TW201021830A - Methods to reduce B-helper T cells to treat autoimmune diseases - Google Patents

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201021830 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於調節免疫反應之領域，更特定言 之，係關於一種藉由降低^助手τ細胞之活性而用於診 斷、預防與治療自體免疫疾病之組合物與方法。 【先前技術】 在不限制本發明之領域下，所說明之背景係關於對抗自 體免疫反應之治療。 ® 許多種用於治療自體免疫疾病之化學及生物免疫治療方 法業已發展出來。免疫治療方法通常試圖在自體免疫疾病 開始後，利用例如化學藥劑（諸如類固酵）或抗自體免疫細 胞抗體減弱整體免疫反應，來治療疾病。例如，其中一種 方法試圖藉由投與可結合諸如CD22、CD20、CD19、及 CD74或HLA-DR抗原之B細胞抗原的抗體而治療自體免疫 疾病。然而’抗體會不顧其正常功能而靶向所有B細胞及 減弱整體免疫反應，而非僅是靶向自體免疫反應。 ❿ 其中一項專利案係頒予Goldenb erg等人之美國專利案第 7,074,403號’其係利用靶向B細胞之抗體的自體免疫疾病 之免疫療法。該專利案教示使用結合B細胞抗原之抗體， ' 而提供一種治療自體免疫疾病之有效方法。可單獨或在多 模式療法中使用可耦合或單獨的抗體及片段。抗體可為雙 特異性抗體且可重組製成融合蛋白質、或製成雜化之多特 異性抗體。 頒予Ways等人之美國專利案第6,1〇3,713號教示一種藉 143697.doc 201021830 由抑制T細胞與B細胞之活化及/或增殖的自體免疫疾病之 療法，及利用同功酶選擇性PKC抑制劑：（S)-3,4-[N,N'_ 1，1'-((2"-乙氧基）-3’"（0)-4’"-(N,N-二甲基胺基）-丁烷）-雙-(3,3'-吲哚基1)]-1(11)-。比咯-2,5-啶酮、及其醫藥上可接 受的鹽，治療自體免疫疾病及/或疾病症狀。 另一實例為Dingivan申請之美國專利申請公開案第 20070025990號，其係關於一種投與/投藥CD2拮抗劑以預 防及治療自體免疫病症或發炎病症之方法。該申請案教示 一種以一種或多種CD2擷抗劑用於為受檢者預防或治療自 體免疫病症或發炎病症之組合物，及一種藉由對受檢者投 與一種或多種CD2結合分子而為受檢者預防或治療自體免 疫病症或發炎病症之方法。該發明提供可達到改善效應之 CD2結合分子之劑量與投與方法，同時避免或減少與投與 一種會誘發周邊血液淋巴細胞耗盡之藥劑相關的不良或不 需的副作用。 另一申請案為Cohen等人申請之美國專利申請公開案第 20040022787號，其係關於一種利用可溶性CTLA4分子與 DMARD或NS AID治療自體免疫疾病之方法。簡而言之， 其教示一種藉由對受檢者單獨投與或與包括改變病情抗風 濕藥物（DMARD)之其他藥劑聯合投與一種阻斷内源性B7 分子與其配位體結合之可溶性CTLA4分子投與，於治療諸 如類風濕之免疫系統疾病的組合物與方法。 【發明内容】 本發明包括一種用於調節免疫反應，更特定言之，係關 143697.doc 201021830 • 於調節B-助手T細胞活性之組合物與方法。已發現IL-l2為 B細胞增殖、成熟與活化成分泌免疫球蛋白之細胞之關鍵 調節劑。文中已證實IL-12藉由控制T細胞子群的發展與活 化及其IL-21分泌而調節T細胞、B-助手T細胞之關鍵族 群。生理學上已發現且已在本文中證實：在諸如幼年型皮 肌炎（JDM)、全身性關節炎（SYS)、及全身性紅斑狼瘡 (SLE)之涉及自體免疫抗體之自體免疫病症中，此等自體 免疫疾病患者血液中之B-助手T細胞的存在量增加。業已 ^ 進一步證實：IL_ 12為自體免疫疾病患者的T細胞所分泌IL- 21之關鍵分子。 本發明包括一種降低Β_助手Τ細胞數量或活性以治療自 體免疫疾病之組合物與方法。其中一種方法包括阻斷 IL-12活性，以抑制3_助手τ細胞之發展及其分泌几-21。另 一種方法利用單株抗體（包括CXCR5)減少B_助手τ細胞的 數量。又另一種方法包括藉由阻斷ICOS而減少B-助手T細 • 胞分泌IL-21。 在-項實施例中’本發明包括一種用於治療自體免疫病 • 纟之組合物與方法，其係投與罹患自體免疫病症之受檢者

. 冑效量/α療組合物’該治療組合物包括足以減少B-助手T :月ϋ數量的IL 12抑制劑，藉此減少例如Β細胞分泌自體免 疫抗體纟癌、樣中，1L-12抑制劑包括至少-種阻斷性 抗-IL-12抗體或其片段。在另一態樣中，本方法進一步包 括一種醫藥上可接受的載劑。在一項實施例中，IL-12抑 制劑包括-種每劑量投與叫之m抑制性抗 143697.doc 201021830 體。在一態樣中’ IL-12抑制劑包括IL-12抑制性抗體，且 該受檢者係以重複投藥方式施受抗體。在又另一態樣中， IL-12抑制劑包括選自由次人類之靈長類動物抗體、鼠類 單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、及人類抗體組成之群 的抗-IL-12抗體。在另一態樣中，IL_12抑制劑包括 RNAi、siRNA或IL-12之其他核酸抑制劑。 可採用本發明治療之自體免疫疾病之非限制性實例包括 彼等其中例如：自體免疫抗體引發自體免疫反應，例如： 急性特發性灰小板減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性 紫癜、皮肌炎、西德納姆舞蹈症（Sydenham’s chorea)、重 症肌無力、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕熱、多腺 禮症候群、大皰性類天皰瘡、糖尿病、過敏性紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、鍵球菌感染後腎炎、結節性 紅斑、高安式動脈炎（Takayasu's arteritis)、阿狄森氏病 (Addison's disease)、類風濕關節炎、多發性硬化症、結節 病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、多動脈炎、 強直性脊柱炎、古德巴斯德症候群（Goodpasture's syndrome)、阻塞血栓性血管炎、修格連氏症候群 (Sjogren's syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺 炎（Hashimoto's thyroiditis)、甲狀腺毒症、硬皮病、慢性 活性肝炎、多發性肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰 瘡、韋格納肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化症、脊 髓癆、巨細胞動脈炎/肌痛、惡性貧血、急進性腎炎及纖 維性肺泡炎。在本發明之另一態樣中，IL-12抑制劑可與 143697.doc 201021830 • 可針對對抗T-細胞、B-細胞、漿細胞、或巨噬細胞或發炎 細胞激素之第二治療劑一起提供。 本發明之又另一實施例為一種加強抵抗抗原之抗原特異 性B細胞反應之方法，其包括：分離原初CD4+ T細胞；並 . 在經承載抗原的樹突狀細胞存在下，以足以發展並活化 助手T細胞之有效量之IL-12，使原初CD4+ T細胞熟化，其 中該經IL-12處理之B-助手T細胞會分泌奈莫耳量之IL-21。 在一態樣中，藉由否定選擇法，自周邊血液單核細胞分離 ® 得到原初CD4+ T細胞。在另一態樣中，藉由否定選擇法， 使用抗CD8之抗體及抗CDllb、CDllc、CD14、CD15、 CD16、CD19、CD45RO、CD56 及 HLA-DR 中之一或多種抗 體，自周邊血液單核細胞獲得原初CD4+ T細胞。在另一態 樣中，抗原係選自病毒、細菌、真菌、癌細胞或毒素。 本發明之另一實施例包括一種調節自體免疫疾病之組合 物與方法，其包括：鑒別出疑似需要治療因B細胞所分泌 _ 自體免疫抗體引起之自體免疫病症的患者；以足以抑制 ❹ CD4+ B助手T細胞之量之抗-IL-12抑制劑治療患者。在一 態樣中，該抗-IL-12抑制劑包括抗-IL-12p40 mAb或抗-IL-12p70 mAb、抗-IL-12p70 mAb、抗-IL-12受體、可溶性失 活IL-12及其組合。在另一態樣中，該抗-IL-12抑制劑包括 IL-12受體拮抗劑。在又另一態樣中，藉由否定選擇法選 出CD4+ B助手T細胞。在一態樣中，藉由否定選擇法，利 用抗 CD8 之抗體及抗 CDllb、CDllc、CD14、CD15、 CD16、CD19、CD45RO、CD56及HLA-DR中一種或多種之 143697.doc 201021830 抗體，自周邊血液單核細胞獲得CD4+ B助手T細胞。在另 一態樣中’在活化的樹突狀細胞存在下，活化CD4+ Β助 手Τ細胞。在一態樣中，自體免疫疾病係選自全身性紅斑 狼瘡、皮肌炎、幼年型皮肌炎、關節炎、全身性關節炎及 銀屑病關節炎。在一態樣中，在發展出自體免疫抗體之 前’向懷疑可能罹患自體免疫疾病之受檢者提供化“之抑 制劑。 本發明之另一項實施例為藉由下列方法製得之Β細胞助 手Τ細胞，該方法包括：分離原初cd4+ Τ細胞；及在可在 IL-12之存在下表現標靶抗原之活化樹突狀細胞存在下， 使原初CD4 Τ細胞成熟’其中該成熟的CD4+ Β-助手Τ細胞 因應對抗原之反應，釋放奈莫耳量之IL_21。 本發明之另一項實施例包括一種組合物與方法，其藉由 使分泌IL-2 1之B-助手T細胞與一種包括IL-12抑制劑之組合 物接觸，而調節8細胞增殖、成熟且活化成分泌免疫球蛋 白的細胞。在一態樣中，IL_12抑制劑減少CD4+ B-助手τ 細胞之分泌。在另一項實施例中，本發明包 括一種增加Β助手Τ細胞含量之方法，其包括在足以引發釋 放奈筹耳量IL-21的量之IL-12中培養原初CD4 Τ細胞。 【實施方式】 當下文詳細探討本發明多項實施例之製造與用法時，應 瞭解本發明提供許多可應用的發明概念，其可於許多特定 情形中具體實施。文中所探討之具體實施例僅供說明製造 及使用本發明之特定方式，且並不限制本發明之範圍。 143697.doc 201021830 為便於理解本發明，許多術語之定義如下。文中所定義 之術語具有與在本發明相M領域中_般技術者通常瞭解之 ^同3義諸如「-種」、「_個」及「該」之術語無意僅 指-個實體’還包括泛指可用於聞述之具體實施例類。文 中的術語係用於闡述本發明之具體實施例，但除非於請求 專利範圍中指出’ Μ其用法不限制本發明。

在某些實施例中，本發明_別需要治療針❹細胞 調節自體免疫疾病之患者之步驟。該鑒別可由受檢者或徤 康專家判定，且可為主細如：觀點意以客觀（例如： 藉由測試或診斷方法測定）。 如文中所用，術語「治療」（「^〜、「㈣加咖」、 「treatmg」）係指由於投與本發明之一或多種療法，而降 低或改善B細胞所調節自體免疫病症的進程、嚴重程度及/ 或時程’ 4改善B細胞所調節自體免疫病症之一種或多種 症狀（以一種或多種可鑒別的症狀較佳），該等療法之標靶 為B·助手T細胞所調節之自體免疫反應，該等τ細胞在il_ 12存在下，因應帶有抗原之展現抗原細胞（例如樹突狀細 胞）對τ細胞之活化作用，而分泌大量IL_2i。 如文中所用，術語「預防」（r prevent」、「preventi〇n」、 及Preventing」）係指降低後天罹患或發展出某特定B-細 胞調節的自體免疫病症的風險，或降低或抑制某特定B_細 胞調節之自體免疫病症之一種或多種症狀的復發、發作或 發展。在一項實施例中，IL_12抑制劑係作為預防措施投 與疑似具有本文所述任一種病症之遺傳傾向之患者（例 143697.doc •9- 201021830 如：人類）。 如文中所用，術語「有效量」係指該IL-12抑制劑之數 量足以降低或改善B-細胞調節的自體免疫病症之嚴重程 度、時程、進程、或發作；預防B-細胞調節的自體免疫病 症進展；造成B-細胞調節的自體免疫病症減退；預防與B-細胞調節的自體免疫病症相關之症狀的復發、發展、發作 或加劇；或加強或改善另一種療法之預防或治療效應。在 一項實施例中，如活體内或活體外測定，根據本發明之治 療使B細胞調節的自體免疫病症之至少一種症狀或表現至 少降低或預防約10%、或甚至20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80% ' 90%、95%、98% 或 99% ° 本發明已知闡述於Freireich等人，（1966) Cancer Chemother Rep 50: 219之用於動物與人類的劑量的相關性 (基於每平方米體表面積之毫克數）。體表面積可約略根據 患者的身高與體重確定。參見例如：Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley，N.Y.，1970，537。本發明化 合物之有效量範圍可為約0.001 mg/kg至約1000 mg/kg，更 佳為 0.01 mg/kg至約 100 mg/kg，更佳為 〇.1 mg/kg至約 10 mg/kg ;或其中最低限為介於0·001 mg/kg與900 mg/kg之間 之任意數值至最南限為介於0.1 mg/kg與1 〇〇〇 mg/kg之間之 任意數值（例如 0.005 mg/kg與 200 mg/kg，0.5 mg/kg與 20 mg/kg)之間的任何範圍。有效劑量亦可依熟習此項技術者 所認為，取決於待治療疾病、投與途徑、賦形劑用法、及 與其他治療方法（諸如使用其他藥劑）組合使用的可能性而 143697.doc -10- 201021830 變化。 操作中，本發明之組合物與方法可包括抗_IL_12抑制 劑’、可單獨或作為醫藥組合物之組分，經靜脈内、經 非,.丄腸、藉由吸入喷霧、經局部、經直腸、經鼻、經 頰内、經陰道或藉由植入式儲積器投與。傳遞IL_12抑制 劑與本發明方法之其他非限制性實例包括皮下、皮内、靜 脈内、肌肉内、關節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、鞘 ;丙火内和顱内’主射或融合技術。在某些實施例中，B_ 助手Τ細胞可經過分離，活體外處理，隨後送回接受治療 之受檢者。 幻如本發明可製成無菌可注射組合物(例如：無菌可 :射溶液或油質懸浮液)投藥’可根據相關技術中已知之 技術’利用適宜的分散劑或濕化劑（諸如τ_8〇声懸浮 無菌可注射製劑亦可為含於無毒性非經腸可接受 稀=劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如】，3_丁 2溶液。可使用之可接受載劑與溶劑為甘露醇、水、林 2溶離inger，Ssoluti〇n)及等滲氣化納溶液。另外，通 ==之非揮發油作為溶劑或懸浮介質(例如合成之 甘油單酗或甘油雙酯p諸如 生物適用於製備可注射物，其為醫肪酸及其甘油醋衍 諸如撖欖油或莲麻油，㈣可接受的天然油， 等油溶液或懸浮液亦可含有^薛^乙基化形式者。該 甲“维素或類似分散;=_或繼， 用界面活性劑或其他類㈣之其他常 劑或吊用於製造醫藥上可接 143697.doc 201021830 受1的固體、液體、或其他劑型之生物可利用度加強劑亦可 用於調配之目的。 本發明之另一實例為用於經口投與之組合物，其可呈任 一經口可接受劑型，包括但不限於膠囊、錠劑、乳液及水 )·生懸洋液刀散液與溶液。若為經口使用之錠劑，常用之 載劑包括乳糖及玉米澱粉。通常亦添加諸如硬脂酸鎂之潤 滑劑。右呈膠囊形式經口投與，適用的稀釋劑包括乳糖及 乾燥玉米澱粉。若水性懸浮液或乳液係經口投與，則活性 成份可與乳化劑或懸浮劑組合，懸浮或溶解於油相。若需 要，可添加某些甜味劑、調味劑、或染色劑。可根據醫藥 調配技術中已熟知之技術製備鼻氣霧劑或吸入組合物，且 可使用苯甲醇或其他適用之防腐劑、加強生物可利用度的 吸收促進劑、氟碳化物、及/或其他技術中已知之溶解劑 或分散劑’製成生理食鹽水溶液。本發明化合物亦可呈用 於經直腸投與之栓劑形式投與。 如文中所用，術語「醫藥上可接受的载劑」係指可包含 IL -12抑制劑且通常對接登旅&為认、 中町接又，口療的焚檢者無害之彼等藥劑 (活性或非活性）。例如諸如環糊精之可與本發明化合物形 成特定、1易溶解之複合物的溶解劑，或—種或多種 為用於遞送本發明化合物之醫藥賦形劑❹之溶解劑 他載劑實例包括膠趙二氧切、硬脂酸鎂、纖維素、十i 烧基硫酸納、及染料。 如文中所用 患者」包括但不限於人類或諸如乳牛 受檢者」、「哺乳動物」及 猴、馬、綿羊 143697.doc -】2· 201021830

錨、狗、小鼠、 大鼠、兔及倉鼠之

為有需要的患者治療或預防B 的方法可進一步包括對該待才 3 依據本揭示案，決定其他治療劑之最佳有效量範圍。在本 發月某^實施例中’當第二治療劑增強或加強^ 2抑制 劑之效應時，本發明江-12抑制劑之有效量可減少。 用於組合療法之藥劑實例可包括TNF拮抗劑（例如但不限 於TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白 質、或小为子TNF拮抗劑）、抗風濕劑（例如甲胺蝶呤、金 諾务（auranofin)、葡萄糖金（aur〇thi〇giuc〇se)、咪唑硫蝶呤 (azathiopnne)、益赛普（etanercept)、硫琥珀酸金鈉（g〇id sodium thiomalate)、羥氣喹硫酸鹽（hydr〇xychl〇rcquine sulfate)、來氟米特（iefiunomide)、柳氮磺胺吡啶 (sulfasalzine))、肌肉鬆他劑、鎮靜劑、非類固酵消炎藥物 (NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經 肌肉阻斷劑、抗微生物劑（例如胺基糖苷、抗真菌劑、抗 寄生蟲劑、抗病毒劑、碳青黴醢類抗生素（carbapenem)、 143697.doc •13- 201021830 頭芽抱菌素（cephalosporin)、氟化喧琳嗣（flurorquinolone)、 巨環内醋（macrolide)、盤尼西林（penicillin)、績胺類、四 環素、其他抗微生物劑）、抗銀屑病劑、皮質類固醇、合 成代謝類固醇、糖尿病相關藥劑、礦物質、營養素、甲狀 腺製劑、維生素、約相關激素、止濕劑、止咳劑、止吐 劑、抗潰瘍劑、緩瀉藥、抗凝血劑、促紅血球生成素（例 如：阿法依伯汀（epoetin alpha))、白jk球生成素（例如： G-CSF、重組人體白細胞生成素（Neupogen))、沙格司亭 (sargramostim)(GM-CSF、魯克因（Leukine))、疫苗、免疫 球蛋白、免疫抑制劑（例如巴力昔單抗（basiliximab)、環孢 靈（cyclosporine)、達克立單抗（daclizumab))、生長激素、 激素替代藥物、雌激素受體調節劑、瞳孔放大劑、散瞳 劑、炫化劑、抗代謝劑、有絲分裂抑制劑、放射性醫藥 物、抗抑鬱劑、抗狂躁劑、抗精神病藥劑、抗焦慮劑、安 眠藥、交感神經藥物、興奮劑、多奈11 瓜齊（donepezil)、他 克林（tacrine)、哮喘藥物、β促效劑、吸入型類固醇、白三 稀抑制劑、曱基黃嗓吟、色甘酸納、腎上腺素或類似物、 多馬絲a(domase alpha)(百慕時（Pulmozyme))、細胞激素或 細胞激素拮抗劑。適宜的劑量已於相關技術中已知。參見 例如：Wells等人編輯，Pharmacotherapy Handbook，第二 版，Appleton 及 Lange, Stamford, Conn. (2000) ； PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，豪 華版，Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)，其 相關部份係以引用的方式併入文中。 143697.doc • 14- 201021830 可使用本發明診斷、預防或治療之自體免疫疾病之非限 制性實例包括彼等可能包括至少部份或甚至主要為抵抗自 體抗原之免疫球蛋白反應的自體免疫疾病，例如自體免疫 疾病，諸如全身性紅斑狼瘡、修格連氏症候群（Sj〇gren,s syndrome)、類風濕性關節炎、青少年糖尿病、韋格納肉 芽腫、發炎性腸病、多發性肌炎、皮肌炎、多發性内分泌 障礙、施密特氏症（Schmidt's syndrome)、自體免疫葡萄膜 ^ 炎、阿狄森氏病（Addison's disease)、腎上腺炎、葛瑞夫茲 氏病（Graves’ disease)、甲狀腺炎、橋本氏曱狀腺炎、自體 免疫甲狀腺病、惡性貧盖、萎縮性胃炎、慢性肝炎、類狼 瘡肝炎、動脈硬化症、初老年期癡呆症、脫髓鞘疾病、多 發性硬化、亞急性皮膚紅斑狼瘡、副曱狀腺低能症、杜絲 勒症候群（Dressler’s syndrome)、重症肌無力、自體免疫性 血小板缺乏症、特發性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、 尋常型天皰瘡、天皰瘡、泡疹樣皮炎、局限性脫髮、類天 φ 皰瘡、硬皮症、進行性全身硬化症、CREST症候群（鈣質 /儿者症雷諾氏症候群（Raynaud's phenomenon)、食道緯 動異常、肢端皮膚硬化、微血管擴張）、成年型糖尿病（II 型糖尿病）、男性與女性自體免疫不孕、僵直性脊椎炎、 潰瘍性結腸炎、克隆氏症（Cr〇hn,s disease)、混合性結締組 織病 '結節性多發動脈炎、全身壞死性血管炎、幼發型類 風濕關節炎、腎小球腎炎、異位性皮膚炎、異位性鼻炎、 古德巴斯德症候群（G〇〇dpasture's Syn(jrome)、查加斯氏病 (Chagas' disease)、類肉瘤、風濕熱、哮喘、復發性流產、 143697.doc -15- 201021830 抗磷脂症候群、農夫肺、多型性紅斑、心切開術後症候 群、庫欣氏症症候群（Cushing's syndrome)、自體免疫慢性 活性肝炎、養鳥者肺、過敏症、過敏性腦脊髓炎、毒性表 皮壞死溶解、禿髮、亞伯氏症候群（Alport syndrome)、肺 泡炎、過敏性肺泡炎、纖維化肺泡炎、間質性肺病、結節 性紅斑、壞疽性膿皮症、輸血反應、麻瘋病、癔疾、利什 曼病、錐蟲病、高安氏動脈炎（Takayasu's arteritis)、風濕 性多發性肌痛症、顧動脈炎、血吸蟲症、巨大細胞動脈 炎、細蟲症、麵菌症、山德斯氏症（Sampter's syndrome)、 濕療、淋巴瘤樣肉芽腫、貝西氏病（Behcet's Disease)、石夕 肺症候群（Caplan's syndrom)、川崎病（Kawasaki disease)、 登革熱、腦脊髓炎、心内膜炎、心内膜纖維化、眼内炎、 持久隆起性紅斑、乾癣、胎兒母紅血球增多症、嗜酸性筋 膜炎、舒爾曼氏症候群（Shulman's syndrome)、費爾蒂氏症 候群（Felty's syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體 炎、異色性捷狀體炎、福克氏捷狀體炎（Fuch's cyclitis)、 IgA腎病、過敏性紫斑症（Henoch-Schonlein purpura)、腎絲球腎 炎、移植物對抗宿主疾病、移植排斥、人類免疫缺乏症病 毒感染、伊科病毒感染、心肌症、阿兹海默氏病、細小病 毒感染、風疹病毒感染、接種疫苗後症候群、先天性風疹 感染、霍金氏與非霍金氏淋巴瘤（Hodgkin's and Non-Hodgkin's lymphoma)、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、伊頓-朗伯症候群（Eaton-Lambert syndrome)、復發性多軟骨炎、 皮膚惡性黑色素瘤、冷凝球蛋白土症、韋爾德斯特姆氏巨 143697.doc -16- 201021830 球蛋白金症（Waldenstrom’s macroglobulinemia)、EB病毒感 染（Epstein-Barr virus infection)、腊腺炎、埃文氏症候群 (Evan's syndrome)、及自體免疫性性腺衰竭。 本發明人已發現IL-12為人體調節抗體反應的關鍵分 子。亦發現，在自體免疫疾病中（包括JDM、SYS、及 SLE)，功能性B-助手T細胞的出現頻率增加。以B-助手T 細胞為標靶從未申請作為自體免疫疾病之治療方法。使用 本發明，可能：1)阻斷IL-12，以抑制B-助手T細胞之發 展，2)阻斷IL-12，以抑制B-助手T細胞分泌IL-21，及3)靶 向B-助手T細胞，以減少其在體内數量，例如藉由使用抗 CXCR5或ICOS之單株抗體。 例如，在中和-IL-12之抗體（抗-IL-12p70 mAb)存在或不 存在下，以超抗原腸毒素B(SEB)培養獲自自體免疫疾病 (包括皮肌炎及全身性紅斑狼瘡）患者之周邊血液單核細胞 (PBMC)，在培養第二天分析IL-21分泌。添加阻斷-IL-12 之抗體，顯著抑制SEB-反應性CD4+ T細胞分泌IL-21。因 此，阻斷IL-12會減少CD4+ T細胞分泌IL-21，其在抗體反 應之發展中有重要作用。 分離原初CD4+ T細胞。藉由Ficoll梯度離心法，以獲自 成年健康志願者之採集血樣純化得PBMC，並在液氮中冷 凍保存於10% DMSO中。藉由否定選擇法第一次提高原初 CD4+ T細胞含量：在4°C下，由PBMC與純化的CD8 (eBiosciences 之 HIT8a)、CDllb(ATCC 之 LM1/2)、CDllc (BD Biosciences 之 B-ly6)、CD14(ATCC 之 M5E2)、CD15 143697.doc -17- 201021830 (BD Biosciences 之 W6D3)、CD16(Beckman Coulter 之 3G8)、CD 19(Beckman Coulter 之 J4.119)、CD45RO(BD Biosciences之 UCHL1)、CD56(Beckman Coulter之 C218)及 HLA-DR(Beckman Coulter 之 B8.12.2)mAb 培養30分鐘，且 隨後在4°C下，與磁珠平板小鼠（Dynabeads Pan Mouse) IgG(Dynal)培養30分鐘。利用磁石（magnet)(Dynal)移除與 抗體結合之細胞。以CD8 PE(eBiosciences之RPA-T8)、 CD56 PE(BD Biosciences 之 B159)、HLA-DR PE(G BD Biosciences 之 46_6)、CD45RA Tricolor(Caltag 之 MEM-56) ❺ 及 CD4+Pacific Blue(Caltag 之 S3.5)mAb 染色，隨後使用 FACSAria(BD Biosciences)篩檢 CD8. CD56_ HLA-DR. CD45RA+ CD4+細胞，進一步純化原初CD4+ T細胞。細胞 純度>99%。 分離B細胞。利用CD19 MicroBeads及LS管柱（Miltenyi Biotec)，藉由陽性選擇法，自採集血樣的PBMC第一次提 高B細胞含量。隨後，以IgD FITC(BD之IA6-2)、CD27 PE(BD Biosciences之 L128)、CD3 APC(BD Biosciences之 _ SK7)、CDllc APC(BD Biosciences之 S-HCL-3)、及 CD14 APC(Caltag之TtiK4)mAb染色，隨後使用 FACSAria，分別 以 IgD+ CD27- CD3· CDllc· CD14·細胞及 IgD_ CD27+ CD3· CDllc_ CD14_細胞篩檢原初與記憶B細胞。細胞純度 >98%。 共培養DC與原初CD4+ T細胞。利用單核細胞分離套組 (Monocyte Isolation Kit)II(Miltenyi Biotec)，藉由否定選 143697.doc -18- 201021830 擇法，自PBMC分離單核細胞。於6孔平板内，於含有1% L-麩胺醯胺、1%盤尼西林/鏈黴素、50 μΜ 2-M基乙酵、 1%丙酮酸鈉、1%非必需胺基酸（皆獲自Sigma)、25 mM HEPES ρ7·2及 10% 熱失活 FBS(Hyclone)之 RPMI 1640 完全 培養基（GIBCO)中，由單核細胞與50 ng/ml IL-4(R&D)與 100 ng/ml GM-CSF(Leukine)培養（2χ106 個細胞/3 ml/孔）， 產生DC。每隔兩天添加細胞激素。在第六天，以經輻射 且經 CD40L轉染之 L-細胞、PGN(InvivoGen，5 pg/ml)、 LPS(Sigma-Aldrich，50 ng/ml)、鞭毛蛋白（InvivoGen，20 ng/ml)、CL097(InvivoGen，5 pg/mli °米 °坐并喧淋化合 物）、熱滅活大腸桿菌（108/ml，Invitrogen)、熱滅活金黃色 酿腺葡萄球菌{Staphylococcus aureus) (108/ml-InvivoGen)、氣熱t 藏活牙 M 致病儀（Porphyromonas gi«g/va//ij(108/ml-InvivoGen)刺激樹突狀細胞。刺激6小時 後，收集暴露於TLR-配位體或熱殺死細菌之DC，並小心 洗滌：以 CDllc APC(BD Biosciences之 S-HCL-3)及 CD40L PE(BD Biosciences之TROPl)mAb染色，隨後藉由 FACS收 集呈CDllc+CD40L/DC之受CD40L-轉染之L細胞刺激之 DC。在96孔圓底平板内，在RPMI完全培養基中，以同種 異基因原初004+丁細胞（4><104個細胞/孔）培養活化的 DC(1.3 xlO3個細胞/孔），歷時7天。在一些實驗中，對培養 物添加1〇4§/1111抗-11^-12卩40(68丨〇5(^611〇63之(1：8.6)或抗-11^-12p70(Pierce之Μ122)阻斷性mAb。為分析IL-12分泌，由 刺激6小時時收集之DC在平底96孔平板内（2xl05個細胞/ 143697.doc •19· 201021830 孔）再培養24小時，並利用IL-I2p70 ELISA套組 (eBiosciences)測定分泌的 IL-12。 藉由CD3/CD28刺激原初CD4+ T細胞《在人類重組細胞 激素：IL-ip(R&D)、IL-6(R&D)、IL-10(R&D)、IL-12(R&D) 、IL-18(R&D)、IL-23(eBiosciences)、IL-27(R&D)、 TNF(R&D)(各10 ng/ml或於指定濃度下）、或IFN-α (Schering之IFN-a2b，500 IU/ml)存在下，於平底96孔平板 内，在RPMI完全培養基中，以與平板結合的CD3 mAb(5 pg/ml，ATCC之 OKT3)及可溶性 CD28 mAb(l pg/m卜 BD _ Biosciences之CD28.2)刺激原初CD4+ T細胞（1 xlO5個細胞/ 孔）。在第七天分析活化的CD4+ Τ細胞。在一些實驗中， 以1 μΜ羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺基酯（分子探針）標記 原初CD4+ Τ細胞，以追縱Τ細胞之增殖。

細胞内細胞激素染色法。在最後4小時，在GolgiPlug (BD Biosciences)存在下，以卟琳醇肉豆蔻酸乙酸酯（phorbol myristate acetate)(25 ng/ml，Sigma-Aldrich)與離子黴素 (ionomycin)(l pg/ml，Sigma-Aldrich)對已受 7 天刺激之原 ® 初CD4+ T細胞再刺激6小時。隨後利用Cytofix/Cytoperm固 定/滲透套組（BD Biosciences)固定與滲透細胞，以IL-21 PE .或 APC(eBiosciences 之 3A3-N2) 、 IL-17A PE (eBiosciences 之 64DEC17)、及 IFNy APC(BD Biosciences 之B27)mAb分析細胞質中表現之細胞激素。在以1%聚甲醛 固定後，於FACS Calibur或FACS CantoII上獲得細胞。利 用FlowJo軟體（TreeStar)分析活化的CD4+ T細胞（FSC *細 143697.doc -20- 201021830 胞）中表現之細胞激素。 活化的CD4+ T細胞之IL-21分泌。在以CDllc APC(BD Biosciences之S-HCL-3)染色，移除殘留之CDllc+ DC後， 在第七天將活化的CD4+ T細胞篩檢出FSC*細胞（CD3/28刺 激）、或CDllcteFSC*細胞（與DC共培養）。在96平底孔盤 (5xl04個細胞/孔）内，在補充10% FBS之Yssel培養基 (Gemini)中，以與平板結合的CD3 mAb(5 pg/ml)及可溶性 CD28 mAb(l pg/ml)再刺激所篩檢出的CD4+ T細胞。24小 時後，利用Luminex分析法分析產生之IL-21之濃度。 利用Luminex技術發展基於人類IL-21珠粒之分析法。使 用PCR，將與TGCTGGCTA與TGA結合並編碼小鼠信號轉 導淋巴細胞活化分子家族成員1信號轉導肽 (gb丨EDL39054.1|)殘基l-24(GL)、gb丨ABN54273.1|纖維質體 聯合體錨定蛋白質殘基1050-1219(LEAD)、及 gb|AAG29348.1|人類介白素21殘基30-162之序列嵌接入哺 乳動物表現載體pCDM8(Seed，1987)之Hind III-Not I間隔 内。該載體主導黏結蛋白-IL-2 1融合蛋白質之分泌。藉由 以CACC為前導之ref|NM_021803.1|殘基47-535嵌接入 pIRES2-DsRed2 (Clontech)之Nhe I-Not I間隔，工程處理主 導分泌天然人類IL-21之載體。依據每轉染1 L使用1 mg總 質粒DNA與1.3 ml 293 Fectin試劑計，根據製造商指示之 方法’利用Freestyle™ 293表現系統（Invitrogen)，製得分 泌的蛋白質。培養經轉染之細胞3天，收集培養物上清 液，並添加含有0.5%盤尼西林/鏈黴素（Biosource)之新鮮 143697.doc -21· 201021830 293 Freestyle™培養基（Invitrogen)，繼續培養2天。取培養 物上清液（1 L)加至20 ml Q瓊脂糖凝膠管柱（GE Healthcare)，以PBS洗蘇，隨後以PBS+lMNaClpH7.4溶 離。溶離份流經定製構建之1 ml抗-黏結蛋白（anti-Cohesin)mAb管柱，以PBS洗滌，並以0.1 Μ甘胺酸pH 2.7 溶離，且隨後相對於DPBS透析。藉由SDS-PAGE凝膠分析 蛋白質，且依據280 nm之理論消光系數分析濃度。 藉由快速、重複性免疫策略產生抗人類IL-21之小鼠 mAb。簡而言之，於30-40天期間，7至9次，以經脚板注 @ 射之1 0 pg之黏結蛋白-IL-2 1融合蛋白質與Ribi或CpG (Dynavax之1017 ISS)佐劑免疫接種6週齡之BALB/c小鼠。 觀察加強的血清效價時，於收集腹股溝與胭部引流淋巴結 之前三至四天，追加接種10 gg，用於經PEG誘發與已調整 至較低血清耐受性之P3x63、Ag8.653(ATCC CRL-1580)及/ 或SP2/0-Ag 14骨髓瘤細胞株進行體細胞融合。利用經0.5 pg/ml對照物黏結蛋白融合蛋白質或0.2 pg/ml黏結蛋白-IL-21塗佈之平板，藉由直接ELISA法，篩選稀釋度為1 : 25 〇 之融合瘤上清液。亦利用經用於錨定單株抗體之山羊抗-小鼠IgG塗布之平板，以捕捉ELISA形式，篩選上清液， 並以0.0625 pg/ml之生物素基化IL-21及隨後以中性鏈親和 素（Neutravidin)-HRP偵測。選殖產生最強力抗體之融合瘤 單細胞並擴大產生純抗體。以棋盤式ELISA形式測試 mAb，以建立能夠偵測IL-21之配對mAb。由mAb依2 pg/ml與平板結合，且隨後與2 ng/ml及20 pg/ml之IL-21， 143697.doc -22- 201021830 及隨後再與100 ng/ml生物素基化mAb培養，然後以中性鏈 親和素-HRP偵測。成功配對之mAb進一步於此ELISA中， 藉由100 ng/ml至45 pg/ml之IL-21滴定篩選，並以100 ng/ml之生物素基化mAb伴體偵測。使ELISA中最敏感之彼 等抗體與小珠共輛（Luminex公司之蛋白質與羧酸化微珠的 兩步驟碳化二亞胺偶聯法，2006年1月），並與4000 pg/ml 至1 pg/ml之重組人類IL-21之滴定系列培養，亦與預計含 有天然人類IL-21之獲自經離子黴素與PMA刺激之CD4+ T 細胞的上清液之稀釋液培養。用於偵測之mAb經生物素基 化並使用0.5 pg/ml. »所選擇配對mAb可偵測來自經IL-21 表現載體轉染之293F細胞所分泌之IL-21。使用黏結蛋白-IL-21作為標準物，其顯然比獲自兩種商品之重組IL-21更 強效。 最終Luminex分析法對hIL-21之敏感性在1 pg/ml至至少 4000 pg/ml範圍内。於Upstate Beadlyte人類26種標把之多 標 標準物（Upstate Beadlyte Human 26 plex multiplex standards.)上測試成對之IL-21。與任一分析物均無交又反 應性。成對之IL-21亦可與Upstate人類22種標靶之多標靶 結合。Luminex小珠共軏物與一般分析條件已由Giavedoni 等人詳述（Giavedoni, 2005)。使用SeroMAP小珠（26區），其 中 ΙχΙΟ7個小珠於500 μΐ 50 mM MES pH 5.0中與5 pg mAb 達最佳耦合》於25X NHS-LC生物素（Pierce)下進行偵測蛋 白mAb之生物素基化，並依0.5 pg/ml下用於分析法中。取 2 pg/ml獲自Prozyme之Phycolink抗生物素鍵菌素R-藻紅蛋 143697.doc -23- 201021830 白（Stre.pavidin R-Phycoerythrin)PJ3 1S用作報導子。 T與B細胞之共培養。如上所述篩檢活化的CD4+ T細 胞，並於減少内毒素的 SEB(0.25 ng/ml ; Toxin technology 公司）存在下，於96-孔圓底平板内，在Yssel培養基/10°/〇 FBS中，與自體記憶B細胞（4χ104個細胞/孔）共培養。在一 些實驗中，對培養物添加抗-IL-2 mAb(BIIR之ΡΑΒ956)、 抗-IL-4 mAb(BD 之 MP4-25D2)、抗-IL-10 mAb(BIIR 之 PAB548)、抗-IFN-γ mAb(BD Biosciences之 B27)、IC0S-L-mIgFc(An 細胞）、IgGIFc 或 IL-21R/Fc(皆獲自 R&D 系 ⑩ 統）。在第6或14天，藉由ELISA分析培養物中產生之 Ig(IgM、IgG及 IgA)。

Ig ELISA。為了測量Ig，在室溫下，於已塗佈5 pg/ml山 羊抗-人類 IgM、IgG、IgA Ab(均獲自 SouthernBiotech公司） 之96孔微滴定平板（Nunc)内培養培養物上清液2小時。洗 滌後，在室溫下，以鹼性磷酸酶共軛山羊抗-人類IgM、

IgG、或IgA Ab(最終稀釋度分別爲1/2000、1/2500、或 1/2500，均獲自SouthernBiotech公司）培養平板1小時。隨 ® 後，經過徹底洗滌後，以對硝基苯磷酸酯（Sigma)培育平 板。以3N NaOH終止反應，由SpectraMax平板讀數器 (Molecular Devices)讀出光學密度。 利用SEB培養PBMC。在存在或不存在抗-IL-12p40或IL-12p70 mAb下，於96-孔平板内，以SEB(0.1 pg/ml)培養純 化的新鮮PBMC(2.5xl05個細胞/孔）48小時，並藉由 Luminex測量所分泌的細胞激素。 143697.doc •24- 201021830 CD4+ T表現型分析法。為了分析CXCR5+ T細胞亞群， 以抗-CXCR5-Alexa 488、CCR6-PE、CD45RA-ECD、 CXCR3-PC5 ' CCR4-PC7 ' ICOS-APC > CD3-AF700 ' CD8-APC H7、CD45RA Pacific Blue、及 CD45 Pacific Orange mAb對獲自自體免疫疾病患者及相對年齡之健康受檢者之 新鮮全血樣本染色。利用FACSAria獲得細胞，並以FlowJo 軟體（TreeStar)分析。 IL-12作為B-助手T細胞發展之關鍵因子。IL-21為T細胞-細胞激素與NKT細胞-細胞激素，其對免疫系統之多種細 胞發揮作用。特定言之，IL-21促進B細胞生長並分化成分 泌抗體之漿細胞。圖1顯示在IL-12存在下接觸的原初CD4+ T細胞製造大量IL-21。簡而言之，在細胞激素存在下（1 〇 ng/ml，但IFN-α為500 IU/ml)，以與平板結合之 抗-CD3/CD28 mAb對原初CD4+ T細胞刺激7天。11^-10、1卜 6、IL-10、IL-18、IL-27、TNF-a、與 IFN-a未誘發出能夠 分泌IL-21之CD4+ T細胞。然而，IL-12促進能夠產生IL-21 之CD4+ T細胞之發展。透過CD3/CD28共活化時，以IL-12 啟動之CD4+ T細胞能夠分泌奈克量之IL-21(於5xl04個細胞/ 200 μΐ之培養物中，分泌3.3±0.4 ng/ml(平均土s.e.m.)， n=5)，而彼等以IL-23誘發者僅分泌皮克量（40±4 pg/ml(平 均士s.e.m.)，n=5)。因此，IL-12強力地誘發原初CD4+ T細 胞產生IL-21。 圖2顯示在IL-12存在下所啟動之原初CD4+ T細胞能夠誘 發自體B細胞產生免疫球蛋白。簡而言之，在第7天，在 143697.doc -25- 201021830 IL-12或其他細胞激素存在下，篩檢出經抗—CD3/CD28 mAb活化之原初CD4+ T細胞，並與自體血液IgD+CD27-原 初B細胞（經抗_IgM mAb及CpG(TLR-9配位體）預活化）共同 培養。添加葡萄球菌.腸毒素B(Staphylococcal enterotoxin B) (SEB)(一種超抗原），以誘發T-B相互反應，並於第14天測 量所分泌的Ig。未經細胞激素啟動之CD4+ T細胞不能誘發 原初B細胞分泌ig(A組，無）。相反地，以IL-12啟動之 CD4+ T細胞會誘發原初b細胞分泌Ig(包括IgM、IgG及 IgA)。與經以il-23啟動之CD4+ T細胞共同培養之原初B細 胞會產生顯著更少量之Ig。 類似地，以IL-12啟動之原初CD4+ T細胞比以IL-23啟動 之CD4+ T細胞誘發IgD-CD27+記憶B細胞產生顯著更高量 之Ig(B組）。因此，IL-12會誘發CD4+ T細胞成為能夠協助 B細胞之細胞。 圖3顯示在IL-12存在下經啟動之CD4+ T細胞係以依賴 IL-21之方式誘發B細胞產生免疫球蛋白。簡而言之，將可 抑制IL-21功能之可溶性IL-21受體/Fc嵌合蛋白質添加至B 細胞與經IL-12啟動之CD4+ T細胞的共培養物。阻斷性 IL-21會顯著地抑制B細胞分泌Ig。因此，以IL-12啟動之 CD4+ T細胞所分泌之IL-21在誘發B細胞產生抗體上具有重 要的作用。 圖4顯示經活化DC透過IL-12會誘發產生IL-21之CD4+ T 細胞。簡而言之，以包括大腸桿菌（£· co/ί)(革蘭氏陰性）、 金黃色釀膿葡萄球菌（51· awrews)(革蘭氏陽性）、及牙周致病 143697.doc •26- 201021830 菌（/!沿勿(革蘭氏陽性）之熱殺死細菌培養DC 6小時， 且隨後與同種異源原初CD4+ T細胞培養。以抗-CD3/CD28 mAb對在第7天篩檢出之活化的CD4+ T細胞再刺激24小 時，以測量IL-21分泌。經細菌活化DC所誘發之CD4+ T細 胞比彼等未受刺激之DC所誘發者分泌更多IL-21。向DC-T 細胞共培養物中添加抑制IL-12及IL-23之抗-IL-12p40阻斷 性mAb，藉由細菌活化的DC顯著抑制會產生IL-21之CD4+ T細胞之發展。請注意，添加僅抑制IL-12之抗-IL-12p70阻 斷性mAb時，足以顯著抑制CD4+ T細胞分泌IL-21(85±5% 抑制率。平均士s.e.m. η=5·)。因此，有感受性之細菌之DC 所誘發會產生IL-21之CD4+ T細胞係受IL-12介導。 圖5顯示阻斷IL-12可抑制本可協助B細胞之T細胞的發 展。簡而言之，在第7天篩檢出藉由與細菌活化的DC培養 而活化之CD4+ T細胞，並與自體記憶B細胞共培養。以經 細菌活化的DC所啟動CD4+ T細胞會誘發B細胞產生Ig。若 向DC-T細胞共培養物中添加抗-IL-12p40 mAb，顯著阻止 B細胞誘發Ig分泌。然而，以抗-IL-12p70 mAb阻斷IL-12即 足以抑制B-助手CD4+ T細胞之發展。因此，活化的DC所 分泌的IL-12對原初CD4+ T細胞分化成B-助手T細胞具重要 性。 IL-12控制IL-21分泌。圖6顯示IL-12控制記憶CD4+ T細 胞分泌IL-21。簡而言之，自健康成年人之血液樣本分離 得到單核細胞（PBMC)，並以葡萄球菌腸毒素B(SEB)刺 激。在培養48小時時分析所產生的ILdl濃度。當以SEB培 143697.doc -27- 201021830 養 48 小時時 ’ PBMC產生大量 il-21(A組，740士250 pg/ml。 平均士s.e.m，n=7)。在48小時培養時期期間，以抗_IL_ 12p70 mAb會阻斷IL-12導致IL-21分泌顯著減少（A&B組。 110±30 pg/ml，η=7，ρ<〇·05)。以抗-1L_12p4〇 mAb 阻斷 IL-12 及 IL-23，使 IL-21 分泌（120±40 pg/ml. n=6)減少至相 當於與僅以IL-12阻斷時的濃度。阻斷IL_12不改變包括 IL-2、IL-5、及IL-17(B組）之其他細胞激素之分泌。因 此’阻斷IL-12顯著抑制il-21及IFN-γ之分泌。因此， IL-12直接作用於產生_IL_21記憶cD4+ τ細胞，且促進 IL-21之分泌。 在自體免疫疾病中’血液中功能性B _助手τ細胞出現頻 率增加。自體抗體相關的自體免疫疾病之實例：皮肌炎 (DM)。 DM為自體免疫發炎性肌肉病變。DM患者顯示近侧肌肉 無力與包括特徵性皮膚皮疹之全身發炎性特徵。美國JDM 之發病率為每年每百萬兒童有3 2人。發作之平均年齡為7 歲，但2 5 %之患者發作時小於4歲。在美國，女孩對男孩 之比例為2.3比1。成年DM最常見於40至60歲之年齡範圍 之人群，且在美國，1〇〇,〇〇〇人中約有2人。MDM之發炎 位點主要累積CD4+ T細胞及B細胞（圖7)。許多DM患者顯 不廣譜之自體抗體，因此已提出B細胞對dm病變之重要 性。事實上，利用Rituximab(抗-CD20 mAb)之兩個最近的 典型試驗顯示消除B細胞對DM患者有益。 圖8證實當對比於健康對照組時，自體免疫疾病患者（包 143697.doc -28- 201021830 括幼年皮肌炎（JDM)患者）顯示變形之CXCR5+ T細胞子 群。 表現CXCR5(—種趨化素受體）之血液CD4+ Τ細胞代表針 對抗體反應特異化之CD4+ T細胞子群。當以抗-CD3 mAb 及ICOS刺激時，CXCR5+ CD4+ T細胞分泌大量IL-21。 CXCR5+CD4+ T細胞中，業已鑒別出三種主要亞群： Thl(CXCR3+)、Th2(CXCR3-CCR6-)及 Thl7(CCR6+)細 胞。Th2及Thl7細胞為有效的B細胞助手，而Thl細胞大體 上不能協助B細胞（A組）。 PBMC之表現型分析分析揭示：相較於相對年齡之健康 對照組，全身性關節炎（SYS)及JDM患者顯示較少的 CXCR5+Thl(CXCR3+)細胞與較多的 CXCR5+Th2(CXCR3-CCR6-)細胞（示於B組）。JDM及SLE(全身性紅斑狼瘡）比健 康對照組中出現CXCR5+Thl7(CXCR3-CCR6+)細胞之頻率 更高。更進一步，JDM中CXCR5+Th2及Thl7細胞族群之出 現頻率比彼等其他自體免疫疾病更高。CXCR5+Th2細胞族 群高於SLE，且CXCR5+Thl7細胞族群高於PSOA(乾癬性 關節炎）。顯而易見地，表現最高CXCR5+Thl7細胞之四名 JDM患者中有三人係研究組中最嚴重且最難治愈患者中之 一（肌肉酶之持續分析，CMAS<40與持續的皮膚皮疹）。 JDM中CXCR5+Thl細胞之出現頻率低於其他兩種自體免疫 疾病。因此，SYS、SLE、及 JDM 中，CXCR5+ CD4+ T細 胞子群變形為Th2及/或Thl7細胞，其代表最有效之B細胞 的助手。此免疫失調可能促成產生.致病性自體反應性B細 143697.doc -29- 201021830 胞。

得自活性JDM患者之記憶CD4+ T細胞提高分泌IL-21。 圖9顯示獲自活性JDM患者之周邊血液單核細胞分泌大量 IL-21。簡而言之，自乾癖性關節炎（ps〇A)、jDm、SYS、 及SLE兒童患者獲得新鮮的pbmC，並以SEB刺激。在第48 小時測量產生的IL-21濃度。顯而易見地，五名顯示最高 量IL-21分泌之JDM患者中有三人（以圓圈指示）為需要投與 潑尼松龍（predonisolone)之活性患者。因此’活化時，活 性JDM患者之血細胞分泌更高量之IL 2 i。 圖10顯示在誘發獲自自體免疫疾病患者之pBMC分泌 IL-21時，IL-12亦為關鍵細胞激素。簡而言之，在會中和 IL-12之mAb之存在或不存在下，以SEB刺激獲自JDM、 SYS、及SLE患者之pBMC，並分析所分泌的仄21濃度。 在獲自所有受測試自體免疫疾病之PBMC的培養物中，藉 由阻斷IL-12，顯著抑制IL_21之分泌（JDM : n=2〇， p=0.0027 ; SYS : η=7，ρ=〇·015 ; SLE : n=15，p=〇 〇〇2。

配對t-測試）’其與獲自健康成年人之樣本之結果一致。因 此’在包括JDM、SYS、及SLE之自體免疫疾病中，m 在誘發記憶CD4+ T細胞分泌IL_2 i中起重要作用。 應瞭解，本說明書中所探討之任—實施例均可採用本發 明之任一方法、套組、試劑、或組合物進行，反之亦然。 更進一步，本發明之組合物可用於達成本發明之方法。 、應瞭解’文中闡述之特定實施例係以舉财式顯示， 並不構成本發明U。在*麟本發明職下，本發 143697.doc -30- 201021830 之主要特徵可用於多項實施例。彼等熟習此項技術者採用 一般實驗;^法即咸瞭解或可確信許多等同本文關述之具 體製程。此等同等物均視為本發明範圍内，並涵蓋於本申 清專利範圍内。 本說明書中所提及之所有公開案與專利申請書均指示本 發明所涉及之彼等熟習此項技術者之技術層面。該等所有 公開案與專利申請案均以引用的方式全部併入文中該引 用程度就如同已特定地及個別地將各個公開案或專利申請 ®案以引用的方式併入一般。 於申請專利範圍及/或說明書中，當與術語「包括」組 合使用時，用詞「一個」或Γ 一種」之用法可意指「單一 個」，但其亦包括「一個或多個」、「至少一個」、及「一個 或超過一個」之含義。請求專利範圍中之術語「或」用以 意指「及/或」’除非特別指出僅意指替代，或替代為完.全 排他，雖然本揭示案亦支持僅意指替代與「及/或」之定 ❿ 義。貫穿本申請案，術語「約」用以意指包括儀器、用於 確疋數值之方法之固有誤差，或存在於研究受檢者間之差 異的數值。 如說明書及請求專利範圍中所用之字詞「包括」 (「comprising」）（及包括之任一形式諸如「包含」 (「comprise」）及「涵括」（「comprises」））、「具有」 (「having」）（及呈任一形式諸如「有」（「have」）與「含 有」（「has」））’「包括」（「including」）（及包括之任一形 式諸如「包括」（「includes」）及「包括」（r include」）） 143697.doc •31- 201021830 或「包含」（「containing」）（及包括之任一形式諸如「包 含」（「contains」）及「包含」（「contain」））係涵括性或 無限制性且不排除其他未引用之元件或方法步驟。 如文中所用之術語「或其組合」係指該術語之前所列物 件之所有排列組合與組合。例如，「A、B、C、或其組 合」意欲包括A、B、C、AB、AC、BC、或ABC，且若在 一特定情形中具順序重要性時，則亦包括BA、CA、CB、 CBA、BCA、ACB、BAC、或CAB。繼續使用該實例，表 達上包括含有一或多個物件或術語之重複的組合，諸如 BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、 CAB ABB、等。熟習此項技術者應瞭解，除非另外表現於 上下文，否則在任一組合中物件或術語之數量上一般沒有 限制。 就本揭示案而言，可在不需過度限制的實驗方法的情況 下，製得及進行文中所揭示與申請之所有組合物及/或方 法。當本發明之組合物與方法以較佳實施例之形式闡述 時，熟習此項技術者將瞭解，可在不脫離本發明之概念、 精神及範圍下，對文中所述組合物及/或方法及方法之步 驟或步驟之順序進行改變。所有該等對熟習此項技術者顯 見之類似取代及修改均認為係在本發明隨附申請專利範圍 所限定之精神、範圍及概念内。 【圖式簡單說明】 為更全面理解本發明之特點與優點，現與隨附圖示一起 參考說明本發明之具體描述，其中： 143697.doc -32- 201021830 圖1顯示IL-12誘發原初CD4+T細胞分泌IL-21。 圖2顯示以IL-12啟動之原初CD4+ T細胞會誘發B細胞產 生免疫球蛋白。 圖3顯示以IL-12啟動之原初CD4+ T細胞會透過il-21與 ICOS協助B細胞。 圖4顯示經活化DC會透過IL-12誘發會產生il-21之CD4 + T細胞。 圖5顯示阻斷性IL-12會抑制可協助B細胞之T細胞之發 ❿展。 圖6顯示IL-12藉由記憶CD4+ T細胞控制分泌IL-21之分 泌0 圖7顯示主要累積在dm之發炎位點之CD4+ T細胞與B細 胞。 圖8顯示在自體免疫疾病患者企液中，功能性^_助手T細 胞之出現頻率增加。 φ 圖9顯示由獲自活性JDM患者之周邊血液單核細胞因應 SEB增加而分泌IL-21。 圖1〇顯示取自JDM患者PBMC之IL-21分泌係依賴IL_12。 143697.doc -33-

Claims (1)

1. 201021830 七 1. 2. 3. ❿4. 5. 6. 7. ❹ 8. 、申請專利範圍： 種冶療自體免疫疾病之方法，其包括投與罹患自體免 疫疾病之党檢者有效量之治療組合物該組合物包括足 以阻斷助手τ細胞活性之量的IL-12抑制劑。 如明求項1之方法，其中該IL-12抑制劑包括至少一種阻 斷性抗-IL-12抗體或其片段。 如請求項1之方法，其進一步包括一種醫藥上可接受的 載劑。 如凊求項1之方法，其中該比_12抑制劑包括以每劑投藥i 至1，000亳克劑量投與之比_12抑制性抗體。 如所求項1之方法，其中該IL_12抑制劑包括IL_12抑制性 抗體’且該受檢者係以重複劑量方式施受抗體。 如請求項1之方法，其中該1£_12抑制劑包括選自由次人 類靈長類動物抗體、鼠類單株抗體、嵌合抗體、人源化 抗體、及人類抗體組成之群的抗dLd2抗體。 如請求項1之方法，其中該IL-i2抑制劑包括RNAi、 siRNA或IL-12之其他核酸抑制劑。 如-請求項1之方法，其中該自體免疫疾病係選自由下列 組成之群：急性特發性血小板減少性紫癜、慢性特發性 血小板減少性紫癜、皮肌炎、西德納姆舞蹈症 (Sydenham's chorea)、重症肌無力、全身性紅斑狼瘡、 狼瘡性腎炎、風濕熱、腺體症候群、大皰性類天皰瘡、 糖尿病、過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura)、鍵球 菌感染後腎炎、結節性紅斑、大動脈炎、阿狄森氏病 143697.doc 201021830 (Addison’s disease)、類風濕關節炎、多發性硬化症、結 節病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、多動脈 炎、強直性脊柱炎、古德巴斯德症候群（Goodpasture’s syndrome)、阻塞血栓性血管炎、修格連氏症候群 (Sjogreis syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、橋本甲狀 腺炎（Hashimoto's thyroiditis)、曱狀腺毒症、硬皮病、 慢性活性肝炎、多發性肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性 天皰瘡、韋格納肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化 症、脊趙療、巨細胞動脈炎/肌痛、惡性貧血、急進性腎 炎及纖維性肺泡炎。 9. 10. 11. 12. 如請求項1之方法，其進一步包括分別地投與第二治療 劑’該第二治療劑係針對τ_細胞、B_細胞、漿細胞、或 巨嗤細胞或發炎細胞激素。 一種增強用以抵抗抗原之抗原特異性B細胞反應之方 法’其包括： 分離原初CD4+ T細胞；及 在承載抗原的樹突狀細胞存在下，以足以發展及活化 B-助手T細胞之有效量的1]：_12，熟化該等原初CD4+ τ細 胞，其中經IL_12處理之該等B_助手τ細胞會分泌奈莫耳 量之IL-2 1。 如β求項10之方法，其中該等原初CD4+ τ細胞係藉由否 定選擇法從外周血夜單核細胞中分離出來。 如明求項10之方法，其中該等原初CD4+ τ細胞係藉由否 定選擇法’使用抗CD8抗體及一或多種抗CDUb、 143697.doc 201021830 CDllc、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45RO、CD56 及HLA-DR之抗體，從外周血液單核細胞中獲得。 13_如請求項1〇之方法，其中該抗原係選自病毒、細菌、真 菌、癌細胞或毒素。 14. 一種調節自體免疫疾病之方法，其包括： 鑑別出需要針對自體免疫疾病治療之疑似病患，談自 體免疫疾病係因Β細胞分泌自體免疫抗體所引起；及 以足以抑制CD4+ Β助手Τ細胞之量之抗-IL-12抑制劑治 療該患者。 15. 如請求項14之方法，其中該抗_il-12抑制劑包括抗-IL-12p40 mAb、抗-IL-12p70 mAb、抗-IL-12受體、可溶性 失活IL-12及其組合。 16. 如請求項14之方法，其中該抗_IL-12抑制劑包括IL-12受 體拮抗劑* 17. 如請求項14之方法，其中該CD4+ B助手T細胞係藉由否 定選擇法選出。 18-如請求項14之方法，其中該Cd4+ B助手T細胞係藉由否 定選擇法，使用抗CD8抗體及一或多種抗CDllb、 CDllc、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45RO、CD56 及HLA-DR之抗體從外周血液單核細胞中獲得。 19. 如請求項14之方法，其中該等CD4+ B助手T細胞在經活 化的樹突狀細胞存在下活化。 20. 如請求項14之方法，其中該自體免疫疾病係選自全身性 紅斑狼瘡、皮肌炎、幼年型皮肌炎、關節炎、全身性關 143697.doc 201021830 節炎及銀屑病關節炎。 21. 如請求項14之方法，其中該IL-12抑制劑係在疑似罹患自 體免疫疾病之受檢者發展出自體免疫抗體之前提供。 22. —種藉由下列方法製得之B細胞助手T細胞，該方法包 括： 分離原初CD4+T細胞；及 該原初CD4+ T細胞在經活化的樹突狀細胞存在下進行 熟化’該等樹突狀細胞在IL-12存在下會表現出標乾抗 原’其中該經熟化CD4 B-助手T細胞會針對抗原做出釋 放出奈莫耳量IL-21之反應。 23. —種調節B細胞增殖、熟化與活化成為分泌免疫球蛋白 細胞之方法’其係將分泌IL-21之B-助手T細胞與包含IL-12抑制劑之組合物接觸。 24. 如請求項23之方法，其中該扎_12抑制劑會減少CD4+ b_ 助手T細胞分泌IL-21與IFN-γ。 25· —種富集B助手T細胞之方法，其包括將該等原初cd4 τ 細胞於其用量足以引起釋放奈莫耳量几_21之比_12中培 養。 。 143697.doc