其它靶标的结合更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间结合的抗体部分。在一些实施例中，与抗原特异性结合的抗体部分与抗原的一个或多个抗原决定物(例如细胞表面抗原或肽/MHC蛋白复合体)以为其对其它靶标的结合亲和力的至少约10倍的结合亲和力反应。
间隔子
本发明的CoStAR任选地包括抗原结合结构域与共刺激受体之间的间隔子区。如本文所用，术语“间隔子”是指CoStAR的将抗原结合结构域与共刺激蛋白的外部配体结合结构域分离的胞外结构区。间隔子提供了接近靶向抗原和受体配体的灵活性。在某些实施例中，采用了长间隔子，例如以靶向膜近侧表位或糖基化抗原(参见Guest R.D.等人胞外间隔子区在嵌合免疫受体的优化设计中的作用：评估四种不同的scFv和抗原(The role ofextracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immunereceptors:evaluation of four different scFvs and antigens.)《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》2005；28:203-211；Wilkie S.等人,人T细胞再靶向到肿瘤相关MUC1：嵌合抗原受体的演进(Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1:theevolution of a chimeric antigen receptor.)《免疫学杂志(J.Immunol.)》2008；180:4901-4909)。在其它实施例中，CoStAR具有短间隔子，例如以靶向膜远端侧表位(参见Hudecek M.等人,受体亲和力和胞外结构域修饰影响ROR1特异性嵌合抗原受体T细胞对肿瘤的识别(Receptor affinity and extracellular domain modifications affecttumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells)《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2013；19:3153-3164；Hudecek M.等人,嵌合抗原受体的非信号传导胞外间隔子结构域对体内抗肿瘤活性是决定性的(The nonsignallingextracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for invivo antitumor activity.)《癌症免疫学研究(Cancer Immunol.Res.)》2015；3:125-135)。在某些实施例中，间隔子包括IgG铰链的全部或部分或衍生自IgG铰链，包含但不限于IgG1、IgG2或IgG4。“衍生自Ig铰链”意指包括IgG铰链中的插入、缺失或突变的间隔子。在某些实施例中，间隔子可以包括一个或多个抗体恒定结构域的全部或部分，如但不限于CH2和/或CH3结构域。在某些实施例中，在包括CH2结构域的全部或部分的间隔子中，CH2结构域被修饰成与Fc受体结合。例如，已发现骨髓细胞中的Fc受体结合损害CAR T细胞功能。在某些实施例中，间隔子包括来自CD28、CD8的Ig样铰链的全部或部分，或包括铰链区的其它蛋白质。在本发明的包括间隔子的某些实施例中，间隔子的长度为1个至50个氨基酸。
在一非限制性实施例中，间隔子包括基本上胞外结构域的全部，例如CD28胞外结构域(即，约氨基酸19、20、21或22至约氨基酸152)或另一种蛋白质的胞外结构域，包含但不限于另一个TNFR超家族成员。在一实施例中，间隔子包括胞外结构域的一部分，例如CD28胞外结构域的一部分，并且可能缺乏Ig结构域的全部或大部分。在另一实施例中，间隔子包含CD28的约141至约152的氨基酸，但不包含CD28胞外结构域的其它部分。在另一实施例中，间隔子包含CD8的约128至约182的氨基酸，但不包含CD8胞外结构域的其它部分。
接头
在某些实施例中，CoStAR胞外结构域包括接头。接头包括用于连接结构域的短程氨基酸，例如具有间隔子或跨膜结构域的结合结构域。为了具有与配体结合的灵活性，配体结合结构域通常将通过包括约5个至25个氨基酸的柔性接头与间隔子或跨膜结构域连接，例如AAAGSGGSG(SEQ ID NO:7)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:62)。在某些实施例中，CoStAR包括通过接头与跨膜结构域直接连接并且不具有间隔子的结合结构域。在某些实施例中，CoStAR包括通过间隔子与跨膜直接连接且并且不具有接头的结合结构域，如SEQ IDNO:58和59所例示的。
信号传导结构域
如以上讨论的，在某些实施例中，CoStAR包括全长初级共刺激受体，所述全长初级共刺激受体可以包括不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6的胞外配体结合部分和胞内信号传导部分。在其它实施例中，共刺激受体包括嵌合蛋白，例如包括前述蛋白中的一种的胞外配体结合结构域和前述蛋白质中的另一种的胞内信号传导结构域。在某些实施例中，CoStAR的信号传导部分包括单个信号传导结构域。在其它实施例中，CoStAR的信号传导部分包括第二胞内信号传导结构域，如但不限于：CD2、CD27、CD28、CD40、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAM)。在某些实施例中，第一胞内信号传导结构域和第二胞内信号传导结构域是相同的。在其它实施例中，第一胞内信号传导结构域和第二胞内信号传导结构域是不同的。在某些实施例中，共刺激受体能够二聚化。不受理论束缚，认为CoStAR使用于信号起始的其它配件分子二聚化或与所述辅助分子缔合。在某些实施例中，CoStAR通过跨膜结构域相互作用使辅助分子二聚化或与配件分子缔合。在某些实施例中，通过共刺激受体的胞内部分和/或胞外部分中的共刺激受体相互作用辅助分子的二聚化或与配件分子的缔合。
跨膜结构域
尽管跨膜的主要功能是将CoStAR锚定在T细胞膜中，但在某些实施例中，跨膜结构域影响CoStAR功能。在某些实施例中，跨膜结构域包含全长初级共刺激受体结构域。在其中CoStAR构建体包括一个受体的胞外结构域和第二受体的胞内信号传导结构域的本发明的实施例中，跨膜结构域可以是胞外结构域或胞内结构域的跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域来自CD4、CD8a、CD28或ICOS。Gueden等人,ICOS跨膜结构域的使用与增加的CAR T细胞持久性和总体抗肿瘤功效相关联(Guedan S.等人,通过ICOS和4-1BB共刺激增强CAR T细胞持久性(Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BBcostimulation.)《临床调查洞察杂志(JCI Insight)》2018；3:96976)。在一个实施例中，跨膜结构域包括跨越细胞膜的疏水α螺旋。
在一实施例中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域的约氨基酸153至约氨基酸179的氨基酸。在另一实施例中，跨膜结构域包括CD8跨膜结构域的约氨基酸183至约氨基酸203的氨基酸。在某些实施例中，本发明的CoStAR可以包含跨膜结构域与信号传导结构域之间的若干个氨基酸。例如，在本文所述的一种构建体中，从CD8跨膜结构域到信号传导结构域的连接包括CD8细胞质结构域的几个氨基酸(例如，CD8的氨基酸204-210)。
变体
在一些实施例中，设想了本文提供的抗体部分或其它部分的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体部分的结合亲和力和/或其它生物性质。抗体部分的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入到编码抗体部分的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如抗体部分的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，其条件为最终构建体具有所期望的特性，例如，抗原结合。
在一些实施例中，提供了包括一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的抗体结合结构域部分。突变改变的所关注位点包含抗体结合结构域重链和轻链可变区(VR)以及框架(FR)。可以将氨基酸取代引入到所关注的结合结构域中，并且筛选产物的期望活性，例如，保留的/经改进的抗原结合或降低的免疫原性。在某些实施例中，可以将氨基酸取代引入到初级共刺激受体结构域(胞外或胞内)、二级共刺激受体结构域或胞外共受体结构域中的一者或多者中。因此，本发明涵盖本文具体公开的CoStAR蛋白和组分部分以及其变体，即与本文具体公开的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的CoStAR蛋白和组分部分。当提及特定序列时，术语“相似性百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”如威斯康星大学GCG软件程序BestFit中所述使用。可以使用其它算法，例如，BLAST、psiBLAST或TBLASTN(其使用Altschul等人(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:405-410中的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》85:2444-2448中的方法)。特定氨基酸序列变体可以通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸、2个、3个、4个、5-10个、10-20个或20-30个氨基酸而不同于参考序列。在一些实施例中，变体序列可以包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个残基被插入、缺失或取代的参考序列。例如，可以插入、缺失或取代5个、10个、15个至20个、至30个或至40个残基。
在一些优选实施例中，变体可以通过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守取代而不同于参考序列。保守取代涉及用具有类似性质的不同氨基酸替代氨基酸。例如，脂肪族残基可以被另一个脂肪族残基替代，非极性残基可以被另一个非极性残基替代，酸性残基可以被另一个酸性残基替代，碱性残基可以被另一个碱性残基替代，极性残基可以被另一个极性残基替代，或者芳香族残基可以被另一个芳族残基替代。保守取代可以例如位于以下基团内的氨基酸之间：
“保守取代”在下表中示出。
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同的侧链性质被分为不同类别：a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；c.酸性：Asp、Glu；d.碱性：His、Lys、Arg；e.影响链朝向的残基：Gly、Pro；芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将需要将这些类别中的一种类别的成员与另一种类别的成员交换。
细胞
本发明中使用的细胞可以是可用于过继细胞疗法的任何淋巴细胞，如T细胞或天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、γ/δT细胞或T调节细胞。对患者来说，细胞可以是同种异体的或自体的。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起关键作用的类型的淋巴细胞。其可以通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其它淋巴细胞，如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开。存在各种类型的T细胞，如下文所概述。细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。CTL在其表面上表达CD8分子。
这些细胞通过与和MHC I类相关的抗原结合来识别其靶标，所述抗原存在于所有有核细胞的表面上。通过IL-10、腺苷和由调节T细胞分泌的其它分子，CD8+细胞可以被灭活至无能状态，这预防自身免疫疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是在感染已消退后长期持续存在的抗原特异性T细胞的子集。在再暴露于其同源抗原后，其快速扩增到大量效应T细胞，由此为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以为CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。调节T细胞(Treg细胞)，先前被称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。其主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并且抑制在胸腺中逃避阴性选择过程的自动反应性T细胞。
已描述了CD4+Treg细胞的两种主要类别，即天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。天然存在的Treg细胞(还被称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)在胸腺中产生并且与开发T细胞与用TSLP激活的骨髓(CD11c+)树突状细胞和浆细胞样(CD123+)树突状细胞两者之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过存在被称为FoxP3的胞内分子而与其它T细胞区分开。适应性Treg细胞(还被称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。
天然杀伤细胞(或NK细胞)是形成先天性免疫系统的一部分的类型的溶细胞。NK细胞以MHC非依赖性方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。NK细胞(属于先天淋巴细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并且构成与生成B和T淋巴细胞的普通淋巴祖细胞分化的第三种类的细胞。
在某些实施例中，本发明的治疗细胞包括被工程化为表达CoStAR的自体细胞。在某些实施例中，本发明的治疗细胞包括被工程化为表达CoStAR的同种异体细胞。由于接受者同种抗原的TCR介导的识别，表达CoStAR的自体细胞在避免移植物抗宿主病(GVHD)方面可能是有利的。另外，CoStAR接受者的免疫系统可以攻击输注的CoStAR细胞，从而引起排斥。在某些实施例中，为了预防GVHD并且为了减少排斥，通过基因组编辑从同种异体CoStAR细胞中去除内源TcR。
核酸
本发明的一方面提供了本发明的核酸序列，其编码本文所述的任何CoStAR、多肽或蛋白质(包含功能部分和其功能变体)。如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。技术人员将理解，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码由于遗传代码的退行性而产生的同一多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，所述核苷酸取代不影响由本文所述的多核苷酸编码以反映其中多肽要进行表达的任何特定宿主生物体的密码子使用，例如密码子优化的多肽序列。根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA。其可以是单链的或双链的。其还可以是在其内包含合成的或经修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸进行的多种不同类型的修饰在本领域是已知的。这些包含甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链加上位于分子的3'和/或5'端处的吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解，多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰，以便增强所关注的多核苷酸的体内活性或寿命。
关于核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包含来自序列或到序列的一个(或多个)核酸的任何取代、变化、修饰、替代、缺失或添加。
核酸序列可以编码如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列或其变体。核苷酸序列可以包括被示出为被工程化为在人细胞中进行表达的密码子优化的核酸序列。
本发明还提供了核酸序列，其包括编码CoStAR的核酸序列以及编码T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的另外的核酸序列。
所述核酸序列可以通过允许两个或更多个核酸序列共表达的序列来连接。例如，构建体可以包括内部启动子、内部核糖体进入序列(IRES)序列或编码切割位点的序列。切割位点可以是自切割的，使得在多肽产生时，所述切割位点在不需要任何外部切割活性的情况下被立即切割成离散的蛋白质。各种自切割位点是已知的，包含手足口病病毒(FMDV)和2A自切割肽。共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是内部启动子。
载体
一方面，本发明提供了一种载体，其包括本发明的核酸序列或核酸构建体。
此类载体可以用于将核酸序列或核酸构建体引入到宿主细胞中，使得其表达根据本发明的第一方面的一个或多个CoStAR，并且任选地表达一种或多种其它所关注的蛋白质(POI)，例如TCR或CAR。载体可以是例如质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。
本发明的核酸也可以用于使用标准基因递送方案来进行核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域是已知的。参见例如，美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，所述美国专利通过引用以其整体并入本文。
衍生自如慢病毒等逆转录病毒的载体是适于实现长期基因转移的工具，因为其允许一个或多个转基因的长期稳定整合以及其在子细胞中的繁殖。载体可能能够转染或转导包含T细胞或NK细胞的淋巴细胞。本发明还提供了本发明的核酸插入在其中的载体。编码CoStAR和任选地TCR或CAR的天然核酸或合成核酸的表达通常通过将编码CoStAR和TCR/CAR多肽或其部分的核酸与一个或多个启动子可操作地连接，并且将构建体掺入到表达载体内来实现。
另外的启动子元件，例如，增强子，调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是许多启动子最近已显示出也在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。
合适的启动子的一个实例为即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包含但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、MSCV启动子、MND启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
载体可以适于复制和整合在真核细胞中。典型的克隆载体含有用于调节期望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。病毒载体技术在本领域是众所周知的，并且例如在Sambrook等人(2001《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York))和其它病毒学和分子生物学手册中(还参见WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利第6,326,193号)中描述。在一些实施例中，表达的构建体如SEQ ID NO:32-65和67-79中示出。在一些实施例中，核酸是允许在单个启动子的控制下表达多个转基因(例如，CoStAR和TCR和/或CAR等)的多顺反子构建体。在一些实施例中，转基因(例如，CoStAR和TCR和/或CAR等)通过自切割2A肽分离。可用于本发明的核酸构建体的2A肽的实例包含F2A、P2A、T2A和E2A。在本发明的其它实施例中，本发明的核酸构建体为多顺反子构建体，其包括：两个启动子，即一个驱动CoStAR的表达启动子以及另一个驱动TCR或CAR的表达的启动子。在一些实施例中，本发明的双启动子构建体为单向的。在其它实施例中，本发明的双启动子构建体为双向的。为了评估CoStAR多肽或其部分的表达，要引入到细胞中的表达载体还可以含有可选标志基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或转导的细胞的群体中鉴定和选择表达细胞。
细胞的来源
在扩增和基因修饰之前，从受试者获得细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)的来源。术语“受试者”旨在包含其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包含人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。可以从多个来源获得T细胞，包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
一方面，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞可以在中可以收获、维持和容易转移T细胞的单采中心和细胞储存设施收集。T细胞可以冷冻保存并储存以供以后使用。可接受的储存持续时间可以进行确定和验证，并且可以为至多6个月、至多一年或更长。
另一方面，将肿瘤浸润细胞(TIL)从肿瘤中分离和/或扩增，例如通过片段化、解剖化或酶消化的肿瘤活检或质量。TIL可以使用肿瘤活检作为起始材料在两阶段过程中产生：阶段1(总体上在2-3个小时内进行)，即使用解剖、酶消化和均质化来产生单细胞悬浮液的肿瘤材料的初始收集和处理，所述单细胞悬浮液可以直接冷冻以使用于后续制造的起始材料稳定，以及阶段2，其可以在在几天或几年后发生。阶段2可以在4周内进行，其可以是连续过程，开始于使阶段1的产物解冻和使TIL生长到肿瘤起始材料之外(约2周)，之后是TIL细胞快速扩增(约2周)以增加细胞量并且因此增加剂量的过程。TIL可以在调配成液态细胞悬浮液之前浓缩并洗涤。
TIL群体可以在收集后的任何点进行转导。在某些实施例中，将冷冻保存的TIL群体在解冻后进行转导以表达CoStAR。在某些实施例中，将TIL群体在从肿瘤起始材料中向外生长或初始扩张期间进行转导以表达CoStAR。在某些实施例中，将TIL群体以在REP期间，例如但不限于REP的约第8天至约第10天进行转导以表达CoStAR。示例性TIL制备描述于申请人的于2019年12月20日提交的美国专利申请序列号62/951,559。
T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，一方面，T细胞通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠粒，如
Figure BDA0004121244240000431
M-450 CD3/CD28 T一起温育，持续足以阳性选择期望的T细胞的时间段来进行分离。一方面，时间段为约30分钟。在另外的方面，时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的方面，时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在又另一优选方面，时间段为10小时至24小时。一方面，温育时间段为24小时。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，可以使用更长的温育时间分离T细胞，如从肿瘤组织或免疫受损的个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。进一步地，使用更长的温育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或降低珠粒与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以优先选择在培养起始时或在该过程期间的其它时间点的T细胞的亚群。另外，通过增加或降低珠粒或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以优先选择在培养起始时或在其它期望时间点的T细胞的亚群。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮次的选择。在某些方面，可能期望的是执行选择程序并且在激活和扩增过程中使用“未经选择的”细胞。“未经选择的”的细胞也可以进行另外轮次的选择。
通过阴性选择富集T细胞群体可以用针对经阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或细胞选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能期望的是富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、CD137、PD1、TIM3、LAG-3、CD150和FoxP3+的调节T细胞。可替代地，在某些方面，T调节细胞被抗CD25缀合的珠粒或其它类似的选择方法耗竭。
本文所述的方法可以包含例如使用例如阴性选择技术选择免疫效应细胞，例如T细胞的特定亚群，所述亚群为T调节细胞耗竭的群体、CD25+耗竭的细胞，例如本文所述的。优选地，T调节耗竭的细胞的群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
与靶抗原特异性结合的CoStAR效应细胞的特定亚群可以通过阳性选择技术而富集。例如，在一些实施例中，效应细胞通过与靶抗原缀合的珠粒一起温育而富集足以阳性选择期望的abTCR效应细胞的时间段。在一些实施例中，时间段为约30分钟。在一些实施例中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长(包含这些值之间的所有范围)。在一些实施例中，时间段为至少一小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施例中，时间段为10小时至24小时。在一些实施例中，温育时间段为24小时。为了分离异质细胞群体中以低水平存在的效应细胞，使用更长的温育时间，如24小时，可以增加细胞产率。在与其它细胞类型相比效应细胞很少的任何情况下，可以使用更长的温育时间来分离效应细胞。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮次的选择。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤之后冷冻。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在此上下文中将是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS、或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖的培养基、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO、或31.25％勃脉力A(Plasmalyte-A)、31.25％右旋糖5％、0.45％ NaCl、10％右旋糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO或含有例如Hespan和勃脉力A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并且以液氮储存罐的气相形式储存。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃下或在液氮中的立即不受控冷冻。
同种异体CoStAR
在本文所述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如缺乏内源T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)的表达的同种异体T细胞，例如HLA I类和/或HLA II类。
缺乏功能性内源TCR的T细胞可以例如被工程化为使得其不在其表面上表达任何功能性TCR，被工程化为使得其不表达包括功能性TCR的一个或多个亚基(例如，被工程化为使得其不表达(或表现出减少表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)或被工程化为使得其在其表面上产生很少的功能性TCR。可替代地，T细胞可以例如通过表达TCR的亚基中的一个或多个亚基的突变或截短形式来表达显著受损的TCR。术语“显著受损的TCR”意指此TCR不会在宿主中引发不利免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如被工程化为使得其不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以被工程化为使得细胞表面表达HLA，例如HLA1类和/或HLA II类，被下调。在一些方面，HLA的下调可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现。
在一些实施例中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLAII类。缺乏功能性TCR和/或HLA的表达的经修饰的T细胞可以通过任何合适的方式获得，包含敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包含使用siRNA、shRNA、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制分子的细胞，例如通过本文所述的任何方法进行工程化的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制分子的细胞，例如，可以降低表达CoStAR的细胞安装免疫效应子应答的能力的细胞。抑制分子的实例包含PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、Gal9、腺苷和TGFRβ。对抑制分子进行抑制，例如通过以DNA、RNA或蛋白质水平进行抑制，可以优化表达CAR的细胞性能。在实施例中，可以使用抑制性核酸(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)，例如本文所述。
使用siRNA或shRNA来抑制内源TCR或HLA
在一些实施例中，TCR表达和/或HLA表达可以在T细胞中使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA和/或本文所述的抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、Gal9、腺苷和TGFRβ)得到抑制。
siRNA和shRNA在T细胞中的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。下调TCR的组分的表达的示例性shRNA描述于例如美国公开：第2012/0321667号中。下调HLA I类基因和/或HLA II类基因的表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如美国公开：第US 2007/0036773号中。
用于抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“用于抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列的集合或包括此类重复序列的集合的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可以用于使TCR和/或HLA基因和/或本文所述的抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ)沉默或突变。
天然存在的CRISPR/Cas系统存在于大约40％经测序的真细菌基因组(eubacteriagenome)和90％经测序的古生菌(archaea)中。Grissa等人(2007)《BMC生物信息学(BMCBioinformatics)》8:172。此系统是一种类型的原核免疫系统，其赋予对如质粒和噬菌体等外来遗传元件的抗性，并且提供获得性免疫形式。Barrangou等人(2007)《科学(Science)》315:1709-1712；Marragini等人(2008)《科学》322:1843-1845。
T细胞的激活和扩增
T细胞可以使用如下所述的方法来总体上激活和扩增：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开第20060121005号。
一般来说，本发明的T细胞可以通过与表面接触而扩增，所述表面具有与其连接的试剂和配体，所述试剂刺激CD3/TCR复合体相关信号，所述配体刺激T细胞的表面上的共刺激分子。具体地，T细胞群体可以如本文所述被刺激，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触或通过与和钙离子载体结合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触。为了在T细胞的表面上共刺激辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，可以使T细胞的群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适合刺激T细胞的增殖的条件下接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包含可以用作本领域通常已知的其它方法的9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松市的Diaclone公司(Diaclone,Besancon,France)(Berg等人,《移植程序(Transplant Proc.)》30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190(9)；13191328,1999；Garland等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol Meth.)》227(l-2):53-63,1999)。
在一些实施例中，扩增可以使用本领域的技术人员已知的烧瓶或容器或气体可渗透容器进行，并且可以进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天、约7天至约14天、约8天至约14天，约9天至约14天、约10天至约14天、约11天至约14天、约12天至约14天或约13天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可以进行约14天。
在某些实施例中，扩增可以在存在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)的情况下使用非特异性T细胞受体刺激来进行。非特异性T细胞受体刺激物可以包含例如抗CD3抗体，如约30ng/ml的OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可从新泽西州拉里坦的OrthoMcNeil公司(OrthoMcNeil)或加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech,Auburn,Calif.)商购获得)或UHCT-1(可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的百进公司商购获得)。CoStAR细胞可以任选地在存在T细胞生长因子，如300IU/mL IL-2或IL-15的情况下通过包含癌症的一种或多种抗原，包含其抗原部分，如表位，来在体外扩增，所述抗原可以任选地由载体，如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如，0.3.mu.M MART-1:26-35(27L)或gpl00:209-217(210M)表达。其它合适的抗原可以包含例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。CoStAR细胞还可以通过用在表达HLA-A2的抗原呈递细胞上进行脉冲的癌症的相同抗原再刺激而快速扩增。可替代地，CoStAR细胞可以用例如示例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激。在一些实施例中，刺激作为扩增的一部分发生。在一些实施例中，扩增在存在经照射的自体淋巴细胞的情况下或通过经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2发生。
在某些实施例中，细胞培养基包括IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包括约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL或介于1000IU/mL与2000IU/mL之间、介于2000IU/mL与3000IU/mL之间、介于3000IU/mL与4000IU/mL之间、介于4000IU/mL与5000IU/mL之间、介于5000IU/mL与6000IU/mL之间、介于6000IU/mL与7000IU/mL之间、介于7000IU/mL与8000IU/mL之间或介于8000IU/mL之间的IL-2。
在某些实施例中，细胞培养基包括OKT3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包括约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL、约1μg/mL或介于0.1ng/mL与1ng/mL之间、介于1ng/mL与5ng/mL之间、介于5ng/mL与10ng/mL之间、介于10ng/mL与20ng/mL之间、介于20ng/mL与30ng/mL之间、介于30ng/mL与40ng/mL之间、介于40ng/mL与50ng/mL或介于50ng/mL与100ng/mL之间的OKT3抗体。
在某些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为扩增期间的组合。在一些实施例中，可以在扩增期间将IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合包含在内。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为扩增期间的组合。在一些实施例中，可以将IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合包含在内。
在某些实施例中，扩增可以在补充的细胞培养基中进行，所述补充的细胞培养基包括IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。
在某些实施例中，扩增培养基包括约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15或约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15或约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15或约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15或约200IU/mL的IL-15或约180IU/mL的IL-15。
在一些实施例中，扩增培养基包括约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21、或约0.5IU/mL的IL-21、或约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21或约2IU/mL的IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包括约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一实施例中，CoStAR细胞与PBMC和/或抗原呈递细胞在扩增中的比率为约1至25、约1至50、约1至100、约1至125、约1至150、约1至175、约1至200、约1至225、约1至250、约1至275、约1至300、约1至325、约1至350、约1至375、约1至400或约1至500、或介于1至50与1至300之间、或介于1至100与1至200之间。
在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，所述试剂可以与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。可替代地，一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂处于溶液中。一方面，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或与表面偶联。在某些方面，两种试剂都可以在溶液中。一方面，试剂可以呈可溶形式，并且然后可以与表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或将与试剂结合的其它结合剂交联。在这方面，参见例如针对人工抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公开第20040101519号和第20060034810号，所述aAPC被设想为用于激活和扩增本发明中的T细胞。
一方面，两种试剂固定在珠粒上，或位于同一珠粒上，即“顺式”，或单独的珠粒上，即“反式”。举例来说，提供初级活化信号的试剂为抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂为抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以等效分子量共固定到同一珠粒上。一方面，使用与用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长的珠粒结合的1:1比率的每种抗体。在本发明的某些方面，使用与珠粒结合的一定比率的抗CD3:CD28抗体，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增增加。在一个特定方面，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1倍至约3倍的增加。一方面，与珠粒结合的CD3:CD28抗体的比率的范围为100:1至1:100，以及其间的所有整数值。在本发明的一方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于一。在本发明的某些方面，与珠粒结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定方面，使用与珠粒结合的1:100CD3:CD28比率的抗体。一方面，使用与珠粒结合的1:75 CD3:CD28比率的抗体。在另外的方面，使用与珠粒结合的1:50 CD3:CD28比率的抗体。一方面，使用与珠粒结合的1:30 CD3:CD28比率的抗体。在一个优选方面，使用与珠粒结合的1:10 CD3:CD28比率的抗体。一方面，使用与珠粒结合的1:3 CD3:CD28比率的抗体。在又一个方面，使用与珠粒结合的3:1 CD3:CD28比率的抗体。
可以使用1:500至500:1以及两者之间的任何整数值的颗粒与细胞的比率来刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域的普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠粒仅可以与很少细胞结合，而较大珠粒可以与许多细胞结合。在某些方面，细胞与颗粒的比率的范围为1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在另外的方面，所述比率包括1:9至9:1以及期间的任何整数值，还可以用于刺激T细胞。引起T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联的颗粒与T细胞的比率可以如上所述变化，然而某些优选值包含1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选比率为每个T细胞至少1:1颗粒。一方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个特定方面，优选颗粒:细胞比率为1:5。在另外的方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激的天数而变化。例如，一方面，颗粒与细胞的比率在第一天为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天以1:1至1:10的最终比率(基于添加当天的细胞计数)向细胞中添加另外的颗粒持续至多10天。在一个特定方面，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1:5。一方面，基于刺激的第一天1:1的最终比率以及刺激的第三天和第五天1:5的最终比率，每天或每隔一天添加颗粒。一方面，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1:10。一方面，基于刺激的第一天1:1的最终比率以及刺激的第三天和第五天1:10的最终比率，每天或每隔一天添加颗粒。本领域的技术人员将理解，各种其它比率可以适用于本发明。具体地，比率将根据粒度以及细胞大小和类型而变化。一方面，供使用的最典型比率在第一天为1:1、2:1和3:1附近。
在本发明的另外方面，将细胞，如T细胞，与试剂包被的珠粒组合，随后将珠粒和细胞分离，并且然后培养细胞。在替代方面，在培养之前，试剂包被的珠粒和细胞未进行分离而是一起培养。在另外的方面，将珠粒和细胞首先通过施加力，如磁力来浓缩，从而使细胞表面标志物的连接增加，由此诱导细胞刺激。
制备CoStAR细胞
可以使用基于病毒和非基于病毒的基因工程化工具以产生CoStAR细胞，包含但不限于T细胞、NK细胞，从而引起治疗基因的永久表达或瞬时表达。基于逆转录病毒的基因递送是一项成熟的具有良好特征的技术，所述技术已被用于将CAR永久性地整合到宿主细胞基因组中(Scholler J.,例如，逆转录病毒修饰的嵌合抗原受体T细胞的十年安全性和功能(e.g.Decade-long safety与function of retroviral-modified chimeric antigenreceptor T cells.)《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》2012；4:132ra53；RosenbergS.A.等人,基因转移到人体中—使用通过逆转录病毒基因转导修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞对患有晚期黑色素瘤的患者的免疫治疗(Gene transfer into humans—immunotherapyof patients with advanced melanoma,using tumor-infiltrating lymphocytesmodified by retroviral gene transduction.)《新英格兰医学期刊(N.Engl.J.Med.)》1990；323:570-578)。
还可以使用非病毒DNA转染方法。例如，Singh等人描述了被开发成对CAR T细胞进行工程化的睡美人(SB)转座子系统的用途(Singh H.等人,使用睡美人系统再定向CD19的T细胞群体的特异性(Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 usingthe Sleeping Beauty system.)《癌症研究(Cancer Res.)》2008；68:2961-2971)并且在临床试验中使用(参见例如，ClinicalTrials.gov:NCT00968760和NCT01653717)。同一技术适用于对CoStAR细胞进行工程化。
已使用了多种SB酶以递送转基因。Mates描述了与第一代转座酶相比，效率增强为大约100倍的高度活跃的转座酶(SB100X)。SB100X支持富集在造血干细胞或祖细胞中的人CD34(+)细胞中的35-50％稳定基因转移(Mates L.等人,新颖的高度活跃的睡美人转座酶的分子进化在脊椎动物中实现了稳健稳定的基因转移(Molecular evolution of a novelhyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transferin vertebrates.)《自然遗传学(Nat.Genet.)》2009；41:753-761)，并且多个转基因可以从多顺反子单质粒(例如，Thokala R.等人,使用睡美人系统再定向T细胞的特异性以通过混合和匹配靶向CD123+肿瘤的VL结构域和VH结构域来表达嵌合抗原受体(Redirectingspecificity of T cells using the Sleeping Beauty system to express chimericantigen receptors by mix-and-matching of VL and VH domains targeting CD123+tumors.)《公共科学图书馆综合(PLoS ONE.)》2016；11:e0159477)或者多质粒(例如，Hurton L.V.等人,拴系IL-15增强抗肿瘤活性并且促进肿瘤特异性T细胞中的干细胞记忆子集(Tethered IL-15augments antitumor activity与promotes a stem-cell memorysubset in tumor-specific T cells.)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》2016；113:E7788-E7797)递送。此类系统与本发明的CoStAR一起使用。
Morita等人描述了用于整合更大转基因piggyBac转座子系统(Morita D.等人,抗CD19嵌合抗原受体在piggyBac转座子工程化的T细胞中的增强的表达(Enhancedexpression of anti-CD19 chimeric antigen receptor in piggyBac transposon-engineered T cells.)《分子疗法方法和临床开发(Mol.Ther.Methods Clin.Dev.)》2017；8:131-140)，Nakazawa等人描述了用于生成表达HER2特异性嵌合抗原受体的EBV特异性细胞毒T细胞的系统的用途(Nakazawa Y等人,使用表达HER2特异性嵌合抗原受体的EBV特异性细胞毒性T细胞的PiggyBac介导的癌症免疫疗法(PiggyBac-mediated cancerimmunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specificchimeric antigen receptor.)《分子疗法(Mol.Ther.)》2011；19:2133-2143)。Manuri等人使用了用于生成CD-19特异性T细胞的系统(Manuri P.V.R.等人,用于生成CD19特异性T细胞以治疗B系恶性肿瘤的piggyBac转座子/转座酶系统(piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.)《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》2010；21:427-437)。
转座子技术简单且经济。一个潜在缺点是目前采用的较长扩增方案可能导致T细胞分化、活性受损并且所输注的细胞的持久性差。Monjezi等人描述了通过效率更高的整合来最小化这些困难的发展微型循环载体(Monjezi R.等人,使用来自微循环载体的非病毒睡美人转位增强的CAR T细胞工程化(Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.)《白血病(Leukemia.)》2017；31:186-194)。这些转座子技术可以用于本发明的CoStAR。
药物组合物
本发明还涉及一种药物组合物，其含有本发明的载体或表达CoStAR的细胞连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及任选地一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。
在一些实施例中，提供了一种药物组合物，其包括上文所述的CoStAR和药学上可接受的载体。在一些实施例中，提供了一种药物组合物，其包括编码根据上述实施例中的任何实施例的CoStAR的核酸和药学上可接受的载体。在一些实施例中，提供了一种药物组合物，其包括表达上述CoStAR的效应细胞和药学上可接受的载体。此类调配物可以例如呈适于静脉内输注的形式。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理上相容的”是指非生物学上或其它方面不期望的材料，例如，所述材料可以掺入到施用于患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不期望的生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的组合物中的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载剂或赋形剂优选地符合毒理学和制造测试的所需标准和/或包含在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)编写的《非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)》中。
本发明的一方面提供了表达重组CoStAR的经修饰的T细胞的群体。合适的群体可以通过上述方法产生。
经修饰的T细胞的群体可以用作药物。例如，如本文所述的经修饰的T细胞的群体可以用于癌症免疫疗法，例如过继性T细胞疗法。
本发明的其它方面提供了如本文所述的经修饰的T细胞的群体用于制造用于治疗癌症的药物、如本文所述的经修饰的T细胞的群体用于治疗癌症的用途，并且癌症治疗方法可以包括向有需要的个体施用如本文所述的经修饰的T细胞的群体。
经修饰的T细胞的群体可以是自体的，即，经修饰的T细胞最初是从与其随后施用于的个体相同的个体(即供体个体和接受者个体是相同的)获得的。用于施用于个体的经修饰的T细胞的合适群体可以通过包括提供从个体获得的T细胞的初始群体、修饰T细胞以表达cAMP PDE或其片段和与个体的癌细胞特异性结合的抗原受体以及培养经修饰的T细胞的方法产生。
经修饰的T细胞的群体可以是同种异体的，即经修饰的T细胞最初是从与其随后施用于的个体的不同的个体获得的(即，供体个体和接受者个体是不同的)。供体个体和接受者个体可以进行HLA匹配以避免GVHD和其它不期望的免疫效应。用于施用于接受者个体的经修饰的T细胞的合适群体可以通过包括提供从供体个体获得的T细胞的初始群体、修饰T细胞以表达与接受者个体的癌细胞特异性结合的CoStAR以及培养经修饰的T细胞的方法产生。
在施用经修饰的T细胞之后，接受者个体可以表现出针对接受者个体的癌细胞的T细胞介导的免疫应答。这对个体的癌症病状可能具有有益作用。
癌症病状的特征可以在于恶性癌细胞的异常增殖，并且可以包含：白血病，如AML、CML、ALL和CLL；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；以及实体癌症，如肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、子宫颈癌、肝癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌以及未知原发性癌症(CUP)。
个体的癌细胞与个体中的正常体细胞可以在免疫上不同(即，癌症肿瘤可以是免疫原性的)。例如，癌细胞可能能够在个体中引发针对由癌细胞表达的一种或多种抗原的全身免疫应答。引发免疫应答的肿瘤抗原可以对癌细胞具有特异性的，或者可以由个体中的一个或多个正常细胞共享。
适于如上所述的治疗的个体可以是哺乳动物，如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长类动物、类人猿(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、星星、长臂猿)或人。
在优选实施例中，受试者为人。在其它优选实施例中，可以采用非人哺乳动物，特别是常规用作用于展示在人体内的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，鼠科动物、灵长类动物、猪科动物、犬科动物或兔动物)。
治疗方法
术语“治疗有效量”是指本文所公开的CoStAR或包括CoStAR的组合物有效“治疗”个体的疾病或病症的量。在癌症的情况下，本文所公开的CoStAR或包括CoStAR的组合物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小或重量；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在本文公开的CoStAR或包括CoStAR的组合物可以防止现有癌细胞的生长和/或杀伤所述癌细胞的程度上，其可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一些实施例中，治疗有效量为生长抑制量。在一些实施例中，治疗有效量为改善患者的无进展存活的量。在如病毒感染等传染病的情况下，本文公开的CoStAR或包括CoStAR的组合物的治疗有效量可以减少被病原体感染的细胞的数量；减少病原体衍生的抗原的产生或释放；抑制(即，在某种程度上减慢并且优选地停止)病原体扩散至未感染的细胞；和/或在某种程度上缓解与感染相关的一种或多种症状。在一些实施例中，治疗有效量为延长患者的存活的量。
表达供当前方法使用的CoStAR的细胞，包含T细胞和NK细胞，可以离体地由患者自身的外周血(自体)产生，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物的环境中(同种异体)产生或在来自未连接的供体的外周血中(同种异体)产生。可替代地，T细胞或NK细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞对T细胞或NK细胞的离体分化。在这些情况下，表达CoStAR以及任选地CAR和/或TCR的T细胞是通过引入编码CoStAR以及任选地CAR和/或TCR的DNA或RNA，通过许多手段之一产生的，所述许多手段包含用病毒载体进行转导、用DNA或RNA进行转染。
表达本发明的CoStAR并且任选地表达TCR和/或CAR的T细胞或NK细胞可以用于治疗血液癌或实体瘤。
一种用于治疗疾病的方法涉及本发明的载体或细胞，包含T细胞或NK细胞的治疗用途。就此而言，可以将载体或T细胞或NK细胞施用于患有现有疾病或病状的受试者，以便减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。本发明的方法可以引起或促进T细胞介导的癌细胞杀伤。可以将根据本发明的载体或T细胞或NK细胞与一种或多种另外的治疗剂一起施用于患者。一种或多种另外的治疗剂可以共施用于患者。“共施用”意指将一种或多种另外的治疗剂和本发明的载体或T细胞或NK细胞在足够接近的时间内施用，使得载体或T细胞或NK细胞可以增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。就此而言，可以首先施用载体或细胞，并且其次可以施用一种或多种另外的治疗剂，反之亦然。可替代地，载体或细胞以及一种或多种另外的治疗剂可以同时施用。可能有用的一种共施用的治疗剂为IL-2，因为这目前在现有细胞疗法中用于增强所施用的细胞的活性。然而，IL-2治疗与毒性和耐受性问题相关。
如所提及的，为了施用于患者，CoStAR效应细胞对于患者可以是同种异体的或自体的。在某些实施例中，同种异体细胞例如通过基因编辑被进一步基因修饰成最小化或预防GVHD和/或患者的针对CoStAR细胞的免疫应答。
CoStAR效应细胞用于治疗与靶抗原相关的癌症和肿瘤疾病。可以使用本文所述的方法中的任何方法治疗的癌症和肿瘤疾病包含未血管化或尚未显著血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(如血液肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。要用本发明的CoStAR效应细胞治疗的癌症的类型包含但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包含在内。
血液癌是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌的实例包含白血病，包含急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
瘤是通常不含有囊肿或液体区的异常组织肿块。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤因形成其的细胞的类型(如肉瘤、癌和淋巴瘤)而命名。实体瘤的实例，如肉瘤和癌，包含肾上腺皮质癌、胆管癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、结肠癌、胃癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺癌(例如、甲状腺髓样癌和甲状腺乳头状癌)、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌(例如、宫颈癌和侵入前颈部发育不良)、结直肠癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌(例如、鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌和纤维肉瘤)、阴茎癌、口咽癌、食管癌、头癌(例如、鳞状细胞癌)、颈癌(例如、鳞状细胞癌)、睾丸癌(例如，精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸形肿瘤、绒毛膜癌、肉瘤、莱迪希细胞瘤(Leydig celltumor)、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤和脂肪瘤)、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、子宫癌(例如、子宫内膜癌)、尿路上皮癌(例如，鳞状细胞癌、过渡性细胞癌、腺癌、输尿管癌和尿膀胱癌)以及CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也被称为多形胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，要施用的本发明的组合物的精确量可以由医师在考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度方面的个体差异以及患者(受试者)的病状的情况下进行确定。通常可以说，包括本文所述的T细胞的药物组合物可以以104个至109个细胞/kg体重，在一些情况下，105个至106个细胞/kg体重施用，包含那些范围内的所有整数值的剂量。还可以按这些剂量多次施用T细胞组合物。细胞可以通过使用免疫疗法中已知的输注技术来施用(参见例如，Rosenberg等人,《新英格兰医学杂志》319:1676,1988)。
组合疗法
本文描述的表达CoStAR的细胞可以与其它已知药剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意味着在受试者患有病症的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已经被诊断为患有所述病症之后并且在所述病症已经治愈或消除或治疗由于其它原因已经停止之前递送所述两种或更多种治疗。在一些实施例中，对一种治疗的递送在对第二治疗的递送开始时仍然发生，使得在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其它实施例中，对一种治疗的递送在对另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施例中，治疗由于组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如，在较少的第二治疗的情况下看到相当的效果，或者相比于在不存在第一治疗的情况下施用第二治疗的情形下将看到的程度，第二治疗在更大程度上减少症状，或者在第一治疗的情况下看到类似情形。在一些实施例中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送的一种治疗将观察到的减少。两种治疗的作用可以是部分加性的、完全加性的或大于加性的。递送可以使得在递送第二治疗时仍然可检测到所递送的第一治疗的最用。
本文所述的表达CoStAR的细胞和至少一种另外的治疗剂可以在相同或单独的组合物中同时施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的表达CAR的细胞，并且可以其次施用另外的药剂，或者施用顺序可以颠倒。
CoStAR疗法和/或其它治疗剂、手术或模态可以在病症活跃期间，或在疾病缓解或疾病不太活跃期间施用。CoStAR疗法可以在另一种治疗之前、与所述治疗同时、治疗后或在病症缓解期间施用。
在组合施用时，疗法和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部均可以以比单独使用的每种药剂，例如作为单一疗法的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，CoStAR疗法、另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部的施用量或剂量比单独使用的每种药剂，例如作为单一疗法的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实施例中，CoStAR疗法、另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部的量或剂量比用于实现相同的治疗作用所需的单独使用的每种药剂，例如作为单一疗法的量或剂量低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在另外的方面，本文所述的表达CoStAR的细胞可以与外科手术、化疗、辐射、免疫抑制剂(如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506)、抗体或其它免疫清除剂(如CAMPATH)、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和照射、肽疫苗，如Izumoto等人2008《神经外科杂志(JNeurosurg)》108:963-971中所述的肽疫苗组合用于治疗方案。
在某些情况下，本发明的化合物与其它治疗剂组合，如其它抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛剂、细胞保护剂以及其组合。
在一个实施例中，本文所述的表达CoStAR的细胞可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包含蒽环类(例如，多柔比星(doxorubicin)(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine))、烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫细胞抗体(例如，阿伦单抗(Alemtuzamab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(Brentuximab))、抗代谢物(包含，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨(fludarabine)))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A(aclacinomycin A)、胶霉毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))、免疫调节剂，如沙利度胺(thalidomide)或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺(lenalidomide))。
考虑用于组合疗法的一般化学治疗剂包含白消安(busulfan，
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)、白消安注射剂/>
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克拉屈滨(cladribine，/>
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阿糖胞苷脂质体注射剂
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盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride，/>
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地塞米松(dexamethasone)、盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride，/>
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)、依托泊苷(etoposide，
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)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate，/>
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伊达比星/>
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米托蒽醌(mitoxantrone，/>
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)、奥加吉妥单抗(Gemtuzumab Ozogamicin，/>
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)。
在实施例中，考虑用于组合疗法的一般化学治疗剂包含阿那曲唑(anastrozole，
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)、比卡鲁胺(bicalutamide，/>
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)、硫酸博来霉素(bleomycinsulfate，/>
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)、白消安/>
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白消安注射剂/>
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卡培他滨(capecitabine，/>
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)、N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶、卡铂(carboplatin，
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)、卡莫司汀(carmustine，/>
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)、苯丁酸氮芥(chlorambucil，
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)、顺铂(cisplatin，/>
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环磷酰胺(
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)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯苷/>
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达卡巴嗪(dacarbazine，/>
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)、放线菌素D(dactinomycin，Actinomycin D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素/>
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柠檬酸柔红霉素脂质体注射剂/>
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地塞米松、多西他赛(docetaxel，/>
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)、盐酸多柔比星/>
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依托泊苷/>
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磷酸氟达拉滨
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5-氟尿嘧啶/>
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氟他胺/>
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替扎西滨(tezacitibine)、吉西他滨(Gemcitabine，二氟脱氧西替丁)、羟基脲/>
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伊达比星/>
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异环磷酰胺/>
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伊立替康(irinotecan，/>
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)、L-天冬酰胺酶/>
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亚叶酸钙、美法仑/>
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6-巯基嘌呤/>
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甲氨蝶呤/>
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麦塔罗(mylotarg)、紫杉醇
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phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他汀(pentostatin)、具有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20/>
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柠檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate，/>
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)、替尼泊苷(teniposide，/>
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)、6-硫鸟嘌呤、噻替哌(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine，
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)、注射用盐酸拓扑替康(topotecan hydrochloride for injection，
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)、长春花碱/>
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长春新碱/>
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和长春瑞滨
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治疗可以通过例如肿瘤消退、肿瘤重量或大小缩小、至进展的时间、存活持续时间、无进展存活、总应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。可以采用用于确定疗法的功效的方法，包含例如通过放射成像测量应答。
序列
以下序列包含完整的CoStAR和CoStAR组分，并且是非限制性的。组分包含信号肽(SP)、结合结构域(BD)、接头、间隔子和跨膜结构域(STM)、无胞外序列或胞内序列的CD28跨膜片段(STM-CD28TM)、胞内信号结构域(SD)以及CD40结构域和基序。SEQ IDNO:33-108包括具有N末端信号肽的CoStAR。全蛋白内的组分位置可以从GenBank和其它来源确认。构建体和组分对于精确大小和范围是说明性的，并且组分可以来自多于一个来源。当存在多于一个胞内信号传导结构域或信号传导片段时，多个结构域可以按任何次序排列。应当理解，虽然某些蛋白质在表达时可以包括N末端信号肽，但那些信号肽是切割的并且在蛋白质进行表达时可能被不精确地切割，并且信号肽从其中去除的所产生的蛋白质包括在N末端氨基酸的位置处具有至多约五个氨基酸的变异的结合结构域。
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尽管已经对本发明以及其优点进行了详细说明，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求书定义的本发明的精神和范围的情况下，本文可以作出各种改变、替换和替代。
本发明将在以下实例中进一步说明，所述实例仅出于说明目的给出，并且不旨在以任何方式限制本发明。
实例
实例1-产生表达CoStAR的T细胞
材料和方法
构建体设计-MFE23 CoStAR由MFE23衍生的单链抗体片段核苷酸序列以及与整个人CD28核酸序列融合的制瘤素M1前导序列组成。由金唯智公司(Genewiz Inc.)对CoStAR核苷酸序列进行了密码子优化和基因合成。通过XbaI和NheI位点将构建体克隆到pSF.Lenti(牛津遗传学公司(Oxford Genetics))中。
慢病毒产生-使用三质粒包装系统(美国圣地亚哥的细胞生物实验室(CellBiolabs,San Diego,USA))通过将10μg每种质粒加上10μg含有转基因的pSF.Lenti慢病毒质粒一起在含有50mM CaCl2的无血清RPMI中混合进行慢病毒产生。将混合物逐滴添加到含50％汇合单层的293T细胞的75cm2烧瓶中的中。在转染后48小时和72小时收集病毒上清液，根据制造商的说明书使用LentiPac慢病毒上清液浓缩(美国马里兰州罗克维尔的GeneCopoeia公司(GeneCopoeia,Rockville,Maryland,USA))溶液汇集和浓缩病毒上清液。将慢病毒上清液浓缩10倍，并且用于在存在4μg/ml聚凝胺(英国多赛特的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Dorset,UK))的情况下直接感染原代人T细胞。从正常健康供体中分离外周血单核细胞，之后根据制造商的说明书用T细胞激活和扩增珠粒(英杰公司(Invitrogen))激活24小时，然后添加慢病毒上清液。
在感染后96小时使用CEA.hFc蛋白和抗hFc-PE二级抗体加抗CD34-APC或通过单独的抗CD34-PE抗体评估细胞转导。然后，使用x10供体错配的经照射的PBMC饲养细胞以1:20-1:200的比率在RPMI+10％ FCS中在添加1μg/ml PHA和200IU/ml IL-2的情况下对细胞进行进一步扩增。14天后，像先前那样对细胞进行染色，并且储存以准备用于测定。
通过将CoStAR阳性或阴性细胞与野生型或OKT3工程化的CEA阳性LoVo或LS174T细胞混合来进行功能测定。简言之，将T细胞与LoVo细胞以不同比率在96孔板中混合，并且通过ELISA进行IFNγ或IL-2测量。将其余细胞与1:10稀释的WST-1试剂(英国的西格玛公司)一起温育30分钟，然后读取450nm下的吸光度。使用以下公式＝100-((实验读数-单独的T细胞)/(单独的肿瘤))x100确定细胞毒性％。
通过以下进行增殖测定：首先在37℃下以1x107个细胞/ml的浓度向T细胞装载10μM eFluor450增殖染料(英国的eBioscience公司(eBioscience,UK))持续10分钟，然后将细胞在5个体积的冷T细胞培养基中在冰上温育5分钟。然后将细胞过度洗涤以去除未结合的染料，并且添加到含有肿瘤细胞的共培养物中。在第2天、第6天和第10天去除细胞，添加1:200稀释的DRAQ7，并且使用MACSQuant细胞仪和MACSQuantify软件对细胞进行分析。
通过从孔中取出细胞并且用抗CD2 PerCP eFluor710抗体(英国的eBioscience公司)在黑暗中染色20分钟，然后进行DRAQ7染色并且使用MACSQuant分析仪进行计数来对增殖测定进行细胞计数。
结果
从商业供应商(龙沙公司(Lonza)或NHSBT公司(NHSBT))获得的血沉棕黄层中分离出原代人T细胞。通过Ficoll介导的分离和T细胞阴性分离试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technologies))分离T细胞。用人T细胞激活和扩增珠粒(英国的英杰公司)激活分离的T细胞。将细胞与经浓缩的慢病毒颗粒一起温育并扩增若干天。慢病毒含有MFE.CoStAR.2A.tCD34构建体(与通过2A切割序列与截短的人CD34共表达的全长人CD28融合的MFE23.scFv)的DNA序列。使用如材料和方法中所概述的经照射的饲养细胞对成功转导的细胞进行了进一步扩增。供体1转导测量为22.69％(17.15CD34+/CoStAR+加5.53％CD34-/CoStAR+)，供体2测量为20.73％，并且供体3测量为13.34％。将细胞使用抗CD34抗体针对CoStAR表达而富集，以获得大于90％的CoStAR阳性的T细胞群体。
为了生成生理上相关的体外模型以测试CoStAR对T细胞活性的影响，针对CEA+肿瘤细胞系LoVo和LS174T对未经转导的细胞和经转导的细胞进行了测试。为了响应于不匹配的肿瘤系而实现T细胞的激活，将肿瘤细胞工程化为表达通过合成跨膜结构域锚定到细胞膜并且使用IRES元件从GFP标志基因分裂的抗CD3单链抗体片段，从而使用流式细胞术来使经转导的细胞可视化。
由散装转染子生成LoVo和LS174T的单细胞克隆。将未经转导的和CoStAR转导的T细胞与野生型未经转导的或OKT3工程化的LS174T或LoVo细胞以不同的效应子:靶比率混合。24小时后，取共培养培养基以进行IL-2ELISA测量。从来自三个供体的CoStAR+和CoStAR-T细胞群体两者中观察到激活依赖性IL-2响应于OKT3工程化的LS174T细胞分泌，其中从经转导的和未经转导的T细胞中看到仅背景IL-2响应于未经工程化的肿瘤细胞分泌(图3A-C)。在测试的所有三个供体中发现CoStAR增强的IL-2对OKT3工程化的肿瘤细胞的分泌。在8:1和16:1的E:T比率下，效应最明显，并且在较高E:T比率下，IL-2分泌太低，以至于无法准确测量。在低效应子与靶比率下，似乎IL-2分泌从未经转导的细胞中饱和。这些观察结果在LoVo细胞中重复，其中针对LS174T对三个供体中的两个供体进行测试，结果相似(图3D和E)。
为了确定CoStAR对T细胞扩增的影响，将经转导的或未经转导的T细胞与野生型或OKT3-GFP工程化的LoVo细胞混合，对3天后总细胞的数量进行计数。在存在IL-2的情况下(图4A)和不存在IL-2的情况下(图4B)，CoStAR响应于LoVo-OKT3而不是野生型LoVo细胞增强了经工程化的T细胞的存活和/或增殖。为了进一步研究这种现象，在来自两个供体的T细胞中使用增殖染料进行细胞增殖分析，以对每个群体在6天内经历的细胞周期的数量进行计数(图4C和D)。与响应于LoVo-OKT3的未经工程化的细胞相比，较大比例的CoStAR工程化的细胞在6天内经历了5个、6个或7个增殖周期，而CoStAR转导的和未经转导的细胞在响应于野生型LoVo的相同持续时间内经历了平均大约2个周期。
生成了由与N末端另外的共刺激结构域融合的CD28组成的多种融合物受体。从以下获得共刺激结构域：CD137、CD2、CD29、CD134、CD150、CD40、GITR和来自IL-2受体γ链(IL-2Rγ)的信号传导结构域。包含了与对诱导型共刺激的先前研究中使用的受体接近的受体。此受体，被命名为CD28(IEV)，被截断，使得CD28的C末端基序是氨基酸三元‘IEV’。由金唯智公司从头生成序列，并且将序列与通过2A自切割肽与融合物CoStAR分离的CD34标志基因一起在EF1α启动子下克隆到慢病毒载体中。将原代CD8+T细胞使用EasySep珠粒(干细胞技术公司)分离，并且在添加慢病毒颗粒之前用抗CD3/抗CD28激活/扩增Dynabead激活。在短扩增时间段之后，将细胞与LoVo或LoVo-OKT3细胞混合，其中包含了抗CD107a抗体以及布雷菲德菌素和莫能菌素，并且在16小时温育后，用针对标志基因(CD34)的抗体以及针对IL-2、IFNγ和Bcl-xL的抗体固定并染色。使用MACSQuant分析仪和MACSQuantify软件进行了分析。图5示出了IL-2从CD34-(CoStAR未转导的)和CD34+(CoStAR转导的)中的应答。统计分析表明，测试的所有受体在携带变体CoStAR受体时诱导产生IL-2的细胞的比例显著增加。并行测量了三个其它读出：IFNγ，即在正常信号1条件下释放但通过共刺激增强的细胞因子；CD107a，即脱颗粒的标志物；以及Bcl-xL，即通过共刺激上调的抗凋亡蛋白。CoStAR的接合增强了以不同程度分析的所有效应子功能。CD28.CD2和CD28.CD40融合物受体表现出引发所测试的所有受体的最稳健应答(参见图6)。
实例2
将基于CD28和CD28.CD40的CoStAR对基于群体的细胞因子分泌的影响。将来自三个供体的原代T细胞用CD28(IEV)截短的CoStAR、全长CD28 CoStAR或CD28.CD40 CoStAR(具有如SEQ ID NO.10中所示的全长CD28但缺乏N末端N和K残基)进行转导或保持未转导。使用CD34标志基因针对CoStAR表达而富集T细胞，并且随后将扩增细胞与LoVo-OKT3细胞混合，并且通过ELISA分析IL-2分泌(参见图7)。未经转导的细胞平均产生0.80ng/ml IL-2，其中CD28(IEV)和全长CD28 CoStAR分别产生4.6ng/ml和5.0ng/ml IL-2。然而，CD28.CD40跨三个供体中平均诱导29.0ng/ml IL-2，因此证明了将CD40掺入到碱性基于CD28的CoStAR中的明显益处。
接下来分析了CoStAR对T细胞扩增的影响。将来自七个供体的T细胞用具有抗CA125(196-14)或抗叶酸受体(MOV-19)scFv的CD28或CD28.CD40 CoStAR或抗叶酸受体肽(C7)抗原结合结构域进行转导。将另外的细胞用携带作为错配对照的抗CEA scFv的CD28CoStAR进行转导。然后将细胞与被工程化为表达膜结合的OKT3(OvCAR-OKT3)的CA125+/叶酸受体+/CEA-细胞系OvCAR3混合。在7天、14天和21天后进行T细胞计数，并且在第7天和第14天添加新鲜OvCAR-OKT3。观察到携带抗CA125 scFv的细胞的有限扩增(平均扩增倍数：CD28：15.1；CD28.CD40：69.1)，然而，用scFv靶向叶酸受体的细胞确实在CD28和CD28.CD40队列两者中扩增(平均扩增倍数：CD28：186.7；CD28.CD40：1295.0)。在使用C7肽以靶向叶酸受体时看到更有限的扩增(平均扩增倍数：CD28：71.5；CD28.CD40：28.0)。对照CEA靶向受体表现出有限的扩增(平均扩增倍数：28.0)。
为了更好地了解信号1和信号2的协同作用，将T细胞用鼠恒定结构域修饰的TCR进行工程化，所述TCR在HLA-A*02以及靶向细胞表面CEA蛋白的CD28或CD28.CD40 CoStAR的背景下识别CEA肽(691-699)。作为对照，还将细胞用CA125特异性CD28 CoStAR进行了转导。将T细胞与HLA-A*02+/CEA+H508细胞混合，并且通过胞内流式细胞术染色对细胞因子产生进行分析。使用针对鼠TCRβ恒定结构域(标记TCR工程化的细胞)以及DYKDDDDK(SEQ ID NO:14)表位标签(标记CoStAR工程化的细胞)的抗体进行流式细胞术门控。因此，可以分析每个共培养孔中的TCR-/CoStAR-、TCR+/CoStAR-、TCR-/CoStAR+和TCR+/CoStAR+细胞。然后绘制CD4+或CD8+T细胞中的每个亚群中的细胞因子产生(图9)。在CD4+细胞中，CD28.CD40CoStAR将CD137和TNFα产生增强到高于单独的TCR刺激，然而由于TCR对CD8的依赖性，CD4+细胞中的TCR应答较差。在CD8+细胞中，IL-2和CD107a的效应子活性更强，特别是，在CD28.CD40CoStAR组中显示出更强的诱导。为了更好地比较受体，绘制了仅TCR+/CoStAR+组中的效应子在CD4+和CD8+细胞中的活性(图10)。在CD4+细胞中，与CEA或错配的靶向CD28的CoStAR相比，CD28.CD40显著增强了对CD137的诱导。在CD8+细胞中，与CEA或错配的靶向CD28的CoStAR相比，CD137诱导显著增加，而与对照CoStAR相比，CD107a诱导增加。因此，CD28.CD40跨广泛范围的模型和效应子活性显示出增强的效应子活性。
实例3
为了评价由携带CD40的CoStAR进行的共刺激，对原代人T细胞进行模拟物转导或用各自携带通过2A切割肽分离的CD34标志基因的MFE23.CD28 CoStAR或MFE23.CD28.CD40CoStAR进行转导。MFE23是对癌胚抗原(CEA)有高亲和力的单链Fv抗体。之后，将体外培养细胞使用MACSTM顺磁选择试剂(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))针对CD34而富集，然后使用经照射的饲养细胞使细胞的数量扩增。MFE23.CD28 CoStAR强烈介导CD34+ T细胞的扩增，并且MFE23.CD28.CD40 CoStAR进一步增强了扩增(图11)。
为了评估共刺激活性和持久性，在存在(200IU/ml)或不存在外源IL-2的情况下，将模拟物转导或用MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40转染的T细胞与LoVo-OKT3细胞以8:1效应子:靶比率共培养。在第1天、第4天、第7天、第11天和第18天，提取细胞，并且通过在MACSQuant流式细胞仪上使用抗CD2试剂枚举活T细胞的数量。在不存在由肿瘤进行的刺激和IL-2的情况下，细胞的数量如预期的下降(图12A)。在不存在刺激但存在IL-2的情况下，存在更明显的细胞存活，但无特异性生长(图12B)。在存在肿瘤但不存在IL-2的情况下，模拟物细胞未显示出特异性存活。MFE23.CD28 CoStAR在前四天介导了扩增的表观倍增，之后是下降。MFE23.CD28.CD40直至第7天介导更大扩增，随后稳定下降(图12C)。在相同条件下但在存在IL-2的情况下，模拟物和MFE23.CD28转导的细胞两者都表现出在18天内20倍扩增，而MFE23.CD28.CD40细胞扩增超过60倍(图12D)。因此，在刺激条件下，在存在和不存在外源IL-2的情况下，基于CD28.CD40的受体表现出优异的扩增和存活。
然后对模拟物转导的和用MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40CoStAR转导的T细胞的细胞因子产生进行测试。对从T细胞/肿瘤共培养物获得的上清液进行珠粒阵列分析。将经工程化的T细胞以1:1效应子:靶比率与LoVo-OKT3细胞一起温育24小时，并且收集上清液。还从相等数量的单独的T细胞或单独的LoVo-OKT3细胞中收集经调理的上清液。使用LegendplexTM人TH1/TH2细胞因子群组(百进公司)对IL-2、IFN-γ、TNFα、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9和IL-21的产生进行分析(图13A-13M)。在来自单独的T细胞或肿瘤的培养基中，细胞因子极低或不可检测到。然而，当与肿瘤一起共培养时，细胞因子产生增强。相比于模拟物，MFE23.CD28增强了IL-2、IL-5、IL-17A/17F、IL-10、IL-9和IL-21的产生。然而，MFE23.CD28.CD40还增强了TNFα、IL-13和IL-22的产生。MFE23.CD28.CD40还增强了比由MFE23.CD28(IL-2、IL-9和IL-17F)引发的细胞因子数量的产生更大的细胞因子数量的产生，但还将一些细胞因子的产生减少到在MFE23.CD28(IL-5和IL-10)的情况下看到的水平以下。与此数据一起证明了向基于CD28的共刺激受体添加CD40增强和/或调节其在细胞因子产生方面的比活性。
进一步对模拟物转导的和用MFE23.CD28或MFE23.CD28.CD40 CoStAR转导的T细胞的趋化因子产生进行测试。使用LegendplexTM人促炎趋化因子群组对IL-8(CXCL8)、IP-10(CSCL10)、嗜酸性粒细胞趋化因子(CCL11)、TARC(CCL17)、MCP-1(CCL2)、RANTES(CCL5)、MIP-1a(CCL3)、MIG(CXCL9)、ENA-78(CXCL5)、MIP-3α(CCL20)、GROα(CXCL1)、I-TAC(CXCL11)和MEP-1β(CCL4)进行分析。(图14A-14M)。趋化因子在来自单独的T细胞的培养基中极低或不可检测到。当与肿瘤共培养时，趋化因子产生得以增强。相比于模拟物，MFE23.CD28增强了CXCL5、CXCL10、CXCL11、CCL17和CCL20的产生。然而，MFE23.CD28.CD40增强了CCL2、CXCL1和CXCL9的产生。MFE23.CD28.CD40还进一步将某些细胞因子的产生增强至比由MFE23.CD28(CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL17、CCL2、CXCL9、CCL5和CCL20)所引发的量更大的量，同时将一些细胞因子的产生减少到在MFE23.CD28(CCL4)的情况下看到的水平以下。与此数据一起证明了向基于CD28的共刺激受体添加CD40增强和/或调节其在趋化因子产生方面的比活性。
对CoStAR针对癌症靶标的功能活性进行了测试。用被工程化为具有对FolR或CA125具有特异性的scFv结合结构域(分别为scFv MOV19和scFv 196-14)的CD28或CD28.CD40 CoStAR对细胞进行了转导。人叶酸受体α(FolR)表示许多肿瘤，包含卵巢肿瘤、头颈肿瘤、肾肿瘤和肺部肿瘤的合适靶标，并且CA125表示卵巢癌的替代性靶标。将来自六个健康供体的原代人T细胞用196-14.CD28、196-14.CD28.CD40、MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40受体工程化，所有这些受体均携带DYKDDDDK表位标签以供检测。将经转导的细胞与FolR+/CA125+OvCAR-OKT3细胞混合，之后在表位标签阳性和阴性群体中使用胞内染色对效应子活性进行分析。在CD28和CD28.CD40工程化的细胞中观察到相比于模拟物转导细胞响应于CA125和FolR两者通过IL-2(15A和15B)、TNFα(15C和15D)、CD137(15E和15F)和BCL-xL(15G和15H)的产生确定的效应子活性的特异性增强，但是相比于MOV19.CD28.CD40，由MOV19.CD28进行的特异性BCL-xL诱导不显著。
对模拟物转导的TIL或用MOV19.CD28.CD40 CoStAR工程化的TIL的扩增和由患者匹配的肿瘤消化物刺激的CD137产生进行评估(图16)。对三个供体肿瘤进行了测试，所述供体肿瘤在消化物上显示出不同水平的FolR，其范围为阴性(6A)、低表达(6B)到高表达(6C)。模拟物和CoStAR工程化的TIL群体中对FolR阴性消化物匹配的CoStAR阴性TIL在肿瘤共培养后表现出类似水平的CD137上调，所述上调未通过存在CoStAR(图16D)得到增强。在暴露于FolR低表达消化物的TIL中，相比于CoStAR-，CoStAR+细胞中的活性增强，其中CD137表达从<10％增加到>20％(图16E)。在暴露于FolR高表达肿瘤消化物的TIL中，活性从CoStAR-群体中的大约20％增加到CoStAR+群体中的大约50％(图16F)。
检查了靶向FolR的CoStAR的效应子功能的增强。响应于FolR+肿瘤消化物，MOV19.CD28.CD40使CD137表达从约20％增加至约50％(图17A)，TNFα产生从10％增加至15％(图17B)并且IL-2产生从2％增加至5％(图17C)。
还检查了由可溶性配体进行的CoStAR介导的刺激。将来自三个健康供体的T细胞用MOV19.CD28或MOV19.CD28.CD40 CoStAR工程化，并且用固定的OKT3激活，从而在不存在FolR的情况下或在OvCAR-OKT3的情况下提供刺激，以提供TCR和CoStAR活性。Bcl-XL活性在OKT3刺激后跨三个供体在10％与20％之间增加(图18A)，而IL-2在0％与12％之间增加(图18B)，并且TNFα在0％与20％之间增加(图18C)。外源可溶性FolR的存在未增强这些特定效应子功能中的任何效应子功能。在存在OvCAR-OKT3的情况下，Bcl-XL诱导在CD28 CoStAR中增强了约20％，但在CD28 CD40 CoStAR中增强了约35％(图18D)，IL-2诱导在CD28 CoStAR中增强了约20％，并且在CD28 CD40 CoStAR中增强了30-50％(图18E)，并且TNFα产生在CD28 CoStAR中增强了20％-30％并且在CD28.CD40 CoStAR中增强了25-50％(图18F)。外源可溶性FolR对这些效应子功能中的任何效应子功能不具有抑制作用。
实例4
材料和方法
构建体设计-MFE23、MOV19和196-14CoStAR构建体包含MFE23(CEA特异性)、MOV19(叶酸受体α特异性)或196-14(CA125特异性)衍生的单链抗体片段核苷酸序列以及与共刺激结构域融合的制瘤素M1前导序列。所述共刺激结构域含有衍生自人CD8或CD28的胞外间隔子区和跨膜结构域，以及CD28、CD2或CD137和/或野生型或突变型CD40变体的信号传导结构域。本文详述的一些CoStAR包括与CD28和CD40融合的人PD1胞外结构域。用P2A切割序列和截短形式的人CD34对受体进行克隆，以允许检测经转导的细胞。由金唯智公司对CoStAR核苷酸序列进行了密码子优化和基因合成。将构建体克隆到第三代慢病毒载体中。
从正常健康供体中分离外周血单核细胞，之后根据制造商的说明书用T细胞激活和扩增珠粒(英杰公司)激活24小时，然后添加慢病毒上清液。
在感染后96小时使用CEA.hFc蛋白(R&D系统公司(R&D Systems))和抗hFc-PE二级抗体加抗CD34-APC或通过单独的抗CD34-PE抗体评估细胞转导。然后，使用x10供体错配的经照射的PBMC饲养细胞以1:20-1:200的比率在RPMI+10％ FCS中在添加30ng/ml OKT3和200IU/ml IL-2的情况下对细胞进行进一步扩增。14天后，像先前那样对细胞进行染色，并且储存以准备用于测定。
通过将CoStAR阳性或阴性细胞与野生型或OKT3工程化的CEA阳性LoVo细胞混合来进行功能测定。简言之，将T细胞与LoVo细胞以不同比率在96孔板中混合。对于流分析，将共培养物与布雷菲德菌素和莫能菌素以及抗CD107a抗体一起温育16小时，随后将细胞用可固定活力染料ef450(eBioscience公司)进行染色，用4％多聚甲醛固定，然后使用Fix/Perm洗涤缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences))渗透。然后将细胞用抗CD34或抗DYKDDDDK抗体进行染色，以区分CoStAR+群体和CoStAR-群体、抗IL-2、抗TNFα和抗IFNγ抗体(百进公司)。对于可溶性分析物分析，收集上清液以通过ELISA、细胞因子珠粒阵列(LEGENDPLEXTM人Th细胞因子群组(12重))或趋化因子珠粒阵列(LEGENDPLEXTM人类促炎趋化因子群组(13重))进行分析。
通过在存在或不存在IL-2的情况下将T细胞和肿瘤细胞以8:1效应子:靶比率在完整T细胞培养基(TCM：补充有10％ FCS、0.01M HEPES和1％盘尼西林/链霉素、50mMβ-巯基乙醇的RPMI)中混合来进行增殖测定。在指定时间点进行细胞计数，并且将新鲜肿瘤细胞以8:1的最终E:T添加在再刺激测定中。通过从孔中取出细胞并且用抗CD2 PerCP eFluor710抗体(英国的eBioscience公司)在黑暗中染色20分钟，然后进行DRAQ7染色并且使用MACSQuant分析仪进行计数来对增殖测定进行细胞计数。
实例5
为了评估用携带CD40的CoStAR转导的T细胞的体内抗肿瘤活性，对原代人T细胞进行模拟物转导或用MOV19.CD28.CD40 CoStAR构建体进行转导，随后进行体外扩增并冷冻保存。MOV19为单链Fv抗体，其对叶酸受体α(FOLR1)具有高亲和力。向免疫受损的小鼠植入已确立的卵巢癌细胞系(A2870、OVCAR-5、OVCAR-8或SK-OV-3)，允许所述卵巢癌细胞系在动物体内生长数天。随后根据小鼠的肿瘤负荷对小鼠进行分级，并且向小鼠最终注射模拟物转导的T细胞或MOV19.CD28.CD40转导的T细胞。在T细胞给药后不久，向小鼠中的一些小鼠注射静脉内IL-2(5μg IL-2，Q2Dx7)以支持T细胞的移植和初始扩增。最终研究设计含有5个组(每个组含有5只小鼠)：PBS(未给药细胞的)、模拟物转导的T细胞、具有IL-2补充的模拟物转导的T细胞、MOV19.CD28.CD40转导的T细胞和具有IL-2补充的MOV19.CD28.CD40转导的T细胞。每周监测肿瘤生长和小鼠存活持续总计40天。
与模拟物转导的组相比，施用了MOV19.CD28.CD40转导的细胞的小鼠显示出更好的肿瘤控制和延长的存活率，无论其是否补充有IL-2都是如此。此数据证明了CoStAR平台在体内改进T细胞抗肿瘤应答的能力，并且还展示了这种经改进的应答如何不依赖于外源IL-2的存在。
实例6
实例涉及鉴定CoStAR的关键组分，如但不限于与另一组分、间隔子、CD40突变体和/或CD28突变体组合的PD-1、MFE23、CD40。
通过HEK293T细胞的CaCl2转染进行病毒产生。通过用JRT3细胞进行滴定来确定CD34(标志基因)表达。
用于健康供体中的外生长的实验设计如下：第0天是从冷冻PBMC中进行T细胞分离。第0天还是用Dynabead激活。第2天是通过旋转接种转导。第5天是去除珠粒。第8天是测量活力和转导率。第8天还是后激活(REP之前)，第13-15天是冷冻。
在磁富集后、REP前的CD34表达在分选之前以及在分选之后按正分数和负分数进行测量。将健康供体用Dynabead激活，并且用CD40CoStAR构建体或模拟物进行转导(旋转接种，MOI 5)。然后将细胞针对其CD34表达而磁富集，并且在分选之前和之后通过流式细胞术(Novocyte)进行分析。
健康供体的实验设计包含如上所述的外生长以及REP：第2天是经转导的T细胞解冻，第1天是磁CD34富集，第0天是用G-Rex进行REP，第5-6天是更换培养基，第11-12天是测量活力和转导速率并冷冻。
大多数CD40 CoStAR修饰的T细胞在CD34富集和REP后富集在CD4中(图20)。在REP后10-11天使用抗人CD4-PerCP-eF710、抗人CD8-PE-Cy7和抗人CD3-FITC评估了CD4和CD8 T细胞表型。通过流式细胞术(Novocyte)进行分析，并且使用NovoExpress 1.5.0软件利用以下门控策略对数据进行分析：活/死排阻、单细胞、CD3+细胞、CD4+细胞或CD8+细胞。
与CD8群体相比，CoStAR修饰的CD4 T细胞被高度转导。将健康供体用Dynabead激活，并且用CD40 CoStAR构建体或模拟物进行转导(旋转接种，MOI 5)。然后将细胞针对其CD34表达而磁富集，并且按照快速扩增方案(REP)进行扩增。在REP后10-11天使用与抗人CD4-PerCP-eF710、抗人CD8-PE-Cy7和抗人CD3-FITC相关的抗人CD34-PE对标志基因CD34在CD4和CD8 T细胞上的表面表达进行评估。通过流式细胞术(Novocyte)进行分析，并且使用NovoExpress1.5.0软件利用以下门控策略对数据进行分析：活/死排阻、单细胞、CD3+细胞、CD4+细胞之中的CD34+细胞或CD8+细胞。
实例7
由与CD40共刺激结构域融合的胞外检查点结合结构域构成的CoStAR可以在CoStAR接合时将抑制信号转化为激活信号。为了测试此类受体的适用性，基于Ankri等人《免疫学杂志》2013；191:4121-4129以及Prosser等人《分子免疫学(MolecularImmunology)》51(2012)263-272中概述的描述但在将CD40添加到信号传导结构域的情况下生成了PD1融合物CoStAR(图21A)。将从健康供体分离的原代人T细胞用CD3/CD28 Dynabead激活，并且用MOI＝5的所指示的PD1融合物CoStAR受体或MFE23.CD28.CD40 CoStAR(阳性对照)进行转导或进行模拟物转导(阴性对照)。使用CD34微珠富集经转导的T细胞，并且在建库之前使用经照射的饲养细胞通过快速扩增方案进行扩增。解冻后，将细胞在补充有IL-2的完整RPMI中搁置3-4天。在过夜IL-2饥饿后使用DRAQ-7(1:200)通过流式细胞术(Novocyte)对活力和绝对计数进行评估，并且使用NovoExpress 1.5.0软件对数据进行分析。将经转导的T细胞在不存在IL-2的情况下与LoVo(CCL-229TM)或LoVo.OKT3.GFP肿瘤细胞一起以8:1效应子对靶比率共培养。24小时后，收集上清液并冷冻。LoVo和LoVo.OKT3.GFP在其表面上天然表达CEA和PD-L1，从而通过单独的(LoVo)或与信号1(LoVo.OKT3.GFP)相关的CoStAR赋予经转导的T细胞信号2。共培养一式三份进行，并且在实验中包含了对应的阴性(单独的T细胞、单独的肿瘤细胞)对照和阳性(PMA+离子霉素)对照。通过ELISA检测到分泌的IL-2和IFN-γ，并且使用FLUOstar Omega微型板读取器测量了吸光度，并且随后用Omega MARS 3.42R5软件对吸光度进行分析。每个符号是每个供体的平均一式三份值(图21C)。表达MFE23.CD28.CD40(CTP194)的细胞在存在LoVo-OKT3细胞的情况下产生平均大约4000pg/ml IL-2，而从PD1融合物中的产生<1000pg/ml。对IFNγ分泌的分析还证实，与模拟物相比，此细胞因子从MFE23.CD28.CD40工程化的细胞中的产生增强，然而未观察到从携带PD1融合物的细胞中的产生增强。接下来，对PD1融合物CoStAR在存在重复肿瘤攻击的情况下介导T细胞存活的能力进行评估(图22)。为此，将CoStAR或模拟物转导的T细胞在第0天和第7天时以8:1E:T比与LoVo-OKT3细胞混合并进行计数，并且在第6-8天和第14-15天进行检查点表达表型分型(图23)。图22示出了在实验期间细胞的扩增倍数，其中模拟物转导细胞的数量在整个实验中下降；相反地，MFE23.CD28.CD40(CTP194)工程化的细胞到第14天在用肿瘤进行连续刺激时扩增至多12倍。尽管PD1融合物CoStAR未表现出与CTP194工程化的细胞相似的扩增程度，但T细胞死亡的程度不如模拟物工程化的细胞那样大，这表明PD1结构域可以介导某种程度的T细胞存活。还在CD34-群体和CD34+群体两者中对在CD4+细胞和CD8+细胞中的检查点表达(LAG3、PD1和TIM3)进行了评估，并且所述检查点表达在图23在第6-8天和第14-15天示出。发现LAG3在第6-8天在CD4+细胞和CD8+细胞中(尽管在CD8+细胞中更可变)相对较低(总体上<20％)，而在携带不同受体或模拟物转导的细胞之间没有明显差异。然而，在第14-15天时，观察到与模拟物工程化的细胞相比，LAG3在携带基于PD1或MFE23的CoStAR的细胞中的表达较低。PD1表达更难以评估，因为PD1作为CoStAR的组分不能由内源表达分离。在CD4+细胞中，观察到与模拟物转导的细胞相比，MFE23.CD28.CD40工程化的细胞中的PD1表达更低，这种效应在第14-15天时更明显。在第6-8天时在CD4+和CD8+细胞中TIM3的表达与LAG3的表达成镜像，而在第14-15天时，TIM3表达总体上低，然而，在第14-15天时确实观察到TIM3在模拟物转导的细胞中的高表达(约80％的细胞)，所述表达在PD1融合物CoStAR细胞中较低，但在携带MFE23.CD28.CD40的细胞中<20％。总之，由反转信号的抗原识别结构域组成的CoStAR，如PD1，是功能性的，但在细胞因子释放或扩增测定中不如携带具有基于scFv的抗原识别结构域的CoStAR的细胞那样表现好。与模拟物工程化的细胞相比，PD1融合物受体还可以调节检查点表达。
接下来，试图了解CD40是如何作为CoStAR的单个组分或与除CD28之外的共刺激结构域的组合进行操作的。为了控制受体寡聚化和化学计量的影响，使用了碱基CD8跨膜结构域进行每次融合并且与对照MFE23.CD28.CD40受体进行了比较(图24A)。第一受体由CD28.CD40信号传导结构域与CD8胞外和跨膜结构域(CTP190)、CD2.CD40信号传导结构域与CD8胞外和跨膜结构域(CTP191)或CD137.CD40信号传导结构域与CD8胞外和跨膜结构域(CTP192)组成。另外，还生成了由单独的CD40组成的受体(CTP193)。经转导的细胞的流式细胞术分析显示，这些受体的表达与CD34标志基因表达没有良好关联，这表明结构格式不允许有效的表面表达(图24A，左下图)。尽管如此，进行了功能性测定，并且显示出与LoVo-OKT3共培养物中的模拟物转导的细胞相比，CD28.CD40、CD137.CD40和CD40受体可以介导增强的IL-2分泌，而IFNγ分泌低于从模拟物转导的细胞和MFE23.CD28.CD40工程化的细胞中进行的分泌(图24B)。对存在LoVo-OKT3细胞的情况下的扩增进行的分析(图25)表明，基于MFE23.CD28.CD40的受体介导的用携带天然CD28胞外和跨膜结构域(CTP194)那些受体进行的扩增最佳，优于具有CD8衍生的跨膜结构域(CTP190)的那些受体。CD137和CD40的融合在整个实验中在没有相关扩增的情况下维持T细胞数量，而由CD2.CD40或单独的CD40组成的受体不支持长期存活。与用模拟物转导的细胞观察到的影响类似。还在第6-8天和第14-15天对细胞进行了表型分析(图26)。在第6-8天时，LAG3在CD4细胞上非常低，并且在CD8+细胞上<20％。在第14-15天时，LAG3存在于约50％的CD4+模拟物细胞上，但存在于<20％的经工程化的细胞上(由于细胞数量不足以进行分析，因此数据不可用于一些受体)。除了第6-8天时的CD2.CD40 CTP191工程化的细胞和稍后时间点的模拟物转导的细胞之外，PD1在CD4+和CD8+细胞上在所分析的两个时间点的表达再次<20％。TIM3在CD4+细胞中在所分析的两个时间点的表达总体上低，但在CD8+细胞中较高，特别是在CD137.CD40(CTP192)和CD40(CTP193)工程化的细胞中。最后，模拟物转导的细胞在第14-15天时显示出>70％的TIM3表达，而携带CD28.CD40 CoStAR的细胞的表达为约20％。总之，含有用CD40测试的共刺激结构域的任何组合的CoStAR可以调节检查点表达，但这种效应在与CD28组合时最明显，并且优于将CD40用作唯一信号传导组分时。
接下来，试图研究MFE23.CD28.CD40构建体内的特定突变的影响，以试图了解不同信号传导组分是如何对CTP194 MFE23.CD28.CD40受体的最佳活性负责的。为此，将突变引入到已知的TRAF2结合基序(SVQE-AVQA)(CTP195)、TRAF2/3结合结构域(PVQET-AVAEA)(CTP196)和TRAF6结合结构域(PQEINF-AQAINF)(CTP197)中。还引入用于引入已显示出在B细胞(P227A)(CTP198)中的活性增强的CD40的多态性变体的点突变和已显示出影响TRAF3结合的Q263A突变(Leo等人《生物化学杂志(J Biol Chem.)》1999)(CTP199)。最后，通过将CoStAR克隆有一式三份的CD40胞内结构域(CTP200)来完成受体队列(图27)。与先前一样，将原代人T细胞用编码这些受体的慢病毒载体转导，使用CD34微珠富集并且在实验之前冷冻。CD34的表达水平平均介于60％与70％之间(图27A)。将经转导的或模拟物转导的细胞与LoVo-OKT3细胞混合，并且在24小时后通过ELISA测量IL-2和IFNγ(图29B)。IL-2从模拟物转导的细胞中的产生低于检测水平。IL-2从对照CTP194受体中的产生为大约4000pg/ml，正如从携带SVQE-AVQA突变的CTP195和携带具有P227A多态性的CTP198受体的细胞中的产生一样。表达TRAF6结合突变PQEINF-AQAINF或TRAF3结合突变Q263A的细胞以及表达一式三份的CD40基序的细胞均显示出IL-2产生适度减少。然而，表达含有TRAF2/3结合基序突变PVQET-AVAEA的CTP196的细胞显示出IL-2产生显著减少。在对IFNγ进行测量时也观察到这种细胞因子减少，其中除了产生大约10ng/ml IFNγ的CTP196之外，所有受体都产生>30ng/ml IFNγ，这与模拟物转导的细胞类似。
接下来，评估了这些不同的CD40信号传导结构域突变对支持重复刺激的能力的影响(图28)。为此，将模拟物转导的或经转导的T细胞与LoVo-OKT3细胞以8:1E:T比率混合，并且跨三个不同供体在第6-8天和第14-15天进行计数。表达CTP194的细胞到第一时间点扩增了大约四倍，并且在再刺激后扩增至>10倍。表达TRAF2结合突变CTP195、TRAF6结合突变CTP197或P227A多态性(CTP198)的细胞在支持再刺激的能力方面适度降低，而表达C263ATRAF3结合突变体的细胞或一式三份的CD40结合结构域在其使细胞扩增的能力中进一步失能。引人注目的是，表达TRAF2/3结合突变型CTP196的细胞在其支持重复刺激的能力方面受到了深刻影响。还对表达这些不同突变的细胞进行了表型分析(图29)。在CD4+或CD8+细胞中在第6-8天时在经转导的细胞与未经转导的细胞之间未看到LAG3的相对表达的明显差异，然而，与表达任何CoStAR的CD4+细胞相比，模拟物转导的细胞在第14-15天时的LAG3表达更高。在CD8+细胞中在第14-15天时未观察到关于LAG3表达的差异。发现在第6-8天时所有受体工程化的CD4+细胞的PD1表达平均<20％，在模拟物工程化的细胞中表达更高。有趣的是，还观察到在第6-8天时在表达TRAF2/3基序突变型CTP196的CD4+和CD8+细胞中以及在第14-15天时在CD4+细胞中观察到PD1表达升高。发现在所分析的两个时间点所有CD4+细胞组中TIM3表达平均低于20％。表达在CD8+细胞中在第一时间点时总体上更可变，平均为大约30％，但在表达CTP196的细胞中略微更高。在第14-15天时，模拟物转导的细胞的TIM3表达远高于经转导的细胞，并且表达CTP196的细胞的TIM3表达为来自其它组的细胞的表达的大约两倍。
所测试的最后一组受体是含有携带至YMNM和PYAP细胞质基序的突变的CD28的受体，所述突变对于涉及PKCθ、PI3k和Lek等的激活信号级联至关重要(Esensten等人2016)。CTP201含有PYAP-AYAA突变，而CTP202含有YMNM-FMNM突变。还将具有延伸的IgG4铰链的受体包含到此队列中，以确立含有较长接头结构域的CoStAR是否维持功能性(CTP203)(图30A)。如先前一样，将细胞转导并用CD34微珠富集。发现分选和扩增后的表达对于野生型对照和表达CTP201和CTP202受体的细胞为大约60％，但是对于表达CTP203IgG4铰链结构域受体的细胞低于30％(图30A，下图)。在与LoVo-OKT3细胞共培养之后，评估IL-2从模拟物转导的或经转导的T细胞中的产生(图30B)。来自表达CTP194的细胞的IL-2为大约4000pg/ml，并且对于CD28突变型受体较低，两者均为大约2500pg/ml。然而，来自表达IgG4铰链受体的细胞的IL-2更低，为大约1000pg/ml。作为对照，来自模拟物转导的细胞的IL-2低于较低检测水平。还从相同的细胞中测量了IFNγ(图30B)。来自CTP194的IFNγ为大约1000pg/ml，来自携带PYAP-AYAA CD28突变的CTP201细胞的IFNγ也是如此。观察到IFNγ从表达YMNM-FMNM突变的细胞中的分泌增强。在此受体队列内，IFNγ的产生对于表达CTP203 IgG4铰链受体的细胞是最高的。
接下来，对支持在此受体队列内在进行肿瘤再刺激后进行扩增的能力(图31)。在用LoVo-OKT3细胞进行两轮次的刺激后，表达MFE23.CD28.CD40的细胞扩增了大约10倍。观察到CD28信号传导结构域的突变对细胞在两轮次的刺激内扩增的能力具有深远影响，使用含有IgG4铰链/间隔子结构域的受体也是如此。在两轮次的刺激内，模拟物细胞的数量下降。对细胞在第一次刺激(6-8天)后的表型分析揭示了LAG3在CD4+或CD8+细胞内的表达没有明显差异，前者平均表达大约10％表达，而后者平均表达20％(图32)。然而，与经转导的细胞中的平均10％或更低相比，LAG3表达在第14-15天时在CD4+模拟物细胞中更高，为大约50％+，并且与经转导的细胞相比，在CD8+模拟物细胞中也更高。PD1表达分析揭示了在第一时间点MFE23.CD28.CD40或CD28突变型CD4+细胞中的表达为约10％，而表达IgG4受体的细胞的PD1表达>20％，模拟物转导的细胞也是如此。在第14-15天时，差异仍更大，100％的模拟物CD4+细胞为PD1+。CD8+细胞在两个时间点均表现出低PD1阳性。最后，在第6-8天时在CD4或CD8+TIM3表达中未看到明显差异，然而在第14-15天时，与表达对照或CD28突变型受体的细胞相比，表达IgG4间隔子结构域受体的CD4+细胞显示出更高的PD1阳性，与在CD8+细胞中观察到影响相似。
实例8
共培养测定设置。将效应子(即，未经转导的和经转导的)T细胞在共培养前一天解冻，以1x106个细胞/mL再悬浮在不具有IL-2的TCM中，并且与5％CO2一起在37℃下温育过夜。在共培养当天，根据制造商的说明书，使用ViCELL BLU收集T细胞和BA/F3靶标(即WT、OKT3、FOLR1和OKT3-FOLR1)并对其进行计数。将未经转导的和经转导的T细胞两者在室温下以一系列的solFOLR1(即，0ng/mL、20ng/mL、60ng/mL和200ng/mL)浓度和超生理水平预温育30分钟，所述浓度表示在卵巢癌患者血清中报告的浓度。温育后，将细胞与BA/F3 WT、OKT3、FOLR1或OKT3-FOLR1靶标按以下E:T比率(3:1、1:1、1:3)共培养过夜。每种条件一式三份地进行。根据制造商的说明书用PMA/离子霉素刺激的T细胞和未经刺激的T细胞分别充当阳性对照和阴性对照。过夜后，将板收集并且以500x g离心3分钟。从每个孔中收集100μL上清液，储存在-80℃下，之后进行细胞因子含量分析。然后如下所述对板中的其余细胞进行染色。
对于增殖共培养测定，首先根据制造商的说明书在共培养设置当天用CellTraceTM紫染料对T细胞进行标记。然后将标记的细胞与BA/F3靶细胞(BA/F3、BA/F3-FOLR1、BA/F3-OKT3-FOLR1)以10:1的E:T一起共培养5天。
流动染色及共培养测定的分析。在收集上清液后，将团粒化的细胞洗涤并在室温下用100μL活/死可固定近IR染料(通过将1μL重组染料添加到1mL PBS中制备)标记30分钟。所有洗涤步骤通过向每个孔中添加100μL染色缓冲液，以500x g离心3分钟并倾析上清液来进行。在用活/死染料温育之后，将细胞洗涤并用Fc块(1:50稀释)在室温下封闭15分钟，随后将50μL抗体混合物添加到每个孔中并且在4℃下温育30分钟。然后将细胞洗涤，并且添加一定体积的100μL BD Cytofix缓冲液，并且将细胞在4℃下温育20分钟。固定后，对细胞进行洗涤，在150μL染色缓冲液中重组，并且储存在4℃下，直到使用BD LSR Fortessa X-20进行分析为止。
在细胞术分析之前，将板以500x g离心3分钟，并且将具有125μL FAC染色缓冲液的25μL计数珠粒(即，26000个珠粒)添加到每个孔中。从每个孔中获取总共100μL样品。门控策略如下：
淋巴细胞(前向散射[FSC]-A对侧向散射[SSC]-A)
单细胞门1(FSC-H对FSC-A)
单细胞门2(SSC-H对SSC-A)
活细胞(FSC-H对近远IR APC-Cy7染料)
肿瘤对T细胞(抗小鼠CD45 BV785对抗人CD45 BV650)
从T细胞特异性门控的活化标志物4-1BB(FSC-H对抗人4-1BB BV421)和CD69(FSC-H对抗人CD69 BV711)。
使用以下门控策略记录来自每个孔的珠粒计数：
FSC-A对SSC-A
SSC-H对FITC
使用FlowJo(BD公司，10版)进行分析。使用GraphPad Prism 9绘制图。
细胞因子分析。在纯的情况下或在用来自Meso scale discovery公司(Mesoscale discovery，MSD)的MSDV-Plex Plus促炎群组1试剂盒的稀释剂2以1:200稀释的情况下对从如上所述的共培养测定中收集的上清液进行评估。根据制造商的说明书进行测定，并且使用MSD发现工作台软件进行分析。
分别从来自3个健康供体的与Ba/F3靶标过夜共培养的未经转导的(NTD)和抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)进行的活化标志物(4-1BB和CD69)的表达和细胞因子产生(IL-2和IFNγ)。4-1BB表达在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞中高于NTD细胞中，而CD69表达在两种细胞中相似(图34A)。IL-2和IFNγ表达在抗FOLR1coSTAR修饰的T细胞中比在NTD细胞中更高(图34B)。
在与NTD和CoStAR T细胞过夜共培养后通过流式细胞术评估的Ba/F3靶标的肿瘤计数在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞和NTD细胞中相当(图34C)。
在与Ba/F3靶标过夜或5天共培养后通过流式细胞术评估的NTD和CoStAR T细胞计数以及增殖表明，CD4和CD8 T细胞两者的总细胞计数和增殖在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞中高于NTD细胞中(图34D)。
除了抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞的表达相比于NTD细胞有所增加之外，从来自3个健康供体的与增加浓度的可溶性叶酸受体(sFOLR)一起预温育并且与Ba/F3靶标过夜共培养的未经转导的(NTD)和抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)中进行的活化标志物(4-1BB和CD69)的表达在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞中和NTD细胞中相当(图25A、B)。
在与和增加浓度的sFOLR预温育的NTD和CoStAR T细胞过夜共培养后通过流式细胞术评估的Ba/F3靶标的肿瘤计数在抗FOLR1CoStAR修饰的T细胞中和NTD细胞中相当(图35C)。
与增加浓度的sFOLR预温育的在与Ba/F3靶标过夜共培养后通过流式细胞术评估的NTD和CoStAR T细胞的细胞因子产生(IL-2)的表达在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞中和NTD细胞中相当。
从来自3个健康供体的与Ba/F3靶标过夜共培养的未经转导的(NTD)和抗FOLR1CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)中进行的活化标志物(4-1BB和CD69)的表达在抗FOLR1CoStAR修饰的T细胞和NTD细胞中相当(图36A)。
从来自3个健康供体的与Ba/F3靶标过夜共培养的未经转导的(NTD)和抗FOLR1CoStAR修饰的T细胞(CoStAR)中进行的细胞因子产生(IL-2)的表达在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞中比NTD细胞中有所增加(图36B)。
在与NTD和CoStAR T细胞过夜共培养后通过流式细胞术评估的Ba/F3靶标的肿瘤计数在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞和NTD细胞中相当(图36C)。
在与Ba/F3靶标过夜或5天共培养后通过流式细胞术评估的NTD和CoStAR T计数在抗FOLR1 CoStAR修饰的T细胞中比NTD细胞中有所增加(图36D)。
实例：9
产生CoStAR TIL
将来自6个卵巢肿瘤的TIL通过消化释放，并且在3000U IL-2中培养。在肿瘤消化后48小时和72小时两者，在MOI为5的情况下用编码CoStAR分子和靶向人FOLR1的scFv、接头、与截短的CD40细胞质结构域融合的全长CD28的第3代慢病毒载体进行转导。
使用了流式细胞术分析以确定使用抗独特型抗体表达CoStAR分子以进行表面检测的CD4和CD8 T细胞的频率。约20％至70％的CD4和CD8 T细胞表达CoStAR分子(图37A)。
使用了流式细胞术表面染色分析以确定表达TCRαβ和TCRγδ的细胞的频率。约100％的CD3+细胞表达TCRαβ，并且相当少的CD3+细胞(接近零)表达TCRγδ(图37C)。
将来自6个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与自体消化物在存在布雷菲德菌素A的情况下过夜共培养。第二天通过流式细胞术对表达IL-2或TNFα的细胞的频率进行评估。与自体消化物反应的TIL的频率通过CoStAR分子增强(图38A)。
将来自6个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与自体消化物一起共培养，并且对上清液的细胞因子释放进行评估。CoStAR修饰的细胞的效应子功能增加，如通过IFNγ、TNFα和IL-13释放增加所证明的。响应于用PMA(佛波12-肉豆蔻酸13-乙酸酯)和离子霉素刺激，这些分子的最大水平相似(图38B)。
将来自5个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与BA/F3细胞或被工程化为表达OKT3、FOLR或两者的BA/F3细胞一起共培养。未经修饰的和CoStAR修饰的TIL的细胞因子分泌在与未经修饰的BA/F3或表达单独的OKT3或单独的FOLR1的BA/F3共培养时相当。CoStAR修饰的TIL在与被修饰成表达FOLR1和OKT3两者的BA/F3共培养时分泌增加水平的细胞因子IL-2和IFNγ(图39A)。
将来自5个卵巢肿瘤的CoStAR修饰的TIL与BA/F3细胞或被工程化为表达OKT3、FOLR或两者的BA/F3细胞一起共培养。通过小鼠CD45的细胞计数对针对BA/F3靶细胞的细胞毒性进行评估，所述细胞计数是通过流式细胞术分析确定的。未经修饰的细胞和CoStAR修饰的细胞等效地杀死表达OKT3的靶细胞。CoStAR修饰的TIL不杀死表达单独的FOLR1的BA/F3细胞(图39B)。
将来自3名卵巢癌患者的模拟物或CoStAR修饰的TIL与自体肿瘤在存在无阻断、MHCI、MHC II或MHC I+MHC II阻断或抗体或同种型对照的情况下共培养。评估上清液的IFNγ释放水平。相对于在没有抗体的情况下的释放水平归一化，模拟物和CoStAR修饰的TIL的IFNγ水平类似地降低，这显示出活性是由内源TCR-MHC肽相互作用引起的(图39C)。
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在对本发明的优选实施例进行详细描述后，应理解，由上述段落定义的本发明不限于上述描述中所阐述的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范围的情况下，许多明显的变化是可能的。

Claims (54)

1.一种嵌合共刺激抗原受体(CoStAR)，其包括：
与跨膜结构域操作性地连接的对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的胞外结合结构域、CD28信号传导结构域和CD40信号传导结构域或其信号传导片段。
2.根据权利要求1所述的CoStAR，其中所述CoStAR对FOLR1具有特异性。
3.根据权利要求2所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域包括MOV19 scFv。
4.一种靶向受试者的表达FOLR1的癌症的方法，所述方法包括施用表达根据权利要求1至3所述的CoStAR的经工程化的免疫细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述癌症包括肾癌、肺癌或卵巢癌。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述经工程化的免疫细胞包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、αβT细胞、γδT细胞或NK T细胞。
7.一种嵌合共刺激抗原受体(CoStAR)，其包括：
与跨膜结构域操作性地连接的胞外结合结构域、第一信号传导结构域和CD40信号传导结构域或其信号传导片段。
8.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述CoStAR不包括信号1信号传导结构域。
9.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述第一信号传导结构域包括CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6的信号传导结构域或信号传导片段。
10.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述CD40信号传导片段由以下组成、基本上由以下组成或包括以下：SH3基序(KPTNKAPH，SEQ ID NO:26)、TRAF2基序(PKQE，SEQ ID NO:27；PVQE，SEQ ID NO:28；SVQE，SEQ ID NO:29)、TRAF6基序(QEPQEINFP，SEQ ID NO:30)、PKA基序(KKPTNKA，SEQ ID NO:31；SRISVQE，SEQ ID NO:32)或其组合，或者为全长CD40胞内结构域。
11.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述CD40信号传导片段由以下组成、基本上由以下组成或包括以下：PVQET。
12.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述CoStAR包括第一信号传导结构域、第二信号传导结构域和CD40信号传导结构域或其信号传导片段。
13.根据权利要求12所述的CoStAR，其中所述第二信号传导结构域包括CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6的信号传导结构域或信号传导片段。
14.根据权利要求9所述的CoStAR，其中所述第一信号传导结构域包括全长共刺激结构域。
15.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述第一信号传导结构域包括CD28信号传导结构域。
16.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述CD40信号传导结构域包括SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。
17.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域通过接头和/或间隔子与所述跨膜结构域操作性地连接。
18.根据权利要求16所述的CoStAR，其中所述接头包括约5个至约20个氨基酸。
19.根据权利要求16所述的CoStAR，其中所述接头包括AAAGSGGSG(SEQ ID NO:8)。
20.根据权利要求16所述的CoStAR，其中所述间隔子包括约10个至约250个氨基酸。
21.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述CoStAR包括第二胞外结合结构域。
22.根据权利要求21所述的CoStAR，其中所述第二胞外结合结构域包括来自CD8或CD28的配体结合结构域。
23.根据权利要求16所述的CoStAR，其中所述间隔子包括一个或多个免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白恒定区。
24.根据权利要求16所述的CoStAR，其中所述间隔子包括SEQ ID NO:13的一个或多个免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白恒定区。
25.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述跨膜结构域包括CD28或CD8的跨膜结构域。
26.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12的跨膜结构域序列。
27.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域与肿瘤相关抗原结合。
28.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域与肿瘤微环境相关抗原结合。
29.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域对CD70、CD146、FOLR1、癌胚抗原(CEA)、5T4、黑素转铁蛋白(CD228)、Her2、EGFR、GPC3、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP/CSPG4)、CD71、EPCAM、SM5-1、叶酸受体或CA125、PDL-1、CD155 PD-1、间皮素、或肿瘤特异性肽(p)-主要组织相容性(MHC)复合体、或肿瘤特异性pMHC复合体抗原特异性单链T细胞受体(scTCR)、或转铁蛋白或抗体或抗原结合蛋白具有特异性。
30.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域对PDL1具有特异性。
31.根据权利要求30所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域包括SEQ ID NO:6。
32.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域对CEA具有特异性。
33.根据权利要求32所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域包括SEQ ID NO:5。
34.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域对FOLR1具有特异性。
35.根据权利要求32所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域包括SEQ ID NO:4。
36.根据权利要求7所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域对CD155、CD112或CD113具有特异性。
37.根据权利要求36所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域包括SEQ ID NO:7。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的CoStAR，其包括两个或更多个胞外结合结构域。
39.根据权利要求1所述的CoStAR，其中所述胞外结合结构域包括scFv、肽、抗体重链、天然配体或受体。
40.根据权利要求1至37中任一项所述的CoStAR，其进一步包括位于C末端处的CD3ζ信号传导结构域。
41.根据权利要求1至37中任一项所述的CoStAR，其进一步包括N末端信号肽。
42.一种核酸，其编码根据权利要求1至41中任一项所述的CoStAR。
43.一种载体，其包括根据权利要求42所述的核酸。
44.一种细胞，其表达根据权利要求1至41中任一项所述的CoStAR。
45.一种细胞，其表达根据权利要求1至41所述的CoStAR中的两种或更多种CoStAR。
46.根据权利要求45所述的细胞，其表达抗FOLR1.CD28.CD40和抗CA125.41BB.CD40或表达抗FOLR1.CD28.CD40和PD1.CD28.CD40。
47.根据权利要求44所述的细胞，其中所述细胞包括α-βT细胞、γ-δT细胞、T调节细胞、TIL、NKT细胞或NK细胞。
48.根据权利要求44所述的细胞，其中所述细胞共表达CAR或TCR。
49.一种制备根据权利要求44所述的细胞的方法，所述方法包括用根据权利要求43所述的载体转导或转染细胞的步骤。
50.一种用于制备表达根据权利要求1至41中任一项所述的CoStAR的细胞群体的方法，所述方法包括：
51.i)检测所述CoStAR在用根据权利要求43所述的载体转染或转导的细胞的表面上的表达；以及
52.ii)选择被鉴定为表达所述CoStAR的细胞。
53.一种细胞群体，其针对细胞表达而富集根据权利要求1至41中任一项所述的CoStAR。
54.一种用于治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求44至48中任一项所述的细胞或根据权利要求53所述的细胞群体的步骤。
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