JP2023510782A - 腫瘍を処置する方法 - Google Patents

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ジョゼフ ホルバティノビッチ
マーク デベネデッテ
チャールズ ニコレット
イリーナ チェレパノバ
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コイミューン インコーポレイテッド
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Abstract

本開示は、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法と、循環IgGレベルを低下させる、CD16+T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、B細胞の濃度および／もしくは機能を低下させる、CD38+TGF-β+B細胞の頻度を低下させる、B細胞のTGF-β分泌を減少させる、ならびに／またはCD25+CD28+CD4および／もしくはCD8 T細胞の頻度を維持することができる医薬品とを投与することによって、腫瘍（例えば、腎細胞がん）を処置する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2020年1月10日に出願された米国仮特許出願第62/959,317号に対する優先権を主張する。
開示の分野
本開示は、腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法を投与し、ならびに循環IgGレベルを低下させる、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、B細胞の濃度および／もしくは機能を低下させる（例えば、mTOR阻害剤）、CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度を低下させる、B細胞のTGF-β分泌を減少させる、および／またはCD25+CD28+ CD4および／もしくはCD8 T細胞の頻度を維持することができる医薬品を投与することによって、腫瘍（例えば、腎細胞がん）を処置する方法を提供する。
開示の背景
腎臓がんは、男女共に最も一般的な10種類のがんのうちの1つである。全体として、腎臓がんを発症する生涯リスクは、男性では約48人に1人および女性では約83人に1人である。Siegel RL et al. Cancer Journal for Clinicians 2019;69(1):7-34 (2019)（非特許文献1）. 米国がん協会 (American Cancer Society) による2019年の米国における腎臓がんの推計によると、およそ73,820件の腎臓がんの新たな症例（男性44,120件および女性29,700件）が生じ、およそ14,770人（男性9,820人および女性4,950人）がこの疾患で死亡する。これらの数字には、すべての種類の腎臓がんおよび腎盂がんが含まれている。米国総合がんネットワーク (National Comprehensive Cancer Network)（「NCCN」）および米国がんデータベース (National Cancer Database)（「NCDB」）によると、毎年の新たな腎臓がん症例の90%は腎細胞がん（「RCC」）であると推定される。
転移性RCC（「mRCC」）を含むRCCの大部分の患者に対する初期治療は、腫瘍の外科的除去であり、通常は腎摘出と称される罹患腎臓の部分的または完全な除去を必要とする。転移性疾患がない場合、NCCNは腎摘出術後の観察を推奨しているが、再発のリスクが高いと考えられる患者には全身療法が推奨されている。注目すべきことには、診断時に腫瘍が原発腎臓を超えて他の臓器に転移している患者は、新たにmRCCと診断されたと見なされ、全体的な予後および生存率は最も不良である。診断時にmRCCを呈した患者に対して、または早期のRCCからの再発の結果として、NCCNは、転移病巣が手術のみで除去できる稀な例を除き、現在利用可能な治療法による全身療法を推奨している。
mRCCは一般に、化学療法、放射線療法、およびホルモン療法などの従来の全身的アプローチに抵抗性である。mRCCは、少数のmRCC患者において臨床的有用性を実証している、インターフェロンαおよびIL-2などのサイトカインベースの免疫療法で処置されているが、これらの療法は、心肺、神経精神、皮膚、腎臓、肝臓、および血液の副作用を含む、それらの使用を制限する重篤な毒性を有することが示されている。高用量IL-2は完全なmRCC寛解を実証しているが、その毒性により、その使用はごく少数の患者に制限される。
過去10年間に、Sutent（登録商標）（スニチニブ）、Votrient（登録商標）（パゾパニブ）、Torisel（登録商標）（テムシロリムス）、Nexavar（登録商標）（ソラフェニブ）、Avastin（登録商標）（ベバシズマブ）＋インターフェロンα、Afinitor（登録商標）（エベロリムス）、Inlyta（登録商標）（アキシチニブ）、ならびにごく最近では、カボザンタニブ (cabozantanib) とニボラマブ (nivolamab) とイピリミマブ (ipilimimab)、およびニボリマブとチロシンキナーゼ阻害剤（「TKI」）などのいくつかの薬剤が、mRCCの処置のために承認されている。
これらの新規薬剤の大部分は、インターフェロンαと比較して無増悪生存期間の延長を実証しているが、これらは、特に処置の時点で低リスクとして分類されていない患者において、長期の寛解または生存を伴うことはほとんどない。加えて、これらの新規薬剤はそれぞれ、好中球減少症および他の血液学的毒性、倦怠感、下痢、手足症候群、高血圧、ならびに他の心血管作用などの重篤な毒性を含む、mRCCの処置におけるその使用を制限する欠点を有する。
したがって、転移性RCCに対するより安全でかつより効果的な処置を開発する必要性がある。
Siegel RL et al. Cancer Journal for Clinicians 2019;69(1):7-34 (2019)
開示の概要
本開示の1つの局面は、腫瘍を処置する方法であって、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階の連続段階を含む方法を対象とする。
ある特定の局面において、医薬品の投与は、腫瘍の進行後に行われる。
いくつかの局面において、医薬品はmTOR阻害剤である。いくつかの局面において、mTOR阻害剤はラパマイシンまたはラパマイシン類似体である。ある特定の局面において、ラパマイシン類似体は、エベロリムス、テムシロリムス、シロリムス、およびリダフォロリムスからなる群より選択される。いくつかの局面において、ラパマイシン類似体はエベロリムスである。ある特定の局面において、エベロリムスは1日に1回投与される。いくつかの局面では、約2.5 mg～約20 mgのエベロリムスが1日に1回投与される。いくつかの局面では、約10 mgのエベロリムスが1日に1回投与される。
いくつかの局面において、ラパマイシン類似体はテムシロリムスである。ある特定の局面において、テムシロリムスは1週間に1回投与される。いくつかの局面では、約25 mgのテムシロリムスが1週間に1回投与される。ある特定の局面において、mTOR阻害剤の第1用量は、腫瘍の進行後に投与される。
いくつかの局面において、医薬品はB細胞の機能を低下させ、ナタリズマブ、テリフルノミド、およびオファツムマブからなる群より選択される。
いくつかの局面において、医薬品はB細胞の濃度を低下させ、プレドニゾン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、トリメトレキサート、コルチゾール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、デノスマブ、トリアムシノロンアセトニド、アタシセプト、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、ベバシズマブ、およびイノツズマブオゾガマイシンからなる群より選択される。
いくつかの局面において、医薬品はIgGの循環レベルを低下させ、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、フェノバルビタール、フェニトイン、レナリドミド、クロロキン、キニーネ、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、カプトプリル、コルチゾール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン、フェンクロフェナク、金塩、ペニシラミン、およびスルファサラジンからなる群より選択される。
他の局面において、医薬品は、CD16+制御性T (Treg) 細胞のIgGを介した活性化を阻止する。
いくつかの局面において、医薬品は、抗CD16抗体、同じエピトープへの結合について抗CD16抗体と交差競合する抗体、または抗CD16抗体と同じエピトープに結合する抗体である。
いくつかの局面において、医薬品は、3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体；同じエピトープへの結合について3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体と交差競合する抗体；または3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体と同じエピトープに結合する抗体である。
いくつかの局面において、免疫療法はCMN-001である。ある特定の局面において、CMN-001は3週間ごとに約1回投与される。
いくつかの局面において、免疫療法のレジメンは、医薬品の用量レジメンの開始後にも継続される
いくつかの局面において、腫瘍は腎細胞がんである。ある特定の局面において、腫瘍は転移性腎細胞がんである。いくつかの局面において、腫瘍は淡明細胞型である。
ある特定の局面において、腫瘍は、乳がん、膵臓がん、星状細胞腫、多形神経膠芽腫、メラノーマ、リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症からなる群より選択される。
いくつかの局面おいて、患者は高リスクまたは中リスクのヒト患者である。ある特定の局面において、高リスク患者は、以下のリスク因子：(i) 診断から全身的治療処置の開始までの期間が1年未満であること、(ii) 低レベルのヘモグロビン、(iii) 補正カルシウムレベルの上昇、(iv) 患者のパフォーマンスステータスまたは身体機能の低下、(v) 好中球のレベルの上昇、および (vi) 血小板数の増加のうちの3つまたはそれ以上を示す。
いくつかの局面において、腫瘍抗原は患者に対して自己である。
腫瘍を有する患者において、循環IgGレベルを低下させる、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、および／またはB細胞の濃度もしくは機能を低下させる方法であって、(a) 患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階の連続段階を含む方法もまた、本明細書において提供される。
腫瘍を有する患者において、CD8+ T細胞におけるプログラム細胞死タンパク質1 (PD1) 発現を調節する方法であって、(a) 患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階の連続段階を含む方法もまた、本明細書において提供される。
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかであり、以下の詳細な説明および実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。本出願を通して引用された科学論文、新聞報道、GenBankエントリー、特許、および特許出願を含む、引用されたすべての参考文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
図1A～1Dは、2つのmTOR阻害剤、エベロリムスおよびテムシロリムスの存在下におけるCMV pp65特異的記憶想起細胞傷害性Tリンパ球 (CTL) の誘導を示す。CMV pp65特異的CTLの割合を、mTOR阻害剤エベロリムスおよびテムシロリムスの非存在下（「未処理」）、ならびに10 ng/ml（「10 ng」）、100 ng/ml（「100 ng」）、または1 ug/ml（「1 ug」）のエベロリムス（図1A）またはテムシロリムス（図1C）の存在下で測定した。CMV pp65特異的CTLの絶対数を、mTOR阻害剤の非存在下（「未処理」）、および10 ng/ml（「10 ng」）、100 ng/ml（「100 ng」）、または1 ug/ml（「1 ug」）のエベロリムス（図1B）またはテムシロリムス（図1B）の存在下で測定した。 図2A～2Bは、2つのmTOR阻害剤、エベロリムスおよびテムシロリムスの存在下におけるCMV pp65特異的想起CTLエフェクター機能の誘導を示す。CMV pp65ペプチドパルス標的細胞に応答してIFN-γ、TNF-α、もしくはIL-2を分泌するか、またはCD107aを発現するCMV pp56特異的CTLの絶対数を、mTOR阻害剤エベロリムスおよびテムシロリムスの非存在下（「未処理」）、ならびに10 ng/ml（「10 ng」）、100 ng/ml（「100 ng」）、または1 ug/ml（「1 ug」）のエベロリムス（図2A）またはテムシロリムス（図2B）の存在下で測定した。 図3A～3Dは、2つのmTOR阻害剤、エベロリムスおよびテムシロリムスの存在下におけるMART-1特異的記憶想起CTLの誘導を示す。MART-1特異的CTLの割合を、mTOR阻害剤エベロリムスおよびテムシロリムスの非存在下（「未処理」）、ならびに10 ng/ml（「10 ng」）、100 ng/ml（「100 ng」）、および1 ug/ml（「1 ug」）のエベロリムス（図3A）またはテムシロリムス（図3C）の存在下で測定した。MART-1特異的CTLの絶対数を、mTOR阻害剤の非存在下（「未処理」）、ならびに10 ng/ml（「10 ng」）、100 ng/ml（「100 ng」）、および1 ug/ml（「1 ug」）のエベロリムス（図3B）またはテムシロリムス（図3B）の存在下で測定した。 図4A～4Bは、2つのmTOR阻害剤、エベロリムスおよびテムシロリムスの存在下におけるMART-1特異的想起CTLエフェクター機能の誘導を示す。MART-1ペプチドパルス標的細胞に応答してIFN-γ、TNF-α、もしくはIL-2を分泌するか、またはCD107aを発現するMART-1特異的CTLの絶対数を、mTOR阻害剤エベロリムスおよびテムシロリムスの非存在下（「未処理」）、ならびに10 ng/ml（「10 ng」）、100 ng/ml（「100 ng」）、または1 ug/ml（「1 ug」）のエベロリムス（図4A）またはテムシロリムス（図4B）の存在下で測定した。 図5A～5Dは、IgG結合制御性細胞の減少に伴う活性化NK細胞および記憶T細胞の増加を示す。CMV抗原をコードするDCで刺激したCTL培養物から作成されたデータをプロットして、活性化NK細胞（細胞／ml）と活性化CD4+ T細胞（細胞／ml）（図5A）、活性化NK細胞（細胞／ml）とIgG結合制御性CD4+ T細胞（図5B）、CMV+（特異的）CTL（細胞／ml）と活性化CD4+ T細胞（細胞／ml）（図5C）、およびCMV+ CTL（細胞／ml）とIgG結合制御性CD4+ T細胞（図5D）の関係を示した。 図6A～6Fは、(Ki67+) プログラム細胞死タンパク質1（「PD1」）-細胞の割合 (%) によって測定された、mRCC患者におけるNK細胞およびT細胞の増殖を示す。図6Aは、1～8日目の、DC刺激なしの培養における、B細胞枯渇PBMC（「B細胞枯渇」）またはB細胞枯渇なしのPBMC（「なし」）からのKi67+PD1- NK細胞 (CD3-CD16+CD56+) の割合 (%) を示す。図6Bは、1～8日目の、DC刺激を伴う培養における、B細胞枯渇PBMC（「B細胞枯渇」）またはB細胞枯渇なしのPBMC（「なし」）からのKi67+PD1- NK細胞 (CD3-CD16+CD56+) の割合 (%) を示す。図6Cは、1～8日目の、DC刺激なしの培養における、B細胞枯渇PBMC（「B細胞枯渇」）またはB細胞枯渇なしのPBMC（「なし」）からのKi67+PD1- CD4+ T細胞 (CD3+CD4+) の割合 (%) を示す。図6Dは、1～8日目の、DC刺激を伴う培養における、B細胞枯渇PBMC（「B細胞枯渇」）またはB細胞枯渇なしのPBMC（「なし」）からのKi67+PD1- CD4+ T細胞 (CD3+CD4+) の割合 (%) を示す。図6Eは、1～8日目の、DC刺激なしの培養における、B細胞枯渇PBMC（「B細胞枯渇」）またはB細胞枯渇なしのPBMC（「なし」）からのKi67+PD1- CD8+ T細胞 (CD3+CD8+) の割合 (%) を示す。図6Fは、1～8日目の、DC刺激を伴う培養における、B細胞枯渇PBMC（「B細胞枯渇」）またはB細胞枯渇なしのPBMC（「なし」）からのKi67+PD1- CD8+ T細胞 (CD3+CD8+) の割合 (%) を示す。 図6-1の説明を参照のこと。 図7A～7Fは、mRCC患者由来のPBMCのインビトロ刺激を示す。mRCC患者由来の培養PBMCをPME-CD40L DCで刺激した後（図7A）、またはPME-CD40L DCで刺激せずに（図7D）、7日目に、フローサイトメトリーを用いて、CD3+CD4low、FoxP3+細胞（Q1ゲート）、CD3+CD4hi、FoxP3+細胞（Q2ゲート）、およびCD3+CD4low、FoxP3-細胞（Q4ゲート）の割合を測定した。CD25（図7B）、細胞内IgG（図7C）、PD1（図7E）、およびケモカイン受容体CXCR4（図7F）の発現を、CD3+CD4low、FoxP3+細胞（ヒストグラム中の破線）、CD3+CD4hi、FoxP3+細胞（ヒストグラム中の実線）、およびCD3+CD4low、FoxP3-細胞（影付きヒストグラム）において測定した。 図8A～8Gは、フローサイトメトリーを用いて測定された、8日間のPME-CD40L DC刺激中の、CD4+ T細胞によるIgG免疫複合体の結合および内部移行を示す。CD4hi発現T細胞におけるIgG検出を、mRCC患者由来のB細胞枯渇PBMC（図8C）において、あるいは抗CD16抗体なしの細胞（「抗体なし」）（図8A）に対して、抗CD16抗体クローン3G8（図8D）、B73.1（図8E）、もしくはCB16（図8F）、またはアイソタイプ対照抗体MPOC-21（図8B）をmRCC患者由来のPBMC培養物に添加した場合に測定した。図8Gは、抗CD16抗体の非存在下における（「なし」）、MPOC-21、3G8、B73.1、もしくはCB16の存在下における、またはmRCC患者由来のPBMCのB細胞枯渇を伴う場合の、IgGと結合するCD3+CD4hi細胞の割合の割合を示す。 図8-1の説明を参照のこと。 図9A～9Gは、8日間のPME-CD40L DC刺激後の、CD8+ T細胞におけるPD1発現を示す。増殖性 (Ki67+) CD8+ T細胞におけるPD1発現を、mRCC患者由来のB細胞枯渇PBMC（図(C）において、あるいは抗CD16抗体なしの細胞（「抗体なし」）（図9A）に対して、抗CD16抗体クローン3G8（図9D）、B73.1（図9E）、もしくはCB16（図9F）、またはアイソタイプ対照抗体MPOC-21（図9B）をmRCC患者由来のPBMC培養物に添加した場合に測定した。図9Gは、抗CD16抗体の非存在下における（「なし」）、MPOC-21、3G8、B73.1、もしくはCB16の存在下における、またはmRCC患者由来のPBMCのB細胞枯渇を伴う場合の、PD1陰性の増殖性 (Ki67+) CD8+ T細胞の割合を示す。 図9-1の説明を参照のこと。 図10A～10Yは、CD4+ T細胞によるIgG免疫複合体の結合および内在化の阻害が抗原特異的CTL拡大に及ぼす影響を示す。CD4+CD25+細胞におけるFoxP3の発現を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）の非存在下における（「なし」）（図10A）、または抗CD16抗体の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAのみをエレクトロポレーションしたDC (DCCMV) で刺激した（「3G8」）（図10B）、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）で刺激した（「DC」）（図10C）、もしくはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体で刺激した（「DC+3G8」）（図10D）健常ドナーPBMCにおいて測定した。CD4+CD25+Foxp3＋細胞におけるIgGの発現を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）の非存在下における（「なし」）（図10E）、または抗CD16抗体の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAのみをエレクトロポレーションしたDC (DCCMV) で刺激した（「3G8」）（図10F）、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）で刺激した（「DC」）（図10G）、もしくはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体で刺激した（「DC+3G8」）（図10H）健常ドナーPBMCにおいて測定した。CD3+CD8＋細胞におけるPD1発現を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）の非存在下における（「なし」）（図10I）、または抗CD16抗体の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAのみをエレクトロポレーションしたDC (DCCMV) で刺激した（「3G8」）（図10J）、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）で刺激した（「DC」）（図10K）、もしくはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体で刺激した（「DC+3G8」）（図10L）健常ドナーPBMCにおいて測定した。CD4+CD25+細胞におけるFoxP3の発現を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）の非存在下における（「なし」）（図10M）、または抗CD16抗体の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションしたPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV) で刺激した（「3G8」）（図10N）、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）で刺激した（「DC」）（図10O）、もしくはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体で刺激した（「DC+3G8」）（図10P）健常ドナーPBMCにおいて測定した。CD4+CD25+Foxp3＋細胞におけるIgGの発現を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）の非存在下における（「なし」）（図10Q）、または抗CD16抗体の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションしたPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV) で刺激した（「3G8」）（図10R）、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）で刺激した（「DC」）（図10S）、もしくはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体で刺激した（「DC+3G8」）（図10T）健常ドナーPBMCにおいて測定した。CD3+CD8＋細胞におけるPD1発現を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）の非存在下における（「なし」）（図10U）、または抗CD16抗体の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションしたPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV) で刺激した（「3G8」）（図10V）、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）で刺激した（「DC」）（図10W）、もしくはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体で刺激した（「DC+3G8」）（図10X）健常ドナーPBMCにおいて測定した。DCで刺激したPBMCの相関解析により、CD4+FoxP3+におけるIgG検出（「IgG+、CD4+FoxP3+に対する%」）と増殖性CD3+CD8+ T細胞におけるPD1発現（「Ki67+PD1+、CD3+CD8+に対する%」）について相関が示される。 図10-1の説明を参照のこと。 図10-1の説明を参照のこと。 図10-1の説明を参照のこと。 図10-1の説明を参照のこと。 図10-1の説明を参照のこと。 図10-1の説明を参照のこと。 図11A～11Lは、CD4+ T細胞によるIgG免疫複合体の結合および内部移行の阻害が、抗原特異的CD8+ T細胞におけるPD1発現に及ぼす影響を示す。CD3+CD4+CD25+CD45RA-細胞におけるIgGの発現を、DCCD40L+CMVで刺激した健常ドナーPBMC（「DC：0日目」）（図11A）、DCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激した健常ドナーPBMC（「DC+3G8：0日目」）（図11B）、DCCD40L+CMVで刺激し、6日目にDCCD40L+CMVで再刺激したPBMC（「DC：0、6日目」）（図11C）、またはDCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激し、次いで6日後に再刺激したPBMC（「DC+3G8：0、6日目」）（図11D）において測定した。CD3+CD8＋細胞におけるPD1の発現を、DCCD40L+CMVで刺激した健常ドナーPBMC（「DC：0日目」）（図11E）、DCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激した健常ドナーPBMC（「DC+3G8：0日目」）（図11F）、DCCD40L+CMVで刺激し、6日目にDCCD40L+CMVで再刺激したPBMC（「DC：0、6日目」）（図11G）、またはDCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激し、次いで6日後に再刺激したPBMC（「DC+3G8：0、6日目」）（図11H）において測定した。CD3+CD8＋細胞におけるPD1の発現を、DCCD40L+CMVで刺激した健常ドナーPBMC（「DC：0日目」）（図11E）、DCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激した健常ドナーPBMC（「DC+3G8：0日目」）（図11F）、DCCD40L+CMVで刺激し、6日目にDCCD40L+CMVで再刺激したPBMC（「DC：0、6日目」）（図11G）、またはDCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激し、次いで6日後に再刺激したPBMC（「DC+3G8：0、6日目」）（図11H）において測定した。CMVデキストラマー陽性CD3+CD8＋細胞におけるPD1の発現を、DCCD40L+CMVで刺激した健常ドナーPBMC（「DC：0日目」）（図11I）、DCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激した健常ドナーPBMC（「DC+3G8：0日目」）（図11J）、DCCD40L+CMVで刺激し、6日目にDCCD40L+CMVで再刺激したPBMC（「DC：0、6日目」）（図11K）、またはDCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体で刺激し、次いで6日後に再刺激したPBMC（「DC+3G8：0、6日目」）（図11L）において測定した。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図12は、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体の非存在下（「なし／なし」）で、および抗CD16抗体（「なし／3G8」）、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションしたPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV)（「DC／なし」）、またはDCCD40L+CMVおよび抗CD16抗体（「DC／3G8」）の存在下で、正常ドナーPBMCにおいて測定された、抗原特異的記憶T細胞によるIFN-γ分泌 (pg/ml) を示す。 図13A～13Eは、抗CD16抗体による免疫グロブリン複合体（「IC」）結合の阻止を示す。CMV pp65特異的CTLの割合を、フローサイトメトリーを用いて、抗CD16抗体の非存在下（図13A）および存在下（図13B）で測定した。CD4+ T細胞における細胞内IgGの割合を、フローサイトメトリーを用いて、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体（「DC+3G8」）、抗CD16抗体（「3G8のみ」）、またはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）（「DCのみ」）の存在下で、ならびにDCおよび抗CD16抗体の非存在下（「DCなし」）で測定した（図13C）。CMV pp65特異的CTLにおけるグランザイムB（「Grb」）産生の割合を、DC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）および抗CD16抗体（「DC+3G8」）、またはDC（pp65 mRNAをエレクトロポレーションした）（「DCのみ」）の存在下で測定した（図13D）。抗CD16抗体がIC結合を阻止する機構を図13Eに示す。 図14A～14Eは、DC療法と併用してエベロリムスを受けたmRCC患者における生存推定値を示す。図14Aは、進行性腎細胞がんの自己樹状細胞免疫療法＋標準治療 (ADAPT)（その後の処置としてのエベロリムスを含む）の第3相試験における全生存期間のカプラン・マイヤー分析を示す。エベロリムス処置集団は、CMN-001（DC療法）の用量（「組み合わせ (N=60)」）または少なくとも1用量もしくは複数用量のスニチニブ（標準治療処置 (SOC)）(「SOC (N=31)」）を受けた被験者を含んでいた。図14Bは、第3相ADAPT試験（処置期間中のその後の処置としてのエベロリムスを含む）における全生存期間のカプラン・マイヤー分析を示す。エベロリムス処置集団は、DC療法による処置期間中にエベロリムスを受けた（「組み合わせ (N=38)」）、または単独のエベロリムスを受けた（「SOC (N=11)」）被験者を含んでいた。図14Cは、第3相ADAPT試験（追跡期間中のその後の処置としてのエベロリムスを含む）における全生存期間のカプラン・マイヤー分析を示す。エベロリムス処置集団は、エベロリムスと併用してDC療法を受けたすべてのmRCC患者（「組み合わせ (N=22)」）、または単独のエベロリムスで処置されたすべてのmRCC患者（「SOC (N=20)」）を含んでいた。図14Dは、併用療法において、試験の追跡期間中 (N=22) または処置期間中 (N=38) にエベロリムスを受けた被験者の間の生存曲線の比較を示す。図14Eは、試験のSOC群において、試験の追跡期間中 (N=20) または処置期間中 (N=11) にエベロリムスを受けた被験者の間の生存曲線の比較を示す。全生存 (OS) 期間中央値、95%信頼区間 (CI) 範囲を含むハザード比、およびパーセント (%) 打ち切り値を示す。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 図15A～15Dは、DC刺激によって誘導されたT細胞増殖を示す。CD4+およびCD4- T細胞のKi-67+発現の頻度を、実施例7に従って、血漿の非存在下において（「血漿なし」）（図15A）、HD血漿（「HD血漿」）（図15B）またはmRCC患者血漿（「mRCC血漿」）（図15C）の存在下において、自己PME-CD40L-CMV DCで刺激した健常ドナー (HD) PBMCについて、フローサイトメトリーにより決定した。図15Dは、健常ドナーから収集された2つの個々の血漿試料（「健常ドナー1血漿」および「健常ドナー2血漿」）、血漿なしの試料、ならびにmRCC患者血漿で処理した試料について決定されたCD4+およびCD4- T細胞の頻度（パーセント (%)）を示す。示されたデータは、2つ組で試験した3回の独立した実験によるものである。CD4陰性 (CD4-) のゲーティングは、CD8+ T細胞集団を表す。 図16A～16Eは、mRCC患者血漿が混合リンパ球反応 (MLR) およびT細胞増殖のOKT3刺激に及ぼす影響を示す。CD4+およびCD4- T細胞のKi-67+発現の頻度を、実施例7に従って、二方向MLRにおいて、血漿添加なし（左側パネル）およびmRCC患者血漿処理（右側パネル）の試料について決定した（図16A）。CD4+およびCD4- T細胞のKi-67+発現の頻度を、実施例7に従って、OKT3抗体をPMBC培養物に添加した血漿添加なし（左側パネル）およびmRCC患者血漿処理（右側パネル）の試料について、フローサイトメトリーにより決定した（図16B）。図16Cは、実施例7に従って、2つの反復培養物（MLR 未処理；MLR mRCC患者血漿処理；OKT3 未処理；およびOKT3 mRCC 患者血漿処理）について決定されたCD4+およびCD4- T細胞の頻度（CD3に対するパーセント(%)）を示す。図16Dは、実施例7に従って、MLRにおいてまたはOKT3抗体で刺激したPMBCについて、Ki-67+ 細胞の幾何平均蛍光強度 (MFI) を測定することによって決定されたCD25発現レベルを示す。図16Eは、実施例7に従って、MLRにおいてまたはOKT3抗体で刺激したPMBCについて、Ki-67+ 細胞の幾何平均蛍光強度 (MFI) を測定することによって決定されたCD28発現レベルを示す。示されたデータは、2つ組で試験した2回の独立した実験によるものである。CD4陰性 (CD4-) のゲーティングは、CD8+ T細胞集団を表す。 図16-1の説明を参照のこと。 図17A～17Fは、mRCC患者血漿およびエベロリムスが、MLR培養物中で刺激した健常ドナーPBMC T細胞に及ぼす影響を示す。CD4+（図17A）およびCD8+ T細胞（図17B）のKi-67+CD28+発現の頻度を、実施例7に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（左側パネル）、またはエベロリムスを添加せずに（中央パネル）もしくは添加して（右側パネル）mRCC患者血漿で処理した培養物について決定した。培養は2つ組で行い、代表的な解析を示す。6名の個々のmRCC患者から収集してMLR培養物において試験した血漿試料の解析から収集された累積データは、実施例7に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（血漿なし）、またはエベロリムスを添加してもしくは添加せずにmRCC患者血漿で処理した場合の、Ki-67+CD4+CD28+（図17C）、Ki-67+CD4+CD28-（図17D）T細胞、Ki-67+CD8+CD28+（図17E）、およびKi-67+CD8+CD28-（図17F）T細胞の頻度 (%) を示す。統計的有意性は、スチューデントT検定よって決定した。*p値<0.05、**p値<0.001、およびns=有意でない。 図17-1の説明を参照のこと。 図18A～18Fは、mRCC患者血漿およびエベロリムスが、自己PMECD40L-CMV DCで刺激した健常ドナーPBMC T細胞に及ぼす影響を示す。CD4+（図18A）およびCD8+ T細胞（図18B）のKi-67+CD28+発現の頻度を、実施例7に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（左側パネル）、またはエベロリムスを添加せずに（中央パネル）もしくは添加して（右側パネル）mRCC患者血漿で処理した培養物について決定した。培養は2つ組で行い、代表的な解析を示す。6名の個々のmRCC患者から収集して試験した血漿試料の解析から収集された累積データは、実施例7に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（血漿なし）、またはエベロリムスを添加してもしくは添加せずにmRCC患者血漿で処理した場合の、Ki-67+CD4+CD28+（図18C）、Ki-67+CD4+CD28-（図18D）T細胞、Ki-67+CD8+CD28+（図17E）、およびKi-67+CD8+CD28-（図18F）T細胞の頻度 (%) を示す。統計的有意性は、スチューデントT検定よって決定した。*p値<0.05、**p値<0.001、およびns=有意でない。 図18-1の説明を参照のこと。 図19A～19Fは、mRCC患者血漿およびエベロリムスが、MLR培養物中で刺激した場合の、健常ドナーPBMCのCD25+CD28+ T細胞の頻度に及ぼす影響を示す。CD4+（図19A）およびCD8+ T細胞（図19B）のCD25+CD28+発現の頻度を、実施例8に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（左側パネル）、またはエベロリムスを添加せずに（中央パネル）もしくは添加して（右側パネル）mRCC患者血漿で処理した培養物について決定した。培養は2つ組で行い、代表的な解析を示す。6名の個々のmRCC患者から収集して試験した血漿試料の解析から収集された累積データを、実施例8に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（血漿なし）、またはエベロリムスを添加してもしくは添加せずにmRCC患者血漿で処理した場合の、CD25+/CD28+ CD4 T細胞（図19C）、CD25+/CD28- CD8 T細胞（図19D）、およびCD25+/CD28+ CD8 T細胞（図19E）の頻度 (%) について示す。統計的有意性は、スチューデントT検定よって決定した。*p値<0.05、**p値<0.001、およびns=有意でない。 図19-1の説明を参照のこと。 図20A～20Eは、mRCC患者血漿およびエベロリムスが、自己PMECD40L-CMV DCで刺激した健常ドナーPBMC T細胞に及ぼす影響を示す。CD4+（図20A）およびCD8+ T細胞（図20B）のKi-67+CD28+発現の頻度を、実施例8に従って、mRCC患者血漿で処理しなかった（左側パネル）、またはエベロリムスを添加せずに（中央パネル）もしくは添加して（右側パネル）mRCC患者血漿で処理した培養物について決定した。培養は2つ組で行い、代表的な解析を示す。6名の個々のmRCC患者から収集して試験した血漿試料の解析から収集された累積データを、実施例8に従って、エベロリムスを添加してもしくは添加せずにmRCC患者血漿で処理した場合の、CD25+/CD28+ CD4 T細胞（図20C）、CD25+/CD28- CD8 T細胞（図20D）、およびCD25+/CD28+ CD8 T細胞（図20E）の頻度 (%) について示す。統計的有意性は、スチューデントT検定よって決定した。*p値<0.05、**p値<0.001、およびns=有意でない。 図20-1の説明を参照のこと。 図21A～21Dは、mRCC患者血漿およびエベロリムスが、刺激されたT細胞におけるCD25およびCD28の発現に及ぼす影響を示す。実施例8に従って、HLA不一致の健常ドナーPBMCを、MLRにおいて（図21A、図21B）または自己DCで（図21C、図21D）刺激し、未処理で（「血漿なし」）、またはエベルリムスを伴ってもしくは伴わずにmRCC患者血漿の存在下で培養した後、T細胞応答を測定した。6名の個々のmRCC患者から収集して試験した血漿試料の解析から、累積データを収集した。Ki-67+ CD8 T細胞の平均蛍光強度 (MFI) を測定することにより、CD25（図21A、図21C）およびCD28（図21B、図21D）の発現レベルを決定した。統計的有意性は、スチューデントT検定よって決定した。*p値<0.05、**p値<0.001、およびns=有意でない。 図22A～22Bは、健常ドナー (HD) およびmRCC患者におけるTGF-β血漿レベルを示す。図22Aは、実施例9に従って決定された、mRCC患者 (mRCC n=8) または健常ドナー (HD n=2) から収集された血漿中のTGF-βレベル (ng/mL) を示す。図22Bは、実施例9に従って決定された、MLR培養物における増殖性 (Ki-67+) CD4 T細胞の頻度 (%) を示す。データは、6名のmRCC患者から得られた血漿でMLR培養物を処理して得られた増殖データの解析を表す。データは、血漿中で検出されたTGF-βの濃度に対してプロットしてある。Rho値は、excelソフトウェアを用いて算出された傾向線によるものである。 図23A～23Dは、エベロリムスが、mRCC患者からのTGF-β分泌およびCD38+ B細胞の頻度に及ぼす影響を示す。図23Aは、実施例9に記載されるように、エベロリムスを添加するかまたは添加せずに、刺激した（「刺激」）または左の刺激していない（「対照」）、mRCC患者由来のPBMCによって分泌されたTGF-β (pg/mL) を示す。図23Bは、実施例9に記載されるように、エベロリムスを添加したまたは添加しなかった非刺激培養物（「対照」）または刺激培養物（「刺激」）中の生存CD19+ B細胞をゲーティングすることにより、フローサイトメトリーにより決定されたCD38+ B細胞の頻度を示す。データは、解析された3名の個々の患者PBMCからのものである。図23Cは、実施例9に従って、エベロリムスなし（上部パネル）またはエベロリムスあり（下部パネル）で刺激した培養物における、フローサイトメトリーによって決定されたLAP+/CD19+ B細胞の頻度を示す。FMO（蛍光マイナス1）ゲートを用いることにより、抗LAP抗体の特異的染色を決定するためのゲートを設定した（左側パネル）。CD19+/LAP+ 細胞にゲートを設定することによって、陽性染色を決定した（右側パネル）。図23Dは、CD19+/LAP+ B細胞を示す（図23Cの右側パネルの右上象限をさらにサブゲーティングして、IgG+およびCD38+ B細胞の頻度を決定した）。象限のゲーティングにより、IgG+CD38- B細胞（左上象限）、IgG+CD38+ B細胞（右上象限）、IgG-CD38- B細胞（左下象限）、およびIgG-CD38+ B細胞（右下象限）の分布が特定される。データは、4名の個々のmRCC患者PBMCから得られた3回の独立した実験の代表である。
開示の詳細な説明
腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法を投与し、ならびに循環IgGレベルを低下させる、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、B細胞の濃度もしくは機能を低下させる、CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度を低下させる、B細胞のTGF-β分泌を減少させる、および／またはCD25+CD28+ CD4および／もしくはCD8 T細胞の頻度を維持することができる医薬品を投与することによって、腫瘍（例えば、腎細胞がん）を処置する方法が、本明細書において開示される。
I. 定義
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。本明細書で用いられる場合、本明細書において明確に別段の定めがある場合を除いて、以下の用語はそれぞれ、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本明細書を通して示される。
「1つの (a)」または「1つの (an)」実体という用語は、その実体の1つまたは複数を指すことに留意されたい；例えば、「1つのヌクレオチド配列」は、1つまたは複数のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「1つの (a)」（または「1つの (an)」）、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
さらに、本明細書で用いられる場合の「および／または」は、2つの特定の特徴または成分のそれぞれを、他方と共に、または他方を伴わずに明確に開示するものと見なされるべきである。したがって、本明細書において「Aおよび／またはB」などの語句で用いられる「および／または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」（単独）、ならびに「B」（単独）を含むことが意図される。同様に、「A、B、および／またはC」などの語句で用いられる「および／または」という用語は、以下の局面：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（単独）；B（単独）；ならびにC（単独）の各々を包含することが意図される。
局面が、「含むこと (comprising)」という言語を使用して本明細書において記載される場合にはいつでも、「～からなること」および／または「～から本質的になること」という用語で記載される他の類似の局面もまた提供されることが理解される。
本明細書で用いられる場合、「含む (comprises)」、「含むこと (comprising)」、「含む (includes)」、「含むこと (including)」、「有すること」、およびそれらの同根語は、「～を含むが、～に限定されないこと」を意味する。
本明細書で用いられる場合、「～からなること」という用語は、「～を含み、かつそれらに限定されること」を意味する。
本明細書で用いられる場合、「～から本質的になること」という用語は、組成物の特定された材料、または方法の特定された段階、および材料または方法の基本的特徴に実質的な影響を及ぼさない付加的な材料または段階を意味する。
特に定義がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で用いられる用語の多くの総合的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系 (SI) に認められている形態で表される。数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。特に指示のない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に5'から3'の向きで記載される。アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシの向きで記載される。本明細書において提供される表題は、本開示の様々な局面を限定するものではなく、これらは本明細書を全体として参照することによって有することができる。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
「約」という用語は、およそ、大まかに、ほぼ、またはその領域内を意味するように、本明細書で用いられる。「約」という用語が数値範囲と併せて用いられる場合、それは、記載された数値の上下の境界を拡大することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、数値を、規定された値の上下に、10パーセントの上下（より高いまたはより低い）の変動だけ修正するために、本明細書で用いられる。
「抗体 (antibody)」および「抗体 (antibodies)」という用語は、当技術分野の用語であり、本明細書において互換的に使用され得、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせなどを、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して認識し、これに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物活性を示す限り、任意の他の改変免疫グロブリン分子を包含する。例えば、本明細書において開示される3G8抗体、B73.1抗体、またはCB16抗体は、抗ヒトCD16抗体である。
抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元立体配置を有する。抗体はありのままでもよいし、または毒素、放射性同位体、等などの他の分子にコンジュゲートされていてもよい。
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指す。「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、または「抗原結合領域」は、抗原に結合する無傷の抗体の一部を指す。抗原結合断片は、無傷の抗体の抗原認識部位（例えば、抗原に結合するのに十分な相補性決定領域 (CDR)）を含み得る。抗体の抗原結合断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、および一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合断片は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、もしくはハムスター）およびヒトなどの任意の動物種に由来してよく、または人工的に生成され得る。
「抗原」という用語は、当技術分野で十分に理解されており、免疫原性である物質、すなわち免疫原を含む。任意の抗原の使用が本開示における使用のために想定され、したがってこれには、自己抗原（正常であるかもしくは疾患関連であるかにかかわらない）、感染性抗原(例えば、微生物抗原、ウイルス抗原、等)、または何らかの他の外来抗原（例えば、食物成分、花粉、等）が含まれるがこれらに限定されないことが認識されるであろう。「抗原」または代替的に「免疫原」という用語は、2種類以上の免疫原の収集物に当てはまり、そのため複数の免疫原に対する免疫応答を同時に調節することができる。さらに、本用語は、免疫原または抗原の種々の異なる製剤のすべてを含む。さらに、抗原は、がん細胞（例えば、腎がん細胞、多発性骨髄腫細胞、およびメラノーマ細胞）または病原体（例えば、HIVおよびHCV）に由来し得る。抗原は、がん細胞または病原体から単離されたまたはそれらに由来するRNAの形態で、抗原提示細胞 (APC) に送達され得る。「～に由来する」には、非関連または関連配列との融合物を含む、天然配列の組換え変種が含まれるが、これに限定されない。任意の細胞（例えば、がん細胞または病原体細胞）から抽出されたRNAのRT-PCR、およびインビトロ転写のための方法は、例えばPCT/US05/053271において開示されている。
「ネイティブ」または「天然」または「野生型」抗原は、エピトープを含むポリペプチド、タンパク質、または断片であり、天然の生物学的供給源から単離されており、対象において、MHC／ペプチド複合体として提示された場合に、抗原受容体、特にT細胞抗原受容体 (TCR) に特異的に結合し得る。
本明細書で用いられる場合、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」または「TAA」は、腫瘍に関連している抗原を指す。周知のTAAの例には、gp100、T細胞によって認識されるメラノーマ関連抗原（「MART」）、およびメラノーマ関連抗原（「MAGE」）が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「エピトープ」は当技術分野の用語であり、抗体が特異的に結合し得る抗原の局所領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続アミノ酸であってよく（直鎖状もしくは連続エピトープ）、またはエピトープは、例えば、1つまたは複数のポリペプチドの2つもしくはそれ以上の非連続領域から集合してもよい（高次構造、非直鎖状、不連続、もしくは非連続エピトープ）。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、必ずしもそうではないが典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは典型的には、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または20個のアミノ酸を特有の空間的高次構造内に含む。所与の抗体がどのエピトープに結合するかを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野において周知であり、これには、例えば、（例えば、CD16）からの重複または連続ペプチドが所与の抗体（例えば、抗ヒトCD16抗体）との反応性について試験される免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイが含まれる。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、当技術分野における技法、ならびに本明細書に記載されるもの、例えば、X線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴、およびHDX-MSが含まれる（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) を参照されたい）。
ある特定の局面において、抗体が結合するエピトープは、例えば、NMR分光法、X線回折結晶学的研究、ELISAアッセイ、質量分析（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）を伴う水素／重水素交換、アレイベースのオリゴペプチドスキャニングアッセイ、および／または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。X線結晶構造解析については、当技術分野における公知の方法（例えば、Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274；McPherson A (1976) J Biol Chem 251 : 6300-6303) のいずれかを用いて、結晶化を達成することができる。抗体：抗原結晶は、周知のX線回折技法を用いて研究することができ、X-PLOR（Yale University, 1992、配布元Molecular Simulations, Inc.；例えば、Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,；U.S. 2004/0014194を参照されたい）、およびBUSTER（Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60；Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW；Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323) などのコンピュータソフトウェアを使用して精緻化することができる。変異誘発マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法を用いて達成することができる。アラニンスキャニング変異誘発技法を含む変異誘発技法の説明については、例えば、Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394、およびCunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081- 1085を参照されたい。
「エピトープマッピング」という用語は、抗体-抗原認識のための分子決定基を同定する工程を指す。
参照抗体と「同じエピトープに結合する」という用語は、所与の方法によって決定した場合に、抗体がアミノ酸残基の同じセグメントに結合することを意味する。抗体が、本明細書に記載される抗体と「CD16上の同じエピトープ」に結合するかどうかを判定するための技法には、例えばエピトープマッピング法、例えば、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のX線分析、および水素／重水素交換質量分析 (HDX-MS) などが含まれる。他の方法では、抗原断片または抗原の変異変種に対する抗体の結合をモニターし、この場合、抗原配列内のアミノ酸残基の改変による結合の消失が、エピトープ成分の指標と見なされる場合が多い。加えて、エピトープマッピングのためのコンピュータコンビナトリアル法を使用することもできる。これらの方法は、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特定の短いペプチドを親和性単離する関心対象の抗体の能力に依存する。同じVHおよびVL、または同じCDR1、2および3配列を有する抗体は、同じエピトープに結合すると予測される。
「標的への結合について別の抗体と競合する」抗体は、標的への他の抗体の結合を（部分的にまたは完全に）阻害する抗体を指す。2つの抗体が標的への結合について互いに競合するかどうか、すなわち一方の抗体が標的への他方の抗体の結合を阻害するかどうかおよびどの程度阻害するかは、公知の競合実験、例えばBIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴 (SPR) 解析を使用して決定することができる。いくつかの局面において、抗体は、標的への別の抗体の結合について、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%競合し、阻害する。阻害または競合のレベルは、どちらの抗体が「遮断抗体」（すなわち、最初に標的と共にインキュベートされるコールド抗体）であるのかによって異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277、またはEd Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999による「Using Antibodies」の第11章に記載された通りに実施することができる。2つの抗体は、抗体が両方向で互いに少なくとも50%遮断する場合に、すなわち、競合実験においてどちらの抗体が抗原と最初に接触するかにかかわらずにこの遮断が生じる場合に、「交差競合する」。
2つの抗体が結合について競合または交差競合するかどうかを判定するための競合的結合アッセイには、実施例に記載されるような、例えばフローサイトメトリーによる、CD16発現細胞への結合についての競合が含まれる。その他の方法には、SPR（例えば、BIACORE（登録商標））、BLI（バイオレイヤー干渉法）、固相直接または間接放射免疫測定法(RIA)、固相直接または間接酵素免疫測定法 (EIA)、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983) を参照されたい）；固相直接ビオチン-アビジンEIA（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) を参照されたい）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) を参照されたい）；1-125標識を使用する固相直接標識RIA（Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) を参照されたい）；固相直接ビオチン-アビジンEIA（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）；および直接標識化RIA（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）が含まれる。
「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」という用語は、T細胞への抗原提示および迅速な移植片拒絶に必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトでは、MHCは「ヒト白血球抗原」または「HLA」複合体としても公知である。MHCによってコードされるタンパク質は、「MHC分子」として公知であり、クラスIおよびクラスIIのMHC分子に分類される。クラスI MHC分子は、β2-ミクログロブリンと非共有結合で結合しているMHCにおいてコードされるα鎖から構成される膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスI MHC分子は、ほぼすべての有核細胞により発現され、CD8+ T細胞への抗原提示において機能することが示されている。クラスI分子には、ヒトではHLA-A、B、およびCが含まれる。クラスII MHC分子もまた、非共有結合で会合したα鎖およびβ鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスII MHC分子は、CD4+ T細胞において機能することが公知であり、ヒトではHLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRが含まれる。
本明細書で用いられる場合、「サイトカイン」という用語は、細胞に対して、例えば成長または増殖の誘導といった種々の効果を発揮する多数の因子のいずれか1つを指す。本発明の実施において単独でまたは組み合わせて使用され得るサイトカインの非限定的な例には、インターロイキン-2 (IL-2)、幹細胞因子 (SCF)、インターロイキン-3 (IL-3)、インターロイキン-4 (IL-4)、インターロイキン-6 (IL-6)、インターロイキン-11 (IL-11)、インターロイキン-12 (IL-12)、インターロイキン-13 (IL-13)、インターロイキン-15 (IL-15)、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、インターロイキン-1β (IL-1β)、インターフェロン-γ (IFNγ)、腫瘍壊死因子-α (TNFα)、プロスタグランジンE2 (PGE2)、MIP-11、白血病抑制因子 (LIF)、c-kitリガンド、トロンボポエチン (TPO)、およびflt3リガンドが含まれる。サイトカインは、例えば、Genzyme (Framingham, Mass.)、Genentech (South San Francisco, Calif.)、Amgen (Thousand Oaks, Calif.)、R&D Systems (Minneapolis, Minn.)、およびImmunex (Seattle, Wash.) などの数社の販売会社から市販されている。必ずしも明示されているとは限らないが、野生型または精製サイトカイン（例えば、組換え産生されたものまたはその変異タンパク質）と同様の生物活性を有する分子が、本開示の精神および範囲内で使用されることが意図されることが意図される。
「抗原提示細胞 (APC)」という用語は、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識可能なペプチド-MHC複合体の形態で1つまたは複数の抗原を提示し、それによって、提示された1つまたは複数の抗原に対する効果的な細胞性免疫応答を誘導することができる細胞のクラスを指す。APCは、マクロファージ、B細胞、内皮細胞、活性化T細胞、および樹状細胞などの無傷の細胞全体、；またはβ2-ミクログロブリンと複合体形成した精製MHCクラスI分子などの、天然または合成の他の分子であり得る。多くの種類の細胞が、T細胞認識のためにその細胞表面上に抗原を提示することができると考えられるが、樹状細胞のみが、細胞傷害性Tリンパ球 (CTL) 応答のために、抗原を効率的な量で提示してナイーブT細胞を活性化する能力を有する。
「樹状細胞 (DC)」という用語は、種々のリンパ組織および非リンパ組織において見出される、形態学的に類似した細胞型の多様な集団を指す、Steinman et al., Ann. Rev. Immunol. 9:271-296 (1991)。樹状細胞は、生物において最も強力でかつ好ましいAPCを構成している。樹状細胞は単球から分化し得るが、それらは異なる表現型を有する。例えば、特定の分化マーカーであるCD14抗原は、樹状細胞では見出されないが、単球はこれを保有している。また、成熟樹状細胞は食作用性でないが、単球は強力な貪食細胞である。成熟DCは、T細胞の活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供し得ることが示されている。未熟DCは、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、マクロピノサイトーシス、または吸着性ピノサイトーシス、および受容体介在性の抗原取り込みによって抗原を捕捉することができ、表現型的にはCD80-またはCD80low、CD83-またはCD83low、CD86lowであり、高細胞内濃度のMHCクラスII分子を有する。成熟DCは、未熟DCと比較して、ベール形態、より低いエンドサイトーシス能力を有し、表現型的にはCD80high、CD83high、CD86highである。成熟DCはIL-12 p70ポリペプチドもしくはタンパク質を分泌し、および／または有意に低レベル（DC 100万個当たり0～500 pg/ml）のIL-10を分泌する。IL-10およびIL-12レベルは、未熟DCからDC成熟の誘導後36時間までに収集された培養上清のELISAによって決定することができる。Wierda W. G. et al., Blood 96: 2917 (2000)；Ajdary S et al., Infection and Immunity 68:1760 (2000)；Banchereau and Steinman et al., Nature 392:245 (1998)。
「B細胞」または「B-細胞」または「Bリンパ球」という用語は、抗体を産生する形質細胞（「成熟B細胞」）に発達する、白血球細胞（白血球）の一種であるリンパ球を指す。「未熟B細胞」は、成熟B細胞に発達し得る細胞である。一般に、プロB細胞（例えば、CD45またはB220を発現する）は、免疫グロブリン重鎖再構成を受けてプロBプレB細胞となり、さらに免疫グロブリン軽鎖再構成を受けて未熟B細胞になる。未熟B細胞は成熟B細胞に発達することができ、これは免疫グロブリン（例えば、IgA、IgG、またはIgM）を産生し得る。成熟B細胞は、CD21およびCD23などの特徴的なマーカーを発現する（CD23hiCD21hi細胞）。B細胞は、リポ多糖 (LPS) またはIL-4などの作用物質、およびIgMに対する抗体によって活性化され得る。例えば、米国特許出願公開第US 2012/0308563号を参照されたい。
本明細書で用いられる場合、「B細胞の濃度を低下させること」または「B細胞の濃度を低下させる」という語句は、B細胞の数を減少させることを指す。いくつかの局面において、本明細書に記載される医薬品を投与することは、医薬品の非存在下で測定されたB細胞の数と比較して、例えばmRCC患者の末梢血単核細胞 (PBMC) において、B細胞の濃度を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低下させることができる。
本明細書で用いられる場合、「B細胞のTGF-β分泌を減少させる」という語句は、B細胞（例えば、刺激B細胞）によって分泌されるTGF-βの濃度の低下を指す。いくつかの局面において、本明細書に記載される医薬品を投与することは、医薬品の非存在下で測定されたTGF-βの濃度と比較して、例えばmRCC患者の血漿中で測定して、TGF-βの濃度を少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18%、少なくとも約19%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低下させることができる。
本明細書で用いられる場合、「CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度を低下させる」という語句は、CD38+ TGF-β+ B細胞の数を減少させることを指す。いくつかの局面において、本明細書に記載される医薬品を投与することは、医薬品の非存在下で測定されたB細胞の数と比較して、例えばmRCC患者の末梢血単核細胞 (PBMC) において、CD38+ TGF-β+ B細胞の数を少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18%、少なくとも約19%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少させることができる。いくつかの局面において、医薬品（例えば、エベロリムス）は、B細胞がCD38+ TGF-β+ B細胞に分化する能力を調節することができる。
本明細書で用いられる場合、「B細胞の機能を低下させること」という語句は、例えば、B細胞増殖の減少、CD80およびCD86の発現の下方制御、免疫グロブリン（例えば、IgGおよびIgM）産生のレベルの低下、ならびに／またはサイトカイン（例えば、IL-10）産生のレベルの低下を指す。Matz et al., European Society for Organ Transplantation 25: 1106-1116 (2012)。
本明細書で用いられる場合、「CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度を維持する」という語句は、CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の数を増加させることを指す。いくつかの局面において、本明細書に記載される医薬品を投与することは、医薬品の非存在下で測定されたB細胞の数と比較して、例えばmRCC患者の末梢血単核細胞 (PBMC) において、CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の数を少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18%、少なくとも約19%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%増加させることができる。
本明細書で用いられる場合、「循環IgGレベルを低下させること」という語句は、IgG産生の減少を指す。ヒトにおいて血清抗体のおよそ75%を占めるIgGは、血液循環中に見出される最も一般的な種類の抗体である。Junqueira et al., Basic Histology. McGraw-Hill (2003)。IgG分子は、形質B細胞によって作製され、放出される。いくつかの局面において、本明細書に記載される医薬品を投与することは、医薬品の非存在下で測定された循環IgGレベルと比較して、患者の血清および／または血漿中の循環IgGレベルを少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低下させることができる。
「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原と結合することができ、免疫応答を媒介する細胞を指す。これらの細胞には、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、ならびに細胞傷害性Tリンパ球 (CTL)、例えば、CTL株、CTLクローン、および腫瘍、炎症、または他の浸潤物からのCTLが含まれるが、これらに限定されない。
「ナイーブ」免疫エフェクター細胞は、その細胞を活性化することができる抗原に曝露されたことがない免疫エフェクター細胞である。ナイーブ免疫エフェクター細胞の活性化は、増殖し、抗原特異的武装エフェクターT細胞に分化するために、ペプチド：MHC複合体の認識、およびプロフェッショナルAPCによる共刺激シグナルの同時送達の両方を必要とする。
「免疫応答」は、当技術分野で理解されている通りであり、一般に、外来因子または異常な、例えば、がん性の細胞に対する脊椎動物内の生体反応を指し、この反応は、これらの因子およびそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の1つまたは複数の細胞（例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー (NK) 細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞、または好中球）、ならびにこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用により媒介され、その結果、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性のもしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織の選択的標的化、それらへの結合、それら対する損傷、それらの破壊、および／または脊椎動物体内からのそれらの排除が起こる。免疫応答には、例えば、T細胞、例えば、エフェクターT細胞、Th細胞、CD4+細胞、CD8+ T細胞、もしくはTreg細胞の活性化もしくは阻害、または免疫系の任意の他の細胞、例えばNK細胞の活性化もしくは阻害が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞」という用語は、以前に抗原に遭遇したことがある、上記で定義された免疫エフェクター細胞である。そのナイーブな対応物とは対照的に、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化は、共刺激シグナルを必要としない。ペプチド：MHC複合体の認識で十分である。
T細胞に関して用いられる場合の「活性化された」は、細胞がもはやG0期になく、その細胞型（例えば、CD8+またはCD4+）に特徴的な細胞毒素、サイトカイン、およびその他の関連する膜結合タンパク質のうちの1つまたは複数を産生し始めており、その表面上に特定のペプチド／MHC複合体を提示する任意の標的細胞を認識し、それと結合し、そのエフェクター分子を放出し得ることを意味する。
「免疫療法」は、免疫系または免疫応答を誘導する、増強する、抑制する、またはその他の方法で修正する段階を含む方法による、疾患に罹患している、または疾患の罹患もしくは再発のリスクがある対象の処置を指す。例えば、CMN-001は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,822,223号において、および実施例において以下に記載されているような、増幅腫瘍RNA＋合成CD40L RNAが同時にエレクトロポレーションされた、完全に成熟し最適化された単球由来樹状細胞から調製された自己免疫療法である。
「免疫刺激療法」または「免疫刺激性療法」は、例えばがんを処置するために、対象における免疫応答の増加（誘導または増強）をもたらす治療法を指す。
「Tエフェクター」（「Teff」）細胞は、細胞溶解活性を有するT細胞（例えば、CD4+およびCD8+ T細胞）、ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化し指向するTヘルパー (Th) 細胞、例えばTh1細胞を指すが、制御性T細胞（Treg細胞）は含まない。
「制御性T」（「Treg」）細胞は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、かつ自己免疫疾患を防ぐT細胞を指す。Tregは免疫抑制性であり、一般にエフェクターT細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。Bettelli et al., Nature 441(7090): 235-238 (2006)。Tregは、バイオマーカーであるCD4、FOXP3、およびCD25を発現し、ナイーブCD4細胞と同じ細胞系譜に由来すると考えられている。Curiel T.J., The Journal of Clinical Investigation. 117(5):1167-1174 (2007)。TGFβは、TregがナイーブCD4+細胞から分化するために必須であり、Tregのホメオスタシスを維持する上で重要である。Chenet W. Immunotherapy 3(8): 911-914 (2011)。
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、T細胞共刺激受容体のアゴニスト活性の増強および／または阻害性受容体のアンタゴニスト活性の増強に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性（標的細胞上で直接的に、またはCD107aもしくはグランザイムの検出により間接的に決定される）、および増殖を測定するアッセイにおける、EC50または最大レベルの活性の増加倍率によって反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍、またはそれ以上増強され得る。
本明細書で用いられる場合、「T細胞を介した応答」という用語は、エフェクターT細胞（例えば、CD8+細胞）およびヘルパーT細胞（例えば、CD4+細胞）を含むT細胞によって媒介される応答を指す。T細胞を介した応答には、例えばT細胞の細胞傷害性および増殖が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「細胞傷害性Tリンパ球 (CTL) 応答」という用語は、細胞傷害性T細胞によって誘導される免疫応答を指す。CTL応答は、主にCD8+ T細胞によって媒介される。
本明細書で用いられる場合、「阻害する」または「阻止する」（例えば、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻害／または阻止に関して）という用語は、互換的に使用され、部分的および完全な阻害／阻止の両方を包含する。いくつかの局面において、抗ヒトCD16抗体（例えば、3G8抗体、B73.1抗体、またはCB16抗体）は、例えば本明細書においてさらに記載されるように決定して、低親和性Fc受容体であるCD16へのIgGの結合を少なくとも約50%、例えば、約60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%阻害する。
「自己」という用語は、後に再導入されるべき個体と同じ個体に由来する任意の物質を指す。例えば、患者に対して自己である腫瘍抗原は、対象から単離された腫瘍抗原を同じ対象に投与することを含む。
「がん」は、体内の異常な細胞の制御されていない成長を特徴とする様々な疾患の幅広い群を指す。制御されていない細胞分裂および成長は、隣接組織に侵入し、またリンパ系または血流を通じて身体の遠隔部位へと転移し得る悪性腫瘍の形成をもたらす。本開示の方法によって処置され得るがんの例には、腎細胞がんが含まれるが、これに限定されない。いくつかの局面において、本開示の方法は、例えば、腎臓がん、乳がん、膵臓がん、脳がん（例えば、星状細胞腫、多形神経膠芽腫）、骨がん、前立腺がん、結腸がん、肺がん、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫 (NHL)、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫 (PMBC)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫 (DLBCL)、濾胞性リンパ腫 (FL)、形質転換濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫 (SMZL)、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病、急性骨髄性白血病 (AML)、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病 (ALL)（非T細胞ALLを含む）、慢性リンパ性白血病 (CLL)、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢神経系 (CNS) の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されたものを含む環境誘発がん、その他のB細胞悪性腫瘍、および前記がんの組み合わせに由来する腫瘍の腫瘍サイズを減少させるために使用することができる。
本明細書で用いられる「腫瘍」という用語は、前がん病変を含む、良性（非がん性）または悪性（がん性）のいずれかの、過剰な細胞の成長または増殖に起因する組織の任意の塊を指す。
本明細書で用いられる「処置する」、「処置すること」、および「処置」という用語は、疾患に伴う症状、合併症、状態、もしくは生化学的徴候の進行、発現、重症度、もしくは再発を逆転させる、軽減する、改善する、阻止する、または遅らせるもしくは防ぐ、または全生存を増強する目的で、対象に対して行われるあらゆる種類の介入もしくは過程、または対象への活性剤の投与を指す。処置は、疾患を有する対象または疾患を有さない対象（例えば、予防のため）のものであってよい。
「疾患進行」、またはPDと省略され得る「進行性疾患」は、本明細書で用いられる場合、特定の疾患に伴う1つまたは複数の症状の悪化を指す。例えば、腫瘍を有する患者の疾患進行（例えば、腫瘍進行）には、1つまたは複数の悪性病変の数またはサイズの増加、腫瘍転移、および死亡が含まれ得る。
「有効用量」または「有効投与量」または「有効量」という用語は、所望の生物学的、治療的、および／または予防的結果をもたらす薬剤の量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因のうちの1つもしくは複数の減少、改善、緩和、低下、遅延、および／もしくは軽減、または生物系の任意の他の所望の変化であり得る。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こす、および／もしくは腫瘍の成長速度を低下させる（腫瘍成長を抑制するなど）、または他の望ましくない細胞増殖を遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの局面において、有効量は、腫瘍の再発を予防するかまたは遅延させるのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与において投与することができる。薬物または組成物の有効量は、(i) がん細胞の数を減少させることができ；(ii) 腫瘍サイズを減少させることができ；(iii) 末梢器官へのがん細胞浸潤をある程度まで阻害する、遅延させる、遅らせる、および停止させることができ；(iv) 腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで遅らせることができ、および停止させることができ；(v) 腫瘍成長を阻害することができ；(vi) 腫瘍の発生および／もしくは再発を予防するもしくは遅延させることができ；ならびに／または (vii) がんに伴う症状の1つもしくは複数をある程度まで緩和することができる。
腫瘍処置の例として、治療有効量または治療有効投与量の薬物は、未処置対象と比較して、細胞成長または腫瘍成長を少なくとも約20%、少なくとも約40%、少なくとも約60%、または少なくとも約80%阻害する。いくつかの局面において、治療有効量または治療有効投与量の薬物は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害する、すなわち細胞成長または腫瘍成長を100%阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、以下に記載されるアッセイを使用して評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、細胞成長を阻害する化合物の能力を調べることによって評価することができ、そのような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロ測定することができる。本明細書に記載されるいくつかの局面において、腫瘍退縮は、少なくとも約20日、少なくとも約40日、または少なくとも約60日の期間にわたって観察し、継続することができる。
本明細書において言及される「体重に基づく」用量または投薬という用語は、患者に投与される用量が、患者の体重に基づいて計算されることを意味する。例えば、体重60 kgの患者が3 mg/kgの抗CD16抗体を必要とする場合、投与のための抗CD16抗体の適切な量（すなわち、180 mg）を計算し、使用することができる。
本明細書に記載される方法および投与量に関する「一定用量」という用語の使用は、患者の体重または体表面積 (BSA) に関係なく、患者に投与される用量を意味する。一定用量はしたがって、薬剤（例えば、抗CD16抗体）のmg/kg用量としてではなく絶対量として提供される。例えば、60 kgの人と100 kgの人が、同一用量の抗体（例えば、480 mgの抗CD16抗体）を受容することになる。
本明細書で用いられる場合、「組成物」という用語は、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）または活性の、アジュバントなど別の化合物または組成物との組み合わせを指す。
本明細書で用いられる場合、本明細書に記載される「薬学的組成物」という用語は、活性剤と不活性または活性の担体との組み合わせを指し、該担体は、該組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断また治療上の使用に適したものにする。
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、および油／水エマルジョンまたは水／油エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のすべてを包含する。組成物は、安定剤および保存剤もまた含み得る。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 18th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990)) を参照されたい。
本明細書で用いられる場合、「投与すること」は、当業者に公知の様々な方法および送達系のいずれかを使用する、対象への薬剤の物理的な導入を指す。本明細書において開示される製剤の例示的な投与経路には、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、これには、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションが含まれる。いくつかの局面において、製剤は、非経口的ではない経路、例えば経口的に投与される。他の非経口的ではない経路には、例えば、鼻腔内、経膣的、経直腸、舌下、または局所的といった、局所、表皮、または粘膜の投与経路が含まれる。投与はまた、例えば、1回、複数回、および／または1回もしくは複数回の長期間にわたって行うことができる。
本明細書で用いられる「用量レジメン」は、免疫療法が施されるかまたは医薬品が投与される様式（例えば、各用量の大きさ（用量サイズ）、用量が繰り返される頻度および間隔）である。
本明細書で用いられる「投薬間隔」は、例えば、本明細書において開示される免疫療法または医薬品の複数回の用量が対象に投与される間に経過する時間量を意味する。したがって、投薬間隔は範囲として示すことができる。
本明細書で用いられる「投薬頻度」は、例えば本明細書において開示される免疫療法または医薬品の用量を所与の時間内に投与する頻度を指す。投薬頻度は、所与の時間当たりの用量の回数として示すことができ、例えば、1日に1回、または1週間に1回、または3週間ごとに1回であってよい。
本明細書で用いられる「1週間に約1回」、「約1週間ごとに1回」、「約2週間ごとに1回」という用語、または任意の他の類似の投薬間隔用語は、およその数を意味し、「1週間に約1回」または「約1週間ごとに1回」は、7日±2日ごと、すなわち5日ごと～9日ごとを含み得る。したがって「1週間に1回」の投薬間隔は、5日ごと、6日ごと、7日ごと、8日ごと、または9日ごとであり得る。「約2週間にごとに1回」は、14日±3日ごと、すなわち11日ごと～17日ごとを含み得る。同様の近似が、例えば、約3週間ごとに1回、約4週間ごとに1回、約5週間ごとに1回、約6週間ごとに1回、および約12週間ごとに1回に適用される。いくつかの局面において、約6週間ごとに1回または約12週間ごとに1回の投薬間隔は、最初の用量を第1週目の任意の曜日に投与することができ、次いで次の用量をそれぞれ第6週目または第12週目の任意の曜日に投与することができることを意味する。他の局面において、約6週間ごとに1回または約12週間ごとに1回の投薬間隔は、最初の用量を第1週目の特定の曜日（例えば、月曜日）に投与し、次いで次の用量をそれぞれ第6週目または第12週目の同じ曜日(すなわち、月曜日)に投与することを意味する。
本明細書で用いられる「患者」には、腫瘍（例えば、mRCC）に罹患している任意のヒトが含まれる。「対象」と「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いられる場合、本用語は、例えば、当技術分野において一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般的にタンパク質と称される長鎖の両方を指し、それらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、数ある中でも、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、互換的に使用されて、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してよく、公知または未知の任意の機能を果たし得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、ならびにプライマーを含む。天然の核酸分子に加えて、本開示の核酸分子はまた修飾核酸分子を含み得る。本明細書で用いられる場合、mRNAは、樹状細胞において翻訳され得るRNAを指す。そのようなmRNAは典型的には、キャッピングされ、リボソーム結合部位（コザック配列）および翻訳開始コドンを有する。
本明細書で用いられる場合、「ug」および「uM」という用語は、それぞれ「μg」および「μM」と互換的に使用される。
本明細書に記載される様々な局面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
II. 開示の方法
本開示は、腫瘍を含む疾患または状態を処置する方法であって、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階の連続段階を含む方法を対象とする。
本開示はまた、腫瘍を有する患者において、循環IgGレベルを低下させる、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、および／またはB細胞の濃度もしくは機能を低下させる方法であって、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階の連続段階を含む方法を対象とする。
免疫療法
1つの局面において、本明細書において提供される免疫療法は、腫瘍を有する患者への、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンの投与を伴う。いくつかの局面において、投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、有効な応答）をもたらすように調整される。
本明細書で用いられる場合、補助的または併用投与（同時投与）には、同一もしくは異なる剤形での免疫療法と医薬品の同時投与、または免疫療法と医薬品の別々の投与（例えば、連続投与）が含まれる。したがって、例えば、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法と医薬品を、同時に投与することができる。あるいは、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法と医薬品を、連続して投与することができる（例えば、CMN-001免疫療法は、医薬品の経口投与と同時に、もしくはその前の約30秒～約10分以内に、または医薬品の静脈内投与の直前に皮内注射される）。
例えば、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法および医薬品を最初に投与し、その後（例えば、その直後に）医薬品を投与することができる。いくつかの局面において、免疫療法と医薬品は同時に投与される。このような同時または連続的な投与は、免疫療法および医薬品の両方が処置対象において同時に存在することをもたらし得る。
いくつかの局面において、免疫療法はCMN-001であり、これは、増幅腫瘍RNA＋合成CD40L RNAが同時にエレクトロポレーションさた、完全に成熟し最適化された単球由来樹状細胞から調製された自己免疫療法である（例えば、Calderhead DM., et al. Keynote Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vancouver, BC, Poster Presentation. Feb. 1-7, 2005；Calderhead DM., et al. J. Immunother. 31(8):731-741 (2008)；DeBenedette MA. et al., J. Immunol. 181(8):5296-305 (2008)；DeBenedette MA. et al., J. Immunother. 34(1):45-57 (2011)、および実施例に記載されている）。
ある特定の局面において、CMN-001は、1週間ごとに約1回、2週間ごとに約1回、3週間ごとに約1回、4週間ごとに約1回、5週間ごとに約1回、6週間ごとに約1回、7週間ごとに約1回、8週間ごとに約1回、9週間ごとに約1回、10週間ごとに約1回、11週間ごとに約1回、または12週間ごとに約1回投与される。ある特定の局面において、CMN-001は3週間ごとに約1回投与される。いくつかの局面において、CMN-001は3週間ごとに1回投与される。
いくつかの局面において、免疫療法のレジメンは、医薬品の用量レジメンの開始後にも継続される。例えば、CMN-001免疫療法は、1週間ごとに約1回、2週間ごとに約1回、3週間ごとに約1回、4週間ごとに約1回、または四半期ごとに約1回投与することができる。いくつかの局面において、mTOR阻害剤は、CMN-001免疫療法の投与中にはいつでも、1日約1回経口投与される。いくつかの局面において、mTOR阻害剤は、免疫療法スケジュールと共に、1週間ごとに約1回静脈内投与される。
医薬品
本明細書で用いられる場合、医薬品は、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る。
ある特定の局面において、本明細書において提供される医薬品は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質 (mTOR) 阻害剤を含む。いくつかの態様において、mTOR阻害剤は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である。ある特定の局面において、ラパマイシン類似体には、エベロリムス、テムシロリムス、シロリムス、リダフォロリムス、またはそれらの組み合わせが含まれる。
阻害剤であるエベロリムスおよびテムシロリムスは、セリン／スレオニンタンパク質mTORを標的とし、タンパク質合成の遮断および細胞増殖の喪失を引き起こす。mTORは、増殖因子受容体のPI3K/Akt経路における下流の細胞周期制御因子を調節する。mTORの下流タンパク質標的には4EBP1およびp70S6Kが含まれ、これらは、血管新生、細胞成長、翻訳、およびタンパク質合成に影響を与える（Liao, C. et al., Cancer 110: 1501-1508 (2007)。機能的には、mTORは、2つの複合体、mTORC1およびmTORC2として存在する。mTORC1は、mTOR、PRAS40（プロリンリッチAKT基質40 kDa）、mLST8（哺乳動物致死性sec-13）、およびmTORの制御関連タンパク質 (RAPTOR) からなり、ラパマイシン、エベロリムス、およびテムシロリムスに対して感受性がある。ラパマイシンは、細胞内受容体FKBP12（12 kDaのFK506結合タンパク質）と複合体を形成し、mTORのFRBドメインに結合し、mTORC1を通じて下流のシグナル伝達を阻害する（Yip, C. et al., Mol Cell 38: 768-774 (2010)；Mills, R. E. et al., Cell Cycle 8: 545-548 (2009)；Foti et al., Clin Sci 129: 895-914 (2015))。
エベロリムスは、ラパマイシン（シロリムス）よりも高い安定性および有機溶媒中での溶解度の増強、ならびに副作用のより少ないより好ましい薬物動態を有する。例えば、米国特許出願公開第2012/0027757号を参照されたい。これは、移植医学ではZortress（登録商標）（米国）およびCertican（登録商標）（例えば、欧州）の商品名で、ならびに腫瘍学ではAfinitor（登録商標）（一般腫瘍）およびVotubia（登録商標）（結節性硬化症（「TSC」）の結果としての腫瘍）として、Novartisにより販売されている。エベロリムスは、商品名EvertorでBioconからも入手可能である。ある特定の局面において、エベロリムスは1日に約1回投与される。いくつかの局面では、約2.5 mg～約20 mg、約3 mg～約19 mg、約4 mg～約18 mg、約5 mg～約17 mg、約6 mg～約16 mg、約7 mg～約15 mg、約8 mg～約14 mg、約9 mg～約13 mg、または約10 mg～約12 mgのエベロリムスが1日に1回投与される。いくつかの局面では、約2.5 mg、約3 mg、約4 mg、約5 mg、約6 mg、約7 mg、約8 mg、約9 mg、約10 mg、約11 mg、約12 mg、約13 mg、約14 mg、約15 mg、約16 mg、約17 mg、約18 mg、約19 mg、約20 mg、約21 mg、約22 mg、約23 mg、約24 mg、または約25 mgのエベロリムスが1日に1回投与される。いくつかの局面では、約10 mgのエベロリムスが1日1回投与される。ある特定の局面では、10 mgのエベロリムスが1日1回投与される。いくつかの局面では、約5 mgのエベロリムスが1日に1回投与される。ある特定の局面では、5 mgのエベロリムスが1日に1回投与される。
Torisel（登録商標）としても公知であるテムシロリムスは、腎細胞がんの処置のためにPfaizer Inc. により販売されている。テムシロリムスの説明および調製は、例えば米国特許第5,362,780号に記載されている。
ある特定の局面において、テムシロリムスは1週間に約1回投与される。いくつかの局面では、約2.5 mg、約3 mg、約4 mg、約5 mg、約6 mg、約7 mg、約8 mg、約9 mg、約10 mg、約11 mg、約12 mg、約13 mg、約14 mg、約15 mg、約16 mg、約17 mg、約18 mg、約19 mg、約20 mg、約21 mg、約22 mg、約23 mg、約24、約25 mg、約26 mg、約27 mg、約28 mg、約29 mg、または約30 mgのテムシロリムスが1週間に1回投与される。いくつかの局面では、約25 mgのテムシロリムスが1週間に1回投与される。いくつかの局面では、25 mgのテムシロリムスが1週間に1回投与される。ある特定の局面では、約25 mgのテムシロリムスが1週間に1回、30～60分かけて投与される。シロリムスは、商品名Rapamune（登録商標）でPfizer Inc. により販売されている。
AP 23573、MK-8669としても公知であり、以前はデフォロリムスとして知られていたリダフォロリムスは、ラパマイシンの特有の非プロドラッグ類似体であり、インビトロの広範囲のヒト腫瘍細胞株およびヒト腫瘍細胞株を利用したマウス腫瘍異種移植モデルにおいて抗増殖活性を有する。リダフォロリムスは、進行がん患者に投与されている。例えば、米国特許出願公開第2012/0027757号を参照されたい。リダフォロリムスの説明および調製は、例えば米国特許第7,091,213号に記載されている。
ある特定の局面において、mTOR阻害剤の第1用量は、腫瘍の進行後に投与される。進行性疾患（例えば、腫瘍の進行）は、例えばSchwartz et al., Eur J Cancer 62: 132-137 (2016) に記載されているように、固形腫瘍効果判定基準 (RECIST) 1.1基準によって定義される。いくつかの局面において、腫瘍の進行、例えば、標的病変のサイズの増加または新たな病変の出現は、コンピュータ断層撮影（CTまたはCAT）スキャンで明らかである。
本開示のmTOR阻害剤は、様々な結晶、非晶質物質、薬学的に許容される塩、水和物、および溶媒和物としても存在し得る。
さらに、本開示のmTOR阻害剤は、プロドラッグとしても提供され得る。一般に、そのようなプロドラッグは、生体によって必要とされる化合物に容易に変換され得る、本開示のmTOR阻害剤の機能的誘導体である。したがって、本明細書に記載される、腫瘍（例えば、腎細胞がん）を含む疾患または状態を処置する方法において、「投与」という用語は、特定の化合物の投与のみならず、患者に投与された後に、生体内で特定の化合物に変換され得る化合物の投与も含む。適切なプロドラッグ誘導体の選択および製造のための従来法は、例えば、「Design of Prodrugs」ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されており、これは本明細書において参照され、本記載の一部として本明細書に全体的に組み入れられる。化合物の代謝産物は、化合物を生物学的環境に置くことによって生成される活性化合物を含み得、本開示における化合物の範囲内である。
いくつかの局面において、B細胞の機能を低下させる医薬品は、ナタリズマブ（Tysabri（登録商標））（例えば、Bornsen L et al., PLoS One. 7(11): e47578 (2010)；Braley T. J. et al. Curr Treat Options Neurol. 15(3):259-269 (2013) に記載されている）；テリフルノミド（Aubagio（登録商標））（例えば、Heinz W et al., Abstract, Annual Meeting of the Consortium of Multiple Sclerosis Centers (CMSC), National Harbor, MD, USA, June 1-4, 2016；Klotz et al., Science Translational Medicine 11(490): eaao5563 (2019)；Braley T. J. et al. Curr Treat Options Neurol. 15(3):259-269 (2013) に記載されている）；またはオファツムマブ（Arzerra（登録商標））（例えば、Vitale et. al., Clin Cancer Res; 22(10); 2359-2367 (2016) に記載されている）より選択される。
いくつかの局面において、B細胞の濃度を低下させる医薬品は、プレドニゾン（例えば、Salinas-Carmona M. C. et al., Autoimmunity. 42(6):537-544 (2009)；Settipane, G. A. et al., J Allergy Clin Immunol. 62(3):162-166 (1978)；Agarwal et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 99(3):281-283 (2007)；Giles et al., J ImmunoTherapy Cancer 6(51)（2018年6月11日公開）に記載されている）；シクロホスファミド（例えば、Sarinas-Carmona M. C. et al., Autoimmunity. 42(6):537-544 (2009)；Ahlmann et al., Cancer Chemother Pharmacol. (4):661-671(2016)；Scurr et al., Clin Cancer Res. 23(22):6771-6780 (2015)；Madondo et al., Cancer Treat Rev. 42:3-9(2016) に記載されている）；メトトレキサート（例えば、Sarinas-Carmona M. C. et al., Autoimmunity. 42(6):537-544 (2009)；Bulatovic et al., Rheumatology 54(9):1724-1734 (2015)；Cribbs et al., Arthritis Rheumatol. (5):1182-1192 (2015)；Yu et al., Clinical and Developmental Immunology, Volume 2013, Article ID 238035, 12 pages (2015) に記載されている）；ミコフェノール酸モフェチル（例えば、Sarinas-Carmona M. C. et al., Autoimmunity. 42(6):537-544 (2009)；Ritter et al., Transpl Infect Dis. 11(4):290-297 (2009)；Allison et al., Immunopharmacology 47(2-3):85-118 (2000)；McMurray et al., Am J Med Sci. 323(4):194-196 (2002) に記載されている）；アザチオプリン（例えば、Sarinas-Carmona M. C. et al., Autoimmunity. 42(6):537-544(2009)；Leitner et al., Immunol Lett. 140(1-2):74-80 (2011)；McCarthy et al., J Clin Invest. 125(8):3215-3225 (2015) に記載されている）；トリメトレキサート（例えば、Rosenthal et al., J Immunol. 141(2):410-416 (1988)；Mader et al., Comprehensive Medicinal Chemistry II, 7:55-79 (2007)；Pappo et al., J Natl Cancer Inst. 82(20):1641-1642 (1990) に記載されている）；コルチゾール（例えば、Besedovsky et al., FASEB 28:67-75 (2014) に記載されている）；プレドニゾロン（例えば、Wehling-Henricksa et al., Neuromuscular Disorders 14(8-9): 483-490 (2004)；Raziuddin et al., Scandinavian Journal of Immunology, 31:139-145 (1990) に記載されている）；メチルプレドニゾロン（例えば、Aristimuno et al., Journal of Neuroimmunology 204(1-2): 131-135 (2008) に記載されている）；デキサメタゾン（例えば、Hinrichs et al., J Immunother. 28(6):517-524 (2005) に記載されている）；ベタメタゾン（例えば、Kubin et al., Acta Derm Venereol 97:449-455 (2017) に記載されている）；トリアムシノロン（例えば、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Triamcinoloneに記載されている）；デノスマブ（Prolia（登録商標））（例えば、Bekker PJ et al., J Bone Miner Res 19(7):1059-1066 (2004)；Rossini M et al., Endocrine 53(3):857-859 (2016) に記載されている）；アタシセプト（例えば、Dall'Era et al., Arthritis & Rheumatism 56(12):4142-4150 (2007)；Xing et al., Oncotarget. 8(52): 89486-89499 (2017) に記載されている）；オクレリズマブ（Ocrevus（登録商標））（例えば、Laurent et al., ECTRIMS Online Library. 200348; P693; Oct 26, 2017；Gingele et al., Cells 8(1),12 (2019) に記載されている）；オビヌツズマブ（Gazyvaro（登録商標））（例えば、Garcia-Munoz et al., Immunotherapy. 10(6):491-499 (2018) に記載されている）；ベバシズマブ（Blincyto（登録商標））（例えば、Goeje et al., Clin Cancer Res 25(7):2219-2227 (2019)；Elamin et al., Cancer Microenviron. 8(1):15-21 (2015)；Li et al., Clin Cancer Res. 12(22):6808-6816 (2006) に記載されている）；またはイノツズマブオゾガマイシン（Besponsa（登録商標））（例えば、Carvello et al., Diabetes 61(1):155-165 (2012) に記載されている）より選択される。
いくつかの局面において、IgGの循環レベルを低下させる医薬品は、カルバマゼピン（例えば、Ashrafi et al., Iran J Pediatr. 20(3):269-176 (2010)；Mauri-Hellweg et al., J Immunol. 155(1):462-472 (1995)；White et al., J Allergy Clin Immunol. 136(2):219-234 (2015) に記載されている）；バルプロ酸ナトリウム（例えば、Ashrafi et al., Iran J Pediatr. 20(3):269-176 (2010)；Goodyear et al., Blood 116(11):1908-1918 (2010)；Armeanu et al., Cancer Res 65(14):6321-6329 (2005)；Poggi et al., Leukemia 23:641-648 (2009) に記載されている）；フェノバルビタール（例えば、Ashrafi et al., Iran J Pediatr. 20(3):269-176 (2010)；Hashizume et al., J Immunol. 168(10):5359-5368 (2002)；Nishio et al., J Derm. Science 48(1):25-33 (2007) に記載されている）；フェニトイン（Dilantin（登録商標））（例えば、Agarwal et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 99(3):281-283 (2012)；Mauri-Hellweg et al., J Immunol. 155(1):462-472 (1995) に記載されている）；レナリドミド（Revlimid（登録商標））（例えば、Shannon et al., Int Immunopharmacol. 12(2):441-446(2012)；Simone et al., Blood 122:119 (2013) に記載されている）；クロロキン（例えば、Accapezzato et al., J Exp Med. 202(6):817-828 (2005)；Garulli et al., Clinical and Vaccine Immunology 15(10):1497-1504 (2008) に記載されている）；アモジアキン（例えば、Mak et al., Chem. Res. Toxicol. 28:1567-1573 (2015) に記載されている）；ピリメタミン（例えば、Pierdominici et al., J Pharmacol Exp Ther. (3):1046-1057 (2005)；F. Matthew Kuhlmann, James M. Fleckenstein, 「Antiparasitic Agents,」 Infectious Diseases (Fourth Edition) (2017) に記載されている）；プログアニル（例えば、Elliott et al., Infect Immun. 73(4): 2478-2485 (2005)；Pombo et. al. Lancet.;360(9333):610-617(2002) に記載されている）；スルホンアミド（例えば、Mauri-Hellweg et al., J Immunol. 155(1):462-472 (1995)；Castrejon et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 125(2):411-418.e4 (2010) に記載されている）；メフロキン（例えば、Bijker et al., PLOS ONE 9(11): e112910 (2014) に記載されている）；アトバコン（例えば、Elliott et al., Infect Immun. 73(4): 2478-2485 (2005)；Pombo et. al. Lancet.;360(9333):610-617(2002) に記載されている）；プリマキン（例えば、Berenzon et al., Journal of Immunology 171:2024-2034 (2003) に記載されている）；アルテミシニン（例えば、Islamuddin et al., PLoS Negl Trop Dis. 9(1):e3321(2015) に記載されている）；ドキシサイクリン（例えば、Kloppenburg et al., Clin Exp Immunot 102:635-641 (1995) に記載されている）；クリンダマイシン（例えば、Ekmekciu et al., Front Immunol. 8:397 (2017) に記載されている）；カプトプリル（例えば、Wysocki et al., Clin Cancer Res. (13):4095-4102 (2006)；Silva Filho et al., Front.Cell. Infect. Microbiol., 7(42):1-17 (2017) に記載されている）；コルチゾール（例えば、Besedovsky et al., FASEB 28:67-75 (2014) に記載されている）；プレドニゾン（例えば、Salinas-Carmona M. C. et al., Autoimmunity. 42(6):537-544 (2009)；Settipane, G. A. et al., J Allergy Clin Immunol. 62(3):162-166 (1978)；Agarwal et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 99(3):281-283 (2007)；Giles et al., J ImmunoTherapy Cancer 6(51)（2018年6月11日公開）に記載されている）；プレドニゾロン（例えば、Wehling-Henricksa et al., Neuromuscular Disorders 14(8-9):483-490 (2004)；Raziuddin et al., Scandinavian Journal of Immunology, 31:139-145 (1990) に記載されている）；メチルプレドニゾロン（例えば、Aristimuno et al., Journal of Neuroimmunology 204(12): 131-135 (2008) に記載されている）；デキサメタゾン（例えば、Hinrichs et al., J Immunother. 28(6):517-524 (2005) に記載されている）；ベタメタゾン（例えば、Kubin et al., Acta Derm Venereol 97:449-455 (2017) に記載されている）；トリアムシノロン（例えば、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Triamcinoloneに記載されている）；酢酸フルドロコルチゾン（例えば、Baeck et al., Allergy 64:978-994 (2009) に記載されている）；酢酸デオキシコルチコステロン（例えば、Mohammed-Ali et al., 「Animal Models of Kidney Disease,」 Animal Models for the Study of Human Disease (Second Edition) (2017)；Perrotta et al., Cardiovascular Research, 114(3):456 467 (2018) に記載されている）；フェンクロフェナク（例えば、Cush et al., Arthritis & Rheumatism 33(5):623-633 (1990)；Spiers et al., International Journal of Immunopharmacology 15(8):865-869(1993) に記載されている）；金塩（例えば、Hirohata et al., Clinical Immunology 91(2):226-233 (1999) に記載されている）；ペニシラミン（例えば、Hirohata et al., Arthritis & Rheumatism 37(6):942-950 (1994)；Hill et al., Journal of Neuroimmunology 97(1-2):146-153 (1999)；Rosada et al., Clin Exp Rheumatol. 11(2):143-148 (1993) に記載されている）；スルファサラジン（例えば、Liptay et al., Br J Pharmacol. 137(5):608-620 (2002)；Kang et al., Immunology. 98(1):98-103 (1999) に記載されている）より選択される。
III. 抗体
ある特定の局面において、本開示は、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化を阻止するための抗CD16抗体の使用を包含する。本開示における使用に適した抗ヒトCD16抗体（またはそれらに由来するVHおよび／もしくはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。あるいは、当技術分野において認識されている抗CD16抗体を使用することができる。例えば、精製マウス抗ヒトCD16、クローン3G8抗体 (BD Biosciences) を使用することができる。
本明細書で用いられる3G8モノクローナル抗体は、ヒトNK細胞関連抗原であるIgG Fc受容体（FcγRIII、「CD16」としても公知である）の50～65 kDa膜貫通型に特異的に結合する。CD16は、NK細胞ならびにマクロファージおよび顆粒球上に発現される。CD16は、シグナル伝達およびNK細胞活性化において役割を果たすことが報告されている。3G8抗体は、可溶性免疫複合体の顆粒球への結合を阻止する。3G8抗体は、FcγRIIaおよびFcγRIIIb分子の両方と相互作用することにより、ヒト好中球における細胞内カルシウムレベルを上昇させることが報告されている（例えば、Vossebeld et al., Int J Biochem Cell Biol. 29(3):465-473 (1997) において）。この抗体は、同型の好中球凝集を誘発することもまた報告されている。
いくつかの局面では、マウス抗ヒトCD16、クローンB73.1抗体 (BioLegend)（例えば、Prodjinotho U, et al., PLoS Negl Trop Dis. 10.1371/journal.pntd.0005777. PubMed (2017) に記載されている）を使用することができる。
ある特定の局面では、マウス抗ヒトCD16、クローンCB16抗体 (eBioscience)（例えば、Yin et al., Scientific Reports 6, Article number: 26296 (2016)；Kragstrup et al., Arthritis Res Ther. 16(1): R42 (2014) に記載されている）を使用することができる。
開示された方法において使用可能な抗CD16抗体には、ヒトCD16に特異的に結合し、本明細書において開示される任意の抗CD16抗体、例えば、3G8抗体、B73.1抗体、またはCB16抗体とヒトCD16への結合について交差競合する、単離された抗体もまた含まれる。いくつかの局面において、抗CD16抗体は、本明細書に記載される抗CD16抗体、例えば、3G8抗体、B73.1抗体またはCB16抗体のいずれかと同じエピトープに結合する。抗原への結合について交差競合する抗体の能力は、これらの抗体が抗原の同じエピトープ領域に結合し、その特定のエピトープ領域への他の交差競合抗体の結合を立体的に妨げることを示す。これらの交差競合抗体は、CD16の同じエピトープ領域に結合することにより、参照抗体、例えば、3G8抗体、B73.1抗体またはCB16抗体のものと非常に類似した機能的特性を有することが予測される。交差競合抗体は、Biacore解析、ELISAアッセイ、またはフローサイトメトリーなどの標準的なCD16結合アッセイにおいて、例えば、3G8抗体、B73.1抗体またはCB16抗体と交差競合するそれらの能力に基づいて容易に同定することができる。
2つの抗体が同じエピトープに結合するかどうかを判定するための技法には、例えば、エピトープマッピング法、例えば、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のX線分析、および水素／重水素交換質量分析 (HDX-MS) など、抗原断片または抗原の変異変種に対する抗体の結合をモニターし、抗原配列内のアミノ酸残基の改変による結合の消失がエピトープ成分の指標と見なされる場合が多い方法、エピトープマッピングのためのコンピュータコンビナトリアル法が含まれる
ある特定の局面において、3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体とヒトCD16への結合について交差競合する、またはそれらと、ヒトCD16抗体の同じエピトープ領域に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト対象に投与する場合、これらの交差競合抗体は、キメラ抗体、操作抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体である。このようなキメラ、操作、またはヒト化もしくはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法によって調製し単離することができる。
本開示の方法において使用可能な抗CD16抗体には、上記抗体の抗原結合部分もまた含まれる。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが十分に実証されている。
開示された方法または組成物における使用に適した抗CD16抗体は、高い特異性および親和性でCD16に結合し、CD16の結合を阻止し、かつCD16シグナル伝達経路の免疫抑制効果を阻害する抗体である。本明細書において開示される組成物または方法のいずれにおいても、抗CD16「抗体」には、CD16に結合し、受容体結合の阻害および免疫系の上方制御において全抗体のものと類似の機能的特性を示す抗原結合部分または断片が含まれる。ある特定の局面において、抗CD16抗体またはその抗原結合部分は、ヒトCD16への結合について3G8抗体、B73.1抗体、またはCB16抗体と交差競合する。
本開示に有用な抗CD16抗体には、本明細書において開示されるVHおよび／またはVL配列の1つまたは複数を有する抗体から出発して操作された抗体が含まれ、この操作抗体は出発抗体とは異なる特性を有し得る。抗CD16抗体は、当技術分野で公知のように、改変抗CD16抗体の操作のために種々の改変によって操作され得る。
IV. 薬学的組成物
ヒト患者への投与に適した薬学的組成物は、典型的には、非経口投与用に、例えば、液体担体中に、または静脈内投与のための液体溶液もしくは懸濁液中への再構成に適するように製剤化される。
一般に、このような組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、特にヒトでの使用について、政府規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。このような薬学的担体は水および油などの滅菌液体であってよく、これには石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、リシノール酸グリセロールポリエチレングリコールなどが含まれる。水または生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射液用の担体として用いることができる。非経口投与用の液体組成物は、注射または持続注入による投与のために製剤化することができる。注射または注入による投与の経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、および皮下が含まれる。1つの局面において、mTOR阻害剤（例えば、テムシロリムス）は静脈内投与される。
V. 患者集団
腫瘍を含む疾患または状態を処置する方法であって、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(ii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階の連続段階を含む方法が、本明細書において提供される。
本開示のいくつかの局面において、本開示の方法を用いて処置され得る腫瘍は、例えば、腎臓がん、乳がん、膵臓がん、脳がん（例えば、星状細胞腫、多形神経膠芽腫）、骨がん、前立腺がん、結腸がん、肺がん、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫 (NHL)、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫 (PMBC)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫 (DLBCL)、濾胞性リンパ腫 (FL)、形質転換濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫 (SMZL)、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病、急性骨髄性白血病 (AML)、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病 (ALL)（非T細胞ALLを含む）、慢性リンパ性白血病 (CLL)、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢神経系 (CNS) の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されたものを含む環境誘発がん、その他のB細胞悪性腫瘍、および前記がんの組み合わせに由来し得る。
本開示のいくつかの局面において、腫瘍抗原は患者に対して自己である。いくつかの局面において、患者の腫瘍抗原は新たに発現され得る。ある特定の局面において、患者の腫瘍抗原は、変異した正常タンパク質抗原であり得る。
本開示はまた、転移性がん（例えば、転移性腎細胞がん（「mRCC」））の処置にも適用可能である。
本開示のいくつかの局面において、ヒト患者はmRCCに罹患している。診断時に、mRCC患者の予後は、客観的な予後リスク因子を用いて、3つの全体的疾患リスクプロファイル‐低リスク、中リスク、および高リスク‐に分類される。これらのリスク因子は、もともとは、この数年間にスニチニブおよびその他の新薬が承認されるよりも前にmRCCの処置のための標準治療であった、インターフェロン-αおよびIL-2などのサイトカインベースの免疫療法で処置された患者の臨床データに基づいて、メモリアル・スローン・ケタリングがんセンター (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)（「MSKCC」）の研究者らによって開発された。以下は改訂されたリスク因子（「Hengリスク因子」）であり、これらはmRCCにおける全生存期間と相関しており、
1. より侵攻性の疾患を示す、診断から全身的治療処置の開始までの期間が1年未満であること（「処置まで1年未満リスク因子」）；
2. 低レベルの、酸素を運搬する血液中のタンパク質であるヘモグロビン；
3. 補正カルシウムレベルの上昇；
4. 患者のパフォーマンスステータスまたは身体機能の低下；
5. 白血球の一種である好中球のレベルの上昇；および
6. 血小板数の増加
を含む。
処置の時点で0個のリスク因子を示す患者は、低リスク群に含まれ；1つまたは2つのリスク因子を示す患者は、中リスク群に含まれ；および3つまたはそれ以上のリスク因子を示す患者は、高リスク群に含まれる。
本開示のいくつかの局面において、患者は高リスクのヒト患者である。ある特定の局面において、高リスク患者は、以下のリスク因子：(i) 診断から全身的治療処置の開始までの期間が1年未満であること、(ii) 低レベルのヘモグロビン、(iii) 補正カルシウムレベルの上昇、(iv) 患者のパフォーマンスステータスまたは身体機能の低下、(v) 好中球のレベルの上昇、および (vi) 血小板数の増加のうちの3つまたはそれ以上を示す。
いくつかの局面において、腫瘍は淡明細胞型である。ある特定の局面において、腫瘍は非淡明細胞型である。RCCの診断は、一般に、顕微鏡下での腫瘍生検の検査によって行われる。腫瘍細胞の外観を評価して、病理医がRCCを淡明細胞型と非淡明細胞型に分類する。全米総合がん情報ネットワーク (National Comprehensive Cancer Network) によると、全RCC診断のおよそ85%は淡明細胞RCCである。
VI. 処置プロトコール
CMN-001の標的用量は、皮内 (i.d.) 注射によって送達される約6～約25×106個のDCである。試験集団は高リスクmRCC患者を含む。CMN-001投薬は、以下の3期からなり得る：
導入期：3週間間隔で3用量
維持期：4週間間隔で7用量；および
ブースター期：12週間ごと。
CMN-001は、一般にがん免疫 (IO) 剤と称されるチェックポイント阻害剤の投与の後に、またはそれと同時に投与することができる。CMN-001は、mTOR阻害剤（例えば、エベロリムス）および／またはTKI阻害剤（例えば、レンバチニブ）の投与の前、それと同時に、またはその後に投与することができる。
VII. 結果
本明細書において開示される方法に従って処置された患者は、好ましくは、がんの少なくとも1つの徴候の改善を経験する。1つの局面において、改善は、測定可能な腫瘍病変の量および／またはサイズの減少によって測定される。別の局面では、病変は、胸部X線またはCTもしくはMRIフィルムで測定することができる。別の局面では、細胞診断または組織診断を使用して、治療に対する応答性を評価することができる。
1つの局面において、処置された患者は、完全奏効 (CR)、部分奏効 (PR)、安定疾患 (SD)、免疫関連完全疾患 (irCR)、免疫関連部分奏効 (irPR)、または免疫関連安定疾患 (irSD) を示す。別の局面において、処置された患者は、腫瘍の縮小および／または成長速度の低下、すなわち腫瘍成長の抑制を経験する。別の局面では、望ましくない細胞増殖が減少するかまたは阻害される。さらに別の局面では、以下のうちの1つまたは複数が起こり得る：がん細胞の数が減少し得る；腫瘍サイズが減少し得る；末梢器官へのがん細胞浸潤が阻害され得る、遅延され得る、遅くなり得る、または停止され得る；腫瘍転移が遅くなり得るまたは阻害され得る；腫瘍成長が阻害され得る；腫瘍の再発が予防または遅延され得る；がんに伴う症状の1つまたは複数がある程度まで緩和され得る。
さらに他の局面において、本処置方法は、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(iii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、ならびに (ii) B細胞の濃度および／または機能の低下のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階を含まない処置方法によって達成されたものよりも優れた臨床的有用率（CBR＝CR＋PR＋SD≧6ヶ月）をもたらす。他の局面において、臨床的有用率の改善は、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階を含まない処置方法と比較して、約20% 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、またはそれ以上である。
さらに他の局面において、本処置方法は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または約100%の客観的奏効率（ORR＝CR＋PR）をもたらす。いくつかの局面において、奏効期間中央値は、≧3ヶ月、≧6ヶ月、≧12ヶ月、または≧18ヶ月である。1つの局面において、奏効期間中央値は≧6ヶ月である。いくつかの局面において、奏効期間≧6ヶ月の患者の頻度は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%である。
さらに他の局面において、本処置方法は、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階を含まない処置方法によって達成されたものよりも優れた客観的奏効率（ORR＝CR＋PR）をもたらす。他の局面において、客観的奏効率の改善は、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階を含まない処置方法と比較して、約20% 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、またはそれ以上である。いくつかの局面において、奏効期間中央値は、≧3ヶ月、≧6ヶ月、≧12ヶ月、または≧18ヶ月である。1つの局面において、奏効期間中央値は≧6ヶ月である。
さらに他の局面において、本処置方法は、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または約100%の疾患制御率（DRR＝CR＋PR＋SD）をもたらす。1つの局面において、本処置方法は、少なくとも約70%の疾患制御率をもたらし、この場合、悪性腫瘍は、抗PD1抗体または抗PD-L1抗体による処置に抵抗性であるLAG-3陽性メラノーマである。いくつかの局面において、奏効期間中央値は、≧3ヶ月、≧6ヶ月、≧12ヶ月、または≧18ヶ月である。1つの局面において、奏効期間中央値は≧6ヶ月である。いくつかの局面において、奏効期間≧6ヶ月の患者の頻度は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%である。
さらに他の局面において、本処置方法は、(a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、(i) 循環IgGレベルを低下させる、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階を含まない処置方法によって達成されたものよりも優れた疾患制御率（DRR＝CR＋PR＋SD）をもたらす。他の局面において、疾患制御率の改善は、(i) 処置前の腫瘍試料におけるLAG-3発現のレベルを決定する段階、(ii) 処置のためのLAG-3陽性腫瘍を選択する段階、(iii) 処置前にLAG-3陽性として同定された腫瘍を処置する段階、または (iv) これらの任意の組み合わせを含まない処置方法と比較して、約20% 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、またはそれ以上である。いくつかの局面において、奏効期間中央値は、≧3ヶ月、≧6ヶ月、≧12ヶ月、または≧18ヶ月である。1つの局面において、奏効期間中央値は≧6ヶ月である。
VIII. キットおよび単位剤形
腫瘍を含む疾患または状態（例えば、腎細胞がん）に罹患している患者を処置するためのキットもまた、本開示の範囲内である。キットは典型的には、キットの内容物の意図される用途および使用説明書を示すラベルを含む。「ラベル」という用語は、キット上にもしくはキットと共に提供されるか、または他の方法でキットに付随する任意の書面または記録媒体を含む。
1つの態様において、キットは例えば以下を含む：
(a) 腫瘍を有する患者への、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量；
(b) (i) 循環IgGレベルの低下、(ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、(iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、(iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、(v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量；ならびに
(c) 本明細書に記載される方法において免疫療法および医薬品を使用するための説明書。
本開示の実施は、特に指示のない限り、当技術分野の技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技法を用いる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155；Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)、およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.) を参照されたい。
以下の実施例は、限定の目的ではなく、例証の目的で提供される。
以下の実験方法および詳細は、以下の実施例において参照される。
実施例1
材料および方法
特に定めのない限り、以下に記載される実施例は、以下の材料および方法のうちの1つまたは複数を使用する。
血液試料の採取および処理
ADAPT試験 (NCT01582672) に登録されたヒト被験者は、参加前に書面によるインフォームドコンセントを提供し、本試験は、ヘルシンキ宣言および調和国際会議の優良臨床試験基準に従って各施設内倫理委員会によって承認された。末梢血試料は、同意したmRCC患者からヘパリンナトリウムチューブ（Becton-Dickinson、NJ, USA）中に、またはKey Biologics (Memphis, TN) によって提供された健常ボランティアから白血球除去収集によって収集した。血液からの血漿の分離は遠心分離によって行い、末梢血単核細胞 (PBMC) はHistopaque-1077 (Sigma-Aldrich) を用いて単離した。分離された血漿は、分注して-80℃で凍結し、PBMCは、10% DMSO (Sigma-Aldrich) を含むFBS (Atlanta Biologicals) 中に再懸濁し、液体窒素中で保存した。血漿は室温で解凍し、56℃まで加熱して30分間置き、短時間遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、直ちに使用するか、または-80℃で再凍結した。
細胞培養
PBMCおよびDCは、解凍してPBS (Lonza) 中で洗浄した後に計数した。成熟後エレクトロポレーション単球由来樹状細胞 (PME-CD40L) は、DeBenedette MA. et al., J Immunol. 181(8):5296-5305 (2008)（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、健常ドナーから作製し、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAとCD40LをコードするRNAを同時にエレクトロポレーションした。生細胞の計数は、BD TruCount Absolute Counting Tubesおよびヨウ化プロピジウム (BD Biosciences) を用いて、フローサイトメトリーにより行った。PBMCおよびDCを、10%正常ヒトAB血清 (Valley biomedical) を含むX-Vivo15（ゲンタマイシンおよびフェノールレッド含有）(Lonza) 中に再懸濁した。エベロリムス (LC Laboratories) を添加するかまたは添加せずに、健常ドナーまたはmRCC患者の血漿と共に、滅菌Falcon 5 mLポリプロピレン丸底試験管 (Corning Life Sciences) 中で、100万個のPBMCを10:1のPBMC:DC比でDCと混合し、37℃の5% CO2インキュベーター内で6日間インキュベートした。HLA不一致の2名の健常ドナーからの凍結PBMCバイアルを解凍し、計数した。各ドナーからの100万個の生存PBMCを、エベロリムスを添加するかまたは添加せずに、健常ドナーまたはmRCC患者の血漿と共に、滅菌Falcon 5 mLポリプロピレン丸底試験管に添加し、37℃の5% CO2インキュベーター内でインキュベートした。精製マウス抗ヒトCD3（クローンOKT3、BD Biosciences）を使用して、培養中の健常ドナーPBMCを刺激した。0.5μgのOKT3を、mRCC患者血漿を添加するかまたは添加せずに、100万個の生存PBMCと共にインキュベートし、37℃の5% CO2インキュベーター内で7日間インキュベートした。
細胞表面および細胞内の染色
T細胞は、APC-H7マウス抗ヒトCD3抗体（クローンSK7、BD Biosciences）を用いて同定した。T細胞サブセットは、Pacific Blueマウス抗ヒトCD4抗体（クローンRPA-T4、BD Biosciences）およびPerCP-Cy5.5マウス抗ヒトCD8抗体（クローンSK1、BD Biosciences）を用いて同定した。IL-2α受容体を発現している活性化T細胞は、Brilliant Violet 605マウス抗ヒトCD25抗体（クローン2A3、BD Biosciences）を用いて同定した。CD80およびCD86と結合するT細胞共刺激受容体は、PEマウス抗ヒトCD28抗体（クローンCD28.2、BD Biosciences）を用いて同定した。B細胞は、APC-eFluor 780マウス抗ヒトCD19抗体（クローンHIB19、ThermoFisher Scientific）を用いて同定した。最終分化したB細胞は、APCマウス抗ヒトCD38抗体を用いて同定した。増殖細胞は、Brilliant Violetマウス抗Ki-67抗体（クローンB56、BD Biosciences）を用いて同定した。免疫グロブリンGサブクラスの重鎖は、PE-CF594マウス抗ヒトIgG抗体（クローンG18-145、BD Biosciences）を用いて同定した。多機能サイトカインであるヒトトランスフォーミング増殖因子β-1は、PerCP-Cy5.5マウス抗ヒトLAP (TGF-β1) 抗体（クローンTW4-2F8、Biolegend）を用いて同定した。培養細胞を含む5mLチューブを400 gで5分間遠心分離した後、上清をデカントした。ペレット化した細胞を、ウシ胎児血清および≦0.09%アジ化ナトリウム (BD Biosciences) を含むStain Buffer 2 mLを添加することによって洗浄し、短時間ボルテックスし、遠心分離した。Stain Bufferをチューブからデカントし、次いでペレット化した試料をモノクローナル抗体で表面染色し、短時間ボルテックスし、暗所において室温で15分間インキュベートした。次いで、試料を2 mLのPBSで洗浄し、遠心分離して、1 mLのPBS中に再懸濁した。2μLのLIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell色素 (ThermoFisher Scientific) を各試料に添加し、37℃で15分間インキュベートした。試料を洗浄し、2 mLのStain Bufferを用いて2回遠心分離した。デカントしペレット化した細胞をボルテックスし、次いで1 mLの希釈Transcription Factor Fix/Perm Buffer (BD Biosciences) を用いて室温で15分間固定した。1 mLの1×Transcription Factor Perm/Wash Buffer (BD Biosciences) を各試料に添加し、短時間ボルテックスし、遠心分離した。Perm/Wash bufferを試料からデカントし、2mLのPerm/Wash bufferで再度洗浄した。Perm/Wash Bufferをチューブからデカントし、次いでペレット化した試料をモノクローナル抗体で細胞内抗原について染色し、短時間ボルテックスし、暗所において室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、試料をPerm/Wash Bufferで2回洗浄し、350μLのStain Buffer中に再懸濁した。
フローサイトメトリーの取得および解析
試料は、青色 (488nm)、緑色 (532nm)、赤色 (633nm)、および紫色 (405nm) レーザーで構成された特別注文のBD LSRIIフローサイトメーターを使用して取得した。UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) を、単色補正コントロールとして使用するために、個々の蛍光色素コンジュゲート抗体と共に使用した。試料の取得には、BD FACSDivaソフトウェア (BD Biosciences) を使用した。試料の解析は、FlowJoソフトウェアv9.9.6 (Tree Star, Inc.) を用いて行った。
B細胞刺激
凍結した患者PBMCを解凍し、計数し、PBS中で洗浄した。この細胞をX-VIVO 15培地（ゲンタマイシンおよびフェノールレッド含有；Lonza）中に細胞2×106個／mLで再懸濁し、37℃の5% CO2インキュベーター内で一晩インキュベートした。細胞を計数し、X-VIVO 15培地中の細胞1×106個／mLで培養液中に設定した。細胞を、CPGオリゴデオキシヌクレオチド (ODN) 2006（2.5μg/mL；InvivoGen）、抗ヒトIgM（25μg/mL；Jackson Labs）、F(ab')2抗ヒトIgG、IgM (H＋L)（25μg/mL；Invitrogen）、LEAF精製抗ヒトCD40（クローンHB14、1.0μg/mL；Biolegend）、IL-2（120 UI/mL；ProLeukin）、IL-4（4 ng/mL；R＆D Systems）、およびIL-21（10 ng/mL；R＆D Systems）の組み合わせで刺激した。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Dedobbeleer O. et al., J Immunol., 199(2):391-396 (2017) を参照されたい。非刺激のまたは刺激済みの培養物に、エベロリムス (LC Laboratories) を10 ng/mLで添加した。培養物を、37℃の5% CO2インキュベーター内で、6日間にわたって終夜インキュベートした。
TGF-β1の検出
血漿および上清試料中の全TGF-β1の濃度は、LEGEND MAX Total TGF-β1 ELISA Kit (Biolegend) を用いて定量化した。試料は、潜在型TGF-β1を活性化するために酸処理によって調製し、次いでアッセイ緩衝液中で1:20または1:100に希釈した。試料を、抗TGF-β1抗体でプレコーティングしたプレート上で2時間インキュベートした。抗TGF-β1を1時間インキュベートし、プレートを洗浄し、Avidin-HRPと共に30分間インキュベートした。プレートをTMB基質溶液および停止溶液で発色させ、ELx800プレートリーダーを使用して450 nmおよび570 nmで読み取った。
統計解析
統計解析は、Microsoft Excel 2016ソフトウェアバージョン (Santa Cruz, CA) で行い、平均値の分散を箱ひげ図として示す。群間の統計比較は、対応のあるτ検定を用いて算出した。p値≦0.05を、統計的に有意であると見なした。
実施例2
エレクトロポレーションによる抗原発現樹状細胞の作製
300×106個の末梢血単核細胞 (PBMC) を、T150フラスコ (Corning) 内の30 mL AIM-V培地 (Thermo Fisher Scientific) 中で2時間培養して、単球の接着をもたらした。単層を冷却リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (Cambrex) で2回洗浄することによって非接着細胞を除去し、残存する単球を、それぞれ1000 U/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)（Bayer AG、Leukine（登録商標）液体）およびIL-4 (R&D Systems) を補充したX-VIVO 15培地 (Cambrex) 中で5日間培養した。DCの成熟を達成するために、まず5日目に未熟DCを10 ng/mL腫瘍壊死因子α(TNF-α) (R&D Systems)、1000μ/mLインターフェロンγ(IFN-γ) (Actimmune)、および1μg/mLプロスタグランジンE2 (PGE2) (Sigma) と共に培養した。6日目に、表現型的に成熟したDCに、3ug／DC 100万個の濃度の、CD40LをコードするRNA (Argos Lot No. 101606 JSC) ＋ 2μg／DC 100万個の、ヒトサイトメガロウイルス (CMV) pp65またはMART-1のいずれかをコードするRNA（CMVpp65 RNA-Argos Lot No 071107XF、MART-1-APL RNA-Argos Lot No. 011909HC）を同時にエレクトロポレーションした。MART-1 RNAおよびCD40L RNAの作製は、例えば、DeBenedette et al., J. Immunol. 181(8):5296-5305 (2008) に記載されている。
エレクトロポレーションしたDCを、低接着性6ウェルプレート (Costar) においてDC 1×106個／mLで、800μ/mL GM-CSFおよび500μ/mL IL-4を補充したX-VIVO 15培地中でさらに4時間培養した。4時間後、冷却PBSで洗浄することによってDCを回収し、抗原がエレクトロポレーションされた成熟後エレクトロポレーション (PME)-CD40L DC調製物である、20% DMSOおよび80% FBS中のDC 10×106個／mLの凍結製剤として調製した。
実施例3
MART-1およびCMV pp65特異的CTLの作製
HLA-A2陽性ドナーに由来し、抗原をコードするmRNAをトランスフェクトしたPME-CD40L DCを、精製CD8+ T細胞と共培養した。共培養はすべてR-10培地中で行った。CD8+ T細胞は、単球接着段階から回収された非接着細胞からCD8+ T Cell Negative Selection Kit II (Miltenyi Biotec) を用いて精製した。CD8+細胞をDCと10:1比で混合し、0.2μg/mL IL-2および10 ng/mL IL-7 (R&D Systems) の存在下でインキュベートした。7日目にDC／T細胞共培養物を再刺激し、20単位／mL IL-2＋10 ng/mL IL-7を補充した。10日目に、MART-1に対する一次免疫応答およびCMV pp65に対する記憶／想起応答の誘導を測定した。
実施例4
サイトメガロウイルス抗原pp65およびメラノーマ関連抗原MART-1に対するCD8+ T細胞免疫応答の誘導
T細胞の特異性および機能の解析
抗原特異的T細胞応答および抗原特異的細胞の表現型を同定するために、T細胞を刺激後10日目に回収し、ブレフェルジンA、モネンシン (BD Biosciences)、およびCD107a PE-Cy5と共に、10:1比のペプチドパルスT2標的細胞と共に4時間インキュベートした。T2細胞は、R-10培地中での1.5時間のインキュベーションによって、MART-APL (LAGIGILTV)、CMV pp65 (NLVPMVATV)、または前立腺特異抗原からの対照ペプチド (PSA-FLTPKKLQCV) のHLA-A2拘束性エピトープでペプチドパルスした。4時間の共培養後、レスポンダーT細胞を必要なペプチド／ペンタマー試薬で10分間染色し、次いで1回洗浄し、CD8-Eflour605、CD45RA-FITC、およびCD28-APCで再染色した。次いで細胞をPBS中で洗浄し、生存率の解析のためにAquadye (BD Biosciences) で染色した。次いで、標識された細胞をFixation/Permeabilization溶液 (eBiosciences) 中で固定し、透過処理した。次いで、細胞を透過処理緩衝液中のIFN-γ-PECy7、TNFa-AF700、およびIL-2-PerCPcy5.5で染色し、取得の前にFACs緩衝液中に再懸濁した。
サイトメガロウイルス抗原pp65に対するCD8 + T細胞免疫応答の誘導
CD8+ 細胞傷害性Tリンパ球 (CTL) 応答を用いて、mTOR阻害剤エベロリムスおよびテムシロリムスの存在下でPME-CD40L DCによって誘導されたpp65 CMV想起応答を測定した。CMV pp65をコードするPME-CD40L DCを用いて、CMN-001製品との適合性について評価中のmTOR阻害剤の存在下で想起CTL応答を刺激した。CMV pp65に特異的な想起CTLの拡大を、PME-CD40L DCによる2週目の刺激後3日目に決定した。様々な濃度のエベロリムスまたはテムシロリムスの存在下で、CMV pp65ペプチドを負荷したMHCペンタマー分子を用いて、規定されたゲート内の細胞の割合（図1Aおよび図1C）ならびにCMV pp65特異的CTLの絶対数（図1Bおよび図1D）を決定した。mTOR阻害剤の非存在下で設定されたDC/CTL共培養と比較して、試験した最低濃度 (10 ng/ml) の両方のmTORの存在下で、CMV pp65特異的CTLの割合および数の両方が増加した。CMV+ CTLの割合および絶対数のこの増加は、試験した、より高濃度のmTOR (1μg/ml) においてさえ明らかであった。
mTOR阻害がインビトロでCTLエフェクター機能に及ぼす影響を評価するために、CMV pp65特異的CTLを、サイトカインIFN-γ、TNF-α、およびIL-2を分泌する能力、ならびに溶解活性を測定するための代替マーカーとして機能する脱顆粒マーカーCD107aを発現する能力についてアッセイした。図2Aおよび図2Bに示されるデータでは、CMV pp65ペプチドパルス標的細胞に応答してIFN-γ、TNF-α、もしくはIL-2を分泌するか、またはCD107aを発現するCMV pp56特異的CTLの絶対数を測定している。示されたCMV+ CTLの絶対数は、各パラメータの抗原特異的応答のみを表示するために、バックグラウンドの非特異的応答について補正してある。サイトカインを分泌するかまたはCD107aを発現するCMV+ CTLの数は、未処理のCTLと比較して、試験した両方のmTOR阻害剤の存在下で増加した。さらに、このエフェクター機能の増加は、エベロリムス（図2A）およびテムシロリムス（図2B）ともに、試験した最低濃度 (10 ng/ml) で見られ、試験した最高濃度 (1μg/ml) でさえも維持された。
メラノーマ関連抗原MART-1に対する一次CD8 + T細胞免疫応答の誘導
mTOR阻害剤の存在下におけるMART-1特異的CTLプライミングの同様の解析を行った。MART-1抗原をコードするPME-CD40L DCを用いて、図3A～3Dに示される濃度にわたるmTOR阻害剤エベロリムスおよびテムシロリムスの存在下でCTL応答をプライミングした。MART-1に特異的なプライミングされたCTLの拡大を、PME-CD40L DCによる2週目の刺激後3日目に決定した。MART-1ペプチドを負荷したMHCペンタマー分子を用いて、MART-1特異的CTLの割合（図3Aおよび図3C）ならびに絶対数（図3Bおよび図3D）を決定した。MART-1抗原をコードするPME-CD40L DCは、エベロリムスおよびテムシロリムスの両方の存在下で、MART-1特異的CTLをプライミングすることができた。エベロリムス（図3Aおよび図3B）ならびにテムシロリムス（図3Cおよび図3D）の存在下で、同様レベルのMART-1+ CTLの割合および絶対数が誘導された。
mTOR阻害剤処理がインビトロでCTLエフェクター機能に及ぼす影響を評価するために、MART-1特異的CTLを、サイトカインIFN-γ、TNF-α、およびIL-2を分泌する能力、ならびに溶解活性を測定する代替マーカーとして機能する脱顆粒マーカーCD107aを発現する能力についてアッセイした。図4Aおよび図4Bに示されるデータでは、MART-1ペプチドパルス標的細胞に応答してIFN-γ、TNF-α、もしくはIL-2を分泌するか、またはCD107aを発現するMART-1特異的CTLの絶対数を測定している。示されたMART-1+ CTLの絶対数は、各パラメータの抗原特異的応答のみを表示するために、バックグラウンドの非特異的応答について補正してある。サイトカインを分泌するかまたはCD107aを発現するMART-1+ CTLの数は、未処理のCTLと比較して、試験したより高濃度のエベロリムス（図4A）およびテムシロリムス（図4B）の両方の存在下で増加した。
実施例5
B細胞のIgG分泌の阻害
マルチカラーフローサイトメトリーによる細胞抗原染色
培養細胞を遠心分離し、100μl中、コンジュゲート抗体CD3 (UCHT1) APC-eFluor 780、CD16 (ebioCB16)、CD56 APC (TULY56) (eBioscience)、CD4 (RPA-T4) Pacific Blue、CD8 (SK1) PerCP-Cy5.5、グランザイムb (GB11) FITC、CD279 (EH12.1) PE-Cy7、CD25 (2A3) BV605、CD184 (12G5) PE-Cy5 (BD Biosciences)、CD45RA (HI100) BV570 (Biolegend)、CD14 (TUK4) Qdot 655 (Life Technologies)、およびCMV pp65 MHCデキストラマーまたはペンタマーPE（それぞれImmudexまたはProImmune）で室温で15分間、表面染色した。細胞をPBS (Cambrex) で2回洗浄し、1ml PBS中、Live/Dead Fixable Aqua蛍光反応色素 (Invitrogen) で37℃で15分間染色した。細胞をStain Buffer (FBS) (BD Bioscience) で2回洗浄し、Transcription Factor Buffer Set (BD Bioscience) を用いて室温で15分間固定した。細胞をPerm Wash Bufferで2回洗浄し、100μl中、コンジュゲート抗体IgG (G18-145)、PE-CF594 (BD Biosciences)、FoxP3 PE (206D) (Biolegend)、およびKi67 BV711 (Biolegend) で室温で15分間染色した。細胞をPerm Wash Bufferで2回洗浄し、350μlのStain Buffer (FBS) 中に再懸濁し、Trucount Absolute Counting Tubes (BD Biosciences) に移した。試料は、BD LSRII Special Order System (BD Biosciences) を使用して取得した。解析は、Flowjoソフトウェアver.9.9.4 (Tree Star, Inc.) を用いて行った。
mRCC患者由来の末梢血リンパ球の増殖
mRCC患者からの単核細胞をHistopaque-1077 (Sigma-Aldrich) を用いて単離し、10% DMSO (Sigma-Aldrich) を含むFBS (Atlanta Biologicals) 中に再懸濁し、液体窒素中で保存した。解凍したPBMCを20mlのX-Vivo 15 (Lonza) 中に再懸濁した。製造業者の説明書に従って、抗ヒトCD19マイクロビーズ (Miltenyi Biotec) を用いて、解凍したPBMCからCD19+ B細胞を枯渇させた。簡潔に説明すると、PBMCをCD19マイクロビーズで磁気標識し、LD Macs Columnに負荷した。CD19+ B細胞をMacs Separatorの磁場に残したまま、非標識細胞画分を収集した。B細胞を枯渇させたまたは枯渇させていないPBMCを、5%熱非働化ヒトAB血清 (Valley Biomedical) を含むX-Vivo 15中に、細胞1×106個／mlの濃度で再懸濁し、全腫瘍タンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションした自己由来のPME-CD40L DCと共に、またはそれなしで、37℃±1℃、5% CO2±1%、65～95%相対湿度において8日間インキュベートした。B細胞枯渇リンパ球は、DCで刺激した場合に、B細胞を枯渇させていないPBMCからのリンパ球よりも、6日目から8日目にKi67の検出が増加し、7日目に発現がピークになることにより判断して、増殖の増加を示す。B細胞枯渇PBMCからのCD3-CD16+CD56+ NK細胞は、DC刺激なしで8日目に45.1% Ki67+PD1-であるのに対して、PBMC（B細胞枯渇およびDC刺激なしで培養）からのCD3-CD16+CD56+ NK細胞は、2.7% Ki67+PD1-である（図6A）。B細胞枯渇PBMCは、8日目に、DC刺激で、より高いNK細胞増殖（26.3%対6.0%）を示し続けている（図6B）。B細胞枯渇PBMCからのCD4+T細胞 (CD3+CD4+) は、DC刺激なしで8日目に4.4% Ki67+PD1-であり、非B細胞枯渇PBMCからのCD4+T細胞は、DC刺激なしで8日目に0.1% Ki67+PD1-である（図6C）。B細胞枯渇PBMCは、8日目に、DC刺激で、より高いCD4+ T細胞増殖（5.7%対2.0%）を示し続けている（図6D）。B細胞枯渇PBMCからのCD8+ T細胞（CD3+CD8+）は、DC刺激なしで8日目に0.8% Ki67+PD1-であり、非B細胞枯渇PBMCからのCD8+T細胞は、DC刺激なしで8日目に0.2% Ki67+PD1-である(図6E）。B細胞枯渇PBMCは、8日目に、DC刺激で、より高いCD8+ T細胞増殖（11.3%対7.9%）を示し続けている（図6F）。
mRCC患者由来のPME-CD40L DCは、CD4 hi T細胞におけるFoxP3 + /CD25 + /PD1 + 発現を誘導する
mRCC患者由来の7日目の培養PBMCは、CD3+CD4+細胞をゲーティングした場合、7日目に、DC刺激なしではFoxP3低発現を示すが（図7D）、PME-CD40L DCで刺激した場合にはより高い発現を示す（図7A）。CD3+CD4hi、FoxP3+細胞（ヒストグラム中の実線）は、CD3+CD4low、FoxP3+細胞（ヒストグラム中の破線）およびCD3+CD4low、FoxP3-細胞（影付きヒストグラム）と比較して、CD25（図7B）、細胞内IgG（図7C）、およびPD1（図7E）の発現増加を示す。CD3+CD4hi、FoxP3+細胞（ヒストグラム中の実線）は、CD3+CD4low、FoxP3+細胞（ヒストグラム中の破線）およびCD3+CD4low、FoxP3-細胞（影付きヒストグラム）と比較して、ケモカイン受容体CXCR4のより低い発現を示す（図7F）。
抗CD16抗体は、mRCC患者由来のPME-CD40L DCによって誘導されたCD4 high 発現リンパ球における細胞内IgG取り込みを阻止する
フローサイトメトリー解析により、8日間のDC刺激中の、CD4+ T細胞によるIgG免疫複合体の結合および内部移行が明らかになる。B細胞枯渇PBMC（図8C）、または0日目に培養物に添加された10μgの抗CD16抗体クローン3G8（図8D）、B73.1（図8D）、もしくはCB16（図8D）は、抗CD16抗体を添加しなかった細胞（図8A）またはアイソタイプ対照抗体MPOC-21 (10μg) を添加した細胞（図8B）と比較して、CD4high発現T細胞におけるIgG検出の減少を示す。図8Gは、MPOC-21、3G8、B73.1、もしくはCB16の存在下における、またはmRCC患者由来のPBMCのB細胞枯渇による、IgGと結合するCD3+CD4hi細胞の割合の減少を示す。
抗CD16抗体は、mRCC患者由来のPME-CD40L DCによって誘導されたCD8 + T細胞におけるPD1発現を下方制御する
フローサイトメトリー解析により、8日間のDC刺激後の、PD1陰性の増殖性 (Ki67+) C8+T細胞の割合の増加が明らかになる（それぞれ7.82%および2.13%）（図9A）。B細胞枯渇PBMC（図9C）、または0日目に培養物に添加された10μgの抗CD16抗体クローン3G8（図9D）、B73.1（図9E）、もしくはCB16（図9F）は、抗CD16抗体を添加しなかった細胞またはアイソタイプ対照抗体MPOC-21 (10μg) を添加した細胞（図9B）と比較して、PD1陰性の増殖性CD8+ T細胞の増加を示す。図9Gは、抗CD16抗体の非存在下における、MPOC-21、3G8、B73.1、もしくはCB16の存在下における、またはmRCC患者由来のPBMCのB細胞枯渇による、PD1陰性の増殖性 (Ki67+) C8+ T細胞の割合の変化を示す。
CD4 + T細胞によるIgG免疫複合体の結合および内部移行は、健常ドナー由来のPD1 + CD8 + 増殖性T細胞を誘導する
Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) を用いて健常ドナーから単核細胞を単離し、10% DMSO (Sigma-Aldrich) を含むFBS (Atlanta Biologicals) 中に再懸濁し、液体窒素中で保存した。解凍したPBMCを20mlのX-Vivo 15 (Lonza) 中に再懸濁した。PBMCを、5%熱非働化ヒトAB血清 (Valley Biomedical) を含むX-Vivo 15中に、細胞1×106個／mlの濃度で再懸濁し、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションした自己由来のPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV) もしくはpp65 CMVタンパク質をコードするRNAのみをエレクトロポレーションしたPME DC (DCCMV) と共に、またはそれらなしで、37℃±1℃、5% CO2±1%、65～95%相対湿度において7日間インキュベートした。健常ドナー由来の7日目の培養PBMCは、0日目にDCCMVで刺激した場合に、CD4+CD25+ T細胞におけるFoxP3発現の増加を示した（図10Cおよび10D）。CD4+FoxP3+T細胞は、DCCMV（27%（図10G）から15%（図10H））またはDCCD40L+CMV（26.4%（図10S）から11.5%（図10T））と共に0日目に抗CD16クローン3G8を培養物に添加した場合に、IgG検出の減少を示した。CD4+FoxP3+細胞におけるIgGの減少と共に、CD3+CD8+ T細胞は、DCCMVで刺激した場合（17.1%（図10K）から13.4%（図10L））またはDCCD40L+CMVで刺激した場合（16.1%（図10W）から11.2%（図10X））に、PD1陽性Ki67+増殖性細胞の割合の減少を示した。DCCD40L+CMVで刺激したPBMCは、DCCMVで刺激したPBMC（4.1%（図10K））と比較して、より高い割合のPD1発現陰性の増殖性CD8+T細胞 (15.5% 10W) を示す。0日目に培養物に添加した場合、3G8抗体の添加により、PD1陰性Ki67+増殖性CD3+CD8+ T細胞の割合はさらに増加し、DCCMVでは5.6%であり（図10L）、DCCD40L+CMVでは26.7%であった（図10X）。DCで刺激したPBMCの相関解析により、CD4+FoxP3+におけるIgG検出と増殖性CD3+CD8+ T細胞におけるPD1発現について正の相関が示される（図10Y）。したがって、IgG複合体と結合するCD4+細胞とCD8+PD1+ T細胞との間には直接的な相関がある。IgG複合体の結合を抗CD16抗体で阻止すると、PD1陰性の増殖性CD8+ T細胞の割合が増加する。
CD4 + T細胞によるIgG免疫複合体の結合および内部移行の阻害は、抗原特異的CD3 + CD8 + CTLのPD1発現を減少させる
Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) を用いて健常ドナーから単核細胞を単離し、10% DMSO (Sigma-Aldrich) を含むFBS (Atlanta Biologicals) 中に再懸濁し、液体窒素中で保存した。解凍したPBMCを20mlのX-Vivo 15 (Lonza) 中に再懸濁した。PBMCを、5%熱非働化ヒトAB血清 (Valley Biomedical) を含むX-Vivo 15中に、細胞1×106個／mlの濃度で再懸濁し、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションした自己由来のPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV) と共に、またはそれなしで、37℃±1℃、5% CO2±1%、65～95%相対湿度において7日間インキュベートした。一部のPBMCは、6日目にDCCD40L+CMVで再刺激した。抗CD16クローン3G8を0日目に培養物に添加した場合、CD3+CD4+CD25+CD45RA T細胞は、IgG検出の減少を示す（図11Bおよび図11D）。IgG陰性Ki67+細胞は、再刺激せずに3G8を伴うPBMCでは59.2%（図11A）から69.1%（図11B）に増加し、および6日目にDCで再刺激し0日目に3G8を添加した場合には、50.1%（図11C）から79.6%（図11D）に増加した。CMVデキストラマー陽性CD8 T細胞は、3G8抗体の存在下でDCCD40L+CMVで刺激した場合、6日間刺激した培養物では（727（図11I）対370（図11J））の、および6日目にさらに1日間DCで再刺激したPBMCでは1276（図11K）対796（図11L）の、PD1平均蛍光強度の減少を示す。
IGAg結合を阻止することにより、抗原特異的記憶T細胞によるIFN-γ分泌が増強される
健常ドナーPBMCを解凍し、20mlのX-Vivo 15 (Lonza) 中に再懸濁した。PBMCを、5%熱非働化ヒトAB血清 (Valley Biomedical) を含むX-Vivo 15中に、細胞1×106個／mlの濃度で再懸濁し、pp65 CMVタンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションした自己由来のPME-CD40L DC (DCCD40L+CMV) と共に、またはそれなしで、37℃±1℃、5% CO2±1%、65～95%相対湿度において8日間インキュベートした。IGAg複合体のCD16への結合を阻止することの機能的結果を試験した。細胞から生成された上清を、製造業者の説明書に従ってCytometric Bead Array (CBA) Flex Set Kit (BD Biosciences) を用いて、インターフェロンγ (IFN-γ) の存在について解析した。50μlの上清を、IFN-γに特異的なCapture Beads と共に室温でインキュベートした。1時間後、PE検出試薬を各チューブに添加し、さらに2時間インキュベートした。1.0 mlのWash Bufferを添加し、200×gで5分間遠心分離することにより、試料を洗浄した。各チューブから上清を除去し、300μlのWash Bufferで置換した。試料は、LSRIIフローサイトメーターを用いて取得し、FCAP Arrayソフトウェア (BD Bioscience) を用いて解析した。抗CD16抗体3G8の存在下では、DCCD40L+CMVで刺激した培養物においてIFN-γ分泌が増強された（図12）。
IgG複合体結合を阻止することにより、抗原特異的記憶T細胞によるGrbが増強される
CD4+ T細胞へのIgG複合体結合を阻止することにより（図13C）、その後、DCCD40L+CMVで刺激した培養物において、CMV特異的CTLの割合が0.818%（図13A）から2.05%（図13B）に増加する。さらに、細胞溶解活性の発現に関与する分子であるGrbを発現するCMV特異的CTLの能力は、阻止抗体の存在下で増加した（図13D；白いヒストグラム）。
IgG結合制御性細胞の減少に伴う活性化NK細胞および記憶T細胞の増加
CMV抗原をコードするDCで刺激したCTL培養物（上述）から作成されたデータをプロットして、活性化NK細胞と活性化CD4+ T細胞（図5A）、活性化NK細胞とIgG結合制御性CD4+細胞（図5B）、CMV+（特異的）CTLと活性化CD4 T細胞（図5C）、およびCMV+ CTLとIgG結合制御性CD4 T細胞（図5D）の関係を示した。
実施例6
進行性腎細胞がんの自己樹状細胞免疫療法＋標準治療 (ADAPT) の第3相試験における全生存期間のカプラン・マイヤー分析
mRCC患者における第1選択治療としてのTKIと併用した自己DC療法を評価するADAPT臨床試験の全結果は、Figlin RA. et al., Clin Cancer Res., 26(10):2327-2336 (2020) に記載されている。ADAPT試験の臨床データの後ろ向き解析中に、DC療法の投与後または第1選択のSOC療法後に第2選択療法としてのmTOR阻害剤エベロリムスを受けた患者91名のコホートが特定された。DC療法と併用してエベロリムスを受けたmRCC患者は、臨床的有用性を示した（図14A）。エベロリムス処置集団 (n=91) は、（DC療法）の用量 (n=60) または少なくとも1用量もしくは複数用量のスニチニブ (n=31) を受けた被験者を含んでいた。DC療法とエベロリムスを併用して処置された患者の全生存期間 (OS) 中央値は23.0ヶ月であったのに対して、単独のエベロリムスで処置された患者群では13.6ヶ月であり、ハザード比は0.76（95% CI；0.45～1.31）であった。ADAPT臨床試験のデータのさらなる後ろ向き解析では、最初に進行が現れた後に第2選択のエベロリムスを受けた患者に目を向け (n=49)、患者は、DC療法による処置期間中にエベロリムスを受けたか（図14B）(n=38)、または単独のエベロリムスを受けた (n=11)。OS中央値は、併用処置群で19.3ヶ月であり、単独エベロリムス処置群で17.8ヶ月であり、ハザード比は0.89（95 %CI；0.42～2.10）であった。
最大の臨床的有用性は、試験の追跡期間中にエベロリムスを受けた、併用群に登録された患者において認められた (n=42)（図14C）。エベロリムスと併用してDC療法を受けた併用群のmRCC患者 (n=22) のOS中央値は25.8ヶ月であったのに対して、SOC療法後の追跡においてエベロリムスで処置された群 (n=20) では13.4ヶ月であった。ハザード比は0.51（95% CI；0.23～1.11）であった。これらの結果から、第2選択療法で投与されたエベロリムスが、DC療法と併用された場合に、臨床的有用性の改善をもたらすことが示される。さらに、本データから、エベロリムスの添加前に免疫応答が活性化される必要があることが示唆される。したがって、エベロリムス処置の前に投与されるDC療法は、活性記憶T細胞応答を誘導し、それがエベロリムスによってさらに増強される。
さらに、患者を群内で比較した場合、試験の追跡期間中にエベロリムスを受けた患者と併用群における処置中にエベロリムスを受けた患者との間で生存曲線が良好に分離し、OSは19.3ヶ月に対して25.7ヶ月であった（HR 0.59 95%CI；0.30、1.19）（図14D）。しかしながら、SOC群に登録され、追跡または処置のいずれかにおいてエベロリムスを受けた患者について同様の解析を行った場合、生存曲線は追跡中よりも処置中のエベロリムスの投与を支持し、OSはそれぞれ17.7ヶ月および13.4ヶ月であった（HR 1.04 95%CI；0.43、2.48）（図14E）。
実施例7
mRCC患者から収集された血漿は免疫抑制性である
健常ドナーから収集されたPBMCを、0日目に添加した10% HD血漿または10% mRCC患者血漿の存在下で、pp65 CMVタンパク質をコードする自己PME-CD40L-CMV DCでインビトロで7日間刺激した。T細胞の増殖を、Ki67陽性細胞の検出によって測定した。DC刺激は、CD4+ T細胞およびCD4-(CD8+) T細胞の両方の増殖をもたらし（図15A）、健常ドナー由来の血漿の添加により増殖は阻害されなかったが（図15B）、それとは対照的に、mRCC患者由来の血漿はCD4およびCD8 T細胞の両方の増殖を完全に阻止した（図15C）。第2の健常ドナーから収集され、第2の実験で試験した血漿により、血漿の免疫抑制的性質が健常ドナーではなくmRCC患者から収集された血漿に特異的であるという観察結果が確認された（図15D）。
mRCC患者血漿によって媒介される免疫抑制の範囲を理解するために、mRCC患者血漿の存在下でT細胞を刺激するためにHLA不一致健常ドナーを用いる二方向MLRを利用して、一連の実験を設定した。
CD4+およびCD4- T細胞のKi-67+発現の頻度を、7日間の培養後に、二方向MLRにおいて、血漿添加なし（左側パネル）および血漿処理（右側パネル）の試料について決定した（図16A）。mRCC患者血漿を添加すると、CD4+およびCD8+ T細胞の両方の増殖が阻止され、増殖性CD4 T細胞の頻度は12%から0.26%に低下し（図16Aの右上象限）、CD8 T細胞については増殖性CD8 T細胞の頻度は5.36%から0.58%に低下した（図16Aの右下象限）。
さらに、OKT3抗体を0日目にPMBC培養物に添加し、7日間の培養後に、血漿添加なし（左側パネル）および血漿処理（右側パネル）の試料についてフローサイトメトリーによりKi-67を検出することによって、CD4+およびCD4- T細胞の増殖を決定した（図16B）。MHC拘束を回避し、TCR複合体を介して直接シグナル伝達する抗CD3抗体OKT3でPBMC培養物を刺激した場合には、mRCC患者血漿の添加により、CD4 T細胞の増殖（図16Bの右上象限）もCD8 T細胞の増殖（図16Bの右下象限）も抑制されなかった。これらのデータから、mRCC患者血漿がT細胞増殖を阻害する能力が、培養物中のAPC上のMHC分子の認識に依存していたことが示される。MLRにおける抑制プロファイルを、反復試料について示す（図16C）。
さらに、MLR培養物をmRCC患者血漿で刺激すると、CD4およびCD8 T細胞におけるCD25（図16D）およびCD28（図16E）受容体の両方の発現が減少した。対照的に、T細胞をOKT3抗体で刺激した場合、mRCC患者血漿の添加はCD25の発現にほとんど影響を及ぼさなかったが（図16D）、MLRで見られた効果と同様にCD28の発現に影響を及ぼした（図16E）。
ADAPT試験に登録され、DC療法の投与後に第2選択療法としてのエベロリムスを受けた患者がより良好な臨床成績を有したという観察結果を考慮して、エベロリムスがmRCC患者血漿の免疫抑制活性を逆転させ、T細胞応答を増強し得るという概念を調べた。HLA不一致の健常ドナーPBMCを混合し、2% mRCC患者血漿の存在下で、0日目に20 ngのエベロリムスを添加するかまたは添加せずに7日間培養し、CD28+記憶T細胞の頻度を決定した。エベロリムスは、mRCC患者血漿の存在下で減少した増殖性CD28+ CD4 T細胞の頻度を部分的に回復させた（図17Aの中央および右側パネル）。しかしながら、6名の個々のmRCC患者から収集された血漿試料の抑制活性を試験した場合、この回復は統計的に有意ではなかった (p<0.087)（図17C）。一方、増殖性CD28- CD4 T細胞の頻度の上昇は、血漿添加により検出されず、これはエベロリムスの添加によって逆転させることができた（図17D）。同様のパターンが、血漿の存在下でCD8 T細胞について検出され（増殖性CD28+ CD8 T細胞の頻度の低下（図17E）および増殖性CD28- CD8 T細胞の頻度の上昇（図17F））、これはエベロリムスの添加により逆転させることができた。これらの結果は、試験した6つのmRCC患者血漿試料のコホートについて統計的有意性に達した。
エベロリムスがどのようにしてmRCC患者血漿の免疫抑制効果を軽減し得るのかの理解を深めるため、pp65 CMV抗原を提示する自己DCでPBMCを刺激した。健常ドナーPBMCと自己DCを混合し、2% mRCC患者血漿の存在下で、0日目に20 ngのエベロリムスを添加するかまたは添加せずに6日間培養した。増殖性CD28+ CD4 T細胞の少ないが再生可能な頻度が誘導されたが、CD28- CD4 T細胞はごくわずかであり（図18Aの左側パネル）、これはMLRで見られたCD4 T細胞応答とは異なっている。しかしながら、増殖性CD28+ CD4 T細胞の頻度は、mRCC患者血漿の存在下で抑制され（図18Aの中央パネル）、エベロリムスを共培養物に添加した場合に部分的に回復した（図18Aの右側パネル）。MLRからの結果と同様に、エベロリムスの存在下における増殖応答の変化は、試験した6つの血漿試料のコホートにおいて統計的有意性に達しなかった (p<0.283)（図18C）。低頻度の増殖性CD28- CD4 T細胞が検出され、エベロリムスはこれらの細胞の頻度にはほとんど影響を及ぼさない（図18D）。しかしながら、エベロリムスは、増殖性CD28+ CD8 T細胞の血漿媒介抑制を部分的に逆転させ（図18Bの中央および右側パネル）、この効果は、試験した6つの血漿試料のコホートについて統計的に有意であった (p<0.0002)（図18E）。MLRで見られたデータとは対照的に、エベロリムスは、増殖性CD28-CD8 T細胞の頻度を低下させる最小限の能力を有した (p<0.92)（図18F）。
実施例8
エベロリムスは、CD25+CD28+記憶T細胞の頻度を維持するのに役立つ
エベロリムスは、他のmTOR阻害剤と共に、腎細胞がんの処置のために承認された治療法であるが、これは従来、移植臓器の生存期間、特に腎臓移植片の生存期間を延長するための免疫抑制剤として使用されてきた。したがって、記憶T細胞応答を誘導するように設計された自己DC療法を受けた患者に対して、免疫抑制剤がどのように臨床的有用性をもたらすのかを理解することは興味深いことであった。例えば、DeBenedette MA et al., J Immunother., 34(1):45-57 (2011)；Calderhead DM. et al., J Immunother., 31(8):731-741 (2008) を参照されたい。
血漿の抑制がCD28+ T細胞の頻度に選択的に影響を及ぼし、エベロリムスがこの記憶表現型の抑制の軽減を媒介するという観察結果を考慮して、CD28+ T細胞サブセットをさらに特徴付けた。HLA不一致の健常ドナーPBMCを混合し、2% mRCC患者血漿の存在下で、0日目に20 ngのエベロリムスを添加するかまたは添加せずに7日間培養した。刺激後のMLR培養物において、CD28およびCD25二重陽性のCD4およびCD8 T細胞の頻度の増加が検出され（図19Aおよび19Bの左側パネル）、これらが初期記憶T細胞であることが示唆された。T細胞におけるCD25およびCD28受容体の発現は両方とも、記憶T細胞の完全な分化に不可欠である。血漿処理により、CD25+CD28+ CD4およびCD8 T細胞の両方の頻度が低下した（図19Aおよび図19Bの中央パネル）。血漿の存在下で刺激した培養物へのエベロリムス添加は、CD25+CD28+ CD4およびCD8 T細胞の頻度の部分的回復をもたらした（図19Aおよび19Bの右側パネル）。6つの独立した血漿試料で処理した培養物のコホートからの複合結果により、CD25+CD28+ T細胞表現型の回復が、CD4 T細胞（図19C p< 0.045）およびCD8 T細胞（図19E p< 0.0061）の両方について統計的に有意であることが示される。さらに、血漿の存在下で刺激した培養物におけるD25+CD28- CD8 T細胞の頻度の上昇は、エベロリムスを添加した場合に、もはやCD25+CD8 T細胞の優位な集団を示さなかった（図19D p< 0.001）。
さらに、PBMCを自己DCで刺激した場合のmRCC患者血漿の抑制効果に対するエベロリムスの影響を調べた。MLR実験から示されたデータと同様に、CD25+CD28+ CD4およびCD8 T細胞集団の頻度は、mRCC患者血漿の存在下で低下し（図20Aおよび20Bの左および中央パネル）、エベロリムスの添加によって部分的に回復させることができた（図20Aおよび20Bの右側パネル）。しかしながら、CD25+CD28+ CD4 T細胞の回復は、試験した6つのmRCC血漿試料のコホートにおいて統計的有意性に達しなかった（図20C）。対照的に、エベロリムスは、mRCC患者血漿の存在下で刺激したCD25+CD28-（図20D）およびCD25+CD28+（図20E）CD8 T細胞の頻度を部分的に回復させることができ、試験した6つの患者血漿試料のコホートについて統計的有意性に達した。
CD25+CD28+ T細胞の頻度を回復させるエベロリムスの能力を理解するために、mRCC患者血漿の存在下で、MLRにおいてまたは自己DCで刺激したCD8 T細胞におけるCD25およびCD28両方の発現を、幾何平均蛍光強度 (MFI) によって測定した。HLA不一致の健常ドナーPBMCを、2% mRCC患者血漿の存在下で、0日目に20 ngのエベロリムスを添加するかまたは添加せずに、MLRにおいて7日間刺激するか（図21Aおよび21B）、またはDCで刺激して6日間培養した後に（図21Cおよび21D）、T細胞応答を測定した。mRCC患者血漿は、MLRにおいてまたは自己DCで刺激したCD8 T細胞の細胞表面におけるCD25およびCD28両方の発現を減少させた（図21）。エベロリムスの添加は、MLRにおいて刺激したCD8 T細胞（図21Aおよび21B）ならびに自己DCで刺激したCD8 T細胞（図21Cおよび21D）におけるCD25およびCD28の発現の統計的に有意な増加をもたらした。これにより、CD8 T細胞の細胞表面におけるCD25（図21Aおよび21C）ならびにCD28（図21Bおよび21D）の発現の統計的に有意な増加が存在した。
実施例9
エベロリムスはB細胞のTGF-β分泌を阻害する
mRCC患者から収集された血漿の1つの潜在的な免疫抑制成分は、高濃度のTGF-βである。腫瘍は、TGF-βの存在を通じて免疫抑制性の微小環境を築き、CD4およびCD8 T細胞機能の調節不全を引き起こし得る。8つの無作為に選択された、試験されたADAPT mRCC患者血漿試料のコホートでは、2名の個々の健常ドナーから収集された血漿（1.9 ng/mLおよび3.4 ng/mL）と比較して、高濃度のTGF-β（12 ng/mL～143 ng/mL）が検出された（図22A）。mRCC患者の血漿中で測定されたTGF-βの濃度は、MLR培養物中で刺激されたKi-67+ CD4 T細胞の頻度と逆相関した（図22B；r2値0.51）。
TGF-βの1つの潜在的な供給源は制御性B細胞であり、B細胞がTGF-βを産生する能力は、mTORシグナル伝達経路を介して制御され得る。さらに、mRCC患者の末梢血中に存在する活性化CD38+ B細胞は、潜在型TGF-βを産生する。CD38+ B細胞は、TGF-βによるのではなくIL-10を介して自己免疫炎症反応およびCD4 T細胞の分化を抑制する制御性B細胞の供給源であることが報告されている。例えば、Banko Z, J. Immunol., 198(4):1512-1520 (2017)；Blair PA. et al., Immunity, 32(1):129-140 (2010) を参照されたい。しかしながら、歯周病患者において、CD38+ B細胞の頻度とTGF-βは正に相関した。例えば、Hetta HF. et al., Vaccines, 8(2) (2020) を参照されたい。報告されたデータにおける矛盾は、異なるサイトカインプロファイルを有するB細胞を生じさせる、異なる炎症環境を反映している可能性がある。例えば、Rosser EC. et al., Immunity, 42(4):607-612 (2015) を参照されたい。
そこで、B細胞のTGF-β産生に及ぼすエベロリムスの影響を調べた。mRCC患者由来のPBMCを、実施例1に記載されるように、エベロリムスを添加するかまたは添加せずに、刺激して（「刺激」）または刺激せずに（「対照」）、TGF-β分泌を誘導した。上清中のTGF-β濃度を、6日後にELISAによって測定した。mRCC患者由来のPBMCを、エベロリムスの存在下で刺激してB細胞を活性化した場合、刺激されたB細胞によって分泌されるTGF-βの濃度が低下した（図23A）。
CD38+ B細胞の頻度を、エベロリムスを添加したまたは添加しなかった非刺激培養物（「対照」）または刺激培養物（「刺激」）中の生存CD19+ B細胞をゲーティングすることにより、フローサイトメトリーによって決定した。刺激により、CD19+ B細胞の5.58%から22.1%の範囲のCD38+ B細胞が検出され、エベロリムスで処理した場合には、CD38+ B細胞の頻度はその後低下し、3.07%から6.35%の範囲であった（図23B）。潜在関連ペプチド (LAP) と複合体を形成した潜在型TGF-βの細胞内検出によると、刺激されたCD19+ B細胞は、TGF-βを産生することができた（図23Cの右上パネル）。
エベロリムスで処理すると、CD19+ LAP+ B細胞の頻度が低下した（図23Cの右下パネル）。さらに、LAP+ B細胞のサブゲーティングにより、エベロリムスによって、LAP+/Ig+ B細胞の頻度が61.5%から6.14%に低下し（図23Dの左上象限）、LAP+/Ig+ CD38+ B細胞の頻度が3.89%から0.11%に（図23Dの右上象限）、およびLAP+CD38+Ig- B細胞の頻度が4.04%から2.63%に（図23Dの右下象限）低下したことが明らかになった。したがって、エベロリムスは、B細胞がCD38+ TGF-β+ B細胞に分化する能力を調節することができる。
がん患者由来の活性化CD38+ B細胞におけるTGF-βを検出する能力は、がん患者におけるB細胞の制御状態を反映し得る。TGF-βは活性型では存在せず、活性化のためには潜在型タンパク質から切断されなければならない。このことから、血漿中のTGF-βと、TGF-βをT細胞に送達するためのメディエーターとしてのB細胞との関連が示唆される。
特定の局面の前述の説明は、本開示の一般的性質を十分に明らかにしているため、他の者は、当業者の技能の範囲内の知識を適用することによって、本開示の一般的概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなく、そのような特定の局面を容易に修正し、および／または様々な適用に適合させることができる。したがって、そのような適合および修正は、本明細書に提示された教示および指導に基づいて、開示された局面の等価物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書における語法または用語は、説明の目的であって限定を目的とするものではなく、本明細書の用語または語法は、教示および指導に照らして当業者によって解釈されるべきであることが理解されるべきである。
本開示の他の局面は、本明細書において開示される本開示の明細書および実施の考察から当業者には明らかであろう。明細書および実施例は、単なる例示として見なされ、本開示の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
本明細書において開示される出版物、特許、および特許出願はすべて、それぞれ個々の出版物、特許、または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、参照により組み入れられる。

Claims (30)

  1. 腫瘍を処置する方法であって、
    (a) 腫瘍を有する患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに
    (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、
    (i) 循環IgGレベルの低下、
    (ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、
    (iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、
    (iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、
    (v) B細胞のTGF-β分泌の減少、および
    (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持
    のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階
    の連続段階を含む、前記方法。
  2. 医薬品の投与が腫瘍の進行後に行われる、請求項1に記載の方法。
  3. 医薬品がmTOR阻害剤である、請求項2に記載の方法。
  4. mTOR阻害剤の第1用量が、腫瘍の進行後に投与される、請求項3に記載の方法。
  5. mTOR阻害剤がラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、請求項3に記載の方法。
  6. ラパマイシン類似体が、エベロリムス、テムシロリムス、シロリムス、およびリダフォロリムスからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
  7. ラパマイシン類似体がエベロリムスである、請求項6に記載の方法。
  8. エベロリムスが1日に約1回投与される、請求項7に記載の方法。
  9. 約10 mgのエベロリムスが1日に1回投与される、請求項8に記載の方法。
  10. ラパマイシン類似体がテムシロリムスである、請求項6に記載の方法。
  11. テムシロリムスが1週間に1回投与される、請求項6に記載の方法。
  12. 約25 mgのテムシロリムスが1週間に1回投与される、請求項11に記載の方法。
  13. 医薬品がB細胞の機能を低下させ、ナタリズマブ、テリフルノミド、およびオファツムマブからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
  14. 医薬品がB細胞の濃度を低下させ、プレドニゾン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、トリメトレキサート、コルチゾール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、デノスマブ、トリアムシノロンアセトニド、アタシセプト、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、ベバシズマブ、およびイノツズマブオゾガマイシンからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
  15. 医薬品がIgGの循環レベルを低下させ、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、フェノバルビタール、フェニトイン、レナリドミド、クロロキン、キニーネ、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、カプトプリル、コルチゾール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン、フェンクロフェナク、金塩、ペニシラミン、およびスルファサラジンからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
  16. 医薬品が、CD16+制御性T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、請求項1に記載の方法。
  17. 医薬品が、抗CD16抗体、同じエピトープへの結合について抗CD16抗体と交差競合する抗体、または抗CD16抗体と同じエピトープに結合する抗体である、請求項16に記載の方法。
  18. 医薬品が、3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体；同じエピトープへの結合について3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体と交差競合する抗体；または3G8抗体、B73.1抗体もしくはCB16抗体と同じエピトープに結合する抗体である、請求項17に記載の方法。
  19. 免疫療法がCMN-001である、請求項1に記載の方法。
  20. CMN-001が3週間ごとに約1回投与される、請求項19に記載の方法。
  21. 免疫療法のレジメンが、医薬品の用量レジメンの開始後にも継続される、請求項1に記載の方法。
  22. 腫瘍が腎細胞がんである、請求項1に記載の方法。
  23. 腫瘍が転移性腎細胞がんである、請求項22に記載の方法。
  24. 腫瘍が淡明細胞型である、請求項22に記載の方法。
  25. 患者が高リスクのヒト患者である、請求項23に記載の方法。
  26. 高リスク患者が、以下のリスク因子：
    (i) 診断から全身的治療処置の開始までの期間が1年未満であること、
    (ii) 低レベルのヘモグロビン、
    (iii) 補正カルシウムレベルの上昇、
    (iv) 患者のパフォーマンスステータスまたは身体機能の低下、
    (v) 好中球のレベルの上昇、および
    (vi) 血小板数の増加
    のうちの3つまたはそれ以上を示す、請求項25に記載の方法。
  27. 腫瘍が、乳がん、膵臓がん、星状細胞腫、多形神経膠芽腫、メラノーマ、リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
  28. 腫瘍抗原が患者に対して自己である、請求項1に記載の方法。
  29. 腫瘍を有する患者において、循環IgGレベルを低下させる、CD16+ T細胞のIgGを介した活性化を阻止する、ならびに／またはB細胞の濃度および／もしくは機能を低下させる方法であって、
    (a) 患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに
    (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、
    (i) 循環IgGレベルの低下、
    (ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、
    (iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、
    (iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、
    (v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに
    (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持
    のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階
    の連続段階を含む、前記方法。
  30. 腫瘍を有する患者において、CD8+ T細胞におけるプログラム細胞死タンパク質1 (PD1) 発現を調節する方法であって、
    (a) 患者に、腫瘍抗原をコードするRNAを負荷した樹状細胞を含む免疫療法の用量レジメンを投与する段階；ならびに
    (b) 段階 (a) の少なくとも1用量の免疫療法の投与後に、
    (i) 循環IgGレベルの低下、
    (ii) CD16+ T細胞のIgGを介した活性化の阻止、
    (iii) B細胞の濃度および／または機能の低下、
    (iv) CD38+ TGF-β+ B細胞の頻度の低下、
    (v) B細胞のTGF-β分泌の減少、ならびに
    (vi) CD25+CD28+ CD4および／またはCD8 T細胞の頻度の維持
    のうちの1つまたは複数を引き起こし得る医薬品の用量レジメンを投与する段階
    の連続段階を含む、前記方法。
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