KR20110066193A - Ｂ-헬퍼 ｔ 세포를 감소시켜 자가면역 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

Ｂ-헬퍼 ｔ 세포를 감소시켜 자가면역 질환을 치료하는 방법 Download PDF

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자끄 에프. 방쉐로
마리아 비르히니아 파스쿠알
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Abstract

본 발명은 자가면역 장애를 갖는 피검자에게 약제학적으로 허용되는 담체 및 적어도 하나의 IL-12 억제제, 예를 들어 차단 항-IL-12 항체 또는 이의 단편을 포함하는 유효량의 치료학적 조성물을 투여함으로써 자가면역 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.

Description

Ｂ-헬퍼 Ｔ 세포를 감소시켜 자가면역 질환을 치료하는 방법{Methods to reduce B-Helper T cells to treat autoimmune diseases}
본 발명은 일반적으로 면역 반응을 조절하는 분야에 관한 것이며, 더욱 특히는 B-헬퍼(Helper) T 세포의 활성을 감소시킴으로써 자가면역 질환을 진단, 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 범위를 한정함이 없이, 본 발명의 배경기술이 자가면역 반응에 대한 치료법과 관련하여 기술되어 있다.
다수의 화학적 및 생물학적 면역치료 방법이 자가면역 장애의 치료를 위하여 개발되었었다. 전형적으로, 면역치료 방법은 예를 들어 화학제, 예컨대 스테로이드 또는 항-면역 세포 항체를 사용하여 전체 면역 반응을 약화시킴으로써 자가면역 장애가 시작된 후 자가면역 장애를 치료하기 위하여 시도되었었다. 예를 들어, 한 가지 이러한 방법에서는 B-세포 항원, 예를 들어 CD22, CD20, CD19 및 CD74 또는 HLA-DR 항원에 결합하는 항체를 투여함으로써 자가면역 장애 치료를 시도한다. 그러나, 상기 항체는 B 세포의 정상적인 기능을 고려함이 없이 모든 B 세포를 표적으로 하며 단지 표적 자가면역 반응이 아니라 전체 면역 반응을 약화시켰다.
한 가지 이러한 특허로는 B 세포를 표적으로 하는 항체를 이용한 자가면역 장애의 면역치료법에 대한, 골든버그 (Goldenberg) 등에게 허여된 미국 특허 제7,074,403호가 있다. 이 특허에는 자가면역 장애의 치료에 효과적인 수단을 제공하기 위하여 B-세포 항원에 결합하는 항체를 사용하는 것이 교시되어 있다. 접합된 (conjugated) 상태이거나 네이키드 (naked) 상태일 수 있는 항체 및 단편은 단독으로 사용되거나 다중모드 (multimodal) 치료법에서 사용된다. 상기 항체는 2특이성 (bispecific) 항체일 수 있으며, 융합 단백질로서, 또는 다중특이성 (polyspecific) 하이브리드 (hybrid) 항체로서 재조합에 의해 생성될 수 있다.
웨이스 (Ways) 등에게 허여된 미국 특허 제6,103,713호에는 T 세포 및 B 세포의 활성화 및/또는 증식의 억제에 의한 자가면역 질환의 치료적 치료법 및 아이소자임 (isozyme) 선택성 PKC 억제제, (S)-3,4-[N,N'-1,1'-((2"-에톡시)-3'''(O)-4'''-(N,N-디메틸아미노)-부탄)-비스-(3,3'-인돌릴)]-1(H)-피롤-2,5-디온 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 이용하여 자가면역 질환 및/또는 질환 징후의 치료를 위한 치료적 치료법이 교시되어 있다.
다른 예로는 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 예방 및 치료를 위한 CD2 길항제의 투여/투약 방법에 대한, 딘기반 (Dingivan)에 의해 출원된 미국 특허 출원 제20070025990호가 있다. 상기 출원에는 하나 이상의 CD2 길항제를 이용하여 피검자에서 자가면역 장애 또는 염증성 장애를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 하나 이상의 CD2 결합 분자를 상기 피검자에게 투여함으로써 상기 피검자에서 자가면역 장애 또는 염증성 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 교시되어 있다. 본 발명은 말초 혈액 림프구의 고갈을 유도하는 제제의 투여와 결부된 해로운 부작용 또는 원하지 않는 부작용을 회피하거나 감소시키면서 효능을 개선시키는 CD2 결합 분자의 용량 및 투여 방법을 제공한다.
또 다른 출원으로는 가용성 CTLA4 분자 및 DMARD 또는 NSAID를 이용하여 자가면역 질환을 치료하는 방법에 대한, 코헨 (Cohen) 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 제20040022787호가 있다. 간략히 설명하면, 내인성 B7 분자가 이의 리간드에 결합하는 것을 차단하는 가용성 CTLA4 분자를 단독으로 또는 질환 조절 항-류마티스 약물 (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug, DMARD)을 포함하는 다른 제제와 함께 피검자에게 투여함으로써 류마티스 질환과 같은 면역계 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 교시되어 있다.
본 발명은 면역 반응의 조절을 위한 조성물 및 방법을 포함하며, 더욱 특히는 B-헬퍼 T 세포 활성의 조절에 관한 것이다. IL-12는 면역글로불린 분비 세포로의 B 세포의 증식, 성숙 및 활성화의 주요 조절자임이 밝혀졌다. 본 발명에서는 IL-12가 T 세포의 주요 집단, B 헬퍼 T 세포를 이 T 세포 하위세트의 발생 및 활성화와 이의 IL-21 분비를 제어함으로써 조절한다는 것이 입증된다. 자가면역 항체를 포함하는 자가면역 장애, 예를 들어 연소자성 피부근염 (juvenile dermatomyositis, JDM), 전신성 관절염 (systemic arthritis, SYS), 및 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)에서 이들 자가면역 질환 환자의 혈액에서 B-헬퍼 T 세포의 존재가 증가함이 생리학적으로 발견되었으며 이것이 본 발명에서 입증된다. IL-12가 자가면역 질환을 갖는 환자 유래의 T 세포에 의한 IL-21 분비에 있어서 주요 분자임이 추가로 입증되었다.
본 발명은 B-헬퍼 T 세포의 개수 또는 활성을 감소시켜 자가면역 질환을 치료하는 조성물 및 방법을 포함한다. 한 가지 이러한 방법은 IL-12 활성을 차단하여 B-헬퍼 T 세포의 발생 및 이의 IL-21 분비를 억제하는 것을 포함한다. 또 다른 방법은 CXCR5를 포함하는 모노클로날 항체를 이용하여 B-헬퍼 T 세포의 개수를 감소시킨다. 또 다른 방법은 ICOS의 차단에 의해 B-헬퍼 T 세포로부터의 IL-21의 분비를 감소시키는 것을 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 자가면역 장애를 갖는 피검자에게 B-헬퍼 T 세포를 감소시키기에 충분한 양의 IL-12 억제제를 포함하는 유효량의 치료학적 조성물을 투여함으로써 예를 들어 B 세포에 의한 자가면역 항체 분비를 감소킴에 의해 자가면역 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일 양상에서, IL-12 억제제는 적어도 하나의 차단 항-IL-12 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 방법은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일 실시 양태에서, IL-12 억제제는 용량당 1 내지 1,000 mg의 투여량으로 투여되는 IL-12 억제 항체를 포함한다. 일 양상에서, IL-12 억제제는 IL-12 억제 항체를 포함하고 상기 항체를 반복 투여량으로 상기 피검자에게 투여한다. 또 다른 양상에서, IL-12 억제제는 유인 영장류 (subhuman primate) 항체, 쥐 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화 항체 및 사람 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항-IL-12 항체를 포함한다. 또 다른 양상에서, IL-12 억제제는 IL-12의 RNAi, siRNA 또는 기타 핵산 억제제를 포함한다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환의 비제한적 예는 예를 들어 자가면역 항체가 자가면역 반응을 유도하는 것, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근염, 시덴함 무도병 (Sydenham's chorea), 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 류마티스열, 다선 증후군, 수포성 유사천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쉔라인 자반증 (Henoch-Schonlein purpura), 연쇄상구균 감염후 신장염, 결절성 홍반, 다카야스 동맥염 (Takayasu's arteritis), 애디슨병 (Addison's disease), 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신병증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿패스처 증후군 (Goodpasture's syndrome), 폐색성 혈전 혈관염 (thromboangitis ubiterans), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 갑상선 중독증, 경피증, 만성 활성 간염, 다발성 근염/피부근염, 다발성 연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 막성 신병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수로, 거대 세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염 및 섬유화 폐포염을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, IL-12 억제제는 T-세포, B-세포, 형질 세포, 또는 대식세포 또는 염증성 사이토카인에 대한 2차 치료제와 함께 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 나이브 (naive) CD4+ T 세포를 분리하고; 항원-로딩된 (loaded) 수지상 세포의 존재 하에 B-헬퍼 T 세포를 발생 및 활성화하기에 충분한 유효량의 IL-12를 이용하여 상기 나이브 CD4+ T 세포를 성숙시킴을 포함하는, 항원에 대한 항원-특이적 B 세포 반응을 향상시키는 방법이며, 여기서 상기 IL-12 처리된 B-헬퍼 T 세포는 나노몰 양의 IL-21을 분비한다. 일 양상에서, 나이브 CD4+ T 세포는 음성 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리된다. 또 다른 양상에서, 나이브 CD4+ T 세포는 CD8에 대한 항체 및 CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56 및 HLA-DR에 대한 하나 이상의 항체를 이용하여 음성 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득된다. 또 다른 양상에서, 항원은 바이러스, 세균, 진균, 암 또는 독소로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 자가면역 질환을 조절하는 조성물 및 방법을 포함하며, 이는 B 세포에 의한 자가면역 항체의 분비에 의해 야기되는 자가면역 장애에 대한 치료법을 필요로 하는 것으로 의심되는 환자를 확인하고; CD4+ B 헬퍼 T 세포를 억제하기에 충분한 양의 항-IL-12 억제제로 상기 환자를 치료함을 포함한다. 일 양상에서, 항-IL-12 억제제는 항-IL-12p40 mAb 또는 항-IL-12p70 mAb, 항-IL-12p70 mAb, 항-IL-12 수용체, 가용성 비활성 IL-12 및 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 양상에서, 항-IL-12 억제제는 IL-12 수용체 길항제를 포함한다. 또 다른 양상에서, CD4+ B 헬퍼 T 세포는 음성 선별에 의해 선별된다. 일 양상에서, CD4+ B 헬퍼 T 세포는 CD8에 대한 항체 및 CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56 및 HLA-DR에 대한 하나 이상의 항체를 이용하여 음성 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득된다. 또 다른 양상에서, CD4+ B 헬퍼 T 세포는 활성화된 수지상 세포의 존재 하에 활성화된다. 일 양상에서, 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 피부근염, 연소자성 피부근염, 관절염, 전신성 관절염 및 건선 관절염으로부터 선택된다. 일 양상에서, IL-12 억제제는 자가면역 항체의 발생 이전에 자가면역 질환의 이환성(susceptibility)이 의심되는 피검자에게 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 나이브 CD4+ T 세포를 분리하고; IL-12의 존재 하에 표적 항원을 발현하는 활성화된 수지상 세포의 존재 하에 상기 나이브 CD4 T 세포를 성숙시킴을 포함하는 방법에 의해 생산된 B 세포 헬퍼 T 세포이며, 여기서, 상기 성숙된 CD4+ B-헬퍼 T 세포는 항원에 반응하여 나노몰 양의 IL-21을 방출한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 IL-21 분비 B-헬퍼 T 세포를 IL-12 억제제를 포함하는 조성물에 노출시킴으로써 면역글로불린 분비 세포로의 B 세포의 증식, 성숙 및 활성화를 조절하는 조성물 및 방법을 포함한다. 일 양상에서, IL-12 억제제는 CD4+ B-헬퍼 T 세포에 의한 IL-21 및 IFN-γ 둘 모두의 분비를 감소시킨다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 나노몰 양의 IL-21의 방출을 유도하기에 충분한 양의 IL-12와 함께 나이브 CD4 T 세포를 항온배양함을 포함하는, B 헬퍼 T 세포를 풍부화하는 방법을 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점의 보다 완전한 이해를 위하여, 이제 "발명을 실시하기 위한 구체적인 내용"을 첨부된 도면과 함께 참조하며, 여기서,
도 1은 IL-12가 나이브 CD4+ T 세포의 IL-21의 분비를 유도함을 도시한다.
도 2는 IL-12로 프라이밍된 (primed) 나이브 CD4+ T 세포가 B 세포의 면역글로불린 생성을 유도함을 도시한다.
도 3은 IL-12로 프라이밍된 CD4+ T 세포가 IL-21 및 ICOS를 통하여 B 세포를 도움을 도시한다.
도 4는 활성화된 DC가 IL-12를 통하여 IL-21-생성 CD4+ T 세포를 유도함을 도시한다.
도 5는 IL-12의 차단이 B 세포를 도울 수 있는 T 세포의 발생을 억제함을 도시한다.
도 6은 IL-12가 기억 CD4+ T 세포에 의한 IL-21 분비물의 분비를 제어함을 도시한다.
도 7은 CD4+ T 세포 및 B 세포가 DM 내의 염증 부위에 주로 축적됨을 도시한다.
도 8은 자가면역 질환 환자의 혈액에서의 기능성 B 헬퍼 T 세포의 증가된 빈도를 도시한다.
도 9는 활성 JDM 환자로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포에 의해 IL-21 분비가 SEB에 반응하여 증가함을 도시한다.
도 10은 JDM 환자 유래의 PBMC에 의한 IL-21 분비가 IL-12에 의존적임을 도시한다.
본 발명의 다양한 실시 양태들의 제조 및 사용이 하기에 상세하게 논의되어 있지만, 본 발명은 매우 다양한 특정 맥락에서 구현될 수 있는 많은 응용가능한 본 발명의 개념을 제공함이 인식되어야 한다. 본원에서 논의되는 특정 실시 양태는 본 발명을 제조 및 사용하는 특정한 방식을 단순히 예시하는 것이며, 본 발명의 범위의 한계를 정하는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 다수의 용어가 하기에 정의되어 있다. 본원에서 정의되는 용어는 본 발명에 관련있는 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 단수형의 용어 ("a", "an" 및 "the")와 같은 용어는 단수형의 실체만을 나타내고자 하는 것은 아니며, 특정 예가 예시에 사용될 수 있는 일반적인 종류를 포함한다. 본원의 술어는 본 발명의 특정 실시 양태를 기술하기 위하여 사용되지만, 이의 사용은 특허청구범위에서 약술된 것을 제외하고는 본 발명의 한계를 정하는 것은 아니다.
소정의 실시 양태에서, 본 발명은 피검자가 B-세포 조절 자가면역 장애의 치료를 필요로 함을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 확인은 피검자 또는 의료 전문가가 판단하는 것일 수 있으며, 주관적이거나 (예를 들어, 의견), 또는 객관적 (예를 들어, 시험 또는 진단 방법에 의해 측정가능함)일 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"이라는 용어는 IL-12의 존재 하에 항원-로딩된 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)에 의한 T 세포의 활성화에 반응하여 다량의 IL-21을 분비하는 B-헬퍼 T 세포에 의해 매개되는 자가면역 반응을 표적으로 하는 본 발명의 하나 이상의 치료제의 투여에 의해 생기는 B-세포 조절 자가면역 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간의 감소 또는 개선 또는 B-세포 조절 자가면역 장애의 하나 이상의 증상 (바람직하게는 하나 이상의 식별가능한 증상)의 개선을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "예방하다", "예방" 및 "예방하는"이라는 용어는 주어진 B-세포 조절 자가면역 장애의 획득 또는 발병 위험의 감소, 또는 주어진 B-세포 조절 자가면역 장애의 하나 이상의 증상의 재발, 개시 또는 발병의 감소 또는 억제를 나타낸다. 일 실시 양태에서, IL-12 억제제는 본원에 기술된 장애들 중 임의의 것에 대하여 유전적 소인을 갖는 것으로 의심되는 환자 (예를 들어, 사람)에게 예방적 조치로서 투여된다.
본원에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 B-세포 조절 자가면역 장애의 중증도, 지속 기간, 진행 또는 개시를 감소 또는 개선시키거나, B-세포 조절 자가면역 장애의 진행을 예방하거나, B-세포 조절 자가면역 장애의 퇴행을 야기하거나, B-세포 조절 자가면역 장애와 결부된 증상의 재발, 발병, 개시 또는 진행을 예방하거나, 또는 또 다른 치료법의 예방적 또는 치료적 효과(들)를 향상 또는 개선시키기에 충분한 IL-12 억제제의 양을 나타낸다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 치료법은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 측정할 때 적어도 약 10%, 또는 심지어 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의, B-세포 조절 자가면역 장애의 적어도 하나의 증상 또는 이의 출현의 감소 또는 예방을 제공한다.
본 발명은 동물 및 사람에 있어서의 투여량들 (신체 표면적 제곱미터 당 밀리그램을 기반으로 함)의 상호관련성이 문헌[Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep 50: 219]에 기술되어 있음을 인식하고 있다. 신체 표면적은 환자의 키 및 체중으로부터 대략적으로 측정될 수 있다. 예를 들어 문헌[Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N.Y., 1970, 537] 참조. 본 발명의 화합물의 유효량은 약 0.001 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위; 또는 상기 범위의 임의의 하한치가 0.001 mg/kg 내지 900 mg/kg 사이의 임의의 양이고 상기 범위의 상한치가 0.1 mg/kg 내지 1000 mg/kg 사이의 임의의 양인 임의의 범위 (예를 들어 0.005 mg/kg 내지 200 mg/kg 사이, 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg 사이)일 수 있다. 또한 유효량은 당업계의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 치료되는 질환, 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 제제의 사용과 같은 기타 치료적 치료제를 공동 사용할 가능성에 따라 달라질 것이다.
실시에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 단독으로 또는 약제학적 조성물의 성분으로서 정맥내 투여되거나, 경구 투여되거나, 비경구 투여되거나, 흡입 스프레이에 의해 투여되거나, 국소 투여되거나, 직장 투여되거나, 비강 투여되거나, 협측 투여되거나, 질 투여되거나, 이식된 저장소 (reservoir)를 통하여 투여될 수 있는 항-IL-12 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 IL-12 억제제의 전달 방법의 다른 비제한적인 예는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액막내, 스템내 (intrastemal), 경막내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 소정의 실시 양태에서, B-헬퍼 T 세포는 분리되고, 시험관 내에서 처리되고, 그 후 치료를 위하여 피검자에게 되돌려질 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 주사가능한 멸균 조성물로서 제조 및 투여될 수 있으며, 예를 들어, 주사가능한 멸균 수성 또는 유성 현탁액이 (예를 들어, 트윈 (Tween) 80과 같은) 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 멸균 제제는 또한 비독성의 비경구용으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 주사가능한 멸균 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 용액으로서의 것일 수 있다. 이용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 만니톨, 물, 링거액 (Ringer's solution) 및 염화나트륨 등장액이 있다. 게다가, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다 (예를 들어, 합성 모노- 또는 디글리세라이드). 지방산, 예를 들어 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체는 올리브유 또는 피마자유와 같은 약제학적으로 허용되는 천연 오일이 이러한 바와 같이 특히 이의 폴리옥시에틸화 버전에서 주사제의 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 또는 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 유사 분산제를 또한 함유할 수 있다. 일반적으로 사용되는 기타 계면활성제, 예를 들어 트윈 또는 스팬 (Span) 또는 기타 유사 유화제 또는 약제학적으로 허용되는 고형물, 액체 또는 기타 투여형의 제조에 일반적으로 사용되는 생체이용성 인핸서가 제형화를 위하여 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로는 경구 투여용 조성물이 있으며, 이는 캡슐제, 정제, 에멀젼, 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 경구용으로 허용되는 투여형일 수 있다. 경구용 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘이 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여함에 있어서, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 또는 에멀젼이 경구 투여될 때, 활성 성분은 유화제 또는 현탁제와 조합된 유성 상 중에 현탁 또는 용해될 수 있다. 경우에 따라, 소정의 감미제, 착향제 또는 착색제가 첨가될 수 있다. 비강용 에어로졸 또는 흡입 조성물은 의약품 제형화 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조될 수 있으며, 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생체이용성을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 당업계에 공지된 기타 가용화제 또는 분산제를 이용하여 염수 중 용액으로서 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 IL-12 억제제가 혼입될 수 있는 제제 (활성 또는 비활성)를 나타내는데, 이는 치료될 피검자에게 일반적으로 유해하지 않다. 예를 들어, 본 발명의 화합물과 특정한, 더욱 가용성인 복합체를 형성하는 사이클로덱스트린과 같은 가용화제, 또는 하나 이상의 가용화제가 본 발명의 화합물을 전달하기 위한 약제학적 부형제로서 이용될 수 있다. 다른 담체의 예는 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산마그네슘, 셀룰로오스, 나트륨 라우릴 설페이트 및 염료를 포함한다.
본원에서 사용되는 "동물", "피검자", "포유동물" 및 "환자"라는 용어는 사람 또는 동물, 예를 들어 소, 원숭이, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼 및 햄스터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
B-세포 조절 자가면역 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 B-세포 조절 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 방법은 상기 환자에게 IL-12 억제제를 유효량으로 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 또한 IL-12 억제제는 B-세포 조절 자가면역 장애 또는 이의 증상을 예방 또는 치료하기 위하여 통상적으로 사용되는 것과 같은 기타 치료제와 함께 전달될 수 있다. 이러한 병용 요법적 치료에서, IL-12 억제제 및 기타 약물 제제(들) 둘 모두는 통상적인 방법에 의해 포유동물 (예를 들어, 사람, 남성 또는 여성)에게 투여될 수 있다. 상기 제제는 단일 투여형 또는 개별 투여형으로 투여될 수 있다. 유효량의 상기 다른 치료제는 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 개시 내용에 비추어 보면, 숙련자라면 상기 다른 치료제의 최적의 유효량 범위를 결정할 수 있다. 본 발명의 소정의 실시 양태에서, 본 발명의 IL-12 억제제의 유효량은 제2 치료제가 IL-12 억제제의 효과를 강화하거나 향상시킬 경우 감소될 수 있다.
병용 요법용 제제의 예는 TNF 길항제 (예를 들어, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파살진), 근이완제, 최면제, 비스테로이드계 항-염증약 (non-steroid anti-inflammatory drug, NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크로라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또 다른 항미생물제), 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드 (anabolic steroid), 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선약, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 진토제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로파이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (filgrastim) (예를 들어, G-CSF, 뉴포젠 (Neupogen)), 사그라모스팀 (sargramostim) (GM-CSF, 류카인 (Leukine)), 백신접종, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 대사 길항제, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 조증 치료제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경 유사 작용제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식약, 베타 효능제, 흡입용 스테로이드제, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도마제 알파 (domase alpha) (풀모자임 (Pulmozyme)), 사이토카인 또는 사이토카인 길항작용을 포함할 수 있다. 적합한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 관련 부분이 본원에 참고로 포함된 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]을 참조.
본 발명을 이용하여 진단, 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역 질환의 비제한적인 예는 자기-항원에 대하여 적어도 부분적으로 또는 심지어 주로 면역글로불린 반응을 포함할 수 있는 자가면역 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 연소자 발병성 진성 당뇨병, 베게너 육아종증, 염증성 장질환, 다발성 근염, 피부근염, 다발성 내분비계 부전, 슈미트 증후군 (Schmidt's syndrome), 자가면역 포도막염, 애디슨병, 부신염, 그레이브스병 (Graves' disease), 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 위 위축, 만성 간염, 루푸스양 간염, 아테롬성 동맥 경화증, 초로성 치매, 탈수초성 질환, 다발성 경화증, 아급성 피부형 홍반성 루푸스, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 심상성 천포창, 천포창, 포진상 피부염, 원형 탈모증, 유사 천포창, 경피증, 진행성 전신성 경화증, CREST 증후군 (석회증 (calcinosis), 레이노 현상 (Raynaud's phenomenon), 식도 운동 장애 (esophageal dysmotility), 수지경화증 (sclerodactyly) 및 모세혈관 확장증), 성인 발병성 진성 당뇨병 (제II형 당뇨병), 남성 및 여성 자가면역성 불임, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 크론병 (Crohn's disease), 혼합성 결합 조직 질환, 결절성 다발성 동맥염, 전신성 괴사성 혈관염, 연소자 발병성 류마티스 관절염, 사구체신염, 아토피성 피부염, 아토피성 비염, 굿패스처 증후군, 차가스병 (Chagas' disease), 사르코이드증, 류마티스열, 천식, 반복 유산, 항-인지질 증후군, 농부폐 (farmer's lung), 다형 홍반, 심장 절개술 후 증후군, 쿠싱 증후군 (Cushing's syndrome), 자가면역성 만성 활성 간염, 새 사육가 폐 (bird-fancier's lung), 알러지성 질환, 알러지성 뇌척수염, 독성 표피 괴사 용해증, 탈모증, 알포트 증후군 (Alport's syndrome), 폐포염, 알러지성 폐포염, 섬유화 폐포염, 간질성 폐질환, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈마니아증, 트리파노조마증, 다카야스 동맥염, 다발성 근육통, 측두동맥염, 주혈흡충증, 거대 세포 동맥염, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군 (Sampter's syndrome), 습진, 림프종 모양 육아종증, 베체트병 (Behcet's disease), 카플란 증후군 (Caplan's syndrome), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 뎅기열, 뇌척수염, 심내막염, 심근내막 섬유증, 안내염, 장기 융기성 홍반 (erythema elevatum et diutinum), 건선, 태아 적아구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군 (Shulman's syndrome), 펠티 증후군 (Felty's syndrome), 사상충증, 모양체염, 만성 모양체염, 홍채이색 모양체염, 푸크 모양체염 (Fuch's cyclitis), IgA 신병증, 헤노흐-쉔라인 자반증, 사구체신염, 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부반응, 사람 면역 결핍 바이러스 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종 후 증후군, 선천성 풍진 감염, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 (Hodgkin's and Non-Hodgkin's lymphoma), 신장 세포 암종, 다발성 골수종, 이튼-람베르트 증후군 (Eaton-Lambert syndrome), 재발성 다발성 연골염, 악성 흑색종, 한랭글로불린혈증, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulemia), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) 감염, 유행성 이하선염, 에반 증후군 (Evan's syndrome) 및 자가면역성 성선 부전과 같은 자가면역 질환을 포함한다.
본 발명자는 IL-12가 사람에 있어서 항체 반응을 조절하는 주요 분자임을 밝혀내었다. 또한 JDM, SYS 및 SLE를 포함하는 자가면역 질환에서 기능성 B-헬퍼 T 세포의 빈도가 증가됨을 알아내었다. B-헬퍼 T 세포의 표적화는 자가면역 질환에 있어서 치료적 접근법으로서 결코 주장된 적이 없었다. 이제, 본 발명을 이용하여 1) IL-12를 차단하여 B-헬퍼 T 세포의 발생을 억제하고, 2) IL-12를 차단하여 B-헬퍼 T 세포에 의한 IL-21의 분비를 억제하고, 3) B-헬퍼 T 세포를 표적화하여 신체에서의 상기 세포의 수를 감소시키는 것이 예를 들어 CXCR5 또는 ICOS에 대한 모노클로날 항체의 사용에 의해 가능하다.
예를 들어, 피부근염, 및 전신성 홍반성 루푸스를 포함하는 자가면역 질환 환자로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 IL-12-중화 항체 (항-IL-12p70 mAb)의 존재 또는 부재 하에 초항원 장독소 (superantigen enterotoxin B, SEB)를 이용하여 배양되었으며, IL-21 분비는 배양 2일째에 분석되었음이 발견되었다. IL-12-차단 항체의 첨가는 SEB-반응성 CD4+ T 세포로부터의 IL-21 분비를 유의하게 억제하였다. 따라서, IL-12의 차단은 CD4+ T 세포로부터의 IL-21의 분비를 감소시키며, 이는 항체 반응의 발생에서 중요한 역할을 한다.
나이브 CD4+ T 세포의 분리. 건강한 성인 지원자로부터 수득된 아페레시스 (apheresis) 혈액 샘플로부터 피콜 (Ficoll) 구배 원심분리에 의해 PBMC를 정제하고, 이를 액체 질소 내에 10% DMSO 중에 계속 냉동인 상태로 두었다. 먼저 나이브 CD4+ T 세포를 음성 선별에 의해 풍부화하였다: PBMC를 정제된 CD8 (HIT8a, 이바이오사이언시즈 (eBiosciences)), CD11b (LM1/2, ATCC), CD11c (B-ly6, 비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences)), CD14 (M5E2, ATCC), CD15 (W6D3, 비디 바이오사이언시즈), CD16 (3G8, 베크만 코울터 (Beckman Coulter)), CD19 (J4.119, 베크만 코울터), CD45RO (UCHL1, 비디 바이오사이언시즈), CD56 (C218, 베크만 코울터) 및 HLA-DR (B8.12.2, 베크만 코울터) mAb를 이용하여 4℃에서 30분 동안 항온배양하고, 그 후 다이나비즈 팬 마우스 (Dynabeads Pan Mouse) IgG (다이날 (Dynal))를 이용하여 4℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 항체-결합 세포를 자석 (다이날)으로 제거하였다. 나이브 CD4+ T 세포를, CD8 PE (RPA-T8, 이바이오사이언시즈), CD56 PE (B159, 비디 바이오사이언시즈), HLA-DR PE (G46-6, 비디 바이오사이언시즈), CD45RA 트라이컬러 (Tricolor) (MEM-56, 칼태그 (Caltag)) 및 CD4+ 퍼시픽 블루 (Pacific Blue) (S3.5, 칼태그) mAb를 이용한 염색 후 FACSAria (비디 바이오사이언시즈)를 이용하여 CD8- CD56- HLA-DR- CD45RA+ CD4+ 세포로서 분류함으로써 추가로 정제하였다. 세포 순도는 >99%였다.
B 세포의 분리. 먼저 B 세포를 CD19 마이크로비즈 (MicroBeads) 및 LS 컬럼 (밀테니이 바이오테크 (Miltenyi Biotec))을 이용하여 양성 선별에 의해 아페레시스 PBMC로부터 풍부화하였다. 그 후, 나이브 및 기억 B 세포를, IgD FITC (IA6-2, BD), CD27 PE (L128, 비디 바이오사이언시즈), CD3 APC (SK7, 비디 바이오사이언시즈), CD11c APC (S-HCL-3, 비디 바이오사이언시즈), 및 CD14 APC (TuK4, 칼태그) mAb를 이용한 염색 후 FACSAria를 이용하여 각각 IgD+ CD27- CD3- CD11c- CD14- 세포 및 IgD- CD27+ CD3- CD11c- CD14- 세포로서 분류하였다. 세포 순도는 >98%였다.
DC 및 나이브 CD4+ T 세포의 공동 배양. 단핵구 분리 키트 (Monocyte Isolation Kit) II (밀테니이 바이오테크)를 사용하여 음성 선별에 의해 PBMC로부터 단핵구를 분리하였다. 6웰 플레이트에서 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 2-머캅토에탄올, 1% 피루브산나트륨, 1% 비필수 아미노산 (모두 시그마 (Sigma)사 제조), 25 mM HEPES p7.2 및 10% 가열 불활성화 FBS (하이클론 (Hyclone)를 함유하는 RPMI 1640 완전 배지 (GIBCO) 중 50 ng/ml IL-4 (알앤디 (R&D)) 및 100 ng/ml GM-CSF (류카인 (Leukine))를 이용하여 단핵구를 배양함으로써 (2 x 106개의 세포/3 ml/웰) DC를 생성하였다. 사이토카인을 2일마다 첨가하였다. 6일에 수지상 세포를 조사된 CD40L-형질감염 L-세포, PGN (5 ㎍/ml, 인비보젠 (InvivoGen)), LPS (50 ng/ml, 시그마-알드리치), 플라젤린 (20 ng/ml, 인비보젠), CL097 (이미다조퀴놀린 화합물. 5 ㎍/ml, 인비보젠), 가열 사멸시킨 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) (108개/ml, 인비트로젠 (Invitrogen)), 가열 사멸시킨 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (108개/ml - 인비보젠), 또는 가열 사멸시킨 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) (108/ml - 인비보젠)로 자극하였다. 6시간의 자극 후, TLR-리간드 또는 가열 사멸시킨 세균에 노출시킨 DC를 수거하고 주의깊게 세척하였다: CD40L-형질감염 L 세포로 자극한 DC를, CD11c APC (S-HCL-3, 비디 바이오사이언시즈) 및 CD40L PE (TROP1, 비디 바이오사이언시즈) mAb로 염색한 후 FACS에 의해 CD11c+CD40L- DC로서 회수하였다. RPMI 완전 배지 중에서 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 동종 (allogeneic) 나이브 CD4+ T 세포 (4 x 104개의 세포/웰)를 이용하여 활성화 DC (1.3 x 103개의 세포/웰)를 7일 동안 배양하였다. 일부 실험에서, 10 ㎍/ml의 항-IL-12p40 (C8.6, 이바이오사이언시즈) 또는 항-IL-12p70 (M122, Pierce) 차단 mAb를 상기 배양물에 첨가하였다. IL-12 분비의 평가를 위하여, 6시간의 자극에서 수거한 DC를 평저 96웰 플레이트에서 추가로 24시간 동안 배양하고 (2 x 105개의 세포/웰), 분비된 IL-12를 IL-12p70 ELISA 키트 (이바이오사이언시즈)를 이용하여 측정하였다.
CD3/CD28을 통한 나이브 CD4+ T 세포의 자극. 나이브 CD4+ T 세포 (1 x 105개의 세포/웰)를 하기의 사람 재조합 사이토카인의 존재 하에 RPMI 완전 배지 중에서 평저 96웰 플레이트에서 플레이트-결합된 CD3 mAb (5 ㎍ /ml, OKT3, ATCC) 및 가용성 CD28 mAb (1 ㎍/ml. CD28.2, 비디 바이오사이언시즈)로 자극하였다: IL-1β (알앤디), IL-6 (알앤디), IL-10 (알앤디), IL-12 (알앤디), IL-18 (알앤디), IL-23 (이바이오사이언시즈), IL-27 (알앤디), TNF (알앤디), (각각 10 ng/ml 또는 지시된 농도), 또는 IFN-α (IFN-α2b. 500 IU/ml, 슈에링 (Schering)). 활성화된 CD4+ T 세포를 7일에 분석하였다. 일부 실험에서, 나이브 CD4+ T 세포를 1 μM 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르 (몰레큘러 프로브즈 (Molecular Probes))로 표지하여 T 세포의 증식을 추적하였다.
세포내 사이토카인 염색. 7일간 자극한 CD4+ T 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트 (25 ng/ml, 시그마-알드리치) 및 이오노마이신 (1 ㎍/ml, 시그마-알드리치)으로 6시간 동안 재자극하였는데, 마지막 4시간 동안은 골지플러그 (GolgiPlug) (비디 바이오사이언시즈)가 존재하였다. 그 후 세포를 사이토픽스 (Cytofix)/사이토펌 고정 (Cytoperm Fixation)/투과화 (Permeabilization) 키트 (비디 바이오사이언시즈)를 이용하여 고정 및 투과화되게 하고, 세포질 중의 발현 사이토카인을 IL-21 PE 또는 APC (3A3-N2, 이바이오사이언시즈), IL-17A PE (64DEC17, 이바이오사이언시즈), 및 IFNγ APC (B27, 비디 바이오사이언시즈) mAb를 이용하여 분석하였다. 1% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 FACS 칼리버 (Calibur) 또는 FACS CantoII에서 세포를 획득하였다. 활성화된 CD4+ T 세포 (FSC고 세포)에서의 사이토카인 발현을 플로우조 (FlowJo) 소프트웨어(트리스타 (TreeStar))로 분석하였다.
활성화된 CD4+ T 세포로부터의 IL-21 분비. 활성화된 CD4+ T 세포를, 잔류 CD11c+ DC를 제거하기 위해 CD11c APC (S-HCL-3, 비디 바이오사이언시즈)로 염색한 후 7일에 FSC고 세포 (CD3/28 자극), 또는 CD11c저FSC고 세포(DC와 공동 배양)로 분류하였다. 분류된 CD4+ T 세포를 10% FBS로 보충된 이셀 (Yssel) 배지 (제미니 (Gemini))에서 평저 96웰 플레이트(5 x 104개의 세포/웰)에서 플레이트-결합된 CD3 mAb (5㎍ /ml) 및 가용성 CD28 mAb (1 ㎍/ml)로 재자극시켰다. 24시간 후, 생성된 IL-21 수준을 루미넥스 (Luminex) 분석을 이용하여 평가하였다.
루미넥스 기술을 이용한 사람 IL-21 비드-기반 분석법의 개발. 포유동물 발현 벡터 pCDM8 (시드 (Seed), 1987)의 Hind III - Not I 구간 내로 TGCTGGCTA와 TGA에 의해 경계가 정해진 그리고 마우스 시그날링 림프구 활성화 분자 계열 구성원 1 시그날 펩타이드 (gb|EDL39054.1|) 잔기 1-24, GL, gb|ABN54273.1| 셀룰로솜 고정 단백질 잔기 1050-1219, LEAD, 및 gb|AAG29348.1| 사람 인터루킨 21 잔기 30-162를 암호화하는 서열을 삽입하기 위하여 PCR을 사용하였다. 이 벡터는 코헤신 (cohesin)-IL-21 융합 단백질의 분비를 지시하였다. 천연 사람 IL-21의 분비를 지시하는 벡터는, pIRES2-DsRed2 (클론테크 (Clontech))의 Nhe I - Not I 구간 내로 CACC가 선행하는 ref|NM_021803.1| 잔기 47-535를 삽입시켜 조작하였다. 분비된 단백질은 1.3 ml 293 펙틴 (Fectin) 시약/L 형질감염을 이용하여 총 1 mg 플라스미드 DNA에 기초하여 제조사의 프로토콜에 따라 프리스타일 (FreeStyle)TM 293 발현 시스템 (인비트로젠)을 이용하여 생성하였다. 형질감염된 세포를 3일 동안 배양하였으며, 배양 상청액을 수집하고 2일 동안 계속 항온배양하면서 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 (바이오소스 (Biosource))를 포함하는 신선한 293 프리스타일TM 배지 (인비트로젠)를 첨가하였다. 배양 상청액 (1 L)을 PBS로 세척한 20 ml Q 세파로스 (Sepharose) 컬럼 (지이 헬스케어 (GE Healthcare)) 상에 로딩한 후, PBS + 1M NaCl pH 7.4로 용출시켰다. 용출된 분획을 맞춤 제작된 1 ml 항-코헤신 mAb 컬럼에 통과시킨 후, PBS로 세척하고 0.1 M 글리신 pH 2.7로 용출시킨 후, DPBS에 대해 투석시켰다. SDS-PAGE 겔에 의해 단백질을 분석하였으며 농도는 280 nm에서의 이론적 흡광 계수에 기초하였다.
사람 IL-21에 대한 마우스 mAb는 신속하고 반복적인 면역화 전략에 의해 생성하였다. 간략히 설명하면, 6주령 BALB/c 마우스를 풋 패드 (foot pad) 주사에 의해, 30-40일의 과정에 걸쳐 7-9회, 10 ㎍의 코헤신-IL-21 융합 단백질과 리비 (Ribi) 또는 CpG (1017 ISS, 다이나박스 (Dynavax)) 애주번트로 면역화하였다. 향상된 혈청 역가의 관찰시, 더 낮은 혈청 허용성에 적응시킨 P3x63, Ag8.653 (ATCC CRL-1580) 및/또는 SP2/O-Ag 14 골수종 세포주와의 PEG-유도 체세포 융합을 위한 서혜부 및 슬와 배출 림프절을 수집하기 전에 3 내지 4일에 10 ㎍의 부스트 (boost)를 제공하였다. 0.5 ㎍/ml의 대조 코헤신 융합 단백질로 또는 0.2 ㎍/ml의 코헤신-IL-21로 코팅된 플레이트에서 직접적 ELISA에 의해 1:25 희석의 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다. 상청액은 또한 모노클로날 항체를 고정하기 위해 염소 항-마우스 IgG로 코팅된 플레이트 및 0.0625 ㎍/ml의 비오티닐화된 IL-21 및 이어서 뉴트라비딘 (Neutravidin)-HRP를 이용한 검출을 이용하는 포획 ELISA 포맷에서 스크리닝하였다. 가장 강력한 항체를 생성하는 하이브리도마는 순수한 항체의 생성을 위해 클로닝되고 스케일된 (scaled) 단일 세포였다. IL-21을 검출할 수 있는 쌍을 확립하기 위해 mAb를 체커보드 (checkerboard) ELISA 포맷으로 시험하였다. mAb를 2 ㎍/ml로 플레이트에 결합시키고 그 후 2 ng/ml 및 20 pg/ml의 IL-21을 이용하여 항온처리하고 그 후 100 ng/ml의 비오티닐화 mAb를 이용하여 항온처리하고 이어서 뉴트라비딘-HRP로 검출하였다. 성공적으로 쌍을 이룬 mAb를 추가로 100 ng/ml 내지 45 pg/ml의 IL-21 적정 및 100 ng/ml의 비오티닐화 mAb 파트너를 이용한 검출에 의해 이 ELISA에서 스크리닝하였다. ELISA에서 가장 민감한 항체를 비드에 접합시키고 (카르복실화된 미소구체에의 단백질의 2단계 카르보디이미드 커플링을 위한 루미넥스 코포레이션 (Luminex Corporation) 프로토콜, 2006년 1월) 4000 pg/ml 내지 1 pg/ml의 재조합 사람 IL-21 적정 시리즈, 및 천연 사람 IL-21을 함유하는 것으로 예상되는, 이오노마이신 및 PMA로 자극된 CD4+ T 세포로부터의 상청액 희석물을 이용하여 항온처리하였다. 검출 mAb를 비오티닐화시키고 0.5 ㎍/ml로 사용하였다. 선택된 mAb 쌍은 IL-21 발현 벡터로 형질감염된 293F 세포로부터 분비된 IL-21을 검출하였다. 두 상업적 공급처로부터의 재조합 IL-21보다 유의하게 더 강력한 코헤신-IL-21을 표준물로 사용하였다.
최종 루미넥스 분석은 적어도 4000 pg/ml까지의 범위에 걸쳐 1 pg/ml hIL-21에 민감하였다. IL-21 쌍을 업스테이트 비드라이트 (Upstate Beadlyte) 휴먼 (Human) 26 플렉스 멀티플렉스 표준물에서 시험하였다. 분석물 중 어느 것과도 교차 반응성이 없었다. IL-21 쌍은 또한 업스테이트 휴먼 22 플렉스와 멀티플렉스화될 수 있었다. 루미넥스 비드 접합 및 일반 분석 조건은 문헌[Giavedoni, et al. (Giavedoni, 2005)]에 상세히 기술되어 있다. 500 ㎕ 50 mM MES pH 5.0 중의 5 ㎍ mAb에서 1 x 107개 비드의 최적 커플링을 이용하여 세로맵 (SeroMAP) 비드(영역 26)를 사용하였다. 검출 mAb의 비오티닐화를 25X NHS-LC 비오틴 (피어스 (Pierce))에서 수행하였으며 분석에서 0.5 ㎍/ml로 사용하였다. 2 ㎍/ml에서, 프로자임 (Prozyme)으로부터의 피코링크 스트렙타비딘 (Phycolink Strepavidin) R-피코에리트린 (Phycoerythrin) PJ31S를 리포터로 사용하였다.
T- 및 B-세포의 공동 배양. 활성화된 CD4+ T 세포를 상기에 기술한 바와 같이 분류하고, 내독소-감소된 SEB (0.25 ng/ml; 톡신 테크놀로지, 인크. (Toxin technology, Inc.))의 존재 하에서 이셀 배지/10% FBS에서 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 자가유래 기억 B 세포 (각각의 웰 당 4 x 104개의 세포)와 공동 배양하였다. 일부 실험에서, 항-IL-2 mAb (PAB956, BIIR), 항-IL-4 mAb (MP4-25D2, BD), 항-IL-10 mAb (PAB548, BIIR), 항-IFN-γ mAb (B27, 비디 바이오사이언시즈), ICOS-L-mIgFc (앤셀 (Ancell)), IgG1Fc 또는 IL-21R/Fc (둘 모두 알앤디 시스템즈 (R&D Systems)로부터 입수)를 배양물에 첨가하였다. 배양물에서 생성된 Ig (IgM, IgG 및 IgA)를 6일 또는 14일에 ELISA에 의해 분석하였다.
Ig ELISA. Ig의 측정을 위하여, 배양 상청액을 5 ㎍/ml 염소 항-사람 IgM, IgG, IgA Ab (모두 서던바이오테크, 인크.(SouthernBiotech, Inc.)로부터 입수)로 코팅된 96웰 미세역가 플레이트 (눈크(Nunc))에서 실온에서 2시간 동안 항온배양하였다. 세척 후, 플레이트를 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-사람 IgM, IgG, 또는 IgA Ab (각각 1/2000, 1/2500, 또는 1/2500의 최종 희석. 모두 서던바이오테크, 인크로부터 입수함)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 항온배양하였다. 그 후, 플레이트를 완전한 세척 후 p-니트로페닐 포스페이트 (시그마(Sigma))를 이용하여 항온배양하였다. 반응을 NaOH 3N로 중단시키고, 광학 밀도를 스펙트라맥스 (SpectraMax) 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices))로 판독하였다.
SEB를 사용한 PBMC 배양물. 항-IL-12p40 또는 IL-12p70 mAb의 존재 또는 부재 하에서 48시간 동안 96웰 플레이트에서 정제된 신선한 PBMC (2.5 x 105개의 세포/웰)를 SEB (0.1 ㎍/ml)를 이용하여 배양하였으며, 분비된 사이토카인을 루미넥스에 의해 측정하였다.
CD4+ T 세포 표현형의 분석. CXCR5+ T 세포 하위집단을 분석하기 위하여, 자가면역 질환 환자 및 연령-매칭된 건강한 피검자로부터 수득된 신선한 전혈 샘플을 항-CXCR5-Alexa 488, CCR6-PE, CD45RA-ECD, CXCR3-PC5, CCR4-PC7, ICOS-APC, CD3-AF700, CD8-APC H7, CD45RA 퍼시픽 블루, 및 CD45 퍼시픽 오렌지 mAb로 염색하였다. 세포를 FACSAria로 획득하였으며, 플로우조 소프트웨어 (트리스타)로 분석하였다.
B-헬퍼 T 세포의 발생을 위한 주요 인자로서의 IL-12. IL-21은 T 세포- 및 NKT 세포-사이토카인이며, 면역계의 많은 세포에 작용한다. 특히, IL-21은 항체-분비 형질 세포로의 B 세포의 성장 및 분화를 촉진한다. 도 1은 IL-12의 존재 하에서 프라이밍된 나이브 CD4+ T 세포가 다량의 IL-21을 생성함을 보여준다. 간략히 설명하면, 나이브 CD4+ T 세포를 사이토카인 (500 IU/ml의 IFN-α를 제외하고는, 10 ng/ml)의 존재 하에서 플레이트-결합 항-CD3/CD28 mAb로 7일 동안 자극하였다. IL-1β, IL-6, IL-10, IL-18, IL-27, TNF-α, 및 IFN-α는 CD4+ T 세포가 IL-21을 분비할 수 있도록 유도하지 않았다. 그러나, IL-12는 IL-21을 생성할 수 있는 CD4+ T 세포의 발생을 촉진하였다. CD3/CD28을 통한 재활성화시에, IL-12로 프라이밍된 CD4+ T 세포는 나노그램 양의 IL-21을 분비할 수 있었던 반면 (5 x 104개의 세포/200 ㎕의 배양물에서 3.3 ±0.4 ng/ml. 평균±s.e.m. n=5), IL-23으로 프라이밍된 것들은 단지 피코그램 양을 분비하였다 (40±4 pg/ml. 평균±s.e.m. n=5.). 따라서, IL-12는 나이브 CD4+ T 세포가 IL-21을 생산하도록 강력하게 유도한다.
도 2는 IL-12의 존재 하에서 프라이밍된 나이브 CD4+ T 세포가 자가유래 B 세포의 면역글로불린 생성을 유도할 수 있음을 보여준다. 간략히 설명하면, IL-12 또는 기타 사이토카인의 존재 하에서 항-CD3/CD28 mAb에 의해 활성화된 나이브 CD4+ T 세포를 7일에 분류하였으며, 항-IgM mAb 및 CpG (TLR-9 리간드)로 사전활성화된 자가유래 혈액 IgD+CD27- 나이브 B 세포와 공동 배양하였다. 초항원인 스타필로코커스 장독소(Staphylococcal enterotoxin) B (SEB)를 첨가하여 T-B 상호작용을 유도하였으며, 분비된 Ig를 14일에 측정하였다. 사이토카인으로 프라이밍되지 않은 CD4+ T 세포는 나이브 B 세포가 Ig를 분비하도록 유도하지 못했다 (A, 없음). 이와는 대조적으로, IL-12로 프라이밍된 CD4+ T 세포는 나이브 B 세포가 IgM, IgG, 및 IgA를 비롯한 Ig를 분비하도록 유도하였다. IL-23으로 프라이밍된 CD4+ T 세포와 공동 배양된 나이브 B 세포는 상당히 더 적은 양의 Ig를 생성하였다.
이와 유사하게, IL-12로 프라이밍된 나이브 CD4+ T 세포는 IL-23으로 프라이밍된 CD4+ T 세포보다 유의하게 더 많은 양으로 IgD-CD27+ 기억 B 세포로부터의 Ig 생성을 유도하였다 (B). 따라서, IL-12는 CD4+ T 세포가 B 세포를 도울 수 있는 세포가 되도록 유도한다.
도 3은 IL-12의 존재 하에서 프라이밍된 CD4+ T 세포가 IL-21에 의존하는 방식의 B 세포의 면역글로불린 생성을 유도함을 보여준다. 간략히 설명하면, IL-21의 기능을 억제하는, 가용성 IL-21 수용체/Fc 키메라 단백질을 B 세포와 IL-12로 프라이밍된 CD4+ T 세포의 공동 배양물에 첨가하였다. IL-21의 차단은 B 세포가 Ig를 분비하는 것을 상당히 억제하였다. 따라서, IL-12로 프라이밍된 CD4+ T 세포로부터 분비된 IL-21은 B 세포에 의한 항체 생성의 유도에서 중요한 역할을 한다.
도 4는 활성화된 DC가 IL-12를 통해 IL-21-생성 CD4+ T 세포를 유도함을 보여준다. 간략히 설명하면, DC를 6시간 동안, 이. 콜라이 (E. coli) (그람 음성), 에스. 아우레우스 (S. aureus) (그람 양성), 및 피. 긴기발리스 (P. gingivalis) (그람 양성)를 비롯한 가열 사멸 세균을 이용하여 항온배양하고, 그 후 동종이계 나이브 CD4+ T 세포와 함께 배양하였다. 7일에 분류된 활성화된 CD4+ T 세포를 24시간 동안 항-CD3/CD28 mAb로 재자극하여 IL-21 분비를 측정하였다. 세균-활성화된 DC로 프라이밍된 CD4+ T 세포는 비자극 DC로 프라이밍된 것보다 많은 IL-21을 분비하였다. IL-12 및 IL-23 둘 모두를 억제하는 항-IL-12p40 차단 mAb의 첨가는, DC-T 세포 공동 배양 동안 세균-활성화 DC에 의한 IL-21-생성 CD4+ T 세포의 발생을 유의하게 억제하였다. 주목할 만하게는, IL-12만을 억제하는 항-IL-12p70 차단 mAb의 첨가는 CD4+ T 세포에 의한 IL-21 분비를 유의하게 억제하기에 충분하였다 (85 ± 5% 억제율. 평균 ± s.e.m. n=5.). 따라서, 세균을 감지한 DC에 의한 IL-21-생성 CD4+ T 세포의 유도는 IL-12에 의해 매개되었다.
도 5는 IL-12의 차단이 B 세포를 도울 수 있는 T 세포의 발생을 억제함을 보여준다. 간략히 설명하면, 세균-활성화 DC를 이용한 배양에 의해 활성화된 CD4+ T 세포를 7일에 분류하고 자가유래 기억 B 세포와 공동 배양하였다. 세균-활성화 DC로 프라이밍된 CD4+ T 세포는 B 세포가 Ig를 생성하도록 유도하였다. B 세포에 의한 Ig 분비의 유도는 DC-T 세포 공동 배양 동안 항-IL-12p40 mAb가 첨가되었을 때 유의하게 손상되었다. 그러나, 항-IL-12p70 mAb를 이용한 IL-12의 차단은 B-헬퍼 CD4+ T 세포의 발생을 억제하기에 충분하였다. 따라서, 활성화된 DC에 의해 분비된 IL-12는 나이브 CD4+ T 세포의 B-헬퍼 T 세포로의 분화에 중요하다.
IL-12는 IL-21 분비를 제어한다. 도 6은 IL-12가 기억 CD4+ T 세포에 의한 IL-21 분비를 제어함을 보여준다. 간략히 설명하면, 단핵 세포 (PBMC)를 건강한 성인의 혈액 샘플로부터 분리하여, 스타필로코커스 장독소 B (SEB)로 자극시켰다. 생성된 IL-21의 수준을 배양 48시간에 분석하였다. PBMC는 48시간 동안 SEB를 이용하여 배양했을 때 많은 양의 IL-21을 생성하였다 (A. 740±250 pg/ml. 평균 ±s.e.m. n=7). 항-IL-12p70 mAb를 이용한 48시간 활성화 기간 동안 IL-12의 차단은 IL-21 분비를 유의하게 감소시켰다(A&B. 110±30 pg/ml. n=7. p<0.05). 항-IL-12p40 mAb를 이용한 IL-12 및 IL-23 둘 모두의 차단은 IL-12만의 차단과 비견되는 수준으로 IL-21 분비를 감소시켰다 (120±40 pg/ml. n=6). IL-12의 차단은 IL-2, IL-5, 및 IL-17을 비롯한 다른 사이토카인의 분비를 변경하지 않았다 (B). 따라서, IL-12의 차단은 IL-21 및 IFN-γ 둘 모두의 분비를 특이적으로 억제하였다. 따라서, IL-12는 IL-21-생성 기억 CD4+ T 세포에 직접 작용하며 IL-21의 분비를 촉진한다.
자가면역 질환의 혈액에서 기능성 B-헬퍼 T 세포의 빈도 증가. 자가항체-결부된 자가면역 질환의 예: 피부근염 (DM).
DM은 자가면역성 염증성 근병증이다. DM을 가진 환자는 근위근 무력 및 특징적인 피부 발진을 비롯한 전신성 염증 특징을 나타낸다. 미국에서 JDM의 발생률은 매년 어린이 100만 명당 3.2명이다. 발병 평균 연령은 7세이지만, 환자의 25%는 발병시에 4세 미만이다. 미국에서, 여아 대 남아의 비는 2.3 대 1이다. 성인 DM은 40 내지 60세 연령 범위에서 가장 일반적이며, 미국에서 100,000명 중 약 2명에서 관찰된다. CD4+ T 세포 및 B 세포는 DM에서 염증 부위에 주로 축적된다 (도 7). 많은 DM 환자는 광범위한 자가항체 레퍼토리를 나타내며, 따라서 B 세포는 DM 발병에서 중요한 것으로 제안되었다. 사실상, 리툭시맙(Rituximab) (항-CD20 mAb)을 이용한 최근의 두 가지 파일럿 시험은 B 세포의 결실이 DM 환자에게 유익함을 보여주었다.
도 8은 연소자성 피부근염 (JDM) 환자를 비롯한 자가면역 질환 환자가 건강한 대조군에 비하여 편향된 CXCR5+ T 세포 하위세트를 나타냄을 입증한다.
케모카인 수용체인 CXCR5를 발현하는 혈액 CD4+ T 세포는 항체 반응에 대하여 특수화된 CD4+ T 세포 하위세트를 대표한다. CXCR5+ CD4+ T 세포는 항-CD3 mAb 및 ICOS로 자극될 때 다량의 IL-21을 분비한다. CXCR5+ CD4+ T 세포 내에서, 하기의 3가지 주요 하위집단을 확인하였다: Th1 (CXCR3+), Th2 (CXCR3-CCR6-) 및 Th17 (CCR6+) 세포. Th2 및 Th17 세포는 효율적인 B 세포 헬퍼인 반면, 전적으로 Th1 세포는 B 세포를 도울 수 없다 (A).
PBMC의 표현형 분석에 의하면, 전신성 관절염 (SYS) 환자 및 JDM 환자는 건강한 연령-매칭 대조군보다 더 적은 CXCR5+ Th1 (CXCR3+) 및 더 많은 CXCR5+ Th2 (CXCR3-CCR6-) 세포를 나타내었다 (B에 제시되어 있음). CXCR5+ Th17 (CXCR3-CCR6+) 세포의 빈도는 JDM 및 SLE (전신성 홍반성 루푸스)에서 건강한 대조군보다 더 많았다. 더욱이, CXCR5+ Th2 및 Th17 세포 집단의 빈도는 다른 자가면역 질환에서의 것보다 JDM에서 더 높았다. CXCR5+Th2 세포 집단은 SLE에서보다 유의하게 더 많았으며, CXCR5+ Th17 세포 집단은 PSOA (건선 관절염)에서보다 더 많았다. 주목할 만하게는, 연구된 코호트에서 가장 많이 아프고 가장 난치성인 환자들 (근육 효소의 지속적인 상승, CMAS<40 및 지속적인 피부 발진) 중에 최고 CXCR5+Th17 세포를 나타낸 4명의 JDM 환자 중 3명이 있었다. JDM에서의 CXCR5+Th1 세포의 빈도는 다른 두 자가면역 질환에서보다 유의하게 더 낮았다. 따라서, SYS, SLE 및 JDM에서 CXCR5+CD4+ T 세포 하위세트는 가장 효율적인 B 세포 헬퍼를 대표하는 Th2 및/또는 Th17 세포쪽으로 편향된다. 이러한 면역 조절 이상은 병원성 자가반응 B 세포의 생성에 기여할 수 있다.
기억 CD4+ T 세포에 의한 증가된 IL-21 분비물을 활성 JDM 환자로부터 수득했다. 도 9는 활성 JDM 환자로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포가 다량의 IL-21을 분비함을 입증한다. 간략히 설명하면, 신선한 PBMC를 건선 관절염 (PSOA), JDM, SYS 및 SLE 소아 환자로부터 수득하고, SEB로 자극하였다. 생성된 IL-21의 수준을 48시간에 측정하였다. 주목할 만하게는, 프레도니솔론의 투여를 필요로 한 활성 환자들 중에는 최고 IL-21 분비 (원으로 나타냄)를 나타낸 5명의 JDM 환자들 중 3명이 있었다. 따라서, 활성 JDM 환자의 혈액 세포는 활성화시에 더욱 많은 양의 IL-21을 분비한다.
도 10은 IL-12가 자가면역 질환 환자로부터 수득된 PBMC에 의한 IL-21 분비의 유도에서 또한 주요 사이토카인임을 보여준다. 간략히 설명하면, IL-12-중화 mAb의 존재 또는 부재 하에 JDM, SYS 및 SLE 환자 유래의 PBMC를 SEB로 자극하고, 분비된 IL-21 수준을 분석하였다. 모든 시험한 자가면역 질환으로부터의 PBMC의 배양물 중 IL-12를 차단함으로써 IL-21 분비가 유의하게 억제되었으며 (JDM: n=20, p=0.0027; SYS: n=7, p=0.015; SLE: n=15, p=0.002. 쌍체 비교 t-검정), 이는 건강한 성인으로부터 수득된 샘플에서의 발견과 일치한다. 따라서, IL-12는 JDM, SYS 및 SLE를 포함하는 자가면역 질환에서 기억 CD4+ T 세포로부터의 IL-21 분비의 유도에서 필수적인 역할을 한다.
본 명세서에서 논의된 임의의 실시 양태는 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있으며 그 반대도 가능하다고 생각된다. 더욱이, 본 발명의 조성물을 이용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.
본원에 기술된 특정 실시 양태들은 예시로서 제시된 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 제시된 것은 아님이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다양한 실시 양태에서 이용될 수 있다. 당업계의 숙련자라면 단지 일상적인 실험, 본원에 기술된 특정 절차에 대한 많은 등가 절차를 이용하는 것을 인지하거나 상기 이용을 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 등가 절차는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되며 특허청구범위에 포함된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 업계의 숙련자의 수준을 나타내는 것이다. 모든 간행물 및 특허 출원은 마치 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 나타내어지는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 단수형 ("a" 또는 "an") 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. 특허청구범위에서의 "또는"이라는 용어의 사용은, 본 개시 내용이 단지 대안 및 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지하더라도, 명백하게 대안만을 언급하는 것으로 나타내지 않으면 또는 그 대안이 상호 배타적이지 않으면 "및/또는"을 의미하도록 사용된다. 본 출원 전체에 걸쳐, "약"이라는 용어는 소정의 값이 장치에 있어서의 내재된 오차의 변동을 포함함을 나타내도록 사용되며, 당해 방법은 연구 피검자들 사이에 존재하는 당해 변동 또는 값을 측정하기 위하여 이용된다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 "포함하는" (및 "포함하는"의 임의의 형태, 예를 들어 "포함하고 있다" 및 "포함한다"), "갖는" (및 "갖는"의 임의의 형태, 예를 들어 "갖고 있다" 및 "갖는다"), "포함하고 있는" (및 "포함하고 있는"의 임의의 형태, 예를 들어 "포함하다" 및 "포함하고 있는 것이다") 또는 "함유하는" (및 "함유하는"의 임의의 형태, 예를 들어 "함유하고 있다" 및 "함유한다")이라는 용어는 포괄적이고 제한이 없으며 (open-ended), 추가적인, 상술되지 않은 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 "또는 이들의 조합"이라는 용어는 그 용어 앞의 열거된 항목들의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하고자 하는 것이며, 특정 맥락에서 순서가 중요할 경우, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB를 또한 포함하고자 한다. 이러한 예를 계속하자면, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들어 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등을 포함하는 조합이 명확히 포함된다. 숙련자라면, 달리 그 맥락에서 명백하지 않으면 임의의 조합의 항목 또는 용어의 수에 대한 한정은 전형적으로 전혀 없음을 이해할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 조성물 및/또는 방법 모두는 본 발명의 개시 내용에 비추어 보면 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 실시 양태의 견지에서 기술하였지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 변화가 본 조성물 및/또는 방법에 그리고 본원에 기술된 방법의 단계에서 또는 상기 단계의 순서에서 적용될 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백할 것이다. 모든 이러한 유사한 치환 및 변경은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (25)

  1. B-헬퍼(Helper) T 세포 활성을 차단하기에 충분한 양의 IL-12 억제제를 포함하는 유효량의 치료학적 조성물을 자가면역 장애를 갖는 피검자에게 투여함을 포함하는, 자가면역 장애를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-12 억제제가 적어도 하나의 차단 항-IL-12 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 IL-12 억제제가 용량당 1 내지 1,000 mg의 투여량으로 투여되는 IL-12 억제 항체를 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 IL-12 억제제가 IL-12 억제 항체를 포함하고, 상기 항체를 반복 투여량으로 상기 피검자에게 투여하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 IL-12 억제제가 유인 영장류 (subhuman primate) 항체, 쥐 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화 항체 및 사람 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항-IL-12 항체를 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 IL-12 억제제가 IL-12의 RNAi, siRNA 또는 다른 핵산 억제제를 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근염, 시덴함 무도병 (Sydenham's chorea), 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 류마티스열, 다선 증후군, 수포성 유사천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쉔라인 자반증 (Henoch-Schonlein purpura), 연쇄상구균 감염후 신장염, 결절성 홍반, 다카야스 동맥염 (Takayasu's arteritis), 애디슨병 (Addison's disease), 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신병증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿패스처 증후군 (Goodpasture's syndrome), 폐색성 혈전 혈관염 (thromboangitis ubiterans), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 갑상선 중독증, 경피증, 만성 활성 간염, 다발성 근염/피부근염, 다발성 연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 막성 신병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수로, 거대 세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염 및 섬유화 폐포염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, T-세포, B-세포, 형질 세포, 또는 대식세포 또는 염증성 사이토카인에 대한 2차 치료제를 별도로 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 나이브 (naive) CD4+ T 세포를 분리하고;
    항원-로딩된 (loaded) 수지상 세포의 존재 하에 B-헬퍼 T 세포를 발생 및 활성화시키기에 충분한 유효량의 IL-12를 이용하여 상기 나이브 CD4+ T 세포를 성숙시킴(여기서, 상기 IL-12 처리된 B-헬퍼 T 세포는 나노몰 양의 IL-21을 분비한다)
    을 포함하는, 항원에 대한 항원-특이적 B 세포 반응을 향상시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 나이브 CD4+ T 세포를 음성 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 나이브 CD4+ T 세포를 CD8에 대한 항체와 CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56 및 HLA-DR에 대한 하나 이상의 항체를 사용하여 음성 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득하는, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 항원이 바이러스, 세균, 진균, 암 또는 독소로부터 선택되는, 방법.
  14. B 세포에 의한 자가면역 항체의 분비에 의해 야기되는 자가면역 장애에 대한 치료법을 필요로 하는 것으로 의심되는 환자를 확인하고;
    CD4+ B 헬퍼 T 세포를 억제하기에 충분한 양의 항-IL-12 억제제로 상기 환자를 치료함
    을 포함하는, 자가면역 질환을 조절하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항-IL-12 억제제가 항-IL-12p40 mAb, 항-IL-12p70 mAb, 항-IL-12 수용체, 가용성 비활성 IL-12 및 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 항-IL-12 억제제가 IL-12 수용체 길항제를 포함하는, 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 CD4+ B 헬퍼 T 세포를 음성 선별에 의해 선별하는, 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 CD4+ B 헬퍼 T 세포를 CD8에 대한 항체와 CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD45RO, CD56 및 HLA-DR에 대한 하나 이상의 항체를 사용하여 음성 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득하는, 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 CD4+ B 헬퍼 T 세포를 활성화 수지상 세포의 존재 하에 활성화시키는, 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 전신성 홍반성 루푸스, 피부근염, 연소자성 피부근염, 관절염, 전신성 관절염 및 건선 관절염으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 IL-12 억제제를 자가면역 항체의 발생 이전에 자가면역 질환의 이환성(susceptibility)이 의심되는 피검자에게 제공하는, 방법.
  22. 나이브 CD4+ T 세포를 분리하고;
    IL-12의 존재 하에 표적 항원을 발현하는 활성화된 수지상 세포의 존재 하에 상기 나이브 CD4 T 세포를 성숙시킴(여기서, 상기 성숙된 CD4+ B-헬퍼 T 세포는 항원에 반응하여 나노몰 양의 IL-21을 방출한다)
    을 포함하는 방법에 의해 생산된 B 세포 헬퍼 T 세포.
  23. IL-12 억제제를 포함하는 조성물에 IL-21 분비 B-헬퍼 T 세포를 노출시킴으로써 면역글로불린 분비 세포로의 B 세포의 증식, 성숙 및 활성화를 조절하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 IL-12 억제제가 CD4+ B-헬퍼 T 세포에 의한 IL-21 및 IFN-γ 둘 모두의 분비를 감소시키는, 방법.
  25. 나노몰 양의 IL-21의 방출을 유도하기에 충분한 양의 IL-12와 함께 나이브 CD4 T 세포를 항온배양함을 포함하는, B 헬퍼 T 세포를 풍부화하는 방법.
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