TW202302107A - 用於產生抗腫瘤免疫反應的組成物和方法 - Google Patents

用於產生抗腫瘤免疫反應的組成物和方法 Download PDF

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Abstract

本發明揭示了包括脫氫苯賴酮類似物，如普那布林和用於治療癌症的抗CD47劑的組成物。本發明還揭示了透過對需要的受試者共同施用脫氫苯賴酮類似物和一種或多種抗CD47劑來治療癌症的方法。一些實施例中，一種或多種抗CD47試劑是一種能夠結合CD47的抗CD47抗體分子，以及這些具有免疫活性且仍能結合CD47的單特異性抗體的片段。

Description

用於產生抗腫瘤免疫反應的組成物和方法
本發明涉及化學和醫藥領域。具體地，本發明涉及脫氫苯賴酮類似物、包括脫氫苯賴酮類似物的組成物以及它們在治療中的用途。
腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAM)以促進腫瘤生長的M2表現型為主，與不良預後相關。由於M1極化巨噬細胞具有抗腫瘤功能，巨噬細胞體內重新編程是一種很有前途的癌症治療策略。TAMs從M2到M1的交替極化可能引發腫瘤特異性免疫反應。
CD47是一種細胞表面受體，由一個胞外IgV集合結構域、一個5跨膜結構域和一個可變剪接的細胞質尾部組成。兩種配體結合CD47:信號抑制受體蛋白α(SIRPα)和血小板反應蛋白1(TSP1)。CD47的表現和/或活性與許多疾病和失調有關。
腫瘤細胞透過過度表現CD47來劫持免疫抑制機制，有效地幫助它們逃脫免疫監視和先天免疫細胞的毒殺。(Majeti R, Ch等人，CD47是人類急性骨髓性白血病幹細胞的不良預後因子和治療性抗體標的，Cell. 2009年7月23日;138 (2): 286-99;S. Jaiswal等人，CD47在循環造血幹細胞和白血病細胞中向上調控以避免吞噬作用，細胞。2009年7月23日；138(2): 271-85)。CD47在大多數人類癌症(如NHL、AML、乳腺癌、結腸癌、膠質母細胞瘤、膠質瘤、卵巢癌、膀胱癌和前列腺癌)中表現向上調控，CD47表現位準的升高與侵襲性疾病和生存不良明顯相關。(Majeti R，等人，細胞。2009年7月23日;138 (2): 286-99;S. Jaiswal等人，細胞。2009年7月23日;138 (2):271-85; Willingham S B等，CD47-信號調節蛋白α(SIRPα)相互作用是人類固態腫瘤的治療標的，美國國家科學院學報。2012年4月24日；109 (17): 6662-7; Chao M P, 等人，治療性抗體針對CD47消除人類急性淋巴細胞白血病，癌症研究。2011年2月15日；71(4): 1374-84)。
本發明的各方面涉及治療癌症患者的方法。在一些實施例中，所述方法包括：給予治療劑量的式(I)化合物和抗CD47製劑：
Figure 02_image001
其中 R 1、R 4和R 6各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1′和R 1″各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R1、R 1′和R 1″或者共價結合，或者不是共價結合； R 2、R 3和R 5各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 12烷基、不飽和C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基和取代硝基，磺醯基和取代磺醯基； m是等於0、1或2的整數; X 1和X 2分別選自氧原子、氮原子和硫原子，並且 Y選自下組：氮原子、具有上述R 5基團的取代氮原子、氧原子、硫原子、或氧化硫原子、亞甲基和取代亞甲基； Z，對於每個獨立的n，如果不是零，Z 1、Z 2、Z 3和Z 4分別選自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；而虛線鍵可以是單鍵或雙鍵。
在一些實施例中，抗CD47劑是特異性結合CD47的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合CD47的抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，抗CD47劑是特異性結合於SIRPα的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合到SIRPα的抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，該抗體促進CD47表現細胞的巨噬細胞介導的吞噬作用。在一些實施例中，該抗CD47劑是可溶性CD47結合SIRPα片段。在一些實施例中，抗CD47劑阻止CD47和SIRPα之間的相互作用。在一些實施例中，抗CD47劑是從IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型、Ig-G1-N297Q、IG4-S228P以及IG64 PE中選出的IgG同型。在一些實施例中，癌症選擇自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T-ALL、B-ALL、急性骨髓細胞白血病(AML)、B淋巴母細胞白血病/淋巴瘤；彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)；B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、SLL、邊緣區淋巴瘤、中樞神經系統淋巴瘤、裏克特症候群、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化、真性紅血球增多症、皮膚T細胞淋巴瘤、MGUS、骨髓增生異常症候群(MDS)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前B淋巴母細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。在一些實施例中，式(I)化合物以約5 mg/m 2至150 mg/m 2的劑量給藥。在一些實施例中，式(I)化合物經口、舌下、頰下、皮下、靜脈、鼻內、瘤內、局部、經皮、皮內、腹腔、肌肉、肺內、陰道、直腸或眼內給藥。在一些實施例中，式(I)化合物與放射聯合施用。在一些實施例中，式(I)化合物每週給藥一次。在一些實施例中，式(I)化合物在三周(21天)治療週期的第1天和第8天各給藥一次。在一些實施例中，癌症是非霍奇金淋巴瘤。
在一些實施例中，式(I)化合物包括：普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)-亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z, 6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))–亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)6-((5-1H-咪唑-4-(叔丁基)基)亞甲基-d哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟苯甲醯)苯基亞甲基)6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
在本發明的某些方面，提供了一種治療癌症患者的方法。在一些實施例中，該方法包括給藥治療劑量的普那布林和抗CD47劑。在一些實施例中，抗CD47劑是特異性結合CD47的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合CD47的抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，抗CD47劑是特異性結合於SIRPα的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合到SIRPα的抗體是孤立的單株抗體。在一些實施例中，該抗體促進CD47表現細胞的巨噬細胞介導的吞噬作用。在一些實施例中，該抗CD47劑是可溶性CD47結合SIRPα片段。在一些實施例中，抗CD47劑阻止CD47和SIRPα之間的相互作用。在一些實施例中，抗CD47劑是從IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型、IgG1-n297q、IG4-S228P和IG64 PE組中選擇的IgG同型。在一些實施例中，癌症選擇自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T-ALL、B-ALL、急性骨髓細胞白血病(AML)、B-淋巴母細胞白血病/淋巴瘤；彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)；B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、SLL、邊緣區淋巴瘤、中樞神經系統淋巴瘤、裏克特症候群、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化、真性紅血球增多症、皮膚T細胞淋巴瘤、MGUS、骨髓增生異常症候群(MDS)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前B淋巴母細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。在一些實施例中，普那布林的劑量約為5 mg/m2至150 mg/m2。在一些實施例中，普那布林可經口、舌下、頰下、皮下、靜脈、鼻內、瘤內、局部、經皮、皮內、腹腔、肌肉、肺內、陰道、直腸或眼內給藥。在一些實施例中，普那布林與放療聯合使用。在一些實施例中，普那布林每週給藥一次。在一些實施例中，普那布林在三周(21天)的治療週期的第1天和第8天分別給藥一次。在一些實施例中，癌症是非霍奇金淋巴瘤。
本發明的某些方面，提供了一種在需要的受試者中治療癌症的方法，其中所述癌症包括表現CD47的細胞。在一些實施例中，該方法包括給被試者服用的有效量的一種或多種抗CD47製劑和普那布林。在一些實施例中，一種或多種抗CD47製劑是抑制人CD47和SIRPα相互作用的單株抗體。在一些實施例中，單株抗體是人抗體。在一些實施例中，單株抗體包括人kappa恆定區。在一些實施例中，在給藥普那布林之前給藥單株抗體。在一些實施例中，在給藥普那布林後給藥單株抗體。在一些實施例中，單株抗體是一種優化抗體分子。在一些實施例中，從利妥昔單抗或達雷木單抗中選擇一種或多種抗CD47製劑。在一些實施例中，癌症選自急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T-ALL、B-ALL、急性骨髓細胞白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴母細胞白血病/淋巴瘤中選擇；彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)；B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、SLL、邊緣區淋巴瘤、中樞神經系統淋巴瘤、裏克特症候群、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化、真性紅血球增多症、皮膚t細胞淋巴瘤、MGUS、骨髓增生異常症候群(MDS)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前B淋巴母細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。在一些實施例中，癌症是從選自下組的組織的癌症：肺、胰腺、乳房、肝臟、卵巢、睾丸、腎臟、膀胱、脊髓、大腦、子宮頸、子宮內膜、結腸/直腸、肛門、食道、膽囊、胃腸道、皮膚、前列腺、垂體、胃、子宮、陰道和甲狀腺。在一些實施例中，所述一種或多種抗CD47製劑與藥物上可接受的載劑或稀釋劑聯合給藥。在一些實施例中，所述一種或多種抗CD47製劑經皮下注射。在一些實施例中，一種或多種抗CD47製劑經靜脈注射。
在本發明的某些方面，提供了包含普那布林和一種或多種抗CD47製劑的藥物組成物。在一些實施例中，抗CD47製劑是特異性結合CD47的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合CD47的抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，抗CD47製劑是特異性結合於SIRPα的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合到SIRPα的抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，該抗體促進CD47表現細胞的巨噬細胞介導的吞噬作用。在一些實施例中，所述抗CD47劑是可溶性CD47結合SIRPα片段。在一些實施例中，抗CD47製劑阻止CD47和SIRPα之間的相互作用。在某些實施例中，抗CD47製劑是從IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型、IgG1-N297Q、IG4-S228P和IG64PE組中選擇的IgG同型。在一些案例中，普那布林的含量介於5毫克到150毫克之間。
在本發明的某些方面，提供了一種對具有表現CD47的癌細胞的受試者進行治療的方法。在一些實施例中，該方法包括檢測受試者體內CD47的腫瘤細胞表現，並向受試者提供治療量的普那布林和抗CD47製劑。在一些實施例中，檢測腫瘤細胞CD47的表現包括用於檢測受試者中腫瘤細胞CD47表現的免疫細胞化學、蛋白質體學、mRNA定量或其組合中的至少一種。
詳細說明
本發明提供的方法和組成物在使用以CD47為標的的藥物和式(I)化合物協同組合治療、延遲進展、防止癌症或其他腫瘤的復發或減輕其症狀方面非常有用。在一些實施例中，式(I)為普那布林。普那布林，(3Z,6Z)-3-苄亞苄基-6-{[5-(2-甲基-2-丙基)-1H-咪唑-4-基]亞甲基}-2,5-哌𠯤二酮，是天然化合物苯吡嗪酮的合成類似物。根據美國專利第7,064,201號和7,919,497號中詳細的方法和流程可以很容易地製備普那布林，這些專利的全部內容在此引入作為參考。在不受任何特定理論約束的情況下，我們驚奇地發現普那布林增強了TAMs從M2表現型到M1表現型的極化。這種效應允許普那布林與CD47標靶藥物協同作用。在一些方面，標靶CD47的藥物包括一個或多個單株抗體或一個抗原結合片段。在一些實施例中，一個或多個單株抗體或抗原結合片段能夠調節，例如，阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47的表現、活性和/或信號傳遞。在一些實施例中，一種或多種抗CD47製劑是特異性結合CD47的抗體或抗原結合片段。
在進一步描述本發明之前，需要理解的是，本發明不侷限於所述的特定實施例，當然，這樣的實施例可能會有所不同。還需要理解的是，本發明使用的術語僅用於描述特定實施例，而不旨在進行限制，因為本發明的範圍僅由所附申請專利範圍來限定。
如果提供了一個值的範圍，則應理解，除非上下文另有明確規定，否則，每個中間值與所述範圍內的十分之一的值、所述範圍上下限之間的值與所述範圍內的其他所述值或中間值都包含在本發明中。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地包含在較小範圍內，也包含在本發明中，但不受規定範圍內任何特別的限制。規定的範圍包括其中一種限度或兩種限度時，不包括其中一種限度或兩種限度的範圍也包括在本發明中。
本文所述的方法可以按照邏輯上可能的所述事件的任何順序執行，也可以按照事件的順序執行。
除另有規定外，本發明使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。儘管任何與本文所述的方法和材料相似或相等的方法和材料也可以用於本發明的實踐或測試，但現在描述了優選的方法和材料。
本文所涉及的所有出版物在本文中透過引用本發明和描述所引用的出版物相關的方法和/或材料併入。
必須注意的是，在本文所使用的和所附申請專利範圍中，單數形式“a”、“an”和“the”包括複數指涉物，除了上下文另有明確規定。還應注意，在起草申請專利範圍時，可以排除任何可選的要素。因此，本聲明旨在作為在引用請求項要素或使用“否定”限制時使用 “僅”、“僅”等專有術語的先行基礎。
本文所討論的出版物僅供在本申請的提交日期之前公開。這裡的任何內容都不能被視為一種許可，即本發明不享有因先前發明而提前出版的權利。此外，所提供的出版日期可能與實際出版日期不同，實際出版日期可能需要獨立確認。 定義
除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域的普通技術人員的一般理解相同的含義。所有的專利、申請、公開的申請和其他出版物的全部內容透過引用併入全文。如果本文中某一術語有多種定義，除非另有說明，否則以本節中的定義為准。
本發明使用“製劑”一詞來表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料製成的提取物。
術語“抗體”或“抗體片段”旨在包括任何包含多肽鏈的具有特定形狀的分子結構，以適應和辨識一個表位，其中一個或多個非共價結合相互作用穩定了分子結構和表位之間的複合物。本發明所使用的抗體可以是多株抗體或單株抗體。抗體還包括游離抗體和由此衍生的抗原結合片段，以及偶聯物，如聚乙二醇抗體、藥物、放射性同位素或毒素偶聯物等。針對特定表位或表位組合的單株抗體可以標靶和/或耗盡表現該標記的細胞群。可以利用各種技術使用單株抗體篩選表現標記的細胞群，包括使用抗體包被的磁珠進行磁性分離，用附著在固體基質上的抗體進行“篩選”和流式細胞術(參見美國專利第5,985,660號；莫里森等人。細胞，96:737-49(1999))。這些技術允許在活檢標本的免疫組織化學染色、在檢測癌細胞進入血液和其他生物液體等的標記物存在等方面時篩選特定的細胞群。這類抗體的人源化版本也在本發明的範圍內。由於其低抗原性，人源化抗體尤其適用於人體內應用。
術語“癌症”、“瘤”、“腫瘤”和“癌”在本文中可互換使用，指細胞表現出相對自主生長的細胞，使得它們表現出以細胞增殖控制顯著喪失為特徵的異常生長表現型。一般來說，目前本申請中用於檢測或治療的感興趣細胞包括癌前細胞(例如，良性細胞)、惡性細胞、轉移前細胞、轉移細胞和非轉移細胞。癌症細胞的檢測尤其重要。
本文使用的“CD47多肽”表示人類CD47的三個轉錄體變體(變體1，NM001777；變體2, NM 198793；變體3，NM001028079)編碼三種CD47多肽的異構體。CD47異構體1 (NP 001768)是三種異構體中最長的，有323個胺基酸長。CD47異構體2 (NP 942088)長305個胺基酸。CD47異構體3長312個胺基酸。這三個異構體在前303個胺基酸的序列上是相同的。胺基酸1-8為信號序列，胺基酸9-142為CD47免疫球蛋白樣結構域，該結構域為可溶性片段，胺基酸143-300為跨膜結構域。
CD47多肽的前142個胺基酸包含CD47的胞外區域(SEQ ID NO: 1)。這三種異構體在胞外區域有著相同的胺基酸序列，因此任何異構體都可以用來生產可溶性CD47。“可溶性CD47”是一種缺乏跨膜結構域的CD47蛋白。可溶性CD47是由表現它的細胞分泌出來的，而不是侷限在細胞表面。
本文所用的“融合”多肽指的是由多肽或其部分(例如，一個或多個域)融合或結合到異質多肽上的多肽。例如，融合可溶性CD47蛋白與自然序列可溶性CD47多肽共用至少一種生物學特性。融合多肽包括如上所述的免疫粘附素，它將CD47多肽的一部分與免疫球蛋白序列結合，所述表位標記多肽包括可溶性CD47多肽或其部分與“標籤多肽”融合。標籤多肽具有足夠的殘基，可以提供一個抗原決定基，從而產生抗體，但又足夠短，不會干擾CD47多肽的生物活性。合適的標籤多肽通常具有至少6個胺基酸殘基，並且通常具有6-60個胺基酸殘基。
本文所用的術語“免疫結合”和“免疫結合特性”指的是發生在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特異性抗原之間的非共價相互作用。免疫結合相互作用的強度或親和力可以用相互作用的解離常數(K d)來表示，其中K d越小，親和力越大。所選多肽的免疫結合特性可以用已知的方法來量化。其中一種方法是測量抗原結合位點/抗原複合物形成和解離的速率，其中這些速率取決於複合物配偶體的濃度、相互作用的親和力以及在兩個方向上同等影響速率的幾何參數。因此，“開速率常數”(k on)和“關速率常數”(k off)都可以透過計算濃度和實際締合速率和離解速率來確定。(見《自然》361:186-87(1993))。k off/k on的比值能夠消除所有與親和力無關的參數，並等於解離常數K d。(見Davies等人(1990)《生物化學年度回顧》59:439-473)。當平衡結合常數(K d)≦1μM，優選≦100 nM，更優選≦10 nM，最好是≦100 pM到大約1 pM，本發明的一種抗體特異性地與CD47結合，其測定方法如放射性配體結合測定、表面等離子體共振(SPR)、流式細胞儀或者是那些本領域已知的類似的檢測。
本文所使用的術語“分離多核苷酸”一詞是指基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸，或它們的某些組合，根據其起源，“分離多核苷酸”(1)與自然界中發現的“分離多核苷酸”的全部或部分多核苷酸不相關，(2)可操作地連接到一個在自然界中沒有連接到的核苷酸，或(3)在自然界中不作為較大序列的一部分出現。
本文所涉及的術語“分離蛋白”是指由cDNA、重組RNA、合成來源或它們的某些組合組成的蛋白質，由於其來源或來源的不同，該“分離蛋白”(1)與自然界中發現的蛋白不相關，(2)不含來自相同來源的其他蛋白，例如，不含海洋蛋白，(3)由不同物種的細胞表現，或(4)在自然界中不存在。
本文所用的術語“多肽”作為一個通用術語來指多肽序列的天然蛋白質、片段或類似物。因此，天然的蛋白質片段和類似物是多肽屬的物種。
術語“藥學上可接受的載劑”或“藥學上可接受的賦形劑”包括任何和所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這種介質和試劑用於藥物活性物質是本領域公知的。如果任何常規介質或製劑與活性成分不相容，則考慮在治療組成物中使用。此外，可以包括本領域常用的各種佐劑。對在藥物組成物中包含各種成分的考慮進行了描述，例如，在Gilman等人(Eds.)(1990)中；古德曼和吉爾曼的：治療學的藥理學基礎，第八版，佩加蒙出版社，其全文引入本文作為參考。藥物上可接受的賦形劑可以是單糖或單糖衍生物。
本文所用的術語“受試者”是指人類或非人類哺乳動物，例如狗、貓、老鼠、鼠、牛、羊、豬、山羊、非人類靈長類動物或鳥，如雞，以及任何其他脊椎動物或無脊椎動物。
術語“哺乳動物”以其通常的生物學意義使用。因此，它具體包括但不限於靈長類動物，包括猿類(黑猩猩、猿、猴子)和人類、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔子、狗、貓、齧齒動物、大鼠、小鼠、豚鼠等。
本文所用的術語“有效量”或“治療有效量”是指在一定程度上有效緩解或減少一種或多種疾病或病症症狀發作可能性的治療劑的數量，並且可以包括治癒一種疾病或病症。
本文所用的術語“治療”、“療法”或“處理”是指為預防和/或治療的目的將一種化合物或藥物組成物給藥給受試者。術語“預防性治療”是指治療尚未表現出某種疾病或狀況的症狀，但易患某種疾病或病症或在其他方面有患這種疾病或病症風險的受試者，透過這種治療降低患者發展這種疾病或病症的可能性。術語“治療性治療”是指對已經患有某種疾病或病症的受試者進行給藥治療。
本文所用的術語“化療藥物”是指能夠減少、防止、減輕、限制和/或延遲轉移病灶或腫瘤生長的藥物，或透過腫瘤的壞死、凋亡或任何其他機制直接殺死腫瘤細胞的藥物，或可以以藥學上有效的量使用，以減少、防止、減輕、限制和/或延遲轉移灶病灶或腫瘤生長的藥物。化療藥物包括但不限於，例如，氟嘧啶；嘧啶核苷；嘌呤核苷；抗葉酸鹽，鉑類藥物；蒽環黴素/蒽二酮；表鬼臼毒素；喜樹鹼；激素；激素複合物；抗激素；酶、蛋白、多肽及多株抗體和/或單株抗體；長春花生物鹼；紫杉烷；埃博黴素；抗菌管劑；烷化劑；抗代謝物；拓撲異構酶抑制劑;抗病毒藥物；以及其他各種細胞毒和細胞抑制劑。 化合物
在一些實施中，所述化合物是由式(I)表示的脫氫苯賴酮:
Figure 02_image001
其中 R 1、R 4和R 6獨立選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1′和R 1″各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1、R 1′和R 1″或者共價結合，或者不是共價結合； R 2、R 3和R 5各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 12烷基、不飽和C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基和取代硝基，磺醯基和取代磺醯基； m是等於0、1或2的整數; X 1和X 2分別從氧原子、氮原子和硫原子組成的基團中選擇，並且 Y選自下組：氮原子、具有上述R 5基團的取代氮原子、氧原子、硫原子、或氧化硫原子、亞甲基和取代亞甲基； Z，對於每個獨立的n，如果不是零，Z 1、Z 2、Z 3和Z 4分別從碳原子、硫原子、氮原子或氧原子中選；而虛線鍵可以是單鍵或雙鍵。
在一些實施例中，所述化合物是由式(II)表示的脫氫苯賴酮：
Figure 02_image004
其中 R 2和R 3分別選自下組：氫原子、鹵素原子；單取代、多取代或未取代的直鏈或支鏈的下列殘基的變體：C 1-C 12烷基、C 1-C 12烯基、醯基和烷氧基；以及單取代、多取代或未取代的下列殘基的變體：環烷基、環烷氧基、芳基、雜芳基、胺基、硝基和磺醯；或R 2是與Ar連接的鍵；; R 4和R 6各自獨立地選自下組：氫原子、鹵素、羥基、下列殘基的單取代、多取代或未取代、直鏈或支鏈變體：C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基、烷氧基、醯基、芳基烷基、雜芳基烷基、烷氧基羰基氧基、酯、芳基烷氧基、烷氧基和烷基硫；下列殘基的單取代、多取代或未取代變體：醯基氧、芳基氧羰基、環烷基、環烯基、環烷氧基、芳基、雜芳基、芳基氧、芳基羰基、雜環烷基、羰基、胺基、胺基羰基、醯胺、胺基羰基、硝基、疊氮、苯基、羥基、硫代、烷基硫代、芳基硫代、硫氧基磺醯基、噻吩、羧基、氰基； X 1和X 2分別選自下組：氧原子、硫原子以及被R 5基團取代的氮原子。 R 5選自下組：氫原子、鹵素原子、飽和的C 1-C 12烷基、不飽和的C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、被取代芳基、雜芳基、被取代雜芳基、胺基、被取代胺基、硝基、被取代硝基、磺醯基和被取代磺醯基； Y選自下組：被R 5取代的氮原子、氧原子、硫原子、氧化硫原子、亞甲基和被取代的亞甲基； n為0、1、2、3或4；並且 Ar是由一環和三環組成的環狀或多環芳烴或雜芳基環系統，其中： 所述系統的每個環是一個5、6、7或8元環； 所述系統的每個環分別含有0、1、2、3或4個選自氧、硫和氮的雜原子；和 所述系統的每個環被一個或多個選自下組的取代基選擇性地取代：氫、鹵素、羥基、下列殘基的單取代、多取代或未取代、直鏈或支鏈變體：C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基、烷氧基、醯基、芳基烷基、雜芳基烷基、烷氧基羰基氧基、酯、芳基烷氧基、烷氧基硫代；下列殘基的單取代、多取代或未取代變體：醯基氧、芳基氧羰基、環烷基、環烯基、環烷氧基、芳基、雜芳基、芳基氧基、雜環烷基、羰基、胺基、胺基、醯胺、胺基氧基、硝基、疊氮、苯基、羥基、硫代、烷基硫代、芳基硫代、噻吩、氧基磺醯基、磺醯基、羧基、氰基；任選取代的稠環，所述稠環選自下組：二氧唑、二硫唑、惡硫唑、二氧嘧啶、二硫嘧啶和惡硫嘧啶。
在一些實施例中，式(I)化合物選自：普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)-亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基) 哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-1H-咪唑-4-(叔丁基)基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟苯甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
上述所述化合物可以使用美國專利號7,919,497中描述的方法製成，該方法在本文中全部引用並作為參考。 抗 CD47 抗體
在一些實施例中，本發明的CD47抗體為單株抗體。透過調節、阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47和/或CD47/SIRPα介導的細胞信號可以生成單株抗體，例如，透過膜結合/或可溶性CD47免疫動物，如人類CD47或其免疫原性片段、衍生物或變體。或者，用含有編碼CD47的核酸分子的載體轉染的細胞免疫動物，使得CD47表現並與轉染細胞的表面相關聯。或者，透過篩選含有抗體或抗原結合域序列的序列庫獲得抗體。該序列庫的製備，例如，在噬菌體中作為蛋白質或肽融合到噬菌體外殼蛋白，表現在組裝的噬菌體顆粒表面和包含在噬菌體顆粒內的編碼DNA序列(即“噬菌體顯示序列庫”)。然後篩選骨髓瘤/B細胞融合產生的融合瘤對CD47的反應性。
在一些實施例中，所述與CD47結合的本發明的單株抗體，以及這些具有免疫活性且仍與CD47結合的單特異性抗體的片段，包括本文所述的典型抗體，例如5A3抗體、5A3M4抗體、5A3M3抗體、5A3M5抗體、KE8抗體、KE8-P6H5抗體(也稱為KE8H5)、KE8-P3B2抗體(也稱為KE8B2)、KE8-P2A2抗體 (也稱為KE8A25)、KE8F2抗體、KE8G2抗體、KE84G9抗體、KE81G9抗體、KE81A3抗體、KE8E8抗體、KE8G6 抗體、KE8H3抗體、KE8C7抗體、KE8A4抗體、KE8A8抗體、KE8G1抗體、KE8B7抗體、KE8F1抗體、KE8C4抗體、KE8A3抗體、KE86G9抗體、KE8H6抗體、KA3抗體、KA3-P5G2抗體(也稱為 KA3G2)、KA3-P1A3抗體(也稱為KA3A3)、KA3-P5C5抗體(也稱為KA3C5)、KA3H8抗體、KA3B2抗體、KA3A2抗體、KA3D3抗體、KA3H3 抗體、KC4抗體、KC4-P1G11KC4-P4C11抗體、KC4-P6B1KC4-P4F4抗體、KC4-P2E2抗體(也稱為KC4E2)、KC4抗體、KC4F4 抗體、KC4A1抗體、KC4C11抗體、KC4E10抗體、KC4B1抗體、KC4C3抗體、KC4A抗體、KC4G11、the KC4G9抗體及其片段。
在一些實施例中，一種或多種抗CD47劑包括分離的雙特異性抗體，該雙特異性抗體具有包含與CD47結合的第一臂和包含不與CD47結合的第二胺基酸序列的第二臂，其中，雙特異性抗體抑制CD47和信號調節蛋白α (SIRPα)之間的相互作用。在一些實施例中，第二胺基酸序列與腫瘤相關抗原(TAA)結合。在一些實施例中，雙特異性抗體抑制人類CD47和人類SIRPα之間的相互作用。
在一些實施例中，一種或多種抗CD47製劑可能包括一種或多種雙特異性抗體。本揭示內容的雙特異性抗體允許兩個抗體臂同時結合到細胞表面上的兩個抗原上(稱為共接合)，這導致由於親合機制而引起親和力的累加或協同增加。因此，與只表現單一抗原的細胞相比，共接合賦予了表現兩種抗原的細胞高選擇性。此外，雙特異性抗體的兩臂與各自標的的親和力可以透過一種方式建立，即與標靶細胞的結合主要由其中一個抗體臂驅動。在一些實施例中，雙特異性抗體包含與CD47結合的第一臂和與腫瘤相關抗原結合(TAA)的第二臂，其中第二臂以高親和力結合TAA，第一臂與低親和力結合CD47，即親和力足以抑制CD47/SIRPα對TAA的共接合。這種設計允許本發明的雙特異性抗體優先抑制癌症細胞中的CD47而非正常細胞。在本文所提供的實施例中，一種雙特異性抗體，其第一臂以低親和力結合CD47，第二臂以高親和力結合CD19(稱為CD47xCD19雙特異性)，允許在癌症細胞中優先抑制CD47而非正常細胞。除了兩個抗原結合臂外，CD47 x TAA雙特異性抗體需要功能性的Fc片段來召集巨噬細胞和/或其他免疫效應細胞。一種全人源的雙特異性IgG格式(例如所述的κλ-體格式)非常適合於雙標靶CD47 x TAA雙特異性抗體的生成。如本文所提供的實施例所示，雙標靶雙特異性抗體共接合CD47和CD19的能力導致與CD19陽性細胞結合的親和力顯著增加，並在CD19依賴性中和CD47-SIRPα相互作用。在一些實施例中，雙特異性抗體抑制人源CD47和人源SIRPα相互作用的能力至少是抑制人源CD47/人源SIRPα相互作用的能力的10倍，而抑制人源CD47/人源SIRPα相互作用的能力是由單價抗CD47(包括與CD47結合的第一胺基酸序列和不與人源蛋白結合的第二胺基酸序列)表現出來的。
在一些實施例中，雙特異性抗體抑制人源CD47和人源SIRPα相互作用的能力至少是抑制人源CD47/人源SIRPα相互作用的能力的100倍，而抑制人源CD47/人源SIRPα相互作用的能力是由單價抗CD47(包括與CD47結合的第一胺基酸序列和不與人源蛋白結合的第二胺基酸序列)表現出來的。
在一些實施例中，雙特異性抗體抑制人類CD47和人類SIRPα相互作用的能力至少是抑制人源CD47/人源SIRPα相互作用的能力的1000倍，而抑制人源CD47/人源SIRPα相互作用的能力是由單價抗CD47(包括與CD47結合的第一胺基酸序列和不與人源蛋白結合的第二胺基酸序列)表現出來的。
在一些實施例中，所述雙特異性抗體包含單個重鏈多肽和第一輕鏈和第二輕鏈的兩個副本，其中所述第一輕鏈和第二輕鏈不同。
在一些實施例中，單株抗體可能包括全人源抗體或人源化抗體。在一些實施例中，單株抗體適用於給藥給人而不引起人體對所給免疫球蛋白的免疫反應。
單株抗體可以透過重組DNA的方法製備，如美國專利第4,816,567號中所述的方法，其全文引入本文作為參考。編碼本發明單株抗體的DNA可以很容易地用常規方法進行分離和測序(例如，使用能夠特異性結合編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。
本揭示內容的單株抗體可能具有與CD47結合、抑制SIRPα與CD47結合、降低CD47-SIRPα介導的信號傳導、促進吞噬作用以及抑制腫瘤生長和/或轉移的能力。
本發明的例示性抗體包括2A1抗體、2A1的嵌合版本和2A1的人源化變體。本發明的例示性抗體包括具有從SEQ ID NOs: 305-330中選擇的可變重(VH)鏈的抗體，以及具有從SEQ ID NOs: 331-347中選擇的可變輕(VL)鏈的抗體。具體地，例示性抗體包括表1中提供的抗體。 表1
抗體 可變重鏈 (VH) 可變輕鏈(VL)
2A1 SEQ ID NO: 305 SEQ ID NO: 331
2A1-xi SEQ ID NO: 305 SEQ ID NO: 332
AB2.03 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 333
AB2.04 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 334
AB2.05 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 335
AB2.06 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 336
AB2.07 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 337
AB2.08 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 338
AB2.09 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 339
AB2.13 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 343
AB3.09 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 339
AB6.12 SEQ ID NO: 311 SEQ ID NO: 342
AB6.13 SEQ ID NO: 311 SEQ ID NO: 343
AB6.14 SEQ ID NO: 311 SEQ ID NO: 344
AB6.17 SEQ ID NO: 311 SEQ ID NO: 347
AB10.13 SEQ ID NO: 315 SEQ ID NO: 343
AB10.14 SEQ ID NO: 315 SEQ ID NO: 344
AB11.05 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 335
AB12.05 SEQ ID NO: 317 SEQ ID NO: 335
AB15.05 SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 335
AB16.06 SEQ ID NO: 321 SEQ ID NO: 335
AB17.05 SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 335
AB22.05 SEQ ID NO: 327 SEQ ID NO: 335
AB23.05 SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO: 335
AB24.05 SEQ ID NO: 329 SEQ ID NO: 335
AB25.05 SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 335
這些抗CD47臂、單特異性抗CD47抗體、單價抗CD47抗體和/或至少有一個結合位點特異性CD47的雙特異性抗體包含一個可變重鏈胺基酸序列，其序列至少為SEQ ID NO: 114所示胺基酸序列的90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上，且有一個可變輕鏈胺基酸序列，其序列至少為從SEQ ID NO: 116、118、120、122、 124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204和206中選擇的胺基酸序列的90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或以上。
本揭示內容還提供了與CD47結合的單價抗體。這些抗體在本文中統稱為抗CD47單價抗體或抗CD47單株抗體。單價抗體包括一只能特異性辨識CD47的單臂，另一隻單臂在此稱為假臂。假臂包括一個不與人源蛋白結合或以其他方式交叉反應的胺基酸序列。在一些實施例中，所述假臂包括不與全血中的人源蛋白結合或以其他方式交叉反應的胺基酸序列。本領域普通技術人員將認識到，在血液中發現的人源蛋白代表系統迴圈中的所有或基本上全部抗原。在一些實施例中，所述假臂包括不與固體組織中的人源蛋白結合或以其他方式交叉反應的胺基酸序列。優選地，這種單價抗體至少對人源CD47有特異性。在一些實施例中，辨識人源CD47的單價抗體也對至少一種非人源CD47蛋白發生交叉反應，例如，透過非限制性實施例中，非人類靈長類CD47，如食蟹猴CD47和齧齒動物CD47。
在一些實施例中，一種或多種抗CD47劑包括免疫劑。在一些實施例中，免疫劑包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。一般來說，如果需要人類來源的細胞，可以使用周邊淋巴細胞，或者如果需要非人類哺乳動物來源的細胞，可以使用脾臟細胞或淋巴細胞。然後用合適的融合劑(如聚乙二醇)將淋巴細胞與永生化細胞株融合形成融合瘤細胞(Goding，《單株抗體：原理和實踐》，學術出版社，(1986)第59-103頁)。永生化細胞株通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是齧齒類、牛和人類來源的骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。融合瘤細胞可以在適當的培養基中培養，該培養基優選包含抑制未融合的永生化細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，融合瘤的培養基通常包括次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培養基”)，這些物質會阻止缺乏HGPRT細胞的生長。
在一些實施例中，永生化細胞株是那些有效融合的細胞株，支持所選抗體產生細胞穩定的高位準抗體表現並對培養基如HAT培養基敏感的細胞株。更多優選的永生化細胞株是小鼠骨髓瘤細胞株，其可從例如加利福尼亞州聖地牙哥索爾克研究所細胞分配中心和弗吉尼亞州馬納薩斯的美式培養庫獲得。人類骨髓瘤細胞和小鼠-人異骨髓瘤細胞株也已被描述用於生產單株抗體。(見Kozbor J. 免疫學，133:3001 (1984)；Brodeur等人，單株抗體生產技術與應用，Marcel Dekker公司，紐約，(1987)第51-63頁)。
本揭示內容還包括與本文所述的CD47抗體結合到相同表位的抗體。例如，本發明的抗體特異性結合一個表位，該表位包含一個或多個人類CD47上的胺基酸殘基(參考基因庫登錄號Q08722.1)。如下所示為人類例示性CD47的胺基酸序列(基因庫登錄號Q08722.1 (GI:1171879)，在此引入作為參考。
如本文所討論的，假設本發明包含抗體或免疫球蛋白分子的胺基酸序列的微小變化，前提是胺基酸序列的變化至少保持75%，更優選至少80%、90%、95%，最優選99%。特別是，守恆的胺基酸替代物也是可以考慮的。守恆替換是發生在胺基酸家族內的那些在側鏈上有關聯的胺基酸。遺傳編碼的胺基酸一般分為以下幾大類：(1)酸性胺基酸有天冬胺酸、麩胺酸；(2)鹼性胺基酸有離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性胺基酸有丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸、色胺酸；(4)非電荷極性胺基酸有甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。親水性胺基酸包括精胺酸、天冬胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸和蘇胺酸。疏水性胺基酸包括丙胺酸、半胱胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、蛋胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。其他胺基酸家族包括(i)絲胺酸和蘇胺酸，它們是脂族-羥基族；(ii)天冬醯胺和麩醯胺酸，屬醯胺類；(iii)丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸和異亮胺酸，它們是脂族；(iv)苯丙胺酸，色胺酸和酪胺酸，它們是芳香族。例如，可以合理地認為，用異亮胺酸或纈胺酸單獨取代亮胺酸，用麩胺酸取代天門冬胺酸，用絲胺酸取代蘇胺酸，或用結構相關的胺基酸取代類似的胺基酸，不會對合成分子的結合或性質產生重大影響，特別是如果替換物不包含框架位點內的胺基酸。透過測定多肽衍生物的特異性活性，可以很容易地確定胺基酸變化是否導致功能性多肽的產生。本文詳細描述了分析方法。抗體片段或類似物或免疫球蛋白分子可以很容易地用本領域普通的技術製備出來。優選位於功能域邊界附近的抗體片段或類似物的胺基和羧基末端。透過將核苷酸和/或胺基酸序列資料與公共或專有序列資料庫進行比較，可以確定結構域和功能域。優選地，電腦化的比較方法可用於辨識序列基序或預測的蛋白質構形域，這些結構出現在其他已知結構和/或功能的蛋白質中。辨識折疊成已知三維結構的蛋白質序列的方法是已知的。鮑伊等人。科學253:164(1991)。因此，上述實施例表明，本領域技術人員能夠辨識序列基序和結構構形，其可用於根據本發明定義結構域和功能域。
優選的胺基酸取代基是那些：(1)降低蛋白質水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變蛋白質複合物的結合親和力，(4)改變結合親緣性，以及(4)賦予或改變類似物的其他物理化學或功能特性的取代基。類似物可以包含除了天然存在的肽序列之外的序列的各種突變體。例如，單個或多個胺基酸取代(優選守恆的胺基酸取代)可以在天然存在的序列中(優選在形成分子間接觸的多肽區域外的片段中)進行。守恆的胺基酸取代不應顯著改變親代序列的結構特徵(例如，取代胺基酸不應破壞親代序列中出現的螺旋或破壞親代序列中其他類型的二級結構)。在《蛋白質、結構和分子原理》(Creighton, Ed., W. H. Freeman和公司，紐約(1984))、《蛋白質結構導論》(C. Branden和J. Tooze, 編著。紐約加蘭出版社，紐約(1991))和Thornton等人。自然354:105 (1991)中描述了本領域已辨識的多肽二級和三級結構。
透過公知的技術純化抗體，如使用蛋白A或蛋白G進行親和層析，其主要提供免疫血清的IgG部分。隨後，或可選地，可將所尋找的免疫球蛋白的標的抗原或其表位固定在管柱上，透過免疫親和層析法純化免疫特異性抗體。例如，在D. Wilkinson(The Scientist，發表於The Scientist, Inc.，賓夕法尼亞州費城，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28頁)中討論了免疫球蛋白的純化。
單株抗體的篩選可以透過例如測量CD47和/或CD47/SIRPα介導的信號，並確定所檢測的單株抗體是否能夠調節、阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或以其他方式干擾CD47-和/或CD47/sirp α介導的信號。這些檢測可以包括競爭性結合檢測。此外，這些檢測可以測量生物學讀數，例如透過巨噬細胞促進CD47表現細胞的吞噬能力。在一些實施例中，可以使用在小鼠和隨後的融合瘤生成中改進的RIMMS(重複免疫多位點)免疫策略來辨識CD47抗體。
本領域已知的多種方法可用於產生針對CD47或其衍生物、片段、類似物同系物或同源物的單株抗體。(例如，參見《抗體：實驗室手冊》，Harlow E和Lane D, 1988年，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，在此引入全文作為參考)。全人抗體是一種抗體分子，在這個抗體分子中，輕鏈或重鏈(包括CDRs)的整個序列都來自人類基因。本文將這種抗體稱為“人源抗體”或“全人源抗體”。 例如，使用下面提供的實施例中描述的方法製備單株抗體。人類單株抗體也可以使用三瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(參考Kozbor等人，1983年，今日免疫學4:72)以及EBV融合瘤技術(例如Cole等人，1985年出版，《單株抗體和癌症治療》，Alan R. Liss公司，第77-96頁)製備。人類單株抗體可以透過使用人類融合瘤來利用和生產(見Cote等人，1983年。美國國家科學院學報，80:2026-2030)或在體外用EB病毒轉化人B細胞(參考Cole等人，1985年出版，《單株抗體和癌症治療》，Alan R. Liss, Inc.，第77-96頁)。抗體也可以由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生(參見Dhara等人，2018年。生物藥物，32, 571-584)。
確定單株抗體是否具有單株抗體的特異性的另一種方法是將本發明的單株抗體與可溶性CD47蛋白(通常與之反應)預培育，然後加入被檢測的單株抗體，以確定被檢測的單株抗體結合CD47的能力是否受到抑制。如果被檢測的單株抗體被抑制，那麼在所有可能的情況下，它具有與單株抗體相同的或在功能上等效的表位特異性。
在其他替代的方法中，例如使用噬菌體展示方法，其使用僅含有人類序列的抗體，可以開發出CD47抗體。這種方法是本領域公知的，例如在WO92/01047和美國專利第6,521,404中，在此引入作為參考。該方法利用天然或重組的CD47或其片段源篩選攜帶隨機對輕鏈和重鏈的噬菌體組合序列庫。在另一方法中，CD抗體可以透過一種方法產生，其中該方法中至少有一個步驟包括用人類CD47蛋白免疫轉基因的非人類動物。在這種方法中，這種異種非人類動物的一些內源性重鏈和/或kappa輕鏈位點失活，無法重新排列以產生編碼對抗原作出反應的免疫球蛋白的基因。此外，至少有一個人類重鏈位點和至少一個人類輕鏈位點已穩定轉移到動物體內。因此，作為對給藥抗原的反應，人類基因位點重新排列以提供編碼人類可變區域免疫特異性抗原的基因。因此，一旦免疫後，異種鼠可以產生B細胞，其可分泌完全的人類免疫球蛋白。
本揭示內容還提供了分離的、重組的和/或合成的抗CD47人類、靈長類、齧齒類、哺乳動物、嵌合的、人性化的和/或CDR嫁接的抗體和組成物以及編碼核酸分子，該核酸分子包含至少一個多核苷酸，其至少編碼一個抗CD47抗體分子的一個片段。本揭示內容進一步包括但不侷限於製造和使用這類核酸和抗體的方法，其中包括診斷和治療組成物、方法和裝置。
例示性的抗CD47單價和雙特異性抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)。
Common-HC-NT (SEQ ID NO:1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAGTTATGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACAGTCTCGTGGAACTCAGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCTCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAA
COMMON-HC-AA (SEQ ID NO: 2) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
5A3抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 3所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 4)。
5A3-LC-NT (SEQ ID NO: 3) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGGTGCATCCAGGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
5A3-LC-AA (SEQ ID NO: 4) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
5A3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(EQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 115所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 116)。
5A3-VL-NT (SEQ ID NO: 115) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGGTGCATCCAGGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
5A3-VL-AA (SEQ ID NO: 116) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIK
5A3-M4抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 5所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 6)。
5A3-M4-LC-NT (SEQ ID NO: 5) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGGTGCATCCAGGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGAACCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
5A3-M4-LC-AA (SEQ ID NO: 6) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRNPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
The 5A3-M4抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 117所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 118)。
5A3-M4-VL-NT (SEQ ID NO: 117) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGGTGCATCCAGGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGAACCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
5A3-M4-VL-AA (SEQ ID NO: 118) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRNPRTFGQGTKVEIK
The 5A3-M4抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 7所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 8)。
5A3-M3-LC-NT (SEQ ID NO: 7) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGTCCATTAGTAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGCTGCATCCTCGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
5A3-M3-LC-AA (SEQ ID NO: 8) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
5A3-M3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 119所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 120)。
5A3-M3-VL-NT (SEQ ID NO: 119) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGTCCATTAGTAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGCTGCATCCTCGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
5A3-M3-VL-AA (SEQ ID NO: 120) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIK
5A3-M5抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 9所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 10)。
5A3-M5-LC-NT (SEQ ID NO: 9) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGGTGCATCCAGGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGTACCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
5A3-M5-LC-AA (SEQ ID NO: 10) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRYPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
5A3-M5抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 121所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 122)。
5A3-M5-VL-NT (SEQ ID NO: 121) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGGTGCATCCAGGTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGAAGCACCCCCGGTACCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
5A3-M5-VL-AA (SEQ ID NO: 122) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQKHPRYPRTFGQGTKVEIK
Ke8抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 11所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 12)。
Ke8-LC-NT (SEQ ID NO: 11) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGTTCCACAAGCGGCGGCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8-LC-AA (SEQ ID NO: 12) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFHKRRPQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 123所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 124)。
Ke8-VL-NT (SEQ ID NO: 123) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGTTCCACAAGCGGCGGCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KE8-VL-AA (SEQ ID NO: 124) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFHKRRPQTFGQGTKVEIK
Ke8H5抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 13所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 14)。
KE8H5-LC-NT (SEQ ID NO: 13) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGCGAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGTTCCATAAGCGTGCGCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8H5-LC-AA (SEQ ID NO: 14) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIARYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFHKRAPQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8H5抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 125所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 126)。
KE8H5-VL-NT (SEQ ID NO: 125) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGCGAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGTTCCATAAGCGTGCGCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KE8H5-VL-AA (SEQ ID NO: 126) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIARYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFHKRAPQTFGQGTKVEIK
Ke8B2抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 15所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 16)。
KE8B2-LC-NT (SEQ ID NO: 15) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCACCCGCGTGCCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8B2-LC-AA (SEQ ID NO: 16) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRAPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8B2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 127所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 128)。
KE8B2-VL-NT (SEQ ID NO: 127) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCACCCGCGTGCCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8A2抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 17所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 18)。
KE8A2-LC-NT (SEQ ID NO: 17) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCCCGTGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8A2-LC-AA (SEQ ID NO: 18) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8A2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 129所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 130)。
KE8A2-VL-NT (SEQ ID NO: 129) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCCCGTGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KE8A2-VL-AA (SEQ ID NO: 130) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIK
Ke8E8抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 19所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 20)。
KE8E8-LC-NT (SEQ ID NO: 19) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCCCGTGGCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8E8-LC-AA (SEQ ID NO: 20) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8E8抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 131所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 132)。
KE8E8-VL-NT (SEQ ID NO: 131) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCCCGTGGCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8H3抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 21所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 22)。
KE8H3-LC-NT (SEQ ID NO: 21) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCGCGTGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8H3-LC-AA (SEQ ID NO: 22) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8H3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 133所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 134)。
KE8H3-VL-NT (SEQ ID NO: 133) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCGCGTGGGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KE8H3-VL-AA (SEQ ID NO: 134) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRGPRTFGQGTKVEIK
Ke8G6抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 23所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 24)。
KE8G6-LC-NT (SEQ ID NO: 23) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTGCGCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8G6抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 135所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 136)。
KE8G6-VL-NT (SEQ ID NO: 135) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTGCGCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8A3抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 25所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 26)。
KE8A3-LC-NT (SEQ ID NO: 25) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGTAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGGCATCCCCGTGGGCCGAGCACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8G6抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 137所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 138)。
KE8A3-VL-NT (SEQ ID NO: 137) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGTAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGGCATCCCCGTGGGCCGAGCACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KE8A3-VL-AA (SEQ ID NO: 138) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSQSISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRHPRGPSTFGQGTKVEIK
Ke81A3抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 27所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 28)。
KE81A3-LC-NT (SEQ ID NO: 27) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGGCATCCGCGTGCCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke81A3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 139所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 140)。
KE81A3-VL-NT (SEQ ID NO: 139) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGGCATCCGCGTGCCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KE81A3-VL-AA (SEQ ID NO: 140) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRHPRAPRTFGQGTKVEIK
Ke8A8抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 29所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 30)。
KE8A8-LC-NT (SEQ ID NO: 29) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTGCGCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE8A8-LC-AA (SEQ ID NO: 30) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMHPRAPKTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke8A8抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 141所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 142)。
KE8A8-VL-NT (SEQ ID NO: 141) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTAT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTGCGCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8C7抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 31所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 32)。
KE8C7-LC-NT (SEQ ID NO: 31) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGCGCCATCCGCGTGGCCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8C7抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 143所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 144)。
KE8C7-VL-NT (SEQ ID NO: 143) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAATAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGCGCCATCCGCGTGGCCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8G2抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 33所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 34)。
KE8G2-LC-NT (SEQ ID NO: 33) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCCCGTGCGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8G2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 145所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 146)。
KE8G2-VL-NT (SEQ ID NO: 145) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCCCGTGCGCCGAGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke81G9抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 35所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 36)。
KE81G9-LC-NT (SEQ ID NO: 35) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGCGGCATAAGCGTTCCCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke81G9抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 147所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 148)。
KE81G9-VL-NT (SEQ ID NO: 147) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGCGGCATAAGCGTTCCCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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KE8F2-LC-NT (SEQ ID NO: 37) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCGCGTGCGCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8F2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 149所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 150)。
KE8F2-VL-NT (SEQ ID NO: 149) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCGCGTGCGCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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KE8B7-LC-NT (SEQ ID NO: 39) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGGAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTAGCCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8B7抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 151所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 152)。
KE8B7-VL-NT (SEQ ID NO: 151) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGGAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTAGCCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8C4抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 153所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 154)。
KE8C4-VL-NT (SEQ ID NO: 153) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCGCGTGGGCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8F1抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 155所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 156)。
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Ke8G11抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 157所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 158)。
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Ke8H6抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 47所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 48)。
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Ke8H6抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 159所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 160)。
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Ke84G9抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 49所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 50)。
KE84G9-LC-NT (SEQ ID NO: 49) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCGCGTAGCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KE84G9-LC-AA (SEQ ID NO: 50) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKHPRSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ke84G9抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 161所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 162)。
KE84G9-VL-NT (SEQ ID NO: 161) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAAGCATCCGCGTAGCCCGCGGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke8A4抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 51所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 52)。
KE8A4-LC-NT (SEQ ID NO: 51) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGCTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGTTCCATAAGCGTAGCCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGA GTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke8A4抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 163所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 164)。
KE8A4-VL-NT (SEQ ID NO: 163) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGCTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGTTCCATAAGCGTAGCCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ke86G9抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 53所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 54)。
KE86G9-LC-NT (SEQ ID NO: 53) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGGCATCCGCGTGGGCCGACCACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
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Ke86G9抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 165所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 166)。
KE86G9-VL-NT (SEQ ID NO: 165) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGGCATCCGCGTGGGCCGACCACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ka3抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 55所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 56)。
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Ka3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 167所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 168)。
KA3-VL-NT (SEQ ID NO: 167) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCACCCGCGCGCCCCGAAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ka3A2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 169所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 170)。
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Ka3H3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 171所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 172)。
KA3H3-VL-NT (SEQ ID NO: 171) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTGCTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCTCGCTCGCCGAAAACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
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Ka3B2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 177所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 178)。
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Ka3C5抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 179所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 180)。
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Ka3G2抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 69所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 70)。
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Ka3G2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 181所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 182)。
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Ka3D3抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 71所示的核酸序列編碼的kappa輕鏈(SEQ ID NO: 72)。
KA3D3-LC-NT (SEQ ID NO: 71) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCTCGCGCGCCGAAAACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
KA3D3-LC-AA (SEQ ID NO: 72) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMHPRAPKTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ka3D3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 183所示的核酸序列編碼的kappa可變輕結構域(SEQ ID NO: 184)。
KA3D3-VL-NT (SEQ ID NO: 183) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGTAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGATGCATCCTCGCGCGCCGAAAACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
KA3D3-VL-AA (SEQ ID NO: 184) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMHPRAPKTFGQGTKVEIK
Kc4抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 73所示的核酸序列編碼的lambda輕鏈(SEQ ID NO: 74)。
KC4-LC-NT (SEQ ID NO: 73) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA
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Kc4抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 185所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 186)。
KC4-VL-NT (SEQ ID NO: 185) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
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KC4G11-LC-NT (SEQ ID NO: 75) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGGAAGGCGAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATAAGGATAGTGATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA
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Kc4G11抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 187所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 188)。
KC4G11-VL-NT (SEQ ID NO: 187) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGGAAGGCGAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATAAGGATAGTGATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
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KC4C11-LC-NT (SEQ ID NO: 77) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGGGGGAATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAATAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA
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Kc4C11抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 189所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 190)。
KC4C11-VL-NT (SEQ ID NO: 189) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGGGGGAATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAATAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
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KC4A1-LC-NT (SEQ ID NO: 79) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGTGCGAGGAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAGTAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA
KC4A1-LC-AA (SEQ ID NO: 80) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVSARNYVSWYQQHPGKAPKLMIYESSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Kc4A1抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 191所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 192)。
KC4A1-VL-NT (SEQ ID NO: 191) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGTGCGAGGAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAGTAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
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Kc4A4抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 193所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 194)。
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Kc4E10抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 195所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 196)。
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Kc4C3抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 199所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 200)。
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KC4F4-LC-AA (SEQ ID NO: 90) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVRRANYVSWYQQHPGKAPKLMIYQDSSRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Kc4F4抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 201所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 202)。
KC4F4-VL-NT (SEQ ID NO: 201) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGGAGGGCTAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATCAGGATAGTAGTCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
KC4F4-VL-AA (SEQ ID NO: 202) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVRRANYVSWYQQHPGKAPKLMIYQDSSRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVL
Kc4B1抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 91所示的核酸序列編碼的lambda輕鏈(SEQ ID NO: 92)。
KC4B1-LC-NT (SEQ ID NO: 91) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGGGCTAATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAGTAGTGCGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA
KC4B1-LC-AA (SEQ ID NO: 92) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVRANNYVSWYQQHPGKAPKLMIYESSARPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Kc4B1抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 203所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 204)。
KC4B1-VL-NT (SEQ ID NO: 203) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTAGGGCTAATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAGTAGTGCGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
KC4B1-VL-AA (SEQ ID NO: 204) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVRANNYVSWYQQHPGKAPKLMIYESSARPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVL
Kc4E2抗體包括由SEQ ID NO: 1所示的核酸序列編碼的共同重鏈(SEQ ID NO: 2)和由SEQ ID NO: 93所示的核酸序列編碼的lambda輕鏈(SEQ ID NO: 94)。
KC4E2-LC-NT (SEQ ID NO: 93) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTTATTATAATAAGTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAGTAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA
KC4E2-LC-AA (SEQ ID NO: 94) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVYYNKYVSWYQQHPGKAPKLMIYESSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Kc4E2抗體包括由SEQ ID NO: 113所示的核酸序列編碼的共同可變重結構域(SEQ ID NO: 114)和由SEQ ID NO: 205所示的核酸序列編碼的lambda可變輕結構域(SEQ ID NO: 206)。
KC4E2-VL-NT (SEQ ID NO: 205) CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTTATTATAATAAGTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGAGTAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATTGGTGGTTCCGCCCCAAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
KC4E2-VL-AA (SEQ ID NO: 206) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVYYNKYVSWYQQHPGKAPKLMIYESSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDWWFRPKVFGGGTKLTVL
本揭示內容中的例示性單株抗體包括，例如，具有如下序列所示的可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈區(VL)的人源化抗體。
SEQ ID NO: 305 EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASQPN1KDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPDNGDTEFAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTSVTV
SEQ ID NO: 306 EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYLHWVQQAPGKGLEWMGWIDPDNGDTEYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTSVTV
SEQ ID NO: 307 QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 308 EVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 309 QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWWPDNGDTEYAQKFQGRVTMTADTSSNTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYH1DYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 310 QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGPNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 311 QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 312 QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDYGDTEYAQFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 313 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDSGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 314 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNADTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 315 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNTDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 316 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNTDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSPYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 317 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTYYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSPYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 318 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFTYYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 319 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYNFTYYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGQTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 320 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTITYYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 321 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 322 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 323 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFTDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 324 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTITDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 325 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 326 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 327 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 328 QMQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 329 EVQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
SEQ ID NO: 330 EVQLVGSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
在一些實施例中，提供了一些CD47抗體,其可變輕鏈區(VL)如下所示：
SEQ ID NO: 331 DIKMTQSPSSLYASLGERVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKSPKILIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEMK
SEQ ID NO: 332 DIKMTQSPSSLYASLGERVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKSPKILIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 333 DIQMTGSPSSLSASVGDRVTITCKASQDTHRYLSWYQQKPKAPKLLIYRANPLVDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 334 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 335 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 336 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWYQQKPGKAPKRLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFFYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 337 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHRYLAWYQQKPGKVPKLLIYRANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYDEFPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 338 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHRYLAWYQQKPGQAPRLLIYFANRRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQYDEFPYTGFQGTRLEIK
SEQ ID NO: 339 DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 340 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRARQGIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 341 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDTHRYLSWFQQKPGKVPKILIYRANRLVDGVSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 342 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 343 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRARQGIHRYLSSWFQQKPGKVPKILIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 344 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRARQGIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 345 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKLLIYRANRLVDGCPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 346 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKLLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 347 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRARQGIHRYLSWFQQKPGKVPKLLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
在一些實施例中，抗CD47抗體為SEQ ID NO: 401。
SEQ ID NO: 401 – B6H12.2 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE
在一些實施例中，抗CD47抗體為SEQ ID NO: 402。
SEQ ID NO: 402 – BRIC126 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE
在一些實施例中，抗CD47抗體為Hu5f9-g4. SEQ ID NO:403。
SEQ ID NO: 403 – Hu5f9-g4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSDIVMTQSPLSLPVTGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK 藥物組成物
標準的藥物配方技術可用於製作本文所述的藥物組成物，例如在Remington的《藥劑學科學與實踐》第21版Lippincott Williams & Wilkins (2005)所揭示的那些技術，其全部內容在此引入作為參考。相應地，一些實施例中包括藥物組成物：其包含：(a)安全且治療有效量的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽；(b)一個或多個與CD47結合的單株抗體或一個或多個與CD47結合的單株抗體的免疫活性片段以及(c)藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或其組合。在一些實施例中，式(I)化合物選自普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-yl)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟甲基酶)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯) 苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
術語“藥學上可接受的載劑”或“藥學上可接受的賦形劑”包括任何和所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這種介質和試劑用於藥物活性物質是本領域公知的。如果任何常規介質或製劑與活性成分不相容，則考慮在治療組成物中使用。此外，可以包括本領域常用的各種佐劑。對在藥物組成中包含各種成分的考慮進行了描述，例如，在Gilman等人(Eds.)(1990)中;古德曼和吉爾曼的:治療學的藥理學基礎，第八版，佩加蒙出版社，其全文引入本文作為參考。藥物上可接受的賦形劑可以是單糖或單糖衍生物。
一些可以作為藥學上可接受載劑或其組分的物質的實施例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉類，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、甲基纖維素；黃蓍粉；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油、可哥樹油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如TWEENS；濕潤劑，如十二烷基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑；穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽水以及磷酸鹽緩衝溶液。 治療方法
一些實施例涉及使用本文所述的藥物組成物對需要的主體進行癌症治療的方法。一些實施例涉及一種用於治療癌症的方法，其包括共同施用式(I)化合物和一種或多種抗CD47藥物。在一些實施例中，式(I)化合物選自普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d) 哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟甲基酶)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
在一些實施例中，一種或多種抗CD47藥物包括一種或多種單株抗體，該單株抗體可在需要時與CD47結合。在一些實施例中，受試者可以是動物，例如哺乳動物或人類。在一些實施例中，受試者是人。在一些實施方案中，與CD47特異性結合的單株抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，一種或多種抗CD47試劑是特異性結合於SIRPα的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，特異性結合到SIRPα的單株抗體是分離的單株抗體。在一些實施例中，單株抗體促進巨噬細胞介導的CD47表現細胞的吞噬作用。在一些實施例中，一種或多種抗CD47藥物是可溶性CD47結合SIRPα片段。在一些實施例中，一種或多種抗CD47藥物阻止CD47和SIRPα之間的相互作用。在某些實施例中，抗CD47劑是從IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型、IG-G1-N297Q、IG4-S228P和IG64 PE組中選擇的IgG同型。在一些實施例中，癌症選自非霍奇金淋巴瘤。在一些實施例中，普那布林以約5 mg/m 2至150 mg/m 2的劑量給藥。在一些實施例中，普那布林可經口、舌下、頰下、皮下、靜脈、鼻內、瘤內、局部、經皮、皮內、腹腔、肌內、肺內、陰道、直腸或眼內給藥。在一些實施例中，在一些實施例中，普那布林與放療聯合使用。在一些實施例中，普那布林與化療藥物聯合用藥。在一些實施例中，普那布林每週給藥一次。在一些實施例中，普那布林在三周(21天)的治療週期的第1天和第8天每天給藥一次。
在本揭示內容的一些方面，提供了一種對具有表現CD47的癌細胞受試者進行治療的方法。在一些實施例中，該方法包括：檢測受試者中CD47的腫瘤細胞表現，並向受試者提供治療量的普那布林和抗CD47劑。在一些實施例中，檢測腫瘤細胞CD47的表現包括用於檢測受試者中腫瘤細胞CD47表現的免疫細胞化學、蛋白質體學、mRNA定量或其組合中的至少一種。在一些實施例中，普那布林和一種抗CD47劑以相同的配方給藥。其他實施例包括共給藥由式(I)化合物和一種或多種單株抗體，這些單株抗體以單獨組成物與CD47結合。因此，一些實施例包括第一藥物組成物和第二藥物組成物，其中第一藥物組成物包括：(a)安全且治療有效量的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽和(b)其藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或其組成物，第二藥物組成物包括：(a)與CD47結合的一種或多種單株抗體和(b)其藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或其組成物。
在一些實施例中，癌症是頭頸癌、肺癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、黑素瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。在一些例子中，癌症是腎細胞癌、惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、霍奇金淋巴瘤或鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症是從乳腺癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、白血病、卵巢癌、胃癌、腎細胞癌、肝癌、胰腺癌、淋巴瘤和骨髓瘤中選擇的。在一些實施例中，癌症是固態腫瘤或血液癌。
一些實施例包括使用本文所述的組成物來診斷、預測、監測、治療、緩解和/或預防與受試者中異常CD47表現、活性和/或信號傳遞相關的疾病或病理。治療方案是透過使用標準方法辨識受試者，例如，患有(或有發展風險的)與CD47表現、活性和/或信號傳遞相關的疾病或疾病的人類患者，如癌症或其他腫瘤疾病。作為非限制性實例，在一些實施例中，與異常CD47表現、活性和/或信號傳導相關的疾病或障礙包括血液癌和/或固態腫瘤。血液癌包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作為非限制性實例，某些形式的白血病，包括急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性骨髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性顆粒細胞白血病(CML)、骨髓增生障礙/腫瘤(MPDS)和脊髓發育不良症候群。作為非限制性實例，某些類型的淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤，包括惰性和侵襲性的非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤(小細胞和大細胞)。作為非限制性實例，某些類型的骨髓瘤包括多發性骨髓瘤(MM)，巨細胞骨髓瘤，重鏈骨髓瘤，輕鏈骨髓瘤或Bence-Jones骨髓瘤。固態腫瘤包括乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤、前列腺腫瘤、黑色素瘤腫瘤、結直腸腫瘤、肺腫瘤、頭頸部腫瘤、膀胱腫瘤、食道腫瘤、肝臟腫瘤、腎臟腫瘤等。
與癌症和其他腫瘤疾病相關的症狀包括，例如，發炎、發熱、全身不適、疼痛(通常侷限於發炎部位)、食欲不振、體重減輕、水腫、頭痛、疲勞、皮疹、貧血、肌肉無力、肌肉疲勞和腹部症狀，例如腹痛、便秘或腹瀉。
本發明組成物的治療有效量一般涉及達到治療目標所需的量。如上所述，這可能是抗體與其標的抗原之間的結合作用，在某些情況下，干擾了標的抗原的功能。所需要的給藥量進一步取決於抗體對其特定抗原的結合親和力，也取決於所給抗體從其所給的其他物件的自由容量中消耗的速率。作為非限制性實例，本發明的抗體或抗體片段的治療有效劑量的範圍可以是約0.1 mg/kg體重到約100mg/kg體重。例如，常見的劑量頻率可以從每天兩次到每週一次不等。 給藥
本文所述的藥物組成物的給藥可以透過任何可接受的給藥模式，所述給藥方式用於類似的用途，包括但不限於：口服、舌下、頰下、皮下、靜脈、鼻內、瘤內、局部、經皮、皮內、腹腔、肌內、肺內、陰道、直腸或眼內。口服和非腸道給藥在治療作為優選實施例受試者的適應症時是慣用的。
本發明所述組成物可按單位劑型提供。如在本文中所使用的，“單位劑型”是一種組成物，根據良好的醫療實踐，該組成物含有適於以單劑量給藥於動物，優選哺乳動物受試者的化合物或組成物的量。然而，配製單一或單位劑型並不意味著每天給藥一次或每個療程給藥一次。儘管沒有明確排除單次給藥，這種劑型可考慮每天給藥1次、2次、3次或更多，可在一段時間內(例如，約30分鐘至約2-6小時)輸液，或連續輸液，並可在一個療程中給藥不止一次。本領域技術人員將認識到，製劑沒有特別考慮整個治療過程，並且這些決定是留給治療領域技術人員而不是製劑。
如上所述有用的組成物可以是多種給藥途徑的任何一種合適形式，例如，用於口腔、舌下、頰部、鼻部、直腸、外用(包括經皮和皮內)、眼內、腦內、顱內、鞘內、動脈內、靜脈、肌肉內、或其他親代給藥途徑。熟練的技術人員將理解，口腔和鼻用組成物包括透過吸入給藥並使用可用的方法製備的組成物。根據需要的特定給藥途徑，可以使用各種在醫學上公認的載劑。藥學上可接受的載劑包括，例如，固體或液體填料、稀釋劑、親水劑、表面活性劑和封裝物質。可以包括具有藥物活性的物質，這些物質不會對化合物或組成物的抑制活性產生實質性的干擾。與所述化合物或組成物結合使用的載劑的量足以提供按該化合物的單位劑量使用的實際數量的材料。用於製備可用於本文所述方法的劑型的技術和組成物在以下參考文獻中描述，所有參考文獻均引入本文作為參考:《當代藥物學》，第四版，第9和10章(Banker和Rhodes，編輯，2002)；Lieberman等人，《藥物劑型：片劑》(1989年)和Ansel，《藥物劑型概論》第八版(2004)。
可使用多種口服劑型，包括片劑、膠囊(如固體凝膠膠囊和液體凝膠膠囊)、顆粒和散裝粉劑等固體劑型。片劑可以是壓縮片劑、片劑三酸鹽片、腸溶片、糖衣片、薄膜片或多重壓縮片劑，含有適當的粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、調味劑、誘導流劑和熔劑。液體口服劑型包括水溶液、乳劑、懸浮液、由非發泡性顆粒重組的溶液和/或懸浮液，以及由發泡性顆粒重組的發泡性製劑，包含適當的溶劑、防腐劑、乳化劑、懸浮劑、稀釋劑、甜味劑、熔劑、著色劑和調味劑。
適用於製備口服單位劑型的藥學上可接受載劑在本領域是公知的。片劑通常包括傳統的藥物相容佐劑作為惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、甘露醇、乳糖和纖維素；澱粉、明膠、蔗糖等粘結劑；澱粉、褐藻酸、交叉鏈糖等崩解劑；潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石粉。諸如二氧化矽的滑劑可以用來改善粉末混合物的流動特性。可添加FD&C染料等著色劑進行外觀處理。甜味劑和調味劑，如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果香料，都是可咀嚼片的有效佐劑。膠囊通常包括上述揭示的一種或多種固體稀釋劑。載劑組件的選擇取決於口味、成本和貨架穩定性等次要考慮因素，這些都不是關鍵因素，而且可以由技術熟練的人輕易做出。
口服成分還包括液體溶液、乳劑、懸浮液等。適合製備這類組成物的藥學上可接受的載劑是本領域公知的。糖漿、酏劑、乳劑和懸浮液載劑的典型成分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液體蔗糖、山梨醇和水。對於懸浮液，典型的懸浮劑包括甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、AVICEL RC-591、黃蓍膠和海藻酸鈉；典型的潤濕劑包括卵磷脂和聚山梨醇酯80；典型的防腐劑包括尼泊金甲酯和苯甲酸鈉。口服液組成物還可以包含一種或多種成分，如上述所述的甜味劑、調味劑和著色劑。
這些組成物也可以用常規方法包覆，通常是使用pH值或時間依賴性的塗層，使得在所需局部施用的附近或在不同時間將本發明組成物釋放到胃腸道中以延長所需的作用。這種劑型通常包括但不限於一種或多種鄰苯二甲酸酯醋酸纖維素、聚鄰苯二甲酸乙烯酯、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、Eudragit塗料、蠟和蟲膠。
本文所述的組成物可選擇性地包括其他藥物活性。
可用於獲得所述化合物的全身遞送的組成物包括舌下劑型、頰面劑型和鼻劑型。這種組成物通常包括一種或多種可溶性填充物質，如蔗糖、山梨醇和甘露醇；以及如洋槐、微晶纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素等粘結劑。上述所揭示的滑劑、潤滑劑、甜味劑、著色劑、抗氧化劑和調味劑也可能包括在內。
配製用於局部眼科使用的液體組成物，其配製使其可以局部施用於眼部。舒適度可以盡可能地最大化，儘管有時配方考慮(例如藥物穩定性)可能需要低於最佳舒適度。在舒適感不能最大化的情況下，可配製液體，使患者可承受局部眼科使用。此外，眼科可接受的液體可以包裝為一次性使用，也可以含有防腐劑以防止在多次使用中受到污染。
在眼科應用中，溶液或藥物通常使用生理鹽水溶液作為主要載劑來配製。優選地，可以用適當的緩衝系統將眼用溶液保持在舒適的pH值。這些配方還可能含有常規的、藥學上可接受的防腐劑、穩定劑和表面活性劑。
可在本揭示的藥物組成物中使用的防腐劑包括但不限於，苯紮氯銨、PHMB、氯丁醇、硫柳汞、苯汞、醋酸鹽和硝酸苯汞。例如，Tween 80就是一種有用的表面活性劑。同樣，各種有用的載劑可用於本文所述的眼科製劑。這些載劑包括但不限於聚乙烯醇、聚維酮、羥丙基甲基纖維素、泊洛沙姆、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素和純淨水。
根據需要或方便，可以添加張力調節劑。它們包括但不限於鹽，特別是氯化鈉、氯化鉀、甘露醇和甘油，或任何其他適合的眼科可接受的補血調節劑。
只要所製備的製劑在眼科上是可接受的，就可以使用各種緩衝液和調節pH值的方法。對於許多組成物，pH值將在4到9之間。相應地，緩衝液包括醋酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液和硼酸鹽緩衝液。根據需要，酸或鹼可以用來調整這些配方的pH值。
眼科可接受的抗氧化劑包括但不限於焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、乙醯半胱胺酸、丁基羥基茴香醚和丁基羥基甲苯。
可以包括在眼科製劑中的其他賦形劑組分是螯合劑。一種有用的螯合劑是依地酸二鈉，雖然其他的螯合劑也可以用在合適的地方或與之聯合使用。
對於局部使用，可以使用含有本揭示內容的組成物，如面霜、軟膏、凝膠、溶液或懸浮液等。局部配方通常由藥物載劑、共溶劑、乳化劑、滲透增強劑、防腐劑系統和潤膚劑組成。
對於靜脈給藥，本文所述的組成物可以溶解或分散在藥物上可接受的稀釋劑中，例如生理鹽水或葡萄糖溶液。為了達到理想的pH值，可以加入適當的佐劑，包括但不限於氫氧化鈉、碳酸鈉、醋酸鈉、鹽酸和檸檬酸。在各種實施例中，最終組成物的pH值範圍為2至8，最好為4至7。抗氧化佐劑可能包括亞硫酸氫鈉、丙酮亞硫酸氫鈉、甲醛鈉、亞碸酸鈉、硫脲和EDTA。在最終的靜脈組成物中發現的其他非限制性的合適賦形劑可能包括磷酸鈉或鉀、檸檬酸、酒石酸、明膠和碳水化合物，如葡萄糖、甘露醇和右旋糖酐。其他可接受的賦形劑描述於Powell等人的《用於非腸道製劑的賦形劑簡編》(PDA J 藥物科學和技術，1998、52238-311)和Nema等人的《賦形劑及其在批准的可注射產品中的作用：當前的使用和未來的方向》(PDA J 藥學科學和技術2011,65 287-332)中，兩者在此全文引入作為參考。還可包括用於實現抑菌或抑菌溶液的抗菌劑，包括但不限於硝酸苯汞、硫柳汞撒、苯乙氯銨、苯甲氯銨、苯酚、甲酚和氯丁醇。還可包括用於實現抑菌或抑菌溶液的抗菌劑，包括但不限於硝酸苯汞、硫柳汞撒、苯乙氯銨、苯甲氯銨、苯酚、甲酚和氯丁醇。
靜脈內給藥的組成物可以以一種或多種固體的形式提供給護理者，所述固體在給藥前不久用合適的稀釋劑如無菌水、鹽水或葡萄糖在水中復原。在其他實施例中，所述組成物以溶液形式提供，可用於腸外注射。還有在其他實施例中，組成物以在給藥前進一步稀釋的溶液形式提供。在包括給藥本文所述化合物和另一藥劑的組合的實施例中，該組合可作為混合物提供給護理人員，或護理人員可在給藥前混合兩種藥劑，或兩種藥劑可分別給藥。
在一些實施例中，普那布林和抗CD47製劑以單獨的組成物給藥，普那布林組成物和抗CD47製劑使用相同的給藥途徑給藥。在其他實施例中，使用不同給藥途徑給藥普那布林組成物和抗CD47組成物。在一些實施例中，普那布林和抗CD47組成物都是靜脈注射的。在一些實施例中，普那布林和抗CD47組成物都是口服的。在一些實施例中，普那布林和抗CD47組成物均在瘤內給藥。在一些實施例中，靜脈注射普那布林組成物，口服抗CD47組成物。在一些實施例中，普那布林組成物靜脈注射和抗CD47組成物瘤內注射。在一些實施例中，口服普那布林組成物，靜脈注射抗CD47組成物。在一些實施例中，口服普那布林組成物，瘤內口服抗CD47組成物。在一些實施例中，瘤內給予普那布林組成物，靜脈給予抗CD47組成物。在一些實施例中，普那布林組成物瘤內給藥，抗CD47組成物口服給藥。
本文所述的活性化合物的實際劑量取決於所述特定化合物和所要處理的條件；合適劑量的選擇完全在本領域技術人員的知識範圍內。在一些實施例中，普那布林的劑量範圍約為1 mg/m 2至50 mg/m 2。在一些實施例中，普那布林以體表面積的1-50 mg/m 2的劑量給藥。在一些實施例中，在一些實施例中，普那布林約以體表面積的1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-13.75、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-22.5、1-25、1-27.5、1-30、1.5-2、1.5-3、1.5-4、1.5-5、1.5-6、1.5-7、1.5-8、1.5-9、1.5-10、1.5-11、1.5-12、1.5-13、1.5-13.75、1.5-14、1.5-15、1.5-16、1.5-17、1.5-18、1.5-19、1.5-20、1.5-22.5、1.5-25、1.5-27.5、1.5-30、2.5-2、2.5-3、2.5-4、2.5-5、2.5-6、2.5-7、2.5-8、2.5-9、2.5-10、2.5-11、2.5-12、2.5-13、2.5-13.75、2.5-14、2.5-15、2.5-16、2.5-17、2.5-18、2.5-19、2.5-20、2.5-22.5、2.5-25、2.5-27.5、2.5-30、2.5-7.5、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-13.75、3-14、3-15、3-16、3-17、3-18、3-19、3-20、3-22.5、3-25、3-27.5、3-30、3.5-6.5、3.5-13.75、3.5-15、2.5-17.5、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-13.75、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-22.5、4-25、4-27.5、4-30、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-13.75、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-22.5、5-25、5-27.5、5-30、6-7、6-8、6-9、6-10、6-11、6-12、6-13、6-13.75、6-14、6-15、6-16、6-17、6-18、6-19、6-20、6-22.5、6-25、6-27.5、6-3、7-8、7-9、7-10、7-11、7-12、7-13、7-13.75、7-14、7-15、7-16、7-17、7-18、7-19、7-20、7-22.5、7-25、7-27.5、7-30、7.5-12.5、7.5-13.5、7.5-15、8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-13.75、8-14, 8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、8-22.5、8-25、8-27.5、8-30、9-10、9-11、9-12、9-13、9-13.75、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-22.5、9-25、9-27.5、9-30、10-11、10-12、10-13、10-13.75、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19、10-20、10-22.5、10-25、10-27.5、10-30、11.5-15.5、12.5-14.5、7.5-22.5、8.5-32.5、9.5-15.5、15.5-24.5、5-35、17.5-22.5、22.5-32.5、25-35、25.5-24.5、27.5-32.5、2-20、2.5-22.5或9.5-21.5 mg/m 2的劑量給藥。在一些實施例中，普那布林約以體表面積的0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 mg/m 2的劑量給藥。在一些實施例中，普那布林約以小於體表面積的0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 mg/m 2的劑量給藥。在一些實施例中，普那布林約以大於體表面積的0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 mg/m 2的劑量給藥。
在一些實施例中，普那布林的劑量約為5 mg-300 mg、5 mg-200 mg、7.5 mg-200 mg、10 mg-100 mg、15 mg-100 mg、20 mg-100 mg、30 mg-100mg、40 mg-100 mg、10 mg-80 mg、15 mg-80 mg、20 mg-80 mg、30 mg-80 mg、40 mg-80 mg、10 mg-60 mg、15 mg-60 mg、20 mg-60 mg、30 mg-60 mg或約40 mg-60 mg。在一些實施例中，注射的普那布林約為20 mg-60 mg、27 mg-60 mg、20 mg-45 m或27 mg-45 mg。在一些實施例中，注射的普那布林約為5 mg-7.5 mg、5 mg-9 mg、5 mg-10 mg、5 mg-12mg、5mg-14mg、5mg-15 mg、5 mg-16 mg、5 mg-18 mg、5 mg-20 mg、5 mg-22 mg、5 mg-24 mg、5 mg-26 mg、5 mg-28mg、5mg-30mg、5mg-32mg、5mg-34mg、5mg-36mg、5mg-38mg、5mg-40mg、5mg-42mg、5mg-44mg、5mg-46mg、5mg-48mg、5mg-50mg、5mg-52mg、5mg-54mg、5mg-56mg、5mg-58mg、5mg-60mg、7 mg-7.7 mg、7 mg-9 mg、7 mg-10 mg、7 mg-12mg、7mg-14mg、7mg-15 mg、7 mg-16 mg、7 mg-18 mg、7 mg-20 mg、7 mg-22 mg、7 mg-24 mg、7 mg-26 mg、7 mg-28mg、7mg-30mg、7mg-32mg、7mg-34mg、7mg-36mg, 7mg-38mg, 7mg-40mg, 7mg-42mg, 7mg-44mg, 7mg-46mg, 7mg-48mg, 7mg-50mg、 7mg-52mg、7mg-54mg、7mg-56mg、7mg-58mg、7mg-60mg、9 mg-10 mg、9 mg-12mg、9mg-14mg、9mg-15 mg、9 mg-16 mg、9 mg-18 mg、9 mg-20 mg、9 mg-22 mg、9 mg-24 mg、9 mg-26 mg、9 mg-28mg、9mg-30mg、9mg-32mg、9mg-34mg、9mg-36mg、9mg-38mg、9mg-40mg、9mg-42mg、9mg-44mg、9mg-46mg、9mg-48mg、9mg-50mg、9mg-52mg、9mg-54mg、9mg-56mg、9mg-58mg、9mg-60mg、10 mg-12mg、10mg-14mg、10mg-15 mg、10 mg-16 mg、10 mg-18 mg、10 mg-20 mg、10 mg-22 mg、10 mg-24 mg、10 mg-26 mg、10 mg-28mg、10mg-30mg、10mg-32mg、10mg-34mg、10mg-36mg、10mg-38mg、10mg-40mg、10mg-42mg、10mg-44mg、10mg-46mg、10mg-48mg、10mg-50mg、10mg-52mg、10mg-54mg、10mg-56mg、10mg-58mg、10mg-60mg、12mg-14mg、12mg-15 mg、12 mg-16 mg、12 mg-18 mg、12 mg-20 mg、12 mg-22 mg、12 mg-24 mg、12 mg-26 mg、12 mg-28mg、12mg-30mg、12mg-32mg、12mg-34mg、 12mg-36mg、12mg-38mg、12mg-40mg、12mg-42mg、12mg-44mg、12mg-46mg、12mg-48mg、12mg-50mg、12mg-52mg、12mg-54mg、12mg-56mg、12mg-58mg、12mg-60mg、15 mg-16 mg、15 mg-18 mg、15 mg-20 mg、15 mg-22 mg、15 mg-24 mg、15 mg-26 mg、15 mg-28mg、15mg-30mg、15mg-32mg, 15mg-34mg, 15mg-36mg, 15mg-38mg, 15mg-40mg, 15mg-42mg, 15mg-44mg、15mg-46mg、15mg-48mg、15mg-50mg、15mg-52mg、15mg-54mg、15mg-56mg、15mg-58mg、15mg-60mg、17 mg-18 mg、17 mg-20 mg、17 mg-22 mg、17 mg-24 mg、17 mg-26 mg、17 mg-28mg、17mg-30mg、17mg-32mg、17mg-34mg、17mg-36mg、17mg-38mg、17mg-40mg、17mg-42mg、17mg-44mg、17mg-46mg、17mg-48mg、17mg-50mg、17mg-52mg、17mg-54mg、17mg-56mg、17mg-58mg、17mg-60mg、20 mg-22 m、20 mg-24 m、20 mg-26 mg、20 mg-28mg、20mg-30mg、20mg-32mg、20mg-34mg、20mg-36mg、20mg-38mg、20mg-40mg、20mg-42mg、 20mg-44mg、20mg-46mg、20mg-48mg、20mg-50mg、20mg-52mg、20mg-54mg、20mg-56mg、20mg-58mg、20mg-60mg、22 mg-24 mg、22 mg-26 mg、22 mg-28mg、22mg-30mg、22mg-32mg、22mg-34mg、22mg-36mg、22mg-38mg、22mg-40mg、22mg-42mg、22mg-44mg、22mg-46mg、22mg-48mg、22mg-50mg、22mg-52mg、22mg-54mg、22mg-56mg、22mg-58mg、22mg-60mg、25 mg-26 mg、25 mg-28mg、25mg-30mg、25mg-32mg、25mg-34mg、25mg-36mg、25mg-38mg、25mg-40mg、25mg-42mg、25mg-44mg、25mg-46mg、25mg-48mg、25mg-50mg、25mg-52mg、25mg-54mg、25mg-56mg、25mg-58mg、25mg-60mg、27 mg-28mg、27mg-30mg、27mg-32mg、27mg-34mg、27mg-36mg、27mg-38mg、27mg-40mg、27mg-42mg、27mg-44mg、27mg-46mg、27mg-48mg、27mg-50mg、27mg-52mg、27mg-54mg、27mg-56mg、27mg-58mg、27mg-60mg、30mg-32mg、30mg-34mg、30mg-36mg、30mg-38mg、30mg-40mg、30mg-42mg、30mg-44mg、30mg-46mg、30mg-48mg、30mg-50mg、30mg-52mg、30mg-54mg、30mg-56mg、30mg-58mg、30mg-60mg、33mg-34mg、33mg-36mg、33mg-38mg、33mg-40mg、33mg-42mg、33mg-44mg、33mg-46mg、33mg-48mg、33mg-50mg、33mg-52mg、33mg-54mg、33mg-56mg、33mg-58mg、33mg-60mg、36mg-38mg、36mg-40mg、36mg-42mg、36mg-44mg、36mg-46mg、36mg-48mg、36mg-50mg、36mg-52mg、36mg-54mg、36mg-56mg、36mg-58mg、36mg-60mg、40mg-42mg、40mg-44mg、40mg-46mg, 40mg-48mg, 40mg-50mg, 40mg-52mg, 40mg-54mg, 40mg-56mg, 40mg-58mg、40mg-60mg、43mg-46mg、43mg-48mg、43mg-50mg、43mg-52mg、43mg-54mg、43mg-56mg、43mg-58mg、42mg-60mg、45mg-48mg、45mg-50mg、45mg-52mg、45mg-54mg、 45mg-56mg、45mg-58mg、45mg-60mg、48mg-50mg、48mg-52mg、48mg-54mg、48mg-56mg、48mg-58mg、48mg-60mg、50mg-52mg、50mg-54mg、50mg-56mg、50mg-58mg、50mg-60mg、52mg-54mg、52mg-56mg、52mg-58mg或52mg-60mg。在一些實施例中，普那布林的劑量約大於5 mg、10 mg、12.5 mg、13.5 mg、15 mg、17.5 mg、20 mg、22.5 mg、25 mg、27 mg、30 mg、40、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90、100 mg、125 mg、150mg或200 mg。在一些實施例中，普那布林的劑量約少於5 mg、10 mg、12.5 mg、13.5 mg、15 mg、17.5 mg、20 mg、22.5 mg、25 mg、27 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、125 mg、150mg或200 mg。
在一些實施例中，與CD47結合的一種或多種單株抗體的每日劑量可約為體重的100µg/kg至約100µg/kg或以上，約0.5µg/kg或以下至約1 mg/kg，約1.0µg/kg到約100 mg/kg，或從約1.0 mg/kg到約50 mg/kg。在一些實施例中，與CD47結合的一種或多種單株抗體的每日劑量可以為約0.1 mg到約150 mg/劑，約0.5 mg或更少至約100 mg/劑，約1.0 mg至約75 mg/劑，或約35 mg到約50 mg/劑。
在一些實施例中，抗CD47劑可以以約1 mg/kg至約50 mg/kg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47劑的劑量範圍約為1-50 mg/kg。抗CD47劑可以以1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-13.75、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-22.5、1-25、1-27.5、1-30、1.5-2、1.5-3、1.5-4、1.5-5、1.5-6、1.5-7、1.5-8、1.5-9、1.5-10、1.5-11、1.5-12、1.5-13、1.5-13.75、1.5-14、1.5-15、1.5-16、1.5-17、1.5-18、1.5-19、1.5-20、1.5-22.5、1.5-25、1.5-27.5、1.5-30、2.5-2、2.5-3、2.5-4、2.5-5、2.5-6、2.5-7、2.5-8、2.5-9、2.5-10、2.5-11、2.5-12、2.5-13、2.5-13.75、2.5-14、2.5-15、2.5-16、2.5-17、2.5-18、2.5-19、2.5-20、2.5-22.5、2.5-25、2.5-27.5、2.5-30、2.5-7.5、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-13.75、3-14、3-15、3-16、3-17、3-18、3-19、3-20、3-22.5、3-25、3-27.5、 3-30、3.5-6.5、3.5-13.75、3.5-15、2.5-17.5、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-13.75、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-22.5、4-25、4-27.5、4-30、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-13.75、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-22.5、5-25、5-27.5、5-30、6-7、6-8、6-9、6-10、6-11、6-12、6-13、6-13.75、6-14、6-15、6-16、6-17、6-18、6-19、6-20、6-22.5、6-25、6-27.5、6-30、7-8、7-9、7-10、7-11、7-12、7-13、7-13.75、7-14、7-15、7-16、7-17、7-18、7-19、7-20、7-22.5、7-25、7-27.5、7-30、7.5-12.5、7.5-13.5、7.5-15、8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-13.75、8-14、8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、8-22.5、8-25、8-27.5、8-30、9-10、9-11、9-12、9-13、9-13.75、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-22.5、9-25、9-27.5、9-30、10-11、10-12、10-13、10-13.75、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19、10-20、10-22.5、10-25、10-27.5、10-30、11.5-15.5、12.5-14.5、7.5-22.5、8.5-32.5、9.5-15.5、15.5-24.5、5-35、17.5-22.5、22.5-32.5、25-35、25.5-24.5、27.5-32.5、2-20, t 2.5-22.5或9.5-21.5 mg/kg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47可以以約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45 mg/kg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47製劑可以以約少於0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 mg/kg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47製劑可以以約大於0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 mg/kg的劑量給藥。
在一些實施例中，抗CD47製劑的劑量約為0.5 mg-3000 mg、0.5 mg-2500 mg、0.5 mg-2000 mg、0.5 mg-1500 mg、0.5 mg-1000 mg、0.5 mg-500 mg、0.5 mg-200 mg、0.75 mg-200 mg、1.0 mg-100 mg、1.5 mg-100 mg、2.0 mg-100mg、3.0 mg-100 mg、4.0 mg-100 mg、1.0 mg-80 mg、1.5 mg-80 mg、2.0 mg-80 mg、3.0mg-80 mg、4.0 mg-80 mg、1.0 mg-60 mg、1.5 mg-60 mg、2.0 mg-60 mg、3.0 mg-60 mg或約4.0 mg-60 mg。在一些實施例中，抗CD47製劑以20 mg-60mg、27 mg-60 mg、20 mg-45 mg或27 mg-45 mg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47製劑大約以5 mg-7.5 mg、5 mg-9 mg、5 mg-10 mg、5 mg-12mg、5mg-14mg、5mg-15 mg、5 mg-16 mg、5 mg-18 mg、5 mg-20 mg、5 mg-22 mg、5 mg-24 mg、5 mg-26 mg、5 mg-28mg、5mg-30mg、5mg-32mg、5mg-34mg、5mg-36mg、5mg-38mg、5mg-40mg、5mg-42mg、5mg-44mg、5mg-46mg、5mg-48mg、5mg-50mg、5mg-52mg、5mg-54mg、5mg-56mg、5mg-58mg、5mg-60mg、7 mg-7.7 mg、7 mg-9 mg、7 mg-10mg、7 mg-12mg、7mg-14mg、7mg-15 mg、7 mg-16 mg、7 mg-18 mg、7 mg-20 mg、7 mg-22 mg、7 mg-24 mg、7 mg-26 mg、7 mg-28mg、7mg-30mg、7mg-32mg、7mg-34mg、7mg-36mg、7mg-38mg、7mg-40mg、7mg-42mg、7mg-44mg、7mg-46mg、7mg-48mg、7mg-50mg、7mg-52mg、7mg-54mg、7mg-56mg、7mg-58mg、7mg-60mg、9 mg-10 mg、9 mg-12mg、9mg-14mg、9mg-15 mg、9 mg-16 mg、9 mg-18 mg、9 mg-20 mg、9 mg-22 mg、9 mg-24 mg、9 mg-26 mg、9 mg-28mg、9mg-30mg、9mg-32mg、9mg-34mg、9mg-36mg、9mg-38mg、9mg-40mg、9mg-42mg、9mg-44mg、9mg-46mg、9mg-48mg、9mg-50mg、9mg-52mg、9mg-54mg、9mg-56mg、9mg-58mg、9mg-60mg、10 mg-12mg、10mg-14mg、10mg-15 m、10 mg-16mg、10 mg-18 mg、10mg-20 mg、10 mg-22 mg、10 mg-24 mg、10mg-26 mg、10 mg-28mg、10mg-30mg、10mg-32mg、10mg-34mg、10mg-36mg、10mg-38mg、10mg-40mg、10mg-42mg、10mg-44mg、10mg-46mg、10mg-48mg、10mg-50mg、10mg-52mg、10mg-54mg、10mg-56mg、10mg-58mg、10mg-60mg、12mg-14mg、12mg-15 mg、12 mg-16 mg、12 mg-18 mg、12 mg-20 mg、12 mg-22 mg、12mg-24mg、12mg-26mg、12mg-28mg、12mg-30mg、12mg-32mg、12mg-34mg、12mg-36mg、12mg-38mg、12mg-40mg、12mg-42mg、12mg-44mg、12mg-46mg、12mg-48mg、12mg-50mg、12mg-52mg、12mg-54mg、12mg-56mg、12mg-58mg、12mg-60mg、15mg-16 mg、15mg-18mg、15 mg-20 mg、15 mg-22 mg、15 mg-24 mg、15 mg-26 mg、15 mg-28mg、15mg-30mg、15mg-32mg、15mg-34mg、15mg-36mg、15mg-38mg、15mg-40mg、15mg-42mg、15mg-44mg、15mg-46mg、15mg-48mg、15mg-50mg、15mg-52mg、15mg-54mg、15mg-56mg、15mg-58mg、15mg-60mg、17 mg-18 mg、17 mg-20 mg、17 mg-22 mg、17 mg-24 mg、17 mg-26mg、17mg-28mg、17mg-30mg、17mg-32mg、17mg-34mg、17mg-36mg、17mg-38mg、17mg-40mg、17mg-42mg、17mg-44mg、17mg-46mg、17mg-48mg、17mg-50mg、17mg-52mg、17mg-54mg、17mg-56mg、17mg-58mg、17mg-60mg、20 mg-22 mg、20 mg-24 mg、20 mg-26 mg、20 mg-28mg、20mg-30mg、20mg-32mg、20mg-34mg、20mg-36mg、20mg-38mg、20mg-40mg、20mg-42mg、20mg-44mg、20mg-46mg、20mg-48mg、20mg-50mg、20mg-52mg、20mg-54mg、20mg-56mg、20mg-58mg、20mg-60mg、22 mg-24 mg、22 mg-26 mg、22 mg-28mg、22mg-30mg、22mg-32mg、22mg-34mg、22mg-36mg、22mg-38mg、22mg-40mg、22mg-42mg、22mg-44mg、22mg-46mg、22mg-48mg、22mg-50mg、22mg-52mg、22mg-54mg、22mg-56mg、22mg-58mg、22mg-60mg、25 mg-26 mg、25 mg-28mg、25mg-30mg、25mg-32mg、25mg-34mg、 25mg-36mg、25mg-38mg、25mg-40mg、25mg-42mg、25mg-44mg、25mg-46mg、25mg-48mg、25mg-50mg、25mg-52mg、25mg-54mg、25mg-56mg、25mg-58mg、25mg-60mg、27 mg-28mg、27mg-30mg、27mg-32mg、27mg-34mg、27mg-36mg、27mg-38mg、27mg-40mg、27mg-42mg、27mg-44mg、27mg-46mg、27mg-48mg、27mg-50mg、27mg-52mg、27mg-54mg、27mg-56mg、27mg-58mg、27mg-60mg、30mg-32mg、30mg-34mg、30mg-36mg、30mg-38mg、30mg-40mg、30mg-42mg、30mg-44mg、30mg-46mg、30mg-48mg、30mg-50mg、30mg-52mg、30mg-54mg、30mg-56mg、30mg-58mg、30mg-60mg、33mg-34mg、33mg-36mg、33mg-38mg、33mg-40mg、33mg-42mg、33mg-44mg、33mg-46mg、33mg-48mg、33mg-50mg、33mg-52mg、33mg-54mg、33mg-56mg、33mg-58mg、33mg-60mg、36mg-38mg、36mg-40mg、36mg-42mg、36mg-44mg、36mg-46mg、36mg-48mg、36mg-50mg、36mg-52mg、36mg-54mg、36mg-56mg、36mg-58mg、36mg-60mg、40mg-42mg、40mg-44mg、40mg-46mg、40mg-48mg、40mg-50mg、40mg-52mg、40mg-54mg、40mg-56mg、40mg-58mg、40mg-60mg、43mg-46mg、43mg-48mg、43mg-50mg、 43mg-52mg、43mg-54mg、43mg-56mg、43mg-58mg、42mg-60mg、45mg-48mg、45mg-50mg、45mg-52mg、45mg-54mg、45mg-56mg、45mg-58mg、45mg-60mg、48mg-50mg、48mg-52mg、48mg-54mg、48mg-56mg、48mg-58mg、48mg-60mg、50mg-52mg、50mg-54mg、50mg-56mg、50mg-58mg、50mg-60mg、52mg-54mg、52mg-56mg、52mg-58mg、52mg-60mg、100mg-200mg、200mg-300mg、300mg-400mg、400mg-500mg、500mg-1000mg、1000mg-2000mg或1000mg-3000mg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47製劑以約大於5 mg、10 mg、12.5 mg、13.5 mg、15 mg、17.5 mg、20 mg、22.5 mg、25 mg、27 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、125 mg、150mg或200 mg的劑量給藥。在一些實施例中，抗CD47製劑以約少於5 mg、10 mg、12.5 mg、13.5 mg、15 mg、17.5 mg、20 mg、22.5 mg、25 mg、27 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、125 mg、150mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、1000 mg、2000 mg或3000 mg的劑量給藥。
在一些實施例中，抗CD47製劑的初始劑量為第1天1 mg/kg，隨後每週45 mg/kg。
在一些實施例中，在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之前給藥普那布林。在一些實施例中，普那布林與抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物同時給藥。在一些實施例中，在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之後給藥普那布林。
在一些實施例中，普那布林在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之後約1 min、5min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、24h、30h、36h、40h或48h給藥。在一些實施例中，普那布林在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之後約少於1 min、5min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、30h、36h、40h或48h給藥。在一些實施例中，普那布林在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之後約多於1 min、5min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、30h、36h、40h或48h給藥。在一些實施例中，普那布林在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之後約1min-5min、1min-10min、1min-15min、1min-20min、1 min-25min、1 min-30min、0.25h-0.5h、0.25-0.75h、0.25-1h、0.5h-1h、0.5h-2h、0.5h-2.5h、1h-2h、1h-3h、1h-5h、1h-24h、1min-24h或1 min-2h、1-2天、1-3天、1-4天、1-5天或1-6天給藥。
在一些實施例中，當在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之前給藥普那布林時，在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之前約1min-5min、1min-10min、1min-15min、1min-20min、1 min-25min、1 min-30min、0.25h-0.5h、0.25-0.75h、0.25-1h、0.5h-1h、0.5h-2h、0.5h-2.5h、1h-2h、1h-3h、1h-5h、1h-24h、1min-1h、1min-2h、1min-5h、1min-24h、1-2天、1-3天、1-4天、1-5或-6天給藥普那布林。在一些實施例中，在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之前約1 min、5min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、30h、36h、40h、48h、4天、5天、6天或7天給藥普那布林。在一些實施例中，在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之前約少於1 min、5min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、30h、36h、40h、48h、4天、5天、6天或7天給藥普那布林。在一些實施例中，在給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物之前約多於1 min、5min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、30h、36h、40h、48h、4天、5天、6天或7天給藥普那布林。
在一些實施例中，治療計畫包括每3周聯合給藥一次抗CD47製劑或抗CD47藥物組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周聯合給藥一次抗CD47製劑或抗CD47藥物組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周兩次聯合給藥抗CD47劑或抗CD47抗體和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中每1周聯合給藥抗CD47試劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中每1周兩次聯合給藥抗CD47試劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在21天治療週期的第1天、第8天和第15天聯合給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物和普那布林的共給藥包括在給藥普那布林之前給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體。在一些實施例中，抗CD47劑或抗CD47抗體組成物與普那布林的共給藥包括在給藥普那布林之後給藥抗CD47劑或抗CD47抗體。在一些實施例中，抗CD47劑或抗CD47抗體組成物和普那布林的共給藥包括同時給藥抗CD47劑或抗CD47抗體和普那布林。在一些實施例中，本段所述的抗CD47劑或抗CD47抗體組合可分別為第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八抗CD47製劑或抗CD47抗體。在一些實施例中，治療計畫包括每週每天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物和普那布林，持續使用一周。在一些實施例中，治療計畫包括2周、3周或4周每天聯合使用抗CD47劑或抗CD47抗體組合和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組合和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天和第2天聯合給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天和第3天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天和第4天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第3天和第5天聯合給藥抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物和普那布林。在一些實施例中，每個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體可以相同或不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與其餘給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與第二個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體相同或不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與第三個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體相同或不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與第四個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體相同或不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與第五個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體相同或不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與第六個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體相同或不同。在一些實施例中，第一個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體與第七個給藥日使用的抗CD47製劑或抗CD47抗體相同或不同。
在一些實施例中，治療計畫包括每3周給藥一次抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物(例如，第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8)。在一些實施例中，治療計畫包括每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周給藥一次抗CD47劑或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周兩次使用抗CD47劑或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中，每1周給藥一次抗CD47劑或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中，每1周給藥兩次抗CD47劑或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中，每1周給藥三次(例如第1、2、3天或第1、3、5天)抗CD47劑或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在21天的治療週期中，第1天、第8天和第15天給藥抗CD47劑或抗CD47抗體組成物。本段所述的抗CD47劑或抗CD47抗體組成物可分別為第一、二、三、四、五、六、七、八種抗CD47製劑或抗CD47抗體。在一些實施例中，治療計畫包括每週每天給藥抗CD47劑或抗CD47抗體組成物，持續給藥一周。在一些實施例中，治療計畫包括每週每天給藥抗CD47劑或抗CD47抗體組成物，持續給藥2周、3周或4周。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天和第2天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天和第3天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第3天和第5天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天和第4天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天給藥抗CD47藥物或抗CD47抗體組成物。
在一些實施例中，治療計畫包括每3周給藥一次普那布林。在一些實施方案中，治療計畫包括1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周給藥1次普那布林。在一些實施方案中，治療計畫包括1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周給藥2次普那布林。在一些實施方案中，治療計畫包括1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中，每1周給藥一次普那布林。在一些實施方案中，治療計畫包括1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中，每1周給藥兩次普那布林。在一些實施方案中，治療計畫包括1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的治療週期中，每1周給藥三次普那布林(例如第1、2、3天或第1、3、5天)。在一些實施例中，治療計畫包括在21天的治療週期中，第1天、第8天和第15天給藥普那布林。本段所述的抗CD47劑或抗CD47抗體組成物可分別為第一、二、三、四、五、六、七、八種抗CD47製劑或抗CD47抗體組成物。在一些實施例中，治療計畫包括連續一周每週每天服用普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在2周、3周或4周內每週每天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天和第2天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天和第3天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第3天和第5天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天和第4天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天給藥普那布林。在一些實施例中，治療計畫包括在每週治療的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天給藥普那布林。
只要治療方案是臨床耐受的，治療週期可以重複。在一些實施例中，抗CD47劑或抗CD47抗體和普那布林的治療週期重複n次，其中n為2～30範圍內的整數。在一些實施例中，n為2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，新治療週期可在前一個治療週期完成後立即發生。在一些實施例中，新治療週期可以在前一個治療週期完成後的一段時間內發生。在一些實施例中，在前一個治療週期結束後的1周、2周、3周、4周、5周、6周或7周後可以進行新的治療週期。
本文揭示的組成物的給藥可以透過任何可接受的給藥方式來進行，所述給藥方式用於類似的用途，包括但不限於口服、皮下、頰面、皮下、靜脈內、鼻內、瘤內、局部、經皮、腹膜內、肌內，肺內、陰道內、直腸內、胃內或眼內。口服和非腸道給藥在處理作為一些實施例的受試者的適應症時是慣用的。
在一些實施例中，本文所述的組成物可與其他治療製劑聯合使用。在一些實施例中，本發明所述的組成物可以與化療、放療和生物療法等療法結合給藥或使用。
為了進一步說明本發明，包括以下實施例。當然，實施例不應被解釋為具體限制本發明。在請求項範圍內的這些實施例的變化屬於本領域技術人員的許可權範圍，並被認為屬於所述的範圍，並在此提出權利要求。讀者將認識到，具有本揭示的技術人員和本領域的技術人員能夠在沒有詳盡示例的情況下製備和使用本發明。 實施例 實施例 1– 抗 CD47 / 普那布林協同作用
普那布林可放大M1抗癌巨噬細胞的存在和功能，包括其吞噬活性。透過使用CD47抗體(抗CD47)與癌細胞上的CD47結合，阻斷信號調節蛋白α(SIRPα)對巨噬細胞的活化，增加巨噬細胞對癌細胞的吞噬和毒殺。本研究透過巨噬細胞的吞噬作用，證實了普那布林和抗CD47在腫瘤細胞吞噬中的協同作用，無論可活化Fc受體的腫瘤細胞抗原的抗體存在或不存在。
無論是否具有辨識腫瘤細胞抗原的抗體，普那布林與抗CD47的協同作用是在體外利用人類原發性非霍奇金淋巴瘤(NHL)細胞或CFSE標記的NHL細胞株進行吞噬試驗來評估的。這些CFSE標記的細胞與小鼠或人類巨噬細胞一起培育，所述巨噬細胞經載體對照或普那布林預處理(可能以4：1的靶：效應細胞比例)。在IgG1同型對照或抗CD47抗體(可能是選殖株B6H12.2、BRIC126或2D3)存在的情況下，將癌細胞與預處理的巨噬細胞一起培育2小時，並加入或加入利妥昔單抗，如前面所述(Majeti等人，2009，細胞，138:286-299，其全文全部引入作為參考)。小鼠和人類巨噬細胞也如前所述製備。BALB/c或Fcγr-/-(Taconic, Hudson，紐約，美國)小鼠骨髓單核細胞分化為小鼠巨噬細胞。實驗結束時，用螢光顯微鏡分析細胞以確定吞噬指數(指100個吞噬細胞攝取的細胞數量)。
更具體地說(如Chao等人，2010，細胞，142:699-713中所述，引入全文作為參考)，體外吞噬實驗是用不同濃度或劑量的抗CD47抗體(B6H12.2)(1-10μg/ml)培養的NHL細胞來進行，並加入或不加入固定濃度的抗CD20 IgG2a或利妥昔單抗。將這些抗體與小鼠或人類巨噬細胞培育的NHL細胞用普那布林載體或不同濃度的普那布林預處理24-48小時，濃度為10 nM到1μg/ml。對於每一種細胞類型，需要確定抗CD47抗體和普那布林的濃度來產生明確的單藥效應，而不是陰性對照(吞噬指數)。將達到相同吞噬指數的藥物聯合濃度繪製在等波圖上，並確定聯合指數(CI)。根據公式CI=(d1/D1)+ (d2/D2)計算CI，其中d1=藥物1聯合達到吞噬指數的劑量，d2=藥物2聯合達到吞噬指數的劑量，D1=藥物1單獨達到吞噬指數的劑量，D2=藥物2單獨達到吞噬指數的劑量。CI小於、等於和大於1分別表示協同作用、可加性和拮抗性。
在單獨但類似的研究中，用曲妥珠單抗代替利妥昔單抗，用SKBR 3Her2過度表現乳腺癌細胞代替NHL細胞，以進一步評估普那布林增強抗CD47和腫瘤標靶抗體對巨噬細胞吞噬活性作用的能力。 實施例 2– 普那布林對巨噬細胞的影響
促進腫瘤生長的M2表現型在腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAM)中占主導地位，與不良預後相關。由於M1極化巨噬細胞具有抗腫瘤功能，因此巨噬細胞的體內重新編程被認為是一種很有前景的癌症治療策略。TAMs從M2到M1的交替極化可能引發腫瘤特異性免疫反應。本研究探討了普那布林對巨噬細胞功能的影響。
BI/6小鼠皮下注射1x106MC38腫瘤細胞，當腫瘤在50-80 mm3範圍內時，每隔一天注射3次普那布林(15mg/kg)。第一次給藥普那布林後7天切除腫瘤，並使用小鼠標記物CD45、CD11b、Ly6G、ly6C和CD206在流式細胞儀上進行分析。巨噬細胞的特徵為:CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C-L/D-。結果如圖1A所示，與未處理細胞相比，普那布林提高了M1/M2比值。C57BI/6和Rag-/-小鼠皮下注射1×105 MC38腫瘤細胞，腫瘤在50-80mm3範圍內用普那布林(7 mg/kg)或載體處理。總生存率如圖1B所示，這表明普那布林處理的野生型小鼠的生存率最高。
從MC38荷瘤小鼠中分離出的腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)、從C57BI/6小鼠中分離出的骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)和從PBMCs中分離出的人類單核源性巨噬細胞分別用10、100、200和1000 nM普那布林處理。在人類巨噬細胞治療48,72和96小時、小鼠腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)和骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)治療72小時後，用流式細胞術分析M1和M2標記物的表現。用小鼠抗CD206和人類抗CD163抗體區分M2，用小鼠抗CD86或小鼠抗CD80和人抗CD86抗體區分M1。小鼠和人IFNγ+LPS和IL-4分別將巨噬細胞極化至M1或M2。圖2A顯示了TAM和BMDM巨噬細胞的M1/M2比值，並證明普那布林將巨噬細胞極化至M1的有效性。圖2B顯示了單核細胞來源的巨噬細胞的M1/M2比值，並證明了普那布林將巨噬細胞極化至M1的有效性。
用25ng IL-4 (M2對照)、50ng IFNγ+10ng LPS (M1對照)、10，200和1000nM 普那布林處理單核細胞來源的巨噬細胞。72小時後，處理後的巨噬細胞與鈣黃綠素標記的NA8-mel腫瘤細胞按E:T比例1:2共培養。2小時後用抗人類CD14-APC和CD11b-PE抗體透過流式細胞術分析吞噬作用。抗人類CD47(10μg/ml)與巨噬細胞和腫瘤一起培育，並作為陽性對照以阻斷“別吃我”的信號。CD14+CD11b+：巨噬細胞；Calcein+CD11b+：吞噬作用。用普那布林的巨噬細胞能夠誘導腫瘤細胞的吞噬作用。結果如圖3所示。
用200nM普那布林或LPS+ IFN γ處理人類單核細胞來源的巨噬細胞4、6、8、18、20、24和48小時。收集上層清液透過LEGENDplex進行細胞因子分析，收集細胞mRNA進行qPCR分析。普那布林治療48小時後，IL-1b、IL-6和IL-12p40 (M1標記物)蛋白積累增加，而IL-1b和iNOS mRNA早在6小時就被誘導。在M2標記物中，普那布林治療20小時後，在mRNA位準上觀察到Egr2、Tgfb、IL-4、CCL17和IL-10的降低。結果如圖4所示。 實施例 3– 小鼠和人類巨噬細胞的體外分化和治療
MC38小鼠細胞株由Medizinischen Hochschule Hannover的Thomas Wirth提供。小鼠EMT6細胞株和人HuT 78細胞株均購自ATCC。小鼠細胞株在含有l-麩醯胺酸(Sigma-Aldrich, D6429)的DMEM培養基中培養，並添加10%的FCS (Pan Biotech, P30-5500)、1X MEM必要胺基酸(Sigma-Aldrich, M7145)和1X青黴素/鏈黴素(Sigma-Aldrich, P4333)。HuT 78人細胞株維持在含有l-麩醯胺酸(R8758, Sigma-Aldrich) 的RPMI培養基中、其中補充了青黴素/鏈黴素(100 ng/ml, Sigma-Aldrich)和10%胎牛血清(Sigma-Aldrich)。
C57BL/6N野生型小鼠取自生物醫學系的育種機構或法國Janvier實驗室。Rag2-/- C57BL/6N小鼠在本系生物醫學實驗室培育。所有的動物都是根據機構指導方針飼養的，所有的實驗都是按照瑞士聯邦規定進行的(巴塞爾Kantonal許可證證號：2370和2408)。所有的實驗都是在8-16周齡的小鼠身上進行的，雄性和雌性都使用，對結果沒有影響。所有的動物都被維持在12小時的光照週期內，並給予自由供應的食物和水。
透過密度梯度離心，使用Histopaque (Sigma-Aldrich, 10771)從健康獻血者(瑞士巴塞爾大學醫院血庫)的白血球層中分離出人類外周血單核細胞(PBMCs)。新鮮的腫瘤樣本取自瑞士巴塞爾大學醫院接受腫瘤切除的兩名卵巢癌患者。病人的特點歸納如表2所示。該研究得到了當地倫理審查委員會(Ethikkommission Nordwestschweiz)和瑞士巴塞爾大學醫院的批准。所有患者均同意將其腫瘤樣本用於研究。新鮮的腫瘤標本在切除後直接機械分離和消化，使用漆酶 (Innovative Cell Technologies, AT-104)、膠原酶IV (Worthington, LS004188)、透明質酸酶(Sigma-Aldrich, H6254)和DNAse IV型(Sigma-Aldrich, D5025)。製備單細胞懸浮液，將樣品保存在中，待進一步使用。在接下來的試驗中，卵巢癌樣品的單細胞懸浮液保持在含有l-麩醯胺酸(Sigma-Aldrich, R8758) 的RPMI培養基中，其中補充了1倍青黴素/鏈黴素(Sigma-Aldrich, P4333)和10%胎牛血清(Pan Biotech, P30-5500)。 表2
標的基因 正向引子 反向引子
Ccl17 GTGGTACCAGACATCTGAGGC CTCTCTTGTTGTTGGGGTCCG
Egr2 CAACATCTACCCGGTGGAGGAC GATGCCTGCACTCACAATATTG
Gapdh ACCCAGAAGACTGTGGATGG TCTAGACGGCAGGTCAGGTC
Il10 CTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTC ATTCTTCACCTGCTCCACGGCCTT
Il1 GATAAGCCCACTCTACAGCTGG GAAGACGGGCATGTTTTCTGCTTG
Il4 CCGAGTTGACCGTAACAGACATC GCACCCAGGCAGCGAGTGTC
Inos AGGGACAAGCCTACCCCTC CTCATCTCCCGTCAGTTGGT
Tgfb1 CCCAGCATCTGCAAAGCTC GTCAATGTACAGCTGCCGCA
C57BL/6N WT或C57BL/6N Rag2-/-小鼠右側皮下注射500,000 MC38細胞，這些細胞懸浮在無酚紅DMEM(無添加劑)中。第18天(命名為第0天)，患有MC38腫瘤(40–80 mm 3)的小鼠腹腔注射普那布林(7.0 mg/kg, Beyondspring)、載體(DMSO)或在第0、1、2、4、7、9、11天不注射。根據公式D/2*d*d計算腫瘤體積，其中D和d分別為最長和最短的腫瘤直徑，單位為mm。在一些實驗中，注射普那布林7.5 mg/kg(每天2劑，每週3次)第7天犧牲小鼠後，收集腫瘤並使用流式細胞術進行分析。
在小鼠巨噬細胞分化中，從C57BL/6N WT小鼠中分離出骨髓細胞，在添加20 ng/mL小鼠巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF, Peprotech, 315-02)的完全RPMI中，37℃培養7天，將細胞分化為巨噬細胞。培養第4天，添加4mL RPMI完全培養基，輔以MCSF (最終濃度20ng/ml)。第7天，用冷PBS洗滌細胞，並與含有EDTA (2mM, Sigma-Aldrich)的PBS培育。將10萬個細胞置於含20 ng/mL M-CSF的完整RPMI 96孔盤中，37℃過夜。接下來，用不同濃度的普那布林(Beyondspring)或載體(0.1% DMSO)處理細胞48或72小時。
另外，從已建立的MC38腫瘤中分離出腫瘤浸潤性巨噬細胞，透過收集腫瘤，如下文所述，對其進行機械和酶消化，並對CD11b+ F4/80+細胞進行FACS分類。然後用200 nM或1000 nM普那布林體外處理TAMs 48小時。
在人類巨噬細胞的分化中，使用MACS分離套組(Miltenyi Biotec，130-050-201)，按照製造商的說明，透過陽性選擇從健康的人源PBMCs中分離CD14+細胞，並使用50 ng/ml的人類M-CSF (Peprotech, 300-25)處理6天。培養第3天，用含50 ng/mL M-CSF的新鮮培養基替換培養基。然後對細胞進行計數，以每孔20萬個細胞的密度將細胞植入96孔盤中，並在普那布林處理前過夜。在JNK抑制劑SP600125(20μM或40μM劑量，Selleckchem)存在或不存在的情況下，用不同劑量的普那布林在37℃下處理細胞48或72小時。
透過將上述獲得的腫瘤單細胞懸浮液解凍，從卵巢癌樣本中獲得人類巨噬細胞初代細胞，並使用BD Fortessa對CD11b+CD14+細胞進行FACS篩選。然後對細胞進行計數，以每種情況下200,000個細胞將細胞植入含有50 ng/ml M-CSF的RPMI培養基中，在37℃條件下用普那布林處理或對照處理48小時。
在所有情況下，作為對照條件，用LPS(小鼠體外Gen-20 ng/mL，人體實驗10 ng/mL)和IFNγ(50 ng/mL, Peptrotech)組成物或IL-4(小鼠20 ng/mL，人體實驗25 ng/mL；Peprotech)處理小鼠或人類巨噬細胞，分別誘導類似於M1的或類似於M2的極化。這些培養物的培養基中還添加M-CSF(小鼠細胞20 ng/mL，人類細胞50 ng/mL)。用BD Fortessa檢測巨噬細胞增殖和細胞活力。此外，根據製造商的說明，使用精密計算珠(Biolegend, 424902)透過流式細胞術計算絕對細胞計數。
在共培養實驗中，使用CTV(ThermoFisher, C34557)對HuT 78淋巴瘤細胞進行預染色，並按照製造商的說明，以每孔5000個細胞的密度將細胞植入96孔盤中。然後將分化的人類巨噬細胞以每孔25,000或50,000個細胞的密度添加到含有HuT 78細胞的96孔盤的孔中。這些細胞在37℃條件下共培養48或72小時。用BD Fortessa檢測腫瘤細胞的增殖和生存能力。此外，根據製造商的說明，使用精密計算珠(Biolegend, 424902)透過流式細胞術計算絕對細胞計數。
如前所述，分離並分化人類巨噬細胞。用QIAGEN RNeasy套組(74104)提取總RNA，用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad, 1708890)將其轉化為cDNA。接下來，根據製造商的規範，使用Thermo Fisher ABI ViiA7機器，使用SsoAdvanced Universal SYBR Green supermix套組(Bio-Rad, 1725270)進行即時qPCR。使用GAPDH作為持家基因。引子序列列於表3。 表3
螢光染料 標的 選殖株 公司 Cat. 編號 種反應性
PE Annexin V / Biolegend 640908 人類/小鼠
FITC CD11b ICRF44 BD 562793 人類
APC CD14 63D3 Biolegend 77474 人類
PerCP-eFluor 710 CD14 63D3 eBioscience 9046-0149-120 人類
PE-Cy7 CD163 GH1/61 Biolegend 333614 人類
PE CD206 15-2 Biolegend 321106 人類
PE-CF594 CD3 UCHT1 BD 562280 人類
PE-Cy7 CD69 GH1/61 Biolegend 333614 人類
BV605 CD80 L307.4 BD 563315 人類
BV711 CD86 IT2.2 Biolegend 305440 人類
PE Fas DX2 Biolegend 305608 人類
BV605 Fas-L NOK-1 BD 744099 人類
APC Ki67 Ki-67 Biolegend 3505014 人類
PE-Cy7 CD11b M1/70 eBioscience 25-0112-82 小鼠
BV711 CD206 CO68C2 Biolegend 141727 小鼠
PE CD206 C068C2 Biolegend 141706 小鼠
APC-Cy7 CD3e 145-2C11 BD Pharmingen 561042 小鼠
BUV496 CD4 GK1.5 BD Pharmingen 564667 小鼠
PerCP-Cy5.5 CD45 30-F11 eBioscience 45-0451-82 小鼠
BV605 CD80 16-10A Biolegend 104729 小鼠
APC CD86 GL-1 Biolegend 105012 小鼠
BV785 CD8a 53-6.7 Biolegend 100750 小鼠
APC F4/80 BM8 Invitrogen MF48005 小鼠
BV421 F4/80 BM8 Biolegend 123132 小鼠
PE Fas-L MFL3 eBioscience 12-5911-81 小鼠
FITC FoxP3 FJK-16s Invitrogen 11-5773-82 小鼠
為了測量細胞因子的釋放，按照上述方法獲得人類巨噬細胞，用普那布林(200 nM)或LPS (10 ng/ml)和IFNγ(50 ng/ml)組成物處理。處理24或48小時後，以1500 rpm離心96孔盤5分鐘，收集細胞培養上清液。根據製造商的說明，在人類M1/M2巨噬細胞面板(Biolegend, 740509)上使用基於珠光體的複合套組測量細胞因子釋放。
對於從MC38腫瘤中分離的免疫人群的分析，採用以下方案。用刀片將收取的MC38腫瘤切成更小的碎片，然後置於37℃條件下2-4 mL消化液中(含漆酶(PAA)、膠原酶IV (Worthington)、透明質酸酶(Sigma)和DNAse IV型(Sigma))持續振盪45分鐘。腫瘤懸浮液用70μM尼龍網過濾，用含EDTA (5mM)的PBS洗滌。將細胞懸浮液加入1ml RBC裂解液，裂解1分鐘，然後用含有2mM EDTA的PBS洗滌。最後一步，用70μM尼龍網過濾細胞懸浮液，將其儲存在-80℃條件中待進一步分析或直接用於流式細胞術染色。
單細胞懸浮液用PBS洗滌，用可固定的活/死UV僵屍染料(BioLegend)染色。然後用Fc受體阻斷抗CD16/32抗體(選殖株2.4G2；1:100)或用人類Fc受體結合抑制劑(Invitrogen, 1:100)在4℃條件下阻斷細胞20分鐘。接下來，使用表S3中所列的螢光團偶聯抗鼠或抗人抗體對細胞表面抗原進行染色，在4℃條件下染色20分鐘。核內染色時，用Invitrogen固定化/Perm稀釋劑(00-5223-56)滲透固定細胞。在FACS緩衝液(PBS, 0.5mM EDTA, 2% FCS, 10% NaN3)中洗滌和抗體培育。細胞用IC固定緩衝液(eBioscience, 00-8222-49)固定20分鐘，或直接用LSR Fortessa或FACS Aria III(BD Bioscience)固定20分鐘。 普那布林治療導致 MC38 腫瘤縮小和瘤內 M1 樣 TAMs 聚集
首次研究了普那布林在小鼠體內對皮下MC38結腸癌腫瘤的抗腫瘤活性。用7種劑量的普那布林(7.0 mg/kg；腫瘤周圍給藥)處理腫瘤小鼠(50-100 mm 3)11天(圖5)，並測量腫瘤生長情況。與載體處理的小鼠相比，普那布林處理的小鼠在14天後具有更小的腫瘤體積(圖5B，左)。同樣，在治療組中，活的非免疫細胞(CD45-細胞；腫瘤細胞)的百分比顯著降低(圖5B，右)。普那布林處理的小鼠到終點的生存期也顯著延長(p=0.0081, 對數等級檢定)(圖5C)。在EMT6乳腺癌小鼠模型中也觀察到了類似的結果(圖11A和11B)。
普那布林處理7天後(如圖5所示)，腫瘤微環境分析結果顯示，普那布林或對照處理小鼠中CD4+(圖5E，左)和CD8+ T 細胞(圖5E，右)頻率無變化。普那布林處理的MC38腫瘤與對照腫瘤相比，腫瘤浸潤Tregs的頻率顯著降低(圖5F)。普那布林治療的小鼠的腫瘤浸潤T細胞(CD4+和CD8+)是功能性的，在體外用抗CD3和抗CD28單株抗體(mAbs)重新刺激後，與對照組相比，其產生細胞內IFN-γ的能力增加(圖5G)。TNF-α表現在處理的和對照T細胞中保持不變(圖11C)。為了評估T細胞在該系統中的作用，在缺乏T細胞和B細胞的C57BL/6 Rag2-/-小鼠中，監測經普那布林處理後MC38腫瘤的生長情況。Rag2-/-和WT小鼠均對普那布林同樣敏感，因為在有T細胞和沒有T細胞的小鼠中觀察到腫瘤生長對普那布林反應的延遲(圖5H)。這表明，在MC38腫瘤模型中，T細胞可能不是影響普那布林療效的主要驅動因素。
值得注意的是，在普那布林處理的MC38腫瘤中，觀察到CD11b+CD11c+骨髓性細胞整體減少(圖5I，左)，特別是F4/80+ TAMs(圖5I，右)。還應注意的是，M1樣和M2樣TAM比值(定義為CD80+和CD206+TAMs的比值，圖5J)顯著增加，表明抗腫瘤M1樣TAMs的存在增加。隨後對普那布林對巨噬細胞極化和功能的影響進行了特徵鑑定。 普那布林誘導小鼠和人類巨噬細胞 M1 極化
為了闡明普那布林治療對小鼠巨噬細胞的直接作用，用FACS從建立的MC38腫瘤中分離CD11b+F4/80+TAMs，並在體外用普那布林治療48小時(圖6A)。小鼠TAMs分別用LPS(20 ng/ml)和IFNγ(50 ng/ml)的組成物或IL-4(20 ng/ml)單獨處理作為M1-或M2-TAM對照。如預期的那樣，LPS和IFNγ處理導致TAMs中CD80表現增加，而IL-4條件下CD80表現下降(圖6B和6C)。引人注目的是，無論是使用劑量(200nM或1000nM)的普那布林處理，均導致M1/M2比值顯著增加(M1標記：CD80和M2標記：CD206)，類似於LPS/IFNγ治療(圖6C和6D)。重要的是，普那布林並沒有改變TAMs的生存能力。與對照組相似，90%以上的細胞在普那布林處理後存活(圖12)。接下來，評估普那布林對骨髓源性巨噬細胞的影響(BMDM，圖6E)。與TAMs相似，普那布林處理的BMDMs導致M1標記物CD80和CD86顯著的劑量依賴性增加(分別是圖6F左和圖12B)，並伴隨CD206的表現降低(圖6F，右)。因此，觀察到普那布林處理後M1/M2比值呈劑量依賴性增加，類似於LPS/ IFN-γM1對照(圖6G和圖12C)。
下一步，研究健康的人類單核細胞來源的巨噬細胞(圖6H)。在劑量增加的普那布林或對照組(在M-CSF存在的情況下，用10 ng/ml LPS和50 ng/ml IFN-γ或只用25 ng/ml IL-4-M-CSF)處理48小時後，採用流式細胞術檢測人類M1標記物CD86、M2標記物CD206和CD163的表現。與小鼠BMDMs相似，普那布林處理人類巨噬細胞後，CD86表現量呈劑量依賴性增加(圖6I，左)，M2標記物表現量下降(圖6I，右和圖12D)和M1/M2比值顯著增加(圖6J)。在培養72和96小時後也維持了這種表現型(圖12E-F)。 普那布林誘導 M1- 巨噬細胞增殖和促發炎細胞因子釋放
接下來評估普那布林誘導的向M1表現型轉移是否伴有巨噬細胞增殖和效應功能的改變。巨噬細胞從健康人類CD14+單核細胞分化而來(圖7A)。在處理過的巨噬細胞中，測定了作為細胞跟踪紫羅蘭(CTV)染料稀釋的增殖。普那布林處理導致CD86+ 巨噬細胞(M1)增殖增加，如圖7B(左)的直方圖所示。有意思的是，在未處理組、M1對照組(LPS/IFN-γ)和IL-4處理組中均未觀察到CD86+ 巨噬細胞有這樣的增殖。在所有條件下，CD163 +巨噬細胞 (M2) 增殖保持不變(圖7B，右)。CTV的稀釋度也被量化為平均螢光強度(MFI，圖7C)。將AnnexinV染色，並將其用於分析不同亞型細胞中潛在的細胞死亡誘導。當分析總巨噬細胞種群或M1和M2亞群時，普那布林處理後的AnnexinV+細胞無顯著變化(圖7D)。這些結果表明，普那布林誘導的微管去穩定特異性和優先觸發M1樣巨噬細胞增殖，而不誘導M2樣巨噬細胞死亡。
接下來，評估M1或M2特異性細胞因子的蛋白和基因表現。普那布林或LPS/ IFN-γ對照處理24或48小時後，巨噬細胞產生M1相關細胞因子IL-1β、IL-6和IL-12p40的能力增加(圖7E)。此外，在普那布林處理後最早4小時發現iNOS基因表現增加(圖7F)，最早6小時發現IL-1基因表現增加(圖13A)。相反地，M2相關基因的Egr2、Tgfb1、Il4和Ccl17的mRNA在普那布林治療20小時後仍處於下調狀態(圖13B)。 JNK 途徑參與普那布林誘導的 M1- 巨噬細胞的極化和增殖
鑒於最近發現微管的去穩定觸發小鼠樹突狀細胞中JNK的活化，結合普那布林處理，研究了JNK參與體外誘導人類巨噬細胞M1極化和增殖(圖8A)。SP600125是一種有效和特異性的JNK抑制劑，抑制JNK可以降低普那布林處理的巨噬細胞中CD86的表現，從而導致普那布林對M1極化的部分逆轉(圖8B，左)。相反，JNK抑制不影響CD163的表現(圖8B，右)。因此，透過FACS評估總計數，普那布林處理後M1 (CD86+)事件更高，而JNK抑制後這種效應部分消失；在CD163+事件中沒有觀察到類似的效果(圖8C)。值得注意的是，JNK抑制並未顯著改變巨噬細胞活力(圖8D)。這些發現表明普那布林在直接誘導巨噬細胞向M1樣表型的極化和這些M1樣巨噬細胞以JNK依賴的方式增殖中的作用。 普那布林極化的 M1 樣人類巨噬細胞誘導 Fas 依賴性直接毒殺腫瘤細胞
接下來，試圖確定普那布林極化的M1樣巨噬細胞的效應功能。普那布林處理CD14+單核細胞來源的巨噬細胞48小時。透過改變培養基去除普那布林後，巨噬細胞與預先用CTV染色的HuT 78腫瘤細胞共培養48小時，巨噬細胞與腫瘤細胞的比例分別為5:1和10:1(圖9A)。用活/死染色法測定腫瘤細胞活力，用CTV染料稀釋法測定腫瘤細胞增殖。
流式細胞術分析結果顯示，與未處理的和只有對照的HuT 78細胞相比，在與1000 nM普那布林處理的巨噬細胞共培養時，HuT 78的生存力在任意細胞比例下都有所下降(圖9B)。在LPS/IFN-γ M1處理對照組中，也出現了類似的腫瘤細胞生存力下降的結果(圖9B)。同樣，與普那布林(1000 nM)極化的人類巨噬細胞共培養時，HuT 78的增殖受到強烈抑制(圖9C和9D)，而在此劑量下，活巨噬細胞的比例顯著增加(圖14)。
有趣的是，與未處理細胞和陽性對照相比，與普那布林處理的巨噬細胞共培養的Fas+腫瘤細胞增加(LPS/IFN-γ處理，圖9E)。同樣，觀察到普那布林處理後的人類巨噬細胞Fas-L表現呈劑量依賴性增加(圖9F)。綜上所述，資料表明普那布林極化的巨噬細胞抑制腫瘤細胞增殖，增加腫瘤細胞死亡，這可能是透過Fas/Fas- l相互作用介導的。 普那布林觸發卵巢癌患者腫瘤浸潤巨噬細胞的功能極化
為了研究普那布林是否能誘導人類TAMs的M1極化，使用FACS對來自卵巢癌患者的兩份腫瘤消化液中的CD11b+CD14+細胞進行分類(主要為M2表現型，圖15)，在CTV染色前用普那布林處理(圖10A)。值得注意的是，在使用劑量增加的普那布林處理48小時後，CD86+ TAMs的百分比呈劑量依賴性增加(圖10B，左)。LPS/IFNγ M1對照處理中也出現了類似的增加(圖10B，左)。相反，與未處理和IL-4M2對照組相比，普那布林處理的細胞中CD206的表現顯著降低(圖10B，右側)。與健康的人類CD14+巨噬細胞一樣，普那布林處理瘤內TAMs導致M1(CD86+) TAMs增殖優先增加(用CTV稀釋法測量)，如圖10C(左)的直方圖和圖10D(左)量化的MFI，而M2 TAMs未觀察到這一點(圖10C和10D，右)。總之，這些資料表明普那布林處理可以使來自癌症患者的TAMs重新極化為M1樣表型，並優先誘導M1增殖。
微管標靶藥物(MTAs)的抗腫瘤作用模式主要是透過有絲分裂紡錘體阻滯和隨後的凋亡途徑活化和腫瘤細胞死亡。
然而，MTA普那布林在α,β-微管蛋白異質二聚體上在一個不同的位置以不同於秋水仙鹼和其他微管蛋白標靶藥物預測動力學的方式，與β-微管蛋白的秋水仙鹼袋結合。普那布林結合的微管蛋白異質二聚體被阻止聚合成微管，其最終以細胞類型特定的方式影響細胞功能。與此相一致的是，普那布林在透過消除腫瘤血管中的內皮細胞來選擇性地減少腫瘤血流量的同時，也被證明能促進樹突狀細胞的成熟，誘導癌細胞凋亡。普那布林可能與緩解化療誘導的中性顆粒細胞的能力有關，這是普那布林在臨床試驗的第三階段(NCT03294577)的適應症，使用普那布林標靶微管蛋白可以增加患腫瘤小鼠骨髓中造血幹細胞/祖細胞的數量。
然而，普那布林對腫瘤模型和癌症患者的免疫腫瘤微環境的影響仍有待探索。這一點尤其重要，因為透過合理的組合和調節癌症免疫週期的不同步驟來提高目前的癌症免疫療法的前景具有巨大的臨床潛力。
在本研究中，證實了普那布林在同基因MC38和EMT6小鼠腫瘤模型中表現出單藥作用，這兩種腫瘤模型均以骨髓性為主，因此適合研究骨髓性細胞。事實上，多項研究表明，在MC38模型中，用抗CSFR1抗體清除巨噬細胞可降低腫瘤負擔，支持骨髓細胞特別是巨噬細胞在改變腫瘤排斥反應中的功能作用。
鑒於普那布林在誘導樹突狀細胞成熟和強活化以及隨後增強抗腫瘤免疫方面的作用，推測普那布林的抗腫瘤作用可能與其他骨髓性細胞有關。事實上，免疫表現型顯示巨噬細胞為顯性表現型，在普那布林處理的腫瘤中M1樣TAMs的比例增加。在T細胞缺陷的Rag2-/-動物中進行的研究表明，T細胞在驅動普那布林的單藥治療效果方面不是關鍵的。事實上，普那布林體外處理從MC38腫瘤分離的TAMs，小鼠BMDM和人單核細胞來源的巨噬細胞導致了向M1表現型和功能極化的劑量依賴性增加。值得注意的是，在接受藥物治療的癌症患者中，用於體外研究的普那布林的劑量是可以達到的。普那布林誘導的M1表現型的特徵是M1表面標記物向上調控，促發炎細胞因子分泌增強，類似於經典的M1極化劑如LPS和IFN-γ。然而，普那布林誘導的M1樣極化表現出經典體外極化M1巨噬細胞未觀察到的獨特特徵，如M1樣巨噬細胞增殖增加以及普那布林對腫瘤的直接毒殺。這表明普那布林可能表現出M1樣的免疫調節特性，與體外LPS和IFN-γ刺激後觀察到的經典M1極化在機制和功能上不同。一種無偏倚的方法，如差異基因表現分析，可以透視地幫助確定經典和普那布林誘導的巨噬細胞極化之間的重疊程度。
此外，研究表明，普那布林處理人類巨噬細胞的一個重要功能結果是增強了其腫瘤細胞毒殺能力。實驗中，巨噬細胞用普那布林處理，然後在沒有該化合物的情況下與腫瘤細胞一起培育，以排除普那布林對腫瘤細胞的任何直接細胞毒性作用。因此，認為所觀察到的腫瘤細胞死亡的增加是普那布林誘導的人類巨噬細胞免疫調節的直接結果。巨噬細胞能夠透過Fas-Fas-L軸以自分泌和旁分泌的方式調節自我凋亡。此外，巨噬細胞已知可表現Fas和Fas-L，並在免疫複合物、PHA或超抗原的刺激下向上調控和釋放可溶性Fas-L。本研究假設，巨噬細胞殺死普那布林增強的腫瘤細胞至少在一定程度上依賴於觀察到的極化TAMs上Fas-L表現的增加。此外，Hu T78腫瘤細胞與普那布林極化的巨噬細胞共培養後，Fas表現增加。在小鼠腫瘤模型中Fas-L缺失被證明可使腫瘤浸潤的骨髓性細胞群向免疫抑制表現型傾斜，並導致腫瘤負荷增加。該研究中觀察到的另一種增加腫瘤細胞死亡的潛在機制可能是促發炎細胞因子如IL-1β的分泌增加，這在之前的研究中被證明在IFN-γ存在時可誘導腫瘤細胞死亡。普那布林極化的TAMs的抗腫瘤能力的增強是否完全依賴於接觸和/或由IL-1β等可溶性因子介導，還有待研究。
普那布林以分化的方式與微管蛋白結合，並對腫瘤細胞產生直接的細胞毒性作用。因此，驚訝地發現在免疫細胞中，即巨噬細胞和樹突狀細胞，普那布林不誘導免疫細胞凋亡，相反，它能增強巨噬細胞的活化功能和增殖。從機制上看，普那布林誘導的巨噬細胞的極化和增殖在很大程度上依賴於JNK信號。
類似地，在之前的研究中觀察到普那布林誘導的腫瘤細胞凋亡也被證明依賴於腫瘤細胞內的JNK信號途徑。因此，普那布林處理似乎對細胞的促進增殖或抗增殖作用取決於細胞類型，這可能反過來取決於細胞特異性JNK下游信號。
與這裡巨噬細胞的情況類似，之前的研究表明，在普那布林處理的反應中，JNK途徑的活化對DC的成熟至關重要。特別是，在普那布林引起微管去穩定時釋放GEF-H1，這是普那布林誘導的JNK途徑活化和隨後DC活化所必需的。
在大多數固態腫瘤中，TAMs的高浸潤與預後不良有關。在卵巢癌中，TAMs是腫瘤微環境中免疫細胞的主要群體。這些細胞與卵巢癌的進展、轉移和化療抗藥性密切相關，因此是不良臨床結果的預測因子。鉑衍生物化療化合物，如順鉑和卡鉑，可能更有利於促進腫瘤的M2巨噬細胞的增加，這裡的研究表明，暴露於普那布林，一種微管去穩定藥物，能夠將卵巢癌患者的TAMs重新極化為M1樣表型，並誘導M1增殖。這表明普那布林處理巨噬細胞再極化是一種可行的治療選擇。
普那布林處理與放療結合可能特別有吸引力，這會導致單核細胞流入增加，並轉化為M2 TAMs。事實上，在放射治療前施用普那布林可以提高治療效果。此外，研究結果為普那布林與針對骨髓細胞的免疫療法的組合設計提供了理論基礎，以協同作用達到增強的抗腫瘤免疫。
總之，該研究支持普那布林在臨床試驗中的進一步發展，並為MDAs觸發TAM極化向抗腫瘤表現型的作用機制提供了關鍵的新見解。
當結合附圖進行閱讀時，從以下詳細描述可最佳理解本發明。應該強調，根據慣例，附圖的各種特徵可能並未按比例繪製。相反，為了清楚起見，各種特徵的尺寸可以任意擴大或縮小。附圖如下圖所示。
圖1A顯示了經普那布林處理的C57BI/6小鼠瘤內TAM細胞的M1極化情況。圖1B顯示了經普那布林治療的C57BI/6和Rag-/-小鼠的存活率。
圖2A和2B顯示了經普那布林處理後來自小鼠腫瘤、小鼠骨髓和人單核細胞的巨噬細胞從M2到M1的極化情況。
圖3顯示了普那布林處理後，增強了細胞的吞噬作用。
圖4顯示了普那布林治療可以誘導M1標記物的增加。
圖5A顯示了患有MC38腫瘤的小鼠(50-100 mm 3)未接受治療或在治療開始後的第0、1、2、4、7、9、11天在腫瘤周圍用普那布林治療(7 mg/kg)(MC38細胞接種後第18天給藥)。
圖5B顯示了普那布林處理後7天或對照組小鼠的腫瘤體積(左)和活CD45-細胞占總細胞(右為腫瘤細胞)的百分比。
圖5C顯示了普那布林與對照小鼠的Kaplan-Meier生存至人道終點曲線(顯示了對數等級檢定P值)。
圖5D顯示了MC38荷瘤小鼠未接受治療或在治療開始後的第0、2、4天每天兩次腹腔內給藥普那布林(7.5 mg/kg)(第一次給藥是在MC38細胞接種後18天)。治療開始後第7天採集腫瘤細胞進行流式細胞術分析。
圖5E顯示了經普那布林處理和未處理的MC38腫瘤中，腫瘤內CD4+(左)和CD8+(右)T細胞占活CD45+CD3+細胞總數的百分比。
圖5F顯示了經普那布林處理和未處理的MC38腫瘤中，腫瘤內Treg(左)和CD8+T細胞與Treg的比例(右)。
圖5G顯示了在經普那布林處理或未處理的MC38腫瘤中，抗CD3和抗CD28單抗體外再刺激腫瘤浸潤免疫細胞後，IFNγ+CD4+和IFNγ+ CD8+細胞的百分比。
圖5H顯示了在野生型C57BL/6(WT)或T和B細胞缺陷C57BL/6 RAG-/-小鼠實驗終點，經普那布林處理的小鼠與未處理的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。
圖5I顯示了CD11b+CD11c+陽性樹突細胞(左圖為所有CD45+細胞)和F4/80+Ly6C-Ly6G-TAMs(右圖為11b+種群)在經普那布林處理或未處理的MC38荷瘤小鼠中出現的頻率。
圖5J顯示了普那布林處理的MC38荷瘤小鼠和處理的MC38荷瘤小鼠的M1/M2比值(定義為CD80+和CD206+ TAMs之間的比值)。
圖6A顯示了從C57BL/6小鼠中分離出的MC38腫瘤(400-600mm 3)(第1天)。浸潤性TAMs用FACS處分選，第0天用普那布林處理或進行相關對照處理，然後第2天用流式細胞術評估巨噬細胞極化情況。
圖6B左圖中的直方圖顯示了小鼠TAMs經普那布林(1000nM或200nM)、IL-4(25 ng/mL)或LPS(20 ng/mL)和IFN-γ(50ng/mL)處理48小時後和未經處理對照組的CD80表現結果。右圖顯示了48h後不同處理條件下小鼠TAMsCD80表現的gMFI(如圖所示)。
圖6C顯示了經普那布林治療或對照條件下48小時小鼠TAMs中CD80和CD206表現的密度圖。
圖6D顯示了普那布林處理小鼠TAMs或對照條件下48小時後M1/M2比值的定量。
圖6E顯示了用M-CSF(20 ng/mL)和IL-4(25 ng/mL)培養小鼠骨髓細胞7天後產生的小鼠骨髓源性巨噬細胞。用普那布林或對照條件(濃度如圖5B)處理骨髓源性巨噬細胞2天，然後用流式細胞儀進行評估。
圖6F顯示了F4/80+骨髓源性巨噬細胞中CD80+(左)或CD206+(右)細胞在經普那布林或對照條件下處理的頻率。
圖6G顯示了48小時後經普那布林或對照條件下處理的小鼠骨髓源性巨噬細胞中M1/M2比值的量化結果。
圖6H顯示了用來自健康供體周邊血液單核細胞(PBMCs)的M-CSF(50 ng/mL)和IL-4(25 ng/mL)產生巨噬細胞，並使用指定劑量的普那布林或對照組(LPS 25 ng/mL和IFN-γ 50 ng/mL)處理的實驗大綱。
圖6I顯示了CD11b+ CD14+人源巨噬細胞中CD80+(左)或CD206+(右)細胞在普那布林或對照條件處理下出現的頻率。
圖6J顯示了普那布林或對照條件處理下48小時後源自巨噬細胞的CD14+的M1/M2比值的量化結果。
圖7A顯示了在流式細胞術和多重細胞因子分析之前，從健康供體的周邊血液單核細胞中產生巨噬細胞，然後用CTV標記並進行普那布林或對照處理的實驗大綱。
圖7B顯示了普那布林(1000nM或200nM)、IL-4 (25 ng/mL)、LPS(25ng/mL)和IFN-γ(50ng/mL)聯合用藥或未處理48小時後CTV表現(如CD86+ (左)或CD206+(右)人巨噬細胞增殖)的直方圖。
圖7C顯示了經普那布林或對照處理48小時後CD86+(左)或CD206+(右)人源巨噬細胞中gMFI的CTV信號的量化結果。
圖7D顯示了用普那布林或對照條件處理48小時的人源巨噬細胞中AnnexinV+細胞(左)的百分比和和AnnexinV的gMFI(右)。
圖7E顯示了用普那布林(上)或LPS (25ng/mL)和IFN-γ(50 ng/mL)以及結合處理(下)0、24或48小時後四名健康供體的人源巨噬細胞上清液中促發炎細胞因子IL-1β、IL-6和IL12p40的定量。
圖7F顯示了普那布林或LPS(25ng/mL)和IFN-γ(50ng/mL)聯合治療4或8小時後，qPCR對人巨噬細胞iNOS mRNA表現的定量。
圖8A顯示了從健康供體的周邊血液單核細胞中產生巨噬細胞以及在JNK抑制劑SP600125(iJNK, 20 μM)存在的情況下使用指定劑量的普那布林或對照處理的實驗大綱。
圖8B顯示了在JNK抑制劑存在或缺失的情況下用普那布林或對照條件處理的CD11b+CD14+人源吞噬細胞中CD86+(左)或CD163+(右)細胞的百分比。
圖8C顯示了JNK抑制劑存在或缺失的情況下，用普那布林或對照條件處理的並使用流式細胞術上的計數株計算的CD11b+CD14+人源吞噬細胞中CD86+(左)或CD163+(右)事件。
圖8D顯示了透過流式細胞儀測定了用普那布林或對照條件處理後，總人源巨噬細胞中活細胞(對於排除活細胞的染料呈現陰性的細胞)占的百分比。
圖9A顯示了從健康供體的周邊血液單核細胞中產生巨噬細胞，用普那布林或對照處理，並與CTV標記的HuT 78腫瘤細胞共培養48小時的實驗大綱。
圖9B顯示了活HuT 78腫瘤細胞單獨培養或與人巨噬細胞共培養後的頻率，其中巨噬細胞用普那布林預處理或在5：1(左)或10：1(右)E：T(E即效應因子=巨噬細胞；T即腫瘤細胞=HuT 78腫瘤細胞)比例下對照處理。
圖9C顯示了與經普那布林預處理或以5：1(左)或10：1(右)E：T比例對照處理的人源巨噬細胞共培養後，HuT 78腫瘤細胞增值的CTV信號的直方圖。左圖為與經普那布林預處理或對照條件處理的人源巨噬細胞共培養後Fas+ HuT 78腫瘤細胞出現的頻率。右圖為與經普那布林或對照條件處理的人源巨噬細胞共培養後，Fas-L+ M1巨噬細胞(CD86+)出現的頻率。
圖9D顯示了與經普那布林預處理或以5：1(左)或10：1(右)E：T比例對照處理的人源巨噬細胞共培養後，在HuT 78細胞中CTV 信號作為gMFI的定量。
圖9E顯示了與未處理細胞和陽性對照相比，與經普那布林處理的巨噬細胞共培養時，Fas+腫瘤細胞增多。
圖9F顯示了經普那布林處理後的人源巨噬細胞Fas-L 表現呈劑量依賴性增加。
圖10A顯示了卵巢患者腫瘤消化液中分離TAM，並用CTV標記以及用普那布林或對照處理的實驗大綱。
圖10B顯示了經普那布林或對照條件處理48小時後 CD11b+ CD14+人源腫瘤浸潤巨噬細胞中CD86+(左)或CD206+(右)細胞出現的頻率。
圖10C顯示了CTV信號的直方圖，即在體外用普那布林(1000 nM或200 nM)或對照處理48小時後，人卵巢TAMs的增殖情況。
圖10D顯示了在體外用普那布林(1000 nM或200 nM))或對照處理48小時後人源卵巢TAMs中CTV信號gMFI的量化結果。
圖11A顯示了隨著時間的推移，未處理(黑線)或普那布林處理(藍線；劑量為15 mg/kg)的動物的EMT-6腫瘤生長情況。
圖11B顯示了經普那布林處理的EMT-6荷瘤小鼠與未處理的小鼠之間的Kaplan-Meier生存至人道終點曲線。採用對數等級Mantel-Cox檢定來確定統計差異性，P值如圖所示。
圖11C顯示了經普那布林處理或未處理的MC38腫瘤在體外抗-CD3和抗-CD28單抗再刺激瘤CD4+和CD8+ T細胞後，TNFα+CD4+和TNFα+CD8+細胞的百分比。
圖12A顯示了根據圖6E中的示意圖，經普那布林或對照處理後小鼠骨髓源性巨噬細胞的百分比。
圖12B顯示了經普那布林或對照處理後F4/80+骨髓源性巨噬細胞中CD86+細胞出現的頻率。
圖12C顯示了經普那布林或對照處理的骨髓源性巨噬細胞中M1/M2比例的量化結果。
圖12D顯示了經普那布林或對照處理的CD11b+CD14+人源巨噬細胞中CD163+細胞出現的頻率。
圖12E顯示了經普那布林或對照處理48、72或96小時後CD11b+CD14+人源巨噬細胞中CD86+細胞出現的頻率。
圖12F顯示了經普那布林或對照處理48、72或96小時後CD11b+ CD14+人源巨噬細胞中CD206+細胞出現的頻率。
圖13A顯示了用普那布林或LPS和IFN-γ聯合處理6或18小時後，經核酸擴增和檢測後人巨噬細胞中IL1b mRNA表現的量化結果。
圖13B顯示了用普那布林或LPS和IFN-γ聯合處理4、8或20小時後，經核酸擴增和檢測後人巨噬細胞中Tgfb、Egr2、Il4和Ccl17 mRNA表現的量化結果。
圖14F顯示了與Fas+ HuT 78腫瘤細胞在5:1(左)或10:1(右)E:T比值共培養後普那布林或對照處理的人源巨噬細胞的頻率。
圖15顯示了從未處理的人卵巢腫瘤消化液中分離的TAMs中CD80+和CD163+細胞出現的頻率。
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Claims (45)

  1. 一種治療癌症患者的方法，該方法包括：給予有效劑量的式(I)所示的化合物和一種抗CD47劑：
    Figure 03_image001
    其中 R 1、R 4和R 6各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1′和R 1″各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1、R 1′和R 1″或者共價結合，或者不是共價結合； 每個R 2、R 3和R 5各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 12烷基、不飽和C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基和取代硝基，磺醯基和取代磺醯基； m是等於0、1或2的整數; X 1和X 2分別選自氧原子、氮原子和硫原子，並且 Y選自下組：氮原子、具有上述R 5基團的取代氮原子、氧原子、硫原子、或氧化硫原子、亞甲基和取代亞甲基； Z，對於每個獨立的n，如果不是零，Z 1、Z 2、Z 3和Z 4分別選自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；而虛線鍵可以是單鍵或雙鍵。
  2. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是特異性結合CD47的抗體或抗原結合片段。
  3. 如請求項2所述的方法，其特徵在於，所述特異性結合CD47的抗體是分離的單株抗體。
  4. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是特異性結合到SIRPα的抗體或抗原結合片段。
  5. 如請求項4所述的方法，其特徵在於，所述特異性結合到SIRPα的抗體是分離的單株抗體。
  6. 如請求項4所述的方法，其特徵在於，所述抗體促進CD47表現細胞的巨噬細胞介導的吞噬作用。
  7. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是可溶性CD47結合SIRPα片段。
  8. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑阻止CD47和SIRPα之間的相互作用。
  9. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是從IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型、Ig-G1-N297Q、IG4-S228P以及IG64 PE中選出的IgG同型。
  10. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述癌症選自下組：非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T-ALL、B-ALL、急性骨髓細胞白血病(AML)、B淋巴母細胞白血病/淋巴瘤；彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)；B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、SLL、邊緣區淋巴瘤、中樞神經系統淋巴瘤、裏克特症候群、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化、真性紅血球增多症、皮膚T細胞淋巴瘤、MGUS、骨髓增生異常症候群(MDS)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前B淋巴母細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。
  11. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物以約5 mg/m 2至150 mg/m 2的劑量給藥。
  12. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物經口、舌下、頰下、皮下、靜脈、鼻內、瘤內、局部、經皮、皮內、腹腔、肌肉、肺內、陰道、直腸或眼內給藥。
  13. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物與放射聯合施用。
  14. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物每週給藥一次。
  15. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物在三周(21天)治療週期的第1天和第8天各給藥一次。
  16. 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的方法，其中所述式(I)化合物選自普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)-亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z, 6Z)-3-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z, 6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-1H-咪唑-4-(叔丁基)基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟苯甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
  18. 一種在需要的受試者中治療癌症的方法，其中所述癌症包括表現CD47的細胞，所述方法包括：給受試者施用有效劑量的一種或多種抗CD47劑和式(I)化合物：
    Figure 03_image001
    其中 R 1、R 4和R 6各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1′和R 1″各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1、R 1′和R 1″或者共價結合，或者不是共價結合； 每個R 2、R 3和R 5獨立選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 12烷基、不飽和C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基和取代硝基，磺醯基和取代磺醯基； m是等於0、1或2的整數; X 1和X 2分別選自氧原子、氮原子和硫原子，並且 Y選自下組：氮原子、具有上述R 5基團的取代氮原子、氧原子、硫原子、或氧化硫原子、亞甲基和取代亞甲基； Z，對於每個獨立的n，如果不是零，Z 1、Z 2、Z 3和Z 4分別選自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子擇；而虛線鍵可以是單鍵或雙鍵。
  19. 如請求項18所述的方法，其特徵在於，所述一種或多種抗CD47製劑是抑制人類CD47和SIRPα相互作用的單株抗體。
  20. 如請求項19所述的方法，其特徵在於，所述單株抗體是人抗體。
  21. 如請求項19或20所述的方法，其特徵在於，所述單株抗體包括人kappa恆定區。
  22. 如請求項19-21中任一項所述的方法，其特徵在於，在給藥普那布林之前給藥所述單株抗體。
  23. 如請求項19-21中任一項所述的方法，其特徵在於，在給藥普那布林後給藥所述單株抗體。
  24. 如請求項18所述的方法，其特徵在於，所述單株抗體是一種優化抗體分子。
  25. 如請求項18所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47製劑選自：利妥昔單抗或達雷木單抗。
  26. 如請求項18-25中任一項所述的方法，其特徵在於，所述癌症選自下組：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、T-ALL、B-ALL、急性骨髓細胞白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴母細胞白血病/淋巴瘤中選擇；彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)；B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、SLL、邊緣區淋巴瘤、中樞神經系統淋巴瘤、裏克特症候群、多發性骨髓瘤、骨髓纖維化、真性紅血球增多症、皮膚t細胞淋巴瘤、MGUS、骨髓增生異常症候群(MDS)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前B淋巴母細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。
  27. 如請求項18-25中任一項所述的方法，其特徵在於，所述癌症選自下組的組織的癌症：肺、胰腺、乳房、肝臟、卵巢、睾丸、腎臟、膀胱、脊髓、大腦、子宮頸、子宮內膜、結腸/直腸、肛門、食道、膽囊、胃腸道、皮膚、前列腺、垂體、胃、子宮、陰道和甲狀腺。
  28. 如請求項18所述的方法，其特徵在於，將所述一種或多種所述抗CD47製劑與藥物上可接受的載劑或稀釋劑聯合給藥。
  29. 如請求項18所述的方法，其特徵在於，將所述一種或多種所述抗CD47製劑經皮下注射。
  30. 如請求項18所述的方法，其特徵在於，將所述一種或多種所述抗CD47製劑經靜脈注射。
  31. 如請求項18-30中任一項所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物選自：普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)-亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基) 哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-1H-咪唑-4-(叔丁基)基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟苯甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
  32. 一種藥物組成物，其中，所述藥物組成物含有式(I)化合物和一種或多種抗CD47劑，
    Figure 03_image001
    其中 R 1、R 4和R 6各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1′和R 1″各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1、R 1′和R 1″或者共價結合，或者不是共價結合； R 2、R 3和R 5各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 12烷基、不飽和C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基和取代硝基，磺醯基和取代磺醯基； m是等於0、1或2的整數; X 1和X 2分別選自氧原子、氮原子和硫原子，並且 Y選自下組：氮原子、具有上述R 5基團的取代氮原子、氧原子、硫原子、或氧化硫原子、亞甲基和取代亞甲基； Z，對於每個獨立的n，如果不是零，Z 1、Z 2、Z 3和Z 4分別選自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；而虛線鍵可以是單鍵或雙鍵。
  33. 如請求項32所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是特異性結合CD47的抗體或抗原結合片段。
  34. 如請求項33所述的方法，其特徵在於，所述特異性結合CD47的抗體是分離的單株抗體。
  35. 如請求項32所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是特異性結合於SIRPα的抗體或抗原結合片段。
  36. 如請求項35所述的方法，其特徵在於，所述特異性結合到SIRPα的抗體是分離的單株抗體。
  37. 如請求項35所述的方法，其特徵在於，所述抗體促進CD47表現細胞的巨噬細胞介導的吞噬作用。
  38. 如請求項32所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是可溶性CD47結合SIRPα片段。
  39. 如請求項32所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑阻止CD47和SIRPα之間的相互作用。
  40. 如請求項32所述的方法，其特徵在於，所述抗CD47劑是從IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型、IgG1-n297q、IG4-S228P和IG64 PE組中選擇的IgG同型。
  41. 如請求項32所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物的量介於約5毫克到150毫克之間。
  42. 如請求項32-41中任一項所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物選自：普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)-亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基) 哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-1H-咪唑-4-(叔丁基)基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟苯甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
  43. 一種對具有表現CD47的癌細胞的受試者進行治療的方法，所述方法包括： 檢測受試者中是否有表現CD47的腫瘤細胞；和 向所述受試者提供具有治療作用的式(I)化合物和抗CD47劑：
    Figure 03_image001
    其中 R 1、R 4和R 6各自獨立地選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1′和R 1″獨立選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基、羥基、羧基、-CO-O-R 7、氰基、烷基硫基、包括多鹵代烷基、鹵代羰基和羰基-CH 2CO-R 7的鹵代烷基，其中R 7選自於以下組的基團：氫原子、鹵素原子、飽和C 1-C 24烷基、不飽和C 1-C 24烯基、環烷基、環烯基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基、疊氮、取代硝基、苯基和取代苯基； R 1、R 1′和R 1″或者共價結合，或者不是共價結合； 每個R 2、R 3和R 5獨立選自下組：氫原子、氘原子、鹵素原子、飽和C 1-C 12烷基、不飽和C 1-C 12烯基、醯基、環烷基、烷氧基、環烷氧基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、胺基、取代胺基、硝基和取代硝基，磺醯基和取代磺醯基； m是等於0、1或2的整數; X 1和X 2分別選自氧原子、氮原子和硫原子，並且 Y選自下組：氮原子、具有上述R 5基團的取代氮原子、氧原子、硫原子、或氧化硫原子、亞甲基和取代亞甲基； Z，對於每個獨立的n，如果不是零，Z 1、Z 2、Z 3和Z 4分別選自碳原子、硫原子、氮原子或氧原子；而虛線鍵可以是單鍵或雙鍵。
  44. 如請求項43所述的方法，其特徵在於，所述檢測表現CD47的腫瘤細胞包括：用於檢測受試者中腫瘤細胞CD47表現的免疫細胞化學、蛋白質體學、mRNA定量或其組合中的至少一種。
  45. 如請求項43或44所述的方法，其特徵在於，所述式(I)化合物選自：普那布林、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)-亞甲基)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基-d)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(苯基-2,3,4,5,6-d 5)-亞甲基-d-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基) 哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(4-氟化物-(苯基-2,3,5,6-d 4))-亞甲基-6-((5-(叔丁基)1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-氟甲基酶)-6-((5-1H-咪唑-4-(叔丁基)基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-氟苯甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-(4-甲氧基甲醯)苯基亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮、(3Z,6Z)-3-(3-甲氧基苯亞甲基)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮或(3Z,6Z)-3-(3-(三氟甲基酶)-6-((5-(叔丁基)-1H-咪唑-4-基)亞甲基-d)哌𠯤-2,5-二酮。
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