KR102216083B1 - 정상 b 세포를 고갈시켜 내성을 유도하기 위한 ｃａｒｔ19의 용도 - Google Patents
정상 b 세포를 고갈시켜 내성을 유도하기 위한 ｃａｒｔ19의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간에서 내성을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하는 것을 포함하고, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2012년 7월 13일자 출원된 미국 가출원 제61/671,508호를 우선권으로 주장하고, 이의 내용은 전체가 본 명세서에서 참조로서 도입된다.
유전자 전이 기술을 사용하여, T 세포는, 주요 조직접합성 복합체(MHC)-독립적인 신규한 항원 특이성을 부여하는 이들의 표면 상에서 항체 결합 도메인을 안정하게 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 특이적 항체의 항원 인식 도메인을 단일 키메라 단백질 내로 CD3-z 쇄 또는 FcgRI 단백질의 세포내 도메인과 조합하는 이러한 방법의 적용이다[참조: Gross et al, 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10024-10028; Irving et al, 1991 Cell 64: 891-901]. CAR을 시험하는 실험은 다수의 학술 의료 센터에서 현재 진행중이다[참조: Kohn et al. 2011 Mol. Ther. 19: 432-438; Jena et al, 2010 Blood 116: 1035-1044]. 대부분의 암에서, 종양-특이적 항원은 여전히 잘 정의되어 있지 않지만, B 세포 악성종양에서 CD19는 매력적인 종양 표적이다. CD19의 발현은 정상 및 악성종양 B 세포로 제한되고[참조: Uckun et al., 1988 Blood 71: 13-29], CD19는 CAR을 안전하게 시험하기 위해 광범위하게 수용된 표적이다. CAR은 내인성 T 세포 수용체와 유사한 방식으로 T 세포 활성화를 유발할 수 있지만, 현재까지 이러한 기술의 임상적 적용에 대한 주요 장해는 CAR+ T 세포의 생체내 확장, 주입후 세포의 신속한 소실, 및 임상 활성의 실망으로 제한되어 왔다[참조: Jena et al, 2010 Blood 116: 1035-1044; Sadelain et al, 2009 Curr. Opin. Immunol. 21: 215-223].
CAR-매개된 T 세포 반응은 공자극 도메인의 부가에 의해 추가로 증강될 수 있다. 임상전 모델에서, CD137(4-1BB) 신호전달 도메인의 포함은 CD3-z 쇄 단독의 포함과 비교하여 CAR의 항종양 활성 및 생체내 존속성을 현저히 증가시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Milone et al., 2009 Mol. Ther. 17, 1453-1464; Carpenito et al, 2009 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106: 3360-3365]. 이러한 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포의 양자 전이를 위한 안전성 및 용이성을 평가하기 위해, CD19+ 악성종양을 표적화하기 위해 CD3-z 및 4-1BB 공자극 도메인 둘 다를 포함하는 항-CD19 CAR을 발현하는 자가 T 세포(CART19 세포)를 사용하는 파일럿 임상 시험이 수행되었다. 3명의 환자가 이 프로토콜하에서 치료되었다. 이들 환자 중 1명으로부터의 조사결과 중의 일부가 문헌[참조: Porter et al, 2011 N. Engl. J. Med. 365: 8]에 기재되어 있고, 이는 이러한 치료가 종양 퇴화, CART19 세포 존속성 및 지연된 종양 용해 증상의 예상치 않은 발생을 야기하는 것을 보고한다. 또한, CART19 세포가 치료된 3명의 환자 모두에서 강력한 임상적 항종양 효과를 매개하는 것이 관찰되었다. 평균적으로, 각각의 주입된 CAR T 세포 및/또는 이들의 자손은 고도의 화학치료-내성 만성 림프구 백혈병(CLL)을 갖는 환자의 생체내에서 1000개 이상의 백혈병 세포를 제거했다. CART 19 세포는 강건한 생체내 T 세포 확장을 경험하고, 혈액 및 골수(BM)에서 적어도 6개월 동안 고도로 존속하고, 메모리 표현형을 갖는 세포 상에서 기능 수용체를 지속적으로 발현시키고, 생체내에서 항-CD19 효과기 기능을 유지했다. 그러나, CART19 작제물이 쥐 서열(항체 결정인자), 및 CAR19 작제물의 상이한 성분 사이의 독특한 접합 단편 둘 다를 함유하는 경우에 인간 숙주에 의한 거부반응을 CART19 세포가 회피하는 방법은 여전히 명확하지 않다.
따라서, CART19 세포의 장기간 존속성의 메커니즘 및 이들 세포가 인간 숙주에 의해 거부되지 않는 이유에 대한 당해 기술분야의 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.
본 발명은 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 유효량의 세포를 대상체에게 투여하여 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 것을 포함하고, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 B 세포 표면 마커를 표적화한다.
본 발명은 대상체에서 내성을 촉진시키는 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 유효량의 세포를 대상체에게 투여하여 대상체에서 내성을 촉진시키는 것을 포함하고, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 B 세포 표면 마커를 표적화한다.
한 가지 실시형태에서, 상기 내성은 이식된 조직에 대한 이식 내성이다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 B 세포를 고갈시킨다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 이식된 조직과 동시에 투여된다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 이식된 조직의 투여 전에 투여된다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 이식된 조직의 투여 후에 투여된다.
본 발명은 이식 대 숙주 질환 (graft versus host disease) (GVHD)을 치료하는 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 방법은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 GVHD를 치료하는 것을 포함하고, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 B 세포 표면 마커를 표적화한다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 B 세포를 고갈시킨다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 이식된 조직과 동시에 투여된다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 이식된 조직의 투여 전에 투여된다.
한 가지 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 세포는 이식된 조직의 투여 후에 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시형태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 관련하여 읽을 때에 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명할 목적으로, 현재 바람직한 실시형태가 도면에 제시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 제시된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1a 내지 1f를 포함하는 도 1은 CART19 세포의 혈액 및 골수에서 지속된 생체내 확장 및 존속성을 증명하는 일련의 이미지이다. 도 1a 내지 1c에 도시된 전혈 또는 도 1d 내지 1f에 도시된 골수로부터 단리한 DNA, 도 1a 및 1d에 도시된 UPN 01, 도 1b 및 1e에 도시된 UPN 02 및 도 1c 및 1f에 도시된 UPN 03으로부터 수득한 샘플은 CART 19 서열을 검출하고 정량화하기 위해 정량화된 분석을 사용하여 Q-PCR 분석에 벌크로 제공했다. 각각의 데이터 포인트는 1.56% 미만의 최대 CV(%)를 갖는 100 내지 200ng 게놈 DNA에 대한 3회 측정치의 평균을 나타낸다. 분석에 대한 합격/불합격은 기준 샘플의 경사 및 증폭 효율 및 증폭에 대한 사전 확립된 범위를 포함했다. 기준 곡선 범위에 의해 확립된 분석에 대한 정량화 하한치는 2카피 도입유전자/게놈 DNA ㎍이고; 당해 값보다 낮은 샘플 수치는 추정치를 고려하고, 적어도 2/3 반복치가 값 15%에 대한 CV(%)와 함께 Ct 값을 생성한 경우를 나타낸다. CART19 세포는 UPN 01 및 UPN 03의 경우에 0일, 1일 및 2일, 및 UPN 02의 경우에 0일, 1일, 2일 및 11일에 주입했다.
도 2a 내지 2c를 포함하는 도 2는 생체내에서 기능적 메모리 CAR의 연장된 표면 CART19 발현 및 확립을 도시하는 일련의 이미지이다. 도 2a는 CAR-발현 CD3+ 림프구 및 말초 및 골수에서 B 세포의 부재의 검출을 나타낸다. CART19 세포 주입후 169일에서 UPN 03으로부터 수득한 새롭게 처리된 말초혈 또는 골수 단핵 세포는 CART19의 표면 발현(상부) 또는 B 세포의 부재(하부)에 대해 유동 세포분석법으로 평가하였고; 대조군으로서 건강한 기증자 ND365로부터 수득한 PBMC를 염색했다. CD3+ 림프구에서의 CAR3+ 발현을 평가하기 위해, 샘플을 CD14-PE-Cy7 및 CD16-PE-Cy7(덤프 채널) 및 CD3-FITC에 대한 항체로 동시 염색하고, CD3+ 상에서 양성적으로 게이팅 (gating)하였으며, CD8a-PE, 및 알렉사(Alexa)-647에 접합된 항-CAR19 유전자형 항체로 동시 염색함으로써 CD8+ 및 CD8-림프구 구획에서의 CAR19 발현에 대해 평가하였다. 플롯에서의 데이터는 덤프 채널-음성/CD3 양성 세포 모집단 상에서 게이팅된다. B 세포의 존재를 평가하기 위해, 샘플을 CD14-APC 및 CD3-FITC(덤프 채널)에 대한 항체로 동시 염색하고, CD20-PE 및 CD19-PE-Cy-7에 대한 항체로 동시 염색함으로써 덤프 채널-음성 분획에서 B 세포의 존재에 대해 평가하였다. 모든 경우에, 음성 게이트 4분원(gate quadrant)은 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이 비-염색 대조군 상에서 확립되었다. CD4+(도 2b) 및 CD8+(도 2c) T 세포 서브셋의 T 세포 면역표현형 검사가 제시되어 있다. T 세포 주입후 56일차 및 169일차에 아페레시스에 의해 수득된 UPN 03으로부터의 동결된 말초혈 샘플을 어떠한 인자의 첨가 없이 배양 배지에 밤새 방치하고, 세척하고, T 세포 메모리, 활성화 및 고갈에 대한 마커의 발현을 위한 다중-파라미터 면역표현형 검사를 실시하였다. 도 6에 도시된 바와 같은 게이팅 전략은 덤프 채널(CD14, CD16, 라이브/데드 아쿠아(live/dead aqua))-음성 및 CD3-양성 세포에 대한 초기 게이팅, 이어서 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대한 양성 게이팅을 포함한다. 게이트 및 4분원은 FMO 대조군(CAR, CD45RA, PD-1, CD25, CD127 및 CCR7)을 사용하여 확립되거나, 양성 세포 모집단(CD3, CD4, 및 CD8) 상에서 게이팅 및 명확하게 설명된 서브셋(CD27, CD28 및 CD57)에 의해 확립되었으며; 데이터는 사상의 객관적 가시화를 위한 이중 지수 변환 후에 표시되었다. 존속하는 CAR 세포의 기능적 역량이 하기 실험에서 제시된다. T 세포 주입후 56일차 및 169일차에 아페레시스에 의해 수득된 UPN 03으로부터의 동결된 말초혈 샘플은 어떠한 인자의 첨가 없이 배양 배지에서 밤새 방치하고, 세척하였으며, CD107 탈과립화 분석을 사용하여 CD19 발현 표적 세포를 인식하는 능력에 대해 생체외에서 직접 평가했다. 항-CD28, 항-CD49d 및 CD107-FITC의 존재하에 2시간 배양 후, 세포 혼합물을 수확하고, 세척하였으며, CD19 발현 표적에 반응하여 탈과립화하는 CART19 세포의 능력을 평가하기 위해 다중 파라미터 유동 세포분석법에 적용하였다. 상기 게이팅 전략은 덤프 채널(CD14-PE-Cy7, CD16-PE-Cy7, 라이브/데드 아쿠아)-음성 및 CD3-PE-양성 세포 상에서의 초기 게이팅, 및 이어서 CD8-PE-텍사스 레드(Texas Red)-양성 세포에 대한 게이팅을 수반했으며; 제시된 데이터는 CD8+ 게이팅된 모집단을 위한 것이다. 모든 경우에, 음성 게이트 4분원은 비-염색 대조군 상에서 확립되었다.
도 3a 내지 도 3c를 포함하는 도 3은 CART19 세포의 주입 후에 임상적 반응을 평가하는 실험 결과를 도시하는 일련의 이미지이다. 도 3a는 UPN 02가 최소 반응(R/B, 화살표)으로 2사이클의 리툭시맵(rituximab) 및 벤다무스틴(bendamustine)으로 처리되었다는 것을 나타낸다. CART19 T 세포는 벤다무스틴 단독(B, 화살표)으로 처리한지 초기 4일 후에 주입되었다. 리툭시맵 및 벤다무스틴 내성 백혈병은 주입 18일 이내에 절대 림프구 계수(ALC)에서 60,600/㎕에서 200/㎕로의 감소에 의해 나타낸 바와 같이 혈액으로부터 신속하게 제거되었다. 코르티코스테로이드 처리는 불안감 및 비감염성 발열 증상으로 인해 주입 후 18일차에 시작되었다. 기준선(점선)은 ALC에 대한 정상의 상한치를 나타낸다. 도 3b는 CD20에 대한 UPN 01 및 UPN 03 환자로부터 순차 골수 생검 또는 응고 검체를 염색하는 예시적 실험의 결과를 나타낸다. 환자 둘 모두에 존재하는 백혈병에 의한 전처리 침윤은 세포충실도(cellularity) 및 3계통 조혈의 정상화가 수반되는 후처리 검체 상에는 존재하지 않았다. UPN 01은 유동 세포분석법, 세포유전학 및 형광 원위치 하이브리드화(flourescence in situ hybridization, FISH)에 의해 평가하는 경우에 어떠한 CLL 세포도 검출되지 않거나, 골수 또는 혈액에서의 유동 세포분석법에 의해 검출된 정상 B 세포를 갖지 않았다. UPN 03은 +23일차에 유동 세포분석법에 의해 확인된 5%의 잔류 정상 CD5-음성 B 세포를 가졌으며, 이는 이들이 모노클로날인 것을 나타냈으며; +176일차에는 어떠한 정상 B 세포도 검출되지 않았다. 도 3c는 화학치료-내성의 일반화 림프샘장애의 신속한 분해능을 평가하기 위해 순차 CT 이미지화를 사용한 실험 결과를 나타낸다. 좌우 엽액량은, 화살표 및 원으로 표시된 바와 같이, 주입후 83일차(UPN 01) 및 31일차(UPN 03) 정도에 분해되었다.
도 4a 내지 도 4c를 포함하는 도 4는 UPN 01, UPN 02 및 UPN 03에 대해 순환시 절대 림프구의 계수 및 전체 CART19+ 세포를 도시하는 일련의 이미지이다. 순환시 전체 CART19+ 세포에 대한 림프구(전체 정상 세포 및 CLL 세포)의 전체 수는 혈액의 용적이 5.0ℓ이라는 가정하에 CBC 값으로부터의 절대 림프구 계수를 사용하여 3명의 대상체 모두에 대해 플롯팅된다. 순환시 CART19 세포의 전체 수는, 도 1에 도시된 바와 같이, 절대 림프구 계수를 갖는 직렬식 CBC 값 및 Q-PCR 마킹 값을 사용하여 산정되었으며, 카피수/㎍ DNA를 본 명세서의 다른 개소에 기재된 바와 같이 평균 마킹율(%)로 환산하였다. 상기 Q-PCR 마킹율(%)은 주입 생성물의 유동 세포분석 특성화 및 샘플로부터의 데이터와 밀접하게 상관(2배 미만의 변화)하는 것으로 밝혀졌으며, 이때 수반되는 유동 세포분석 데이터는 염색에 의해 CART19 세포를 직접 계산하는데 이용가능했다.
도 5a 내지 도 5d를 포함하는 도 5는 T 세포 주입후 71일차에 UPN-01 PBMC 중의 CART19-양성 세포의 직접 생체외(ex vivo) 검출을 수반하는 실험을 도시하는 일련의 이미지이다. 주입후 71일차에 새로운 아페레시스 후에 수집되거나 T 세포 생성물(기준선)의 제조를 위해 아페레시스 시점에 동결되고 염색 전에 생존가능하게 해동된 UPN-01 PBMC는 표면 상에서 CAR19 부분을 발현하는 CART19 세포의 존재를 검출하기 위해 유동 세포분석법을 적용하였다. 림프구에서 CAR19의 발현을 평가하기 위해, 샘플을 CD3-PE, 및 알렉사-647에 접합된 항-CAR19 유전자형 항체와 동시 염색하거나, CD3-PE 단독으로 동시 염색했다(CAR19용의 FMO). 도 5a는 초기 림프구 게이트가 전방 및 측면 산란(FSC 대 SSC)에 기초하여 확립된 후, CD3+ 세포 상에서 게이팅에 의해 확립되었다는 것을 나타낸다. 도 5b는 CD3+ 림프구 게이트를 나타내고; 도 5c는 CAR 유전자형 염색을 나타내고; 도 5d는 CAR 유전자형 FMO를 나타낸다. CAR19-양성 게이트는 CAR19 FMO 샘플 상에서 확립되었다.
도 6a 내지 도 6c를 포함하는 도 6은 UPN 03 혈액 검체에서의 다색성 유동 세포분석법을 이용함으로써 CART19 발현을 확인하기 위한 게이팅 전략을 도시하는 일련의 이미지이다. 도 6c에 대한 게이팅 전략은 56일차 UPN 03 샘플에 대해 제시되어 있으며, 169일차 UPN 03 샘플에 대해 사용된 전략을 나타낸다. 도 6a는 덤프(CD14, CD16, 라이브/데드 아쿠아) 음성 및 CD3-양성인 일차 게이트를 나타낸다. 도 6b는 CD4-양성 및 CD8-양성인 이차 게이트를 나타낸다. 도 6c는 CAR19-양성 및 CAR19-음성인 삼차 게이트를 나타내며, 이들은 CAR FMO 샘플(가장 우측 패널) 상에 확립되었다.
도 7은 환자의 인구 통계 및 반응을 요약하는 이미지이다.
도 8은 CART19의 장기간 발현을 도시하는 이미지이다.
도 9a 및 도 9b를 포함하는 도 9는 심(deep) B 세포 무형성을 도시하는 일련의 이미지이다.
도 10은 3명의 환자 모두에서 혈장 세포의 감소를 증명하는 이미지이다.
도 1a 내지 1f를 포함하는 도 1은 CART19 세포의 혈액 및 골수에서 지속된 생체내 확장 및 존속성을 증명하는 일련의 이미지이다. 도 1a 내지 1c에 도시된 전혈 또는 도 1d 내지 1f에 도시된 골수로부터 단리한 DNA, 도 1a 및 1d에 도시된 UPN 01, 도 1b 및 1e에 도시된 UPN 02 및 도 1c 및 1f에 도시된 UPN 03으로부터 수득한 샘플은 CART 19 서열을 검출하고 정량화하기 위해 정량화된 분석을 사용하여 Q-PCR 분석에 벌크로 제공했다. 각각의 데이터 포인트는 1.56% 미만의 최대 CV(%)를 갖는 100 내지 200ng 게놈 DNA에 대한 3회 측정치의 평균을 나타낸다. 분석에 대한 합격/불합격은 기준 샘플의 경사 및 증폭 효율 및 증폭에 대한 사전 확립된 범위를 포함했다. 기준 곡선 범위에 의해 확립된 분석에 대한 정량화 하한치는 2카피 도입유전자/게놈 DNA ㎍이고; 당해 값보다 낮은 샘플 수치는 추정치를 고려하고, 적어도 2/3 반복치가 값 15%에 대한 CV(%)와 함께 Ct 값을 생성한 경우를 나타낸다. CART19 세포는 UPN 01 및 UPN 03의 경우에 0일, 1일 및 2일, 및 UPN 02의 경우에 0일, 1일, 2일 및 11일에 주입했다.
도 2a 내지 2c를 포함하는 도 2는 생체내에서 기능적 메모리 CAR의 연장된 표면 CART19 발현 및 확립을 도시하는 일련의 이미지이다. 도 2a는 CAR-발현 CD3+ 림프구 및 말초 및 골수에서 B 세포의 부재의 검출을 나타낸다. CART19 세포 주입후 169일에서 UPN 03으로부터 수득한 새롭게 처리된 말초혈 또는 골수 단핵 세포는 CART19의 표면 발현(상부) 또는 B 세포의 부재(하부)에 대해 유동 세포분석법으로 평가하였고; 대조군으로서 건강한 기증자 ND365로부터 수득한 PBMC를 염색했다. CD3+ 림프구에서의 CAR3+ 발현을 평가하기 위해, 샘플을 CD14-PE-Cy7 및 CD16-PE-Cy7(덤프 채널) 및 CD3-FITC에 대한 항체로 동시 염색하고, CD3+ 상에서 양성적으로 게이팅 (gating)하였으며, CD8a-PE, 및 알렉사(Alexa)-647에 접합된 항-CAR19 유전자형 항체로 동시 염색함으로써 CD8+ 및 CD8-림프구 구획에서의 CAR19 발현에 대해 평가하였다. 플롯에서의 데이터는 덤프 채널-음성/CD3 양성 세포 모집단 상에서 게이팅된다. B 세포의 존재를 평가하기 위해, 샘플을 CD14-APC 및 CD3-FITC(덤프 채널)에 대한 항체로 동시 염색하고, CD20-PE 및 CD19-PE-Cy-7에 대한 항체로 동시 염색함으로써 덤프 채널-음성 분획에서 B 세포의 존재에 대해 평가하였다. 모든 경우에, 음성 게이트 4분원(gate quadrant)은 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이 비-염색 대조군 상에서 확립되었다. CD4+(도 2b) 및 CD8+(도 2c) T 세포 서브셋의 T 세포 면역표현형 검사가 제시되어 있다. T 세포 주입후 56일차 및 169일차에 아페레시스에 의해 수득된 UPN 03으로부터의 동결된 말초혈 샘플을 어떠한 인자의 첨가 없이 배양 배지에 밤새 방치하고, 세척하고, T 세포 메모리, 활성화 및 고갈에 대한 마커의 발현을 위한 다중-파라미터 면역표현형 검사를 실시하였다. 도 6에 도시된 바와 같은 게이팅 전략은 덤프 채널(CD14, CD16, 라이브/데드 아쿠아(live/dead aqua))-음성 및 CD3-양성 세포에 대한 초기 게이팅, 이어서 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대한 양성 게이팅을 포함한다. 게이트 및 4분원은 FMO 대조군(CAR, CD45RA, PD-1, CD25, CD127 및 CCR7)을 사용하여 확립되거나, 양성 세포 모집단(CD3, CD4, 및 CD8) 상에서 게이팅 및 명확하게 설명된 서브셋(CD27, CD28 및 CD57)에 의해 확립되었으며; 데이터는 사상의 객관적 가시화를 위한 이중 지수 변환 후에 표시되었다. 존속하는 CAR 세포의 기능적 역량이 하기 실험에서 제시된다. T 세포 주입후 56일차 및 169일차에 아페레시스에 의해 수득된 UPN 03으로부터의 동결된 말초혈 샘플은 어떠한 인자의 첨가 없이 배양 배지에서 밤새 방치하고, 세척하였으며, CD107 탈과립화 분석을 사용하여 CD19 발현 표적 세포를 인식하는 능력에 대해 생체외에서 직접 평가했다. 항-CD28, 항-CD49d 및 CD107-FITC의 존재하에 2시간 배양 후, 세포 혼합물을 수확하고, 세척하였으며, CD19 발현 표적에 반응하여 탈과립화하는 CART19 세포의 능력을 평가하기 위해 다중 파라미터 유동 세포분석법에 적용하였다. 상기 게이팅 전략은 덤프 채널(CD14-PE-Cy7, CD16-PE-Cy7, 라이브/데드 아쿠아)-음성 및 CD3-PE-양성 세포 상에서의 초기 게이팅, 및 이어서 CD8-PE-텍사스 레드(Texas Red)-양성 세포에 대한 게이팅을 수반했으며; 제시된 데이터는 CD8+ 게이팅된 모집단을 위한 것이다. 모든 경우에, 음성 게이트 4분원은 비-염색 대조군 상에서 확립되었다.
도 3a 내지 도 3c를 포함하는 도 3은 CART19 세포의 주입 후에 임상적 반응을 평가하는 실험 결과를 도시하는 일련의 이미지이다. 도 3a는 UPN 02가 최소 반응(R/B, 화살표)으로 2사이클의 리툭시맵(rituximab) 및 벤다무스틴(bendamustine)으로 처리되었다는 것을 나타낸다. CART19 T 세포는 벤다무스틴 단독(B, 화살표)으로 처리한지 초기 4일 후에 주입되었다. 리툭시맵 및 벤다무스틴 내성 백혈병은 주입 18일 이내에 절대 림프구 계수(ALC)에서 60,600/㎕에서 200/㎕로의 감소에 의해 나타낸 바와 같이 혈액으로부터 신속하게 제거되었다. 코르티코스테로이드 처리는 불안감 및 비감염성 발열 증상으로 인해 주입 후 18일차에 시작되었다. 기준선(점선)은 ALC에 대한 정상의 상한치를 나타낸다. 도 3b는 CD20에 대한 UPN 01 및 UPN 03 환자로부터 순차 골수 생검 또는 응고 검체를 염색하는 예시적 실험의 결과를 나타낸다. 환자 둘 모두에 존재하는 백혈병에 의한 전처리 침윤은 세포충실도(cellularity) 및 3계통 조혈의 정상화가 수반되는 후처리 검체 상에는 존재하지 않았다. UPN 01은 유동 세포분석법, 세포유전학 및 형광 원위치 하이브리드화(flourescence in situ hybridization, FISH)에 의해 평가하는 경우에 어떠한 CLL 세포도 검출되지 않거나, 골수 또는 혈액에서의 유동 세포분석법에 의해 검출된 정상 B 세포를 갖지 않았다. UPN 03은 +23일차에 유동 세포분석법에 의해 확인된 5%의 잔류 정상 CD5-음성 B 세포를 가졌으며, 이는 이들이 모노클로날인 것을 나타냈으며; +176일차에는 어떠한 정상 B 세포도 검출되지 않았다. 도 3c는 화학치료-내성의 일반화 림프샘장애의 신속한 분해능을 평가하기 위해 순차 CT 이미지화를 사용한 실험 결과를 나타낸다. 좌우 엽액량은, 화살표 및 원으로 표시된 바와 같이, 주입후 83일차(UPN 01) 및 31일차(UPN 03) 정도에 분해되었다.
도 4a 내지 도 4c를 포함하는 도 4는 UPN 01, UPN 02 및 UPN 03에 대해 순환시 절대 림프구의 계수 및 전체 CART19+ 세포를 도시하는 일련의 이미지이다. 순환시 전체 CART19+ 세포에 대한 림프구(전체 정상 세포 및 CLL 세포)의 전체 수는 혈액의 용적이 5.0ℓ이라는 가정하에 CBC 값으로부터의 절대 림프구 계수를 사용하여 3명의 대상체 모두에 대해 플롯팅된다. 순환시 CART19 세포의 전체 수는, 도 1에 도시된 바와 같이, 절대 림프구 계수를 갖는 직렬식 CBC 값 및 Q-PCR 마킹 값을 사용하여 산정되었으며, 카피수/㎍ DNA를 본 명세서의 다른 개소에 기재된 바와 같이 평균 마킹율(%)로 환산하였다. 상기 Q-PCR 마킹율(%)은 주입 생성물의 유동 세포분석 특성화 및 샘플로부터의 데이터와 밀접하게 상관(2배 미만의 변화)하는 것으로 밝혀졌으며, 이때 수반되는 유동 세포분석 데이터는 염색에 의해 CART19 세포를 직접 계산하는데 이용가능했다.
도 5a 내지 도 5d를 포함하는 도 5는 T 세포 주입후 71일차에 UPN-01 PBMC 중의 CART19-양성 세포의 직접 생체외(ex vivo) 검출을 수반하는 실험을 도시하는 일련의 이미지이다. 주입후 71일차에 새로운 아페레시스 후에 수집되거나 T 세포 생성물(기준선)의 제조를 위해 아페레시스 시점에 동결되고 염색 전에 생존가능하게 해동된 UPN-01 PBMC는 표면 상에서 CAR19 부분을 발현하는 CART19 세포의 존재를 검출하기 위해 유동 세포분석법을 적용하였다. 림프구에서 CAR19의 발현을 평가하기 위해, 샘플을 CD3-PE, 및 알렉사-647에 접합된 항-CAR19 유전자형 항체와 동시 염색하거나, CD3-PE 단독으로 동시 염색했다(CAR19용의 FMO). 도 5a는 초기 림프구 게이트가 전방 및 측면 산란(FSC 대 SSC)에 기초하여 확립된 후, CD3+ 세포 상에서 게이팅에 의해 확립되었다는 것을 나타낸다. 도 5b는 CD3+ 림프구 게이트를 나타내고; 도 5c는 CAR 유전자형 염색을 나타내고; 도 5d는 CAR 유전자형 FMO를 나타낸다. CAR19-양성 게이트는 CAR19 FMO 샘플 상에서 확립되었다.
도 6a 내지 도 6c를 포함하는 도 6은 UPN 03 혈액 검체에서의 다색성 유동 세포분석법을 이용함으로써 CART19 발현을 확인하기 위한 게이팅 전략을 도시하는 일련의 이미지이다. 도 6c에 대한 게이팅 전략은 56일차 UPN 03 샘플에 대해 제시되어 있으며, 169일차 UPN 03 샘플에 대해 사용된 전략을 나타낸다. 도 6a는 덤프(CD14, CD16, 라이브/데드 아쿠아) 음성 및 CD3-양성인 일차 게이트를 나타낸다. 도 6b는 CD4-양성 및 CD8-양성인 이차 게이트를 나타낸다. 도 6c는 CAR19-양성 및 CAR19-음성인 삼차 게이트를 나타내며, 이들은 CAR FMO 샘플(가장 우측 패널) 상에 확립되었다.
도 7은 환자의 인구 통계 및 반응을 요약하는 이미지이다.
도 8은 CART19의 장기간 발현을 도시하는 이미지이다.
도 9a 및 도 9b를 포함하는 도 9는 심(deep) B 세포 무형성을 도시하는 일련의 이미지이다.
도 10은 3명의 환자 모두에서 혈장 세포의 감소를 증명하는 이미지이다.
본 발명은 부분적으로, CD3z 및 4-1BB 공자극 도메인 둘 다를 포함하는 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포(CART19 세포)가 장기간 동안 포유동물 숙주에서 존속했다는 놀라운 발견에 기초한다. 예를 들면, 현 시점에서, 표면 CAR19를 발현하는 세포는 CAR19 T 세포 주입 후에 21개월에 걸쳐 포유동물 숙주에서 존재하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명은 포유동물에서 내성을 유도하기 위해 B 세포를 표적화하는 CAR을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 포유동물에서 정상 B 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 B 세포를 고갈시키고 따라서 내성을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 형질도입된 T 세포의 양자 세포 전이의 방법에 관한 것이다. CAR은 표적 항원(예: B 세포 항원)에 대한 항체-기반 특이성을, 특이적 항-B 세포의 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 B 세포 항원을 표적화하는 항원 인식 도메인을 갖는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 목적하는 CAR을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 도입함으로써 생성될 수 있다. 본 발명의 CAR T 세포는 생체내에서 복제 가능하여, 지속된 B 세포 고갈 및 내성을 유도할 수 있는 장기간 존속성을 초래할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 거부 에피소드 또는 이식후 림프구증식성 질환의 발생, 중증도 또는 지속기간을 효과적으로 감소시키기 위해 CAR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포를 투여하는 것에 관한 것이다.
정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법은 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 기재하고 청구할 때 하기 용어가 사용될 것이다.
또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시형태를 기재하기 위한 것이며, 제한을 의도하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
관사 "하나(a, an)"는 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양, 시간적 지속 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 경우에 본 명세서에서 사용되는 "약"은, 이러한 변형이 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기에 적절하도록, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 일부 경우에 ±5%, 일부 경우에 ±1% 및 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포함한다는 것을 의미한다.
"활성화"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 검출가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토킨 생성 및 검출가능한 효과기 기능과 연관될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 그 중에서도 세포 분열을 받은 T 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원에서 유래한 완전한 면역글로불린일 수 있으며, 완전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 통상 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에서의 항체는, 예를 들면, 단일 사슬 항체 및 인간화된 항체 뿐만 아니라 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다[참조: Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426].
용어 "항체 단편"은 완전한 항체의 일부를 지칭하고, 완전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는, 이로써 한정되지 않지만, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역학적 적격 세포의 활성화, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로 기능할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 DNA 또는 게놈 DNA로부터 유래할 수 있다. 따라서, 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 이러한 용어가 본 명세서에서 사용됨에 따라, "항원"을 코딩한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당해 기술분야의 숙련자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은, 이로써 한정되지 않지만, 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 용도를 포함하며, 이들 뉴클레오티드 서열은 목적하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 정렬된다는 것이 매우 자명하다. 게다가, 당업자는 항원이 전적으로 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 생성되거나 합성될 수 있거나, 생물학적 샘플로부터 유래할 수 있다는 것은 매우 자명하다. 이러한 생물학적 샘플로는, 이로써 한정되지 않지만, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 들 수 있다.
용어 "자가-항원"은, 본 발명에 따라서, 외래인 것과 같이 면역계에 의해 인식되는 임의의 자기-항원을 의미한다. 자가-항원은, 이로써 한정되지 않지만, 세포 단백질, 인단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 세포 표면 수용체를 포함하는 당단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "자가면역 질환"은 자가면역 반응에 기인하는 질환으로 정의된다. 자가면역 질환은 자기-항원에 대한 부적절하고 과다한 반응의 결과이다. 자가면역 질환의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 그 중에서도 에디슨 질환, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 크론병, 당뇨병(I형), 이영양성 수포성 표피박리증, 정소상체염, 사구체신염, 그레이브병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신 홍반 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 건선, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 강피증, 소그렌 증후군, 척추 관절염, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "자가"는, 동일한 개체로부터 유래하고, 이후에 다시 상기 개체에게 재도입될 수 있는 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
"동종성"은 동일한 종의 다른 동물에서 유래한 이식편을 지칭한다.
"이종성"은 상이한 종의 동물에서 유래한 이식편을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "B 세포 표면 마커"는, 이에 결합하는 약제로 표적화될 수 있는 B 세포의 표면 상에서 발현된 항원이다. B 세포 표면 마커의 예는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커를 포함한다. 특히 목적하는 B 세포 표면 마커는 포유동물의 기타 비-B 세포 조직과 비교하여 B 세포 상에서 우선적으로 발현되고, 전구체 B 세포 및 성숙 B 세포 둘 다에서 발현될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 바람직한 마커는 CD19이고, 이는 최종 분화된 혈장 세포 단계를 통해 프로/프리-B 세포 단계로부터 계통 분화 전체에 걸쳐 B 세포 상에서 발견된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "B 세포 고갈"은, 처리전 수준과 비교하여, 약물, 세포 또는 항체 처리 후의 동물 또는 인간에서 B 세포 수준의 감소를 지칭한다. B 세포 수준은 전체 혈구수를 수득하는 것에 의해, 공지된 B 세포 마커에 대해 FACS 분석 염색에 의해 및 본 명세서의 다른 개소에 기재된 방법 등의 공지된 분석법을 사용하여 측정가능하다. B 세포 고갈은 부분적이거나 또는 완전할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, B 세포의 고갈은 25% 이상이다.
용어 "고갈시키다" 및 "고갈"은, B 세포와 관련하여 및 본 명세서 및 특허청구범위를 위해, B 세포 기능의 차단: B 세포의 기능적 불활성화; B 세포의 세포용해; B 세포의 증식 억제; B 세포의 혈장 세포로의 분화 억제; 치료적 이익을 야기하는 B 세포 기능이상의 유발; 항-방출 항원 항체의 생성 억제; B 세포 수의 감소; 방출 항원에 의한 프라이밍 또는 활성화된 B 세포의 불활성화; 방출 항원에 의한 프라이밍 또는 활성화된 B 세포의 하나 이상의 기능의 차단: 방출 항원에 의한 프라이밍 또는 활성화된 B 세포의 세포용해; 및 방출 항원에 의한 프라이밍 또는 활성화된 B 세포 수의 감소 중의 하나 이상을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. B 세포 고갈은, 이로써 한정되지 않지만, 클론 불활성화, 아폽토시스, 항체-의존성 세포 세포독성, 보체-매개된 세포독성, 및 신호 경로 매개된 불활성화, 기능장해 또는 세포 사멸을 포함하는 하나 이상의 메커니즘의 결과일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "암"은 변종 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로서 정의된다. 암 세포는 국부적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 체내의 기타 부분으로 확산할 수 있다. 다양한 암의 예로는, 이로써 한정되지 않지만, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 들 수 있다.
"CD19" 항원은, 예를 들면, HD237 또는 B4 항원에 의해 동정될 수 있는 약 90kDa의 항원을 지칭한다[참조: Kiesel et al, 1987 Leukemia Research II, 12: 11 19]. CD19는 줄기 세포 단계로부터 B-계통 세포의 분화 전체에 걸쳐 혈장 세포로의 최종 분화를 통해 세포에서 발견되고, 상기 세포는, 이로써 한정되지 않지만, 프리-B 세포, B 세포(천연 B 세포, 항원-자극된 B 세포, 메모리 B 세포, 혈장 세포 및 B 림프구를 포함) 및 여포 수지상 세포를 포함한다. CD19는 또한 인간 태아 조직 중의 B 세포에서 발견된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체에 의해 표적화된 CD19 항원은 인간 CD19 항원이다.
"공자극 리간드"는, 당해 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, T 세포 상의 동족 공자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들면, 펩티드가 적재된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공된 주요 신호 이외에, 이로써 한정되지 않지만, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포(예: aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상에 분자를 포함한다. 공자극 리간드는, 이로써 한정되지 않지만, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 또한, 공자극 리간드는 또한 특히 T 세포 상에 존재하는 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들면, 이로써 한정되지 않지만, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 연관된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
"공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여 T 세포에 의한 공자극 반응, 예를 들면, 이로써 한정되지 않지만, 증식을 매개하는 T 세포 상의 동종 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는, 이로써 한정되지 않지만, MHC 부류 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "공자극 신호"는 TCR/CD3 연결과 같은 일차 신호와 함께 T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 신호를 지칭한다.
"질환"은 동물의 건강 상태이고, 여기서 상기 동물은 항상성을 유지할 수 없으며, 상기 질병이 개선되지 않는 경우에 동물의 건강은 계속해서 악화된다. 대조적으로, 동물에서의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때와 비교하여 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않은 상태로 방치하는 경우, 장애는 필연적으로 동물의 건강 상태의 추가적인 저하를 유발하지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "내인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 임의의 재료 또는 이의 내부에서 생성되는 임의의 재료를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "외인성"이란 용어는 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 이의 외부에서 생성되는 임의의 재료를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 이의 프로모터에 의해 유도된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"는 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위해 충분한 시스 기능 요소를 포함하지만, 발현을 위한 기타 요소는 숙주 세포에 의해 공급되거나, 시험관 내(in vitro) 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당해 기술분야에 공지된 모든 벡터, 예를 들면, 코스미드, 플라스미드(예를 들면, 네이키드(naked) 또는 리포좀에 함유됨), 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 바이러스(예를 들면, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함한다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 둘 모두에서의 위치는 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들면, 2개의 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 상기 분자는 그 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이의 상동성의 비율(%)은 2개의 서열이 공유하는 정합 또는 상동성 위치의 개수를 비교 위치의 개수로 나누어 X 100한 함수 값이다. 예를 들면, 2개의 서열 내의 10개의 위치 중 6개가 정합하거나 상동성인 경우, 상기 2개의 서열은 상동성이 60%이다. 예를 들면, ATTGCC 및 TATGGC의 DNA 서열은 50%의 상동성을 공유한다. 일반적으로, 2개의 서열이 최대 상동성을 제공되도록 정렬되는 경우에 비교를 수행한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"은 항체로서 기능하는 단백질의 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 종종 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로서 지칭된다. 이러한 단백질의 부류에 포함된 5개의 멤버는 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 체내 분비물, 예를 들면, 타액, 눈물, 모유, 위장관 분비물, 및 호흡관 및 비뇨생식관의 점액 분비물에 존재하는 일차 항체이다. IgG는 가장 일반적인 순환 항체이다. IgM는 대부분의 대상체에서 일차 면역 반응에서 생성되는 주요 면역글로불린이다. 이는 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며, 박테리아 및 바이러스에 대한 방어에서 중요하다. IgD는, 알려져 있지 않은 항체 기능을 갖지만 항원 수용체로서 기능할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알러겐에 노출시에 비만 세포 및 호염기성 세포로부터의 매개체의 방출을 야기함으로써 즉시형 과민증을 매개하는 면역글로불린이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 T 세포 매개된 및/또는 B 세포 매개된 면역 반응을 포함한다. 예시적 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들면, 사이토킨 생성 및 세포 세포독성을 포함한다. 또한, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 수행되는 면역 반응, 예를 들면, 항체 생성(체액성 반응), 및 사이토킨 반응성 세포(예를 들면, 마크로파지)의 활성화를 포함한다. 면역 반응에 관여하는 면역 세포는 림프구, 예를 들면, B 세포 및 T 세포(CD4+, CD8+, Th1 및 Th2 세포); 항원 제시 세포(예: 수지상 세포, 마크로파지, B 림프구, 랑게르한스 세포 등의 프로페셔널 항원 제시 세포, 및 케라티노사이트, 내피세포, 성상세포, 섬유아세포, 희돌기교세포 등의 비-프로페셔널 항원 제시 세포); 천연 킬러 세포; 골아세포, 예를 들어 마크로파지, 호산구, 비만세포, 호염기구 및 과립구를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역학적 내성"은 미처리 대상체와 비교하여 처리된 대상체의 비율로 수행된 방법을 지칭한다: a) 특정의 면역학적 반응의 감소된 수준(항원-특이적 효과기 T 림프구, B 림프구, 항체 또는 이들의 등가물에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 생각됨); b) 특이적 면역학적 반응의 개시 또는 진행의 감소; 또는 c) 특이적 면역학적 반응의 개시 또는 진행의 감소된 위험. "특이적" 면역학적 내성은 면역학적 내성이, 다른 항원과 비교하여, 특정의 항원에 대하여 우선적으로 야기되는 경우에 발생한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "교육용 재료"는 간행물, 기록물, 도면, 또는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하기 위해 사용될 수 있는 임의의 기타 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육용 재료는, 예를 들면, 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 고정될 수 있거나, 상기 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 선적될 수 있다. 대안적으로는, 상기 교육용 재료는 상기 교육용 재료 및 화합물이 수령인에 의해 협조적으로 사용될 수 있도록 본 발명에 따라 상기 용기와는 별도로 선적될 수 있다.
"단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"된 것이 아니지만, 이의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들면, 숙주 세포와 같이 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "렌티바이러스"는 레트로바이러스(Retroviridae)과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열성 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 중에서도 특이하지만; 이들은 숙주 세포의 DNA 내로 유의한 양의 유전자 정보를 전달할 수 있고, 따라서 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 일례이다. 렌티바이러스에서 유래한 벡터는 생체내에서 유의한 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조절"이란 용어는 처리 또는 화합물의 부재하에 대상체에서의 반응 수준, 및/또는 달리 동일하지만 처리되지 않은 대상체에서의 반응 수준과 비교해서 대상체에서의 반응 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 상기 용어는 고유의 신호 또는 반응을 방해하고/하거나 상기 고유의 신호 또는 반응에 영향을 주어 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들면, 피하(s.c.), 정맥 내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 시험관내 또는 원위치(in situ)에서 본원에 기재된 방법에 적용가능한 임의의 동물 또는 이의 세포를 지칭한다. 특정의 비제한적인 실시형태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
용어 "거부"는 이식된 기관 또는 조직이 수용체의 신체에 의해 수용되지 않는 상태를 지칭한다. 거부는 이식된 기관 또는 조직을 공격하는 수용체의 면역계로부터 발생한다. 거부는 이식후 수일 내지 수주(급성) 또는 이식후 수년(만성)에 발생할 수 있다.
항체와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "특이적으로 결합하는"이란, 특정 항원을 인식하지만, 샘플 중에서 기타 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 못하는 항체를 의미한다. 예를 들면, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 이러한 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 종간 반응성은 그 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지는 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 그 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지는 않는다. 몇몇 경우, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 제2 화학종과 항체, 단백질 또는 펩티드의 상호작용과 관련하여 상기 상호작용이 상기 화학종 상의 특정한 구조(예를 들면, 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미하기 위해 사용될 수 있지만, 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리의 비표지 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합한 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "자극"이란 자극 분자(예를 들면, a TCR/CD3 복합체)와 이의 동종 리간드가 결합하여, 이로써 한정되지 않지만, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 형질도입 등의 신호 형질도입 사상(event)을 매개함으로써 유도된 일차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-β의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 재구성 등과 같이 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
"자극 분자"는, 용어가 본원에서 사용되는 경우, 항원 제시 세포에 존재하는 동종 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 의미한다.
"자극 리간드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 제시 세포(예를 들면, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상에 존재하는 경우에 T 세포 상의 동종 결합 파트너(본원에서 "자극 분자"로서 지칭됨)와 특이적으로 결합하여, 이로써 한정되지 않지만, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하는 T 세포에 의한 일차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 그 중에서도 펩티드가 적재된 MHC 부류 I 분자, 항-CD3 항체, 과작동제 항-CD28 항체, 및 과작동제 항-CD2 항체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아 있는 생물(예를 들면, 포유동물)을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 인간, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 이의 유전자도입 종을 들 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 기타 세포 유형을 본질적으로 포함하지 않는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 이의 자연적으로 발생하는 상태에서 세포가 통상 연관되어 있는 기타 세포 유형과는 분리되어 있는 세포를 지칭한다. 몇몇 경우, 실질적으로 정제된 세포의 모집단은 세포의 상동성 모집단을 지칭한다. 기타 예에서, 이러한 용어는 단순히 이들의 자연 상태에서 이들이 자연적으로 연관되어 있는 세포와는 분리되어 있던 세포를 지칭한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 세포는 시험관 내에서 배양된다. 기타 실시형태에서, 상기 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 처치 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 상태의 억제, 완화 또는 소거에 의해 수득된다.
용어 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 탐구되고 있는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 반응 또는 의학적 반응을 유도할 대상 화합물의 양을 지칭한다. 용어 "치료 유효량"은 화합물이 투여되는 경우에 치료될 장애 또는 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발생을 어느 정도 예방하거나 완화하기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료 유효량은 화합물, 질병 및 이의 중증도, 및 치료될 개체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "이식물"은 개체에 도입되는 세포, 조직 또는 기관을 지칭한다. 이식된 재료의 공급원은 배양된 세포, 또 다른 개체로부터의 세포 또는 동일한 개체로부터의 세포(예를 들면, 세포가 시험관내에서 배양된 후)일 수 있다. 예시적 기관 이식물은 신장, 간, 심장, 폐 및 췌장이다.
본원에서 당해 용어가 사용되는 경우 질병의 "치료"는 대상체가 경험한 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"은 숙주 세포 내로 외인성 핵산이 전달되거나 도입되는 프로세스를 지칭한다. "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"된 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입되어 있는 것이다. 상기 세포는 일차 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.
용어 "내성"은 특정 항원 또는 항원 그룹에 대한 감소되거나 또는 부재하는 면역 반응을 갖는 개체를 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 개체는 남성 또는 여성에서 이식 세포 거부(이에 대해 현저한 면역 반응을 개시)가 나타 않는 경우에 내성인 것으로 간주된다. 몇몇 경우에, 내성 개체는 면역억제 치료의 부재하에서도 이식된 세포를 거부하지 않는다. 본 발명과 관련하여, 개체는 당해 개체가 이식된 세포를 거부하는 경우에 "비-내성"인 것으로 간주된다. 비-내성 개체는 이식된 세포에 대한 활성 면역 반응을 경험하는 개체 뿐만 아니라 거부가 면역억제 치료(예: 표준 면역억제)를 사용하여 조절되는 개체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생체내 내성"은 외래 조직에 특이적인 면역 반응의 실질적 결여를 지칭한다. 면역 반응은 외래 조직에 대해 면역 반응을 개시하는 수용 대상체로부터 유래할 수 있거나, 역으로 면역 반응은 수용 대상체에 대해 면역 반응을 개시하는 외래 조직(예: GVHD)으로부터 유래할 수 있다. 생체내 내성을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.
범위: 본원의 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시형태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범주에 대한 유연성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 범위에 대한 기재는 이러한 범위 내의 각 수치 뿐만 아니라 가능한 부분범위 모두를 구체적으로 개시하고 있는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 이러한 범위의 개개 수치, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6 뿐만 아니라 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같이 부분범위를 구체적으로 개시하고 있는 것으로 간주되어야 한다. 이는 상기 범위의 너비와는 무관하게 적용된다.
기재
본 발명은 포유동물에서 정상 B 세포를 고갈시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR을 사용한 B 세포의 고갈은 포유동물에서 내성을 유도한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 이식된 외래 조직에 대해 생체내 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 이식된 조직의 거부를 예방 및/또는 치료하기 위해 부분적으로 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, 상기 방법은 본 발명의 CAR T 세포를 이식된 외래 조직에 노출된 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "외래 조직"은 골수 이식물, 기관 이식물, 수혈, 또는 의도적으로 대상체에 도입되는 임의의 기타 외래 조직 또는 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 이식-대-숙주 질환(GVHD)을 예방 및/또는 치료하기 위해 부분적으로 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, 상기 방법은 본 발명의 CAR T 세포를 이식된 외래 조직에 노출된 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "외래 조직"은 골수 이식물, 기관 이식물, 수혈, 또는 의도적으로 대상체에 도입되는 임의의 기타 외래 조직 또는 세포를 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR은, T 세포 항원 수용체 복합체 제타 쇄의 세포내 신호전달 도메인(예: CD3 제타)에 융합된 B 세포 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함하도록 조작될 수 있다. 예시적 B 세포 항원은 CD19인데, 이는 이 항원이 악성종양 B 세포 상에서 발현되기 때문이다. 그러나, 본 발명은 CD19을 표적화하는 것으로 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명은 이의 동종 항원에 결합하는 경우에 임의의 B 세포 항원 결합 부분을 포함한다. 항원 결합 부분은 바람직하게는 공자극 분자 및 제타 쇄의 하나 이상으로부터의 세포내 도메인과 융합된다. 바람직하게는, 항원 결합 부분은 CD137(4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3제타 신호 도메인 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 도메인과 융합된다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 CD137(4-1BB) 신호전달 도메인을 포함한다. 이는 본 발명이, CAR-매개된 T-세포 반응이 공자극 도메인의 부가에 의해 추가로 증강될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초하기 때문이다. 예를 들면, CD137(4-1BB)의 포함은, CD137(4-1BB)를 발현하도록 조작되지 않은 다른 동일한 CAR T 세포와 비교하여, CAR T 세포의 CAR 매개된 활성 및 생체내 존속성을 현저히 증가시켰다. 그러나, 본 발명은 특정 CAR로 제한되지 않는다. 오히려, B 세포를 표적화하는 임의의 CAR이 본 발명에 사용될 수 있다. CAR을 제조하기 위한 조성물 및 방법은 본원에서 참조로서 도입되는 국제공개공보 제PCT/US11/64191호에 기재되어 있다.
방법
본 발명은 B 세포를 고갈시키고 내성을 촉진시키기 위해 본 발명의 CAR 및 CAR T 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 상기 방법은 환자에서 이식 내성(예: 기관 또는 조직 이식의)을 촉진시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 GVHD의 예방 및/또는 치료를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 B 세포 상에서 CD19를 표적화한다.
한 가지 실시형태에서, 지속된 기증자 체액 내성을 유도하는 능력은 강력한 이식 내성을 달성하고/하거나 GVHD를 예방 또는 치료하는 요소이다. 본 발명은 기관 또는 조직 이식물과 연관된 하나 이상의 질환, 징후 또는 증상(예를 들면, 이식 거부, GVHD 및/또는 이와 연관된 증상)을 치료하기 위해 CAR T 세포를 동물, 바람직하게는 포유동물, 및 가장 바람직하게는 인간 환자에게 투여함으로써 B 세포를 고갈시키고 내성을 유도하는 본 발명의 CAR T 세포의 용도를 포함한다.
기관 거부는 면역 반응을 통해 이식된 조직의 숙주 면역 세포 파괴에 의해 발생한다. 유사하게는, 면역 반응은 또한 GVHD에 관여하지만, 이 경우에 외래 이식된 면역 세포는 숙주 조직을 파괴한다. 예를 들면, 기관 거부 및/또는 GVHD는 심장, 심장 판막, 폐, 신장, 간, 췌장, 위장, 피부 혈관, 골수, 줄기 세포, 골 또는 도세포 이식 후에 발생할 수 있다. 그러나, 본 발명은 특정 유형의 이식으로 제한되지 않는다. 비-제한적 예로서, 도세포 이식은 당뇨병의 개시를 예방하기 위해 또는 당뇨병의 치료로서 수행될 수 있다. 면역 반응, 특히 B-세포의 증식, 분화 또는 생존을 억제하는 본 발명의 CAR T 세포의 투여는 기관 및/또는 조직 거부 또는 GVHD를 예방하는 효과적 치료이다. 또한, 본 발명의 CAR T 세포의 투여는 기관 및/또는 조직 이식 후의 이식 내성을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 CAR T 세포는 또한 이식 내성을 촉진하고; 기관 및/또는 조직 이식물의 거부를 치료, 감소, 억제 및/또는 예방하기 위해; 및/또는 기관 또는 조직 이식물을 제공받은 환자에서 항체 역가를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하여 이식 거부를 예방 또는 지연시킴으로써 환자의 이식 내성을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하여 이식 기관 또는 조직 거부를 억제함으로써 환자에서 기관 또는 이식 거부를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하여 항체 역가를 감소시킴으로써 기관 또는 조직 이식을 제공받았거나 제공받을 환자에서 항체 역가를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하여 환자에서 이식 거부를 지연시키는 것을 포함하여 환자에서 이식 내성을 촉진시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하여 환자에서 이식 기관 또는 조직 거부를 억제하는 것을 포함하여 환자에서 이식 기관 또는 조직 거부를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하여 환자에서 항체 역가를 감소시키는 것을 포함하여 기관 또는 조직 이식을 제공받았거나 제공받을 환자에서 항체 역가를 감소시키는 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자에서 면역글로불린 생성을 억제 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 B 세포 기능을 감소 또는 억제한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 대상체로부터 B 세포를 고갈 또는 제거한다. 예를 들면, 본 발명의 CAR T 세포는 T 세포가 B 세포에 대한 효과기 기능을 나타내도록 하기 위해 B 세포 표면 항원을 표적화하도록 조작될 수 있다.
이식후의 유해한 면역 반응을 억제하기 위한 치료
본 발명은 이식후의 GVHD 또는 이식 거부를 억제하기 위한 치료로서 본 발명의 CAR T 세포를 사용하는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 수용체에게 이식물의 이식 전에, 이식과 동시에 또는 이식 후에 기증자 이식물, 예를 들면, 생물적합성 격자 또는 기증자 조직, 기관 또는 세포를 본 발명의 CAR T 세포와 접촉시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 CAR T 세포는 수용체에 대해 기증자 이식물에 의한 유해한 반응을 완화, 억제 또는 감소시켜 GVHD를 예방 또는 치료하는 역할을 한다.
본원의 다른 개소에 설명된 바와 같이, T 세포는, 이식물의 수용체에 대해 이식물에 의한 바람직하지 않은 면역 반응의 제거 또는 감소에 사용하기 위해 본 발명의 CAR T 세포를 생성하는 임의의 공급원, 예를 들면, 조직 기증자, 이식물 수용체 또는 기타 무관한 공급원(전혀 상이한 개체 또는 종)으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR T 세포는 조직 기증자, 이식물 수용체 또는 기타 무관한 공급원에 대해 자가, 동종 또는 이종성일 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 이식물은 수용체 내로의 이식편의 이식 전에, 동시에 또는 후에 본 발명의 CAR T 세포에 노출된다. 이러한 상황에서, 임의의 알로반응성 수용체 세포에 의해 유발된 이식물에 대한 면역 반응은, CAR T 세포가 B 세포를 고갈시키고 내성을 유도할 수 있기 때문에, 이식물에 존재하는 본 발명의 CAR T 세포에 의해 억제될 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 기증자 이식물은 수용체에 대한 이식물의 면역원성을 감소시켜 GVHD 또는 이식편 거부를 감소 및/또는 예방하기 위해 수용체 내로 이식 전에 이식물을 처리함으로써 "사전 조정" 또는 "전처리"될 수 있다. 이식물은 이식물과 연관될 수 있는 T 세포를 활성화시키기 위해 이식 전에 수용체로부터의 세포 또는 조직과 접촉될 수 있다. 수용체의 세포 또는 조직을 사용한 이식물의 처리 후, 세포 또는 조직은 이식물로부터 제거될 수 있다. 이어서, 처리된 이식물은 수용체로부터의 세포 또는 조직의 처리에 의해 활성화된 T 및/또는 B 세포의 활성을 감소, 억제 또는 제거하기 위해 본 발명의 CAR T 세포와 추가로 접촉된다. 본 발명의 CAR T 세포를 사용한 이식물의 이러한 처리 후, CAR T 세포는 수용체 내로의 이식 전에 이식물로부터 제거될 수 있다. 그러나, 일부 CAR T 세포는 이식물에 부착할 수 있고, 따라서 이식물을 갖는 수용체에 도입될 수 있다. 이러한 상황에서, 수용체 내로 도입된 CAR T 세포는 이식물과 연관된 임의의 세포에 의해 유발된 수용체에 대한 면역 반응을 억제할 수 있다. 임의의 특정한 이론에 결부되지 않기를 바라면서, 수용체 내로 이식물의 이식 전에 CAR T 세포를 사용한 이식물의 처리는 활성화된 T 및/또는 B 세포의 활성을 감소, 억제 또는 제거하여, 수용체의 조직 및/또는 세포로부터 후속의 항원성 자극에 대한 T 및/또는 세포의 재자극을 예방하거나 저반응성을 유도하는 역할을 한다. 당해 기술분야의 숙련가는 이식 전에 이식물의 사전조정 또는 전처리가 이식편 대 숙주 반응을 감소 또는 제거할 수 있다는 것을 본 개시에 기초하여 이해할 것이다.
치료에의 적용
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 T 세포가 CAR을 발현하도록 유전자 변형되고 CAR T 세포가 이를 필요로 하는 수용체에게 주입되는 세포 치료 유형을 포함한다. 주입된 세포는 표적화된 세포를 사멸시킬 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 표적화된 세포는 B 세포이다. 항체 치료와는 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제 가능하여, 지속된 B 세포 고갈 및 내성을 유도할 수 있는 장기간 존속성을 야기한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 강력한 생체내 T 세포 확장을 경험할 수 있고, 연장된 시간 동안 존속할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 B 세포 증식을 억제하기 위해 재활성화될 수 있는 특이적 메모리 T 세포로 진화한다. 예를 들면, CART19 세포는 CD19를 발현하는 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유발한다.
본 발명의 CAR-변형된 T 세포는 또한 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료를 위한 백신 유형으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화와 관련하여, 하기 중의 적어도 하나가 세포를 포유동물에게 투여하기 전에 시험관내에서 발생한다: i) 세포의 확장, ii) CAR을 코딩하는 핵산을 세포에 도입 및/또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 과정은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 하기에 더욱 상세하게 논의되어 있다. 간단하게, 세포는 포유동물(바람직하게는 인간)로부터 단리되어, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전자 변형된다(즉, 시험관내에서 형질도입되거나 형질감염됨). CAR-변형된 세포는 치료 이익을 제공하기 위해 포유동물 수용체에 투여될 수 있다. 포유동물 수용체는 인간일 수 있으며, CAR-변형된 세포는 상기 수용체에 대해 자가성일 수 있다. 또는, 상기 세포는 수용체와 관련하여 동종성, 동계성(syngeneic) 또는 이종성일 수 있다.
생체외 면역화와 관련하여 세포-기반 백신을 사용하는 이외에, 본 발명은 또한 환자에서 B 세포 항원에 대해 지향된 면역 반응을 유도하기 위해 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 B 세포의 고갈 및 내성의 유도에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 T 세포는 기관 또는 조직 이식과 연관된 하나 이상의 질환, 장애 또는 증상(예: GVHD 및/또는 이와 연관된 증상)의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 치료학적 유효량의 CAR-변형된 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 기관 거부 및 GVHD의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 면역억제제와 조합하여 투여된다. 당해 기술분야에 공지된 임의의 면역억제제가 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역억제제는 사이클로스포린, 아타티오프린, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 마이코페놀산, 프레드니손, 시로리무스, 바실릭시맵 또는 닥리주맵 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 특정한 면역억제제는, 이로써 제한되지 않지만, ORTHOCLONE OKTTM 3(무로모납-CD3), SANDIMMUNETM, NEORALTM, SANGDYATM(사이클로스포린), PROGRAFTM(FK506, 타크로리무스), CELLCEPTTM(마이코페놀레이트 모테필, 이의 활성 대사물질은 마이코페놀산이다), IMURANTM(아자티오프린), 글루코코르티코스테로이드, 아드레노코르티칼 스테로이드, 예를 들면, DELTASONETM(프레드니손) 및 HYDELTRASOLTM(프레드니솔론), FOLEXTM 및 MEXATETM(메토트렉세이트), OXSORALEN-ULTRATM(메톡살렌), RITUXANTM(리툭시맵) 및 RAPAMUNETM(시롤리무스)를 포함한다.
본 발명의 CAR T 세포는 면역억제제의 투여 전, 후 또는 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 CAR T 세포는 면역억제제가 환자에게 투여된 후에 투여될 수 있거나, 본 발명의 CAR T 세포는 면역억제제가 환자에게 투여되기 전에 투여될 수 있다. 또는 달리는 또한, 본 발명의 CAR T 세포는 면역억제제가 환자에게 투여되는 것과 동시에 투여된다.
본 발명의 CAR T 세포 및/또는 면역억제제는 이식 후에 환자에게 투여될 수 있다. 또는 달리는 또한, 본 발명의 CAR T 세포 및/또는 면역억제제는 이식 전에 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 CAR T 세포 및/또는 면역억제제는 또한 이식 수술 동안 환자에게 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, CAR T 세포를 환자에게 투여하는 본 발명의 방법은 면역억제 치료가 개시되면 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들면, 시간에 따라 및, 필요한 경우, 상이한 면역억제 치료 섭생으로 이식 수용체를 모니터링하기 위해 1회 이상 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 이식 수용체가 이식물에 내성이 있는 것으로 예측되는 경우에 면역억제 치료는 감소된다. 몇몇 실시형태에서, 이식 수용체가 이식물에 내성이 있는 것으로 예측되는 경우에 임의의 면역억제 치료는 처방되지 않고, 예를 들면, 면역억제 치료는 중단된다. 이식 수용체가 비-내성 바이오마커 신호를 나타내는 경우, 면역억제 치료는 표준 수준으로 복귀되거나 지속될 수 있다.
기관 또는 조직 이식물은 심장, 심장 판막, 폐, 신장, 간, 췌장, 위장, 피부, 혈관, 골수, 줄기 세포, 골 또는 도세포일 수 있다.
본 발명의 CAR T 세포는 이식 기관 또는 조직 거부의 진단 후에 투여되고, 이어서 기관 또는 조직 거부의 증상이 진정될 때까지 본 발명의 CAR T 세포 및 면역억제제 둘 다가 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 증가된 항체 역가의 진단 후에 투여되고, 이어서 항체 역가가 감소될 때까지 본 발명의 CAR T 세포 및 면역억제제 둘 다가 투여된다.
바람직하게는, 본 발명의 CAR T 세포를 사용한 치료는 환자에게 본 발명의 유효량의 CAR T 세포를 투여함으로써 달성된다.
본 발명의 변형된 T 세포는 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2 또는 기타 사이토킨과 같은 기타 성분, 또는 세포 모집단과 함께 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간단하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 모집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수 등과 같은 완충액; 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란; 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들면, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료(예방)될 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여량 및 투여 빈도는 환자의 조건, 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
"유효량"이 표시되는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양의 크기, 감염 또는 전이 정도, 환자(대상체)의 조건에서 개인차를 고려하여 전문의에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 체중(㎏)당 104 내지 109개의 세포 투여량, 적합하게는 체중당 105 내지 106 세포 투여량(이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)으로 투여될 수 있는 것으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량에서 수회 투여될 수 있다. 상기 세포는 면역치료에서 통상 공지되어 있는 주입 기술을 이용하여 투여될 수 있다[참조: Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988]. 특정한 환자를 위한 최적 투여량 및 치료 섭법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 처치를 조절함으로써 의약 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이는 활성화된 T 세포를 대상체에 투여한 후 후속적으로 다시 수혈하고(또는 아페레시스를 수행하고), 본 발명에 따라 이로부터 T 세포를 활성화하고, 이들 활성화되고 증식된 T 세포를 환자에 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 공정은 수주마다 수회 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 수혈액으로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc 또는 100cc의 수혈액으로부터 활성화된다. 이론과 결부되지 않지만, 이러한 다중 수혈/다중 재주입 프로토콜의 사용은 T 세포의 특정 모집단을 선별하도록 작용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 수질내, 근육내 투여될 수 있거나, 정맥 내(i.v.) 주사에 의해 투여되거나, 또는 복막내 투여될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 상기 T 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법, 또는 T 세포가 치료적 수준까지 증식되는 당해 기술분야에 공지된 기타 방법을 이용하여 활성화되고 증식된 세포는 다수의 임의의 관련된 처리 양식(예를 들면, 이전, 동시 또는 이후)과 함께 환자에게 투여되며, 이때 상기 관련된 처리 양식은, 이로써 한정되지 않지만, 항바이러스성 요법, 시도포피르(cidofovir) 및 인터류킨-2, 시타라빈(Cytarabine, ARA-C로도 공지됨) 등과 같은 약제에 의한 치료, 또는 MS 환자를 위한 나탈리주맵 치료 또는 건선 환자를 위한 에팔리주맵 치료, 또는 PML 환자를 위한 기타 치료를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법, 방사선, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506 등의 면역억제제, 항체, 또는 CAM PATH 등의 기타 면역절제제, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 치료, 사이톡신, 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드류, FR901228, 사이토킨류 및 방사선치료와 함께 사용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도된 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다[참조: Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993]. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 및 플루다라빈, 외부 방사선 치료(XRT) 또는 사이클로포스파미드 등의 화학치료제 및 OKT3 또는 CAMPATH 등의 항체 중의 하나를 이용하는 T 세포 절제 치료(예를 들면, 이전, 동시 또는 이후)와 함께 환자에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 약제, 예를 들면, 리툭산 등의 B-세포 절제 치료 이후에 투여된다. 예를 들면, 한 가지 실시형태에서, 대상체는 높은 투여량의 화학치료 후에 말초혈 줄기세포 이식에 의한 표준 치료를 경험할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식 후에, 대상체는 본 발명의 증식된 면역 세포의 주입액을 제공받는다. 추가의 실시형태에서, 증식된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
환자에 투여되는 상기 치료의 투여량은 치료되는 상태 및 치료받는 수용체의 정확한 성질에 따라 상이할 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링(scaling)은 당해 기술분야에서 허용된 관행에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, CAMPATH에 대한 복용량은 일반적으로 성인 환자에 있어서 1 내지 약 100㎎의 범위일 것이고, 일반적으로는 1일 내지 30일의 기간 동안에 매일 투여될 것이다. 바람직한 1일 복용량은, 몇몇의 경우 1일당 최대 40㎎의 복용량이 사용될 수 있지만(미국 특허 제6,120,766호에 기재됨), 1일당 1 내지 10㎎이다.
실험예
본 발명은 다음의 실험예를 참조하여 추가로 상세하게 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 다음의 실시예로 한정되는 것으로 결코 해석되지 않아야 하며, 오히려 본원에 제공되는 교시의 결과로서 증명되는 임의의 변형 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 기재 없이, 당해 기술분야의 숙련가는 이전의 기재 및 다음의 예시적 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조하고 사용할 수 있고, 특허청구된 방법을 실시할 수 있다고 생각된다. 따라서, 다음의 실시예는 구체적으로는 본 발명의 바람직한 실시형태를 지적하고, 어떠한 방식으로도 개시의 나머지를 제한하는 것으로 해석되어서는 않된다.
실시예 1: 키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 정상 B 세포를 고갈시키고 내성을 유도한다.
본원에 제시된 결과는 CART 19 세포가 환자에서 치료학적 이익을 적어도 18개월 동안 존속하고 제공하는 것을 증명한다. 조작된 T 세포는 생체내에서 400배 확장했고, 골수로 수송했으며, 적어도 6개월 동안 고도로 기능적 CAR을 계속 발현시켰다. 평균하여, 각각의 주입된 CAR+ T 세포는 적어도 1000개 CLL 세포를 근절시켰다. CD19 특이적 면역 반응은 3명의 환자중 2명에서 완전 관해가 수반되는 혈액 및 골수에서 증명되었다. 세포의 일부는 메모리 CAR+ T 세포로서 존속하고, 이는 B 세포 악성종양의 효과적 치료를 위한 이러한 비-MHC 제한된 방법의 가능성을 나타낸다.
이들 실험에 사용된 재료 및 방법이 이제 기재된다.
재료 및 방법
프로토콜 설계
임상 시험(NCT01029366)은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 국제공개공보 제PCT/US11/64191호에 기재된 바와 같이 수행되었다.
벡터 생성
CD19-BB-z 도입유전자(GeMCRIS 0607-793)를 문헌[참조: Milone et al., 2009, Mol Ther. 17: 1453-1464]에 기재된 바와 같이 설계하고 작제했다. 렌티바이러스 벡터는 문헌[참조: Zufferey et al., 1997, Nature biotechnol 15: 871-875]에 기재된 바와 같이 렌티겐 코포레이션(Lentigen Corporation)사에서 3-플라스미드 생성 접근법을 이용하여 현재 적정 제조 기준(good manufacturing practice)에 따라 생산하였다.
CART19 세포 생성물의 제조
항-CD3 및 항-CD28 모노클로날 항체로 코팅된 상자성 폴리스티렌 비드를 사용하는 T 세포의 제조 방법은 개시되어 있다[참조: Laport et al., 2003, Blood 102: 2004-2013]. 렌티바이러스 형질도입은 기재된 바와 같이 수행했다[참조: Levine et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103: 17372-17377].
실험 결과는 하기에 기재되어 있다.
CART19의 생체내 확장 및 존속 및 골수로의 수송
CD3/CD28 비드를 사용하여 확장되고 4-1BB 신호전달 도메인을 발현하는 CAR+ T 세포는 4-1BB가 결여된 CAR에 대해 개선된 것으로 여겨진다. Q-PCR 분석은 혈액 및 골수에서 CART19 세포의 정량적 수송을 가능하기 하기 위해 개발되었다. 모든 환자는 도 1a 및 도 1c에 도시된 바와 같이 적어도 6개월 동안 혈액 내의 CART19-세포의 확장 및 존속을 나타냈다. 놀랍게도, 환자 UPN 01 및 UPN 03은 주입 후 첫 1개월 동안에 혈액 내의 CAR+ T 세포의 확장이 1,000 내지 10,000배였다. 피크 확장 수준은 환자 UPN 01(15일차) 및 환자 UPN 03(23일차)에서 주입 후 임상적 증상의 개시와 일치하였다. 더욱이, 일차 역학으로 모델링될 수 있는 초기 감쇄 후, CART19 T 세포 수준은 주입 후 90일차에서 180일차까지 3명의 환자 모두에서 안정화되었다. 중요하게는, 비록 도 1d 내지 도 1f에서 도시된 바와 같이 혈액에서 관찰된 것보다 5배 내지 10배 정도 낮을 지라도 CART19 T 세포는 또한 환자 모두에서 골수로 수송되었다. 환자 UPN 01 및 03은 소실(T1/2)이 약 35일로서 골수에서 로그 선형 감쇄를 나타냈다.
혈액에서 메모리 CART19 세포의 모집단의 장기간 발현 및 확립
CAR 매개된 암 면역치료에서의 주요 논점은 최적화된 세포 제조 및 공자극 도메인이 유전적으로 변형된 T 세포의 존속을 증강시키고, 환자에서 CAR+ 메모리 T 세포의 확립을 허용하는지의 여부이다. 이전 연구에 따르면, 주입 후에 CAR의 강력한 확장, 장기간 존속 및/또는 T 세포 상에서의 발현이 증명되지 않았다[참조: Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-6115; Lamers et al., 2006, J Clin Oncol 24: e20-e22; Till et al., 2008, Blood, 112, 2261-2271; Savoldo et al., 2011, J Clin Invest doi: 10.1172/JCI46110]. 주입 후 169일차에 혈액 및 골수 모두로부터의 샘플의 유동 세포분석에 따르면, UPN 03에서 세포를 발현하는 CAR19의 존재(도 2a 및 도 2b) 및 도 2a에 도시된 바와 같은 B 세포의 부재가 나타났다. 놀랍게도, Q-PCR 분석에 의해, 3명의 환자 모두는 도 1 및 도 4에 도시된 바와 같이 4개월 및 그 이상 동안 존속하는 CAR+ 세포를 가졌다. 유동 세포분석법에 의한 CAR+ 세포의 생체내 빈도는 CART19 도입유전자에 대한 PCR 분석으로부터 수득된 값과 밀접하게 일치했다. 중요하게도, 도 2a에 도시된 바와 같이 CAR19+ 세포는 CD16-양성 또는 CD14-양성 서브셋에서 검출할 수 없기 때문에, 환자 UPN 03에서 CD3+ 세포만이 CAR19를 발현했다. CAR 발현은 또한 도 5에 도시된 바와 같이 주입 후 71일차에 환자 UPN 01의 혈액 내에서 4.2%의 T 세포의 표면 상에서 검출되었다.
이어서, 다색성 유동 세포분석법은, 도 6에 도시된 항-CAR 유전자형 항체 (MDA-647) 및 게이팅 전략을 이용하여 UPN 03에서 CART19 세포의 발현, 표현형 및 기능을 추가로 특성화하도록 상세한 연구를 수행하기 위해 사용되었다. CAR19 발현에 기초하여 CD8+ 및 CD4+ 세포 둘 모두에서 메모리 및 활성화 마커의 발현에서의 현저한 차이가 관찰되었다. 56일차에, CART19 CD8+ 세포는 도 2c에 도시된 바와 같이 항원에 대한 장기간의 강력한 노출과 일치하는 효과기 메모리 표현형(CCR7-CD27-CD28-)을 주로 나타냈다. 대조적으로, CAR 음성 CD8+ 세포는 세포의 서브셋에서의 CCR7 발현 및 CD27+/CD28- 및 CD27+/CD28+ 분획에서의 실질적 개수와 함께 효과기와 중추 메모리 세포의 혼합물로 이루어져 있다. CART19 및 CAR 음성 세포 모집단 둘 모두는 실질적으로 CD57을 발현하지만, 이러한 분자는 균일하게 CART19 세포에서의 PD-1과 공-발현되며, 이는 이들 세포의 광범위한 복제 이력을 반영할 가능성이 있다. CAR 음성 세포 모집단과는 대조적으로, 전체 CART19 CD8+ 모집단은 CD25 및 CD127 둘 모두의 발현을 결여했다. 169일차 정도에, CAR 음성 세포 모집단의 표현형은 56일차 샘플과 유사하게 유지되었지만, CART19 모집단은 PD-1 음성, CD57 음성 및 CD127 양성인 CAR+ 세포 뿐만 아니라, 중추 메모리 세포의 특징, CCR7의 현저한 발현, 및 CD27 및 CD28의 보다 높은 수준과 함께 소수의 모집단을 함유하도록 진화했다.
CD4+ 구획에서, 56일차에 CART19 세포는 도 2b에 도시된 바와 같이 CCR7의 균일한 결핍, CD57+ 구획 및 CD57-구획 둘 모두 내에 분포한 CD27+/CD28+/PD-1+ 세포의 우점종(predominance), 및 CD25 및 CD127 발현의 본질적 부재를 특징으로 했다. 대조적으로, 이러한 시점에서의 CAR 음성 세포는 CCR7, CD27 및 PD-1 발현에서 불균일하고, CD127을 발현시키고, 또한 실질적 CD25+/CD127-(잠재성 조절 T 세포) 모집단을 함유했다. 169일차 정도에, CD28 발현은 모든 CAR+CD4+ 세포에서 균일하게 양성으로 유지되는 반면, CART19 CD4+ 세포의 분획은 CCR7의 발현, CD27-세포의 보다 높은 비율(%), PD-1 음성 서브셋의 발생, 및 CD127 발현의 획득과 함께 중추 메모리 표현형으로 진화했다. CAR 음성 세포는 CD27 발현에서의 감소 및 CD25+/CD127-세포의 비율(%)에서의 감소를 제외하고는 이들의 56일차 대응물과 매우 일관되게 유지되었다.
CART19 세포는 혈액에서 6개월 후에 효과기 기능을 유지할 수 있다
짧은 존속성 및 부적절한 생체내 증식 이외에도, CAR+ T 세포를 사용한 이전 시험의 제한은 생체내 주입된 T 세포의 기능 활성의 신속한 상실이었다. 환자 UPN 01 및 03에서의 높은 수준의 CART19 세포의 존속 및 CAR19 분자의 표면 발현은 동결보존된 말초혈 샘플로부터 회수된 세포에서 항-CD19 특이적 효과기 기능을 직접 검사하기 위한 기회를 제공했다. 환자 UPN 03으로부터의 PBMC는 CD19 발현에 대해 양성 또는 음성인 표적 세포와 함께 배양되었다. CART19 T 세포의 강력한 CD19 특이적 효과기 기능은, 표면 CD107a 발현에 의해 평가된 바와 같이, CD19 양성이지만 CD19 음성이 아닌 표적 세포에 대해 특정한 탈과립화에 의해 증명되었다. 현저하게도, CD19 양성 표적에 대한 CART19 모집단의 노출은 표준 유동 세포분석 염색에서 동일한 효과기 세포에서 CAR19의 표면 발현을 위해 도 6에 도시된 바와 같이 표면 CAR-19의 신속한 내재화(internalization)를 유도했다. 표적 세포 상에 공자극 분자의 존재는 NALM-6 세포주가 CD80 또는 CD86을 발현하지 않기 때문에 CART19 세포의 탈과립화를 유발하기 위해 요구되지 않는다[참조: Brentjens et al., 2007, Clin Cancer Res 13: 5426-5435]. 효과기 기능은 주입후 56일차에 명백히 나타났고, 169일차 시점에도 유지되었다. CAR+ 및 CAR-T 세포의 강력한 효과기 기능은 또한 약리학적 자극에 의해 증명될 수 있다.
CART19 세포의 임상적 활성
임의의 환자에서 상기 주입후 4일 동안에 일시적 발열 반응이 아닌 유의한 독성은 관측되지 않았다. 그러나, 모든 환자는 후속적으로 첫 번째 주입후 7일차 및 21일차 사이에 유의한 임상적 독성 및 실험적 독성을 발달했다. 이들 독성은 단기간이고, 가역적이었다. 현재까지 치료를 받은 3명의 환자 중, 표준 기준에 따라 CART19 주입후 6개월 초과의 기간에서 CR이 2명이고 PR이 1명이다[참조: Hallek et al., 2008, Blood 111: 5446]. 각각의 환자에 대한 과거의 의료 이력 및 치료에 대한 반응에 대한 세부사항은 도 7에 도시되어 있다.
간단하게, 환자 UPN 01은 주입후 초기 10일 이후에 오한 및 일시적 저혈압과 함께 발열 증상이 발생했다. 신열은 약 2주 동안 존속하였으며, 치유되었지만, 상기 환자는 추가의 체질 증상은 없었다. 상기 환자는 도 3에 도시된 바와 같이 신속하고 완전한 반응을 달성했다. 주입후 1개월차와 6개월차 사이에 유동 세포분석법에 의해 혈액 내에서 어떠한 순환성 CLL 세포가 검출되지 않았다. CART19 세포의 주입후 1개월, 3개월 및 6개월차에 골수는 도 3b에 도시된 바와 같이 형태학 및 유동 세포 분석에 의해 림프구 침윤물의 지속적 부재를 나타냈다. 주입후 1개월 및 3개월차의 CT 스캔에 따르면, 도 3c에 도시된 바와 같이 선병증의 치유가 나타난다. 완전 관해는 이러한 보고 시점에 추가의 10개월 이상 동안 지속되었다.
환자 UPN 02는 리툭시맵과 함께 2회의 벤다무스틴으로 치료되었고, 그 결과 도 3a에 도시된 바와 같이 안정한 질병을 초래하였다. 상기 환자는 CART19 T 세포의 주입 전에 림프구제거 화학치료로서 3번째 복용량의 벤다무스틴을 제공받았다. 상기 환자는 첫 번째 주입후 11일차 및 두 번째 CART19 세포의 증강 당일에 24시간 입원을 요구하는 40℃까지의 신열, 오한 및 호흡곤란이 발생했다. 신열 및 신체 증상은 존속하였으며, 15일차에 상기 환자는 일시적 신부전증을 나타냈지만, 모든 증상은 18일차에 코르티코스테로이드 치료를 개시한 후에 치유되었다. CART19 주입 후 및 높은 신열의 개시와 동시에, 상기 환자는 도 3a에 도시된 바와 같이 말초혈로부터 p53 결핍 CLL 세포의 신속한 제거 및 선병증의 부분 감소를 나타냈으며, 골수는 극적 말초혈 세포감소에도 불구하고 치료 1개월 후에 CLL의 지속적이고 광범위한 침윤을 나타냈다. 상기 환자는 자각 증상이 없는 상태이다.
환자 UPN 03은 CART19 세포의 주입 전에 림프구제거 화학치료로서 펜토스타틴 및 사이클로포스파미드를 제공받았다. 화학치료 3일 후지만 세포 주입 전에, 골수는 CLL에 의한 약 50%의 관여로 과세포형성(60%)이었다. 상기 환자는 낮은 복용량의 CART19 세포(3일에 걸쳐 분할 투여된 1.5×105 CAR+ T 세포/㎏)를 제공받았다. 또한, 주입에 의한 급성 독성은 없었다. 그러나, 첫 번째 주입 14일 후에 상기 환자는 오한, 신열, 메스꺼움 및 설사가 나타나기 시작했다. 주입 후 22일차 정도에 종양 용해 증상은 입원을 요구하는 것으로 진단되었다. 상기 환자는 체질 증상의 치유를 나타냈고, CART19 주입 1개월 이내에 상기 환자는 형태학, 유동 세포분석법, 세포유전학 분석 및 FISH 분석에 의해 혈액 및 골수로부터 순환성 CLL의 제거를 나타냈다. CT 스캔에 따르면, 도 3b 및 도 3c에 도시된 바와 같이 비정상적인 선병증의 치유가 나타났다. 완전 관해는 초기 CART19 세포의 주입으로부터 8개월 이상 지속되었다.
CLL 표적 세포에 대한 생체내 CART19 효과기 비율의 고려
주입 후에 이들 계산으로 T 세포의 확장을 설명할 수는 없지만, 임상전 연구에 따르면 대형 종양은 제거될 수 있으며, 2.2×107개 CAR의 주입은 인간화된 마우스에서 1:42의 생체내 E:T 비율을 위해 1×109개 세포로 구성된 종양을 근절할 수 있는 것으로 나타났다[참조: Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106: 3360-3365]. 시간 경과에 따른 CLL 종양 부하의 추정은 주입된 CAR+ T 세포의 수에 기초하여 3명 대상체의 생체내에서 달성된 종양 감소 및 추정된 CART19 E:T 비율에 의해 산정되었다. 골수, 혈액 및 이차 림프 조직에서 CLL 부하량을 측정함으로써 종양 부하를 산정하였다. 도 7에 도시된 바와 같은 기준선 종양 부하에 따르면, 각각의 환자는 CART19 주입 전에 1012개 차수로 CLL 세포(즉, 1㎏의 종양 부하량)를 갖는 것으로 나타난다. 환자 UPN 03은 용적 CT 스캔 분석 방법에 따라 -1일차(즉, 화학치료후 및 CART19 주입전)에 골수에서 8.8×1011개 CLL 세포의 추정된 기준선 종양 부하, 및 3.3 내지 5.5×1011개 CLL 세포의 이차 림프 조직에서의 측정된 종양 양을 가졌다. 전체 초기 종양 부하(1.3×1012 CLL 세포)의 추정치를 사용하여 1.4×107개 CART19 세포 단독을 UPN 03에 주입하고 치료 후에 어떠한 CLL 세포도 검출 불가능한 것을 고려하면, 현저한 1:93,000의 E:T 비율이 달성되었다. 유사한 산정에 의해, 1:2200 및 1:1000의 효과적 생체내 E:T 비율이 UPN 01 및 UPN 02에 대해 산정되었다. 결국, 1,000배 초과의 생체내 CART19 확장과 조합된 CART19 T 세포의 일련의 사멸 기여는 CART19 세포에 의해 매개되는 강력한 항-백혈병 효과에 기여할 가능성이 있다.
키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 고도의 백혈병을 앓는 환자에서 메모리 및 강력한 항-종양 효과를 확립한다.
CAR의 제한된 생체내 발현 및 효과기 기능은 1세대 CAR을 검사하는 시험에서 주요 제한요소였다[참조: Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-6115; Lamers et al., 2006, J Clin Oncol 24: e20-e22; Till et al., 2008, Blood, 112, 2261-2271; Park et al., 2007, Mol Ther 15: 825833; Pule et al., 2008, Nat Med 14: 1264-1270]. 4-1BB 신호전달 모듈을 함유하는 CAR의 증강된 존속을 증명하는 임상전 모델링[참조: Milone et al., 2009, Mol Ther. 17: 1453-1464; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106: 3360-3365]에 기초하여, 렌티바이러스 벡터 기술에 의해 조작된 CAR의 2세대를 개발하도록 실험을 설계하였다. 이러한 CAR의 2세대는 만성 HIV 감염의 환경에서도 안전한 것으로 밝혀졌다[참조: Levine et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103: 17372-17377]. 현재의 결과에 따르면, 이러한 2세대 CAR이 T 세포에서 발현되고, 중추 메모리 T 세포의 이식을 촉진하도록 설계된 조건하에 배양되는 경우[참조: Rapoport et al., 2005, Nat Med 11: 1230-1237; Bondanza et al., 2006, Blood 107: 1828-1836], 이전 보고에 비해 주입 후의 CAR T 세포의 개선된 확장이 관찰된 것으로 나타난다. CART19 세포는 CD19 특이적 세포성 메모리를 확립하였고, 생체내에서 이전에는 달성되지 않았던 E:T 비율로 종양 세포를 사멸시켰다.
CART19는 4-1BB 신호전달 도메인을 도입하기 위한 첫 번째 CAR 시험 및 렌티바이러스 벡터 기술을 사용하기 위한 첫 번째 CAR 시험이다. 현재 결과에 따르면, CD19 특이성을 나타낸 "종양 침윤성 림프구"의 사실상(de facto) 확립과 함께 종양 부위에 대한 CAR의 효율적 수송이 증명된다. 현저한 생체내 확장은 환자로부터 직접 회수한 CAR이 수개월 동안 생체내에서 효과기 기능을 유지할 수 있다는 첫 번째 증명을 가능하게 했다. 이전 연구에 따르면, 1세대 CAR의 바이러스 특이적 T 세포내로의 도입은 일차 T 세포에 바람직한 것으로 제시되었지만[참조: Pule et al., 2008, Nat Med 14: 1264-1270], 최적으로 공자극된 일차 T 세포내로 도입된 2세대 CAR에 대한 상기 결과는 이러한 개념에 대한 이의를 제기한다. 임의의 특정한 이론에 결부되지 않기를 바라면서, 3명의 환자 모두에서 킬로그램 크기의 종양 부하의 용해로 임상적 효과는 충분하고 선례가 없었으며, 상기 환자중 2명에서 잠재적으로 위험할 정도로 고도의 사이토킨의 지연된 방출이 수반된다는 경계의 주석도 제기되고 있다. 전형적 사이토킨 폭풍 효과는 관측되지 않았다. 그러나, 현재의 연구는 3일간에 걸쳐 CART19의 신중한 주입에 의해 이러한 가능성을 완화하도록 설계되었다.
매우 낮은 복용량의 CAR이 강력한 임상적 반응을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 CART19 벡터 설계의 안전성을 증명한 파일롯 연구였다. 이전 시험에서 검사된 것보다 수십배 정도 낮은 복용량의 CART19 세포가 임상적 이점을 가질 수 있다는 관찰은 더욱 광범위한 규모로 CAR 치료의 추후 실행 및 CD19가 아닌 표적에 대해 지향된 CAR을 검사하는 시험의 설계를 위한 중요한 암시를 내포할 수 있다.
현재의 연구에 따르면, 추가로 중추 메모리 및 효과기 T 세포 둘 모두에서 CART19가 발현되는 것으로 나타났으며, 이는 이전 연구와 비교하여 이들의 장기간 생존에 기여할 가능성이 있다. 임의의 특정한 이론에 결부되지 않기를 바라면서, CAR T 세포는 대체 항원을 발현하는 표적 세포(예를 들면, CLL 종양 세포 또는 정상 B 세포)와의 충돌 및 이의 후속 제거시에 생체내에서 중추 메모리-유사 상태로 분화할 수 있다. 실제로, 4-1BB의 신호전달은 TCR 신호전달과 관련하여 메모리의 발달을 촉진하는 것으로 보고되어 있었다[참조: Sabbagh et al., 2007, Trends Immunol 28: 333-339].
CART19의 연장된 증식 및 생존은 이전에 보고되지 않았던 CAR T 세포의 약물 동력학의 양상을 밝혀냈다. 혈청 및 골수에서 사이토킨 방출의 동력학은 피크 CART19 수준과 상관되어, CD19를 발현하는 세포 표적이 제한적으로 되는 경우, 감쇄가 개시될 가능성이 있는 것으로 관찰되었다. CART19의 연장된 생존에 대한 메커니즘은 상술한 4-1BB 도메인의 도입 또는 천연 TCR 및/또는 CAR을 통한 신호전달과 관련될 수 있다. 흥미로운 가능성은 상기 연장된 생존이 골수 검체에서 확인되었던 CART19의 모집단과 관련되고, 이로 인해 골수에서 B 세포 전구체와의 충돌에 의해 CD19 CAR이 유지될 수 있다는 가설을 제기한다. 생체내에서 CART19 세포의 초기 확장을 유도하는 것이 이러한 논쟁과 관련이 있습니까? 라는 질문과 관련하여, 드문 예외[참조: Savoldo et al., 2011, J Clin Invest doi: 10.1172/JCI46110; Pule et al., 2008, Nat Med 14: 1264-1270]로서, 현재의 연구는 IL-2 주입이 생략되어 있는 유일한 시험이고, 따라서 CART19 세포는 항상성 사이토킨에 반응하여 확장될 수 있거나, 백혈병성 표적 및/또는 정상 B 세포 상에서 발현된 CD19에 반응하여 확장될 가능성이 더욱 크다. 후자의 경우, 정상 세포 상에서 CART19의 자가 재생이 발생하고, "자가 백신화/증강" 및 그에 따른 장기간 종양 면역감시에 의한 CAR 메모리를 위한 메커니즘을 제공할 가능성이 있는 것과 같이, 이는 CD19 및 CD20 등의 정상 APC 상의 표적에 대해 지향된 CAR에 있어서 매력적인 특성이 될 수 있다. CART19 항상성의 메커니즘은 세포 고유 또는 비고유의 존속 메커니즘을 규명하기 위해 추가의 연구를 필요로 할 수 있다. 이들 결과에 앞서, 대부분의 연구원들은 면역 치료의 일시적 형태로서 CAR 치료를 고려하였지만, 최적화된 신호전달 도메인을 갖는 CAR은 장기간 면역감시 뿐만 아니라 관해 유도 및 통합 둘 모두에서 역할을 할 수 있다.
p53 결핍 백혈병을 앓는 2명 환자를 포함하는 3명의 환자 모두에서 강력한 항-백혈병성 효과가 관찰되었다. CAR을 사용한 이전 연구는 림프구제거 화학치료로부터 항-종양 효과를 분리하는 데 어려움이 있었다. 그러나, 현재의 연구에서 생체내 CAR 확장과 동시에 일어나고 상기 생체내 CAR 확장에 의존할 가능성이 있는 플루다라빈-난치성 환자에서 종양 용해의 동력학과 조합된 지연된 사이토킨 방출은 CART19가 강력한 항-종양 효과를 조정한다는 것을 나타낸다. 현재의 결과는 CAR의 효과를 증가시키는데 있어서 화학치료에 대한 역할을 배제하지 않는다.
기타 센터에서 진행하는 연구로부터의 결과와 벡터, 도입유전자 및 세포 제조 과정의 면밀한 비교는 CAR T 세포의 지속적 기능을 생체내에서 수득하기 위해 요구되는 주요 특성을 완전하게 이해하기 위해 요구될 수 있다. 항체 치료와 달리, CAR 변형된 T 세포는 생체내에서 복제할 잠재성을 갖고, 장기간 존속은 지속된 종양 제어를 야기할 수 있다. 비-교차 내성 킬러 T 세포로 구성된 맞춤형 치료의 이용가능성은 B 세포 악성종양을 앓는 환자의 결과를 개선시키는 잠재성을 갖는다. 예를 들면, 리툭시맵 및 베비시주맵(bevicizumab) 등의 약제를 사용한 항체 치료의 제한은 반복된 항체 주입을 요구하는 치료이고, 불편하며 비용이 크다. CART19 세포의 단일 주입 후에 T 세포 상에서 발현된 항-CD19 scFv를 사용한 장기간 항체 치료의 전달(이러한 경우 현재까지 치료된 3명의 환자중 3명 모두에 있어서 적어도 6개월 동안)은 편의성 및 비용 절약을 포함하는 다수의 실질적 이점을 갖는다.
주입후 18개월에서 CART 19의 지속된 검출
본원에 제시된 결과는 CART19의 장기간 발현 및 심 B 세포 무형성(도 8 및 9), 및 3명의 환자 모두에서 혈장 세포의 감소(도 10)를 나타낸다. CART19 시험으로부터의 주요한 놀라움은 고도의 면역원성 표현형을 나타낸 쥐 scFv를 갖는 CART19 세포가 실제로 숙주 환자의 면역계에 의해 거부되지 않았다는 것이다. 이는 CART19 세포가 숙주 환자에서 정상 B 세포를 고갈시켰고 그 결과 내성을 유도했음을 시사한다.
임의의 특정한 이론에 결부되지 않기를 바라면서, CART 19 세포가 하기 적용을 위해 사용될 수 있다: 1) "교차 합치" 양성인 고형 기관 이식 환자; 기존 메모리 B 세포의 제거는 이들 면역화된 환자에서 현재 가능하지 않은 기관 이식을 가능하게 할 수 있다; 2) 환자(예를 들면, 혈우병)에게 제공되는 면역원성 단백질에 대한 내성의 유도; 3) 리툭시맵은 관절염 및 기타 자가면역 질환에서 치료 효과를 갖는다; CART19는 동일하거나 또는 보다 양호하게 작동할 수 있다.
몇몇 예에서, CART 19 세포는 모든 B 세포 서브셋(예: 천연, 메모리, 혈장 세포 전구체 및 "억제 B 레그")를 제거하기 위해 사용될 수 있다. B 레그는 몇몇 암의 면역억제에 관여할 수 있고, 따라서 CART 19는 B 레그를 제거함으로써 면역 반응을 개선시킬 수 있다.
본원에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시내용은 이의 전체가 본원에서 참조로 인용된다. 본 발명은 구체적 실시형태를 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 기타 실시형태 및 변형이 본 발명의 진정한 취지 및 범주를 벗어나지 않고도 당해 기술분야의 숙련가에 의해 고안될 수 있음이 자명하다. 첨부된 특허청구범위는 이러한 실시형태 및 등가의 변형 모두를 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
Claims (12)
- 삭제
- 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 세포를 포함하는 이식 내성을 촉진하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 CAR은 CD19 항원 결합 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 CD19 B 세포 표면 마커를 표적화하고, 상기 유전자 변형된 세포가 B 세포를 고갈시키고, 상기 B 세포 고갈이 상기 세포의 투여 후 18개월 동안 지속됨으로써 이식 내성을 촉진하는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 이식 내성이 이식 조직에 대한 것인, 조성물.
- 삭제
- 제2항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포가 이식 조직과 동시에 투여되는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포가 이식 조직의 투여 전에 투여되는 것인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포가 이식 조직의 투여 후에 투여되는 것인, 조성물.
- 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 세포를 포함하는 이식 대 숙주 질환(GVHD) 치료를 위한 약제학적 조성물로서, 상기 CAR은 CD19 항원 결합 도메인, 공자극 신호전달 영역 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 CD19 B 세포 표면 마커를 표적화하고, 상기 유전자 변형된 세포가 B 세포를 고갈시키고, 상기 B 세포 고갈이 상기 세포의 투여 후 18개월 동안 지속됨으로써 GVHD를 치료하는 것인, 조성물.
- 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포가 이식 조직과 동시에 투여되는 것인, 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포가 이식 조직의 투여 전에 투여되는 것인, 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포가 이식 조직의 투여 후에 투여되는 것인, 조성물.
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