CN110831629A - 用于治疗癌症的包括abx196的组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤药物组合，用于治疗癌症的用途，其包含：(i)化合物ABX196和(ii)至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂。

Description

用于治疗癌症的包括ABX196的组合
【技术领域】
本发明涉及用于治疗癌症的新疗法。
【背景技术】
尽管多年的研究和治疗进展，癌症仍是死亡率的主要原因。
存在着包括化学疗法和免疫疗法在内的众多治疗。然而，即使这些治疗在一些情形中可能是有效的，但是它们通常十分漫长并且复发频繁。另外，它们是造成众多影响患者的生活质量的副作用的根源。
最近已经发现新的治疗对癌症学各方面起作用，例如免疫系统在防御抵抗癌症中的牵涉。然而，这些治疗并非总是十分有效的。
因此对于改进当前疗法(尤其化学疗法和/或免疫疗法)的功效，优选同时减少这些疗法的副作用存在着重要需求。
【发明内容】
本发明来自发明人的以下意想不到的发现：特定的NKT激动剂，即，式(I)
Figure BDA0002025519610000011
的α-半乳糖基神经酰胺衍生物ABX196与其它已知的抗癌治疗的组合使用，尤其与化学疗法和/或免疫疗法的组合使用使得能够显著改进这些已知治疗的功效，尤其是对抗侵袭性癌症的功效。
尤其，发明人发现，包含式(I)
Figure BDA0002025519610000021
的化合物ABX196和肿瘤抗原的疫苗组合物与其它已知的抗癌治疗的组合使用，尤其与化学疗法和/或免疫疗法的组合使用使得能够显著改进这些已知治疗的功效，尤其是对抗侵袭性癌症的功效。
发明人的确证明了包含ABX196和肿瘤抗原Trp2的疫苗组合物与多柔比星或anti-PD-1单克隆抗体的组合使用改进了这些化合物在黑素瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果。
发明人还证明了ABX196与多柔比星(doxorubicin)、索拉非尼(sorafenib)或anti-PD-1单克隆抗体的组合使用改进了这些化合物在黑素瘤、结肠直肠癌、膀胱癌和肝癌小鼠模型中的抗肿瘤效果，并且进一步改进了小鼠模型的存活。
因此本发明涉及一种抗肿瘤药物组合，用于治疗癌症的用途，其包含：
(i)式(I)
的化合物ABX196和，
(ii)至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂。在一种实施方案中，所述抗肿瘤药物组合进一步包含肿瘤抗原。在特别的实施方案中，式(I)
Figure BDA0002025519610000023
的化合物ABX196包含在疫苗组合物(iii)中，该疫苗组合物(iii)进一步包含肿瘤抗原。
本发明的另一个目标涉及一种疫苗组合物，用于在癌症的治疗中与至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂组合使用，该疫苗组合物包含式(I)
Figure BDA0002025519610000031
的化合物ABX196和肿瘤抗原。
本发明进一步涉及一种式(I)
Figure BDA0002025519610000032
的化合物ABX196,用于在癌症的治疗中与至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂组合使用。在一种实施方案中，所述组合进一步包含肿瘤抗原。
本发明的另一个目标涉及一种组合制剂，用于治疗癌症的用途，其包含：
(i)一个或更多个剂量单位的式(I)
Figure BDA0002025519610000033
的化合物ABX196和，
(ii)一个或更多个剂量单位的至少一种化疗剂和/或一个或更多个剂量单位的免疫治疗剂。
在一种实施方案中，在所述组合制剂中，式(I)
Figure BDA0002025519610000034
的化合物ABX196包含在疫苗中，该疫苗进一步包含肿瘤抗原。
在一种实施方案中，当如以上所定义的化合物ABX196包含在根据本发明的以上目标的疫苗组合物中时，其用作所述疫苗组合物中的佐剂。
尤其，针对ABX196与至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂的组合所获得的百分比治疗/对照(T/C(％))指数低于针对单独的至少一种化疗剂和/或单独的至少一种免疫治疗剂所获得的T/C(％)指数。在一种实施方案中，本发明的组合的T/C(％)低于或等于42％。
可通过以下方式来计算百分比治疗/对照(T/C(％))指数：经治疗的肿瘤的中值体积除以对照肿瘤的中值体积并将所得值乘以100。例如，在施用根据本发明的ABX196与至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂的组合之后获得经治疗的肿瘤的中值体积，在施用所述组合的载体之后获得对照肿瘤的中值体积，同时对所述肿瘤体积进行评价。
本发明的详细描述
抗肿瘤药物组合
根据本发明使用的式(I)
的化合物ABX196是α-半乳糖基衍生物，已知其刺激NKT(天然杀伤T)细胞。根据本发明，化合物ABX196还指其药学上可接受的盐。术语"药学上可接受的盐"指保持ABX196的生物有效性和性能并且并非生物学上或其它形式的不合意的盐。关于药学上可接受的盐的综述参见Berge等人((1977)J.Pharm.Sd，第66卷，1)。
如本文所使用的术语"组合"、"治疗组合"或"药物组合"定义了一种剂量单位形式的固定组合或用于组合施用的整套试剂组件(a kit of parts)。在特别的实施方案中，可同时将化合物ABX196或如下文所定义的疫苗组合物与如下文所定义的至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂独立施用，或在允许这些组合搭档显示协同效应的时间间隔内单独施用。
尤其，当化合物ABX196或疫苗组合物与化疗剂组合使用时，可将它们同时独立地施用或在时间间隔内单独施用。类似地，当化合物ABX196或疫苗组合物与免疫治疗剂组合使用时，可将它们同时独立地施用或在时间间隔内单独施用。
另外，当化合物ABX196或疫苗组合物与超过一种化疗剂组合使用时，可将该组合的每一种组分同时独立地施用或在时间间隔内单独施用，或者可将该组合的一些组分同时独立地施用，同时可将该组合的其它组分在时间间隔内单独施用。
类似地，当化合物ABX196或疫苗组合物与超过一种免疫治疗剂组合使用时，可将该组合的每一种组分同时独立地施用或在时间间隔内单独施用，或者可将该组合的一些组分同时独立地施用，同时可将该组合的其它组分在时间间隔内单独施用。
类似地，当化合物ABX196或疫苗组合物与化疗剂和免疫治疗剂组合使用时，可将该组合的每一种组分同时独立地施用或在时间间隔内单独施用，或者可将该组合的一些组分同时独立地施用，同时可将该组合的其它组分在时间间隔内单独施用。
可将构成组合的成分同时施用、半同时施用、单独施用或间隔一段时间施用，以便于获得该组合的最大功效；各施用有可能在其持续时间上从迅速施用变化到连续灌注。
因此可将本发明组合的化合物配制在两种、三种或更多种单独的药物组合物中。
化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物的至少一次施用与至少一种如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂的至少一次施用之间的时间控制优选为约4天。
优选地，在施用化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物之后4天施用如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂。优选地，在施用化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物之前4天施用如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂。
化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物的至少一次施用与如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂的至少一次施用之间的时间控制优选为约7天。
优选地，在施用化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物之后7天施用如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂。优选地，在施用化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物之前7天施用如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂。
在本发明的情况中使用的组合物优选为可静脉内施用的组合物。然而，在局部区域疗法的情况中，可口服、皮下或腹腔内施用这些组合物。在一种实施方案中，在肿瘤内施用这些组合物。
本文中定义术语"组合制剂"来尤其指"整套试剂组件"，在该意义上如以上所定义的组合搭档(i)和(ii)可独立地剂量给药或通过使用含有不同量的组合搭档的不同的固定组合来剂量给药，即，同时或在不同的时间点剂量给药(当使用化疗剂和免疫治疗剂两者时或当使用数种化疗剂和/或数种免疫治疗剂时，这也应用于搭档(ii)的不同的组分)。然后该整套试剂组件的各试剂组件可例如同时施用或按时间顺序交叉施用(即，针对该整套试剂组件的任何试剂组件，在不同的时间点以及利用相同或不同的时间间隔)。
优选将本发明的组合制剂的组合搭档以剂量单位形式配制。术语"剂量单位"指适合作为用于人类对象和其它哺乳动物的单一剂量的物理离散单位，各单位含有预定量的(多种)活性物质，其经计算以产生所需的治疗效果，可选地与合适的药物赋形剂联合。
组合制剂中的待施用的组合搭档(i)与组合搭档(ii)(或适当时，与组合搭档(ii)的不同的组分)的总量比率可变化，例如为了应对待治疗的患者子群体的需求或单名患者的需求。
疫苗组合物
在本发明的上下文中使用的疫苗组合物包含式(I)
Figure BDA0002025519610000071
的化合物ABX196和肿瘤抗原。
"肿瘤抗原"在本文中表示唯独在肿瘤组织上表达、与肿瘤组织相关联地表达或在肿瘤组织中过度表达的抗原。示例性肿瘤抗原包括但不限于5-α-还原酶、α-甲胎蛋白(AFP)、AM-1、APC、APRIL、B黑素瘤抗原基因(BAGE)、β-连环蛋白、Bcl12、Bcr-Abl、Brachyury、CA-125、半胱天冬酶-8(CASP-8，也称为FLICE)、组织蛋白酶S、CD19、CD20、CD21/补体受体2(CR2)、CD22/BL-CAM、CD23/FcεRII、CD33、CD35/补体受体1(CRT)、CD44/PGP-1、CD45/白细胞共同抗原(LCA)、CD46/膜辅助蛋白(MCP)、CD52/CAMPATH-1、CD55/衰变加速因子(DAF)、CD59/保护素、CDC27、CDK4、癌胚抗原(CEA)、c-myc、环氧化酶-2(cox-2)、结肠直肠癌缺失基因(DCC)、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基转移酶、成纤维细胞生长因子-8a(FGF8a)、成纤维细胞生长因子-8b(FGF8b)、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、G黑素瘤抗原基因家族(GAGE-家族)、胃泌素17、胃泌素释放激素、神经节苷脂2(GD2)/神经节苷脂3(GD3)/神经节苷脂-单唾液酸-2(GM2)、促性腺释放激素(GnRH)、UDP-GlcNAc:R1人(α1-6)R2[GlcNAc对人(α1-6)]β1,6-Ν-乙酰基葡糖胺基转移酶V(GnTV)、GP1、gp100/Pme1-17、gp-100-in4、gp15、gp75/酪氨酸相关蛋白-1(gp75/TRP-1)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、类肝素酶、Her2/neu、EGFR、人乳腺肿瘤病毒(HMTV)、70kD热休克蛋白(HSP70)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、胰岛素样生长因子受体-1(IGFR-1)、白细胞介素-13受体(IL-13R)、可诱导氧化氮合酶(iNOS)、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、黑素瘤抗原编码家族(MAGE-家族，至少包括MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3和MAGE-4)、乳腺球蛋白、MAP17、由T细胞-1识别的黑色素A/黑素瘤抗原(MART-1)、间皮素、MIC A/B、MT-MMPs、粘液素、睾丸特异性抗原NY-ESO-1、骨粘连蛋白、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素转铁蛋白、PAI-1、血小板衍生生长因子(PDGF)、PRAME、probasin、祖细胞生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX家族、STAT3、STn、TAG-72、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、uPA、uPAR、TNF-α转化酶(TACE)、胸腺素-β-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TP1、TRP-2、酪氨酸酶、血管内皮生长因子(VEGF)、ZAG、p16INK4、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、紧密连接蛋白-3、紧密连接蛋白-4、BMCA和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
优选地，所述肿瘤抗原是TRP-2。
在一种实施方案中，所述肿瘤抗原的序列选自SEQ ID n°1、SEQ ID n°3和SEQ IDn°4，优选SEQ ID n°3。
优选地，根据待治疗的具体癌症来选择肿瘤抗原。技术人员的确知晓哪种肿瘤抗原与特别的癌症特定相关。例如，技术人员众所周知的是，TRP-2肿瘤抗原由黑素瘤癌细胞表达。
因此，在特别优选的实施方案中，肿瘤抗原是TRP-2，且待治疗的癌症是黑素瘤。
在本发明的上下文中使用的疫苗组合物可包含额外的佐剂。不同于ABX196的额外的佐剂是技术人员众所周知的，并且包括铝盐；水包油乳液，例如弗氏不完全佐剂或PRR配体、TLR3和RLR配体，如poly(I:C)；TLR4配体例如LPS或单磷酰脂质A(MPLA)；TLR5配体，例如鞭毛蛋白；TLR7/8配体，例如咪唑并喹啉；TLR9配体，例如CpG寡脱氧核苷酸；和NOD2配体，如胞壁酰二肽(MDP)。
然而，由于化合物ABX196可作为佐剂存在于本发明的上下文中所使用的疫苗组合物中，因此在优选的实施方案中，疫苗组合物仅包含化合物ABX196作为佐剂。在优选的实施方案中，化合物ABX196用作根据本发明的所述疫苗组合物的佐剂。
化疗剂
如本文所使用的术语"化疗剂"指在抗癌化学疗法中使用的任何细胞生长抑制性化合物或细胞毒性化合物。应理解，此类化合物不是抗原。此类化疗剂是技术人员众所周知的，并且包括：
-烷化剂，包括氮芥类，例如环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥和美法仑；亚乙基胺和甲基三聚氰胺，例如塞替派；甲基肼衍生物，例如丙卡巴肼；烷基磺酸酯，例如白消安；亚硝基脲，例如卡莫司汀或洛莫司汀；三氮烯，例如达卡巴嗪和替莫唑胺；铂配位复合物，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂；
-抗代谢物，包括叶酸类似物，例如甲氨蝶呤；嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨和卡培他滨；嘌呤类似物，例如巯嘌呤、喷司他丁、克拉屈滨和氟达拉滨；
-长春花生物碱，例如长春碱、长春瑞滨和长春新碱；
-紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛；
-表鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；
-喜树碱，例如托泊替康和伊立替康；
-抗癌抗生素，例如放线菌素D、道诺霉素、多柔比星、普卡霉素和表柔比星；
-蒽二酮，例如米托蒽醌、丝裂霉素和博来霉素；
-有丝分裂抑制剂，例如多拉司他汀；
-酶，例如L-天冬酰胺酶；
-取代脲，例如羟基脲；
-分化剂，例如维甲酸；
-蛋白激酶抑制剂，例如伊马替尼或苔藓抑素；
-蛋白酶体抑制剂，例如吉非替尼和硼替佐米；
-激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特；促肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松；孕激素，例如醋酸甲地孕酮和甲羟孕酮；雌激素，例如己烯雌酚；抗雌激素，例如他莫昔芬、艾多昔芬、屈洛昔芬、秦哚昔芬、曲沃昔芬、ICI 182,780、EM-800和托瑞米芬；芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦；雄激素，例如丙酸睾酮；抗雄激素，例如氟他胺；以及促性腺素释放剂，例如亮丙立德。
当然，可使用化疗剂的任何合适的组合，这取决于癌症的类型。
在优选的实施方案中，至少一种化疗剂选自多柔比星、环磷酰胺、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和奥沙利铂。在一种实施方案中，至少一种化疗剂是多柔比星或激酶抑制剂，例如索拉非尼。优选地，至少一种化疗剂是多柔比星或索拉非尼，更优选多柔比星。
可将在本发明的上下文中使用的至少一种化疗剂配制在药物组合物中，该药物组合物可进一步包含如下文所定义的药学上可接受的赋形剂。
如果使用不同的化疗剂的组合，则可将这些化疗剂配制在单一药物组合物中或在单独的药物组合物中。
可通过技术人员众所周知的任何合适的途径来施用在本发明的上下文中使用的至少一种化疗剂。如本领域技术人员所认识到的，可适当地配制包含化疗剂的(多种)药物组合物，以与计划的(多种)施用途径相容。合适的施用途径的实例包括胃肠外施用，例如静脉内、皮内、皮下、肌内、腹腔内施用；口服(例如口腔含服、吸入、鼻和肺喷雾)；皮内、经皮(局部)、经粘膜、眼内和直肠施用。
优选地，静脉内施用在本发明的上下文中使用的至少一种化疗剂。
在本发明的上下文中使用的化疗剂的给药方案将取决于所使用的具体药剂。此类给药方案是技术人员众所周知的。它们典型地将特定浓度的所施用的化疗剂与特定的施用方案结合。
例如，优选通过以下方式施用多柔比星：以每一次循环40～75mg/m2的剂量静脉内输注3-5min，每次循环与前一次循环分隔3～4周的间隔，且优选重复循环直到实现550mg/m2的最大总剂量。
然而，由于化合物ABX196或以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物与化疗剂的组合使用显著且协同增加了所述化疗剂的抗癌效果，因此相比于标准的给药方案，有可能降低所使用的化疗剂的剂量和/或缩短其施用的持续时间。
因此在优选的实施方案中，按低于针对至少一种化疗剂(尤其单独使用的或与另一种化疗剂和/或免疫治疗剂组合使用的)推荐的标准给药方案的给药方案来施用该化疗剂。
免疫治疗剂
如本文所使用的术语"免疫治疗剂"指抗癌药剂，其通过引发新的对抗癌细胞的免疫反应或促进现存的对抗癌细胞的免疫反应来介导抗肿瘤效应，所述免疫反应例如靶向肿瘤抗原的抗体或淋巴细胞。基于其(再)激活宿主免疫系统对抗恶性细胞的能力，可将免疫治疗剂分类为"主动的"或"被动的"。
在一种实施方案中，所述免疫治疗剂不是抗原。
优选地，免疫治疗剂是肿瘤抗原的特异性抗体，如以上"疫苗组合物"部分中所定义的。
"抗体"可以是天然的或常规的抗体，其中通过二硫键将两条重链彼此连接，且通过二硫键将各重链与轻链连接。如本文所使用的术语"抗体"表示常规抗体及其片段，以及单结构域抗体及其片段，尤其单结构域抗体的可变重链；以及嵌合的、人源化的、双特异性的或多特异性的抗体。
如本文所使用的抗体还包括"单结构域抗体"，它是其互补决定区是单结构域多肽的部分的抗体。单结构域抗体的实例包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、获得自常规四链抗体的单结构域抗体、工程单结构域抗体。单结构域抗体可获得自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔子和牛。单结构域抗体可以是称为缺乏轻链的重链抗体的天然存在的单结构域抗体，例如由骆驼科(Camelidae)物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和骆马)产生的那些。
这些缺乏轻链的单结构域抗体的可变重链在本领域中称为"VHH"或"纳米抗体(nanobody)"。类似于常规VH结构域，VHH含有四个FR和三个CDR。纳米抗体具有比IgG分子小约十倍的优势，从而恰当折叠的功能性纳米抗体可通过体外表达来产生，同时实现高收率。此外，纳米抗体十分稳定，且抵抗蛋白酶的作用。
如本文中使用的术语"单克隆抗体"或"mAb"指具有单一氨基酸组成的抗体分子，其定向对抗特定抗原。
单克隆抗体可通过B细胞或杂交瘤的单克隆来产生，而且也可以是重组体，即，通过蛋白质工程来产生。
术语"嵌合抗体"指工程抗体，其含有来自一种抗体的一个或更多个区域以及来自一种或更多种其它抗体的一个或更多个区域。尤其，嵌合抗体包含获得自非人动物的抗体的VH结构域和VL结构域与另一种抗体(尤其人抗体)的CH结构域和CL结构域的结合。作为非人动物，可使用任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔子等。嵌合抗体还可表示针对至少两种不同的抗原具有特异性的多特异性抗体。在实施方案中，嵌合抗体具有小鼠来源的可变结构域和人来源的恒定结构域。
术语"人源化抗体"指抗体，其最初完全或部分为非人来源，且其经修饰，以置换某些氨基酸(尤其重链和轻链的构架区中的氨基酸)，以便于避免或最小化人中的免疫反应。人源化抗体的恒定结构域绝大部分时间是人CH和CL结构域。在实施方案中，人源化抗体具有来源于人的恒定结构域。
(常规)抗体的"片段"包含完整抗体的一部分，尤其完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体、由抗体片段形成的双特异性抗体和多特异性抗体。常规抗体的片段还可以是单结构域抗体，例如重链抗体或VHH。
术语"Fab"表示具有约50,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG所获得的片段之中，大约一半的H链N-端侧链和整条L链通过二硫键结合在一起。
术语"F(ab')2"指具有约100,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG所获得的片段之中，其稍大于经由铰链区的二硫键结合的Fab。
术语"Fab'"指具有约50,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab')2片段的铰链区的二硫键而获得。
单链Fv("scFv")多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其通常表达自包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合。人scFv片段包括CDR，尤其通过使用基因重组技术将其保持为恰当构象。二价和多价抗体片段可通过单价scFv的缔合而自发形成，或者可通过经由肽接头(例如二价sc(Fv)2)偶联单价scFvs而生成。
"dsFv"是通过二硫键稳定的VH::VL异源二聚体。
"(dsFv)2"表示通过肽接头偶联的两个dsFv。
术语“双特异性抗体”或“BsAb”表示将两种抗体的抗原结合位点组合在单一分子内的抗体。因此，BsAb能够同时结合两种不同的抗原。
术语"多特异性抗体"表示将两种或更多种抗体的抗原结合位点组合在单一分子内的抗体。
术语"双抗体"指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，所述片段包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的两个结构域配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。
在特别的实施方案中，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂是单克隆抗体或其片段，尤其选自以下的片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体和VHH。
最优选地，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂是单克隆抗体。
优选地，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂是肿瘤抗原的特异性抗体，尤其单克隆抗体，其选自Her2/neu、EGFR、VEGF、CD20、CD52、CD33、TACE、组织蛋白酶S、uPA、uPAR、PD-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、紧密连接蛋白-3、紧密连接蛋白-4、BMCA和CTLA4。在特别优选的实施方案中，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂是PD-1的特异性抗体，尤其单克隆抗体。在一种实施方案中，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂是选自以下的抗体：anti-PD-1、抗CTLA-4、抗PD-L1、抗GITR、抗CD38、抗4-1BB、抗OX40、抗LAG3和抗TIM-3。
在特别优选的实施方案中，免疫治疗剂是单克隆抗PD1抗体。
以上肿瘤抗原的特异性单克隆抗体的实例是技术人员众所周知的，并且包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗(赫赛汀)、阿仑单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、伊匹单抗、纳武单抗(也称为MBS-936558、MDX-1106或ONO-4538anti-PD-1抗体)、派姆单抗(也称为MK-3475anti-PD-1抗体)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(也称为CT-011anti-PD-1抗体)、BMS-936559抗PD-L1抗体、MPDL3280A抗PD-L1抗体、MEDI4736抗PD-L1抗体、MSB0010718C anti-PD-L1抗体、D1(A12)anti-TACE抗体、A9anti-TACE抗体、Fsn0503h抗组织蛋白酶S抗体、ATN-658anti-uPAR抗体或J6M0anti-BMCA抗体。
优选地，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂选自纳武单抗、派姆单抗和皮地利珠单抗。
在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂还可以是缀合物，其包含如以上所定义的单克隆抗体和如以上"化疗剂"部分中定义的化疗剂。
在另一种实施方案中，在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂是过继转移的T细胞。
在本发明的上下文中，术语"过继细胞转移"指基于细胞的抗癌免疫疗法的变体，其通常牵涉(1)采集循环淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，(2)对它们进行离体选择/修饰/膨胀/激活，以及(3)对患者(再)施用它们，最经常在淋巴清除性预调理之后，并且与免疫刺激剂组合(再)施用。
在本发明的上下文中使用的至少一种免疫治疗剂可配制在药物组合物中，该药物组合物可进一步包含如下文所定义的药学上可接受的赋形剂。
如果使用不同的免疫治疗剂的组合，则可将这些免疫治疗剂配制在单一药物组合物中或单独的药物组合物中。
可通过技术人员众所周知的任何合适的途径施用在本发明的上下文中使用的至少一种免疫治疗剂。如本领域技术人员所认识到的，可适当地配制包含(多种)免疫治疗剂的(多种)药物组合物，以与计划的(多种)施用途径相容。合适的施用途径的实例包括胃肠外施用，例如静脉内、皮内、皮下、肌内、腹腔内施用；口服(例如口腔含服、吸入、鼻和肺喷雾)；皮内、经皮(局部)、经粘膜、眼内和直肠施用。
在一种实施方案中，静脉内或肿瘤内施用本发明的上下文中使用的至少一种免疫治疗剂。优选地，静脉内施用本发明的上下文中使用的至少一种免疫治疗剂。
在本发明的上下文中使用的免疫治疗剂的给药方案将取决于所使用的特定药剂。此类给药方案是技术人员众所周知的。它们典型地将特定浓度的施用的免疫治疗剂与特定的施用方案结合。
例如，优选通过以下方式施用纳武单抗：每两周以3mg/kg体重的剂量静脉内输注60min。
优选在周期内施用本发明的上下文中使用的免疫治疗剂，所述周期包括多次施用，每次施用优选分隔3～4天的时间间隔。
然而，由于化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分所定义的疫苗组合物与免疫治疗剂的组合使用显著且协同地增加了所述免疫治疗剂的抗癌效果，因此相比于标准给药方案，有可能降低所使用的免疫治疗剂的剂量和/或缩短其施用的持续时间。
因此，在优选的实施方案中，以低于针对该免疫治疗剂推荐的标准给药方案(尤其单独使用或与另一种免疫治疗剂和/或化疗剂组合)的给药方案施用至少一种免疫治疗剂。
在本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。
"药学上的"或"药学上可接受的"指分子实体和组合物，其在适当时施用于哺乳动物(尤其人)时，不产生不利的、过敏的或其它麻烦的反应。药学上可接受的载体或赋形剂指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
可通过技术人员众所周知的任何合适的途径施用本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物。如本领域技术人员认识到的，可适当地配制药物组合和/或疫苗组合物，以与计划的施用途径相容。合适的施用途径的实例包括胃肠外施用，例如静脉内、皮内、皮下、肌内、腹腔内施用；口服(例如口腔含服、吸入、鼻和肺喷雾)；皮内、经皮(局部)、经粘膜、眼内和直肠施用。
优选地，静脉内、肌内、皮下、鼻内或肿瘤内(更优选静脉内)施用本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物。在一种实施方案中，静脉内或肿瘤内施用本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物。
可对有需要的患者施用本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物一次或数次(包括例如首要剂量，随后一个或数个促升剂量)。优选地，施用本发明的上下文中使用的疫苗组合物仅一次(因此不需要任何促升剂量的任何施用)。
可按至少0.2μg化合物ABX196/患者的剂量递送在本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物。在一种实施方案中，可按至少3ng/kg(例如3ng/kg～5ng/kg)的化合物ABX196剂量递送在本发明的上下文中使用的药物组合和/或疫苗组合物。有效剂量还将取决于施用途径以及与其它药剂共同使用的可能性而变化。
癌症的治疗
本发明进一步涉及治疗癌症的方法，其包括在有需要的患者中施用治疗有效量的如以上"抗肿瘤药物组合"部分中定义的抗肿瘤药物组合，所述组合包含：
(i)式(I)
Figure BDA0002025519610000171
的化合物ABX196和
(ii)如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂和/或如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂。在一种实施方案中，所述ABX196化合物包含在疫苗组合物中，该疫苗组合物进一步包含如以上"疫苗组合物"部分中定义的肿瘤抗原。
本发明还涉及：
(i)式(I)
Figure BDA0002025519610000172
的化合物ABX196和，
(ii)如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂和/或如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂在制备意欲治疗癌症的抗肿瘤药物组合中的用途。在一种实施方案中，所述ABX196化合物包含在疫苗组合物中，该疫苗组合物进一步包含如以上"疫苗组合物"部分中定义的肿瘤抗原。
本发明还涉及治疗癌症的方法，其包括在有需要的患者中施用(尤其共同施用)治疗有效量的式(I)
Figure BDA0002025519610000173
的化合物ABX196与治疗有效量的如以上“化疗剂”部分中定义的至少一种化疗剂和/或治疗有效量的如以上“免疫治疗剂”部分中定义的至少一种免疫治疗剂的组合。在一种实施方案中，所述ABX196化合物包含在疫苗组合物中，该疫苗组合物进一步包含如以上"疫苗组合物"部分中定义的肿瘤抗原。
本发明还涉及式(I)
Figure BDA0002025519610000181
的化合物ABX196和如以上"疫苗组合物"部分中定义的肿瘤抗原在制备意欲与如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂和/或如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂组合治疗癌症的疫苗组合物中的用途。
本发明还涉及用于治疗癌症的方法，其包括在有需要的患者中施用(尤其共同施用)治疗有效量的式(I)
Figure BDA0002025519610000182
的化合物ABX196与(a)治疗有效量的如以上"疫苗组合物"部分中定义的肿瘤抗原以及，(b)治疗有效量的如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂和/或治疗有效量的如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂的组合。
本发明还涉及式(I)
Figure BDA0002025519610000183
的化合物ABX196在制备意欲与(a)如以上"疫苗组合物"部分中定义的肿瘤抗原以及(b)如以上"化疗剂"部分中定义的至少一种化疗剂和/或如以上"免疫治疗剂"部分中定义的至少一种免疫治疗剂组合治疗癌症的药物中的用途。
在本发明的所有上述方面，当包含在疫苗组合物中时，化合物ABX196可用作佐剂。
本文中所使用的术语"共同施用"或"组合施用"定义为包括对单名患者施用所选择的治疗剂，且意欲包括其中非必需通过相同的施用途径或同时来施用药剂的治疗方案。
根据本发明，术语"对象"或"有需要的对象"意欲用于受癌症影响或可能受癌症影响的人或非人哺乳动物。
在本发明的上下文中，术语“治疗”("treating"或"treatment")表示逆转、减轻、抑制此类术语应用的病症或病况或此类病症或病况的一种或更多种症状的进展或预防此类术语应用的病症或病况或此类病症或病况的一种或更多种症状。
本发明化合物的"治疗有效量"表示化合物的量足以以适用于任何药物治疗的合理的益处/风险比来治疗癌症(例如限制生长或减缓或阻断肿瘤转移)。然而应理解，本发明化合物的每日总用量将由主治医师在明智的医学判断范围内来决定。针对任何特定对象的具体的治疗有效剂量水平将取决于各种各样的因素，包括被治疗的病症以及该病症的严重性；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合；对象的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或巧合使用的药物；以及药物领域众所周知的类似因素。例如，本领域技术范围内熟知化合物的起始剂量水平低于实现所需治疗效果的那些水平，并逐渐提高剂量直到实现所需的效果。
根据本发明的抗肿瘤药物组合特别有用于治疗癌症。
本发明的抗肿瘤药物组合可用于治疗处于其发展的任何阶段的可觉察的癌性肿瘤，包括处于其发展的晚期的癌症。尤其，本发明的抗肿瘤药物组合可用于治疗十分具有侵袭性的癌症。
更尤其，本文中所使用的术语"癌症的治疗"包括以下特征中的至少一种：减轻与癌症相关的症状、降低癌性肿瘤的程度(例如降低肿瘤生长)、稳定癌性肿瘤的状态(例如抑制肿瘤生长)、防止癌症的进一步扩散(例如转移)、防止癌症的发生或复发、延迟或阻碍癌症的进展(例如降低肿瘤生长)或改善癌症的状态(例如减小肿瘤尺寸)。
本文中所使用的术语"癌症"或"癌性肿瘤"指其中一群细胞已经在不同程度上变得不响应通常支配增殖和分化的控制机制的病症。癌症指各种类型的恶性新生物和肿瘤，包括原发肿瘤和肿瘤转移。可由本发明的组合治疗的癌症的非限制性实例是淋巴细胞增生性病症；乳腺癌；卵巢癌；前列腺癌；宫颈癌；子宫内膜癌；骨癌；肝癌；胃癌；结肠癌；胰腺癌；甲状腺癌；头和颈癌；中枢神经系统癌；周围神经系统癌；皮肤癌；肾癌；肝细胞癌；肝脏肿瘤；肝母细胞瘤；横纹肌肉瘤；食管癌；甲状腺癌；神经节母细胞瘤(ganglioblastoma)；纤维肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；软骨肉瘤；骨源性肉瘤；脊索瘤；血管肉瘤；内皮肉瘤；尤文肿瘤；平滑肌肉瘤；杆状乳头肉瘤(rhabdotheliosarcoma)；浸润性导管癌；乳突状腺癌；黑素瘤；鳞状细胞癌；基底细胞癌；腺癌；肾细胞癌；肾上腺样瘤；肾上腺样腺癌；胆管癌；绒膜癌；精原细胞瘤；胚胎癌；维尔姆斯肿瘤；睾丸肿瘤；肺癌，包括小细胞、非小细胞和大细胞肺癌；膀胱癌；胶质瘤；星形细胞瘤；髓母细胞瘤；颅咽管瘤；室管膜瘤；松果体瘤；视网膜母细胞瘤；神经母细胞瘤；结肠癌；直肠癌；造血系统恶性肿瘤，其包括所有类型的白血病和淋巴瘤，包括急性髓细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；和肝癌。
优选地，本发明的上下文中的待治疗的癌症选自黑素瘤、肾癌、肝癌、胰腺癌和肺癌。
在一种实施方案中，本发明的上下文中的待治疗的癌症选自黑素瘤、肝癌、膀胱癌和结肠直肠癌。
最优选地，本发明的上下文中的待治疗的癌症是黑素瘤。
鉴于与单独治疗相关的差别毒性，组合疗法可提供治疗优势。例如，使用一种化疗剂或使用一种免疫治疗剂的治疗可引起使用ABX196或使用本发明疫苗组合物见不到的特别毒性。这种差别毒性本身可允许待施用的每种治疗处于其下不存在毒性或毒性达到最小的剂量，以致该组合疗法一起提供治疗剂量，同时避免组合药剂的各成分的毒性。此外，因为由组合治疗实现的治疗效果是增强的效果，所以可甚至进一步降低每种药剂的剂量，从而将伴随的毒性甚至降低到更大的程度。
在特别优选的实施方案中，根据本发明的治疗癌症的方法包括一次施用(优选静脉内)本发明的化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物，然后4天后一次施用(优选通过静脉内输注)如以上部分"化疗剂"中所定义的化疗剂，尤其多柔比星。
在另一种实施方案中，根据本发明的治疗癌症的方法包括一次施用(优选静脉内)本发明的化合物ABX196或如以上"疫苗组合物"部分中定义的疫苗组合物，然后7天后第一次施用(优选静脉内输注)如以上"免疫治疗剂"部分中定义的免疫治疗剂(尤其纳武单抗)，优选接着4天后第二次施用(优选静脉内输注)所述免疫治疗剂，优选进一步然后3天后第三次施用(优选通过静脉内输注)所述免疫治疗剂，进一步优选然后4天后第四次施用(优选通过静脉内输注)所述免疫治疗剂。
通过附图和以下实施例进一步阐述本发明。
【附图说明】
图1：在实施例1中植入C57BL/6小鼠中的B16-F10肿瘤的平均体积和中值体积，C57BL/6小鼠在第3天经TRP2-ABX196治疗、在第10天、第14天、第17天和第21天经anti-PD-1抗体或TRP2-ABX196与anti-PD-1抗体的组合治疗。
图2：在实施例1中，具有B16-F10肿瘤并经TRP2-ABX196、anti-PD-1抗体、或TRP2-ABX196与anti-PD-1抗体的组合治疗的C57BL/6小鼠的存活。
***：p<0.001；****：p<0.0001；n.s.：不显著。
图3：在实施例1中植入C57BL/6小鼠中的B16-F10肿瘤平均体积和中值体积，C57BL/6小鼠在第3天经TRP2-ABX196治疗、在第7天经多柔比星或TRP2-ABX196与多柔比星的组合治疗。
图4：在实施例1中，具有B16-F10肿瘤并经TRP2-ABX196、多柔比星、或TRP2-ABX196与多柔比星的组合治疗的C57BL/6小鼠的存活。
**：p<0.01***：p<0.001；****：p<0.0001；n.s.：不显著
图5：实施例5的具有B16F10的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)，小鼠暴露于静脉内施用的载体、anti-PD-1单克隆抗体、ABX196或暴露于静脉内施用的anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合平均+/-SEM。
图6：实施例5的具有B16F10的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)，小鼠暴露于肿瘤内施用的载体、anti-PD-1单克隆抗体、ABX196或暴露于肿瘤内施用的anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合平均+/-SEM。
图7：实施例5的具有B16F10的小鼠的存活，小鼠暴露于静脉内施用的载体、anti-PD-1单克隆抗体、ABX196或暴露于静脉内施用的anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合平均+/-SEM。
图8：实施例5的具有B16F10的小鼠的存活，小鼠暴露于肿瘤内施用的载体、anti-PD-1单克隆抗体、ABX196或暴露于肿瘤内施用的anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合平均+/-SEM。
图9：实施例6的具有CT-26的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)，小鼠暴露于静脉内施用的载体、anti-PD-1单克隆抗体、ABX196或暴露于静脉内施用的anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合平均+/-SEM。
图10：实施例6的具有MBT-2的小鼠的平均肿瘤体积(mm3)，小鼠暴露于静脉内施用的载体、anti-PD-1单克隆抗体、ABX196或暴露于静脉内施用的anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合平均+/-SEM。
图11：实施例6的具有MBT-2的小鼠的存活，小鼠暴露于静脉内施用的载体(2)、anti-PD-1单克隆抗体(4)、ABX196(3)或暴露于anti-PD-1单克隆抗体与ABX196的组合(1)。
图12：在第20天，来自实施例7的各组小鼠的肝脏的的％肿瘤侵袭。G1：载体；G2：索拉非尼；G3：索拉非尼+ABX196；G4：多柔比星；G5多柔比星+ABX196；G6：anti-PD-1；G7anti-PD-1+ABX196
序列的描述
Figure BDA0002025519610000231
【具体实施方式】
实施例1
本实施例证明了包含化合物ABX196和肿瘤抗原的疫苗组合物提高了化疗剂(例如多柔比星)或免疫治疗剂(例如anti-PD-1抗体)的抗癌效果。
1.材料与方法
1.1.化合物
所使用的疫苗组合物包含肽CI II-TRP2180-188和ABX196佐剂。
序列为KFGWTGPDCNRKKPA GG NCSVYDFFVWLHYY(序列ID号:1)的肽Cl II-TRP2180-188由与来自肿瘤相关的抗原酪氨酸酶相关的蛋白-2的免疫优势肽(其在黑素细胞中过度表达)(SVYDFFVWL(序列ID号:3))融合的II类表位(KFGWTGPDCNRKKPA(序列ID号:2))构成。
佐剂ABX196具有激活NKT细胞的性能。
所使用的化疗剂是多柔比星(DOXO CELL，Cell Pharm)。
所使用的免疫治疗剂是anti-PD-1抗体(ref.：BE0146、BioXcell；克隆：RMP1-14，活性：小鼠；同种型：大鼠IgG2a；贮存条件：+4℃)。
1.2.化合物载体
将多柔比星稀释于NaCl 0.9％中。
根据制造商的推荐在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它合适的载体中制备anti-PD-1抗体。
以50mg/mL的浓度将Cl II-TRP2肽(5mg/管)重悬浮于DMSO中。
以250μg/mL的溶液形式提供佐剂ABX196。
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备含有Cl II-TRP2肽和ABX196的最终疫苗制剂。
组1在第3天使用的载体溶液(参见第2.1.2.部分)含有稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的DMSO，其终浓度与CL II-TRP2/ABX196疫苗的相同。1.3.治疗剂量
每只小鼠施用50μg剂量的肽Cl II-TRP2连同1μg佐剂ABX196。
以10mg/kg的剂量施用anti-PD-1抗体。
以12mg/kg的剂量施用多柔比星。
1.4.施用途径
通过静脉内途径将疫苗组合物注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
将anti-PD-1抗体注射入小鼠的腹膜腔中(腹腔内，IP)。
将多柔比星静脉内注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
在所有的组中，根据小鼠的最新近的体重，以10mL/kg/施用的体积剂量(即，对于一只重20g的小鼠，施用200μL的疫苗组合物)施用疫苗组合物。1.5.癌细胞系和培养条件
1.5.1.癌细胞系
下表1中详述了所使用的细胞系
表1：所使用的细胞系
细胞系 类型 物种 来源
B16-F10 黑素瘤 小鼠 ATCC <sup>a</sup>
a美国模式培养物保藏所，美国弗吉尼亚马纳萨斯
B16-F10细胞系建立自由C57BL/6J小鼠中自发出现的黑素瘤产生的肺转移。
1.5.2.细胞培养条件
细胞在37℃下，在潮湿气氛(5％CO2，95％空气)中，在其各自的培养基(参见下表)中生长为单层。培养基是含有补充有10％胎牛血清(ref:3302，Lonza)的2mM L-谷氨酰胺(ref:BE12-702F，Lonza，Verviers，比利时)的DMEM。肿瘤细胞贴壁于塑料瓶。用于实验用途，通过以下方式使肿瘤细胞从培养瓶脱附：用胰蛋白酶-凡尔生(ref:BE17-161E,Lonza)在不含钙或镁的Hanks培养基(ref:BE10-543F,Lonza)中处理5分钟并通过添加完全培养基来中和。在血细胞计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％锥虫蓝排除分析来评价它们的成活力。
1.6.动物的使用
1.6.1.动物
从JANVIER LABS(Le Genest-Saint-Isle，法国)获得95只健康雌性C57BL/6(C57BL/6J)小鼠(6-7周龄)。根据FELASA指南，将动物保持在SPF健康状况。
根据法国和欧洲规程和关于实验室动物的看护和使用的NRC指南(NRC Guide forthe Care and Use of Laboratory Animal)来实现动物居住和实验程序。
1.6.2.居住条件
将动物维持在以下受控环境条件下的居住间中：
-温度：22±2℃，
-湿度55±10％，
-光照周期(12h光明/12h黑暗)，
-HEPA过滤空气，
-在没有回流的条件下，每小时空气交换15次。
为动物圈占地提供消毒和足够的空间，具有铺垫材料、食物和水，环境和社交丰富度(群居)如下描述：
-聚碳酸酯顶部过滤器的欧洲标准III或IV型笼，
-玉米芯铺垫(ref:LAB COB 12，SERLAB，法国)，
-25kGy辐射的饮食( Soest，德国)，
-用于具有免疫能力的啮齿类的完全食物-R/M-H Extrudate，
-无菌的以0.2μm过滤的水，
-环境丰富度(SIZZLE-dri kraft-D20004SERLAB,法国)。
2.治疗
2.1.新疫苗与靶向PD-1的抗体或多柔比星的组合在具有皮下B16-F10黑素瘤的小鼠中的抗肿瘤活性研究
2.1.1.动物中B16-F10肿瘤的诱导
通过将200μL的PBS缓冲液中的1×106个B16-F10细胞皮下注射入95只C57BL/6雌性动物的右胁腹中来诱导肿瘤。将肿瘤细胞注射入胁腹中的日期视作第0天。
2.1.2.治疗方案
在第3天，然后将出自九十五(95)只(动物)中的90只根据它们的体重随机分入6组，每组(组1至6)15只动物。
使用Vivo 软件(Biosystemes，Couternon，法国)执行统计检验(方差分析，ANOVA)，以检验组间均匀性。
·来自组1的动物在第3天接受一次IV注射用于疫苗组合物的载体，并在第10、14、17和21天接受4次IP施用用于anti-PD-1抗体的载体。
·来自组2的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同1μg的ABX196。
·来自组3的动物在第10、14、17和21天接受4次IP施用anti-PD-1抗体。
·来自组4的动物在第3天接受一次IV注射50μg的CL II-TRP2连同1μg的ABX196，并在第10、14、17和21天接受4次IP施用anti-PD-1抗体。
·来自组5的动物在第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星。
·来自组6的动物在第3天接受一次IV注射50μg的CL II-TRP2连同1μg的ABX196，并在第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星。治疗方案总结在下表2中。
表2:治疗方案
Figure BDA0002025519610000271
Figure BDA0002025519610000281
如在第2.2部分中所描述地实施动物监控。
2.2.动物监控
2.2.1.临床监控
每天记录成活力和行为。一周测量体重两次直到注射肿瘤细胞，然后一周测量三次。用卡尺一周三次测量肿瘤的长度和宽度，并且通过下式来估计肿瘤的体积：
2.2.2.人道终点(Humane endpoint)
-疼痛、煎熬或苦恼的征兆：疼痛姿势、疼痛面具、行为，
-肿瘤超过正常体重的10％(考虑个体肿瘤)但不超过1,500mm3(考虑右胁腹上的肿瘤体积/MFP和左胁腹上的肿瘤体积/MFP的总和)，
-含离床活动(ambulation)或营养的肿瘤干预，
-溃烂的肿瘤或组织糜烂，
-维持20％体重减轻2个连续日，
-差的体况、消瘦、恶病质、脱水，
-对外部刺激长久缺乏主动反应，
-迅速呼吸困难、贫血、明显出血，
-神经病性征兆：绕圈、惊厥、麻痹，
-体温持续下降，
-腹胀。
2.2.3.尸体剖检
对本研究中的所有终结动物执行尸体剖检(目视检查)，且可能的话，对所有安乐濒死或发现死亡的动物执行尸体剖检。
2.3.动物程序
2.3.1.麻醉
异氟烷气体麻醉用于肿瘤接种和i.v.注射。
2.3.2.安乐死
先后通过超剂量的气体麻醉(异氟烷)和颈脱位或放血来对动物执行安乐死。
3.数据处理
3.1.健康参数
使用Vivo 软件(Biosystemes,Couternon,法国)来确定以下健康评估标准：
-提供动物的个体体重和平均体重，
-平均体重变化(MBWC)：计算经治疗的动物的平均重量变化(按百分比计)((第B天的重量减去第A天的重量)除以第A天的重量)。选择计算MBWC的区间作为体重曲线和体重测量天数的函数。
3.2.功效参数
就相对于对照动物，疫苗组合物对经治疗动物的肿瘤体积的影响而言来评价治疗功效。使用Vivo
Figure BDA0002025519610000292
软件(Biosystemes,Couternon,法国)来确定以下的抗肿瘤功效评估标准：
-提供个体肿瘤体积、平均肿瘤体积和中值肿瘤体积，
-提供没有肿瘤的小鼠的数量。
还监控小鼠存活，并用作功效参数。绘制存活曲线。
通过在第14天的经治疗的肿瘤的中值体积除以对照肿瘤的中值体积并乘以100来计算百分比治疗/对照(T/C(％)指数)。等于或小于42％的T/C％被由癌症治疗部门的药品评价分支机构(NCI)视为显著的抗肿瘤活性。
Figure BDA0002025519610000301
肿瘤生长抑制也是抗肿瘤功效的反映，并按下式计算：
高于50％的％TGI视作有活性。
3.3.统计分析
用GrapadPrism软件(6.07版本)，使用Kruskall-Wallis检验，在规定的时间对所有治疗分析平均肿瘤体积。遵照使用Dunn多重比较检验的成对比较，所有处理之间差异显著(P<0.05)。使用时序(Mantel-Cox)检验，用GrapadPrism软件(6.07版本)分析存活。遵照使用时序(Mantel-Cox)检验的成对比较，所有处理之间差异显著(P<0.05)。
4.结果
4.1.本发明疫苗组合物(TRP2-ABX196)与靶向PD-1的抗体或多柔比星的组合在具有皮下B16-F10黑素瘤的小鼠中的抗肿瘤活性研究
4.1.1.毒性参数
测定平均体重曲线，并研究治疗对小鼠的个体体重的影响。
在本研究期间，任何治疗组的经治疗的动物均没有观察到一般状况的恶化，并且临床状况保持良好。
对于三组经TRP2-ABX196免疫的小鼠，在免疫后两天测量到重大重量减轻，即，大约10％。所有的小鼠中的重量减轻是暂时的，且它们在第5天迅速恢复重量。
除了经TRP2-ABX196与多柔比星的组合治疗的小鼠(其体重在治疗时期期间保持稳定)，所有其它治疗组的重量发展类似。
因此，除了施用单独的或组合的疫苗TRP2-ABX196之后暂时的重量减轻，所有治疗均被具有B16-F10肿瘤的C57BL/6J小鼠良好耐受。
4.1.2.抗肿瘤活性分析
个体肿瘤体积曲线、平均肿瘤体积曲线和中值肿瘤体积曲线显示于图1和3中。
小鼠存活曲线显示于图2和图4。
中值存活时间(按天数计)的总结显示于下表3中。
表3：每一实验组的中值存活(天数)
治疗组 中值存活(天数)
载体 17
TRP2-ABX196 21
anti-PD-1抗体 17
TRP2-ABX196+anti-PD-1抗体 28
多柔比星 21
TRP2-ABX196+多柔比星 26
第17天的肿瘤体积的统计分析显示于下表4中。
表4:在第17天各治疗之间的肿瘤生长的统计分析
在第17天的所有治疗的全面比较：P值<0.0001(Kruskal-Wallis检验)。
治疗之间的成对比较：根据Dunn多重比较检验的P值
Figure BDA0002025519610000311
Figure BDA0002025519610000321
Vehic.:载体；α-PD-1:anti-PD-1抗体；Doxo.:多柔比星
*:P<0.05；***:P<0.001；****:P<0.0001
在第19天的肿瘤体积的统计分析显示于下表5中。
表5:在第19天治疗之间的肿瘤生长的统计分析
在第19天的所有治疗的全面比较：P值<0.0001(Kruskal-Wallis检验)。治疗之间的成对比较：根据Dunn多重比较检验的P值
Figure BDA0002025519610000322
Figure BDA0002025519610000331
Vehic.:载体；α-PD-1:anti-PD-1抗体；Doxo.:多柔比星
*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001；****:P<0.0001
在第17天和第19天的三个亚组之间的肿瘤体积的统计分析显示于下表6中。
表6:在第17天和第19天的三个亚组之间的肿瘤生长的统计分析
作为参比组的使用TRP2-ABX196的三个组的统计分析：
第17天 第19天
P值-Kruskal-Wallis检验<sup>a</sup> 0.0228 0.0121
TRP2-ABX196+Anti-PD-1抗体<sup>b</sup> * ns
TRP2-ABX196+多柔比星<sup>b</sup> * **
a:三个组(考虑TRP2-ABX196、TRP2-ABX196+anti-PD-1抗体和TRP2-ABX196+多柔比星)
b:使用TRP2-ABX196作为参比组的Dunn多重比较检验
*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001；****:P<0.0001
小鼠存活的统计分析显示于下表7中。
表7:治疗之间的小鼠存活的统计分析
所有存活曲线的全面比较：P*<0.0001
成对比较的总结：
Figure BDA0002025519610000332
α-PD-1:anti-PD-1抗体；Doxo.:多柔比星
*时序(Mantel-Cox)检验
**:粗体数字指经比较的组之间差异显著(P<0.05)。
表8:第14天的抗肿瘤活性指数
Figure BDA0002025519610000341
与anti-PD-1抗体组合的TRP2-ABX196的抗肿瘤活性分析
具有B16-F10肿瘤的小鼠在第3天经TRP2-ABX196疫苗治疗，在第10天、第14天、第17天和第21天经anti-PD-1抗体或两者的组合治疗。肿瘤生长的动力学显示于图1中。
如所预期的，相比于载体处理组，不存在与anti-PD-1抗体治疗相关的抗肿瘤活性。那些观察得到显示anti-PD-1展现任何活性的T/C和TGI值的支持(表8；T/C>42％以及TGI<50％)。相反，相比于载体处理组，使用TRP2-ABX196的小鼠治疗导致B16-F10肿瘤较慢生长。T/C和TGI值反映TRP2/ABX196活性的抗肿瘤活性(表8；T/C<42％以及TGI>50％)。TRP2/ABX196的抗肿瘤活性在与anti-PD-1抗体组合时进一步得到改善，在后一组中直到第14天肿瘤生长完全稳定；还如由T/C和TGI值所指示(表8)的，T/C和TGI值分别为低于15％和高于90％。那些值指示了高活性治疗，因为遵照NCI指南，低于15％的T/C表明治疗的高效力。
在第17天的肿瘤生长的严密且彻底的统计分析(表5)显示了所有组之间的肿瘤体积差异显著以及经TRP2-ABX196疫苗和anti-PD-1治疗的小鼠组的肿瘤体积仅相比于载体处理组得到极显著的减小。
本着提高统计分析的力度，并证明组合组相对疫苗治疗组的差异的目的，对三个组(即，TRP2-ABX196、TRP2-ABX196+anti-PD-1抗体、以及TRP2-ABX196+多柔比星)实施后续的统计分析(表6)。该分析显示第17天TRP2-ABX196和TRP2-ABX196与anti-PD-1抗体的组合之间的肿瘤体积的显著减小，然而该差异在第19天没有达到显著。
小鼠存活显示于图2中。相比于载体处理组小鼠的存活(表7)，经TRP2-ABX196以及TRP2-ABX196与anti-PD-1抗体的组合治疗的小鼠的存活得到显著改善，同时相比于单独的TRP2-ABX196疫苗，组合治疗的提高接近显著(P＝0.0710)。
与多柔比星组合的TRP2-ABX196的抗肿瘤活性分析
具有B16-F10肿瘤的小鼠在第3天经TRP2-ABX196疫苗治疗、在第7天经多柔比星治疗或经该两种的组合治疗。肿瘤生长的动力学显示于图3中。
相比于载体处理组，经单独的多柔比星治疗的小鼠的肿瘤生长呈现弱的且不显著的下降(表4和5)。即使TGI略高于50％，T/C值仍保持高于42％，这显示多柔比星缺乏抗肿瘤效力。经TRP2-ABX196与多柔比星的组合治疗的小鼠直至第14天呈现完全稳定的肿瘤生长；经对该实验的完全统计分析，在第17天和第19天的肿瘤体积的减小相对于载体处理组达到显著(表4和5)。TRP2/ABX196与多柔比星的协同效应也得到T/C和TGI值(其分别为<42％和>50％)的证明(表8)。
遵照三个组的后续统计分析(表6)，在第17天和第19天，发现TRP2-ABX196与TRP2-ABX196和多柔比星的组合之间的肿瘤体积的显著减小。
小鼠存活显示于图4中。相比于载体处理组小鼠的存活，经TRP2-ABX196与多柔比星的组合治疗的小鼠的存活得到显著改善(表7)，同时相比于各单独实施的治疗，存活提高没有达到显著。
针对所有实验组的中值存活的分析显示于表3中。
5.结论
本实施例的目的是将TRP2-ABX196疫苗与已知诱导免疫原性细胞死亡的anti-PD-1抗体或化疗剂多柔比星组合。
单独或组合测试的化合物被动物充分耐受，且没有记录药物相关的严重毒性或死亡。
接受TRP2-ABX196疫苗的所有组中观察到短暂的接近10％的重量减轻，但是所有的小鼠迅速(即，单次疫苗注射之后2～5天)恢复其正常重量。
相比于载体处理组，经TRP2-ABX196疫苗治疗的小鼠的存活得到显著改善。当分别与anti-PD-1抗体或多柔比星组合时，对于该两种组合组，抗肿瘤活性与单独的疫苗相比时进一步得到改善，将21天的中值存活分别提高到28天和26天。相对于单独的疫苗，使用TRP2-ABX196疫苗与anti-PD-1抗体的组合的存活提高接近显著(P＝0.071)。即使TRP2/ABX196和多柔比星治疗呈现抗肿瘤效果，如由T/C比所反映的，本发明的组合(ABX196+anti-PD-1或+多柔比星)也改进了那些治疗，当小鼠经组合治疗时，T/C比低于16％(参见表8)。遵照NCI指南，低于15％，则治疗视作高度有效。在组合治疗的存在下，在相同的品系上的TGI(肿瘤生长抑制)高达78％，这证明了组合治疗是高度有效的。
在B16-F10模型的强侵袭性及其值得注意的差的免疫原性情形中，这些结果是引人注目的。值得注意的是，已利用大量的注射的肿瘤细胞(即，一百万个/动物)来实施实验，这可能潜在解释为什么没有观察到肿瘤的完全消退。
实施例2
本实施例描述了相比于包含其它的α-半乳糖基神经酰胺衍生物作为佐剂的其它疫苗组合物，用包含ABX196作为佐剂的本发明疫苗组合物获得的特定效果。
材料与方法
如实施例1中所描述地实施本实验，除了对小鼠施用5×105个B16-F10细胞。
所使用的其它的α-半乳糖基神经酰胺衍生物为下式的α-GalCer：
Figure BDA0002025519610000371
-第一种实验的治疗方案如下：
Figure BDA0002025519610000372
-第二种实验的治疗方案如下：
Figure BDA0002025519610000373
Figure BDA0002025519610000381
-第三种实验的治疗方案如下：
Figure BDA0002025519610000382
Figure BDA0002025519610000391
-第四种实验的治疗方案如下：
Figure BDA0002025519610000392
在第12天和第16天每组处死5只小鼠并进行尸体解剖。
收集肿瘤并实施对下列群体的流式细胞仪分析：
·T毒性群体：CD45+/CD3+/CD8+/TNFα/穿孔素/颗粒酶
·Treg群体：CD45+/CD3+/CD4+/CD8-/FoxP3+
实施例3
1.研究目的
评估如实施例2中定义的ABX196和α-Gal-Cer在异位B16-F10黑素瘤模型中的抗肿瘤活性。
评估与多柔比星治疗组合的ABX196和α-Gal-Cer在异位B16-F10黑素瘤模型中的抗肿瘤活性。
2.材料与方法
本实验与实施例1相同，以下内容除外。
试验及参比物质载体
将多柔比星稀释于0.9％NaCl中
以250μg/mL溶液的形式提供ABX196
以1mg/mL溶液的形式提供α-Gal-Cer
在PBS缓冲液中实施稀释ABX196或αGalCer
在第7天组1中使用的载体溶液含有稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的DMSO，其终浓度与ABX196测试项目相同。
治疗剂量
以10或100ng/小鼠的剂量施用ABX196和α-Gal-Cer化合物。
以12mg/kg的剂量施用多柔比星。
施用途径
通过静脉内途径将测试物质注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
将多柔比星静脉内注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
在所有的组中，根据最新近的小鼠体重，以5mL/kg/施用的体积剂量(即，针对一只重20g的小鼠，施用100μL试验物质)施用测试物质(ABX196和α-Gal-Cer)。以10mL/kg/施用的体积剂量施用多柔比星。
3.实验设计和治疗
3.1.1.动物中诱导B16-F10肿瘤
通过将200μL PBS缓冲液中的5x105个B16-F10细胞皮下注射入一百九十五(195)只C57BL/6雌性动物的右胁腹中来诱导肿瘤。将肿瘤细胞注射入右胁腹中的日期视作第0天。
3.1.2.治疗方案
在第7天，然后将出自于一百九十五(195)只动物中的一百五十(150)只根据它们的肿瘤体积随机分入10组，每组15只动物(组1至10)。若第7天的体积太小，尤其呈现没有可测量的肿瘤的小鼠，则根据它们的体重实施随机分组。
使用Vivo 软件(Biosystemes,Couternon,法国)执行统计检验(方差分析)，以检验组间均匀性。
治疗方案总结于下表中：
Figure BDA0002025519610000412
Figure BDA0002025519610000421
·来自组1的动物在第7天和第10天接受一次IV注射测试物质载体。
·来自组2的动物第10天接受一次IV注射10ng的ABX196。
·来自组3的动物第10天接受一次IV注射10ng的α-Gal-Cer。
·来自组4的动物第10天接受一次IV注射100ng的ABX196。
·来自组5的动物第10天接受一次IV注射100ng的α-Gal-Cer。
·来自组6的动物第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星。
·来自组7的动物第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星，且在第10天接受一次IV注射10ng的ABX196。
·来自组8的动物第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星，且在第10天接受一次IV注射100ng的ABX196。
·来自组9的动物第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星，且在第10天接受一次IV注射10ng的α-Gal-Cer。
·来自组10的动物第7天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星，且在第10天接受一次IV注射100ng的α-Gal-Cer。
实施例4
1.研究目的
部分1：疫苗CL II-TRP2/ABX196或CL II-TRP2/α-Gal-Cer与anti-PD-1抗体的组合在异位B16-F10黑素瘤模型中的抗肿瘤活性的评估
部分2：来自经单独的或与anti-PD-1抗体治疗组合的CL II-TRP2/ABX196疫苗治疗的小鼠的B16-F10肿瘤中免疫浸润的表征
2.材料与方法
本实验的部分1与实施例1相同，以下内容除外。
测试及参比物质载体
根据制造商的推荐，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它合适的载体中制备anti-PD-1抗体。
将Cl II-TRP2肽(5mg/管)以50mg/mL的浓度重悬浮于DMSO中。
以250μg/mL溶液的形式提供佐剂ABX196
以1mg/mL溶液的形式提供佐剂α-Gal-Cer
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备含有Cl II-TRP2肽和ABX196的最终疫苗制剂。
在第3天组1使用的载体溶液含有稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的DMSO，其终浓度与CL II-TRP2/ABX196疫苗的相同。
治疗剂量
施用剂量为每只小鼠50μg肽Cl II-TRP2连同100ng的佐剂ABX196或α-Gal-Cer。
以10mg/kg的剂量施用anti-PD-1抗体。
施用途径
静脉内途径将测试物质注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
将anti-PD-1抗体注射入小鼠的腹膜腔中(腹腔内，IP)。
在所有的组中，根据小鼠的最新近体重，以5mL/kg/施用的体积剂量(即，针对一只重20g的小鼠，施用100μL测试物质)施用测试物质。
以10mL/kg/施用的体积剂量来施用anti-PD-1抗体。
3.实验设计和治疗
部分I：疫苗与靶向PD-1的抗体的组合在具有皮下B16-F10黑素瘤的小鼠中的抗肿瘤活性研究
i.动物中诱导B16-F10肿瘤
通过将200μL的PBS缓冲液中的5x105个B16-F10细胞肿瘤皮下注射入一百五十六(156)只C57BL/6雌性动物的右胁腹中来诱导肿瘤。将肿瘤细胞注射入右胁腹中的日期视作第0天。
ii.治疗方案
在第3天，然后将出自一百五十六(156)只动物中的一百二十(120)只根据它们的体重随机分入9组，6组(每组)15只动物(组1-6，ACT2)和3组(每组)10只动物(组1-3，ACT3)。
使用Vivo
Figure BDA0002025519610000441
软件(Biosystemes,Couternon,法国)实施统计检验(方差分析)来检验组间均匀性。
·来自组1的动物在第3天接受一次IV注射测试物质载体，在第10、14、17和21天接受4次IP施用测试参比载体(抗体)。
·来自组2的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同100ng的ABX196。
·来自组3的动物在第10、14、17和21天接受4次IP施用anti-PD-1抗体。
·来自组4的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同100ng的ABX196，在第10、14、17和21天接受4次IP施用anti-PD-1抗体。
·来自组5的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同100ng的α-Gal-Cer。
·来自组6的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同100ng的α-Gal-Cer，在第10、14、17和21天接受4次IP施用anti-PD-1抗体。
治疗方案总结于下表中：
Figure BDA0002025519610000442
Figure BDA0002025519610000451
部分II：来自经疫苗与靶向PD-1的抗体的组合治疗的小鼠的B16-F10黑素瘤肿瘤中免疫T细胞浸润的表征。
·来自组1的动物在第3天接受一次IV注射测试物质载体，在第10、14、17和21天接受4次IP施用测试参比载体(抗体)。
·来自组2的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同100ng的ABX196。
·来自组3的动物在第3天接受一次IV注射50μg的Cl II-TRP2连同100ng的ABX196，在第10、14、17和21天接受4次IP施用anti-PD-1抗体。
治疗方案总结于下表中：
Figure BDA0002025519610000461
在第13天和第17天评估肿瘤中的免疫T细胞浸润。在结束时间，收集来自每组5只小鼠的肿瘤。对于组2和3，在收集的每一天(即，第13天和第17天)收集应答与未应答小鼠之间的均衡比例。
从小鼠中移出之后，将各肿瘤称重并转移到含有RPMI培养基的管中。用手术刀将肿瘤机械破坏为几毫米大小的小片，并最终用1mL注射器柱塞在70μm筛(Ref.352350,FALCON)上压碎。锥虫蓝染色之后紧接着对细胞进行计数，且将一百万个细胞离心且重悬浮于染色缓冲液(PBS(ref:17-516F,Lonza)、0.2％BSA(ref:A7030,Sigma,Saint-Quentin-Fallavier,法国)、0.02％NaN3(ref:S2002,Sigma))中。
根据由各抗体的供应商所描述的条件，向肿瘤细胞混悬液中加入针对所选择的标记物的抗体。在细胞表面上检测到标记物CD45、CD3、CD4、CD8。细胞透化之后，细胞内检测到标记物FoxP3、TNFα、穿孔素、颗粒酶。在每一种情况下，同种型对照抗体用作阴性对照。用来测量以下两种群体的一组抗体列举在下表中：
·Treg细胞群体：CD45+/CD3+/CD4+/CD8-/FoxP3+
·T毒性群体：CD45+/CD3+/CD8+/TNFa/穿孔素/颗粒酶
Figure BDA0002025519610000471
将细胞和抗体的混合物在黑暗中于室温孵育20～30分钟，洗涤和重悬浮于200μL染色缓冲液中。所有样品贮存于冰上，并防止受光直到流式细胞仪分析。
使用配备有405nm、488nm和633nm波长处的3个激发激光器的空间流式细胞仪(LSR II,BD Biosciences)对染色的细胞进行分析。获得流式细胞仪数据直到或者每个样品记录到10,000mCD45+事件或者持续2分钟的最大持续时间为止。
实施例5：静脉内或肿瘤内施用与anti-PD-1抗体组合的ABX196的研究
1.研究目的
在体内具有黑素瘤B16F10肿瘤的同系小鼠模型上实施本研究。在具有免疫能力的C57BL/6小鼠中皮下接种B16F10肿瘤细胞。
在第0天，通过将细胞注射入8-10周龄雌性C57BL/6小鼠的胁腹中来皮下接种黑素瘤B16F10肿瘤细胞，然后将动物随机分派到对照(载体PBS处理)和治疗组。
对于anti-PD-1抗体治疗，在第6、9、12、15和21天对小鼠腹腔内(IP)注射anti-PD-1抗体。此外，在第10天当平均肿瘤尺寸达到100mm3时，使用一次施用，静脉内或肿瘤内施用1个剂量的ABX196。
这样组织用于抗肿瘤功效评价的动物生理学组：
-对照载体处理组(PBS，根据anti-PD-1治疗方案)
-anti-PD-1治疗组(腹腔内施用1个剂量)
-ABX196治疗组(第10天静脉内(iv)施用1个剂量)
-组合治疗组(第10天静脉内(iv)施用1个剂量的ABX196联合腹腔内(ip)施用1个剂量的anti-PD-1抗体)
-ABX196治疗组(第10天肿瘤内(it)施用1个剂量)
-组合治疗组(第10天肿瘤内(it)施用1个剂量的ABX196联合腹腔内(ip)施用1个剂量的anti-PD-1抗体)
其中：
每组14-15只小鼠
总共90只小鼠用于体内功效评价
2.实验程序
2.1动物
小鼠(Mus musculus)，C57BL/6品系，雌性
供应商：Charles River Laboratories-BP 0109-F 69592L'Arbresle Cedex
使用8～10周的动物。将6周龄小鼠放置驯化约14天(在8周龄植入B16F10肿瘤细胞)。本研究使用90只动物。
通过频繁周转(8-20体积/小时，这取决于所居住的动物的密度)来实施通风和空气处理，并将温度控制在22～25℃。将湿度保持在40～70％。一天保持人工照明12小时。每天检查食物(粒料)和饮水(自来水)的量和获得性。小鼠居住在集体笼中，其中每笼(820cm2笼)10只动物。由动物护理员一周更新一次笼。
2.2动物监控
每周三次测量并记录肿瘤体积和动物的体重。超过2000mm3的肿瘤体积或相对于动物的初始总量而言大于15％的重量减轻视作终点。
类似地，如果小鼠(i)俯伏或(ii)不再清洁其表皮(coat)(毛发竖立且无光泽)、(iii)活动较少，则这也视作终点。在符合这些状况中的至少一种时，通过颈脱位处死小鼠。
为了使涉及模型的疼痛、煎熬和焦虑最小化，每2天对动物进行监控。观察包括可靠的标准，例如重量减轻(15％)和姿势变化。制造环境丰富度来使焦虑最小化(塑料管)。
疼痛程序：
对于操作步骤(肿瘤细胞的皮下注射)，使用氯胺酮(0.33mg/ml)和赛拉嗪(33.6μg/ml)通过腹腔内注射来实现麻醉。
2.3黑素瘤癌细胞植入程序：
-癌细胞系：
根据供应商的说明书，在补充有终浓度为10％的FBS的RPMI 1640中体外培养黑素瘤B16F10细胞。在植入小鼠中之前，使用锥虫蓝排除法评价细胞成活力，并根据成活细胞计数制备细胞混悬液。
-小鼠中诱导黑素瘤B16F10肿瘤：
将B16F10细胞皮下植入具有免疫能力的C57BL/6小鼠(8周龄雌性)的右胁腹中。植入程序如下(所有步骤均在无菌的层流条件下进行)：
用腹腔内注射90μL麻醉剂(即，1.5mg/Kg氯胺酮和150μg/Kg赛拉嗪)来将小鼠(体重约20g)麻醉。将待植入的细胞重悬浮于无菌的PBS中，需要植入的体积装载于带有25G针的1ml注射器中(1000,000个细胞/100μL)。
2.4药理学治疗
-anti-PD-1抗体治疗
应用anti-PD-1单克隆抗体(a-PD-1)治疗方案，通过i.p.注射100μg。在第6、9、12、15和18天重复治疗4次。
27G剂量注射针用于i.p.注射。
材料：
-Anti-PD-L1单克隆抗体(a-PD-1)–(克隆RMP1-14)
-用于i.p施用的anti-PD-1单克隆抗体制剂
-溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中的anti-PD-1单克隆抗体。
使用Dulbecco PBS来溶解anti-PD-1抗体(浓度为1.0mg/mL)(体积100uL)。然后将母液制成等分试样(用于1天治疗的量)，并在-20℃下贮存。
-ABX 196治疗
在第10天通过以下方式施用ABX196：
-或者以100ng/小鼠的剂量静脉内(i.v)注射；
-或者以10ng/小鼠的剂量肿瘤内(i.t)注射
材料：
用于i.v施用的ABX196
以在PBS中的250μg/mL溶液的形式提供ABX196。制备1μg/mL的ABX196溶液，并在4℃下贮存。在第10天，将100μL的1μg/mL ABX196溶液注射入来自组3和4的小鼠的尾静脉中。
用于i.t施用的ABX196
以在PBS中的250μg/mL溶液的形式提供ABX196。制备0.4μg/mL的ABX196溶液，并在4℃下贮存。在第10天，将来自组5和6的动物麻醉，并将25μL的0.4μg/mL ABX196溶液注射入肿瘤中。
药理学治疗的总结
Figure BDA0002025519610000511
Figure BDA0002025519610000521
3.结果
接种B16F10细胞后从第6天开始，经4周时期对所有的实验动物组每周监控3次以下参数：
-肿瘤尺寸：每周3次通过体检测量，
-体重：每周监控3次，以及
-存活：表示于Kaplan-Meier图中，每周3次。
抗肿瘤活性指数计算与实施例1对于T/C(％)指数和TGI(％)的计算相同。
1.抗肿瘤应答评价
a)肿瘤体积
图5和6中给出的结果显示暴露于不同的治疗的具有B16F10的小鼠肿瘤攻击后的平均肿瘤体积(mm3)。
尤其结果显示，i.v.或i.t.施用的根据本发明的anti-PD-1抗体与ABX196的组合比单独的ABX196或单独的anti-PD-1抗体更有效减小肿瘤体积。
结果还显示于下表中。
第17天6个测试组之间的平均肿瘤体积的统计分析
双尾未配对t检验，用Welch校正
Figure BDA0002025519610000522
Figure BDA0002025519610000531
Figure BDA0002025519610000532
载体是参比组。平均+/-SEM，使用Graph Pad Prism执行时序(Mantel-Cox)检验->平均+/-SEM。执行时序(Mantel-Cox)检验，显著性；*p<0,05；**p<0,01；***p<0,001；****p<0,0001
b)存活
图7和8中给出的结果显示暴露于不同的治疗的具有B16F10的小鼠肿瘤攻击后的存活。
尤其，结果显示，i.v.或i.t.施用的根据本发明的anti-PD-1抗体与ABX196的组合导致比单独的ABX196或单独的anti-PD-1抗体更高的存活百分率。
c)抗肿瘤活性指数
Figure BDA0002025519610000541
结论:
本研究旨在评价与PD-1阻滞组合的ABX196在同系小鼠黑素瘤模型中的益处。
anti-PD-1抗体没有影响，甚至在第18天施用补充剂量也没有影响。在肿瘤体积(图5和6)和存活水平(图7和8)方面均观察到缺乏影响。
同样，在其施用(iv或it)后的较早时间点观察到ABX196的短暂影响，这不解释为显著影响。
然而，令人感兴趣地观察到ABX196与抗PD1抗体之间的协同效果。实际上，ABX196能够增强anti-PD-1效果(其根本无效)。iv和it施用ABX196均观察到这种协同效果。尤其，在肿瘤体积水平(图5和6)上可观察到anti-PD-1与anti-PD-1+ABX196(iv或it)之间的显著差异(p分别等于0.012和0.0245)。存活数据清楚证明了组合的ABX196与anti-PD-1抗体相对于载体的益处。
实施例6：单独地或与anti-PD-1抗体组合地全身施用的ABX196在结肠癌和膀胱癌中的抗肿瘤活性的测定
1.材料与方法
1.1.测试及参比物质
1.1.1.测试物质
ABX196。
1.1.2.参比物质
anti-PD-1抗体(ref.:BE0146,BioXcell；克隆：RMP1-14,反应性：小鼠；同种型：大鼠IgG2a；贮存条件：+4℃)。
1.1.3.测试及参比物质载体
根据制造商的推荐，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它合适的载体中制备anti-PD-1抗体。
以250μg/mL的溶液的形式提供ABX196。
1.2.治疗剂量
以100ng/小鼠的剂量施用ABX196。以10mg/kg的剂量施用anti-PD-1抗体。
1.3.施用途径
通过静脉内途径将测试物质注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
将anti-PD-1抗体注射入小鼠的腹膜腔中(腹腔内，IP)。
在所有的组中，以固定的100μL体积剂量(即，针对一只重20g的小鼠，大约5mL/kg/施用)来施用ABX196。
以10mL/kg/施用的体积剂量施用anti-PD-1抗体。
1.4.癌细胞系和培养条件
1.4.1.癌细胞系
所使用的细胞系详述于下表中：
细胞系 类型 物种 来源
CT-26 结肠腺癌 小鼠 ATCC a
MBT-2 膀胱癌 小鼠 ATCC a
a美国模式培养物保藏所美国弗吉尼亚马纳萨斯
·CT-26细胞系是BALB/C小鼠的N-亚硝基-N-甲基尿烷-(NNMU)诱导的未分化的结肠癌细胞系。
·鼠MBT-2细胞系源自C3H/HeJ小鼠中的致癌物诱导的膀胱肿瘤。MBT-2细胞系获得自Memorial Sloan Kettering Cancer Center(美国纽约)的Cozzi博士。
1.4.2.细胞培养条件
肿瘤细胞在37℃下，在潮湿气氛(5％CO2，95％空气)中生长为单层。培养基是RPMI1640，其含有补充有10％胎牛血清(ref:3302,Lonza)的2mM L-谷氨酰胺(ref:BE12-702F,Lonza,Verviers,比利时)。肿瘤细胞贴壁于塑料瓶。用于实验用途，通过以下方式使肿瘤细胞从培养瓶脱附：用胰蛋白酶-凡尔生(ref:BE02-007E,Lonza)在不含钙或镁的Hanks培养基(ref:BE10-543F,Lonza)中处理5分钟并通过添加完全培养基来中和。
对细胞进行计数，并通过0.25％锥虫蓝排除分析来评价它们的成活力。
1.5.动物
从CHARLES RIVER(L'Arbresles)获得六十三(63)只6-7周龄健康雌性BALB/c小鼠，用于与该品系小鼠同系的各模型(即，CT-26)，并且从Jackson Laboratory(BarHarbor,Maine)获得68(六十八)只6-7周龄健康雌性C3H/HeJ(C3H/HeOuJ)小鼠，用于MBT-2模型。
根据FELASA指南，将动物维持在SPF健康状况。根据法国和欧洲规程和关于实验室动物的看护和使用的NRC指南来实现动物居住和实验程序。动物的居住条件与实施例1中的相同。
2.实验设计和治疗
2.1.在动物中诱导CT-26和MBT-2肿瘤
通过将200μL的RPMI 1640中1x106个CT-26细胞皮下注射入63只雌性BALB/C小鼠的右胁腹中来诱导肿瘤。通过将200μL的RPMI 1640中1x106个细胞皮下注射入六十八(68)只雌性动物中来诱导MBT-2肿瘤。
2.2.治疗方案
当肿瘤达到80-120mm3的平均体积时开始治疗。使用Vivo
Figure BDA0002025519610000561
软件(Biosystemes,Couternon,法国)将出自六十三(63)只用于CT-26模型或六十八(68)只用于MBT-2模型的动物中的四十八(48)只根据它们的个体肿瘤体积随机分入4组，每组12只动物。实施统计检验(方差分析,ANOVA)来检验组间均匀性。治疗方案如下：
-来自组1的动物接受IV注射ABX196载体和IP注射anti-PD-1抗体载体，
-来自组2的动物接受IV注射100ng的ABX196，
-来自组3的动物接受每周两次施用anti-PD-1抗体，
-来自组4的动物接受IV注射100ng的ABX196以及每周两次施用anti-PD-1抗体。
治疗方案总结于下表中：
Figure BDA0002025519610000571
-*:在首次IV施用ABX196(伴随施用)后没有任何延迟地启动anti-PD-1抗体的IP注射。
2.3.动物监控
2.3.1.临床监控
所有研究数据，包括动物体重测量数据、肿瘤体积、临床和死亡率记录和治疗按时间表并记录在Vivo
Figure BDA0002025519610000572
数据库(Biosystemes,Dijon,法国)中。
每天记录成活力和行为。一周测量体重两次。一周用卡尺测量肿瘤的长度和宽度两次，并且通过下式来估计肿瘤的体积：
Figure BDA0002025519610000581
抗肿瘤活性指数计算与实施例1对于T/C(％)指数和TGI(％)的计算相同。
2.4.统计检验
使用Vivo
Figure BDA0002025519610000582
软件(Biosystemes,Couternon,法国)执行所有的统计分析。使用ANOVA执行平均体重、MBWC、随机平均肿瘤体积、平均肿瘤体积V、达到V的平均时间和平均肿瘤倍增时间的统计分析。在ANOVA结果显著的情况下，使用Bonferroni/Dunn校正执行成对检验。使用时序(Kaplan-Meier)检验来比较存活曲线。A P值<0.05视作显著。
2.5.人道终点
人道终点与实施例1相同。
2.6.尸体剖检
对研究中的所有终结动物执行尸体剖检(目视检查)，且可能的话，对所有安乐濒死或发现死亡的动物执行尸体剖检。
2.7.麻醉
异氟烷气体麻醉用于所有程序：肿瘤接种和静脉注射。
2.8.镇痛
为所有痛苦程序提供非药理学护理。另外，可在主治兽医的推荐下提供不受研究干预的药理学护理(主题治疗)。
2.9.安乐死
先后通过超剂量的气体麻醉(异氟烷)和颈脱位或放血，对动物执行安乐死。
3.结果
3.1.测试治疗在具有皮下CT-26结肠直肠癌的小鼠中的抗肿瘤活性
图9中给出显示暴露于不同的治疗中的具有CT-26的小鼠肿瘤攻击后的平均肿瘤体积(mm3)结果。尤其，结果显示，根据本发明的anti-PD-1抗体与ABX196的组合在减小肿瘤体积方面比单独的ABX196或单独的anti-PD-1A b更有效。
下表中给出抗肿瘤活性指数：
Figure BDA0002025519610000591
3.2.测试治疗在具有皮下MBT-2膀胱癌的小鼠中的抗肿瘤活性
图10中给出显示暴露于不同的治疗中的具有MBT-2的小鼠肿瘤攻击后的平均肿瘤体积(mm3)的结果。尤其，结果显示，根据本发明的anti-PD-1抗体与ABX196的组合在减小肿瘤体积方面比单独的ABX196或单独的anti-PD-1A b更有效。
下表中给出抗肿瘤活性指数：
3.3.存活
图11和下表中给出显示暴露于不同的治疗的具有MBT-2的小鼠肿瘤攻击后的存活的结果。
来自实验组的具有MBT-2的小鼠的中值存活(天数)
Figure BDA0002025519610000593
Figure BDA0002025519610000601
相比于使用单独的ABX196或Anti-PD-1抗体的治疗，ABX196与anti-PD-1抗体的组合显著改善了小鼠的存活。
各治疗之间小鼠存活的统计分析
Figure BDA0002025519610000602
所有存活曲线的全面比较：P值0.0045(***)(时序(Mantel-cox)检验)
成对比较的总结
4.结论
单独或组合的测试治疗被动物良好耐受，并且没有记录到药物有关的严重毒性或死亡。
ABX196+anti-PD-1对结肠直肠癌的抗肿瘤活性
相比于载体处理组，经ABX196+anti-PD-1治疗的小鼠的肿瘤生长延迟(参见图9)得到显著改善。T/C和TGI比率清楚证明了ABX196与anti-PD-1抗体之间的协同效应。只有使用ABX196+anti-PD-1治疗的组呈现T/C<42％。
对膀胱癌的抗肿瘤效果
ABX196+anti-PD-1抗体的组合显著降低肿瘤生长(参见图10)。T/C和TGI比率清楚证明了ABX196与anti-PD-1抗体之间的协同。相比于经载体处理的组，经ABX196+anti-PD-1治疗的小鼠的存活(参见图11)得到明显改善。对于组合组，当与单独的ABX196或单独的anti-PD-1相比时，抗肿瘤活性进一步得到改善，其中与anti-PD-1抗体组合时，27或28天的中值存活提高到34天。
实施例7：与多柔比星或索拉非尼或anti-PD-1抗体组合的ABX196在原位Hepa 1-6肝癌模型中的抗肿瘤活性的评估
1.材料与方法
1.1测试及参比物质
1.1.1测试物质
ABX196
1.1.2参比物质
多柔比星：DOXO CELL，Cell Pharm.
索拉非尼(
Figure BDA0002025519610000611
Bayer Pharma，200mg/丸)。
anti-PD-1抗体(ref.:BE0146，BioXcell；克隆：RMP1-14，反应性：小鼠；同种型：大鼠IgG2a；贮存条件：+4℃)。
1.2.测试及参比物质载体
将多柔比星稀释于0.9％NaCl中。
根据制造商的推荐，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它合适的载体中制备anti-PD-1抗体。
施用于小鼠的每一天，使索拉非尼丸剂破碎并先后溶解于DMSO(ref:41640，Fluka，Sigma，Saint Quentin Fallavier，法国),然后在Tween 20(ref:P9416,Sigma)中，然后加入NaCl(0.9％)(DMSO/Tween 20/NaCl(0.9％)的最终比率：5/5/90v/v)，以达到10mg/mL的适当浓度。
以250μg/mL溶液的形式提供ABX196。在PBS缓冲液中实施ABX196的稀释。
第5天在组1中使用的载体溶液含有稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的DMSO，其终浓度与ABX196测试项目的相同。
1.3.治疗剂量
以100ng/小鼠的剂量施用ABX196。
以12mg/kg的剂量施用多柔比星。
以10mg/kg的剂量施用anti-PD-1抗体。
以100mg/kg的剂量施用索拉非尼。
1.4.施用途径
通过静脉内途径将ABX 196注射入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
将多柔比星静脉内施用入小鼠的尾静脉中(IV，大丸剂)。
将anti-PD-1抗体注射入小鼠的腹膜腔中(腹腔内，IP)。
经由插管通过经口管饲(经口，PO)施用索拉非尼。
在所有的组中，以100μL(对于一只重20g的小鼠，大约5mL/kg/施用)的固定体积剂量施用ABX196。根据小鼠的最新近的体重，以10mL/kg/施用的体积剂量施用多柔比星、anti-PD-1抗体和索拉非尼。
1.5.癌细胞系和培养条件
1.5.1癌细胞系
所使用的细胞系详述于下表中：
细胞系 类型 来源
Hepa 1-6 肝细胞癌 ATCCa
a:美国模式培养物保藏所，美国弗吉尼亚马纳萨斯
Hepa 1-6细胞系是C57/L小鼠中产生的BW7756小鼠肝肿瘤的衍生物。
1.5.2.细胞培养条件
肿瘤细胞在37℃下，在潮湿气氛(5％CO2，95％空气)中生长为单层。培养基是DMEM，其含有4mM L-谷氨酰胺(ref:BE12-604F，Lonza，Verviers，比利时)、4.5g/l葡萄糖和补充有10％胎牛血清(ref:3302,Lonza)的1mM NaPyr。肿瘤细胞贴壁于塑料瓶。
用于实验用途，通过以下方式使肿瘤细胞从培养瓶脱附：用胰蛋白酶-凡尔生(ref:BE17-161E,Lonza)在不含钙或镁的Hanks培养基(ref:BE10-543F,Lonza)中处理5分钟并通过添加完全培养基来中和。在血细胞计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％锥虫蓝排除分析来评价它们的成活力。
1.5.3动物
从JANVIER LABS(Le Genest-Saint-Isle)获得一百(100)只5至6周龄健康雌性C57BL/6(C57BLl6J)小鼠。
根据FELASA指南，将动物维持在SPF健康状况。根据法国和欧洲规程和关于实验室动物的看护和使用的NRC指南来实现动物居住和实验程序。居住条件与实施例1中的相同。
1.6.磁共振成像
在配备有主动梯度屏蔽系统的4.7T水平磁铁(PharmaScan，Bruker BiospinGmbH，德国)上实施所有成像实验。在ParaVision(PV5.1,Bruker Biospin)下获得所有的MR图像。
1.6.1.线圈和托架
使小鼠俯卧位于专用的小鼠躯体托架中，所述托架在Pharmascan内的容积线圈(38mm内径)中滑行。
1.6.2.麻醉和生理学监控
在所有的获得期间，使用异氟烷(Minerve,Bondoufle,法国)与空气的混合物经由鼻片对小鼠进行连续麻醉。使用经胶带粘贴在其腹上的压力传感器来连续监控小鼠的呼吸率。经由紧接MRI工作站放置并通过光纤维缆(SA Instruments，USA)与传感器连接的笔记本电脑监控生理学信号。
1.6.3.MR成像序列
校准和定位
将动物定位于磁铁中之后，获得侦查图像用于校准目的。获得矢状、冠状和轴向切片。在该获得的开始，实施自动调节，以最优化垫片(Shim)、RF功率和MR信号的增幅。
Figure BDA0002025519610000641
该步骤期间使用的序列具有下列特征：
其中：TE是回波时间，TR是重复时间，FOV是视野。
1.6.4.T2加权的(T2w)解剖成像–沿轴取向
使用T2w罕见序列获得解剖图像。该步骤期间使用的序列具有下列特征：
Figure BDA0002025519610000642
必需时，可调适FOV尺寸和序列参数，以提供最佳的成像结果。
1.6.5.图像处理
将所有的MR图像转移至基于
Figure BDA0002025519610000643
的工作站，以在ImageJ下进行分析。通过目视评估整个肝脏中的肿瘤百分率来半定量评估肿瘤侵袭。
2.实验设计和治疗
2.1.通过脾内注射诱导动物中的Hepa1-6肿瘤
经由脾内注射将50μL的RPMI 1640培养基中的一百万(1x106)个肿瘤细胞移植入100只C57BL/6小鼠中。简言之，做出小的左肋下胁腹切口。使脾脏外置。将脾脏暴露于无菌纱布垫上，并在目视控制下，用27-计量注射针注射细胞混悬液。接种细胞之后切除脾脏。将肿瘤细胞注射之日视作第0天。
2.2.治疗方案
第5天开始治疗。使用Vivo
Figure BDA0002025519610000651
软件(Biosystemes,Couternon,法国)将出自一百(100)只动物中的九十九(99)只根据它们的个体体重随机分成3组，(每组)13只动物；和5组，(每组)12只动物。实施统计检验(方差分析,ANOVA)来检验组间均匀性。
治疗方案如下：
-来自组1动物在第5天接受一次IV注射ABX196载体，
-来自组2动物从第5天开始每天接受一次PO施用100mg/kg/施用的索拉非尼，持续连续的21天，
-来自组3动物在第5天接受一次IV注射100ng的ABX196，并且从第5天开始每天一次PO施用100mg/kg/施用的索拉非尼，持续连续的21天，
-来自组4的动物在第5天接受一次IV注射12mg/kg的多柔比星，
-来自组5动物在第5天接受一次IV注射100ng的ABX196和一次IV注射12mg/kg的多柔比星，
-来自组6的动物在第7、10、14和17天接受4次IP施用anti-PD-1抗体(每周两次x2(Twice weekly x2))，
-来自组7的动物在第5天接受一次IV注射100ng的ABX196并且在第7、10、14和17天接受4次IP施用anti-PD-1抗体(每周两次x2)。
治疗方案总结于下表中：
Figure BDA0002025519610000661
2.3.采血
在第7天和第22天，通过颈静脉穿刺将大约120μL血液采集入含有促凝剂的采血管中。采样后以1,300g将管离心30分钟，在室温下持续10分钟，以获得血清。在-80℃下将血清样品贮存于丙烯管中。在第22天通过ELISA分析对所有采集到的血清样品进行分析，用于测定循环AFP水平(剂量小鼠a-胎蛋白/AFP,ref:MAFP00，RD Systems)。
2.4.MRI成像时间点
在第19天和第20天，对来自组1-8的小鼠(每组5只)成像(每天40只动物)。然后执行半定量分析。
2.5.小鼠终结
在小鼠最后终结的时间(约第60天)称重肝脏。目视评估转移的数量，且记录它们各自的定位、外观(形状、颜色、一致性)和尺寸。摄取肝脏的宏观照片。
将来自所有动物(出于伦理原因或出于最后终结而处死)的肝脏/肿瘤切成4mm厚的切片并固定在4％中性缓冲的福尔马林中24～48小时，然后包封在石蜡(
Figure BDA0002025519610000671
Merck,Darmstadt,德国)中。
2.6.动物监控
2.6.1.临床监控
所有研究数据，包括动物体重测量数据、临床和死亡率记录和治疗按时间表并记录在Vivo
Figure BDA0002025519610000672
数据库(Biosystemes,Dijon,法国)中。
每天记录成活力和行为。一周测量体重三次。
2.6.2.人道终点
腹部直径超过25mm
疼痛、煎熬或苦恼的征兆：疼痛姿势、疼痛面具、行为，
含离床活动或营养的肿瘤干预，
3个连续日维持20％体重减轻，
差的体况、消瘦、恶病质、脱水，
对外部刺激长久缺乏主动反应，
迅速呼吸困难、贫血、明显出血，
神经病性征兆：绕圈、惊厥、麻痹，
体温持续下降，
腹胀。
2.6.3.尸体剖检
对研究中的所有终结动物执行尸体剖检(目视检查)，且可能的话，对所有安乐濒死或发现死亡的动物执行尸体剖检。
2.6.4.手术
手术方法描述于IACUC批准的Operating Procedures中。
2.6.5.麻醉
异氟烷气体麻醉用于所有程序：手术和采血。
2.6.6.镇痛
使多模式卡洛芬/丁丙诺啡或赛罗卡因/丁丙诺啡镇痛规程适于手术程序的严重程度。为所有痛苦程序提供非药理学护理。另外，可在主治兽医的推荐下提供不受研究干预的药理学护理(主题治疗)。
2.6.7.安乐死
先后通过超剂量的气体麻醉(异氟烷)和颈脱位或放血，对动物执行安乐死。
3.数据呈现
4.1.健康参数
使用Vivo
Figure BDA0002025519610000681
软件(Biosystemes,Couternon,法国)来确定以下健康评估标准：
-单独和/或平均(或中值)的动物体重，
-平均体重变化(MBWC)：计算经治疗的动物的平均重量变化(按百分比计)(第B天的重量减去第A天的重量除以第A天的重量)。选择所计算的MBWC的区间作为体重曲线和体重测量天数的函数。
3.2.功效参数
就相对于对照动物，试验物质对经治疗的动物的肿瘤体积的影响而言来评价治疗功效。确定下列抗肿瘤功效的评估标准：
-在第19天至20天，使用MRI成像测量单独和/或平均(或中值)的肝脏内肿瘤侵袭，
-在第22天，测量a-甲胎蛋白在血浆中的循环量，
-结束时测量的肝脏重量，
-存活曲线，
-中值存活时间。
结果
肿瘤侵袭
图12中给出的结果显示了第20天来自各治疗组的肝脏的肿瘤侵袭百分比。
第20天载体与各组之间的肿瘤侵袭的统计分析。
Kruskal-Wallis检验p值<0,0001(****)
使用Dunn检验的成对比较
Figure BDA0002025519610000691
Figure BDA0002025519610000701
第61天活的动物和肿瘤侵袭的总结
组 活的分数 没有可检测的转移的分数
1载体 4/13 3/13
2索拉非尼 5/13 5/13
3索拉非尼+ABX196 11/12 10/12
4多柔比星 9/12 9/12
5多柔比星+ABX196 8/12 6/12
6Anti-PD-1 11/12 10/12
7Anti-PD-1+ABX196 12/12 12/12
结论
本实验证明了，包括化疗剂或免疫治疗剂和ABX196的组合比单独采用的该组合的每一种组分更有效。
如图12中所显示，包括ABX196的组合治疗呈现较少的肿瘤侵袭。肿瘤侵袭降低转化为更优的存活。

Claims (15)

1.一种抗肿瘤药物组合，用于治疗癌症的用途，其包含：
(i)式(I)
Figure FDA0002025519600000011
的化合物ABX196和，
(ii)至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂，其中所述至少一种免疫治疗剂不是抗原。
2.根据权利要求1所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合，其中式(I)
Figure FDA0002025519600000012
的化合物ABX196包含在疫苗组合物(iii)中，所述疫苗组合物(iii)还包含肿瘤抗原。
3.根据权利要求1或2所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合，其中
单独地施用式(I)
Figure FDA0002025519600000013
的化合物ABX196(i)或，
疫苗组合物(iii)与所述至少一种化疗剂和/或所述至少一种免疫治疗剂(ii)。
4.根据权利要求1或2所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合，其中半同时地施用式(I)
Figure FDA0002025519600000021
的化合物ABX196(i)或，
疫苗组合物(iii)与所述至少一种化疗剂和/或所述至少一种免疫治疗剂(ii)。
5.根据权利要求1或2所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合，其中将式(I)
Figure FDA0002025519600000022
的化合物ABX196(i)或，
疫苗组合物(iii)与所述至少一种化疗剂和/或所述至少一种免疫治疗剂(ii)间隔一段时间施用，以便于获得所述组合的最大功效。
6.一种疫苗组合物，用于在治疗癌症中与至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂组合使用，所述疫苗组合物包含式(I)
Figure FDA0002025519600000023
的化合物ABX196和肿瘤抗原，其中所述至少一种免疫治疗剂不是抗原。
7.一种式(I)
的化合物ABX196，用于在治疗癌症中与至少一种化疗剂和/或至少一种免疫治疗剂组合使用，其中所述至少一种免疫治疗剂不是抗原。
8.根据权利要求7所述的用于其用途的式(I)
Figure FDA0002025519600000031
的化合物ABX196，其中所述组合进一步包含抗肿瘤抗原。
9.一种组合制剂，用于治疗癌症的用途，其包含：
(i)一个或更多个剂量单位的式(I)
Figure FDA0002025519600000032
的化合物ABX196和，
(ii)一个或更多个剂量单位的至少一种化疗剂和/或一个或更多个剂量单位的免疫治疗剂，
其中所述至少一种免疫治疗剂不是抗原。
10.根据权利要求9所述的用于其用途的组合制剂，其中式(I)
Figure FDA0002025519600000033
的化合物ABX196包含在疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包含肿瘤抗原。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合、根据权利要求6所述的用于其用途的疫苗组合物、根据权利要求7或8所述的用于其用途的化合物ABX196、或根据权利要求9或10所述的用于其用途的组合制剂，其中所述化疗剂选自多柔比星、环磷酰胺、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和奥沙利铂。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合、根据权利要求6所述的用于其用途的疫苗组合物、根据权利要求7或8所述的用于其用途的化合物ABX196、或根据权利要求9或10所述的用于其用途的组合制剂，其中所述化疗剂是多柔比星或索拉非尼。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合、根据权利要求6所述的用于其用途的疫苗组合物、根据权利要求7或8所述的用于其用途的化合物ABX196、或根据权利要求9或10所述的用于其用途的组合制剂，其中所述免疫治疗剂是选自以下的肿瘤抗原的特异性抗体：Her2/neu、EGFR、VEGF、CD20、CD52、CD33、TACE、组织蛋白酶S、uPA、uPAR、PD-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、紧密连接蛋白-3、紧密连接蛋白-4、BMCA和CTLA4。
14.根据权利要求1至5中任一项所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合、根据权利要求6所述的用于其用途的疫苗组合物、根据权利要求7或8所述的用于其用途的化合物ABX196、或根据权利要求9或10所述的用于其用途的组合制剂，其中所述免疫治疗剂是单克隆anti-PD1抗体。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的用于其用途的抗肿瘤药物组合、根据权利要求6所述的用于其用途的疫苗组合物、根据权利要求7或8所述的用于其用途的化合物ABX196、或根据权利要求9或10所述的用于其用途的组合制剂，其中所述癌症选自黑素瘤、肝癌、结肠直肠癌和膀胱癌。
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