KR20200103703A

KR20200103703A - Nkg2d 도메인을 포함하는 다중특이적 키메라 수용체 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20200103703A
Application number: KR1020207019347A
Authority: KR
Inventors: 샤오후이 판; 준 왕; 핑얀 왕; 츄촨 주앙; 리안 마
Original assignee: 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디.
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-09-02
Also published as: JP7379803B2; AU2018396969A1; CA3086932A1; MX2020006818A; WO2019129220A1; IL275512A; EP3732192A1; CN111836827B; CN114656569B; CN114656569A; WO2019127215A1; US20210363218A1; RU2020120853A; JP2021508463A; SG11202005584TA; CN114656570B; BR112020013211A2; CN114656570A; TW201930342A; EP3732192A4

Abstract

본 출원은 NKG2D를 표적으로 하는 키메라 수용체, 및 NKG2D 도메인 및 제2 항원 결합 도메인 이를 테면 IL-3 도메인을 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 제공한다. 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 키메라 수용체, 그리고 제2 항원 결합 도메인 이를 테면 IL-3 도메인을 포함하는 제2 키메라 수용체를 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 또한 제공된다. 추가로, 암 치료용 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포), 약제학적 조성물, 키트, 및 암 치료 방법이 더 제공된다.

Description

NKG2D 도메인을 포함하는 다중특이적 키메라 수용체 및 이의 사용 방법

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2017년 12월 28일자로 출원된 국제 특허 출원 번호. PCT/CN2017/119397호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 내용은 전문이 본원에 참조로 편입된다.

ASCII 텍스트 화일로 서열 목록 제출

ASCII 텍스트 파일로 다음과 같이 제출된 내용은 전체 내용이 본원에 참조자료로 편입된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형태 (CRF)(화일명: 761422000941SEQLISTING.txt, 기록일: 2018년 12월 28일, 크기: 85 KB).

본 출원의 분야

본 발명은 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체, 듀얼(dual) 키메라 수용체 시스템, 공작된 면역 작동체(effector) 세포, 및 이의 사용 방법에 관계한다.

발명의 배경

급성 골수성 백혈병 (AML)은 골수 및 혈액을 지배하는 골수성 전구체의 비정상적인 클론 증식을 특징으로 하며, 이는 정상적인 조혈을 심각하게 손상시킨다. AML은 서구 세계의 모든 성인 발병 백혈병의 약 25%를 차지하는 가장 흔한 유형의 급성 백혈병이다. AML은 매년 100,000 명의 성인 당 3-5 명 꼴로 발생하여, 모든 백혈병 중 사망률이 가장 높다(DiNardo and Cortes 2016). 지난 40 년 동안 AML 환자의 5-년 상대적인 전반 생존율은 1975 년에서 1980 년 사이에 6.3%에서 2007 년에서 2012 년 사이에 23.9%로 약간 증가했다(Mardiros 외. 2015).

AML의 표준 일선(first line) 치료법은 유도 요법으로서 안트라사이클린과 함께 시타라빈을 사용하는 화학요법과, 이 유도 요법 후 완벽한 관해(CR)를 얻은 환자를 위한 고-용량 시타라빈 및/또는 동종 줄기 세포 이식 (alloSCT)의 반복된 주기를 사용하는 것이다. 젊은 환자의 거의 70%에서 현재 유도 화학 요법으로 초기 CR을 달성할 수 있지만, 환자의 43%에서 결국 재발이 되며, 18%는 일선 유도 요법을 사용하여도 CR을 절대 얻지 못한다 (Forman and Rowe 2013). AlloSCT는 두 번째 관해(remission) 후 바람직한 치료 방법이다. alloSCT를 받은 환자 중 5-년 무병-생존율은 40-50%이며, 이는 면역-기반 요법에 대한 AML의 민감성을 보여준다. 그러나, 1 차 불응성(refractory) 질환이 있거나, 또는 6 개월 미만의 초기 CR을 가진 환자는 alloSCT 치료로 인한 혜택을 거의 갖지 못한다 (Mardiros 외. 2015). 또한, 통상적인 구제 화학요법(salvage chemotherapy)에 의한 환자의 장기에 대한 세포 독성 손상은 alloSCT의 성공 가능성을 더 손상시킨다. 따라서, 재발 또는 유도 실패 후, AML 환자에게는 보다 효과적이고 독성이 낮은 치료제가 필요하다.

T 세포는 종양, 특히 신생-항원(neo-antigens)을 초래하는 높은 돌연변이성 부하(burden)를 가진 종양을 공격하고, 근절할 잠재력이 있다. 그러나, T 세포의 항종양 능력은 종종 면역-억제성 종양 미세 환경 (TME)에 의해 능동적으로 억제된다(McGranahan 외. 2016). 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)는 종양 세포 상의 항원으로 지향되는 세포외(extracellular) 항원 결합 도메인, 힌지 영역, 그리고 항원 결합 시 T 세포 활성화를 유도하기 위한 T 세포 수용체(TCR)의 세포내 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는, 융합 단백질을 인코딩하는 유전자를 형질도입시킴(신호유도)으로써 구축된다. 종양 항원 인지를 위한 토종의 TCRs에 의존하는 통상적인 T 세포와 상이하게, CAR-T 세포는 미가공(unprocessed) 항원으로 재지향되고, 이로 인하여, 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 항원의 발현과 독립적으로 종양 세포를 사멸시킨다. 따라서, CAR-T 세포는 면역요법의 많은 고유한 한계를 극복할 수 있는 능력을 갖는다. 20 년의 전임상 연구 및 임상 시험 후, CAR-T 기반 요법의 안전성 및 타당성이 확인되었으며, 혈액학적 악성 종양에서 전례없는 임상 결과를 얻었다(K℃henderfer 외. 2015; Louis 외. 2011).

본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고문헌에 편입된다.

본 출원의 간단한 요약

본 출원은 NKG2D 리간드 및 제2 항원, 이를 테면, 종양 항원, 가령, CD123을 표적으로 하는 다중특이적 키메라 수용체 및 듀얼 키메라 수용체 시스템을 제공한다. NKG2D 리간드를 표적으로 하는 키메라 수용체 또한 제시된다.

본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함한다.

본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 제공한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인 및 제2 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인.

본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 제공한다: (a) 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인, 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 경유해서 제1 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 약 50개 이내 길이의 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 12-15로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본 출원의 한 측면은 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 제공하며, 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 각 세포외 도메인은 이량체화(dimerization) 모티프를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체화 모티프는 NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인 사이에 대체된다(displaced). 일부 구체예들에서, 상기 이량체화 모티프는 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼이다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 경유해서 상기 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 약 50개 이내 길이의 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 12-15로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다(crosslinked). 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인, NKG2D 도메인, 막경유 도메인, 그리고 상기 세포내 신호전달 도메인.

상기에서 기술된 다중특이적 기메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 키메라 수용체는 이중특이적(bispecific) 키메라 수용체다.

상기에서 기술된 다중특이적 기메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 단편은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 리간드 또는 리간드 결합 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 리간드 또는 리간드 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 IL-3 도메인은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 9의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인, 또는 제1 NKG2D 도메인 및/또는 제2 NKG2D 도메인은 서열 번호: 7 또는 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7 또는 8의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, 4-1BB, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 서열 번호: 4 또는 45의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 4-1BB의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 영역을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나에서 폴리펩티드 쇄중 하나 또는 그 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.

본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 제공한다: (i) 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제1 키메라 수용체, 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 키메라 수용체, 이때 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인; 그리고 (b) 제2 막경유 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 제2 세포내 신호전달 도메인을 더 포함한다.

본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 제공한다: (i) 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제1 키메라 수용체, 이때 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함하는 제1 세포외 도메인 ; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 키메라 수용체, 이때 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인; 그리고 (b) 제2 막경유 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 제2 세포내 신호전달 도메인을 더 포함한다.

상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 단편은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 리간드 또는 리간드 결합 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 리간드 또는 리간드 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 IL-3 도메인은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 9의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인, 또는 제1 NKG2D 도메인 및/또는 제2 NKG2D 도메인은 서열 번호: 7 또는 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7 또는 8의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 제1 및/또는 제2 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, 4-1BB, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 및/또는 제2 막경유 도메인은 서열 번호: 4 또는 45의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 제1 및/또는 제2 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 제1 및/또는 제2 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 4-1BB의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에 따른 일부 구체예들에서, 제1 및/또는 제2 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 영역을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나에서 하나 또는 그 이상의 폴리핍테드 쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체를 인코딩하는 제1 핵산 서열과 제2 키메라 수용체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공되며, 이때 제1 핵산 서열은 자가-절단(self-cleaving) 펩티드를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 경유하여 제2 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 일부 구체예들에서, 상기 자가-절단 펩티드는 T2A, P2A, 또는 F2A 펩티드다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 16-20 및 서열 번호: 33-35, 또는 서열 번호: 16-20 및 33-35로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 34의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 34의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 제1 키메라 수용체; 그리고 서열 번호: 41의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 41의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 제2 키메라 수용체를 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 35의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 35의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 제1 키메라 수용체; 그리고 서열 번호: 42의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 42의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 제2 키메라 수용체를 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 36 또는 37의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 36 또는 37의 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 21-27 및 38-40, 또는 서열 번호: 21-27 및 38-40로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열에 대하여 최소한 약 85% (가령, 최소한 약 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다.

일부 구체예들에서, 상기에서 기술된 단리된 핵산중 임의의 하나 또는 그 이상을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 벡터가 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터다.

본 출원의 또다른 측면은 상기 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템, 단리된 핵산, 또는 벡터중 임의의 하나를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 T 세포, NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 T 세포이다.

일부 구체예들에서, 상기 기술된 공작된 면역 작동체 세포들중 임의의 하나, 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본 출원의 또다른 측면은 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 당해 개체에게 상기에서 기술된 임의의 하나의 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 다발성 골수종, 급성 림프모구 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병이다.

상기에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체, 듀얼 키메라 수용체 시스템, 공작된 면역 작동체 세포, 단리된 핵산, 또는 벡터중 임의의 하나를 포함하는 키트 및 물품의 제조 및 사용 방법들이 또한 제공된다.

도 1a는 IL-3 도메인과 2개 NKG2D 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하는 예시적인 이중특이적 키메라 수용체 (LIC2001)의 계략도를 나타낸다. 양으로 하전된 잔기 (R)는 제1 NKG2D 도메인의 N 말단 (가령, 리버스(reverse) NKG2D 도메인)에서 공작되며, 음으로 하전된 잔기 (D)는 제2 NKG2D 도메인의 C 말단 (가령, 포워드(forward) NKG2D 도메인)에서 공작된다. 상기 공작된 R 잔기와 D 잔기는 염 다리(salt bridge)를 형성하고, 서로 이량체화가 촉진된다.
도 1b는 IL-3 도메인과 2개 NKG2D 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하는 예시적인 이중특이적 키메라 수용체 (LIC2001-1)의 계략도를 나타낸다.
도 1c는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 예시적인 이중특이적 키메라 수용체의 계략도를 나타내며, 상기 각 쇄는 IL-3 도메인, 류신 지퍼 모티프, 및 NKG2D 도메인을 포함한다. 각 폴리펩티드 쇄의 류신 지퍼 모티프는 이량체화를 촉진한다. 추가적으로, NKG2D 도메인들은 서로 이황화물 결합을 통하여 가교될 수 있다. LIC2002는 IL-3 도메인, 류신 지퍼 모티프, 및 리버스 NKG2D 도메인을 포함한다. LIC2002-2는 IL-3 도메인, 류신 지퍼 모티프, 및 포워드 NKG2D 도메인을 포함한다.
도 1d는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 예시적인 이중특이적 키메라 수용체(LIC2002-1)의 계략도를 나타내며, 상기 각 쇄는 IL-3 도메인, 류신 지퍼 모티프, 및 NKG2D 도메인을 포함한다. NKG2D 도메인들은 서로 이황화물 결합을 통하여 가교된다.
도 1e는 NKG2D 리간드를 표적으로 하는 제1 키메라 수용체, 그리고 CD123을 표적으로 하는 제2 키메라 수용체를 포함하는 예시적인 듀얼 키메라 수용체 시스템 (LIC2003)의 계략도를 나타낸다. 제1 키메라 수용체는 2개의 NKG2D 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함하는데, 이 두 쇄는 서로 이황화물 결합을 통하여 가교될 수 있다. 제2 키메라 수용체는 IL-3 도메인을 포함한다. 제2 키메라 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 함유하거나, 또는 함유하지 않을 수 있다.
도 1f는 NKG2D 리간드를 표적으로 하는 제1 키메라 수용체, 그리고 CD123을 표적으로 하는 제2 키메라 수용체를 포함하는 예시적인 듀얼 키메라 수용체 시스템 (LIC2004)의 계략도를 나타낸다. 제1 키메라 수용체는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 이들 각 쇄는 단일 NKG2D 도메인을 포함하고, 이때 NKG2D 도메인들은 서로 이황화물 결합을 통하여 가교된다. 제2 키메라 수용체는 IL-3 도메인을 포함한다. 제2 키메라 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 함유하거나, 또는 함유하지 않을 수 있다. 이 도면은 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않는 예시적인 제2 IL-3 키메라 수용체를 보여준다.
도 2는 유동 세포측정(flow cytometry)으로 측정될 때, 공작된 T 세포에서 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 구조체 (LIC2004 및 LIC2002-2)의 발현을 보여준다.
도 3a-3c는 종양 세포에 대한 다양한 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포의 시험관내 세포독성 활성을 나타낸다: K562-CD123-Luc (도 3a), K562-Luc (도 3b) 및 KG1-Luc (도 3c).
도 4는 K562-CD123-Luc에 대항하여 다양한 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포의 투여량-의존적 세포독성 활성을 비교하는 플롯을 보여준다.
도 5a-5b는 종양 세포에 대항하여 다양한 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포의 투여량-의존적 세포독성 활성을 나타낸다: K562-CD123-Luc (도 5a) 및 K562-Luc (도 5b). “NKG2D-CD123 결합체(binder)”란 LIC2004 듀얼 키메라 수용체 시스템을 발현시키는 공작된 T 세포를 지칭한다. “NKG2D”는 상기 LIC2004 듀얼 키메라 수용체 시스템 (가령, LIC2004-1)에서 오직 NKG2D 도메인을 포함하는 키메라 수용체만을 발현시키는 공작된 T 세포를 지칭한다. “CD123 결합체”는 상기 LIC2004 듀얼 키메라 수용체 시스템에서 오직 IL-3 도메인을 포함하는 키메라 수용체만을 발현시키는 공작된 T 세포를 지칭한다.
도 6a는 K562-CD123-Luc 및 K562-Luc 세포의 사멸에 있어서 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포에 의해 MICA (NKG2D의 동족(cognate) 리간드)의 차단 효과를 보여준다. 도 6b에서는 BSA가 K562-CD123-Luc 및 K562-Luc 세포의 사멸에 있어서 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포에 의한 유의적인 차단 효과를 갖지 않음을 보여준다.
도 7은 K562 및 K562-CD123-Luc 종양 세포에 대항하여 LIC2004 구조체 및 LIC2002-2 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포의 세포독성 활성을 보여준다.
도 8a-8c는 LIC2002-2, LIC2004 및 LIC2004-1 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포를 K562-CD123-Luc, K562-Luc 및 KG1-Luc 세포주(cell lines)와 공동-배양함으로써, IFNγ의 분비된 수준을 보여준다.

본 출원의 상세한 설명

본 출원은 NKG2D 리간드 및 제2 항원, 이를 테면 CD123 (가령, IL-3 도메인)을 표적으로 하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체 및 듀얼 키메라 수용체 시스템을 제공한다. 일부 구체예들에서, 항체-기반 CARs와 달리, 본원에서 기술된 키메라 수용체 및 듀얼 키메라 수용체 시스템은 T 세포 상에서 리간드와 이의 동족 수용체 사이에 높은 친화력(affinity) 및 특이성(specificity)을 이용한다. NKG2D 리간드는 오로지 스트레스를 받은(stressed) 세포, 특히 종양 세포 상에서만 발현된다. 본원에서 기술된 NKG2D 키메라 수용체 및 듀얼 키메라 수용체 시스템를 발현시키는 공작된 면역 세포는 강화된 항종양 수용력(capacity)을 갖고, 항-암 치료를 위한 유용한 치료제를 제공한다.

따라서, 본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 제공한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인 (가령, CD123을 표적으로 하는 결합 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 키메라 수용체가 제공되는데, 이때 상기 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인), 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인, 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 키메라 수용체가 제공되며, 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 이량체화 모티프, 이를 테면 류신 지퍼를 더 포함한다.

또다른 측면에서, 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 제공된다: (i) 다음을 포함하는 제1 키메라 수용체: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; (ii) 다음을 포함하는 제2 키메라 수용체: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 제2 막경유 도메인; 그리고 임의선택적으로 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때 제1 세포외 도메인은 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인.

상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포), 상기 공작된 면역 작동체 세포를 이용한 약제학적 조성물, 키트, 제조물품 및 암을 치료하는 방법들이 또한 본원에 기술된다.

I.정의

본원에서 이용된 바와 같이, “키메라 수용체”란 유전공학적으로 공작된 수용체를 지칭하는데, 이는 항원-항체 상호작용 또는 리간드-수용체 결합을 통하여 면역 작동체 세포, 이를 테면 T 세포 상에 하나 또는 그 이상의 특이적 폴리펩티드 상호작용을 접합하는데(graft) 이용될 수 있다. 일부 키메라 수용체는 “키메라 항원 수용체", “인위적인 T-세포 수용체", “키메라 T 세포 수용체", 또는 “키메라 면역 수용체”로도 알려져 있다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 하나 또는 그 이상의 항원 (이를 테면 종양 항원)에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막경유 도메인, 그리고 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 리간드로부터 유도된 최소한 하나의 도메인, 또는 수용체의 상기 세포외 도메인을 포함하는데, 이때 상기 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원, 이를 테면 종양 항원을 포함한다.

“NKG2D 키메라 수용체”란 세포외 도메인 NKG2D 리간드 (가령, NKG2D 도메인)에 특이적인 하나 또는 그 이상의 결합 도메인들을 포함하는 세포외 도메인을 갖는 키메라 수용체를 지칭한다. “NKG2D × IL-3 키메라 수용체”란 NKG2D 리간드에 특이적인 결합 도메인 (가령, NKG2D 도메인)과 CD123에 특이적인 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인)을 포함하는 세포외 도메인을 갖는 키메라 수용체를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “NKG2D 도메인”은 상기 NKG2D의 세포외 도메인에 있는 기능적 단편을 지칭하며, 이는 NKG2D 도메인의 이량체화 때 하나 또는 그 이상의 NKG2D 리간드에 특이적으로 결합할 수 있다. 예시적인 인간 NKG2D 리간드에는 MICA, MICB, 및 ULBP 분자가 함유되지만, 이에 국한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, “IL-3 도메인”이란 IL-3의 기능적 단편 (전장의 IL-3 포함)을 지칭하는데, 이는 CD123, 가령, IL-3R 복합체 및/또는 IL-3RA 하위단위(subunit)에 특이적으로 결합할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “표적으로 하다", “특이적으로 결합하다", “특이적으로 인지하다", 또는 “~에 특이적”이란 측정가능한 그리고 재생가능한 상호작용, 이를 테면 표적과 항원 결합 단백질 (이를 테면 항원 결합 도메인, 리간드, 또는 키메라 수용체) 사이의 결합을 지칭하는데, 이것으로 생물학적 분자를 포함하는 혼성 분자들의 집단 존재 하에서 표적의 존재를 결정한다. 예를 들면, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 다른 표적에 결합하는 것과 비교하여 더 큰 친화력, 항원항체결합력(avidity), 더욱 즉각적으로, 및/또는 더 오랜 기간 동안 당해 표적에 결합하는 항원 결합 단백질이다. 일부 구체예들에서, 무관한 표적에 항원 결합 단백질의 결합 정도는 가령, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, 표적에 당해 항원 결합 단백질의 결합에 대해 약 10% 미만이다. 일부 구체예들에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은

1 μM,

100 nM,

10 nM,

1 nM, 또는

0.1 nM의 해리상수(Kd)를 갖는다. 일부 구체예들에서, 항원 결합 단백질은 상이한 종의 단백질중에서 보존된 단백질 상에 있는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 특이적 결합은 독점적(exclusive) 결합을 포함할 수 있지만, 이것을 요구하지는 않는다.

용어 “특이성(specificity)”이란 항원의 특정 에피토프에 대하여 항원 결합 단백질(이를 테면 항원 결합 도메인, 리간드 또는 키메라 수용체)의 선택적 인지를 지칭한다. 용어 "다중특이적"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질 (이를 테면 키메라 수용체)은 2개 또는 그 이상의 항원-결합 부위를 갖고, 이중 최소한 2개는 상이한 항원에 결합한다는 것을 나타낸다. "이중특이적"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질 (이를 테면 키메라 수용체)은 2가지 상이한 항원-결합 특이성을 갖는다는 것을 나타낸다.

“결합 친화력”이란 분자 (이를 테면 항원 결합 도메인, 리간드, 또는 키메라 수용체) 및 이의 결합 짝 (가령, 항원)의 단일 결합 부위 사이에 비-공유 상호작용의 총 강도를 일반적으로 나타낸다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “결합 친화력”이란 결합 쌍(가령, 항원 결합 도메인과 항원)의 구성요소들간에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 명세서에서 설명된 것이 포함된 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화력 항체는 일반적으로 항원을 천천히 결합 시키며 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은-친화력 항체는 일반적으로 항원을 더 빨리 결합시키고, 더 오랫동안 결합하는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 출원의 목적을 위해 사용될 수 있다.

용어 “항체”는 모노클론 항체 (전장의 4-쇄 항체 또는 면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장의 중쇄로만의 항체 포함), 다중에피토프성 특이성, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체, 디아바디, 및 단일-쇄 분자), 뿐만 아니라 항체 단편 (가령, Fab, F(ab')₂, 및 Fv)을 갖는 항체 조성물을 함유한다. 본원에서 고려되는 항체에는 단일-도메인 항체, 이를 테면 의오직 중쇄로만의 항체가 포함된다.

“항체 단편”은 무손상(intact) 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편들; 디아바디(diabodies); 선형(linear) 항체 (U.S. 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata 외, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); 단일-쇄 항체 분자; 단일-도메인 항체 (이를 테면, V_HH), 및 항체 단편들에서 형성된 다중특이성 항체을 포함한다.

또한 “sFv”또는 “scFv”으로도 약칭되는 “단일-쇄 Fv”는 단일 폴리펩티드 쇄에 연결된 V_H 및 V_L항체 도메인을 포함하는 항체 단편들이다. 바람직하게는, 상기 sFv 폴리펩티드는 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하고, 이는 상기 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 만들게 한다. sFv에 관한 리뷰는 Pluckthun in The Pharmacology of Mon℃lonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참고한다.

펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대하여 “아미노산 서열 동일성 백분율(%)”및 "상동성(homology)"은 참고 서열 및 후보 서열들을 배열하고, 필요에 따라 최대 백분율의 서열 동일성을 획득하기 위하여 갭을 도입한 후, 특정 펩티드, 또는 폴리펩티드 서열에 있는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에 있는 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존 치환은 서열 동일성 부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 성취될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.

본원에서 기술되는 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 그것이 생성된 환경에서 통상적으로 관련된 최소한 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고, 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 상기 단리된 핵산은 이의 생산 환경과 연합된 모든 다른 성분들과 연합되지 않는다. 본원에서 기술된 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 이들이 자연계에서 발견되는 형태 또는 설정이 아닌 형태로 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 세포에서 자연적으로 존재하는 본원에서 기술되는 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 핵산과는 구별된다.

용어 “조절 서열”이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하도록 연계된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵 생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의선택적으로 오퍼레이터(operator) 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, "작동가능하도록 연계"된다. 예를 들면, 프리서열(presequence) 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레프로테인(preprotein)으로 발현되는 경우 폴리펩티드의 DNA에 작동 가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된다; 또는 리보솜 결합 부위는 해독을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하도록 연계되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연계된"이란 연계된 DNA 서열이 연속적이며, 분비 리더의 경우 연속적이고 판독 단계(reading phase)에 있음을 의미한다 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연계(linking)는 통상적인 제한절단 부위(restriction sites)에서 결찰(ligation)에 의해 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptors) 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.

용어 “벡터"란 본원에서 사용된 바와 같이, 이에 연결된 또다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 포함된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”라고 지칭된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "자가(autologous)"라는 용어는 한 개체로부터 유래된 임의의 물질이 당해 동일한 개체에게 재-도입될 수 있는 임의의 물질을 의미한다.

"동종이계(allogeneic)"란 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래 된 이식편(graft)을 지칭한다.

용어 “형질감염된(transfected)”또는 “형질변형된(transformed)”또는 “형질도입된(transduced)”이란 본원에서 사용된 바와 같이, 외인성 핵산이 숙주 세포 안으로 전달되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. “형질감염된” 또는 “형질변형된” 또는 “형질도입된” 세포는 외인성(exogenous) 핵산이 형질감염된, 형질변형된 또는 형질도입된 것을 말한다. 세포는 원래 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양"이라는 표현은 상호 교환 가능하게 사용되며, 이러한 모든 명칭에는 자손이 포함된다. 따라서, "형질감염체" 및 "형질감염된 세포"라는 말은 1 차 대상 세포 및 전이 수에 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 의도적이거나 또는 의도하지 않은 돌연변이로 인한 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있다는 것이 또한 이해되어야 한다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되어, 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도 본원에서는 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “치료(treatment)”또는 “치료하는(treating)"이란 임상 결과를 포함하여 유익하거나 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 다음중 하나 또는 그 이상을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 당해 질환으로 인한 하나 또는 그 이상의 증상의 완화, 당해 질환 정도의 감소, 당해 질환을 안정화 (가령, 당해 질환의 악화 방지 또는 지연), 당해 질환의 확산(가령, 전이) 방지 또는 지연, 당해 질환의 재발 방지 또는 지연, 당해 질환 진행을 지연 또는 늦춤, 당해 질환 상태의 개선, (부분적 또는 전적으로) 당해 질환의 차도를 제공, 당해 질환을 치료하는데 요구되는 하나 또는 그 이상의 약물의 투여량(dose)의 감소, 당해 질환 진행의 지연, 삶의 질 증가, 및/또는 생존 연장. “치료”에는 암의 병리학적 결과 감소가 또한 포괄된다. 본 출원의 방법은 치료의 이들 하나 또는 그 이상의 임의의 측면들을 고려한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "개체" 또는 "대상"은 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포유 동물을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 개체는 인간이다.

본원에 이용된 용어 “효과량(effective amount)”이란 명시된 장애, 상태 또는 질환의 치료, 이를 테면, 하나 또는 그 이상의 증상을 개선, 완화, 경감 및/또는 지연시키는데 충분한 제제, 이를 테면 공작된 면역 작동체 세포, 또는 이의 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 암과 관련하여, 유효량이란 종양이 종양을 수축 및/또는 종양의 성장 속도를 감소시키기 위해 (예를 들어, 종양 성장을 억제하기 위해), 또는 다른 원치않는 세포 증식을 예방 또는 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 구체예들에서, 효과량은 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예들에서, 효과량은 재발을 예방하거나 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 효과량은 하나 또는 그 이상의 투여로 투여될 수 있다. 당해 약물 또는 조성물의 효과량은 (i) 암 세포의 수를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 줄이고; (iii) 주변 장기로의 암 세포 침윤이 어느 정도 억제, 지연, 늦추거나, 또는 바람직하게는 중단시키고; (iv) 종양 전이를 억제하고(즉, 어느 정도 지연, 바람직하게는 중단); (v) 종양 성장을 억제시키고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 방지 또는 지연시키고; 및/또는 (vii) 암과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 없애줄 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 암의 발달을 "지연(delaying)"시키는 것은 질병의 발달을 지연, 방해, 늦춤, 지체, 안정화 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 질병의 이력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 기간이 될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분히 또는 상당한 지연은 사실상 개체가 질병을 발병하지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 암의 발달을 "지연"시키는 방법은 당해 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때, 주어진 시간 프레임에서 질병 발생 확률을 감소시키고 및/또는 주어진 시간 프레임에서 질병의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 일반적으로 통계적으로 유의미한 수의 개체를 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다. 암의 발달은 컴퓨터 단층 촬영 (CAT Scan), 자기 공명 영상 (MRI), 복부 초음파, 응고 검사, 동맥 조영 또는 생검을 포함한 (이에 국한되지는 않음) 표준 방법을 사용하여 탐지할 수 있다. 발달은 초기에는 탐지불가능할 수 있고, 발생, 재발 및 발병을 포함하는 암의 진행을 지칭할 수도 있다.

본 명세서에 기술된 본 출원의 구체예는 구체예들로 "로 구성되는(consisting)" 및/또는 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"것을 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 값 또는 파라미터의 "약(about)"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 변형을 포함(및 설명)한다. 예를 들면, “약 X”에 대한 설명은 “X”의 설명을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 값 또는 파라미터가 "아닌(not)"이란 일반적으로 값 또는 파라미터를 "제외한 것(other than)"을 의미하고 설명한다. 예를 들면, 상기 방법은 유형 X의 암 치료에 사용되지 않는다라는 것은 당해 방법은 유형 X를 제외한 암 치료를 이용한다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수(“a”, “an”및 “the”)형은 다른 명시적인 언급이 없는 한, 복수 개념을 포함한다는 것으로 주지되어야 한다.

II. 다중특이적 키메라 수용체 및 듀얼 키메라 수용체 시스템

본 출원은 NKG2D 리간드를 표적으로 하는 키메라 수용체 및 키메라 수용체 시스템을 제공한다 본 출원의 한 측면은 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인, 이를 테면 CD123 결합 도메인, 가령, IL-3 도메인을 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 제공한다.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제1 NKG2D 도메인, 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, 막경유 도메인 (CD8α), 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 키메라 수용체가 제공되며, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 이량체화 모티프 (가령, 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다: (a) 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제1 NKG2D 도메인, 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, 막경유 도메인 (CD8α), 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 도메인, 그리고 CD3ζ으로부터 유래된 일차 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 33에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 38의 핵산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열이 제공된다.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체가 제공된다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다.

상기 키메라 수용체 (가령, 다중특이적 키메라 수용체)는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 단량체이다. 일부 구체예들에서, 상기 단량체 키메라 수용체는 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인), 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, 그리고 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인). 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인은 제2 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인은 N-말단에 제1 공작된 잔기를 포함하고, 제2 NKG2D 도메인은 C-말단에 제2 공작된 잔기를 포함하며, 이때 제1 공작된 잔기는 가령, 이황화물 결합 또는 염 다리를 통하여 제2 공작된 잔기에 연합된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커, 이를 테면 약 50개 미만의 길이 아미노산으로 된 펩티드 링커, 가령, 서열 번호: 12-15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 통하여 제1 NKG2D 도메인에 융합된다.

일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체 (가령, 다중특이적 키메라 수용체)는 이량체, 이를 테면 동종이량체 또는 이형이량체다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체 키메라 수용체는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 각 쇄는 단일 NKG2D 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체 키메라 수용체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체 키메라 수용체는 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인, NKG2D 도메인, 막경유 도메인, 그리고 상기 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인, 제2 항원 결합 도메인, 막경유 도메인, 그리고 상기 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 이량체 키메라 수용체의 각 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 서로 비-공유적으로 연합되어, 이량체를 형성한다. 일부 구체예들에서, 이량체 키메라 수용체의 각 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 서로 공유적으로 연합되어, 가령, 상기 세포외 도메인에서 이황화물 결합, 및/또는 이량체화 모티프를 통하여 (가령, 류신 지퍼, 또는 시스테인 지퍼) 이량체를 형성한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커, 이를 테면 약 50개 미만의 길이 아미노산으로 된 펩티드 링커, 가령, 서열 번호: 12-15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 통하여 상기 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 이량체화 모티프, 이를 테면 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼를 통하여 상기 NKG2D 도메인에 융합된다.

따라서, 일부 구체예들에서, 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체가 제공되는데, 이때 상기 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, 그리고 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커, 이를 테면 약 50개 미만의 길이 아미노산으로 된 펩티드 링커, 가령, 서열 번호: 12-15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 통하여 제1 NKG2D 도메인 또는 제2 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 키메라 수용체는 상기 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인), 제1 펩티드 링커, 제1 NKG2D 도메인, 제2 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.

일부 구체예들에서, 다중특이적 (가령, 이중특이적) 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 키메라 수용체를 제공하며, 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커, 이를 테면 약 50개 미만의 길이 아미노산으로 된 펩티드 링커, 가령, 서열 번호: 12-15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 통하여 상기 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인), 펩티드 링커, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체가 제공되며, 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 이량체화 모티프 (가령, 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼), 및 제2 항원 결합 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인), 류신 지퍼, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 세포 표면 항원, 이를 테면 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 예시적인 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 항체 단편, 이를 테면 단일-쇄 항체 (가령, scFv) 또는 단일-도메인 항체 (가령, VHH)이다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD123 (가령, IL-3R 또는 IL-3RA 하위단위)에 특이적으로 결합하는 항체 단편 (가령 scFv 또는 VHH)이다.

일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 리간드이다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 리간드-결합 도메인, 이를 테면 수용체의 세포외 도메인이다. 예시적인 리간드 및 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 IL-3 도메인이다.

따라서, 일부 구체예들에서, 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체가 제공되는데, 이때 상기 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, 그리고 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인)을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 펩티드 링커, 이를 테면 약 50개 미만의 길이 아미노산으로 된 펩티드 링커, 가령, 서열 번호: 12-15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 통하여 제1 NKG2D 도메인 또는 제2 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 항-CD123 항체 단편 (가령, scFv 또는 VHH)이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 키메라 수용체는 상기 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 제1 펩티드 링커, 제1 NKG2D 도메인, 제2 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 예시적인 다중특이적 키메라 수용체는 도 1a-1b에 나타낸다.

일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체가 제공되며, 이 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 펩티드 링커, 이를 테면 약 50개 미만의 길이 아미노산으로 된 펩티드 링커, 가령, 서열 번호: 12-15에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커를 통하여 상기 NKG2D 도메인에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 항-CD123 항체 단편 (가령, scFv 또는 VHH)이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 펩티드 링커, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 예시적인 다중특이적 키메라 수용체는 도 1d에 나타낸다.

일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체가 제공되며, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 이량체화 모티프 (가령, 류신 지퍼, 또는 시스테인 지퍼), 및 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 항-CD123 항체 단편 (가령, scFv 또는 VHH)이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 류신 지퍼, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 예시적인 다중특이적 키메라 수용체는 도 1c에 나타낸다.

예시적인 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 및 이들의 서열은 표 1에 나타낸다. 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 갖는 이량체 키메라 수용체의 경우, 상기 단량체 하위단위의 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 16-20로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 NKG2D × IL-3 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 16-20로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 NKG2D × IL-3 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 33의 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 NKG2D 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 NKG2D 키메라 수용체가 제공된다. 서열 번호: 16-20 및 33으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 또한 제공된다.

일부 구체예들에서, 본원에서 제공된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체중 임의의 하나를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예들에서, 이때 상기 키메라 수용체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 갖는 이량체 키메라 수용체, 상기 키메라 수용체의 단량체 하위단위, 가령, 상기 폴리펩티드 쇄의 단일 카피를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 21-25 및 38로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 핵산은 DNA이다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 핵산은 RNA (가령, mRNA)이다. 일부 구체예들에서, 상기 기술된 키메라 수용체 또는 다중특이적 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산중 임의의 하나를 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 발현 벡터다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 이를 테면 렌티바이러스 벡터다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 비(non)-바이러스 벡터다.

[표 1]

듀얼 키메라 수용체 시스템

본 출원의 한 측면은 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 제공한다: (i) 다음을 포함하는 제1 키메라 수용체: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b) 제1 막경유 도메인, 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 다음을 포함하는 제2 키메라 수용체: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인, (b) 제2 막경유 도메인, 그리고 임의선택적으로 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인. 제1 키메라 수용체는 NKG2D 리간드에 특이적으로 결합하고, 제2 키메라 수용체는 제2 항원, 이를 테면 종양 항원, 가령, CD123에 특이적으로 결합한다.

제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체 각각은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 상기 듀얼 키메라 수용체 시스템은 본원에서 기술된 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 다음을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함하는 제1 세포외 도메인 , (b) 제1 막경유 도메인, 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인은 제2 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인은 N-말단에 제1 공작된 잔기를 포함하고, 제2 NKG2D 도메인은 C-말단에 제2 공작된 잔기를 포함하며, 이때 제1 공작된 잔기는 가령, 이황화물 결합 또는 염 다리를 통하여 제2 공작된 잔기에 연합된다. 일부 구체예들에서, 제1 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 상기 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는, 폴리펩티드 쇄를 포함한다: 제1 NKG2D 도메인, 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 예시적인 제1 키메라 수용체는 도 1e에 나타낸다.

일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b) 제1 막경유 도메인, 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 예시적인 제1 키메라 수용체는 도 1f에 나타낸다.

일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체는 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 이량체화 도메인 (가령, 류신 지퍼, 또는 시스테인 지퍼), (b) 제1 막경유 도메인, 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 이량체화 도메인은 NKG2D 도메인의 N-말단에 위치한다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체화 도메인은 NKG2D 도메인의 C-말단에 위치한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 추가 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: 류신 지퍼, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 다음을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다:(a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인, 그리고 (b) 제2 막경유 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 제2 세포외 도메인은 NKG2D 도메인을 더 포함하는데, 예를 들면, 제2 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인, 또는 제2 항원 결합 도메인과 NKG2D 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD123 결합 도메인, 이를 테면 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 제2 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 상기 제 2 세포외 도메인의 C-말단과 제 2 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 상기 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: IL-3 도메인, CD8α 힌지 영역, 및 CD8α 막경유 도메인. 예시적인 제2 키메라 수용체는 도 1e 및 도 1f에 나타낸다.

일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 다음을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다:(a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인, (b) 제2 막경유 도메인, 그리고 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 세포외 도메인은 NKG2D 도메인을 더 포함하는데, 예를 들면, 제2 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인, 또는 제2 항원 결합 도메인과 NKG2D 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD123 결합 도메인, 이를 테면 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 제2 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 상기 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: IL-3 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 그리고 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 제공된다: (i) 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제1 키메라 수용체 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b) 제1 막경유 도메인, 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다음을 포함하는 제2 키메라 수용체: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인 (가령, IL-3 도메인), (b) 제2 막경유 도메인, 그리고 임의선택적으로 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 막경유 도메인 및/또는 제2 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제1 세포내 신호전달 도메인 및/또는 제2 세포내 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 상기 제 1 세포외 도메인의 C-말단과 제 1 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 각 폴리펩티드 쇄는 각 폴리펩티드 쇄의 N-말단에 위치한 신호 펩티드 (이를 테면 CD8α 신호 펩티드)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제3 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인과 CD8α 막경유 도메인. 예시적인 듀얼 키메라 수용체 시스템은 도 1f에 나타낸다.

일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체의 폴리펩티드(들)과 제2 키메라 수용체의 폴리펩티드(들)은 폴리시스트론 핵산 구조체를 통하여 발현된다. 예를 들면, 제1 키메라 수용체의 폴리펩티드(들)은 자가-절단 펩티드를 경유하여 제2 키메라 수용체의 폴리펩티드(들)에 융합된다. 예시적인 자가-절단 펩티드에는 T2A, P2A, 및 F2A가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 상기 T2A 펩티드는 예를 들면, Szymczak AL. 외., Correction of multi-gene deficiency in vivo using a “self-cleaving”2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol 2004; 22(5)589-594를 참고한다.

일부 구체예들에서, 본원에 기술된 상기 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체를 인코딩하는 제1 핵산 서열과 제2 키메라 수용체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공되며, 이때 제1 핵산 서열은 자가-절단 펩티드(가령, T2A)를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 경유하여 제2 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 일부 구체예들에서, 이때 제1 키메라 수용체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 갖는 이량체 키메라 수용체이며, 상기 제1 핵산은 제1 키메라 수용체의 단량체 하위단위, 가령, 상기 폴리펩티드 쇄의 단일 카피를 인코딩한다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 34-35 및 41-42로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, NKG2D × IL-3 듀얼 키메라 수용체 시스템이 제공되는데, 이는 서열 번호: 34의 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 키메라 수용체와 서열 번호: 41의 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 키메라 수용체를 포함한다. 일부 구체예들에서, NKG2D × IL-3 듀얼 키메라 수용체 시스템이 제공되는데, 이는 서열 번호: 35의 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 키메라 수용체와 서열 번호: 42의 아미노산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 키메라 수용체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 36 또는 37에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 26-27, 39-40 및 43-44로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 핵산은 DNA이다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 핵산은 RNA (가령, mRNA)이다. 일부 구체예들에서, 상기에서 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템 또는 키메라 수용체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산중 임의의 것을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 발현 벡터다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 이를 테면 렌티바이러스 벡터다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 비(non)-바이러스 벡터다. 예시적인 듀얼 키메라 수용체 시스템은 하기에 나타낸다:

[표 2]

세포외 도메인

본원에서 기술된 듀얼 키메라 수용체 시스템의 다중특이적 키메라 수용체, 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체를 포함하는 상기 키메라 수용체는 하나 또는 그 이상의 NKG2D 도메인들 및/또는 제2 항원 결합 도메인을 비롯하여, 하나 또는 그 이상의 (이를 테면 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상중 임의의 하나) 항원 결합 도메인들을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 결합을 통하여, 펩티드 링커를 통하여, 또는 이량체화 모티프, 이를 테면 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼를 통하여 서로 직접적으로 융합될 수 있다.

NKG2D 도메인

상기 키메라 수용체의 세포외 도메인은 하나 또는 그 이상의 NKG2D 도메인들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체의 세포외 도메인은 단일 NKG2D 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인은 동일하다. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인은 상이하다. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인은 펩티드 결합을 통하여, 또는 펩티드 링커를 통하여 서로 직접적으로 융합될 수 있다.

일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 인간 NKG2D 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 상기 NKG2D의 세포외 도메인, 가령 인간 NKG2D로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 포워드 NKG2D 도메인, 가령, 야생형 NKG2D 도메인과 동일한 순서의 아미노산 서열을 갖는 도메인이다. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 야생형 NKG2D의 세포외 도메인으로부터 약 최소한 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 150개 또는 그 이상의 아미노산중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 리버스 NKG2D 도메인, 가령, 야생형 NKG2D 도메인의 아미노산 서열 순서의 역순 서열 갖는 도메인이다. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인 (제1 NKG2D 도메인 및/또는 제2 NKG2D 도메인 포함)은 서열 번호: 7 또는 8에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, NKG2D 도메인은 NKG2D의 상응하는 야생형 서열과 비교하였을 때, 최소한 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산 치환 (가령, 보존 아미노산 치환)을 포함한다.

NKG2D는 NK 세포의 세포 독성 활성을 자극하거나, 또는 억제하는 C-유형 렉틴 수용체인 NKG2 패밀리의 독특한 구성원이다. NKG2D는 NK 세포 및 CD8⁺T 세포 (가령, αβ T 세포 및 γδ T 세포)의 표면에서 주로 발현되는 유형 II 막경유-고정된 당단백질이다. 인간 수용체와 뮤린(murine) 수용체 사이에 70%의 서열 동일성이 공유되어, 여러 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있다. CD94로 이형이량체화되고, 비고전적(nonclassical) MHC 당단백질 클래스 I에 결합하는 다른 NKG2 수용체와 달리, NKG2D는 동종이량체를 형성하고 세포 스트레스-유도성 분자에 결합한다. 축적 증거는 NKG2D가 자가 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포와 같은 스트레스를 받은, 또는 비정상 세포에 대한 면역감시(immunosurveillance)에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

다양한 NKG2D 리간드들이 인간에서 확인되었는데, 여기에는 인간 염색체 6 상에 클러스트되어 있는 (Bahram 외. 2005) MHC 패밀리 안에 있는 유전자들에 의해 인코드된 MIC 분자 (MHC 클라스 I 쇄-관련된 단백질 A 및 단백질 B, 또는 MICA 및 MICB), 및 ULBP 분자 (UL16-결합 단백질, 이는 RAET1 단백질로도 공지되어 있음)들이 포함된다. 모든 NKG2D 리간드는 MHC 클라스 I 분자에 대하여 상동성이며, 상당한 대립형질(allelic) 변이를 나타낸다. 비록 NKG2D 리간드 RNAs가 신체의 모든 조직 및 장기에 광범위하게 발현되지만, NKG2D 리간드는 일반적으로 정상적인 성체 세포 표면에는 없다(Le Bert and Gasser 2014). 그러나, NKG2D 리간드의 발현은 열 충격, DNA 손상 및 정지된 DNA 복제를 포함한 세포 스트레스에 반응하여, 주로 상피 기원 조직에서 유도되거나 또는 상향조절된다. 세포 상에 NKG2D 리간드의 존재는 NK 세포 표적화 및 잠재적 제거를 위해 세포의 활동을 떨어뜨린다(flags)(Le Bert and Gasser 2014). 흥미롭게도, 다양한 혈액학적, 고형 종양에 걸쳐 형질전환된 세포에서 DNA 복구 경로의 높은 활성은 NKG2D 리간드의 발현을 유도하고, 이로 인하여 이들 세포가 NK-매개된 용해에 취약하게 만든다(Sentman 외. 2006).

NKG2D는 KLRK1 유전자에 의해 인코드된다. NKG2D는 하기 3개 도메인을 포함하는 막경유 수용체 단백질이다: 세포질 도메인 (인간 NKG2D의 잔기 1-51), 막경유 도메인 (인간 NKG2D의 잔기 52-72), 및 세포외 도메인 (인간 NKG2D의 잔기 73-216). 상기 NKG2D의 세포외 도메인은 C-유형 렉틴 도메인 (인간 NKG2D의 잔기 98-213)을 함유한다.

제2 항원 결합 도메인

제2 항원 결합 도메인은 세포 표면 분자에 특이적으로 결합한다. 제2 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커(marker)로서 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 제2 항원 결합 도메인에 의해 표적화되는 항원은 이 질환에 직접 또는 간접적으로 관련될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항원은 종양 항원이다. 일부 구체예들에서, 상기 종양 항원은 B 세포 악성과 연관된다.

종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 유발할 수 있는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 본 발명의 표적화된 항원의 선택은 치료될 특정 유형의 암에 의존할 것이다. 예시적인 종양 항원으로는 예를 들면, 신경교종-연합된 항원, 암배아 항원 (CEA), β-인간 융모막 고나도트로핀, 알파페토단백질 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로메라제 리버스 전사효소, RU1, RU2 (AS), 내장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 설바이빈 및 텔로메라제, 전립선-상피성암 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중성 엘라스타제, 에피린B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린이 포함된다.

일부 구체예들에서, 상기 종양 항원은 종양-특이적 항원 (TSA) 또는 종양-연합된 항원 (TAA)이다. TSA는 종양 세포에 특유한 것이며, 신체의 다른 세포에서는 발생되지 않는다. TAA 연합된 항원은 종양 세포에만 특유하지 않으며, 대신 항원에 대한 면역학적 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포에서 발현된다. 상기 종양에서의 이 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAAs는 면역계가 미성숙한 경우 그리고 반응할 수 없는 경우 태아 발달 중 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있고, 그리고 정상 세포에서 정상적으로 매우 낮은 수준으로 존재할 수 있지만, 종양에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다. 습니다.

TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적인 예들은 다음과 같다: 분화 항원, 이를 테면 MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중계통(multilineage) 항원, 이를 테면 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 배아 항원, 이를 테면 CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제제 유전자, 이를 테면 p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전좌(transl℃ations)로 인한 독특한 종양 항원; 이를 테면 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 그리고 바이러스 항원, 이를 테면 Epstein Barr 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 거대, 단백질-기반 항원에는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-페토단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연합된 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.

제2 항원 결합 도메인은 임의의 적합한 포멧일 수 있다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 항체, 이를 테면 4-쇄 항체, 또는 단일-도메인 항체, 이를 테면 오로지 중쇄 항체로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 항체 단편, 이를 테면, Fab, Fv, scFv, 또는 VHH이다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다.

일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 수용체의 리간드, 또는 리간드 결합 도메인이다. 일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된 리간드 또는 리간드 결합 도메인이다.

CD123-결합 도메인

일부 구체예들에서, 제2 항원 결합 도메인은 CD123-결합 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123-결합 도메인은 항-CD123 항체의 항체 단편 (가령, scFv 또는 VHH)이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123-결합 도메인은 CD123의 리간드, 또는 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 IL-3 도메인은 인간 IL-3, 이를 테면 전장의 인간 IL-3 또는 이의 기능적 단편으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123-결합 도메인은 서열 번호: 9에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다: (a) CD123-결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 그리고 (b) 막경유 도메인. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 하나 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들로 구성된다(또는 필수적으로 구성된다). 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 상기 세포외 도메인의 C-말단과 막경유 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 영역 (이를 테면 CD8α 힌지 영역)을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: CD123-결합 도메인과 막경유 도메인 (CD8α). 일부 구체예들에서, 상기 CD123-결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123-결합 도메인은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 41 또는 42에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 43 또는 44에 대하여 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성중 최소한 대략 임의의 하나를 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다.

IL-3 (인터루킨-3) 유전자는　염색체 5 상에 메핑되며, 이는 152개 아미노산 길이의 단백질을 인코드한다. IL-3은 세포 활성, 이를 테면 세포 성장, 분화 및 자가사멸(apoptosis)와 같은 광범위한 세포 활성을 지원할 수 있는 사이코킨이다. IL-3은 CD123 항원으로도 알려진, 인터루킨-3 수용체 (IL-3R)에 결합함으로써 작용한다. IL-3R은 리간드 특이적 알파 하위단위 및 신호 신호유도 베타 하위단위를 포함하는 이형이량체인데, 이 하위단위는 IL-3의 수용체, 콜로니 자극 인자 2 (CSF2/GM-CSF), 및 인터루킨 5 (IL5)에 대한 수용체들에 의해 공유된다. 상기 IL-3R의 활성화는 βc쇄의 인산화, Vav1과 같은 SH2-함유 어댑터 분자의 동원(recruitment), 그리고 Jak2/STAT5 및 Ras/MAPK 경로를 통한 다운스트림 신호 전달을 야기한다.

IL-3R은 75 kD 당단백질이며, N-글리코시다아제에 의해 가수 분해될 때 43 kD가 된다. IL-3R은 IL-3에 대한 특이적 결합을 담당하는 3 개의 세포외 도메인, 막경유 도메인, 및 세포내 신호 전달에 없어서는 안 될 짧은 세포간(intercellular) 도메인을 갖는다(Sato 외. 1993). IL-3R은 IL-3에 대하여 낮은 친화력과 높은 특이성을 갖는, 이형이량체 수용체다. IL-3에 결합하면, IL-3R이 활성화되고, 세포 증식 및 생존이 촉진된다 (Liu 외. 2015).

CD123은 AML 모구(AML blasts) (가령, 골수)에서 과다발현된다. AML 환자의 75-89%에서 AML 모구 및 백혈병 줄기 세포 (LSCs)는 CD123을 발현한다. 명백히 대조적으로, 정상적인 조혈 줄기 세포 (HSCs)에서 CD123의 발현은 낮거나 또는 검출불가능하다 (Frankel 외. 2014; Jordan 외. 2000). AML 이외에도, CD123은 또한 B 세포 계통 급성 림프모구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 혈장세포 수지상 세포 신생물 및 털 세포 백혈병을 비롯한, 다양한 혈액 악성 종양에서 과발현된다(Munoz 외. 2001). 이 발현 프로파일에 의해 CD123은 질병의 임상 진단, 예후 및 중재에서 유용한 바이오마커가 된다. 현재, 초기 단계 임상 시험에서 CD123-표적화 요법이 안전하고 조혈에 큰 부작용이 없는 것으로 입증되었다. 인간에서 CD123-표적화 요법의 항-백혈병 활성이 여전히 연구되고 있다.

이량체화 모티프

일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 이량체화 모티프 및 단일 NKG2D 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 제2 항원 결합 도메인, 단일 NKG2D 도메인, 그리고 이들 사이에 배치된 이량체화 모티프를 포함한다. 상기 이량체화 모티프는 키메라 수용체에서 2개의 폴리펩티드 쇄의 이량체화를 촉진시키고, 이에 의해 NKG2D 동종이량체의 형성 및 NKG2D 동종이량체의 NKG2D 리간드에의 결합을 용이하게 한다. 적합한 이량체화 모티프는 당분야에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체화 모티프는 류신 지퍼이다. 일부 구체예들에서, 상기 류신 지퍼는 서열 번호: 10의 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체화 모티프는 시스테인 지퍼다. 예시적인 시스테인 지퍼는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Guilaume 외. (2015) PLoS ONE 10(6): e0128779 참고.

펩티드 링커

일부 구체예들에서, NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인)은 펩티드 링커를 경유하여 서로 융합된다. 일부 구체예들에서, 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인은 펩티드 링커를 경유하여 서로 융합된다. 상기 키메라 수용체의 상이한 도메인들은 또한 펩티드 링커를 경유하여 서로 융합될 수 있다. 상이한 도메인들을 연결하는 펩티드 링커들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

키메라 수용체에 있는 각 펩티드 링커는 다양한 도메인의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라 동일한 또는 상이한 길이를 가질 수 있다. 각 펩티드 링커는 독립적으로 선택 및 최적화될 수 있다. 상기 키메라 수용체에 이용된 펩티드 링커(들)의 길이, 연성도 및/또는 다른 성질들은 하나 또는 그 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화력, 특이성 또는 항원항체결합력을 포함하나, 이에 국한되지 않는 성질에 어느 정도 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 2개의 인접 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 하기 위해, 더 긴 펩티드 링커가 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, 짧은 펩티드 링커가 키메라 수용체의 막경유 도메인과 상기 세포내 신호전달 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 연성(flexible) 잔기 (이를 테면, 글리신 및 세린)를 포함하여, 인접 도메인은 서로에 대하여 상대적으로 움직임이 자유롭다. 예를 들면, 글리신-세린 더블릿(doublet)이 적합한 펩티드 링커일 수 있다.

상기 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 그 이상의 아미노산 길이중 임의의 것이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 많아야 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 또는 이보다 적은 아미노산 길이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커의 길이는 약 1개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 50개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산 내지 약 100개 아미노산중 임의의 것일수 있다.

상기 펩티드 링커는 자연적으로 발생되는 서열, 또는 비-자연적으로 발생되는 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 오로지-중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로 이용될 수 있다. 예를 들면, WO1996/34103 참고. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 연성 링커다. 예시적인 연성 링커는 글리신 중합체 (G)_n(서열 번호: 28), 글리신-세린 중합체(예를 들면, (GS)_n (서열 번호: 29), (GSGGS)_n(서열 번호: 30), (GGGS)_n(서열 번호: 31), 및 (GGGGS)_n(서열 번호: 32) 포함, 이때 n은 최소한 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당분야에 공지된 다른 연성 링커를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 12-15로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

막경유 도메인

본 출원의 상기 다중특이적 키메라 수용체, 상기 듀얼 키메라 수용체 시스템의 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체를 비롯한 상기 키메라 수용체는 상기 세포외 항원 결합 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막경유 도메인을 포함한다. 막경유 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, “막경유 도메인”이란 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본원에 기재된 키메라 수용체에 사용하기에 적합한 막경유 도메인은 천연 단백질로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 이는 합성의 비-천연 단백질 세그먼트(segment), 예를 들어 세포막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 세그먼트일 수 있다.

막경유 도메인들은 당해 막경유 도메인의 3차원 구조에 근거하여 분류된다. 예를 들면, 막경유 도메인들은 알파 나선, 하나 이상의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴(barrel), 또는 세포의 인지질 이중 층에 걸칠 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 또한, 막경유 도메인은 당해 막경유 도메인이 막을 가로 질러 통과하는 횟수 및 단백질의 배향을 포함하는 막경유 도메인 위상배치(topology)에 기초하여 또는 대안적으로 분류될 수 있다. 예를 들면, 단일-통과 막 단백질은 세포막을 한번 횡단하고, 다중-통과 막 단백질은 세포막을 적어도 2 회 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 이상의 횟수) 횡단한다. 막 단백질은 세포의 내부 및 외부에 대한 말단 및 막-경유 세그먼트 (들)의 위상배치에 따라 유형 I, 유형 II 또는 유형 III으로 정의될 수 있다. 유형 I 막 단백질은 단일 막-스패닝(spanning) 영역을 가지며, 당해 단백질의 N-말단은 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고, 당해 단백질의 C-말단은 세포질 측에 존재하도록 배향된다. 유형 II 막 단백질은 단일 막-스패닝(spanning) 영역을 가지지만, 당해 단백질의 C-말단은 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고, 당해 단백질의 N-말단은 세포질 측에 존재하도록 배향된다. 유형 III 막 단백질은 다수의 막-스패닝 세그먼트를 가지며, 막경유 세그먼트의 수 및 N-말단 및 C-말단의 위치에 기초하여 추가로 분류될 수 있다.

일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 키메라 수용체의 막경유 도메인은 유형 I 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 다중-통과 막 단백질의 막경유 도메인들은 본원에서 기술된 키메라 수용체에 사용에 양립될 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합체 (최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의) 알파 나선 또는 베타 쉬트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다중-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대 측에 존재하고, 가령, 당해 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측에 있고, 당해 단백질의 C-말단은 세포외 측에 존재한다.

일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체의 막경유 도메인은 T-세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막경유 도메인에서 선택된 막경유 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α, CD4, CD28, 4-1BB, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다.

일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD28로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α의 전장의 막경유 도메인으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 CD8α절두된 막경유 도메인으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 서열 번호: 4 또는 45의 아미노산 서열을 포함하는, CD8α의 막경유 도메인이다.

본원에 기재된 키메라 수용체에 사용하기 위한 막경유 도메인은 또한 합성의 비-천연 발생 단백질 세그먼트의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인은 합성의, 비-자연 발생적 알파 나선 또는 베타 쉬트이다. 일부 구체예들에서, 상기 단백질 세그먼트는 최소한 대략적으로 20개의 아미노산, 가령, 최소한 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 또는 그 이상의 아미노산이다. 합성의 막경유 도메인들의 예는 당분야, 예를 들면, U.S. 특허 번호.7,052,906 B1 및 PCT 공개 번호. WO 2000/032776 A2에 공지되며, 이의 관련 내용은 본원의 참고자료에 편입된다.

막경유 도메인은 막경유 영역과 막경유 도메인의 C-말단에 위치한 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막경유 도메인의 세포질 영역은 3개 또는 그 이상의 아미노산을 포함하며, 일부 구체예들에서, 이는 지질 이중층에서 막경유 도메인의 배향을 지원한다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기는 막경유 도메인의 막경유 영역에 존재한다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기는 막경유 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 막경유 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린, 및 리신을 포함한다.

일부 구체예들에서, 막경유 도메인의 막경유 영역은 소수성 아미노산 잔기들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체의 막경유 도메인은 인위적인 소수성 서열을 포함한다. 예를 들면, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항(triplet)은 막경유 도메인의 C 말단에 존재할 수 있다. 일부 구체예들에서, 막경유 영역은 대부분 소수성 아미노산 잔기, 이를 테면 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 발린을 포함한다. 일부 구체예들에서, 막경유 영역은 소수성이다. 일부 구체예들에서, 막경유 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 세그먼트의 수치성(hydropathy) 또는 소수성 또는 친수성 특성은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 Kyte 및 Doolittle 수치 분석에 의해 평가될 수 있다.

세포내 신호전달 도메인

본 출원의 상기 다중특이적 키메라 수용체, 상기 듀얼 키메라 수용체 시스템의 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체를 비롯한 상기 키메라 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 키메라 수용체를 발현하는 면역 작동체 세포의 정상 작동체 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 “작동체 기능”이란 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T 세포의 작동체 기능은 예를 들면, 사이토킨의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 용어 “세포질 신호전달 도메인”이란 당해 작동체 기능 신호를 변환하고, 세포에게 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 보통 전체 세포질 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 많은 경우, 전체 쇄를 반드시 이용할 필요는 없다. 세포질 신호 전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 한, 그러한 절두된 부분이 온전한 작동체 기능 신호를 전달한다면, 무손상 쇄를 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포질 신호전달 도메인은 당해 작동체 기능 신호를 변환시키는데 충분한 세포질 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분이 포함되는 것으로 의미한다.

일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인으로 필수적으로 구성된 신호전달 도메인을 포함한다. “일차(primary) 세포내 신호전달 도메인”이란 면역 작동체 기능을 유도하는 자극 방식에서 작용하는 세포질 신호전달 서열을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프, 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유한다. “ITAM"은 본원에서 사용된 바와 같이, 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분에 일반적으로 존재하는 보존된 단백질 모티프다. 상기 모티프는 6-8개의 아미노산에 의해 분리된, 아미노산 서열 YxxL/I의 2개 반복부를 포함할 수 있으며, 이때 각 x는 독립적으로 임의의 아미노산이며, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 만든다. 신호전달 분자내 ITAMs는 세포 내에서 신호 변환에 중요하고, 이는 ITAM에서 티로신 잔기들의 인산화 및 이어서 당해 신호전달 분자의 활성화에 의해 최소한 일부분 중재된다. ITAMs는 신호전달 경로에 관련된 다른 단백질의 도킹(docking) 부위로 또한 기능을 할 수 있다. 예시적인 ITAM-함유 일차 세포질 신호전달 서열에는 CD3ζ, FcR 감마 (FCER1G), FcR 베타 (Fc 입실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다.

일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 일차 세포내 신호전달 도메인은 야생형 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 야생형 CD3ζ의 일차 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.

공동-자극 신호전달 도메인

많은 면역 작동체세포는 항원-특이 적 신호의 자극에 추가하여, 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진할 뿐만 아니라 세포의 작동체 기능을 활성화시키기 위해 공동-자극을 필요로 한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 최소한 하나의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 용어 “공동-자극 신호전달 도메인"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 이를 테면 작동체 기능과 같은 면역 반응을 유도하기 위해, 세포 내에서 신호 변환(transduction)을 매개하는 단백질의 최소한 일부를 지칭한다. 상기 키메라 수용체의 공동-자극 신호전달 도메인은 공동-자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있으며, 이는신호를 변환시키고, 면역 세포, 이를 테면 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구(eosinophils)에 의해 매개되는 반응을 조절한다. “공동-자극 신호전달 도메인”은 공동-자극 분자의 세포질 부분일 수 있다. 용어 "공동-자극 분자"란 공동-자극 리간드에 특이적으로 결합하고, 이로 인하여 상기 면역 세포에 의한 공동-자극 반응, 이를 테면 증식 및 생존을 포함하나, 이에 국한되지 않은 반응을 중재하는 면역 세포(이를 테면 T 세포) 상에 동족 결합 짝을 말한다.

일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 단일 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 2개 또는 그 이상의 (이를 테면 약 2, 3, 4개, 또는 그 이상중 임의의) 공동-자극 신호전달 도메인들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 2 개 또는 그 이상의 동일한 공동-자극 신호전달 도메인들, 예를 들면, CD28의 공동-자극 신호전달 도메인의 2개 사본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 상이한 공동-자극 단백질, 이를 테면 본원에서 기술된 임의의 2개의 또는 그 이상의 공동-자극 단백질의 2개 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인 (이를 테면 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 및 하나 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들과 상기 일차 세포내 신호전달 도메인 (이를 테면 CD3ζ세포질 신호전달 도메인)은 임의선택적 펩티드 링커를 통하여 서로 융합된다. 상기 일차 세포내 신호전달 도메인, 그리고 하나 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들은 임의의 적합한 순서로 정렬될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들은 막경유 도메인과 상기 일차 세포내 신호전달 도메인 (이를 테면 CD3ζ세포질 신호전달 도메인) 사이에 위치한다. 다중 공동-자극 신호전달 도메인들은 부가적 또는 상승적(synergistic) 자극 효과를 제공할 수 있다.

숙주 세포 (가령, 면역 세포)에서 공동-자극 신호전달 도메인 활성화로 당해 세포로부터 사이토킨의 생산 및 분비, 식작용 성질, 증식, 분화, 생존, 및/또는 세포독성의 를 증가 또는 감소를 유도할 수 있다. 임의의 공동-자극 분자의 공동-자극 신호전달 도메인은 본원에 기재된 키메라 수용체에서 사용하는데 호환적일 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 인자들, 이를 테면 당해 작동체 분자가 발현되는 면역 작동체 세포 유형(가령, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구) 및 원하는 면역 작동체 기능 (가령, ADCC 효과)에 근거하여 선택될 수 있다. 키메라 수용체에 사용을 위한 예시적인 공동-자극 신호전달 도메인들은 공동-자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있는데, 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: B7/CD28 패밀리의 구성요소들 (가령, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC, 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성요소들 (가령,4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파, 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성요소들 (가령, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, 및 SLAM/CD150); 그리고 임의의 다른 공동-자극 분자, 이를 테면 CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클라스 I, HLA-DR, Ikaros, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연합된 항원-1 (LFA-1), 및 NKG2C.

일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 공동-자극 신호전달 도메인들은 CD27, CD28, 4-1BB (가령, CD137), ICOS, OX40, CD30, CD40, CD3, 림프구 기능-연합된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 구성된 군에서 선택된다.

일부 구체예들에서, 본 출원의 키메라 수용체에서 세포내 신호전달 도메인은 CD28로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인과 CD28의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 키메라 수용체에서 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB (가령, CD137)로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인과 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.

일부 구체예들에서, 본 출원의 키메라 수용체에서 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 공동-자극 신호전달 도메인과 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, CD28의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD28의 공동-자극 신호전달 도메인, 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인.

본원에서 기술하는 임의의 공동-자극 신호 전달 도메인의 변이체는 당해 공동-자극 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조절할 수 있다면, 당해 변이체는 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 공동-자극 신호전달 도메인들은 야생형 대응부와 비교하였을 때, 최대 10개의 아미노산 잔기 변이 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 8)를 포함한다. 하나 또는 그 이상의 아미노산 변이를 포함하는 공동-자극 신호전달 도메인들을 또한 변이체로 지칭할 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이로 인하여, 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호 전달 도메인과 비교하였을 때, 신호전달 형질도입의 증가 및 면역 반응의 강화된 자극을 초래할 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이로 인하여, 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호 전달 도메인과 비교하였을 때, 신호전달 형질도입의 감소 및 면역 반응의 감소된 자극을 초래할 수 있다.

힌지 영역

본 출원의 상기 다중특이적 키메라 수용체, 상기 듀얼 키메라 수용체 시스템의 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체를 비롯한 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인과 막경유 도메인 사이에 위치한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 일반적으로 단백질의 두 도메인 사이에서 발견되는 아미노산 세그먼트이며, 단백질의 유연성 및 서로에 대하여 하나 또는 이들 두 도메인 모두의 움직임을 허용할 수 있다. 당해 작동체 분자의 막경유 도메인에 대하여, 세포외 항원 결합 도메인의 이러한 유연성 및 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수있다.

상기 힌지 영역은 약 10-100개 아미노산, 가령, 약 15-75개 아미노산, 20-50개 아미노산, 또는 30-60개 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역의 아미노산 길이는 최소한 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75개 아미노산일 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 자연 발생적 단백질의 힌지 영역이다. 힌지 영역을 포함하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 단백질의 힌지 영역은 본원에 기재된 키메라 수용체에 사용하기에 적합하다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 자연 발생 단백질의 힌지 영역의 적어도 일부이고, 이는 키메라 수용체에 유연성을 부여한다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 CD8α의 힌지 영역의 일부분, 가령, CD8α의 힌지 영역의 최소한 15개(가령, 20, 25, 30, 35, 또는 40개) 연속 아미노산을 함유하는 단편이다. 일부 구체예들에서, CD8α의 상기 힌지 영역은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다.

항체, 이를 테면 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체의 힌지 영역은 본원에 기재된 키메라 수용체에 사용하기에 적합하다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 당해 항체의 불변 도메인들 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 영역이다. 일부 구체예들에서, 항체의 상기 힌지 영역은 당해 항체의 힌지 영역과 당해 항체의 하나 또는 그 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 당해 항체의 힌지 영역과 당해 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 당해 항체의 힌지 영역과 당해 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 당해 항체의 힌지 영역과 IgG1 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 당해 항체의 힌지 영역과 IgG1 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다.

비-자연 발생적 펩티드는 본원에 기술된 키메라 수용체를 위한 힌지 영역으로 또한 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막경유 도메인 사이의 힌지 영역은 펩티드 링커, 이를 테면 (GxS)n 링커이며, 이때 x 와 n는 독립적으로 3과 12 사이의 정수, 가령, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상의 정수일 수 있다.

신호 펩티드

본 출원의 상기 다중특이적 키메라 수용체, 상기 듀얼 키메라 수용체 시스템의 제1 키메라 수용체 및 제2 키메라 수용체를 비롯한 상기 키메라 수용체는 상기 폴리펩티드(들)의 N-말단에서 신호 펩티드(또한 신호 서열로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩티드는 세포 안에서 원하는 부위로 폴리펩티드를 표적화시키는 펩티드 서열이다. 일부 구체예들에서, 신호 펩티드는 작동체 분자를 세포의 분비 경로로 표적화시키고, 당해 작동체 분자의 지질 이중층으로의 통합 및 고정을 허용할 것이다. 본원에 기재된 키메라 수용체에 사용하기에 적합한 자연 발생 단백질 또는 합성의, 비-자연 발생 신호 서열의 신호 서열을 포함하는 신호 펩티드는 당업자에게 자명할 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 신호 펩티드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α, IL-3, 및 IgG1 중쇄로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, IL-3의 신호 펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, CD8α의 신호 펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다.

III. 공작된 면역 작동체 세포

본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나를 포함하는 숙주 세포 (이를 테면 공작된 면역 작동체 세포)가 본 출원에서 추가 제공된다.

따라서, 일부 구체예들에서, 키메라 수용체를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)가 제공되는데, 이때 키메라 수용체는 다음을 포함한다:(a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함한다.

일부 구체예들에서, 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)가 제공되는데, 이때 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 폴리펩티드 쇄를 포함하는 키메라 수용체를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)가 제공되는데, 이때 폴리펩티드 쇄는 다음을 포함한다:(a) 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, 그리고 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인)을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 항-CD123 항체 단편 (가령, scFv 또는 VHH)이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 제1 펩티드 링커, 제1 NKG2D 도메인, 제2 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 (가령, 이중특이적) 키메라 수용체를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)가 제공되는데, 이때 상기 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 펩티드 링커, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 NKG2D 도메인과 CD123 결합 도메인 사이에 배치된 이량체화 모티프 (가령, 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼) 를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 류신 지퍼, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)가 제공된다: (i) 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제1 키메라 수용체 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다음을 포함하는 제2 키메라 수용체: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인; (b) 제2 막경유 도메인; 그리고 임의선택적으로 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: IL-3 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 그리고 임의선택적으로 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)가 제공된다: (i) 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제1 키메라 수용체, 이때 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인을 포함하는 제1 세포외 도메인 ; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 키메라 수용체, 이때 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인; (b) 제2 막경유 도메인; 그리고 임의선택적으로 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제1 키메라 수용체 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: IL-3 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 그리고 임의선택적으로 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 상기 공작된 면역 작동체 세포는 하나 또는 그 이상의 면역조절제를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 공작된 포유류 세포는 상기 면역조절제를 인코드하는 이종(heterologous) 핵산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역조절제를 인코드하는 이종(heterologous) 핵산은 본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코드하는 벡터 상에 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역조절제는 Runx3의 조절제다. 일부 구체예들에서, 상기 조절제는 폴리펩티드, 이를 테면 Runx3 또는 MITF로부터 유래된 폴리펩티드다. 일부 구체예들에서, 상기 조절제는 RNA, 이를 테면 miRNA 또는 siRNA이다. Runx3는 T 세포 귀환(homing) 및 고형 종양으로의 침윤을 도울 수 있으며, 이는 성공적인 T-세포 매개된 면역 요법에서 중요한 요소이다.

벡터

본 출원은 본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나를 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 포유 동물 세포와 같은 진핵 세포에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 및 이의 유도체를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, Sambrook 외. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 메뉴얼에 기술된다.

포유 동물 세포로의 유전자 전이를 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들면, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 상기 이종(heterologous) 핵산을 벡터에 삽입되고, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자로 포장될 수 있다. 이어서 재조합 바이러스를 단리하고, 시험관내 또는 생체 외에서 조작된 포유 동물 세포로 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 아데노바이러스 벡터가 이용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당분야에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 렌티바이러스 벡터가 이용된다. 일부 구체예들에서, 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터가 이용된다. 예를 들면, 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 휴대하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터는 당분야에 공지된 프로토콜에 따라 포장될 수 있다. 생성된 렌티바이러스 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 포유류 세포 (이를 테면 일차 인간 T 세포)를 형질도입시키는데 이용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 장기(long-term) 유전자 전이를 달성하는데 적합한 도구인데, 이는 이식유전자(transgene)의 장기적이고, 안정적인 통합 및 이의 자손 세포에서의 그의 전파를 허용하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 면역원성이 낮으며, 비-증식 세포를 형질도입할 수 있다.

일부 구체예들에서 , 상기 벡터는 본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코드하는 핵산중 임의의 하나를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커를 사용하는 것을 포함하여 당 업계의 임의의 공지된 분자 클로닝 방법을 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산은 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 포유동물 세포에서 유전자 발현을 위해 다양한 프로모터가 연구되었으며, 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터로 크게 분류될 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코딩하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 구성적 프로모터는 이종(heterologous) 유전자 (이식유전자라고도 함)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 한다. 본원에서 고려되는 예시적인 구성적 프로모터에는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 인간 연장(elongation) 인자-1알파 (hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터 (UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터 (PGK), 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터 (SV40), 및 CMV 초기 인핸서 (CAGG)에 결합된 닭 β-액틴 프로모터가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 이식유전자 발현을 유도하는 데있어서 그러한 구성적 프로모터의 효율은 수많은 연구에서 널리 비교되어 왔다. 예를 들면, Michael C. Milone 외 는 일차 인간 T 세포에서 키메라 수용체 발현을 유도하는 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율성을 비교하였고, hEF1α 프로모터는 이식유전자 발현을 최고 수준으로 유도할 뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지되었다고 결론지었다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)).

일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터 범주에 속한다. 상기 유도성 프로모터는 하나 또는 그 이상의 조건, 이를 테면 상기 공작된 면역 작동체 세포의 물리적 조건, 미세환경, 또는 상기 공작된 면역 작동체 세포, 유도제 (가령, 유도물질)의 생리학적 상태, 또는 이의 조합에 의해 유도될 수 있다. 일부 구체예들에서, 유도 조건은 상기 공작된 포유류 세포, 및/또는 당해 약제학적 조성물을 제공받은 대상에서 내생 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 구체예들에서, 유도 조건은 유도제, 방사선 조사 (이온화 방사선, 빛과 같은), 온도 (가령, 열), 산화 환원 상태, 종양 환경 및 공작된 포유류 세포의 활성화 상태로 구성되는 군에서 선택된다.

일부 구체예들에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터를 통하여 형질감염된 숙주 세포 집단에서 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 발현시키는 세포를 선별하기 위하여 선택성 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 또한 함유한다. 선별 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두가 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열에 의해 측면에 있을 수있다. 예를 들면, 상기 벡터는 전사 및 해독 종결자, 개시 서열 및 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유할 수 있다.

면역 작동체 세포

“면역 작동체 세포”는 면역 작동체 기능을 수행할 수 있는 면역 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 최소한 FcγRIII를 발현시키고, ADCC 작동체 기능을 수행한다. ADCC를 중재하는 면역 작동체 세포의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단세포, 세포독성 T 세포, 호중구, 및 호산구를 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 T 세포다. 일부 구체예들에서, T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, 또는 이의 조합이다. 일부 구체예들에서, T 세포는 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 발현되고, 표적 세포, 이를 테면 CD20+ 또는 CD19+ 종양 세포에 결합될 때 IL-2, TFN, 및/또는 TNF을 생산한다 . 일부 구체예들에서, CD8+ T 세포는 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템이 발현되고, 표적 세포에 결합될 때, 항원-특이적 표적 세포를 용해시킨다.

일부 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 NK 세포이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 확립된 세포주, 예를 들면, NK-92 세포일 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 면역 작동체 세포는 분화된 줄기 세포, 이를 테면 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS, 또는 배아 줄기 세포다.

상기 공작된 면역 작동체 세포는 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 상기 면역 작동체 세포, 이를 테면 T 세포 안으로 도입시킴으로써 준비된다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템은 본원에 기술된 단리된 핵산 또는 본원에 기술된 벡터를 형질감염시킴으로써 면역 작동체 세포로 도입될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템은 단백질을 세포 막으로 삽입시키고, 세포들은 미세유동 시스템, 이를 테면 CELL SQUEEZE^® 을 통과시킴으로써, 면역 작동체 세포로 도입된다(예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 번호 20140287509 참고).

벡터 또는 단리된 핵산을 포유 동물 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 기재된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 면역작동체 세포 내로 전달될 수 있다.

상기 벡터를 면역작동체 세포에 도입시키는 물리적 방법은 인산 칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 마이크로인젝션, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Sambrook 외. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참고. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 전기천공에 의해 세포 안으로 도입된다.

상기 벡터를 면역 작동체 세포 안으로 도입시키는 생물학적 방법에는 DNA 벡터 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터는 인간 세포와 같은 포유 동물 세포에 유전자를 삽입하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.

상기 벡터를 면역 작동체 세포 안으로 도입시키는 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 이를 테면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 그리고 수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드계는 리포좀 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.

일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코딩하는 RNA 분자는 통상적인 방법 (가령, 시험관내 전사)에 의해 준비되고, 공지된 방법, 이를 테면 mRNA 전기천공을 통하여 면역 작동체 세포 안으로 도입된다. 가령, Rabinovich 외., Human Gene Therapy 17:1027-1035 참고.

일부 구체예들에서, 형질도입되거나 형질감염된 면역 작동체 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후에 생체 외에서 전파된다. 일부 구체예들에서, 형질도입되거나 형질감염된 면역 작동체 세포는 최소한 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 12 일, 또는 14 일중 임의의 기간 동안 전파되도록 배양된다. 일부 구체예들에서, 형질도입되거나 형질감염된 면역 작동체 세포는 상기 공작된 포유류 세포를 선별하기 위하여 추가 평가 또는 스크리닝될 수 있다.

리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나, 또는 발현되지 않는 유전자이며, 폴리펩티드의 발현으로 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성으로 현시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포로 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다 (가령, Ui-Tei 외. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). 적합한 발현 시스템은 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다.

상기 공작된 면역 작동체 세포 안에 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 인코드하는 핵산 존재를 확인하는 다른 방법들에는 예를 들면, 당분야에 공지된 분자 생물학적 검정, 이를 테면 서든 및 노든 블랏팅, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 이를 테면 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 가령, 면역학적 방법(이를 테면 ELISAs 및 웨스턴 블랏)에 의해 탐지하는 것이 포함된다.

T 세포의 공급원

T 세포의 확장 및 유전자 변형 전에, 개체로부터 T 세포의 공급원이 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, 당업계에서 이용 가능한 다수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이를 테면 FICOLL™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여, 대상으로부터 수집된 혈액 단위로부터 T 세포를 수득할 수 있다. 일부 구체예들에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분 채집술(apheresis)에 의해 수득된다. 성분 채집 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵(nucleated) 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 일부 구체예들에서, 성분 채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획(fraction)을 제거하고, 세포를 후속 처리 단계에 적합한 완충제 또는 배지에 넣을 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포를 인산 완충 염수 (PBS)로 세척한다. 일부 구체예들에서, 상기 세척액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나, 또는 이들 두 2가 양이온이 아닐지라도 많은 것이 부족할 수 있다. 다시, 놀랍게도, 칼슘이 없는 초기 활성화 단계는 확대된 (magnified) 활성화로 이어진다. 세척 단계가 제조업자의 지시에 따라 반-자동 "흐름-통과(flow-through)" 원심 분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 이용하여 당분야에 공지된 방법에 따라 이루어질 수 있음을 당업자는 용이하게 인지할 것이다. 세척 후, 세포는 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca²⁺-없는, Mg²⁺-없는 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액이 있거나 또는 없는 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분 채집 샘플에서 바람직하지 않은 성분들이 제거 될 수 있고, 세포가 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.

일부 구체예들에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 PERCOLL™ 구배(gradient)를 통한 원심 분리 또는 역류 원심 분리 용리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써, 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 이를 테면 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포는 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가 분리될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 원하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 시간 동안 항-CD3/항-CD28 (가령, 3×28)-접합된 비드, 이를 테면 DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T와 항온처리함으로써, T 세포는 단리된다. 일부 구체예들에서, 기간은 약 30 분이다. 추가 구체예에서, 기간은 30 분 내지 36 시간 또는 더 긴 시간 및 그 사이의 모든 정수 값 범위이다. 추가 구체예에서, 기간은 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 일부 구체예들에서, 기간은 10 내지 24 시간이다. 일부 구체예들에서, 상기 항온처리 기간은 24 시간이다. 백혈병 환자에서 T 세포를 분리하기 위해 24 시간과 같은 더 긴 배양 시간을 사용하면, 세포 수율이 증가할 수 있다. 다른 세포 유형과 비교하여, T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 단리하기 위해, 예를 들어 종양 침윤 림프구 (TIL)를 종양 조직으로부터 또는 면역-절충된(compromised) 개체로부터 단리시키는 것은 더 긴 배양 기간이 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 배양 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하는 시간을 단순히 단축 또는 연장시킴으로써, 및/또는 (본 명세서에 추가로 기술 된 바와 같이) 비드에 대한 T 세포의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 동안 또는 공정 동안 다른 시점에서 또는 이에 대해 우선적으로 선택되거나, 또는 반하여(against) 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시 또는 다른 바람직한 시점에서 우선적으로 선택되거나, 또는 반하여(against) 선택될 수 있다. 당업자는 다수의 선택 라운드가 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 일부 구체예들에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 확장 과정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가 선택 라운드를 또한 거칠 수 있다.

음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍도(enrichment)는 음성적으로 선택된 세포에 대하여 특유한 표면 마커를 지향하는 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일 클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성(magnetic) 면역흡착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류(sorting) 및/또는 선택법이다. 예를 들면, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부하게 하거나 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 특정 구체예들에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈될 수 있다.

양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 20 억개 세포/mL의 농도가 사용된다. 한 구체예에서, 1 억개 세포/mL의 농도가 사용된다. 추가 구체예에서, 1 억 개 이상의 세포/mL가 사용된다. 추가 구체예에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만 또는 5 천만 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 여전히 또다른 구체예에서, 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 들추가 구체예에서, 1억2천5백만 또는 1억5천만 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같이 관심대상 표적 항원을 약하게 발현시킬 수 있거나 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터 약하게 발현될 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있게 한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 획득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 더 효율적으로 선택할 수 있다.

일부 구체예들에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석함으로써, 입자와 세포 사이의 상호 작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합될 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들면, CD4+ T 세포는 CD28을 더 높은 수준으로 발현시키고, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 구체예들에서, 사용된 세포의 농도는 5x10⁶/mL이다. 일부 구체예들에서, 사용된 농도는 약 1x10⁵/mL 내지 1x10⁶/mL 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.

일부 구체예들에서, 세포는 2-10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 길이 동안 회전자(rotator)에서 배양될 수 있다.

자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이 문맥에서 유용할 수 있지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBD, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들면, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 적합한 세포 동결 배지를 이용하는 것과 관련되며, 그 다음 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃로 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 기상(vapor phase)에 저장된다. 다른 제어된 동결 방법이 이용될 수 있고, 뿐만 아니라 -20℃에서 즉시 또는 액체 질소에서 제어되지 않는 동결이 이용될 수 있다.

일부 구체예들에서, 동결보존된 세포를 본원에 기재된 바와 같이 해동시키고, 세척하고, 활성화 전에 실온에서 1 시간 동안 휴면(rest)시켰다.

본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 시간 이전에 대상으로부터 혈액 샘플 또는 성분 채집 산물의 수집이 또한 본 출원에서 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집 될 수 있고, T 세포와 같은 바람직한 세포는 분리 및 동결되어, 본원에 기재된 것과 같은 T 세포로부터 혜택을 받을 수 있는 임의의 수의 질병 또는 상태를 위한 T 세포 요법에서 나중에 사용될 수 있다. 한 구체예에서 혈액 샘플 또는 성분 채집은 일반적으로 건강한 대상에서 채취된다. 특정 구체예들에서, 혈액 샘플 또는 성분 채집은 질병이 발생할 위험이 있지만, 아직 질병이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상으로부터 채취되며, 관심대상 세포는 분리되어 추후 사용을 위해 동결된다. 특정 구체예들에서, T 세포는 팽창, 동결되며, 추후에 사용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 샘플은 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후, 그리나 임의의 치료에 앞서 환자로부터 수집된다. 추가 구체예에서, 상기 세포는 하기 임의의 수의 관련 치료 양식에 앞서 대상으로부터 혈액 샘플 또는 성분 채집으로부터 단리된다: 나탈리주맙,에팔리주맙, 항바이러스제, 화학 요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506과 같은 제제, 항체, 또는 다른 면역절제(immunoablative) 제제 이를 테면, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이토산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀 산, 스테로이드, FR901228과 같은 제제를 이용한 치료 및 조사(irradiation). 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 또는 성장 인자 유도된 신호 전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)를 억제한다(Liu 외., Cell 66:807-815, 1991; Henderson 외., Immun 73:316-321, 1991; Bierer 외., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가 구체예에서, 상기 세포는 당해 환자로 부터 단리되고, 골수 또는 줄기 세포 이식, 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 시클로포스파미드와 같은 화학요법제, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용하는 T 세포 절제(ablative therapy) 요법과 함께 (예를 들어, 이전 또는 동시에 또는 이후에) 추후 사용을 위해 동결된다. 또다른 구체예에서, 상기 세포는 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산과 같은 B-세포 절제 요법 후, 치료에 추후 사용을 위해 동결될 수 있다.

일부 구체예들에서, T 세포는 치료후 환자로부터 직접적으로 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로 치료 후, 치료 직후 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안, 수득된 T 세포의 품질이 최적일 수 있거나, 또는 생체 외에서 확장하는 이들의 능력이 개선될 수 있다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체 외 조작 후, 이들 세포는 강화된 접목(engraftment) 및 생체내 확장에 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이러한 회복 단계 동안, T 세포, 수지상 세포 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 더욱이, 특정 구체예들에서, 동원(mobilization) (예를 들어, GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 요법은 대상에서 특히, 치료 후 특정된 기간(window of time) 동안 특정 세포 유형의 재 증식(repopulation), 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 상태를 창출하는데 이용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.

T 세포의 활성화 및 확장

본원에 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템으로 T 세포의 유전적 변형전 또는 후에, 상기 T 세포는 예를 들면, U.S. 특허 번호. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 그리고 U.S. 특허 출원 공개 번호. 20060121005에서 기술된 방법들을 이용하여 일반적으로 활성화되고, 확장될 수 있다.

일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연합된 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 접촉에 의해, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(가령, 브리오스태틴)과의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면에서 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예로는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 포함하며, 당분야에 흔히 공지된 다른 방법에서와 같이 이용될 수 있다 (Berg 외., Transplant Pr℃. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 외., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland 외., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

일부 구체예들에서, T 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동-자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 상태이거나 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 작용제는 동일한 표면 (즉, "시스(cis)" 형성)에, 또는 분리된 표면 (즉, "트랜스(trans)" 형성)에 결합될 수 있다. 대안으로, 하나의 제제는 표면에 결합되고, 다른 제제는 용액으로 결합될 수 있다. 한 구체예에서, 공동-자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 상태이거나 또는 표면에 결합된다. 특정 구체예들에서, 두 작용제 모두 용액내 있을 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 작용제는 가용성 형태일 수 있고,이어서 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 제제에 결합할 항체 또는 다른 결합제와 같은 표면에 가교 결합될 수 있다. 이 점에 있어서, 예를 들면, 본 발명에서 T 세포 활성화 및 확장에 이용되는 것으로 고려되는 인위적인 항원 제공 세포(aAPCs)에 대하여 U.S. 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810 참고.

일부 구체예들에서, T 세포를 작용제-코팅된 비드와 조합하고, 후속적으로 비드 및 세포를 분리한 후, 당해 세포를 배양한다. 대안적인 구체예에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고, 함께 배양된다. 추가 구체예에서, 비드 및 세포는 먼저 자기력과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.

예를 들면, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드 (3 x 28 비드)가 T 세포에 접촉하게 함으로써 결찰될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 세포 (예를 들면, 10⁴ 내지 10⁹ 개의 T 세포)와 비드 (예를 들면, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드, 1:1 비율)는 완충제, 바람직하게는 PBS (이가 양이온, 이를 테면, 칼슘 및 마그네슘 없는)에서 복합된다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 세포는 샘플에서 매우 드물고, 샘플의 0.01%만을 포함하거나 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 내용 범위 안에 있다. 특정 구체예들에서, 특정 구체예들에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 약 20 억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 또다른 구체예에서, 1 억 개 이상의 세포/mL가 사용된다. 추가 구체예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 5 천만 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 여전히 또다른 구체예에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 1 억개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 들추가 구체예에서, 125 또는 1 억 5 천만 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같이 관심대상 표적 항원을 약하게 발현시킬 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있게 한다. 특정 구체예들에서, 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 획득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 더 효율적으로 선택할 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 혼합물은 수 시간 (약 3 시간) 내지 약 14 일 또는 그 사이의 임의의 시간 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 혼합물을 21 일 동안 배양할 수 있다. 본 발명의 한 구체 예에서, 비드 및 T 세포는 약 8 일 동안 함께 배양된다. 또다른 구체예에서, 비드 및 T 세포는 2-3 일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60 일 이상일 수 있도록 여러 주기의 자극이 또한 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청 (가령, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 당업자에 공지된 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존에 필수적인 인자들을 함유하는 적절한 배지 (가령, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제로는 계면 활성제, 플라스마네이트(plasmanate), 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토 에탄올이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 배지에는 무-혈청, 또는 적절한 양의 혈청(또는 현장), 또는 특정 호르몬 세트, 및/또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토킨(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, 추가 아미노산, 피루브산 나트륨 및 비타민과 함께 Optimizer이 포함된다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양 물에만 포함되며, 대상에 주입될 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37 ℃) 및 대기 (예를 들어, 공기+5% CO₂)하에 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 전형적인 혈액 또는 성분채집된(apheresed) 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포 독성 또는 억제제 T 세포 집단 (TC, CD8)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 생체외 확장은 약 8 일 내지 9 일 전, 주로 TH 세포로 구성되는 T 세포 집단을 생성하는 반면, 약 8 일 내지 9 일 후, T 세포 집단은 점점 더 많은 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 하위세트가 분리된 경우, 이 하위세트를 더 크게 확장시키는 것이 유리할 수 있다.

또한, CD4 및 CD8 마커 이외에도, 다른 표현형 마커는 세포 확장 과정 동안 상당히 유의적으로, 그러나 상당부분 재현가능하게 변한다. 따라서, 이러한 재현성(reproducibility)은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 맞춤화하는 능력을 가능하게 한다.

IV. 약제학적 조성물

본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템중 임의의 하나를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포중 임의의 하나와 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 출원에 더 제공된다. 약제학적 조성물은 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 원하는 순도를 갖는 본원에서 기술된 공작된 면역 작동체 세포 다수를 선택적 약제학적으로 수용가능한 담체들, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다.

수용가능한 담체들, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 비독성이며, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 포함한 항산화제; 보존제, 등장화제, 안정제, 금속 착물 (가령, Zn-단백질 착물); 킬레이트제, 예컨대 EDTA 및/또는 비-이온성 계면 활성제를 포함한다.

완충제는 특히 안정성이 pH에 의존하는 경우, 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는 데 사용된다. 완충제는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 유기 및 무기 산 및 이의 염 모두를 포함한다. 예를 들면, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가적으로, 완충제는 히스티딘 및 트리메틸아민 염, 예컨대 트리스를 포함할 수 있다.

보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되며, 전형적으로 0.2% -1.0% (w/v)의 범위로 존재한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 할로겐화물 (가령, 클로라이드, 브롬화물, 요오드화물), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.

조성물 중에 액체의 등장성을 조정하거나 유지하기 위해 때때로 "안정화제"로 알려진 등장화제(tonicity agents)가 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 큰 하전된 생체 분자와 함께 사용될 때, 이들은 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호 작용할 수 있기 때문에 종종 "안정화제"로 지칭되며, 이로써 분자-간 및 분자-내 상호 작용의 가능성을 감소시킨다. 등장화제는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여, 0.1 중량% 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 5 중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 선호되는 등장화제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 또는 그 이상의 고차 알코올, 예컨대 글리세린, 에리스리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.

추가 부형제에는 다음 중 하나 또는 그 이상을 제공할 수 있는 제제가 포함된다: (1) 증량제(bulking agents), (2) 용해도 증강제, (3) 안정제 및 (4) 용기 벽에 변성 또는 부착을 방지하는 제제. 이러한 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알코올 (상기 열거됨); 아미노산 이를 테면, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올 이를 테면, 슈크로스, 락토오스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클로 톨 (가령, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 이를 테면, 우레아, 글루타티온, 티오크산, 티오글리콜산 나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오 황산나트륨; 저-분자량 단백질, 이를 테면, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로블린; 친수성 중합체 이를 테면, 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (가령, 자일로스, 만노스, 과당, 포도당; 이당류 (가령, 락토스, 말토오스, 슈크로스); 라피노스와 같은 삼당류; 그리고 다당류 이를 테면, 덱스트린 또는 덱스트란.

비-이온성 계면활성제 또는 세제 ("습윤제"라고도 함)는 치료제를 가용화하고, 교반-유도된 응집으로부터 치료용 단백질을 보호하기 위해 존재하고, 이는 또한 활성 치료요법적 단백질 또는 항체의 변성을 유발하지 않으면서 제형이 전단 표면 응력에 노출되게 한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 바람직하게는 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위로 존재한다.

적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80, 등), 폴리옥사머 (184, 188, 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®20, TWEEN®-80, 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온 성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제에는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드가 포함된다.

상기 약제학적 조성물이 생체 내 투여에 사용 되려면, 멸균되어야 한다. 상기 약제학적 조성물은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균성이 부여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 정맥 내 용액 주머니 또는 바이알을 갖는 용기 안에 배치된다.

투여 경로는 공지된 및 허용된 방법, 예를 들어 단일 또는 다중 볼루스(bolus) 또는 적절한 방식으로 장기간에 걸친 주입에 따르는데, 가령, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 동맥내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입 또는 서방성 방출 또는 연장-방출 수단에 의한 주사 또는 주입에 의한다.

본원에서 기술된 상기 약제학적 조성물 또한 치료되는 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물 또는 작용제, 바람직하게는 서로에게 악영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 상기 조성물은 세포독성제, 화학치료요법제, 사이토킨, 면역억제제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 목적하는 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다.

V. 암을 치료하는 방법

본 출원은 세포 면역요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물에 더 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 면역 요법은 혈액 악성 종양 및 고형 종양을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 암을 치료하기 위한 것이다. 본원에서 기술된 상기 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체, 듀얼 키메라 수용체 시스템, 및 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 공작된 T 세포)중 임의의 것을 암 치료 방법에 이용할 수 있다.

일부 구체예들에서, 개체 (이를 테면 인간 개체)에서 암 (이를 테면 다발성 골수종, 급성 림프모구 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병)을 치료하는 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 당해 개체에게 다음을 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다: (1) 키메라 수용체를 포함하는 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포), 이때 키메라 수용체는 다음을 포함한다:(a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (2) 약제학적으로 수용가능한 담체. 일부 구체예들에서, 상기 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 개체 (이를 테면 인간 개체)에서 암 (이를 테면 다발성 골수종, 급성 림프모구 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병)을 치료하는 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 당해 개체에게 다음을 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다: (1) 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)는 다음을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 키메라 수용체를 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, 그리고 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인)을 포함하는 세포외 도메인; (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (2) 약제학적으로 수용가능한 담체. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 항-CD123 항체 단편 (가령, scFv 또는 VHH)이다. 일부 구체예들에서, 상기 CD123 결합 도메인은 IL-3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 제1 펩티드 링커, 제1 NKG2D 도메인, 제2 펩티드 링커, 제2 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 개체 (이를 테면 인간 개체)에서 암 (이를 테면 다발성 골수종, 급성 림프모구 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병)을 치료하는 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 당해 개체에게 다음을 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다: (1) 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)는 다중특이적 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 키메라 수용체를 포함하며, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 CD123 결합 도메인 (가령, IL-3 도메인); (b) 막경유 도메인; 그리고 (c) 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (2) 약제학적으로 수용가능한 담체. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합을 통하여 제2 폴리펩티드 쇄의 NKG2D 도메인에 가교된다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 펩티드 링커, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 상기 세포외 도메인은 NKG2D 도메인과 CD123 결합 도메인 사이에 배치된 이량체화 모티프 (가령, 류신 지퍼 또는 시스테인 지퍼) 를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: IL-3 도메인, 류신 지퍼, NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인.

일부 구체예들에서, 개체 (이를 테면 인간 개체)에서 암 (이를 테면 다발성 골수종, 급성 림프모구 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병)을 치료하는 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 당해 개체에게 다음을 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다: (1) 공작된 면역 작동체 세포 (이를 테면 T 세포)는 다음을 포함하는 듀얼 키메라 수용체 시스템을 포함한다: (i) 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제1 키메라 수용체 각 쇄는 다음을 포함한다: (a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인; (b) 제1 막경유 도메인; 그리고 (c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (ii) 제3 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다음을 포함하는 제2 키메라 수용체: (a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인; (b) 제2 막경유 도메인; 그리고 임의선택적으로 (c) 제2 세포내 신호전달 도메인; 그리고 (2) 약제학적으로 수용가능한 담체. 일부 구체예들에서, 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함한다: NKG2D 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ으로부터 유래된 일차 세포내 신호전달 도메인. 일부 구체예들에서, 제2 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: IL-3 도메인, CD8α 힌지 영역, CD8α 막경유 도메인, 그리고 임의선택적으로 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 도메인.

본원에 기재된 방법은 고형 암 및 액체 암 둘 모두를 비롯한, 다양한 암을 치료하는데 적합하다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 다발성 골수종, 급성 림프모구 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병이다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 불응성 또는 재발된 암이다. 본원에 기술된 방법들은 제1 요법, 제 2 요법, 제 3 요법, 또는 당분야에 공지된 다른 유형의 암 치료법, 이를 테면, 화학요법, 수술, 방사능, 유전자 요법, 면역요법, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 표적화 요법, 저온요법, 초음파 요법, 광역학 요법, 고주파 절제 또는 이와 유사한 것들과 어쥬번트 설정 또는 네오어쥬번트 설정에서 복합 요법으로 이용될 수 있다.

약제학적 조성물의 투여는 주사, 수혈, 이식 또는 이식과 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 상기 조성물은 환자에게 동맥내, 피하, 피내, 종양내, 마디내(intranodally), 골수내, 근육내, 정맥내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 전신으로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 개체에게 주입, 이를 테면, 정맥내 주입에 의해 투여된다. 면역요법을 위한 주입 기술은 당분야에 공지되어 있다(가령, Rosenberg 외, New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)). 부 구체예들에서, 상기 조성물은 정맥 주사로 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상된 특정 용도에 따라 가변적일 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료를 위한 유효량을 결정하기 위한 신뢰할만한 지침을 제공한다. 유효 투여량의 종간(interspecies) 스케일링은 다음과 같은 원칙에 따라 수행될 수 있다: Mordenti, J. 및 Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 외, Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46. 상이한 제형은 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이며, 특정 기관 또는 조직을 치료하기 위한 투여는 또다른 기관 또는 조직에 대한 방식과는 또다른 방식으로 전달을 필요로 할 수 있다는 점은 이 본 출원의 범주 내에 있다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 양은 당해 개체에서 목적하는 임상 반응을 야기시키는데 효과적이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 양은 당해 개체에서 질환 관해 (부분적으로 또는 완전하게)를 야기하는데 효과적이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 양은 당해 개체에서 암의 재발 또는 진행을 방지하는데 효과적이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 양은 당해 개체에서 생존 연장 (이를 테면 무 질환 생존)에 효과적이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 개체의 삶의 질을 향상시키는데 효과적이다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 양은 고형 또는 임파 종양의 성장 억제 또는 크기 감소에 효과적이다. 일부 구체예들에서, 고형 또는 임파 종양의 크기는 최소한 약 10% (예를 들면, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%중 임의의 것들 포함) 감소된다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 양은 당해 개체에서 종양 전이를 억제하는데 효과적이다. 일부 구체예들에서, 최소한 약 10% (예를 들면 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%중 임의의 것을 포함) 전이가 억제된다. 일부 구체예들에서, 림프절로의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 일부 구체예들에서, 폐로의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 전이는 혈액 검사, 뼈 스캔, 엑스레이 스캔, CT 스캔, PET 스캔 및 생검과 같은 당업계의 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.

VI. 키트 및 제조 물품

본원에서 기술된 키메라 수용체, 다중특이적 키메라 수용체, 듀얼 키메라 수용체 시스템, 또는 상기 공작된 면역 작동체 세포를 포함하는 키트, 단위 투약형 및 제조 물품이 더 제공된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물중 임의의 하나를 담고있는 키트가 제공되며, 바람직하게는 이의 사용을 위한 지침이 제공된다.

본 출원의 키트는 적합하게 포장된다. 적합한 포장은 바이알, 병, 자르(jars),가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 비닐 봉지) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 키트는 임의선택적으로 완충제 및 해석 정보와 같은 추가 구성 요소를 제공할 수 있다. 본 출원은 따라서 바이알 (밀봉된 바이알과 같은), 병, 자르,가요성 패키징 및 이와 유사한 것을 포함하는 제조 물품을 또한 제공한다.

제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 연합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기술된 질환 또는 장애 (암과 같은)를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 당해 조성물이 개인의 특정 상태를 치료하는데 사용됨이 라벨 또는 패키지 삽입물에 표시된다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입물은 당해 조성물을 개체에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 상기 라벨에는 재구성 및/또는 사용 지침이 표시될 수 있다. 상기 약제학적 조성물을 보유하는 용기는 다중-사용 바이알일 수 있으며, 이는 재구성된 제형의 반복 투여 (예를 들어, 2-6 회 투여)를 허용한다. 패키지 삽입물은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증(indications), 사용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 설명서를 지칭한다. 추가적으로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 키트 또는 제조 물품은 약제학적 조성물, 예를 들어 병원 약학 및 복합 약학에서 저장 및 사용하기에 충분한 양으로 포장 된 약학 조성물의 다중 단위 용량 및 사용 설명서를 포함할 수 있다.

실시예

하기에서 실시예들은 본 발명의 순전히 예시적인 것으로 의도된 것이며 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 다음 실시예들 및 상세한 설명은 제한이 아닌 예시로서 제공된다.

실시예 1. NKG2D × IL-3 키메라 수용체 및 듀얼 NKG2D/IL-3 키메라 수용체 시스템의 준비

본 실시예는 예시적인 이중특이적 키메라 수용체, 듀얼 키메라 수용체 시스템 및 공작된 T 세포의 기획 및 준비를 설명한다.

이중특이적 키메라 수용체 및 듀얼 키메라 수용체 시스템 구조체의 기획

표 1 및 2에서는 7가지 구조체의 성분들과 상응하는 서열들을 보여준다.

구조체 1: 단량체 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 (LIC2001). 본 이중특이적 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 이때 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인 제1 펩티드 링커, 이의 N-말단에서 공작된 아르기닌 잔기를 갖는 제1 NKG2D 도메인, 제2 펩티드 링커, 및 이의 C-말단에서 공작된 아스파르트산 잔기를 갖는 제2 NKG2D 도메인을 포함한다. NKG2D 도메인들은 이령체화때 NKG2D 리간드 결합를 담당한다. 상기 공작된 아르기닌 잔기와 아스파르트산 잔기는 서로 연합되어, 종양 세포에 결합하지 않은 유리(free) NKG2D 리간드에 NKG2D 이량체가 결합하는 것을 방지할 수 있다. 상기 핵산 구조체는 단일 폴리펩티드 쇄를 인코드한다.

구조체 2: 단량체 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 (LIC2001-1). 본 이중특이적 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 이때 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인, 제1 펩티드 링커, 제1 NKG2D 도메인, 제2 펩티드 링커, 및 제2 NKG2D 도메인을 포함한다. NKG2D 도메인들은 이령체화때 NKG2D 리간드 결합를 담당한다. 상기 핵산 구조체는 단일 폴리펩티드 쇄를 인코드한다. 비교를 목적으로, 단일특이적 NKG2D 키메라 수용체 (LIC2001-2)가 작제되는데, 이것은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 제1 포워드 NKG2D 도메인, 펩티드 링커, 및 제2 포워드 NKG2D 도메인를 포함하는 세포외 도메인; 막경유 도메인 (CD8α), 및 세포내 신호전달 도메인 (4-1BB 및 CD3ζ)을 포함한다. LIC2001-2의 아미노산 서열은 서열 번호: 33이며, LIC2001-2의 핵산 서열은 서열 번호: 38이다.

구조체 3: 류신 지퍼 모티프를 갖는 이량체 NKG2D × IL-3 키메라 수용체(LIC2002). 본 이중특이적 키메라 수용체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 이때 각 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 이때 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인, 류신 지퍼 모티프, 그리고 동종이량체화때 NKG2D 리간드 결합을 담당하는 리버스 NKG2D 도메인를 포함한다. 상기 핵산 구조체는 상기 폴리펩티드 쇄의 단일 복사체를 인코드한다.

구조체 4: 류신 지퍼 모티프없는 이량체 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 (LIC2002-1). 본 이중특이적 키메라 수용체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 이때 각 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 이때 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인, 펩티드 링커, 그리고 동종이량체화때 NKG2D 리간드 결합을 담당하는 리버스 NKG2D 도메인를 포함한다. 상기 핵산 구조체는 상기 폴리펩티드 쇄의 단일 복사체를 인코드한다.

구조체 5: 류신 지퍼 모티프를 갖는 이량체 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 (LIC2002-2). 본 이중특이적 키메라 수용체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 이때 각 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 이때 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인, 류신 지퍼 모티프, 그리고 동종이량체화때 NKG2D 리간드 결합을 담당하는 포워드 NKG2D 도메인를 포함한다. 상기 핵산 구조체는 상기 폴리펩티드 쇄의 단일 복사체를 인코드한다.

구조체 6: 듀얼 NKG2D/IL-3 키메라 수용체 시스템 (LIC2003). 듀얼 NKG2D/IL-3 키메라 수용체 시스템을 위한 폴리시스트론 핵산 구조체가 기획된다. 상기 구조체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 제1 폴리펩티드(세포외 도메인은 리버스 NKG2D 도메인과 동종이량체화때 NKG2D 리간드 결합을 담당하는 포워드 NKG2D 도메인, 막경유 도메인과 세포내 신호전달 도메인, 이어서 T2A 자가-절단 펩티드를 포함) 및 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 제2 폴리펩티드(CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인에 이어서, 세포내 신호전달 도메인없이, 막경유 도메인을 포함)를 인코드한다. 상기 구조체의 발현시 제1 폴리펩티드는 제1 키메라 수용체를 형성하고, 제2 폴리펩티드는 제2 키메라 수용체를 형성한다.

구조체 7: 듀얼 NKG2D/IL-3 키메라 수용체 시스템 (LIC2004). 듀얼 NKG2D/IL-3 키메라 수용체 시스템을 위한 폴리시스트론 핵산 구조체가 기획된다. 상기 구조체는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 제1 폴리펩티드(세포외 도메인은 동종이량체화때 NKG2D 리간드 결합을 담당하는 포워드 NKG2D 도메인, 막경유 도메인과 세포내 신호전달 도메인, 이어서 T2A 자가-절단 펩티드를 포함) 및 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는 제2 폴리펩티드(CD123 결합에 특이적인 IL-3 도메인에 이어서, 세포내 신호전달 도메인없이, 막경유 도메인을 포함)를 인코드한다. 상기 구조체의 발현시, 제1 폴리펩티드의 2개 사본은 이량체인 제1 키메라 수용체를 형성하고, 제2 폴리펩티드는 제2 키메라 수용체를 형성한다. 단일특이적 NKG2D 키메라 수용체 (LIC2004-1)가 구축되며, 이는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 포워드 NKG2D 도메인, CD8α 힌지 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 막경유 도메인 (CD8α), 및 세포내 신호전달 도메인 (4-1BB 및 CD3ζ)을 포함한다. LIC2004-1의 아미노산 서열은 서열 번호: 35이며, 상기 LIC2004-1 의 핵산 서열은 서열 번호: 40이다.

렌티바이러스 발현 벡터의 생성

간략하게 설명하자면, 렌티바이러스 벡터는 pLVX-Puro (Clontech#632164)를 이용하여, 원래 프로모터를 EcoRI 및 XbaI(GenScript의)를 갖는, 인간 연장 인자 1α 프로모터 (hEF1α) 유전자로 대체함으로써 변형된다. NKG2D × IL-3 키메라 수용체 유전자 또는 NKG2D/IL-3 듀얼 키메라 수용체 시스템 유전자는 GenScript에 의해 구축되며, EcoRI/HpaI를 통하여 상기 벡터 안으로 클론되어 재조합 렌티바이러스 발현 플라스미드가 제공되며, 이것은 렌티바이러스 패키징 과정을 더 거치게 된다.

pMDLg/pRRE (Addgene#12251), pRSV-Rev (Addgene#12253), 및 pMD2.G (Addgene#12259)를 함유하는 상기 렌티바이러스 패키징 플라스미드 혼합물은 폴리에테리미드 (PEI)와 함께, pLVX-NKG2D × IL-3 키메라 수용체/듀얼 키메라 수용체 시스템-Puro 발현 플라스미드과 사전-최적화된 비율로 사전-혼합되고, 적절하게 혼합시킨 후, 실온에서 5 분 동안 항온처리된다. 이어서, 형질감염 혼합물을 293FT 세포에 점적 추가하고, 부드럽게 혼합하였다. 그 후, 세포를 37℃및 5% CO₂ 세포 인큐베이터에서 밤새 항온처리하였다. 상청을 4 ℃500g에서 10 분 동안 원심분리한 후 수집하였다. 상청액을 0.45μm PES 필터를 통해 여과한 후, 바이러스 상청액을 20% 슈크로스 구배 초원심분리로 농축시켰다. 원심분리 후, 상청액을 조심스럽게 버리고 바이러스 펠렛을 사전-냉각된 DPBS로 조심스럽게 헹구었다. 그리고 바이러스의 농도가 측정되었다. 바이러스를 적절히 분취한 다음, -80℃에 즉시 보관했다. 상기 바이러스 역가는 GenScript에 의해 개발된 HTRF 키트에 기초하여 p24에 의해 결정되었다. 다음의 재조합 렌티바이러스 발현 플라스미드는 상기 기술된 7가지 구조체 각각에 상응하도록 준비되었다: pLLV-LIC2001, pLLV-LIC2001-1, pLLV-LIC2002, pLLV-LIC2002-1, pLLV-LIC2002-2, pLLV-LIC2003, 및 pLLV-LIC2004, 뿐만 아니라 pLLV-LIC2001-2 및 pLLV-LIC2004-1.

PBMC 준비

백혈구를 수집하고, 세포 농도를 R10 배지에서 5x10⁶ 세포/mL로 조정하였다. 그 다음 백혈구는 1:1 (v/v) 비율에서 0.9% NaCl 용액과 혼합되었다. 3mL 림프준비(lymphoprep) 배지를 15mL 원심분리 튜브에 첨가하고, 림프준비의 상부에 6mL의 희석된 림프구 혼합물을 천천히 적층시켰다. 상기 림프구 혼합물은 20℃에서 브레이크(brakes) 없이 800g에서 30분 동안 원심분리하였다. 림프구 연막(buffy coat)는 그 다음 200 μL 피펫으로 수집하였다. 수거된 분획을 0.9% NaCl 또는 R10의 최소한 6배 희석하고, 상기 용액의 밀도를 감소시켰다. 이어서, 수확된 분획을 20℃에서 10 분 동안 250g에서 원심 분리하였다. 상청액을 완전히 흡인하고, 10mL의 R10을 세포 펠렛에 첨가하였다. 상기 혼합물을 20℃에서 250g에서 10 분 동안 추가로 원심 분리하였다. 이어서 상청액을 흡인했다. 100IU/mL IL-2를 갖는, 2mL 37 ℃로 예열된 R10을 세포 펠렛에 첨가하고, 상기 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁시켰다. 이어서 세포의 수를 헤아리고, PBMC 샘플을 이후 실험을 위해 준비하였다.

T 세포 정제

하기와 같이 제작자가 제공하는 프로토콜에 따라, Miltenyi Pan T 세포 단리 키트 (Cat#130-096-535)를 이용하여, 인간 T 세포 PBMCs로부터 정제되었다. 세포 수는 우선 측정되었다. 세포 현탁액은 300 g에서 10 분 동안 원심분리되었다. 상청액을 완전히 흡인하고, 세포 펠렛을 총 10⁷ 개의 전체 세포당 40 μL 완충제에 재현탁되었다. 10 μL의 Pan T 세포 바이오틴-항체 칵테일이 전체 세포 10⁷ 당 추가되었고, 완전하게 혼합하고, 냉장고 (2~8℃)에서 약 5분 동안 항온처리되었다. 그 다음 30 μL의 완충제가 세포당 10⁷ 이 추가되었다. 20 μL의 Pan T 세포 마이크로비드(MicroBead) 칵테일이 10⁷세포당 추가되었다. 상기 혼합물은 잘 혼합되고, 냉장고 (2~8℃)에서 추가 10 분동안 항온 처리되었다. 자장 분리에는 최소 500μL이 필요하다. LS 컬럼을 적합한 MACS 분리기의 자기장에 두었다. 3 mL의 완충액으로 헹구어 상기 컬럼을 제조하였다. 이어서, 세포 현탁액을 컬럼 상에 적용하고, 라벨안된 세포를 함유하는 흐음-통과액(flow-through)를 수집하여 농축된 T 세포 분획을 나타낸다. 이어서, 3 mL의 완충제로 컬럼을 세척하여 T 세포를 수집하고, 통과하는 라벨안된 세포를 수집하고, 이는 농축된 T 세포를 나타내며, 이전 단계로부터의 통과-액과 결합한다. 그 다음 T 세포는 R10+100IU/mL IL-2에서 재현탁되었다. 그 다음 상기 일차 T 세포는 형질도입 전, 3일 동안 인간 T 세포 활성화/연장 키트 (Miltenyi #130-091-441)으로 사전-활성화되었다.

정제된 T 세포는 재조합 렌티바이러스 벡터 각각으로 형질감염되었거나, 또는 상기 키메라 수용체 구조체 각각을 인코딩하는 mRNA를 전기천공을 통하여 형질감염되고, 그 다음 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 본 실시예에서 기술된 7가지 구조체 각각을 발현시키는 공작된 T 세포가 준비되었다.

공작된 T 세포 상에 키메라 수용체의 발현

LIC2002-2 및 LIC2004 키메라 수용체 구조체를 인코딩하는 mRNA 분자는 전기천공에 의해 각각 T 세포로 전달되었다. 유동 세포측정 검정을 이용하여 상기 키메라 수용체의 발현이 탐지되었다. 간략하게 설명하자면, 전기천공된 T 세포가 수확되었고, DPBS로 헹궈내고, 그 다음 NKG2D 도메인 탐지를 위한 2 μL의 PE-접합된 CD314 단백질 (MILTENYI BIOTEC, 130-111-645)을 함유하는, 또는 IL-3 도메인 탐지를 위한 10 μL의 PE-접합된 항-IL-3 항체 (MILTENYI BIOTEC, 130-096-084)를 함유하는 100 μL DPBS에 재현탁되었다. 반응 혼합물을 20 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 나중에, 세포는 200 μL DPBS로 세척하였고, DPBS에 재현탁시키고, 그리고 유동 세포측정에 의해 분석되었다. 도 2에 나타낸 것과 같이, 상기 공작된 T 세포는 NKG2D 도메인 및 IL-3 도메인들을 갖는 키메라 수용체(들)을 발현시킨다.

시험관내 세포독성 검정

상기 공작된 T 세포는 수거되었고, 384-웰 반응 플레이트에 접종하였다. 표적 세포는 CD123을 재조합적으로 발현시키는 인간 만성 골수성 백혈병 (CML) 세포주 K562-Luc 및 K562-CD123-Luc이었다. 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키기 위해 모든 세포주를 사내(in-house)에서 공작하였다. 종양 세포에 대항하는 공작된 T 세포의 세포독성을 검정하기 위하여, 상기 공작된 T 세포는 20 시간 동안 표적 세포에 대한 작동체(공작된 T 세포) 비율 (“E:T 비율”)에서 당해 표적 세포와 함께 공동-항온처리되었다. ONE-GLO^TM 발광 루시페라제 분석 시약 (Promega # E6110)을 제조사의 프로토콜에 따라 제조하고, 공동-배양된 세포에 첨가하여 각 웰에 남아있는 루시퍼라제 활성을 검출 하였다. 루시페라제는 오직 표적 세포에서만 발현되었기 때문에, 웰에 남아있는 루시페라제 활성은 당해 웰에서 생존가능한 표적 세포의 수와 직접적으로 관련되었다. 최대 루시페라제 활성은 작동체 세포의 부재 하에 표적 세포에 배양 배지를 첨가함으로써 수득되었다. 최소 루시페라제 활성은 양성 대조군으로서 트리톤 X-100을 1%의 최종 농도로 첨가함으로써 결정되었다. 특이적 용해/세포독성은 다음 식에 따라 산출되었다:

특이적 용해/세포독성%=100%×[1-(LUC샘플-LUC최소)/(LUC최대-LUC최소)]. 루시퍼라제 값 ("LUC" 또는 발광)은 각각의 반응 웰에서 생존 세포의 양에 비례한다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, LIC2001-1을 발현시키는 T 세포 (76.63±4.58%), LIC2002-2를 발현시키는 T 세포(96.52±1.68%) 및 LIC2004를 발현시키는 T 세포(96.89±0.70%)는 K562-CD123-Luc에 대항하는 유의적인 사멸 효과를 증명한다. 도 3b에서 나타낸 바와 같이, K562-Luc 세포에 대하여 사멸 효과가 또한 관찰되었다: T 세포를 발현시키는 LIC2001-1 (35.98±6.08%), T 세포를 발현시키는 LIC2002-2 (94.42±2.66%), T 세포를 발현시키는 LIC2004(95.87±1.61%). 그러나, 다양한 NKG2D × IL-3 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 상기 공작된 T 세포ㄴ누 는 K562-Luc 세포 보다는 K562-CD123-Luc 세포에 대항하여 더 높은 세포 독성을 나타내었다.

LIC2002-2를 발현시키는 T 세포 및 LIC2004를 발현시키는 T 세포는 KG1-Luc에 대항하여 시험관내 세포 독성을 평가하기 위하여, 표적 세포에 대한 작동체(공작된 T 세포) 비율 10:1, 5:1 또는 2.5:1에서 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주 KG1-Luc와 함께 공동-항온처리하였다. 도 3c에 나타낸 것과 같이, LIC2002-2를발현시키는 T 세포(83.68±7%, 78.55±4%, 및 60.87±10%) 및 LIC2004를 발현시키는 T 세포(85.6±3%, 76.89±4%, 및 75.53±1%) 모두에 대하여 강력한 그리고 투여량-의존적 세포독성 효과가 관찰되었다.

다양한 작동체: 표적 비율에서 K562-CD123-Luc에 대항하여 LIC2002-2를 발현시키는 T, LIC2004를 발현시키는 T 및 LIC2004-1을 발현시키는 T의 세포독성 활성이 비교되었다. 상기 LIC2004-1 구조체는 LIC2004 듀얼 키메라 수용체 시스템에서 NKG2D 키메라 수용체이다. 이들 결과는 도 4에 나타낸다. Y-축은 특이적 사멸의 백분율을 나타내고, X-축은 작동체: 표적 비율 (가령, 공작된 T 세포 : K562-CD123-Luc 세포)의 자연 로그를 나타낸다. E:T 비율의 로그는 선형 퇴행에 의해 점선에 맞춰진 특정 사멸의 백분율에 대해 표시된다. 피팅된 선의 기울기가 작을수록 더 강력한 사멸 능력을 나타낸다. 이 결과는 LIC2004 듀얼 키메라 수용체 시스템이 상응하는 NKG2D 키메라 수용체 단독 (가령, LIC2004-1; p=0.031)보다 더 높은 효능을 갖는다는 것을 증명한다. 상기 이중특이적 키메라 수용체 구조체 LIC2002-2 및 LIC2004 사이에 유의적인 차이가 없다(p=0.277). Graphpad Prism 6을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

작용 기전

NKG2D × IL-3 키메라 수용체 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포의 기전을 연구하기 위하여 일련의 시험관내 세포 세포독성 검정이 실행되었다. 우선, “NKG2D-CD123 T 세포” (T 세포를 발현시키는 LIC2004), “NKG2D T 세포” (NKG2D-CD8힌지-CD8TM-4-1BB-CD3ζ를 발현시키는 T 세포), 및 “CD123 결합체 T 세포” (IL3-CD8힌지-CD8TM를 발현시키는 T 세포)는 E:T 비율 20:1에서 차례로 표적 K562-CD123-Luc 및 K562-Luc 세포와 함께 공동-배양되었다.

도5a에 나타낸 것과 같이, NKG2D-CD123 T 세포 (70.59±1.5%)는 유의적인 종양 사멸 효과를 보였고, 한편 NKG2D T 세포 (42.14±8.4%)의 상기 종양 사멸 효과는 훨씬 더 약하였으며, 및 CD123 결합체 T 세포는 표적 종양 세포에 대항하여 세포 독성은 없는 것으로 보였다. 도 5b에서, NKG2D-CD123 T 세포는 K562-luc 세포에 대항하여 유의적인 세포독성 (88.28±6.58%)을 또한 나타내었고, 한편 NKG2D T 세포는 더 낮은 세포독성 (66.68±2.87%)을 보였고, CD123 결합체 T 세포는 K562-Luc 세포에 대항하여 세포독성 (-46.98±11.22%)을 보이지 않았다. 이러한 결과는 NKG2D-CD123 T 세포가 NKG2D T 세포보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

더욱이, 세포독성 검정은 NKG2D의 동족 리간드인, 가용성 MICA의 존재 또는 부재하에서 실행되었다. NKG2D-CD123 T 세포 (LIC2002-2 또는 LIC2004)는 상기 표적 세포 (K562-Luc 또는 K562-CD123-Luc)와 E:T 비율 20:1에서 공동-배양되었을 때, 차례로 재조합 MICA 단백질 또는 BSA 단백질로 차단되었다. MICA 또는 BSA는 0 ng/mL, 100ng/mL 또는 1000 ng/mL의 농도에서 공동-배양물에 추가되었다. mRNA 없이 전기천공된 T 세포는 음성 대조군으로 삼았다.

도 6a-6b에서 나타낸 바와 같이, 테스트된 최고 농도에서 MICA를 이용한 치료는 NKG2D 도메인을 차단시킬 수 있었고, LIC2002-2 및 LIC2004를 발현시키는 T 세포의 세포독성 활성을 감소시킬 수 있었다. 비-특이적 BSA를 이용한 치료는 종양 세포에 대항하여 상기 공작된 T 세포의 세포독성에 유의적인 영향을 주지 않았다.

도 7에 나타낸 바와 같이, LIC2002-2를 발현시키는 T 세포 및 LIC2004를 발현시키는 표적 세포에 대한 작동체 (공작된 T 세포)의 20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1 또는 0.625:1 비율에서 K562-CD123-Luc 또는 K562-Luc 세포주와 공동-배양하였다. 이 결과는 당해 K562 세포주에서 LIC2004 및 LIC2002-2의 투여량-의존적 사멸 효과를 보여준다. NKG2D 단독으로 발현시키는 K562 세포보다는 NKG2D 및 CD123을 모두 발현시키는 K562 세포주에서 더 강력한 사멸 효과가 관찰되었다.

IFNγ방출

LIC2002-2, LIC2004 또는 LIC2004-1 구조체를 발현시키는 공작된 T 세포는 20h 동안 차례로 K562-CD123-Luc, K562-Luc, 또는 KG1-Luc 세포주와 함께 공동-배양되었다. 공동 배양 물로부터의 상청액을 수집하고 사이토킨 방출 (가령, 인터페론 감마, IFNγ방출) 수준을 결정하기 위해 평가하였다.

도 8a에서는 20 시간 동안 CD123 양성 K562-CD123-Luc와 함께 공작된 T 세포의 공동-배양 후, 세포-없는 상청액에서 IFNγ의 수준을 보여준다. 분비된 IFNγ수준은 1526.51±92.13 pg/mL (LIC2002-2), 1089.36±8.06 pg/mL (LIC2004), 687.62±31.65 pg/mL (LIC2004-1), 및 64.15±16.56 pg/mL (RNA 없는 대조군)이었다. IFNγ는 T 세포 없는 대조군에서 탐지불가능하였다.

도 8b는 20 시간 동안 K562-Luc와 함께 공작된 T 세포의 공동-배양 후, 세포-없는 상청액에서 IFNγ의 수준을 보여준다. 분비된 IFNγ수준은 3416.67±71.15 pg/mL (LIC2002-2), 3063.46±119.46 pg/mL (LIC2004), 1841.41±222.18 pg/mL (LIC2004-1), 및 3.99±11.57 pg/mL (RNA 없는 대조군)이었다. IFNγ는 T 세포 없는 대조군에서 탐지불가능하였다.

도 8c는 20 시간 동안 KG1-Luc와 함께 공작된 T 세포의 공동-배양 후, 세포-없는 상청액에서 IFNγ의 수준을 보여준다. 분비된 IFNγ수준은 267.75±34.33 pg/mL (LIC2002-2), 265.87±12.19 pg/mL (LIC2004), 236.56±16.45pg/mL (LIC2004-1), 및 220.56±80.5 pg/mL (RNA 없는 대조군)이었다. IFNγ는 T 세포 없는 대조군에서 탐지불가능하였다.

SEQUENCE LISTING <110> NANJING LEGEND BIOTECH CO.,Ltd Fan, Xiaohu Wang, Jun Wang, Pingyan Zhuang, Qiuchuan Ma, Lian <120> MULTISPECIFIC CHIMERIC RECEPTORS COMPRISING AN NKG2D DOMAIN AND METHODS OF USE THEREOF <130> 76142-20009.41 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> PCT/CN2017/119397 <151> 2017-12-28 <160> 45 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gln <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr 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tgctgccttg cctgccactg gcaaccgcag caccaacaag gcaccccatc 1980 cacatcaagg acggcgattg gaacgagttc cgccggaagc tgacctttta cctgaagaca 2040 ctggagaatg cccaggccca gcagacaacc ctgagcctgg ccatcttcac aaccacacca 2100 gcacctcgcc ccccaactcc tgccccaaca atcgcatccc agccactgtc tctgcgcccc 2160 gaggcatgca ggcctgcagc aggcggcgcc gtgcacaccc ggggcctgga ctttgcctgt 2220 gatatctaca tctgggcccc cctggccgga acttgtggcg tcctgctgct gtccctggtc 2280 atcactctgt attgc 2295 <210> 27 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 atggctctgc ccgtgactgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctcgc 60 ccaatccctc tgactgaatc atactgtggc ccatgcccca agaactggat ctgctacaag 120 aacaattgtt atcagttctt tgacgagtct aagaactggt acgagtccca ggcctcttgt 180 atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag 240 ctggtgaaga gctatcactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag 300 tgggaggacg gctccatcct gtctcctaat ctgctgacaa tcatcgagat gcagaagggc 360 gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag ggctatatcg agaactgcag caccccaaat 420 acatacatct gtatgcagag gaccgtgacc acaacccctg caccacggcc ccctacccca 480 gcacctacaa tcgcaagcca gccactgtcc ctgcgccccg aggcatgtag gcctgcagca 540 ggcggcgccg tgcacaccag aggcctggac tttgcctgcg atatctatat ctgggcacct 600 ctggcaggaa cctgtggcgt gctgctgctg agcctggtca tcaccctgta ctgcaagaga 660 ggcaggaaga agctgctgta tatcttcaag cagcctttta tgcgcccagt gcagacaacc 720 caggaggagg acggctgctc ttgtcggttc ccagaggagg aggagggcgg ctgtgagctg 780 agagtgaagt tttctaggag cgccgatgca ccagcatacc agcagggaca gaaccagctg 840 tataacgagc tgaatctggg ccggagagag gagtacgacg tgctggataa gaggagggga 900 cgggaccccg agatgggagg caagccacgg agaaagaacc cccaggaggg cctgtacaat 960 gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tattctgaga tcggcatgaa gggagagagg 1020 cgccggggca agggacacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac aaaggacacc 1080 tatgatgccc tgcacatgca ggccctgcca ccaagaggat ccggagaggg caggggctct 1140 ctgctgacat gcggcgatgt ggaggagaac ccaggcccca tgtccagact gcctgtgctg 1200 ctgctgctgc agctgctggt gaggcctggc ctgcaggcac caatgaccca gacaacccca 1260 ctgaagacaa gctgggtgaa ctgttccaat atgatcgacg agatcatcac ccacctgaag 1320 cagcctccac tgcccctgct ggatttcaac aatctgaatg gcgaggacca ggatatcctg 1380 atggagaaca atctgagaag gcctaacctg gaggccttta atagagccgt gaagagcctg 1440 cagaacgcct ctgccatcga gagcatcctg aagaatctgc tgccatgcct gccactggca 1500 accgcagcac ccacaaggca ccctatccac atcaaggacg gcgattggaa cgagttccgc 1560 cggaagctga ccttttatct gaagacactg gagaatgccc aggcccagca gacaaccctg 1620 tccctggcca tcttcacaac cacacctgca ccacgccccc caactcctgc ccctacaatc 1680 gcatcccagc cactgtctct gcgccctgag gcatgtcggc cagccgccgg aggagccgtg 1740 cacacccggg gcctggattt cgcttgtgac atctacattt gggctcctct ggctggcacc 1800 tgtggggtcc tgctgctg 1818 <210> 28 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (1)...(1) <223> can be present in repeat of at least 1 <400> 28 Gly 1 <210> 29 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> (1)...(2) <223> can be 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aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1320 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1380 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1440 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1500 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1554 <210> 39 <211> 1569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 atggctctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcccgc 60 cctgtgacaa gacagatgtg catctatacc aaccccacat cctgcaatga gatctacggc 120 aagttcagct ccgcctatct ggcctgtgac ggcaagcaga tggagatcat caccctgctg 180 aacccatctc tgatcagcgg cgatgagtgg cagtggtccg gcaatacacc catccacgtg 240 ctgggcatgt ggcactactc taaggtgctg aagctgctgg accaggatga gaagtcttat 300 gtgaagctgc tgagcgccaa ccagtccatg tgctctgccc agagcgagta ctggaataag 360 tccgaggact tctttcagta ctgcaacaat aagtattgta tctggaacaa gccatgcccc 420 ggctgttatt ctgagacact gcccatcagc ggaggaggag gatccggcgg aggaggctct 480 ggcggcggcg gctccggctc tggaggagga ggatccatcc ctctgacaga gtcttactgc 540 ggcccttgtc caaagaattg gatctgctac aagaacaact gttaccagtt ctttgatgag 600 tccaagaact ggtatgagtc ccaggcctct tgtatgagcc agaatgccag cctgctgaag 660 gtgtactcca aggaggacca ggatctgctg aagctggtga agagctatca ctggatgggc 720 ctggtgcaca tccctaccaa cggctcctgg cagtgggagg acggctccat cctgtctcca 780 aatctgctga caatcatcga gatgcagaag ggcgattgcg ccctgtacgc ctctagcttc 840 aagggctata tcgagaactg cagcacccca aatacataca tctgtatgca gcgcaccgtg 900 accacaaccc cagcacctcg gccccctacc ccagcaccaa caatcgcaag ccagcctctg 960 tccctgcgcc cagaggcatg taggccagca gcaggaggag cagtgcacac cagaggcctg 1020 gactttgcct gcgatatcta tatctgggca cctctggcag gaacctgtgg cgtgctgctg 1080 ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaag agaggcagga agaagctgct gtatatcttc 1140 aagcagccct ttatgcgccc tgtgcagaca acccaggagg aggacggctg ctcctgtagg 1200 ttcccagaag aggaggaggg aggatgtgag ctgagagtga agtttagcag gtccgccgat 1260 gcacctgcat accagcaggg acagaaccag ctgtataacg agctgaatct gggccggaga 1320 gaggagtacg acgtgctgga taagaggagg ggacgggacc ccgagatggg aggcaagcct 1380 cggagaaaga acccacagga gggcctgtac aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag 1440 gcctattctg agatcggcat gaagggagag aggcgccggg gcaagggaca cgatggcctg 1500 taccagggcc tgagcaccgc cacaaaggac acctatgatg ccctgcacat gcaggccctg 1560 ccaccaaga 1569 <210> 40 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 atggctctgc ccgtgactgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgctgctcgc 60 ccaatccctc tgactgaatc atactgtggc ccatgcccca agaactggat ctgctacaag 120 aacaattgtt atcagttctt tgacgagtct aagaactggt acgagtccca ggcctcttgt 180 atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag 240 ctggtgaaga gctatcactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag 300 tgggaggacg gctccatcct gtctcctaat ctgctgacaa tcatcgagat gcagaagggc 360 gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag ggctatatcg agaactgcag caccccaaat 420 acatacatct gtatgcagag gaccgtgact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 480 acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 540 gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 600 gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 660 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 720 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 780 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080 gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1122 <210> 41 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30 Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln 35 40 45 Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln 50 55 60 Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80 Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile 85 90 95 Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 110 Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln 130 135 140 Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 145 150 155 160 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 165 170 175 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 180 185 190 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 195 200 205 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 210 215 220 <210> 42 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30 Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln 35 40 45 Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln 50 55 60 Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80 Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile 85 90 95 Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 110 Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln 130 135 140 Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 145 150 155 160 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 165 170 175 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 180 185 190 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 195 200 205 Gly Val Leu Leu Leu 210 <210> 43 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 atgagcagac tgccagtgct gctgctgctg cagctgctgg tgaggcccgg cctgcaggca 60 cctatgaccc agacaacccc cctgaagaca agctgggtga actgttccaa tatgatcgac 120 gagatcatca cccacctgaa gcagcctcca ctgcctctgc tggatttcaa caatctgaat 180 ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagaa ggccaaacct ggaggccttt 240 aatagagccg tgaagtctct gcagaacgcc tctgccatcg agagcatcct gaagaatctg 300 ctgccttgcc tgccactggc aaccgcagca ccaacaaggc accccatcca catcaaggac 360 ggcgattgga acgagttccg ccggaagctg accttttacc tgaagacact ggagaatgcc 420 caggcccagc agacaaccct gagcctggcc atcttcacaa ccacaccagc acctcgcccc 480 ccaactcctg ccccaacaat cgcatcccag ccactgtctc tgcgccccga ggcatgcagg 540 cctgcagcag gcggcgccgt gcacacccgg ggcctggact ttgcctgtga tatctacatc 600 tgggcccccc tggccggaac ttgtggcgtc ctgctgctgt ccctggtcat cactctgtat 660 tgc 663 <210> 44 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 atgtccagac tgcctgtgct gctgctgctg cagctgctgg tgaggcctgg cctgcaggca 60 ccaatgaccc agacaacccc actgaagaca agctgggtga actgttccaa tatgatcgac 120 gagatcatca cccacctgaa gcagcctcca ctgcccctgc tggatttcaa caatctgaat 180 ggcgaggacc aggatatcct gatggagaac aatctgagaa ggcctaacct ggaggccttt 240 aatagagccg tgaagagcct gcagaacgcc tctgccatcg agagcatcct gaagaatctg 300 ctgccatgcc tgccactggc aaccgcagca cccacaaggc accctatcca catcaaggac 360 ggcgattgga acgagttccg ccggaagctg accttttatc tgaagacact ggagaatgcc 420 caggcccagc agacaaccct gtccctggcc atcttcacaa ccacacctgc accacgcccc 480 ccaactcctg cccctacaat cgcatcccag ccactgtctc tgcgccctga ggcatgtcgg 540 ccagccgccg gaggagccgt gcacacccgg ggcctggatt tcgcttgtga catctacatt 600 tgggctcctc tggctggcac ctgtggggtc ctgctgctg 639 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15

Claims

다음의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 키메라 수용체:
(a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
(b) 막경유 도메인; 그리고
(c) 세포내 신호전달 도메인.
다음의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 다중특이적 키메라 수용체:
(a) 제1 NKG2D 도메인, 제2 NKG2D 도메인, 그리고 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
(b) 막경유 도메인; 그리고
(c) 세포내 신호전달 도메인.
청구항 2에 있어서, 이때 상기 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 다음을 포함하는, 다중특이적 키메라 수용체: 제2 항원 결합 도메인, 제1 NKG2D 도메인과 제2 NKG2D 도메인.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 이때 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 통하여 제1 NKG2D 도메인에 융합된, 다중특이적 키메라 수용체.
제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 A 다중특이적 키메라 수용체, 이때 각 쇄는 다음을 포함한다:
(a) NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인과 제2 항원 결합 도메인;
(b) 막경유 도메인; 그리고
(c) 세포내 신호전달 도메인.
청구항 5에 있어서, 이때 각 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 더 포함하는, 다중특이적 키메라 수용체.
청구항 6에 있어서, 이때 상기 이량체화 모티프는 NKG2D 도메인과 제2 항원 결합 도메인 사이에 대체된, 다중특이적 키메라 수용체.
청구항 6 또는 7에 있어서, 이때 상기 이량체화 모티프는 류신 지퍼인, 다중특이적 키메라 수용체.
청구항 8에 있어서, 이때 제2 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 통하여 제1 NKG2D 도메인에 융합된, 다중특이적 키메라 수용체.
청구항 5 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 이때 제1 폴리펩티드 쇄와 제2 폴리펩티드 쇄 각각은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하는, 다중특이적 키메라 수용체: 제2 항원 결합 도메인, NKG2D 도메인, 막경유 도메인, 그리고 상기 세포내 신호전달 도메인.
다음을 포함하는, 듀얼 키메라 수용체 시스템:
(i) 다음을 포함하는 제1 키메라 수용체:
(a) 제1 NKG2D 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
(b) 제1 막경유 도메인; 그리고
(c) 제1 세포내 신호전달 도메인; 그리고
(ii) 다음을 포함하는 제2 키메라 수용체:
(a) 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 세포외 도메인; 그리고
(b) 제2 막경유 도메인.
청구항 11에 있어서, 이때 제2 키메라 수용체은 제2 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는, 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 2 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 또는 청구항 11 또는 12에 있어서, 이때 제2 항원 결합 도메인은 항체 단편인, 다중특이적 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 13에 있어서, 이때 상기 항체 단편은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, CD138, c-Met, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, 및 당지질 F77로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 2 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 또는 청구항 11 또는 12에 있어서, 이때 제2 항원 결합 도메인은 리간드 또는 리간드 결합 도메인인, 다중특이적 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 15에 있어서, 이때 상기 리간드 또는 리간드 결합 도메인은 NKG2A, NKG2C, NKG2F, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1, 및 NKp80으로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된, 다중특이적 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 16에 있어서, 이때 제2 항원 결합 도메인은 IL-3 도메인인, 다중특이적 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 1 내지 10 및 13 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 또는 청구항 11 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 이때 NKG2D 도메인 (또는 제1 NKG2D 도메인 및/또는 제2 NKG2D 도메인)은 서열 번호: 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 1 내지 10 및 13 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 또는 청구항 11 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 이때 막경유 도메인 (또는 제1 막경유 도메인 및/또는 제2 막경유 도메인)은 CD8α, CD4, CD28, 4-1BB, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택된 분자로부터 유래된, 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 1내지 10 및 13 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 또는 청구항 11 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 이때 상기 세포내 신호전달 도메인 (또는 제1 세포내 신호전달 도메인 및/또는 제2 세포내 신호전달 도메인)은 면역 작동체 세포의 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 1 내지 10 및 13 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 또는 청구항 11 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 이때 상기 세포내 신호전달 도메인 (또는 제1 세포내 신호전달 도메인 및/또는 제2 세포내 신호전달 도메인)은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
청구항 21에 있어서, 이때 상기 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 공동-자극 분자로부터 유래된, 키메라 수용체, 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템.
서열 번호: 16-20 및 33-35로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체.
서열 번호: 36 또는 37의 아미노산 서열서열에 대하여 최소한 약 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 1 내지 10 및 13 내지 23 중 어느 한 항에 따른 키메라 수용체를 인코드하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
청구항 11 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 핵산은 제1 키메라 수용체를 인코딩하는 제1 핵산 서열과 제2 키메라 수용체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 이때 제1 핵산 서열은 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 경유하여 제2 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된, 단리된 핵산.
서열 번호: 21-27 및 서열 번호: 38-40으로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열에 대하여 최소한 약 85% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
청구항 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 키메라 수용체 또는 듀얼 키메라 수용체 시스템, 또는 청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는, 공작된 면역 작동체 세포.
청구항 28에 따른 공작된 면역 작동체 세포, 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
개체의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 당해 개체에게 청구항 29에 따른 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.