MX2011003347A - Metodos para reducir celulas t, b-auxiliares para tratar enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes al administrar a un sujeto que tiene una alteración autoinmune una cantidad efectiva de una composición terapéutica que comprende un portador aceptable farmacéuticamente y por lo menos un inhibidor de IL-12, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-12 bloqueador o fragmento del mismo.

Description

METODOS PARA REDUCIR CELULAS T, B-AUXILIARES PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNES CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con el campo de modulación de respuestas inmune y más en particular, con composiciones y métodos para la diagnosis, prevención y tratamiento de enfermedades autoinmunes al reducir la actividad de células T B-auxiliares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes son descritos en relación con tratamientos contra respuestas autoinmunes.

Un número de métodos inmunoterapéuticos químicos y biológicos han sido desarrollados para tratar alteraciones autoinmunes. Comúnmente, los métodos inmunoterapéuticos han intentado tratar alteraciones autoinmune después que han comenzado a amortiguar toda la respuesta inmune utilizando por ejemplo agentes químicos tales como esteroides o anticuerpos celulares auto-inmunes. Por ejemplo, uno de tales métodos intenta tratar alteraciones autoinmunes al administrar anticuerpos que se enlazan a antígenos de célula B, por ejemplo antígeno de CD22, CD20, .CD19 y CD74 o HLA-DR. Sin embargo, los anticuerpos apuntan a todas las células B sin consideración a su funcionamiento normal y amortiguan la repuesta inmune completa, no solo la respuesta inmune objetivo.

Una de tales patentes es la patente estadounidense No. 7,074,403, expedida a Goldenberg, et al., para inmunoterapia de alteraciones autoinmunes utilizando anticuerpos que apuntan a células B. Esta patente enseña el uso de anticuerpos que se enlazan a un antígeno de célula B para proveer un medio efectivo para tratar alteraciones autoinmunes. Los anticuerpos y fragmentos que pueden estar conjugados o descubiertos, son usados solos o en terapias multimodales . Los anticuerpos pueden ser anticuerpos bisespecificos y pueden ser producidos recombinantemente como proteínas de fusión o como anticuerpos poliespecíficos híbridos.

La patente estadounidense No. 6,103,713, expedida a Ways, et al., enseña un tratamiento terapéutico para enfermedades autoinmunes al inhibir la activación y/o proliferación de células T y células B y para tratar alteraciones autoinmunes y/o manifestaciones de enfermedad utilizando el inhibidor de PKC isozima selectivo: (S)-3,4-[N, N' -1 , 1 ' - ( (2"-etoxi) -3 ' " (O) -4 ' (N, -dimetilamino) -butano) -bis- (3 , 3 ' -indolil-1 ) ] -1 (H) -pirrol-2 , 5-diona y sus sales aceptables farmacéuticamente .

Otro ejemplo es la solicitud de patente estadounidense No. 20070025990 presentada Dingivan por métodos para administrar/dosificar antagonistas de CD2 para la prevención y tratamiento de alteraciones autoinmune o alteraciones inflamatorias. La solicitud enseña composiciones para la prevención o tratamiento de una alteración autoinmune o una alteración inflamatoria en un sujeto con uno o más antagonistas de CD2 y métodos para prevenir o tratar una alteración autoinmune o una alteración inflamatoria en un sujeto al administrar una o más moléculas de enlace de CD2 a dichos sujetos. La presente invención provee dosis de moléculas de enlace de CD2 y métodos de administración que dan como resultado eficacia mejorada, en tanto que evitan o reducen los efectos secundarios adversos o indeseables asociados con la administración de un agente que induce el agotamiento de linfocitos de sangre periférica.

Todavía otra solicitud es la solicitud de patente estadounidense No. 20040022787, presentada por Cohén, et al., por métodos para tratar una alteración autoinmune utilizando una molécula de CTLA4 soluble y un DMARD o NSAID. Brevemente, se enseñan composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades del sistema inmune tal como enfermedad reumática, al administrar a un sujeto moléculas de CTLA4 solubles que bloquean las moléculas de B7 endógenas del enlace de sus ligandos, ya sea solas o en conjunción con otros agentes que incluyen fármacos anti-reumáticos modificadores de enfermedad (DMARD) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye composiciones y métodos para la regulación de respuestas inmune y más particularmente, con la modulación de actividad de células T B-auxiliar. Se ha encontrado que IL-12 es un regulador clave de proliferación, modulación y activación de célula B a células que segregan inmunoglobulina . Se demuestra en la presente que IL-12 regula una población clave de células T, células T B-auxiliares , al controlar el desarrollo y activación de este subconjunto de células T y su secreción de IL-21. Fisiológicamente se descubrió y es demostrado en la presente que en alteraciones autoinmunes que incluyen anticuerpos autoinmunes, tales como dermatomiositis juvenil (JDM) , artritis sistémica (SYS) y lupus eritematoso sistémico (SLE) , hay un incremento en la presencia de células T B-auxiliares en la sangre de estos pacientes con enfermedad autoinmune. Se demostró además que IL-12 es una molécula clave en la secreción de IL-21 por células T de pacientes con enfermedades autoinmunes .

Esta invención incluye composiciones y métodos para reducir los números o actividad de célula T B-auxiliar para tratar enfermedades autoinmunes. Uno de tales métodos incluye el bloqueo de la actividad de IL-12 para inhibir el desarrollo de células T B-auxiliares y su secreción de IL-21. Otro método reduce los números de células T B-auxiliares con anticuerpos monoclonales , incluyendo CXCR5. Todavía otro método incluye reducir la secreción de IL-21 de células T B-auxiliares mediante el bloqueo de ICOS .

En una modalidad, la presente, invención incluye composiciones y métodos para el tratamiento de una alteración autoinmune al administrar un sujeto que tiene una alteración autoinmune una cantidad efectiva de una composición terapéutica que comprende un inhibidor de IL-12, en una cantidad suficiente para disminuir la célula T B-auxiliar, reduciendo mediante esto, por ejemplo la secreción de anticuerpo auto-inmune por células B. En un aspecto, el inhibidor de IL-12 comprende por lo menos un anticuerpo anti-IL-12 de bloqueo o fragmento del mismo. En otro aspecto, el método comprende además un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, el inhibidor de IL-12 comprende un anticuerpo inhibidor de IL-12 administrado en una dosificación de 1 a 1,000 mg por dosis. En un aspecto, el inhibidor de IL-12 comprende un anticuerpo inhibidor de IL-12 y el sujeto recibe el anticuerpo en dosificaciones repetidas. En todavía otro aspecto, el inhibidor de IL-12 comprende un anticuerpo anti-IL-12 seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo primate subhumano, anticuerpo monoclonal murino, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo humano. En otro aspecto, el inhibidor de IL-12 comprende un ARNi, siAR u otro inhibidor de ácido nucleico de IL-12.

Ejemplos no limitantes de enfermedad autoinmune que puede ser tratada con la presente invención incluyen aquellas en las cuales, por ejemplo, los anticuerpos autoinmunes disparan una respuesta autoinmune, por ejemplo púrpura trombocitopénica idiopática aguda, púrpura trombocitopénica idiopática crónica, dermatomiositis , corea de Sydenham, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, lupus nefritis, fiebre reumática, síndromes poliglandulares , penfigoide buloso, diabetes mellitus, púrpura de Henoch-Schonlein, nefritis post-estreptococal, eritema nodoso, arteritis de Takayasu, enfermedad de Addison, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, sarcoidosis, colitis ulcerativa, eritema multiforme, neuropatía de IgA, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Goodpasture, tromboangitis ubiterans, síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, tiroiditis de Hashimoto, tirotoxicosis, escleroderma, hepatitis activa crónica, polimiositis /dermatomiositis, policondritis , pénfigo vulgaris, granulomatosis de Wegener, neuropatía membranosa, esclerosis lateral amiotrófica, tabes dorsalis, arteritis de célula gigante/polimialgia, anemia perniciosa, glomerulonefritis progresiva rápidamente y alveolitis fibrosante. En todavía otro aspecto de la presente invención, el inhibidor de IL-12 puede ser provisto con un segundo terapéutico dirigido contra células ,. células B, células de plasma o macrófagos o citoquinas inflamatorias.

Todavía otra modalidad de la presente invención es un método para mejorar, una respuesta de célula B antígeno-específica contra un antígeno que comprende: aislar células T CD4+ naturales y madurar las células T CD4+ naturales en presencia de células dendríticas antígeno-cargadas con una cantidad efectiva de IL-12 suficiente para desarrollar y activar células T B-auxiliares , en donde las células T B-auxiliares IL-12-tratadas segregan cantidades nanomolares de IL-21. En un aspecto, las células T CD4+ naturales son aisladas de células mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa. En otro aspecto, las células T CD4+ naturales son obtenidas de células mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa utilizando anticuerpos contra CD8 y uno o más anticuerpos contra CDllb, CDllc, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56 y HLA-DR. En otro aspecto, el antígeno es seleccionado de un virus, una bacteria, un hongo, un cáncer o una toxina .

Otra modalidad de la presente invención incluye composiciones y métodos de modulación de enfermedades autoinmunes que comprenden: identificar un sujeto sospechoso de necesitar terapia por una alteración autoinmune provocada por la secreción de anticuerpos autoinmunes para célula B y tratar el paciente con una cantidad de un inhibidor anti-lL-12 suficiente para inhibir células T B-auxiliares CD4+. En un aspecto, el inhibidor de anti-IL-12 comprende un mAB anti-IL-12p40 o un mAB anti-IL-12p70 , un mAB anti-IL-12p70 , receptores anti-IL-12, IL-12 inactivo soluble y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, el inhibidor anti-IL-12 comprende un antagonista de receptor de IL-12. En todavía otro aspecto, las células T B-auxiliares CD4+ son seleccionadas mediante selección negativa. En un aspecto, las células T B-auxiliares CD4+ son obtenidas . de células mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa utilizando anticuerpos contra CD8 y uno o más anticuerpos contra CDllb, CDllc, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45R0, CD56 y HLA-DR. En otro aspecto, las células T B-auxiliares CD4+ son activadas en presencia de células dendríticas activadas. En un aspecto, la enfermedad autoinmune es seleccionada de lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis , dermatomiositis juvenil, artritis, artritis sistémica y artritis psoriática. En un aspecto, el inhibidor de IL-12 es provisto a un sujeto sospechoso de susceptibilidad de una enfermedad autoinmune antes del desarrollo de anticuerpos autoinmunes .

Otra modalidad de la presente invención es una célula T célula B-auxiliar fabrica mediante el método que comprende: aislar células T CD4+ naturales y madurar las células T CD4 naturales en presencia de células dendríticas activadas que expresan un antígeno positivo en presencia de IL-12, en donde las células T B-auxiliares CD4+ maduradas liberan cantidades nanomolares de IL-21 en respuesta al antígeno.

Otra modalidad de la presente invención incluye composiciones y métodos de regulación de proliferación, maduración y activación de célula B a células que segregan inmunoglobulina al exponer las células T B-auxiliares que segregan IL-21 a una composición que comprende un inhibidor de IL-12. En un aspecto, el inhibidor de IL-12 reduce la secreción tanto de IL-21 como IFN-? por células T B-auxiliares CD4+. En otra modalidad, la presente invención incluye un método para enriquecer células T B-auxiliares que comprende incubar células T CD4 naturales con una cantidad de IL-12 suficiente para disparar la liberación de cantidades nanomolares de IL-21.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para un entendimiento más completo de los elementos y ventajas de la presente invención, se hace referencia ahora a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las cuales : La Figura 1 muestra que IL-12 induce a las células T CD4+ naturales á segregar IL-21.

La Figura 2 muestra que células T CD4+ naturales cebadas con IL-12 inducen a las células B a producir inmunoglobulina.

La Figura 3 muestra que células T CD4+ cebadas con IL-12 ayudan a las células B por medio de IL-21 e ICOS.

La Figura 4 muestra que las DC activadas inducen a células T CD4+ que producen IL-21 por medio de IL-12.

La Figura 5 muestra que el bloqueo de IL-12 inhibe el desarrollo de células T aptas de auxiliar a células B.

La Figura 6 muestra que IL-12 controla la secreción de IL-21 por células T CD4+ de memoria.

La Figura 7 muestra que células T CD4+ y células B se acumulan predominantemente en sitios inflamatorios en DM.

La Figura 8 muestra que las frecuencias incrementadas de células T B-auxiliares funcionales en la sangre de pacientes con enfermedad autoinmune.

La Figura 9 muestra la secreción de IL-21 incrementada en repuesta a SEB por células mononucleares de sangre periférica obtenidas de pacientes JDM activos .

La Figura 10 muestra que la secreción de IL-21 por PBMC de pacientes con JDM es dependiente de IL-12.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En tanto que la elaboración y uso de varias modalidades de la presente invención son discutidas en detalle a continuación, se debe apreciar que la presente invención provee muchos conceptos inventivos aplicables que pueden ser implementados' en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas discutidas en la presente son solamente ilustrativas de maneras específicas para fabricar y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención.

Para facilitar el entendimiento de esta invención, un número de términos son definidos a continuación. Los términos definidos en la presente tienen significados como se entienden comúnmente por una persona de habilidad ordinaria en las áreas relevantes de la presente invención. Los términos tales como "un", "uno" y "el" no pretenden referirse a solamente una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual un ejemplo específico puede ser usado por ilustración. La terminología en la presente es usada para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como se resume en las reivindicaciones.

En ciertas modalidades, la presente invención comprende la etapa de identificar que un sujeto está en necesidad del tratamiento por una alteración autoinmune regulada por célula B. La identificación puede ser en el juicio de un sujeto o un profesional de la salud o puede ser subjetiva (por ejemplo opinión) objetiva (por ejemplo, mesurable por una prueba o un método de diagnóstico) .

Como se usan en la presente, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la reducción o mejora del avance, severidad y/o duración de una alteración autoinmune regulada por célula B o la mejora de uno o más síntomas (preferiblemente, uno o más síntomas discernibles ) de una alteración autoinmune regulada por célula B resultante de- la administración de una o más terapias de la presente invención que apuntan a respuestas autoinmunes moderadas por células T B-auxiliares que segregan grandes cantidades de IL-21 en respuesta a la activación de las células T por células que presentan antígeno antigeno-cargadas (por ejemplo, células dendríticas) en presencia de IL-12.

Como se usan en la presente, los términos "prevenir", "prevención" y "que impide" se refieren a la reducción en el riesgo de adquirir o desarrollar una alteración autoinmune regulada por célula B dada o la reducción o inhibición de la recurrencia, inicio o desarrollo de uno o más síntomas de una alteración autoinmune regulada por célula B dada. En una modalidad, un inhibidor de IL-12 es administrado como una medida preventiva a un paciente (por ejemplo, un humano), sospechado de tener una predisposición genética a cualquiera de las alteraciones descritas en la presente.

Como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un inhibidor de IL-12 que es suficiente para reducir o mejorar la severidad, duración, avance o inicio de una alteración autoinmune regulada por célula B, impedir el avance de una alteración autoinmune regulada por célula B, provocar la regresión de una alteración autoinmune regulada por célula B, impedir la recurrencia, desarrollo, inicio o avance de un síntoma asociado con una alteración autoinmune regulada por célula B o mejorar o realizar el (los) efecto (s) profiláctico (s) o terapéutico (s) de otra terapia. En una modalidad, un tratamiento de acuerdo con la invención provee una reducción en o prevención de por lo menos un síntoma o manifestación de alteración autoinmune regulada por célula B, tal como es determinada in vivo o in vitro de por lo menos aproximadamente 10%, o aun 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%.

La presente invención reconoce la interrelación de dosificaciones para animales y humanos (basada en miligramos por metro cuadrado de superficie corporal) es descrita en Freireich et al., (1966) Cáncer Chemother Rep 50: 219. El área superficial corporal puede ser determinada aproximadamente de la altura y peso del paciente. Véase, por ejemplo Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals , Ardley, N.Y., 1970, 537. Una cantidad efectiva de un compuesto de esta invención puede variar de aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg, más preferiblemente 0.01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, más preferiblemente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o cualquier intervalo en el cual el extremo inferior del intervalo es cualquier cantidad entre 0.001 mg/kg y 900 mg/kg y el extremo superior del intervalo es cualquier cantidad entre 0.1 mg/kg y 1000 mg/kg (por ejemplo 0.005 mg/kg y 200 mg/kg, 0.5 mg/kg y 20 mg/kg). Las dosis efectivas también variarán, tal como es reconocido por aquellos experimentados en el arte, dependiendo de las enfermedades tratadas , ruta de administración, uso de excipientes y la posibilidad de co-uso con otros tratamientos terapéuticos tal como el uso de otros agentes .

En operación, las composiciones y métodos de la presente invención pueden incluir un inhibidor anti-IL-12 que solo o como componente de una composición farmacéutica, puede ser administrado intravenosa, oral, parenteralmente, mediante atomización de inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginalmente o vía un depósito implantado. Otros ejemplos no limitantes de administración de los inhibidores de IL-12 y métodos de la presente invención incluyen técnicasde inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. En ciertas modalidades, las células T B-auxiliares pueden ser aisladas, tratadas in vitro y luego devueltas al sujeto para tratamiento .

Por ejemplo, la presente . invención puede ser preparada y administrada como una composición inyectable estéril, por ejemplo suspensión acuosa o oleaginosa inyectable estéril, puede ser formulada de acuerdo con técnicas conocidas en el arte utilizando agentes de dispersión o humectación apropiados (tal como, por ejemplo Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede también ser una suspensión o solución inyectable estéril en un diluyente o solvente aceptable parenteralmente no tóxico, por ejemplo como una solución en 1, 3-butandiol. De entre los vehículos y solventes aceptables que pueden ser empleados están manitol, agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, aceites fijos estériles son empleados convencionalmente como solvente o medio de suspensión (por ejemplo, mono- o diglicéridos sintéticos) . Ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites aceptables farmacéuticamente naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en suspensiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones de aceite pueden también contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga o carboximetil celulosa o agentes de dispersión similares . Otros surfactantes usados comúnmente tales como Tweens o Spans u otros agentes emulsificantes similares o mejoradores de la biodisponibilidad que son usadas comúnmente en la manufactura de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras formas de dosificación aceptables farmacéuticamente pueden también ser usados para los propósitos de formulación.

Otro ejemplo de la presente invención es una composición para administración oral que puede ser cualquier forma de dosificación aceptable oralmente en las que se incluyen, pero no limitadas a cápsulas, tabletas, emulsiones y suspensiones acuosas, dispersiones y soluciones. En el caso de tabletas para uso oral, los portadores que son usados comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Agentes lubricantes, tales como esterato de magnesio, son también agregados comúnmente. Para administración oral en la forma de cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las suspensiones o emulsiones acuosas son administradas oralmente, el ingrediente activo puede ser suspendido o disuelto en una fase aceitosa combinada con agentes emulsificantes o agentes de suspensión. Si se desea, Ciertos agentes endulzantes, saborizantes o colorantes pueden ser agregados. Un aerosol nasal o composición de inhalación pueden ser preparados de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte de formulación farmacéutica y pueden ser preparados como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservadores apropiados, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o de dispersión conocidos en el arte. Un compuesto de esta invención puede también ser administrado en forma de supositorios para administración rectal.

Como se usa en la presente, el término "portador aceptable farmacéuticamente" se refiere a aquellos agentes (activos o inactivos) en los cuales el inhibidor de IL-12 puede ser incorporado que es en general no perjudicial al sujeto a ser tratado. Por ejemplo, agentes solubilizantes tales como ciclodextrinas , que forman complejos específicos más solubles con los compuestos de esta invención o uno o más agentes solubilizantes , pueden ser utilizados como excipientes farmacéuticos para la administración de los compuestos de la invención. Ejemplos de otros portadores incluyen dióxido de silicio coloidal, esterato de magnesio, celulosa, lauril sulfato de sodio y tintes.

Como se usan en la presente, los términos "animal", "sujeto", "mamífero" y "paciente" incluyen pero no están limitados a, un humano o un animal tal como una vaca, mono, caballo, oveja, puerco, pollo, pavo, codorniz, gato, perro, ratón, rata, conejo y hámster.

Los métodos para el tratamiento o prevención de una alteración autoinmune regulada por célula B en un paciente en necesidad del mismo puede comprender además administrar al paciente que es administrado un inhibidor de IL-12 en una cantidad efectiva. El inhibidor de IL-12 puede también ser administrado con otros agentes terapéuticos tales como aquellos usados convencionalmente para prevenir o tratar una alteración autoinmune regulada por célula B o síntomas de la misma. En tal tratamiento de terapia de combinación, tanto el inhibidor de IL-12 como el (los) otro(s) agente (s) de fármaco pueden ser administrados a mamíferos (por ejemplo, humanos, macho o hembra) mediante métodos convencionales. Los agentes pueden ser administrados en una sola forma de dosificación o en formas de dosificación separadas. Cantidades efectivas de los otros agentes terapéuticos son bien conocidas para aquellos experimentados en el arte. A la luz de la presente revelación, el técnico experimentado puede determinar el intervalo de cantidad efectiva óptima del otro agente terapéutico. En ciertas modalidades de la invención, la cantidad efectiva del inhibidor de IL-12 de esta invención puede ser reducida en donde un segundo agente terapéutico potencia o mejora el efecto del inhibidor de IL-12.

Ejemplos de agentes para terapia de combinación pueden incluir un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un anticuerpo de TNF o fragmento, un receptor de TNF soluble o fragmento, proteínas de fusión de los mismos o un antagonista de TNF de molécula pequeña) , un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, oro tiomalato de sodio, sulfato de hidroxicloroquino, liflunomida, sulfasalzina) , un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal (NSAID) , un analgésico, .un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular , un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglicósido, un antifungal, un antiparásito, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una fluorquinolona, un macrolato, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano) , un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroide, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiárreico, un antitusivo, un antiemético, un antiúlcera, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa) , un filgrastin (por ejemplo G-CSF, Neupogen) , un un sargramostin (GM-CSF, leucina) , una inmunización, una inmunoglubulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab) , una hormona del crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona, un modulador de receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico , un agente alquilante, un antimetabolito , un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresor, un agente antimaniaco, un antipsicótico, un anxiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donetezil, tacrina, una medicación de asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo, domasa alfa (Pulmocyma) , una citoquina o un antagonista de citoquina. Dosificaciones apropiadas son bien conocidas en el arte. éase, por ejemplo Wells et al., eds . , Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascón Publishing, Loma Linda, Calif. (2000), porciones relevantes incorporadas en la presente por referencia.

Ejemplos no limitantes de enfermedades autoinmunes que pueden ser diagnosticadas, prevenidas o tratadas utilizando la presente invención incluyen aquellas enfermedades autoinmunes que pueden incluir, por lo menos en parte o aun predominantemente respuestas de inmunoglobulina contra auto-antígenos, por ejemplo enfermedad autoinmune tal como lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, artritis reumatoide, diabetes mellitus de inicio juvenil, granulomatosis de Wegener, enfermedad de intestino inflamatorio, polimiositis, dermatomiositis , falla endocrina múltiple, síndrome de Sc midt, uveítis autoinmune, enfermedad de Addison, adrenalitis, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de tiroide autoinmune, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, arterosclerosis , demencia presenil, enfermedades desmielinizantes, esclerosis múltiple, lupus eritematoso cutáneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, miastenia gravis, trombocitopenia autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, pénfigo vulgaris, pénfigo, dermatitis herpetiformis , alopecia arcata, pénfigoide, escleroderma, esclerosis sistémica progresía, síndrome de CREST (calcinosis, fenómenos de Raynaud, dismovilidad esofagal, esclerodactilia y telangiectasia) , diabetes mellitus de inicio de adulto (diabetes tipo II), infertilidad autoinmune de macho y hembra,, espondilitis anquilosante, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad de tejido conectivo mezclado, poliarteritis nedosa, vasculitis necrotizante sistémica, artritis reumatoide de inicio juvenil, glomerulonefritis , dermatitis atópica, rinitis atópica, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumática, asma, aborto recurrente, síndrome de anti-fosfolípido, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Cushing, hepatitis activa crónica autoinmune, pulmón de bird-fancier, enfermedad alérgica, encefalomielitis alérgica, necrolisis epidérmica tóxica, alopecia, síndrome de Alport, alveolitis, alveolitis alérgica, alveolitis fibrosante, enfermedad de pulmón intersticial, eritema nodosum, pioderma gangrenosum, reacción de transfusión, lepra, malaria, leismaniasis , tripanosomiasis, arteritis de Tacayasu, polimialgia reumática, arteritis temporal, esquistosomiasis, arteritis de célula gigante, ascariasis, aspergilosis , síndrome de Sampter, eczema, granulomatosis' linfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Caplan, enfermedad de awasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocardial , endoftalmitis , eritema elevatum e diutinium, psoriasis, eritoblastosis fetalis, faciitis eusinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis, ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, ciclitis de Fuen, nefropatía de IgA, púrpura de Henoch-Schonlei , glomerulonefritis, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de transplante, infección de virus de inmunodeficiencia humana, infección de ecovirus, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, enfermedad de virus de rubéola, síndromes postvacunación, infección de rubéola congenital, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin, carcinoma de célula renal, mieloma múltiple, síndrome de Eaton-Lambert , policondritis de recaída, melanoma maligno, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, infección de virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, y insuficiencia gonadal autoinmune.

Los presentes inventores han descubierto que IL-12 es la molécula clave que regula la respuesta de anticuerpo en el humano. También se encontró que la frecuencia de células T B-auxiliares funcionales es incrementada en enfermedades autoinmunes, incluyendo JD , SYS y SLE. El apuntamiento de células T B-auxiliares nunca ha sido reivindicado como' procedimiento terapéutico en enfermedades autoinmunes . Utilizando la presente invención, es posible ahora: 1) bloquear IL-12 para inhibir el desarrollo de células T B-auxiliares, 2) bloquear IL-12 para inhibir la secreción de IL-21 por células T B-auxiliares, y 3) apuntar células T B-auxiliares para reducir su número en el cuerpo, por ejemplo al utilizar anticuerpos monoclonales contra CXCR5 o ICOS.

Por ejemplo, se ha encontrado que células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de pacientes con enfermedad autoinmune que incluyen dermatomiositis y lupus eritematoso sistémico fueron cultivadas con el superantígeno enterotoxina B (SEB) en presencia o ausencia del anticuerpo IL-12 neutralizante (mAB anti-IL-12p70) y la secreción de IL-21 fue analizada al día 2 del cultivo. La adición del anticuerpo de bloqueo IL-12 inhibió significativamente la secreción de IL-21 de células T CD4+ SEB-reactivas. Por ejemplo, el bloqueo de IL-12 disminuyó la secreción de IL-21 de- células T CD4+, que juegan un papel principal en el desarrollo de respuesta de anticuerpo.

El aislamiento de células T CD4+ naturales . PBMC fueron purificadas mediante centrifugación de gradiente de Ficoll de muestras de sangre de aféresis obtenidas de voluntarios saludables adultos y mantenidas congeladas en DMSO al 10% en nitrógeno líquido. Células T CD4+ fueron enriquecidas primero enriquecidas mediante selección negativa: las PBMC fueron incubadas con mAB · DE8 (HIT8a, eBiosciences ) , CDllb (LM1/2, ATCC), CDllc (B-ly6, BD Biosciences) , CD14 (M5E2, ATCC), CD15 (W6D3, BD Biosciences), CD16 (3G8, Beckman Coulter), CD19 (J4.119, Beckman Coulter) , CD45RO (UCHLl, BD Biosciences), CD56 (C218, Beckman Coulter) and HLA-DR (B8.12.2, Beckman Coulter) purificados por 30 minutos y luego incubadas con IgG de ratón de Dynabeads Pan (Dynal) a 4°C por 30 minutos. Las células enlazadas a anticuerpo fueron removidas con imán (Dynal) . Las células T CD4+ naturales fueron purificadas adicionalmente mediante clasificación con FACSAria (BD Biosciences) como células CD8- CD56- HLA-DR- CD45RA+ CD4+ después de teñido con CD8 PE (RPA-T8 , eBiosciences), CD56 PE (B159, BD Biosciences) , HLA-DR PE (G46-6, BD Biosciences ) , CD45RA Tricolor (MEM-56, Caltag) y CD4.+ Pacific Blue (S3.5, Caltag) mAbs . La pureza celular fue >99%.

Aislamiento de células B. Las células B fueron primero enriquecidas de PBMC de aféresis mediante selección positiva utilizando microperlas de CD19 y columna de LS (Miltenyi Biotec) . Luego, células B naturales y de memoria fueron clasificadas con FACSAria como células IgD+ CD27" CD3" CDllc" CD14" IgD" CD27+ CD3" CDllc" CD14", respectivamente después de teñido con mAb IgD FITC (IA6-2, BD) , CD27 PE (L128, BD Biosciences), CD3 APC (SK7, BD Biosciences), CDllc APC (S-HCL-3, BD Biosciences), y CD14 APC (TÜK4, Caltag). La pureza celular fue >98%.

Cocultivo de DC y células T CD4+ naturales. Los monocitos fueron aislados de PBMC mediante selección negativa utilizando el kit II de aislamiento de monocito (Miltenyi Biotec) . Las DC fueron generadas al cultivar monocitos con 50 ng/ml IL-4 (R&D) y 100 ng/ml GM-CSF (leucina) en medio complete de RPMI 1640 (GIBCO) que contienen 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/streptomicina, 2-mercaptoethanol 50 µ?, 1% de piruvato de sodio, 1% de aminoácidos no esenciales (todos de Sigma), HEPES 25 mM p7.2 y FBS desactivado térmicamente al 10% (Hiclon) en placas de 6 cavidades (2 x 106 células/3 mi/cavidad) . Las citoquinas fueron agredas cada dos días. Al día 6, las células dendríticas fueron estimuladas con células L CD40L-transfectadas y radiadas, PGN (5 ug/ml, invivoGen) , LPS (50 ng/ml, Sigma-Aldrich) , flagelina (20 ng/ml, InvivoGen), CL097 (compuesto de imidazoquinolina, 5 ug/ml, InvivoGen), Escherichia coli asesinado térmicamente (108/ml, Invitrogen) , Staphylococcus aureus asesinado térmicamente (108/ml InvivoGen) o Porphyromonas gingivalis asesinado térmicamente (108/ml - InvivoGen) . Después de 6 horas de estimulación, las DC expuestas a TLR-ligandos o bacterias asesinadas térmicamente fueron cosechadas y lavadas cuidadosamente. Las DC estimuladas con células LCD40L-transfectadas fueron recuperadas como DC CDllc+CD40L" mediante FACS después de teñido con mAb CDllc APC (S-HCL-3, BD Biosciences) y CD40L PE (TROPl, BD Biosciences) . Las DC activadas (1.3 x 103 células /cavidad) fueron cultivadas por 7 días con células T CD4+ naturales alogénicas (4 x 104 células/cavidad) en placas de fondo redondo de 96 cavidades en medio completo de RPMI . En algunos experimentos, 10 ug/ml de anticuerpos monoclonales de bloqueo anti-IL-12p40 (C8.6, eBiosciences ) o anti-IL-12p70 (M122, Pierce) fueron agregados al cultivo. Para la determinación de secreción de IL-12, las DC cosechadas a 6 horas de estimulación fueron cultivadas por otras 24 horas en placas de 96 cavidades fondo plano (2 x 105 células/cavidad) , y la IL-12 secretada fue medida con el kit de Elisa de IL-12p70 (eBiosciences).

Estimulación de células T CD4+ naturales vía CD3/CD28. Células T CD4+ naturales (1 x 105 células/cavidad) fueron estimuladas con mAb CD3 placa-enlazado (5 µ9/??1, 0K 3 , ATCC) y mAb CD28 soluble (1 g ml. CD28.2, BD Biosciences) en placas de 96 cavidades de fondo plano en medio de RPMI completo en presencia de citocinas recombinantes humanas: IL-?ß (R&D) , IL-6 (R&D) , IL-10 (R&D) , IL-12 (R&D) , IL-18 (R&D) , IL-23 (eBiosciences), IL-27 (R&D), TNF (R&D), (10 ng/ml cada uno o a la concentración indicada) o IFN-a (IFN-a2b. 500 iu/ml, Schering) . Las células T CD4+ activadas fueron analizadas en el día 7. En algunos experimentos, las células T CD4+ naturales fueron marcadas con succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína 1 µ? (Molecular Probes) para rastrear la proliferación de células T.

Teñido de citocina intracelular . Células T CD4+ naturales estimuladas por 7 días fueron reestimuladas con miristato acetato de forbol (25 ng/ml, Sigma-Aldrich) e ionomicina (1 µg/ml, Sigma-Aldrich) por 7 horas en presencia de GolgiPlug (BD Biosciences) por las últimas 4 horas. Luego las células fueron fijadas y permeabilizadas utilizando el kit de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) y las citocinas expresadas en el citoplasma fueron analizadas con anticuerpos monoclonales IL-21 PE o APC (3A3-N2, eBiosciences), IL-17A PE (64DEC17, eBiosciences), y IFNy APC (B27, BD Biosciences) mAbs. Las células fueron adquiridas en FACS Calibur o FACS CantoII después de fijación con paraformaldehído al 1%. La expresión de citocina en células T CD4+ activadas (células con alto contenido de FSC) fueron analizadas con los elementos de programación FlowJo (TreeStar) .

Secreción de IL-21 de células T CD4+ activadas. Células T CD4+ activadas fueron clasificadas en el día 7 como células de alto contenido de FSC (estimulación de CD3/28) , o células con bajo contenido de CDllc y alto contenido de FSC (co-cultivo con células dendríticas) después de teñido con CDllc APC (S-HCL-3, BD Biosciences) para remover las CD CDllc+ residuales. Las células T CD4+ clasificadas fueron reestimuladas con anticuerpo monoclonal CD3 placa-enlazado (5 µg /mi) y anticuerpo monoclonal CD28 soluble (1 µg ml) en placas de 96 cavidades de fondo plano (5 x 104 células/cavidad) en medio Yssel (Gemini) complementado con FBS al 10%. Después de 24 horas, lo niveles de IL-21 producidos fueron determinado utilizando el análisis de Luminex.

Desarrollo de análisis a base de perla de IL-21 humano utilizando tecnología Luminex. Se usó PCR para insertar una secuencia enlazada mediante TGCTGGCTA y TGA y el péptido de señal del miembro 1 de la familia de activación linfocítica de señalización de ratón de codificación (gb | EDL3905 .1 | ) residuos 1-24, GL, gb| ABN54273.1I residuos de proteína de afianzamiento de celulosoma 1050-1219, LEAD, y residuos 30-162 de interleucina 21 humana gb |AAG29348.1 | al intervalo Hind III -Not I del vector de expresión mamífero pCDM (Seed, 1987) . Este vector dirigió la secreción de una proteína de fusión de cohesina-IL-21. Un vector que dirige la secreción de IL-21 humano natural fue diseñado al insertar los residuos ref |NM_021803.11 47-535 precedidos por CACC al intervalo Nhe I - Not I de plRES2-DsRed2 (Clontech) . Las proteínas secretadas fueron producidas utilizando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante en base a 1 mg de ADN de plásmido total con 1.3 mi de reactivo de 293 Fectina/litro de transíección. Las células transíectadas fueron cultivadas por 3 días, el sobrenadante de cultivo fue cosechado y un medio de 293 Freestyle™ nuevo (Invitrogen) con penicilina/estreptomicina al 0.5% (Biosource) agregado con incubación continua por 2 días. El sobrenadante de cultivo (1 litro) fue cargado sobre una columna de Q Sepharosa de 20 mi (GE Healthcare) lavada con PBS y luego eluida con PBS + NaCl 1M pH 7.4. La fracción eluída se hizo pasar sobre una columna de anticuerpo monoclonal de anti-cohesina de 1 mi integrado sobre pedido, lavado con PBS y eluido con glicina 0.1 , pH 2.7, y luego dializada contra DPBS. La protein fue analizada mediante análisis de gel de SDS-PAGE y la concentración estuvo basada en el coeficiente de extinción teórico a 280 nm.

Anticuerpos monoclonales de ratón contra IL-21 humanos fueron generados mediante una estrategia de inmunización repetitiva rápida. Brevemente, ratones BALB/c de seis semanas de edad fueron inmunizados mediante inyección en la pata con 10 µg de proteína de fusión de cohesina-IL-21 y adyuvante de Ribi o CpG (1017 ISS, Dynavax) , 7-3 veces en un curso de 30-40 días. En la observación de títulos de suero realzados, un refuerzo de 10 µg fue dado tres a cuatro días antes de la cosecha de nodos linfáticos de drenado inguinal y popliteal en cuanto a la fusión somática PEG-inducida con líneas de célula de mieloma P3x63, Ag8.653 (ATCC CRL-1580) y/o SP2/0-Ag 14, que habían sido adaptadas a tolerancia a suero más bajo. Los sobrenadantes de hibridoma a una dilución de 1:25 fueron seleccionados mediante análisis de ELISA directo con placas recubiertas a 0.5 µg/ml con una proteína de fusión de cohesina' testigo o a 0.2 µg/ml de cohesina-IL-21. Los sobrenadantes fueron también seleccionados en un formato de ELISA de captura utilizando placas recubiertas con IgG antiratón de cabra para afianzar los anticuerpos monoclonales y detección de IL-21 biotinilada a 0.0625 ug/ml seguido por Neutravidina-HRP. Los hibridomas que producen los anticuerpos más potentes fueron clonados con una sola célula y escalados para la producción del anticuerpo puro. Lo mAb fueron probados en un formato de ELISA de tablero de ajedrez para establecer pares que podrían detectar IL-21. Los anticuerpos monoclonales fueron enlazados a placas a 2 g/ml y luego incubados con IL-21 a 2 ng/ml y 20 pg/ml, luego con anticuerpos monoclonales biotinilados a 100 ng/ml seguido por detección con Neutravidina-HRP. Los anticuerpos monoclonales que se aparearon exitosamente fueron seleccionados adicionalmente en este análisis de ELISA mediante titulación con IL-21 de 100 ng/ml a 45 pg/ml y detección con 100 ng/ml del socio de anticuerpo monoclonal biotinilado . Aquellos anticuerpos que f eron más sensibles en el análisis de ELISA fueron conjugados a perlas (protocolo de Luminex Corporation para el acoplamiento de carbodiimida de dos etapas de proteína a microesferas carboxiladas , enero de 2006) e incubados con una serie de titulación de IL-21 humano recombinante de 4000 pg/ml a 1 pg/ml, también como diluciones de sobrenadante de células T CD4+ estimuladas con ionomicina y PMA, que se espera que contengan IL-21 humana natural. Los anticuerpos monoclonales de detección fueron biotinilados y usados a 0.5 pg/ml. La IL-21 detectada del par de mAb seleccionados secretada de células 293F transfectadas con el vector de expresión de IL-21. Cohesina-IL-21 , que fue significativamente más potente que IL-21 recombinante de dos fuentes comerciales, fue usada como el estándar .

El análisis de Luminex final fue sensible a 1 pg/ml de hIL-21'en un intervalo a por lo menos 4000 pg/ml. Lo pares de IL-21 fueron probados en los estándares de multiplex Upstate Beadlyte Human 26. No. hubo ninguna reactividad cruzada con ninguno de los analitos. El par de IL-21 podría también ser multiplexado con el plex 22 humano de Upstate. Las conjugaciones perla de Luminex y condiciones de análisis generales son detallada por Giavedoni, et al. (Giavedoni, 2005) . Perlas SeroMAP (región 26) fueron usadas con acoplamiento óptimo de 1 x 107 perlas a 5 pg de anticuerpo monoclonal en 500 µ? de MES 50 mM, pH 5.0. La biotinilación de el anticuerpo monoclonal detector se hizo a NHS-LC biotina 25X (Pierce) y usado a 0.5 ug/ml en el análisis. La estreptavidina R-Ficoeritrina PJ31s de Phycolink de Prozyme a 2 pg/ml fue usado como el reportero .

Co-cultivo de células T y B. Células T CD4+ activadas fueron clasificadas como se describe anteriormente, y co-cultivadas con células B de memoria autólogas (4 x 104 células /cavidad cada una) en placas de fondo redondo de 96 cavidades en medio Yssel/FBS al 10% en presencia de SEB endotoxina-reducida (0.25 ng/ml; Toxin technology, Inc.) . En algunos experimentos, el anticuerpo monoclonal anti-IL-2 (PAB956, BIIR), anticuerpo monoclonal anti-IL-4 (MP4-25D2, BD) , anticuerpo monoclonal anti-IL-10 (PAB548, BIIR), anticuerpo m anti-IFN-? (B27, BD Biosciences) , ICOS-L-mlgFc (Ancell), IgGlFc o IL-21R/Fc (ambos de R&D Systems) fueron agregados al cultivo. Las Ig (IgM, IgG e IgA) producidas en los cultivos fueron analizadas mediante ELISA al día 6 ó 14.

ELISA de Ig. Para la medición de Ig, el sobrenadante de cultivo fue incubado por 2 horas a temperatura ambiente en placas de microtítulo de 96 cavidades (Nunc) recubiertas con 5 µg/ml de anticuerpos de IgM anti-humano de cabra, IgG, IgA (todos de SouthernBiotech, Inc.). Después de lavado, las placas fueron incubadas a temperatura ambiente por 1 hora con anticuerpos IgM, IgG o IgA anti-humanos de cabra fosfatasa alcalina-conjugados (a una dilución final de 1/2000, 1/2500 ó 1/2500, respectivamente, todos de SouthernBiotech, Inc.). Luego, las placas fueron incubadas con fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) después de lavado extenso. La reacción fue detenida con NaOH 3N y la densidad óptica fue leída mediante el lector de placas Spectra ax (Molecular Devices) .

Cultivos de PBMC con SEB. PBMC nuevas purificadas (2.5 x 105 células/cavidad) fueron cultivadas con SEB (0.1 µg/ml) en placas de 96 cavidades por 48 horas en presencia o ausencia de anticuerpos anti-IL-12p40 o IL-I2p70, y las citocinas secretadas fueron medidas mediante Luminex.

Análisis de Fenotipo de Célula CD4+. Para analizar subpoblaciones de Célula T CXCR5+, muestras de sangre entera nuevas obtenidas de pacientes con enfermedad autoinmune y sujetos saludables coincidentes con la edad fueron teñidas con anticuerpos monoclonales anti-CXCR5-Alexa 488, CCR6-PE, CD45RA-ECD, CXCR3-PC5, CCR4-PC7, ICOS-APC, CD3-AF700, CD8-APC H7 , CD45RA Pacific Blue, y CD45 Pacific Orange mAbs . Las células fueron adquiridas con FACSAria, y analizadas con los elementos de programación FlowJo (TreeStar) .

IL-12 como factor clave para el desarrollo de células T B-auxiliares . IL-21 es una citocina de célula T y NKT que actúa sobre muchas células del sistema inmune. Particularmente, IL-21 promueve el crecimiento y la diferenciación de células B hacia células de plasma que segregan anticuerpo. La Figura 1 muestra que células T CD4+ naturales cebadas en presencia de IL-12 producen grandes cantidades de IL-21. Brevemente, células T CD4+ naturales fueron estimuladas por 7 días con anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28 placa-enlazados en presencia de citocinas (10 ng/ml, excepto IFN-a a 500 IU/ml) . IL-?ß, IL-6, IL-10, IL-18, IL-27, TNF-a e IFN-a no inducen células T CD4+ aptas de secretar IL-21. Sin embargo, IL-12 promovió el desarrollo de células T CD4+ aptas de producir IL-21. Después de la reactivación por medio de CD3/CD28, las células T CD4+ cebadas con IL-12 fueron aptas de secretar cantidades en nanogramos de IL-21 (3.3 ± 0.4 ng/ml en un cultivo de 5 x 104 células/200 µ? . Media ± desviación estándar n=5) , mientras que aquellas cebadas con IL-23 secretaron solamente cantidades en picogramos (40 ± 4 pg/ml. Media ± desviación estándar n=5) . Así, IL-12 induce potentemente a las células T CD4+ naturales a producir IL-21.

La Figura 2 muestra que células T CD4+ naturales cebadas en presencia de IL-12 son aptas de inducir a células B autólogas a producir inmunoglobulinas . Brevemente, células T CD4+ naturales activadas mediante anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28 en presencia de IL-12 u . otras citocinas fueron clasificadas al día 7, y co-cultivadas con células B naturales IgD+CD27- de sangre autólogas pre-activadas con anticuerpo monoclonal anti-IgM y CpG (ligando de TLR-9 ) . La enterotoxina B estafilococal (SEB) , un superantígeno, fue agregado para inducir interacciones de T-B, y las Ig secretadas fueron medidas el día 14. Las células T CD4+ cebadas sin citocina fallaron en inducir a las células B naturales a segregar Ig (A, ninguna) . En contraste, las células T CD4+ cebadas con IL-12 inducen a las células B naturales a segregar Ig, incluyendo IgM, IgG e IgA. Las células B naturales co-cultivadas con células T CD4+ cebadas con IL-23 produjeron cantidades significativamente más bajas de Ig.

Similarmente, células T CD4+ naturales cebadas con IL-12 indujeron la producción de Ig a partir de células B de memoria de IgD-CD27+ a cantidades significativamente más altas que las células T CD4+ cebadas con IL-23 (B) . Así, IL-12 induce a las células T CD4+ a convertirse en células capaces de ayudar a las células B.

La Figura 3 muestra que las células T CD4+ cebadas en presencia de IL-12 inducen a las células B a producir inmunoglobulinas de manera dependiente de IL-21. Brevemente, la proteína quimérica de receptor de IL-21/Fc soluble, que inhibe la función de IL-21, fue agregada a los co-cultivos de células B y las células T CD4+ cebadas con IL-12. El bloqueo de IL-21 inhibió significativamente' a las células B a segregar Ig. Así, IL-21 secretada de células T CD4+ cebadas con IL-12 juega un papel fundamental en la inducción de producción de anticuerpo por células B.

La Figura 4 muestra que las células dendríticas activadas inducen células T CD4+ que producen IL-21 por medio de IL-12. Brevemente, células dendríticas fueron incubadas por 6 horas con bacterias asesinadas térmicamente incluyendo E. coli (gram negativa) , S. aureus (gram positiva) , y P. gingivalis (gram positivo), y luego cultivadas con células T CD4+ naturales alogénicas . Las células T CD4+ activadas clasificadas al día 7 fueron re-estimuladas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 /CD28 por 24 horas para medir la secreción de IL-21. Las células T CD4+ cebadas con células dendríticas bacteria-activadas segregaron más IL-21 que aquellas cebadas con células dendríticas sin estimular. La adición del anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-IL-12p40 , que inhibe tanto IL-12 como IL-23, durante los co-cultivos de células dendríticas-célula T inhibió significativamente el , desarrollo de células T CD4+ que producen IL-21 por células dendríticas bacteria-activadas. Notablemente, la adición del anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-lL-12p70 , que inhibe IL-12 solo, fue suficiente para inhibir significativamente la secreción de IL-21 por células T CD4+ (85 ± 5% de inhibición. Media ± desviación estándar n=5) . Así, la inducción de células T CD4+ que producen IL-21 por células dendríticas que detectaron bacterias fue moderada por IL-12.

La Figura 5 muestra que el bloqueo de IL-12 inhibe el desarrollo de células T aptas de auxiliar a células B. Brevemente, células CD4+ activadas mediante cultivo con células dendríticas bacteria-activadas fueron clasificadas al día 7 y co-cultivadas con células B de memoria autólogas. Células T CD4+ cebadas con células dendríticas bacteria-activadas inducen a las células B a producir Ig. La inducción de secreción de Ig por células B fue significativamente deteriorada cuando el anticuerpo monoclonal anti-IL-12p40 fue agregado durante los co-cultivos de células dendríticas -células T. Sin embargo, el bloqueo de IL-12 con el anticuerpo monoclonal anti-IL-12p70 fue suficiente para inhibir el desarrollo de células T CD4+ B-auxiliares. Así, IL-12 secretado por células dendríticas activadas es crítica para la diferenciación de células T CD4+ naturales a células T B-auxiliares.

IL-12 controla la secreción de IL-21. La Figura 6 muestra que IL-12 controla la secreción de IL-21 por células T CD4+ de memoria. Brevemente, células mononucleares (PBMC) fueron aisladas de muestras de sangre de adultos saludables, y estimulada con enterotoxina B estafilococal (SEB) . Los niveles de IL-21 producidos fueron analizados a 48 horas de cultivo. Las PBMC produjeron altas cantidades de IL-21 cuando son cultivadas con SEB por 48 horas (A. 740 ± 250 pg/ml. Media ± desviación estándar n=7) . El bloqueo de IL-12 durante el período de activación de 48 horas con el anticuerpo monoclonal anti-IL-12p70 dio como resultado una disminución significativa de secreción de IL-21 (A&B. 110 ± 30 pg/ml . n=7. p<0.05). El bloqueo tanto de IL-12 como de IL-23 con el anticuerpo monoclonal anti-IL-12p40 disminuyó la secreción de IL-21 (120 ± 40 pg/ml. n=6) a niveles comparables con el bloqueo de IL-12 solo. El bloqueo de IL-12 no alteró la secreción de otras citocinas en las que se incluyen IL-2, IL-5 e IL-17 (B) . Asi, el bloqueo de IL-12 inhibió específicamente la secreción tanto de IL-21 como de IFN-?. Así, IL-12 actúa directamente sobre células T CD4+ de memoria que producen IL-21 y promueven la secreción de IL-21.

Frecuencia incrementada de células T B-auxiliares funcionales en la sangre de enfermedades autoinmunes. Ejemplo de enfermedad autoinmune auto-anticuerpo-asociada: Dermatomiositis (DM) .

DM es una miopatía inflamatoria autoinmune. Los pacientes con DM muestran debilidad muscular próxima y elementos inflamatorios sistémicos en los que se incluyen erupciones en la piel características. La incidencia de JDM en los Estados Unidos de América es de 3.2 por millón de niños por año. La edad promedio al inicio es de 7 años, pero el 25% de pacientes son jóvenes más jóvenes de 4 años al inicio. En los Estados Unidos de América, la proporción de muchachas a muchachos es de 2.3 a 1. La DM adulta es más común en el intervalo de edad de 40 a 60 años, y observada en aproximadamente 2 de 100,000 gentes en los Estados Unidos de América. Las células T CD4+ y células B se acumulan predominantemente en sitios inflamatorios en dermatomiositis (Figura 7). Muchos pacientes con dermatomiositis muestran un amplio repertorio de autoanticuerpos , asi las células B han sido propuestas como criticas en la patogénesis de dermatomiositis. Actualmente, dos estudios piloto recientes con Rituximab (anticuerpo monoclonal anti-CD20) mostraron que la cancelación de células B fue benéfica a pacientes con dermatomiositis .

La Figura 8 demuestra que los pacientes con enfermedad autoinmune, incluyendo pacientes con dermatomiositis juvenil (JDM) , muestran subconjuntos de células T CXCR5+ desviadas cuando se comparan con testigos saludables .

Células T CD4+ de sangre que expresan CXCR5, un receptor de quimiocina, representan un subconjunto de células T CD4+ especializadas por respuestas de anticuerpo. Las células T CD4+ CXCR5+ segregan grandes cantidades de IL-21 cuando son estimuladas con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 e ICOS. En las células T CD4+ CXCR5+, tres subpoblaciones principales fueron identificadas: células Thl (CXCR3+), Th2 (CXCR3-CCR6- ) y Thl7 (CCR6+ ) . Mientras que las células Th2 y Thl7 son auxiliares de célula B eficientes, las células Thl son totalmente inaptas para ayudar a las células B (A) .

El análisis fenotípico de PBMC reveló que los pacientes son artritis sistémica (SYS) y JDM mostraron menos células Thl CXCR5+ (CXCR3+) y más células Th2 CXCR5+ (CXCR3-CCR6-) que testigos saludables coincidentes en la edad (mostrado en B) . Las frecuencias de células Thl7 CXCR5+ (CXCR3-CCR6+) fueron más altas en JDM y SLE (lupus eritematoso sistémico) que los testigos saludables. Además, las frecuencias de poblaciones de células Th2 y Thl7 de CXCR5+ fueron más altas en JDM que aquellas en otras enfermedades autoinmunes . La población de células Th2-CXCR5+ fue significativamente más alta que el SLE, y la población de células Thl7 CXCR5+ fue más alta que en PSOA (artritis psoriática) . Notablemente, tres de cuatro pacientes de JDM que mostraron las células Thl7 CXCR5+ más altas estuvieron . entre los pacientes más enfermos y más refractarios en el cohorte estudiado (elevación persistente de enzimas musculares, CMAS<40 y . erupciones de la piel persistentes) . La frecuencia de células Thl CXCR5+ en JDM fue significativamente más baja que en las otras dos enfermedades autoinmunes. Así, los subconjuntos de célula T CD4+ CXCR5+- son desviados en SYS, SL'E, y JDM hacia células Th2 y/o Thl7, que representan los auxiliares de célula B más eficientes. Esta inmuno-desregulación podría contribuir a la generación de células B autoreactivas patógenas .

Secreción de IL-21 incrementada por células T CD4+ de memoria obtenidas de pacientes JDM activos. La Figura 9 demuestra . que células mononucleares de sangre periférica obtenidas de pacientes con JDM activa segregan grandes cantidades de IL-21. Brevemente, PBMC nuevas fueron obtenidas de pacientes con artritis psoriática (PSOA) , JDM, SYS y pacientes pediátricos de SLE, y estimuladas con SEB. Los niveles de IL-21 producidos fueron medidos a 48 horas. Notablemente, tres de cinco pacientes con JDM que mostraron la secreción de IL-21 más alta (indicado en círculos) estuvieron entre los pacientes activos que requirieron administración de predonisolona . Así, las células de sangre de pacientes con JDM segregan cantidades más altas de IL-21 después de la activación.

La Figura 10 muestra que IL-12 es la citocina clave también en la inducción de secreción de IL-21 por PBMC obtenidas de pacientes con enfermedad autoinmune. Brevemente, PBMC de pacientes con JDM, SYS, y SLE fueron estimuladas con SEB en presencia o ausencia de anticuerpo monoclonal IL-12-neutralizante, y los niveles de IL-21 secretados fueron analizados. La secreción de IL-21 fue inhibida significativamente en el bloquear IL-12 en los cultivos de PBMC de todas las enfermedades autoinmunes probadas (JDM: n=20, p=0.0027; SYS: n=7 , p=0.015; SLE: n=15, p=0.002. prueba t apareada) , que es consistente con el hallazgo con muestras obtenidas de adultos saludables. Así, IL-12 juega un papel esencial en la inducción de secreción de IL-21 de células T CD4+ de memoria en enfermedades autoinmunes en las que se incluyen JDM, SYS , y SLE.

Se contempla que cualquier modalidad discutida en esta especificación puede ser implementada con respecto a cualquier método, kit, reactivo o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención pueden ser usadas para obtener métodos de la invención.

Se comprenderá que modalidades particulares descritas en la, presente son mostradas a manera de ilustración y no como limitaciones de la invención. Los elementos principales de esta invención pueden ser empleados en varias modalidades sin desviarse del alcance de la invención. Aquellos experimentados en el arte reconocerán o serán aptos de indagar utilizando no más que experimentación de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en la presente. Se considera que tales equivalentes están dentro del alcance de esta invención y son cubiertos por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicadores del nivel de habilidad de aquellos experimentados en el arte con el cual la invención es concerniente. Todas las publicaciones y solicitudes de patente son incorporadas en la presente por referencia a la misma extensión como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia.

El uso de la palabra "uno" o "un" cuando es usada en conjunción con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "por lo menos uno", y "uno o más que uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se propone dar a entender "y/o" a no ser que se indicado explícitamente para referirse a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque" la revelación apoya una definición que se refiere a solamente alternativas y "y/o" . En toda esta solicitud, el término "aproximadamente" es usado para indicar que un valor incluye la variación de error inherente por el dispositivo, el método que es empleado para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Como se usa en esta especificación y reivindicación (es ) , las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprender" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tener" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluye" y "incluir") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contener") son inclusivos y de extremos abiertos y no excluyen elementos adicionales, no citados o etapas de método.

El término "o combinaciones de los mismos" como se usa en la presente se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los ítems enlistados precedentes al término.

Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" pretende incluir por lo menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, incluidas expresamente están combinaciones que contienen repeticiones de uno o más ítems o términos, tal como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y así sucesivamente. El experimentado en el arte entenderá que comúnmente no hay límite en cuanto al número de ítems o términos en cualquier combinación, a no ser que esa evidente de otra manera del contexto. ' Todas las composiciones y/o métodos revelados y reivindicados en la presente pueden ser elaborados y ejecutados sin experimentación indebida a la luz de la presente revelación. En tanto que las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, será evidente para aquellos de habilidad en el arte que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la presente sin desviarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Todos de tales sustitutos y modificaciones similares evidentes para aquellos experimentados en el arte se consideran estar dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. .1. Un método para el tratamiento de una alteración autoinmune caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que tiene una alteración autoinmune, una cantidad efectiva de una composición terapéutica que comprende un inhibidor de IL-12 en una cantidad suficiente para bloquear la actividad de célula T B-auxiliar.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-12 comprende por lo menos un anticuerpo de anti-IL-12 de bloqueo o fragmento del mismo .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además un portador aceptable farmacéuticamente .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de. IL-12 comprende un anticuerpo inhibidor de IL-12 administrado en una dosificación de 1 a 1,000 mg por dosis.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-12 comprende un anticuerpo inhibidor de IL-12 y el sujeto recibe el anticuerpo en dosificaciones repetidas.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-12 comprende un anticuerpo anti-IL-12 seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo de primate subhumano, anticuerpo monoclonal murino, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo humano .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de IL-12 comprende un ARNi, siARN u otro inhibidor de ácido nucleico de IL-12.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es seleccionada del grupo que consiste de púrpura trombocitopénica idiopática aguda, púrpura trombocitopénica idiopática crónica, dermatomiositis , corea de Sydenham, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, lupus nefritis, fiebre reumática, síndromes poliglandulares , penfigoide buloso, diabetes mellitus, púrpura de Henoch-Schonlein, nefritis post-estreptococal , eritema nodosum, arteritis de Takayasu, enfermedad de Addison, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, sarcoidosis, colitis ulcerativa, eritema multiforme, nefropatía de ' IgA, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Goodpasture, tromboangitis ubiterans, síndrome de Sjógren, cirrosis biliar primaria, tiroiditis de Hashimoto, tirotoxicosis , escleroderma, hepatitis activa crónica, polimiositis/dermatomiositis , policondritis , pénfigo vulgaris, granulomatosis de Wegener, nefropatía membranosa, esclerosis lateral amiotrófica, tabes dorsalis, arteritis de célula gigante/polimialgia, anemia perniciosa, glomerulonefritis progresiva' rápidamente y alveolitis fibrosante.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar separadamente un terapéutico secundario dirigido contra células T, células B, células de plasma o macrófagos o citocinas inflamatorias.
10. 10. Un método para mejorar una respuesta de célula B antígeno-específica contra un antígeno, caracterizado porque comprende : aislar células T CD4+ naturales; y madurar las células T CD4+ naturales en presencia de células dendr ticas antígeno-cargadas con una cantidad efectiva de IL-12 suficiente para desarrollar y activar células T B-auxiliares, en donde las células T B-auxiliares IL-12 tratadas segregan cantidades nanomolares de IL-21.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las células T CD4+ naturales son aisladas de células mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las células T CD4+ naturales son obtenidas de células mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa utilizando anticuerpos contra CD8 y uno o más anticuerpos contra CDllb, CDllc, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56. y HLA-DR.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el antígeno es seleccionado de un virus, una bacteria, un hongo, un cáncer o una toxina.
14. 14. Un método para modular enfermedades autoinmunes, caracterizado porque comprende: identificar un paciente sospechoso de necesitar terapia por una alteración autoinmune provocada por la secreción de anticuerpos autoinmunes por células B; y tratar el paciente con una cantidad de un inhibidor de anti-IL-12 suficiente para inhibir células T B-auxiliares CD4+ .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el inhibidor de anti-IL-12 comprende un anticüerpo monoclonal anti-IL-12p40 , un mAb anti-IL-12p70 , receptores anti-IL-12, IL-12 inactiva soluble y combinaciones de los mismos.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el inhibidor de anti-IL-12 comprende un antagonista del receptor de IL-12.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las células T B-auxiliares CD4+ son seleccionadas mediante selección negativa.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las células T B-auxiliares CD4+ son obtenidas de células mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa utilizando anticuerpos contra CD8 y uno o más anticuerpos contra CDllb, CDllc, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56 y HLA-DR.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las células T B-auxiliares CD4+ son activadas en presencia de células dendríticas activadas.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es seleccionada de lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis , dermatomiositis juvenil, artritis, artritis sistémica y artritis psoriática.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el inhibidor de IL-12 es provisto a un sujeto sospechoso de susceptibilidad de una enfermedad autoinmune antes del desarrollo de anticuerpos autoinmunes.
22. 22. Una célula T auxiliar de célula B caracterizada porque es fabricada mediante el método que comprende: aislar células T CD4+ naturales; y madurar las células T CD4 naturales en presencia' de células dendríticas activadas que expresan un antígeno objetivo en presencia de IL-12, en donde las células T B-auxiliares CD4+ maduradas liberan cantidades nanomolares de IL-21 en respuesta al antígeno.
23. 23. Un método para regular la proliferación, maduración y activación de célula B a células que segregan inmunoglobulina al exponer las células T B-auxiliares que segregan IL-21 a una composición que comprende un inhibidor de IL-12.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el inhibidor de IL-12 reduce la secreción tanto de IL-21 como IFN-? por células T B-auxiliares CD4+.
25. 25. Un método para enriquecer células T B-auxiliares caracterizado porque comprende incubar células T CD4 naturales con una cantidad de IL-12 suficiente para disparar la liberación de cantidades nanomolares de IL-21.