ES2927366T3

ES2927366T3 - Vector de expresión de CAR y células T que expresan CAR

Info

Publication number: ES2927366T3
Application number: ES19196196T
Authority: ES
Inventors: Koji Tamada; Yukimi Sakoda; Keishi Adachi
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2035-10-06
Also published as: TW201619377A; RS63601B1; BR112017006710B1; LT3597742T; MX358472B; JP7300763B2; CY1122324T1; PH12017500596A1; CN107109421A; HUE060047T2; MX2017004393A; US20210253726A1; ES2751945T3; JP2020108398A; EP3205720B1; RU2670147C1; PT3597742T; PH12017500596B1; PL3205720T3; JPWO2016056228A1

Abstract

Un objeto de la presente invención es proporcionar células T que expresen CAR que coexpresen un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un factor potenciador de la función inmunitaria de las células T y que tengan un alto efecto inductor de inmunidad y actividad antitumoral, y proporcionar una expresión de CAR vector para la preparación de las células T que expresan CAR. Un vector de expresión CAR comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmunitaria de células T, en el que el ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmunitaria es un ácido nucleico que codifica interleucina-7 y se prepara un ácido nucleico que codifica CCL19, un ácido nucleico que codifica un mutante dominante negativo de SHP-1, o un ácido nucleico que codifica un mutante dominante negativo de SHP-2, o una célula T que expresa CAR introducida con el vector de expresión CAR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vector de expresión de CAR y células T que expresan CAR

Campo técnico

La presente invención se refiere a un vector de expresión de CAR, una célula T que expresa CAR introducido con el vector de expresión de CAR y un agente anticanceroso que comprende la célula T que expresa CAR.

Técnica anterior

Un receptor de antígeno quimérico (en lo sucesivo en la presente memoria, también denominado "CAR") es una proteína quimérica artificial en la cual un anticuerpo de cadena única que reconoce a un antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa se fusiona con una región de transducción de la señal que induce la activación de una célula T. Como se muestra en la Figura 1, la transferencia de un gen que codifica un CAR a una célula T de sangre periférica normal no reactiva en tumores (linfocitos T de sangre periférica) permite la preparación a gran escala de una célula T que expresa un CAR (en lo sucesivo en la presente memoria, también referida simplemente como "célula T-CAR") que son capaces de expresar un CAR. La célula T-CAR es reactiva en tumores y puede causar daño a una célula cancerosa sin depender de la interacción con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

La inmunoterapia contra el cáncer mediante la administración de las células T-CAR, más específicamente, la terapia que implica recoger células T de un paciente, transferir un gen que codifica un CAR a las células T y transferir las células T nuevamente al paciente (véase el documento 1 no de patente) se encuentra actualmente en ensayos clínicos en todo el mundo y que producido resultados que indican la eficacia para, por ejemplo, el tumor maligno en el órgano hematopoyético, como la leucemia o el linfoma.

En los últimos años, se han realizado investigaciones sobre diversas células T-CAR. Se ha propuesto, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende células T humanas autólogas modificadas que comprenden un ácido nucleico que codifica un CAR que consiste en una región de unión al antígeno CD19, una región transmembrana, una región de señal coestimuladora 4-1BB y una región de señal CD3Z (véase el documento de patente 1), una o más poblaciones de células T que expresan el receptor de antígeno quimérico anti-etiqueta (AT-CAR) terapéuticamente eficaces que se administran a un sujeto simultáneamente con o por separado de una formulación de una o más proteínas etiquetadas que se unen a las células cancerosas, en el que las poblaciones de las células T que expresan AT-CAR se unen a las proteínas etiquetadas e inducen la muerte de las células cancerosas (véase el documento de patente 2), las células que comprenden un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende un dominio de unión al antígeno del anticuerpo humano 139, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de transducción de señal de las células T (véase el documento de patente 3), células que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en el que el receptor de antígeno quimérico comprende un dominio de transducción de señal CD3Z que comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana, una región de transducción de señal coestimuladora y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 (véase el documento de patente 4), células T específicas de CD19 genéticamente modificadas que expresan y retienen un receptor quimérico específico de CD19 en las membranas de su superficie celular, en el que el receptor quimérico consiste en un dominio de señalización intracelular para funciones efectoras de inmunocitos, al menos un dominio transmembrana y al menos uno dominio extracelular, y el dominio extracelular comprende un receptor específico de CD19 (véase el documento de patente 5), y células que expresan el receptor de antígeno quimérico que albergan un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende, como dominio intracelular, un dominio intracelular de un receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR) (véase el documento de patente 6).

Sin embargo, ninguna de las técnicas anteriores ha resuelto el problema de la baja eficiencia de supervivencia de las células T-CAR in vivo o la activación insuficiente de las células T endógenas inducidas por las células T-CAR o la acumulación local insuficiente de las mismas en el tumor, o los problemas de señales inmunosupresoras mediadas por la vía PD-L1/PD-1, que es el mecanismo de escape inmunitario del tumor de las células cancerosas, y la inhibición de la actividad de las células T-CAR por factores inmunosupresores como TGF-p o IL-10 secretados en un microambiente canceroso. Por lo tanto, existen tipos de cáncer o casos en los que no se confirma un efecto terapéutico suficiente. Por lo tanto, se ha deseado preparar células T-CAR más eficaces y un vector de expresión para la preparación de las células T-CAR.

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de Patente 1: Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2014/0106449

Documento de Patente 2: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa no examinada (Traducción de la Solicitud PCT) No. 2014-504294

Documento de Patente 3: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa no examinada (Traducción de la Solicitud PCT) No. 2014-516510

Documento de Patente 4: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa no examinada (Traducción de la Solicitud PCT) No. 2014-507118

Documento de Patente 5: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa no examinada No. 2011-004749

Documento de Patente 6: Publicación Internacional No. WO 2013/051718

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013)

Documento no de patente 2: Y. Xu et al. Blood, vol.123, no. 24, 29 de abril 2014, páginas 3750-3579.

Resumen

Objeto para ser Resuelto

Las células T-CAR convencionales se han diseñado para mejorar la capacidad de activar a las células T al contener CD28, 4-1BB, CD3Z o similares en la región de transducción de señal de un CAR. Sin embargo, las células T-CAR convencionales no potencian suficientemente el efecto inductor de inmunidad de las células T-CAR sobre las células T endógenas o la resistencia al mecanismo inmunosupresor de un microambiente tumoral. Dichas células T-CAR aún no han logrado un efecto terapéutico en el cáncer sólido. En consecuencia, un objeto es proporcionar células T-CAR que coexpresen un CAR y un factor potenciador de la función inmune de las células T y que tengan un efecto inductor de inmunidad alto y actividad antitumoral, y proporcionar un vector de expresión de CAR para la preparación de las células T-CAR

Medios para resolver el objeto

Los inventores han intentado mejorar a las células T-CAR con el fin de lograr un mejor efecto inductor de inmunidad o de actividad antitumoral en la inmunoterapia del cáncer utilizando células T-CAR. Durante el curso de la misma, los inventores se han centrado en las citoquinas, las quimioquinas y las proteínas reguladoras de señales, que son factores que mejoran las funciones inmunes de las células T, y construyeron un vector para la coexpresión de un CAR y los factores que mejoran las funciones inmunes de las células T. Como resultado de transferir este vector de expresión a las células T, los inventores han descubierto que se pueden preparar células T-CAR que son superiores en efecto inductor de inmunidad y actividad antitumoral a las células T-CAR convencionales, y de esta forma completaron la presente invención.

Específicamente, la presente invención es como se describe a continuación.

(1) Un método para preparar una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), interleuquina-7 y CCL19, que comprende introducir un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las células T usando uno o más vectores en la célula T, en el que el ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las célula T comprende un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19.

(2) El método para preparar una célula T según (1), que comprende introducir en la célula T un vector que comprende un ácido nucleico que codifica CAR, un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19.

(3) El método para preparar una célula T según (2), en el que un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7, y el ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19, se unen mediante un ácido nucleico que codifica un péptido auto-escindible.

(4) El método para preparar una célula T según (1), que comprende introducir en la célula T un vector que comprende un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica CCL19.

(5) El método para preparar una célula T según (4), en el que un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7, y un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica CCL19, respectivamente, se unen mediante un ácido nucleico que codifica un péptido auto-escindible.

(6) El método para preparar una célula T según cualquiera de (1) a (5), en el que el CAR comprende un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variante de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1 (CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA, y EpCAM.

(7) El método para preparar una célula T según cualquiera de (1) a (6), en el que el ácido nucleico que codifica CAR comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de una región transmembrana de CD8.

(8) El método para preparar una célula T según cualquiera de (1) a (7), en el que el ácido nucleico que codifica CAR comprende ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de una región intracelular de CD28, una región intracelular de 4-1BB, y una región intracelular de CD3Z.

(9) El método para preparar una célula T según cualquiera de (2) a (8), en el que el vector es un vector de retrovirus. (10) Un agente anticanceroso que comprende una célula T que expresa CAR, interleuquina-7 y CCL19 y un aditivo farmacéuticamente aceptable, en el que el CAR comprende un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, Eg Fr , FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variante de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1 (CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA, y EpCAM.

(11) Una célula T que expresa CAR, interleuquina-7 y CCL19, en el que el CAR comprende un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variante de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA, y EpCAM.

Efecto de la invención

El uso del vector de expresión de CAR descrito en la presente memoria permite la preparación de las células T-CAR que tienen toda la viabilidad, la capacidad de acumular linfocitos y la actividad citotóxica contra las células tumorales, y las células T-CAR que tienen resistencia a la inmunosupresión en un microambiente canceroso. Se espera que la inmunoterapia para pacientes con cáncer que utiliza la célula T-CAR produzca un fuerte efecto terapéutico sobre el cáncer y que pueda servir como inmunoterapia contra el cáncer efectiva incluso para el cáncer intratable o progresivo.

Breve descripción de las figuras

[Figura 1] La Figura 1 es un diagrama que muestra la estructura de CAR y el sistema básico de inmunoterapia contra el cáncer utilizando células T-CAR.

[Figura 2] La Figura 2 es un diagrama que muestra un vector para la expresión de CAR, interleuquina-7 (IL-7) y CCL19.

[Figura 3] La Figura 3 es un diagrama que muestra los resultados-1 de confirmar el nivel de expresión de CAR en células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC por citometría de flujo. El gráfico de la izquierda representa una muestra de CAR sin teñir, y el gráfico de la derecha representa una muestra de CAR teñida.

[Figura 4] La Figura 4 es un diagrama que muestra los resultados-2 de confirmar el nivel de expresión de CAR en células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC mediante citometría de flujo.

[Figura 5] La Figura 5 es un diagrama que muestra los resultados de confirmar el nivel de expresión de CAR en células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano mediante citometría de flujo.

[Figura 6] La Figura 6 es un diagrama que muestra los resultados-1 de medir las concentraciones de IL-7 y CCL19 en el sobrenadante celular de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC mediante ELISA.

[Figura 7] La Figura 7 es un diagrama que muestra los resultados-2 de medir las concentraciones de IL-7 y CCL19 en el sobrenadante celular de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC mediante ELISA.

[Figura 8] La Figura 8 es un diagrama que muestra los resultados de medir las concentraciones de IL-7 y CCL19 en el sobrenadante celular de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano mediante ELISA.

[Figura 9] La Figura 9 es un diagrama que muestra el número de células de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC estimuladas y cultivadas durante 3 días, 5 días o 7 días.

[Figura 10] La Figura 10 es un diagrama que muestra la tasa de supervivencia de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC estimuladas y cultivadas durante 3 días, 5 días o 7 días.

[Figura 11] La Figura 11 es un diagrama que muestra el número de células de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano estimuladas y cultivadas durante 5 días.

[Figura 12] La Figura 12 es un diagrama que muestra los resultados-1 de un ensayo de migración de células T utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

[Figura 13] La Figura 13 es un diagrama que muestra los resultados-2 del ensayo de migración de células T utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

[Figura 14] La Figura 14 es un diagrama que muestra los resultados de un ensayo de migración de células dendríticas utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

[Figura 15] La Figura 15 es un diagrama que muestra los resultados de un ensayo de migración de células T utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

[Figura 16] La Figura 16 es un diagrama que muestra los resultados de examinar el potencial proliferativo de células T de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC (día 5 después de la estimulación).

[Figura 17] La Figura 17 es un diagrama que muestra los resultados de examinar el potencial proliferativo de células T, de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC (días 3 y 7 después de la estimulación).

[Figura 18] La Figura 18 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la expresión de CD127 en células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

[Figura 19] La Figura 19 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la expresión de CCR7 en células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

[Figura 20] La Figura 20 es un diagrama que muestra los resultados de examinar el cambio en el volumen tumoral cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones portadores de cáncer.

[Figura 21] La Figura 21 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la tasa de supervivencia de ratones cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones portadores de cáncer.

[Figura 22] La Figura 22 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la tasa de supervivencia de ratones cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20 y a la posterior administración de ciclofosfamida.

[Figura 23] La Figura 23 es un diagrama que muestra los resultados de examinar el volumen tumoral en un ratón cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20 y a la posterior administración de ciclofosfamida.

[Figura 24] La Figura 24 es un diagrama que muestra 1/10 de los valores numéricos en la ordenada del gráfico de CPA+7x19 en la Figura 23.

[Figura 25] La Figura 25 es un diagrama que muestra los resultados de la observación de los tejidos tumorales por tinción con H&E cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20.

[Figura 26] La Figura 26 es un diagrama que muestra los resultados del análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20.

[Figura 27] La Figura 27 es un diagrama que muestra los resultados de la cuantificación de la región positiva marcada por la tinción fluorescente ela Figura 26.

[Figura 28] La Figura 28 es un diagrama que muestra los resultados de examinar un volumen tumoral cuando se administraron células T que expresan CAR-IL-7 anti-CD20 humano, células T que expresan CAR-CCL19 anti-CD20 humano, o células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20.

[Figura 29] La Figura 29(a) es un diagrama que muestra un vector para la expresión de CAR y un mutante negativo dominante de SHP1 (fosfatasa-1 que contiene el dominio de la región 2 de homología con Src). La Figura 29(b) es un diagrama que muestra un vector para la expresión de CAR y un mutante negativo dominante de SHP2 (fosfatasa-2 que contiene el dominio de la región 2 de homología con Src).

[Figura 30] La Figura 30(a) es un diagrama que muestra los resultados de un ensayo de actividad citotóxica utilizando células T que expresan CAR-SHP1DN anti-CD20 humano. La Figura 30(b) es un diagrama que muestra un ensayo de actividad citotóxica utilizando células T que expresan CAR-SHP2DN anti-CD20 humano.

[Figura 31] La Figura 31 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la actividad citotóxica contra las células tumorales mezclando P815-hCD20 en presencia de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC y rituximab unido a FITC.

[Figura 32] La Figura 32 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la actividad citotóxica contra las células tumorales mezclando P815-hCD20 con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

[Figura 33] La Figura 33 es un diagrama que muestra los resultados del análisis de CD4, CD8, CD44 y CD62L para los fenotipos superficiales de leucocitos mediante citometría de flujo cuando se administraron células T CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20.

[Figura 34] La Figura 34 es un diagrama que muestra los resultados de examinar la proliferación de las células T mediante citometría de flujo cuando los leucocitos del bazo fueron estimulados por cultivo durante 4 días con P815-hCD20 tratadas con mitomicina C.

El vector de expresión de CAR no está particularmente limitado siempre que el vector de expresión de CAR comprenda un ácido nucleico que codifique para un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un ácido nucleico que codifique un factor potenciador de la función inmune de las células T, en el que el ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune es un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19, un ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-1, o un ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-2. El receptor de antígeno quimérico significa una proteína quimérica artificial en la que un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa se fusiona con una región de transducción de la señal que induce la activación de una célula T, a través de una región transmembrana.

El ácido nucleico que codifica CAR no está particularmente limitado siempre que el ácido nucleico codifique un polipéptido que constituye CAR. El ácido nucleico que codifica CAR comprende ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de un anticuerpo de cadena única que reconocen un antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa, una región transmembrana y una región de transducción de la señal que induce la activación de una célula T.

El anticuerpo de cadena única en CAR consiste en una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada (scFv) derivada del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de los mismos pueden incluir un oligopéptido o un polipéptido en el que se coloca un péptido conector entre la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada.

El antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa que es reconocido por el anticuerpo de cadena única puede ser una molécula biológica expresada específicamente en una célula cancerosa y una célula progenitora de la misma, una molécula biológica que se expresa nuevamente debido a la transformación maligna de una célula, o una molécula biológica cuyo nivel de expresión aumenta en una célula cancerosa en comparación con una célula normal. Los ejemplos de los mismos pueden incluir CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variantes de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, ^cS1 (CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA y EpCAM.

La región de transducción de la señal de activación de las células T es una región que es capaz de transducir señales intracelularmente cuando el anticuerpo de cadena única reconoce el antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa. La región de transducción de la señal de activación de las células T comprende preferiblemente al menos uno o más polipéptidos seleccionados de polipéptidos de CD28, 4-1BB (CD137), G ⁱT^r, C^d27, OX40, HVEM, CD3Z y regiones intracelulares de la cadena y asociadas al receptor de Fc y más preferiblemente comprende polipéptidos de tres regiones intracelulares de CD28, 4-1 BB y CD3Z.

Estos polipéptidos de las regiones intracelulares se pueden unir mediante un conector oligopeptídico o un conector polipeptídico que consiste en 2 a 10 aminoácidos. Los ejemplos de dicha secuencia conectora pueden incluir secuencias consecutivas de glicina-serina.

Los ejemplos de la región transmembrana pueden incluir polipéptidos de regiones transmembrana derivadas de CD8, cadenas a y p de receptor de células T, CD28, CD3^e, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 y GITR y pueden incluir preferiblemente un polipéptido de una región transmembrana de CD8 humano. Un CAR está anclado a las membranas celulares de una célula T por esta región transmembrana.

La región transmembrana puede comprender una región bisagra que consiste en un oligopéptido o un polipéptido arbitrario y tiene una longitud de 1 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 70 aminoácidos. Los ejemplos de la región bisagra pueden incluir una región bisagra de CD8 humano.

Una región espaciadora que consiste en un oligopéptido o un polipéptido arbitrario puede ubicarse entre el anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa y la región transmembrana o entre la región transmembrana y la región de transducción de la señal de activación de las células T. Los ejemplos de la longitud de la región espaciadora pueden incluir de 1 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 50 aminoácidos. Los ejemplos de dicha región espaciadora pueden incluir secuencias consecutivas de glicina-serina.

El ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función de las células T no está particularmente limitado siempre que el ácido nucleico sea un ácido nucleico que codifique IL-7 y un ácido nucleico que codifique CCL19 (en lo sucesivo, también denominado colectivamente como " el presente ácido nucleico 1"), un ácido nucleico que codifica un muíante negativo dominante de SHP-1 (en lo sucesivo, también denominado "el presente ácido nucleico 2"), o un ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-2 (en lo sucesivo, también denominado “el presente ácido nucleico 3"). El ácido nucleico puede comprender una pluralidad de ácidos nucleicos seleccionados de los presentes ácidos nucleicos 1 a 3 y puede comprender específicamente el presente ácido nucleico 1 y el presente ácido nucleico 2, el presente ácido nucleico 1 y el presente ácido nucleico 3, el presente nucleico ácido 2 y el presente ácido nucleico 3, el presente ácido nucleico 1 y el presente ácido nucleico 2 y el presente ácido nucleico 3.

El ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en el presente ácido nucleico 1 puede comprender un ácido nucleico que codifica IL-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19, y el ácido nucleico que codifica CCL19 puede ubicarse en 5’ o en 3’ del ácido nucleico que codifica IL-7.

El ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP1 no está particularmente limitado siempre que el ácido nucleico codifique un mutante de SHP1 que funcione de forma dominante sobre SHP1 y pueda inhibir el efecto de SHP1. Los ejemplos de los mismos pueden incluir un ácido nucleico que codifica un mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SHP1 mediante la sustitución de al menos un aminoácido por otro aminoácido y que puede inhibir el efecto de SHP1. El ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP2 no está particularmente limitado siempre que el ácido nucleico codifique un mutante de SHP2 que funcione de forma dominante sobre SHP2 y pueda inhibir el efecto de SHP2. Los ejemplos del mismo pueden incluir un ácido nucleico que codifica un mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SHP2 mediante la sustitución de al menos un aminoácido por otro aminoácido y puede inhibir el efecto de SHP2.

El vector de expresión de CAR puede comprender un ácido nucleico arbitrario entre el ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico y el ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las células T, entre una pluralidad de ácidos nucleicos seleccionados del presente ácido nucleico 1, el presente ácido nucleico 2 y el presente ácido nucleico 3, o entre el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en el presente ácido nucleico 1 siempre que se pueda expresar cada ácido nucleico. Estos ácidos nucleicos se unen preferiblemente a través de una secuencia que codifica un péptido auto-escindible (péptido 2A) o IRES (sitio interno de entrada de ribozima), preferiblemente una secuencia que codifica el péptido 2A. La unión que utiliza esta secuencia permite la expresión eficiente de cada ácido nucleico.

El péptido 2A es un péptido auto-escindible derivado de virus y se caracteriza en que G-P (posición de 1 residuo del extremo C) en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 se escinde en el retículo endoplásmico (Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5 (5): 627-638 (2005)). Por lo tanto, los ácidos nucleicos incorporados para flanquear el péptido 2A se expresan intracelularmente independientemente uno del otro.

El péptido 2A es preferiblemente un péptido 2A derivado de picornavirus, rotavirus, virus de insecto, Aphthovirus o virus de Trypanosoma, más preferiblemente un péptido 2A derivado de picornavirus (F2A) que se muestra en la SEQ ID NO: 2.

El ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico se puede preparar mediante una técnica conocida en la técnica, tal como un método de síntesis química o un método de amplificación por PCR, sobre la base de secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos del anticuerpo de cadena única contra un antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa, la región transmembrana y la región de transducción de la señal de activación de las células T. Los codones seleccionados para codificar aminoácidos pueden modificarse con el fin de optimizar la expresión del ácido nucleico en una célula huésped de interés.

La información sobre las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos del anticuerpo de cadena única contra un antígeno de la superficie celular en una célula cancerosa, la región transmembrana y la región de transducción de la señal de activación de las células T puede obtenerse apropiadamente de documentos conocidos en la técnica o por una búsqueda en la base de datos del NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) o similares.

Por ejemplo, la información sobre secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de las regiones transmembrana de CD28, 4-1BB y CD3Z en la región de transducción de la señal de activación de las células T puede obtenerse apropiadamente mediante una búsqueda en la base de datos del NCBI o similares. Los ejemplos de las mismas pueden incluir secuencias registradas bajo GenBank No: NM_006139.2 (fecha de actualización: 10 de mayo de 2014) para CD28 humano, GenBank No: NM_001561.5 (fecha de actualización: 16 de marzo de 2014) para 4-1 Bb humano y GenBank No: NM_000734.3 (fecha de actualización: 12 de agosto de 2014) para CD3Z humano.

La información sobre una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de una región transmembranal de CD8 humano puede obtenerse apropiadamente mediante una búsqueda en la base de datos del NCBI o similares. Los ejemplos de las mismas pueden incluir una secuencia registrada bajo GenBank No: NM_001768.6 (fecha de actualización: 10 de mayo de 2014).

La información sobre la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del anticuerpo de cadena única también se puede obtener preparando un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno de la superficie celular diana, determinando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal mediante un método conocido en la técnica como el método de Edman, y adquiriendo la información sobre la base de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos del método para preparar el anticuerpo monoclonal puede incluir un método de preparación utilizando hibridomas, un método de preparación que implica transformar un huésped con un vector de expresión que contiene el gen del anticuerpo mediante un enfoque de ingeniería genética, y un método de preparación que implica inmunizar a un animal transgénico con el antígeno deseado.

El ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las células T, es decir, el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, el ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-1, o el ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-2, puede prepararse mediante una técnica conocida en la técnica, tal como un método de síntesis química o un método de amplificación por PCR, sobre la base de sus respectivas secuencias de nucleótidos. Los codones seleccionados para codificar los aminoácidos pueden modificarse para optimizar la expresión del ácido nucleico en una célula huésped de interés.

La información sobre el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, el ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-1, o el ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-2 puede obtenerse apropiadamente de documentos conocidos en la técnica o por una búsqueda en la base de datos del NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) o similares.

El ácido nucleico que codifica IL-7 se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con el tipo de célula a la que se transfiere el vector de expresión de CAR. Los ejemplos de los mismos pueden incluir un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de IL-7 humana. Se puede utilizar una secuencia de nucleótidos que tiene un 80 % o más, preferiblemente un 85 % o más, más preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, lo más preferiblemente un 98 % o más de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 siempre que se mantenga el efecto potenciador de la tasa de proliferación celular de IL-7.

El ácido nucleico que codifica CCL19 se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con el tipo de célula a la que transfiere el vector de expresión de CAR. Los ejemplos de los mismos pueden incluir un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de CCL19 humano. Se puede utilizar una secuencia de nucleótidos que tiene un 80 % o más, preferiblemente un 85 % o más, más preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, lo más preferiblemente un 98 % o más de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 mientras se mantenga el efecto quimioatrayente de CCL19 en una célula T.

El ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-1 se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con el tipo de célula a la que se transfiere el vector de expresión de CAR. Los ejemplos de los mismos pueden incluir un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un mutante negativo dominante de SHP-1 humano. Se puede utilizar una secuencia de nucleótidos que tiene un 80 % o más, preferiblemente un 85 % o más, más preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, lo más preferiblemente un 98 % o más de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, siempre que el mutante negativo dominante de SHP-1 pueda inhibir el efecto de SHP-1. En la SEQ ID NO: 5, la serina en la posición 453 es un sitio mutado.

El ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-2 se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con el tipo de célula a la que se transfiere el vector de expresión de CAR. Los ejemplos de los mismos pueden incluir un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de un mutante negativo dominante de SHP-2 humano. Se puede utilizar una secuencia de nucleótidos que tiene un 80 % o más, preferiblemente un 85 % o más, más preferiblemente un 90 % o más, más preferiblemente un 95 % o más, lo más preferiblemente un 98 % o más de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 siempre que el mutante negativo dominante de SHP-2 pueda inhibir el efecto de SHP-2. En la SEQ ID NO: 6, la serina en la posición 459 es un sitio mutado.

El vector de expresión de CAR puede ser lineal o circular y puede ser un vector no viral tal como un plásmido, un vector viral o un vector basado en un transposón. Dicho vector puede contener secuencias de control tales como un promotor y un terminador, y una secuencia de marcador selectivo tal como un gen de resistencia a fármacos o un gen informador. El ácido nucleico que codifica CAR o el ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las células T se encuentra operativamente en 3’ de la secuencia promotora para que cada ácido nucleico pueda transcribirse de manera eficiente. Además, la expresión del ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico se puede confirmar fácilmente debido al gen marcador contenido en el mismo.

El vector de expresión de CAR puede contener un ácido nucleico que codifica un gen suicida. La posición del gen suicida no está particularmente limitada, y el gen suicida puede localizarse, a través de una secuencia que codifica el péptido 2A o IRES, en 3’ del promotor para la expresión del ácido nucleico que codifica IL-7, el ácido nucleico que codifica CCL19, el ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-1, o el ácido nucleico que codifica un mutante negativo dominante de SHP-2 y en 5’ o 3’ de cada uno de estos ácidos nucleicos, o puede estar ubicado en 3’ de un promotor adicional. El vector de expresión de CAR que contiene el ácido nucleico que codifica un gen suicida permite el control del número de las células T que expresan CAR in vivo mediante la administración de un fármaco que activa las funciones del gen suicida de acuerdo con el curso del tratamiento del cáncer, por ejemplo, cuando el tumor ha desaparecido.

Los ejemplos del gen suicida pueden incluir timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) y genes de caspasa 9 inducibles descritos en los documentos que se proporcionan a continuación. Los ejemplos de fármacos que activan las funciones de estos genes pueden incluir ganciclovir para el primero y un compuesto AP1903 CID (inducción química de dimerización) para el último (Cooper LJ., et al., Cytotherapy. 2006; 8 (2): 105- 17; Jensen MC et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2010 sep; 16 (9): 1245-56; Jones BS. Front Pharmacol. 2014 nov 27; 5: 254; Minagawa K., Pharmaceuticals (Basilea). 2015 mayo 8; 8 (2): 230-49; y Bole-Richard E., Front Pharmacol. 201525 ago; 6: 174).

Los ejemplos del vector viral pueden incluir vectores de retrovirus, vectores de lentivirus, vectores de adenovirus y vectores de virus adenoasociados y pueden incluir preferiblemente vectores de retrovirus, más preferiblemente un vector pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) y un vector pMSCV (fabricado por Takara Bio Inc.). Mediante el uso de un vector de retrovirus, un transgén se integra en los genomas de una célula huésped y, por 10 tanto, puede expresarse de manera estable durante un período prolongado.

La célula T que expresa CAR de la presente invención no está particularmente limitada siempre que la célula T que expresa CAR sea una célula T obtenida mediante la transferencia de (a) el vector de expresión de CAR de la presente invención o una célula T obtenida mediante la transferencia de (b) al menos dos vectores: un vector de expresión de CAR que contiene un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 (vector de expresión de CAR-IL-7) y un vector de expresión de CAR que contiene un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica CCL19 (vector de expresión de CAR-CCL19). Los ejemplos del método para transferir el vector de expresión de CAR de la presente invención o el vector de expresión de CAR-IL-7 y el vector de expresión de CAR-CCL19 a una célula T pueden incluir, pero no se limitan particularmente a, métodos de transferencia mediante métodos conocidos en la técnica, tal como un método de infección viral, un método de fosfato de calcio, lipofección, microinyección y electroporación y puede incluir preferiblemente un método de infección viral. El vector de expresión de CAR-IL-7 puede contener a el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica interleuquina-7. El vector de expresión de CAR-CCL19 puede contener el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica CCL19. Al igual que con el vector de expresión de CAR de la presente invención, estos vectores de expresión pueden contener cada uno un ácido nucleico adicional tal como un ácido nucleico que codifica el péptido 2A, IRES o un gen suicida, siempre que cada ácido nucleico pueda expresarse.

Los ejemplos del método de infección viral pueden incluir un método que implica transfectar una célula de empaquetamiento tal como la célula GP2-293 (fabricada por Takara Bio Inc.), la célula Plat-GP (fabricada por Cosmo Bio Co., Ltd.), la célula PG13 (ATCC CRL-10686), o la célula PA317 (ATCC CrL-9078) con el vector de expresión de CAR de la presente invención y un plásmido de empaquetamiento para preparar virus recombinantes e infectar una célula T con los virus recombinantes. El método de infección viral se puede realizar utilizando un kit comercialmente disponible, como el Kit de empaquetamiento de Retrovirus Eco (fabricado por Takara Bio Inc.).

La transferencia del vector de expresión de CAR a la célula T se puede confirmar examinando la expresión del CAR mediante citometría de flujo, transferencia Northern, transferencia Southern, PCR tal como RT-PCR, ELISA o transferencia Western, o examinando la expresión de un gen marcador insertado en el vector.

Los ejemplos de la célula T pueden incluir a una célula T derivada de seres humanos y una célula T derivada de un mamífero no humano (por ejemplo, perro, gato, cerdo o ratón). Alternativamente, la célula T se puede obtener mediante aislamiento y purificación de un fluido corporal tal como sangre o fluido de la médula ósea, tejidos del bazo, timo, ganglios linfáticos o similares, o inmunocitos que se infiltran en los tejidos cancerosos del tumor primario, tumor metastásico, ascitis cancerosa, o similares. Los ejemplos de dichas células T pueden incluir células apT, células ^y5T, células T CD8+, células T CD4+, células T infiltrantes en tumores, células T de memoria, células T sin estimular y células NKT.

El anticuerpo de cadena única expresado por las células T que expresan CAR de la presente invención, está posicionado extracelularmente. La célula T que expresa CAR que tiene este anticuerpo de cadena única es capaz de reconocer un antígeno asociado a tumor (TAA) expresado en la superficie de la célula cancerosa.

Las células T que expresan CAR de la presente invención pueden albergar a un vector que contiene un ácido nucleico que codifica un gen suicida además del vector de expresión de CAR.

El agente anticancerígeno de la presente invención no está particularmente limitado siempre que el agente anticancerígeno comprenda a la célula T que expresa CAR de la presente invención y un aditivo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos del aditivo pueden incluir solución salina, solución salina tamponada, medios de cultivo celular, dextrosa, agua inyectable, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, estabilizadores, solubilizantes y tensioactivos, tampones y antisépticos, agentes de tonicidad, rellenos y lubricantes.

El agente anticancerígeno de la presente invención puede administrarse a un sujeto de prueba que necesite tratamiento contra el cáncer utilizando un método conocido por los expertos en la técnica. Los ejemplos del método de administración pueden incluir inyección intravenosa, intratumoral, intracutánea, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intramedular, intracardiaca, intraarticular, intrasinovial, intracraneal, intratecal y subaracnoidal (líquido cefalorraquídeo).

La cantidad de las células T que expresan CAR de la presente invención contenida en el agente anticancerígeno que se va a administrar, puede ajustarse adecuadamente de acuerdo con el tipo, la posición y la gravedad del cáncer, la edad, el peso corporal y el estado del sujeto de prueba para recibir tratamiento, etc. Los ejemplos de la misma pueden incluir preferiblemente 1x104 a 1x1010 células, preferiblemente 1x105 a 1x109 células, más preferiblemente 5x106 a 5x108 células, en una sola dosis.

El agente anticancerígeno que se va a administrar puede administrarse independientemente 4 veces, 3 veces, dos veces o una vez al día, en un intervalo de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días, una vez a la semana, en intervalos de 7 días, 8 días o 9 días, dos veces a la semana, una vez al mes o dos veces al mes.

Los ejemplos del cáncer para el agente anticancerígeno de la presente invención o un método para tratar el cáncer mencionado más adelante pueden incluir: cánceres tales como adenocarcinoma, cáncer de células escamosas, cáncer adenoescamoso, cáncer indiferenciado, cáncer de células grandes, cáncer de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer vaginal, cáncer de cuello, cáncer uterino, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer de pulmón, cáncer de tráquea, cáncer bronquial, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de testículos y cáncer de ovario; cánceres de tejidos óseos, tejidos de cartílago, tejidos grasos, tejidos musculares, tejidos vasculares y tejidos hematopoyéticos; sarcomas como condrosarcoma, sarcoma de Ewing, hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos; blastomas tales como hepatoblastoma, meduloblastoma, nefroblastoma, neuroblastoma, pancreatoblastoma, blastoma pleuropulmonar y retinoblastoma; tumor de células embrionarias; linfoma y leucemia.

El agente anticancerígeno de la presente invención se puede utilizar en combinación con un agente anticancerígeno adicional. Los ejemplos del agente anticancerígeno adicional pueden incluir: agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, bendamustina, ifosfamida y dacarbazina; antimetabolitos tales como pentostatina, fludarabina, cladribina, metotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina y enocitabina; fármacos de direccionamiento molecular tales como rituximab, cetuximab y trastuzumab; inhibidores de quinasas tales como imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib y trametinib; inhibidores de proteasoma tales como bortezomib; inhibidores de calcineurina tales como ciclosporina y tacrolimus; antibióticos anticancerígenos tales como idarrubicina, doxorrubicina mitomicina C; alcaloides vegetales tales como irinotecán y etopósido; fármacos que contienen platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; terapias hormonales tales como tamoxifeno y bicalutamida; y fármacos inmunorreguladores tales como interferón, nivolumab y pembrolizumab, y pueden incluir preferiblemente agentes alquilantes y antimetabolitos, más preferiblemente ciclofosfamida.

El método para "utilizar el agente anticancerígeno de la presente invención en combinación con el agente anticancerígeno adicional" puede incluir un método que utiliza el agente anticancerígeno adicional en el tratamiento, seguido del uso del agente anticancerígeno de la presente invención, un método que utiliza al mismo tiempo el agente anticancerígeno de la presente invención y el agente anticancerígeno adicional, y un método que utiliza el agente anticancerígeno de la presente invención en el tratamiento, seguido del uso del agente anticancerígeno adicional y puede incluir preferiblemente un método que utiliza el agente anticancerígeno adicional en el tratamiento, seguido del uso del agente anticancerígeno de la presente invención. El uso combinado del agente anticancerígeno de la presente invención y el agente anticancerígeno adicional mejora aún más los efectos terapéuticos sobre el cáncer y también puede reducir los efectos adversos de cada agente anticancerígeno al disminuir la frecuencia de administración o la dosis del agente anticancerígeno. Además, el agente anticancerígeno adicional puede estar contenido en el agente anticancerígeno de la presente invención.

También se describe 1) un método para tratar el cáncer, que comprende administrar la célula T que expresa CAR a un paciente que necesita tratamiento contra el cáncer, 2) la célula T que expresa CAR para su uso como agente anticancerígeno, y 3) uso de una célula T que expresa CAR para la preparación de un agente anticancerígeno.

También se describe un kit para la preparación de la célula T que expresa CAR, que comprende el vector de expresión de CAR de la presente invención. El kit no está particularmente limitado siempre que el kit comprenda el vector de expresión de CAR. El kit puede comprender un manual de instrucciones para la preparación de las células T que expresan CAR, y un reactivo para su uso en la transferencia del vector de expresión de CAR a las células T.

Ejemplo 1

[Preparación de las células T que expresan IL-7 y CCL19]

(Selección del factor potenciador de la función inmune de las células T)

Al menos varios cientos de diferentes tipos de moléculas que pueden controlar las funciones de las células T están presentes in vivo. Los inventores seleccionaron primero IL-7 y CCL19 de entre un enorme número de combinaciones sobre la base de los hallazgos o experimentos anteriores, como moléculas de control para mejorar aún más el efecto antitumoral de las células T-CAR, y también seleccionaron la combinación de estas dos moléculas, es decir, la combinación de IL-7 y CCL19, no cada una sola. Los inventores prepararon un vector para la coexpresión de estos factores potenciadores de la función inmune de las células T y de CAR.

La IL-7 es una citoquina esencial para la supervivencia de las células T y es producida por células no hematopoyéticas, como las células estromales de la médula ósea, el timo y los órganos o tejidos linfáticos. Por otro lado, difícilmente se encuentra que las células T tengan la capacidad por sí mismas de producir IL-7.

La CCL19 se produce principalmente a partir de células dendríticas o macrófagos de ganglios linfáticos y tiene la función de evocar la migración de las células T, células B o células dendríticas maduras a través de su receptor CCR7.

(Preparación del vector de expresión de CAR anti-FITC para la expresión de IL-7 y CCL19)

Un fragmento de ADN de CAR anti-FITC (SEQ ID NO: 7) que codifica CAR anti-FITC que consiste en scFv anti-FITC, una región transmembrana de CD8 de ratón y motivos de señal intracelular de CD28-4-1BB-CD3Z de ratón, un fragmento de ADN de F2A-MCS (SEQ ID NO: 8) que codifica el péptido 2A (F2A) que se muestra en la SEQ ID NO: 1 y un sitio múltiple de clonación (MCS) que sigue al péptido, y un fragmento de ADN de IL-7-F2A-CCL19 (SEQ ID NO: 9) que codifica IL-7 de ratón (sin un codón de paro) y F2A y CCL19 de ratón siguiendo a la IL-7 de ratón, se sintetizaron artificialmente. En la SEQ ID NO: 7, las posiciones 1 a 819 representan una secuencia que codifica el polipéptido del scFv anti-FITC, las posiciones 829 a 1074 representan una secuencia que codifica el polipéptido de la región transmembrana de CD8 de ratón, las posiciones 1075 a 1197 representan una secuencia que codifica el polipéptido de la región intracelular de CD28 de ratón, las posiciones 1198 a 1332 representan una secuencia que codifica el polipéptido de la región intracelular de 4-1BB, y las posiciones 1333 a 1674 representan una secuencia que codifica el polipéptido de la región intracelular de CD3Z. En la SEQ ID NO: 9, las posiciones 1 a 462 representan una secuencia que codifica IL-7, las posiciones 463 a 537 representan una secuencia que codifica el F2A, y las posiciones 538 a 864 representan una secuencia que codifica la CCL19.

Con el fin de preparar un vector de CAR para la expresión de CAR, IL-7 y CCL19, el fragmento de ADN de CAR anti-FITC y el fragmento de ADN de F2A-MCS se unieron para preparar una construcción CAR-F2A-MCS anti-FITC. Posteriormente, la construcción preparada se clonó en un vector de expresión de retrovirus pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) para preparar un vector pMSGV que contiene CAR-F2A-MCS anti-FITC. El fragmento de ADN de IL-7-F2A-CCL19 se insertó en el MCS del vector pMSGV mediante tratamiento con enzimas de restricción (NsiI y SalI) y ligación para obtener un vector pMSGV que contiene CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19 anti-FITC (vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC ). El mapa del vector obtenido se muestra en la Figura 2. Además, el fragmento de ADN de CAR anti-FITC se clonó en un vector de expresión de retrovirus pMSGV para preparar un vector pMSGV que contiene CAR anti-FITC como control (vector de control de CAR anti-FITC ).

(Preparación de retrovirus que alberga el vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC)

Para la transducción de las células T de ratón, se preparó un retrovirus. Una línea celular de empaquetamiento GP2-293 (fabricada por Takara Bio Inc.) se transfectó con el vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC mencionado anteriormente o con el vector control de CAR anti-FITC y un plásmido pCL-Eco (fabricado por Imgenex Corp.) utilizando Lipofectamina 2000 o 3000 (fabricada por Life Technologies Corp.) para preparar retrovirus que albergan el vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC o el vector control de Ca R anti-FITC. Después de 48 horas de la transfección, se recuperó el sobrenadante que contenía el retrovirus.

Se utilizó DMEM suplementado con FCS al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina como medio de cultivo para las células GP2-293. Se utilizó RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 %, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 mM y L-glutamina 2 mM como medio de cultivo para las células T utilizadas en los Ejemplos mencionados más adelante.

(Transducción de las células T de ratón)

Para la transducción de las células T de ratón, se activaron 3x106 células T de ratón purificadas derivadas del bazo y de los ganglios linfáticos durante 48 horas con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado (3 pg/ml), anticuerpo monoclonal anti-CD28 (1 pg/ml) e IL-2 (100 UI/ml). Posteriormente, el sobrenadante que contenía el retrovirus así preparado que albergaba el vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC o el vector control de CAR anti-FITC se mezcló con las células T de ratón activadas (1x106 células/ml) en una placa recubierta con 25 pg/ml de RetroNectin® (fabricado por Takara Bio Inc.). Después de la centrifugación a 1.500 rpm durante 2 horas, las células se cultivaron durante 6 horas en presencia de IL-2 (100 UI/ml). Para eliminar el retrovirus del medio de cultivo, se recuperaron las células T de ratón, se transfirieron a un medio de cultivo de crecimiento fresco (RPMI) que contenía IL-2 (100 UI/ml) y se cultivaron adicionalmente durante 42 horas para obtener células T de ratón que albergaban el vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC (células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC) o células T de ratón que albergaban el vector control de CAR anti-FITC (células T que expresan CAR anti-FITC ).

(Preparación del vector de expresión de CAR anti-CD20 para la expresión de IL-7 y CCL19)

Se preparó un vector pMSGV que contenía CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19 anti-CD20 humano (vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-CD20 humano) de la misma manera que en la preparación del vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-FITC descrito anteriormente, excepto que la secuencia de la región de scFv anti-FITC contenida en la secuencia representada por la SEQ ID NO: 7 fue reemplazada por una secuencia de scFv anti-CD20 humano (SEQ ID NO: 10) sintetizada por Life Technologies Corp. sobre la base de la secuencia de rituximab. Del mismo modo, se preparó un vector pMSGV que contenía CAR anti-CD20 humano (vector de control de CAR anti-CD20 humano) de la misma manera que en la preparación del vector de control CAR anti-FITC descrito anteriormente, excepto que la secuencia de la región de scFv anti-FITC contenida en la secuencia representada por la SEQ ID NO: 7 se reemplazó con la secuencia del scFv anti-CD20 humano (SEQ ID NO: 10). El vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-CD20 humano o el vector control de CAR anti-CD20 humano se transfirió a células T de ratón de la misma manera que se mencionó anteriormente para preparar las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano o células T que expresan CAR anti-CD20 humano.

Ejemplo 2

[Ensayo de expresión de CAR mediante citometría de flujo]

(Análisis mediante citometría de flujo)

El nivel de expresión del CAR que reconoce FITC como antígeno modelo se analizó mediante citometría de flujo de dos colores. Las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC preparadas se cultivaron en presencia de dextrano unido a FITC y un anticuerpo monoclonal anti-CD8 unido a aloficocianina (APC) (53-6.7 fabricado por Affymetrix, Inc.). Se utilizó EC800 (fabricado por Sony Corp.) en la citometría de flujo, y los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (fabricado por Tree Star, Inc.).

El nivel de expresión del CAR que reconoce CD20 humano también se analizó mediante citometría de flujo de dos colores. Las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano preparadas se analizaron utilizando proteína L biotinilada y estreptavidina unida a APC.

(Resultados)

Los resultados se muestran en las Figuras 3 a 5. En la Figura 3, el gráfico de la izquierda representa los resultados sobre una muestra de CAR sin teñir (no se añadió dextrano unido a FITC) de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC, y el gráfico de la derecha representa los resultados sobre una muestra de CAR teñida (se añadió dextrano unido a FITC) de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC. En la Figura 4, "transducción (-)" representa los resultados sobre las células T no transducidas, "Cont." representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-FITC , y "7x19" representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC. En la Figura 5, "transducción (-)" representa los resultados sobre las células T no transducidas, "Cont." representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, y "7x19" representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. Los valores numéricos en estas figuras representan el porcentaje de cada población. Como se muestra en las Figuras 3 a 5, la expresión de CAR se confirmó en las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC y en las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

Ejemplo 3

[Secreción de IL-7 y CCL19]

(Medición de las concentraciones de IL-7 y CCL19 en el sobrenadante de cultivo de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC - 1)

Las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC preparadas o las células T que expresan CAR anti-FITC se estimularon con trastuzumab unido a FITC inmovilizado a 1 pg/ml y se cultivaron durante 3 días. Se recuperó el sobrenadante y se midieron las concentraciones de IL-7 y CCL19 utilizando un kit de ELISA disponible comercialmente (fabricado por R&D systems, Inc.). Los resultados se muestran en la Figura 6.

(Resultados)

Como se muestra en la Figura 6, en el sobrenadante del cultivo, se detectó IL-7 a 300 pg/ml o mayor, y CCL19 a 75 pg/ml o mayor. Por lo tanto, se confirmó que: las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC expresan IL-7 y CCL19; y las IL-7 y CCL19 expresadas se secretan al exterior de las células. IL-7 y CCL19 de las células T de control que expresan CAR anti-FITC cayeron por debajo del límite de detección (No detectadas).

(Medición de las concentraciones de IL-7 y CCL19 en el sobrenadante del cultivo de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC - 2)

Las concentraciones de IL-7 y CCL-19 después del cultivo durante 3, 5 o 7 días con o sin estimulación con trastuzumab unido a FITC inmovilizado o un anticuerpo monoclonal anti-CD3 se midieron utilizando el kit de ELISA. Los resultados se muestran en la Figura 7. En la Figura 7, la columna abierta muestra los resultados obtenidos sin estimulación, la columna gris muestra los resultados obtenidos con estimulación con trastuzumab unido a FITC, y la columna llena muestra los resultados obtenidos con estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3. "Cont." representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-FITC y "7x19" representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

(Resultados)

Como es evidente a partir de la Figura 7, se mostró que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC secretaban IL-7 y CCL-19 al exterior de las células mediante cultivo no solo durante 3 días sino también durante 5 días o 7 días.

(Medición de las concentraciones de IL-7 y CCL19 en el sobrenadante del cultivo de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano)

En cuanto a las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano preparadas o las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, las concentraciones de IL-7 y CCL-19 después del cultivo durante 3 días o 5 días con o sin simulación con mastocitoma P815 tratado con mitomicina C, mastocitoma P815 recombinado genéticamente para expresar CD20 humano (P815-hCD20), o un anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado se midieron de manera similar utilizando el kit de ELISA. Los resultados se muestran en la Figura 8. En la Figura 8, la columna abierta muestra los resultados obtenidos sin estimulación, la columna sombreada en diagonal muestra los resultados obtenidos con estimulación con P815 tratado con mitomicina C, la columna llena muestra los resultados obtenidos con estimulación con P815-hCD20, y la columna gris muestra los resultados obtenidos con estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado. "Cont." representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, y "7x19" representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

(Resultados)

Como es evidente a partir de la Figura 8, también se mostró que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano secretan IL-7 y CCL-19 al exterior de las células.

Ejemplo 4

[Número de células y tasa de supervivencia de las células T que expresan CAR]

(Número de células y tasa de supervivencia de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC)

Se realizó un estudio sobre si IL-7 o CCL19 producidas por las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC ejercerían funciones biológicas y exhibirían un efecto inductor de la inmunidad. Las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC preparadas o las células T que expresan CAR anti-FITC se estimularon con 1 pg/ml de trastuzumab unido a FITC inmovilizado y se cultivaron durante 3 días, 5 días o 7 días, y se recuperaron las células y el sobrenadante. El número de células y la tasa de supervivencia se analizaron mediante tinción con azul de tripán. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10. En las Figuras 9 y 10, la columna llena muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC, la columna abierta muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-FITC y la abscisa muestra el número de días de cultivo. La diferencia estadísticamente significativa se estudió mediante la prueba t de Student (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005, fp <0,001).

(Resultados)

Como se muestra en las Figuras 9 y 10, se potenció tanto la proliferación como la tasa de supervivencia celular de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC, lo que demuestra que IL-7 y CCL19 producidas por las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC ejercen funciones biológicas.

(Número celular de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano)

Una muestra que contiene las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano (4x105 células) se coestimuló con mitomicina C y P815-hCD20 en presencia de un control de isotipo IgG2a de rata, un anticuerpo neutralizante monoclonal anti-CD127, o un anticuerpo neutralizante monoclonal anti-CCR7. Las células se cultivaron durante 5 días y se examinó el número absoluto de células vivas utilizando azul de tripán. CD127 es un receptor de IL-7 y CCR7 es un receptor de CCL19. Los resultados se muestran en la Figura 11. En la Figura 11, "Iso.Cntrl". representa los resultados obtenidos por la estimulación con P815-hCD20 en presencia del control de isotipo IgG2a de rata, "anti-CD127" representa los resultados obtenidos por la estimulación con P815-hCD20 en presencia del anticuerpo neutralizante monoclonal anti-CD127, y "anti-CCR7" representa los resultados obtenidos por la estimulación con P815-hCD20 en presencia del anticuerpo neutralizante monoclonal anti-CCR7. En la Figura 11, la columna llena muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, y la columna abierta muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano. Cada dato se indicó por la media ± desviación estándar de 3 pocillos. *: P <0,05, f : P <0,001.

(Resultados)

Como se muestra en la Figura 11, el número de células de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano también se incrementó, y su tasa de proliferación celular se mejoró mientras que la proliferación celular fue inhibida por anti-CD127, demostrando que la mejora en la tasa de proliferación celular funciona a través del receptor de IL-7 CD127.

Ejemplo 5

[Ensayo de migración de células T]

(Ensayo de migración de células T utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC)

El efecto quimioatrayente de CCL19 se estudió mediante un ensayo de migración celular utilizando Transwell. Las propiedades de migración de las células T respondedoras se midieron mediante la migración a través de un filtro de policarbonato que tenía un tamaño de poro de 5 gm utilizando cámaras T ranswell (R) de 96 pocillos (Costar, fabricado por Corning, Inc.). Específicamente, las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC o las células T que expresan CAR anti-FITC se estimularon durante 3 días con 1 gg/ml de trastuzumab unido a FITC inmovilizado en la cámara inferior. Las células T respondedoras se prepararon a partir del bazo o de los ganglios linfáticos mediante selección negativa utilizando MACS(R) (fabricado por Miltenyi Biotec GmbH). Las células T respondedoras se marcaron con azul CytoTell (fabricado por AAT Bioquest, Inc.) y se cultivaron durante 3 horas en la capa superior. La migración desde la cámara superior a la cámara inferior se examinó mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Figura 12. En la Figura 12, la columna llena muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC, la columna abierta muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-FITC, y la ordenada muestra el número absoluto de las células T respondedoras que migraron a la cámara inferior (lo mismo es cierto para las Figuras 13 y 14 que se muestran a continuación). La diferencia estadísticamente significativa se estudió mediante la prueba t de Student (* p <0,05).

(Resultados)

Como se muestra en la Figura 12, las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC permitieron que un mayor número de las células T migraran a la cámara inferior en comparación con las células T que expresan CAR anti-FITC. En la terapia de transferencia de linfocitos (por ejemplo, células T que expresan CAR), el daño a las células cancerosas por parte de las células T administradas es importante por supuesto, y además, es importante activar a las células T endógenas (= inmunocitos del huésped) originalmente presentes en un paciente con cáncer y reclutar así estas células como células que atacan a las células cancerosas. Para este propósito, se prefiere no solo transferir linfocitos que tienen actividad antitumoral ab extra, sino también evocar la interacción activa entre las células T transferidas y las células T endógenas mediante algún enfoque para que las células T endógenas se acumulen localmente en el cáncer, desde el punto de vista de la mejora de los efectos inmunoterapéuticos. Como se observa en los resultados de la Figura 12, las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC tenían la capacidad de acumular células T intrínsecas, lo que demuestra que puede inducirse la interacción activa entre las células T transferidas y las células T endógenas.

(Ensayo de migración de las células T o células dendríticas utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC)

Una muestra que contenía las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC o las células T que expresan CAR anti-FITC (5x105 células) se estimuló con trastuzumab unido a FITC inmovilizado o un anticuerpo monoclonal anti-CD3 en la cámara inferior de Transwell. El día 3, se colocaron 4x105 células T teñidas con azul CytoTell en la cámara superior y se incubaron durante 3 horas o 5 horas. Asimismo, cada muestra se estimuló con trastuzumab unido a FITC inmovilizado. En el día 3, se colocaron 4x105 células dendríticas teñidas con azul CytoTell en la cámara superior y se incubaron durante 3 horas. Las células respondedoras de cada tipo que migraron desde la cámara superior a la cámara inferior se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en las Figuras 13 y 14. En las Figuras 13 y 14, la columna llena muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC, y la columna abierta muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-FITC . En las Figuras 13 y 14 y en la Figura 15 mencionada más adelante, cada dato se indicó mediante la media ± desviación estándar de 3 pocillos. *: P <0,05, **: P <0,01, f : P <0,001, f f : P <0,00001, J: P <5x10-5.

(Resultados)

Los resultados de las Figuras 13 y 14 demostraron que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC tienen la alta capacidad de acumular células T intrínsecas y células dendríticas.

(Ensayo de migración de células T utilizando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano)

Una muestra que contenía las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano (1 x105 células) se cocultivó con P815-hCD20 tratado con mitomicina C en la cámara inferior de Transwell. El día 3, 4x105 células T teñidas con azul CytoTell se colocaron en la cámara superior y se incubaron durante 3 horas en presencia de un control de isotipo IgG2a de rata, un anticuerpo monoclonal anti-CD127 o un anticuerpo monoclonal anti-CCR7. Las células T respondedoras que migraron desde la cámara superior a la cámara inferior se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Figura 15. En la Figura 15, "Iso.Cntrl." representa los resultados obtenidos por la estimulación con P815-hCD20 en presencia del control de isotipo IgG2a de rata, "anti-CD127" representa los resultados obtenidos por la estimulación con P815-hCD20 en presencia del anticuerpo neutralizante monoclonal anti-CD127, y "anti-CCR7" representa los resultados obtenidos por la estimulación con P815-hCD20 en presencia del anticuerpo neutralizante monoclonal anti-CCR7. En la Figura 15, la columna llena muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, y la columna abierta muestra los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano.

(Resultados)

Como se observa a partir de los resultados de la Figura 15, las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano también tenían la alta capacidad de acumular células T intrínsecas, y la acumulación de las células T intrínsecas fue inhibida por anti-CCR7, lo que demuestra que la acumulación de las células T intrínsecas funciona a través del receptor de CCL19 CCR7.

Los resultados de las Figuras 9 a 15 demostraron que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC y las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano poseen efectos importantes, indispensables para la inducción de la inmunidad, de proliferar eficazmente por IL-7, que tiene una alta tasa de supervivencia, y acumulando localmente células T o células dendríticas en el cáncer a través de CCL19, y tienen un excelente efecto inductor de la inmunidad. En resumen, se mostró que la expresión de las dos moléculas de control, es decir, "IL-7" y "CCL19", en las células T que expresan CAR, permite una mejoría en el potencial proliferativo, la tasa de supervivencia y el efecto inductor de la inmunidad de las células T.

Ejemplo 6

[Potencial proliferativo de las células T]

Una muestra que contenía las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC o las células T de control que expresan CAR anti-FITC (5x105 células) se tiñó con azul CytoTell (fabricado por AAT Bioquest, Inc.), se estimuló con trastuzumab unido a FITC inmovilizado, y luego se analizó mediante citometría de flujo. Los resultados en el día 5 después del inicio de la estimulación se muestran en la Figura 16, y los resultados en los días 3 y 7 después del inicio de la estimulación se muestran en la Figura 17. En la Figura 16, los valores numéricos en los histogramas representan el número de la división celular. En las Figuras 16 y 17, los valores numéricos en las gráficas circulares representan la relación de cada fracción clasificada (0, 1,2, 3 o 4 > el número de división celular) a una población de leucocitos.

(Resultados)

Los resultados de las Figuras 16 y 17 demostraron que el potencial proliferativo de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC aumenta en comparación con las células T que expresan CAR anti-FITC.

Ejemplo 7

[Expresión de CD127 o CCR7 en células T, células dendríticas y células T que expresan CAR]

Se analizaron las células T del bazo no estimuladas (células T sin estimular), células T del bazo estimuladas por cultivo durante 2 días con un anticuerpo monoclonal anti-CD3, un anticuerpo monoclonal anti-CD28 e IL-2 (células T activadas), células dendríticas de bazo no estimuladas (células dendríticas) y células T que expresan CAR anti-FITC (Cont.) y células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC (7x19) preparadas por activación de la misma manera que en " Transducción de las células T de ratón" del Ejemplo 1 mediante citometría de flujo y se examinaron para determinar la expresión de CD127 o de CDR7. Las células T eran una población CD3+CD19-, las células T que expresan CAR anti-FITC y las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC eran poblaciones positivas para perlas de dextrano unidas a FITC y las células dendríticas eran una población CD11c+. Los resultados de examinar la expresión de CD127 se muestran en la Figura 18, y los resultados de examinar la expresión de CCR7 se muestran en la Figura 19. En estos dibujos, los valores numéricos representan el % de células positivas, "Cont." representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-FITC y "7x19" representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

(Resultados)

Como se muestra en la Figura 18, la expresión de CD127 se redujo evidentemente en las células T activadas en comparación con las células T sin estimular, pero se mostró que era mayor en las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC que en las células T activadas y para ser restauradas cubren a las células T sin estimular. Como se muestra en la Figura 19, la expresión de CCR7 se redujo mediante la activación en las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC, pero se mostró que se mantuvo tan alta como aproximadamente el 67 % de la expresión en las células T sin estimular. Hasta ahora, se sabía que la expresión de CD127 o CCR7 se reduce hasta aproximadamente 1/2 a 1/3 por la activación de las células T. Por lo tanto, incluso si se preparan células T que expresan CAR que expresan IL-7 o CCL19, se considera que los efectos de IL-7 y CCL19 se reducen mediante la activación de las células T que expresan CAR. Por lo tanto, generalmente, no puede esperarse que la expresión de IL-7 y CCL19 en células T que expresan CAR aumente el efecto inductor de inmunidad o la actividad antitumoral de las células T que expresan CAR. También en este ensayo, se pudo confirmar que la expresión de CD127 o CCR7 se redujo temporalmente en el día 2 después de la activación de las células T del bazo. No obstante, se mostró que la expresión de CD127 o CCR7 se restableció en el día 4 en las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC.

Esto indica que la expresión de IL-7 y CCL19 en las células T que expresan CAR es útil para potenciar su efecto inductor de inmunidad o su actividad antitumoral.

Ejemplo 8

Efecto terapéutico en modelos de tumor en ratón]

(Administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones)

Se inocularon subcutáneamente 5x105 células de mastocitoma P815 genéticamente recombinadas para expresar CD20 humano (P815-hCD20) a cada ratón portador de cáncer (ratón DBA/2). Después de 3 días, se administraron por vía intravenosa 3x106 células T que expresaban CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano o células T que expresaban CAR anti-CD20 humano se administraron al ratón. Se estableció un grupo sin tratamiento como control mediante la inoculación del mastocitoma P815 a cada ratón y no realizar el tratamiento posterior (sin la administración de las células T que expresan CAR). El volumen tumoral del ratón y la tasa de supervivencia se midieron dos veces por semana. En el análisis del volumen tumoral, se calculó la desviación estándar para cada grupo experimental. La diferencia estadísticamente significativa entre los 3 grupos se estudió mediante la prueba t de Student para el análisis de volumen tumoral y la prueba de rango logarítmico para el examen de la tasa de supervivencia (* P <0,05, ** P <0,01).

Los resultados de examinar el cambio en los volúmenes tumorales de los ratones se muestran en la Figura 20, y los resultados de examinar la tasa de supervivencia de los ratones se muestran en la Figura 21. En las Figuras 20 y 21, el círculo abierto representa los resultados obtenidos por la administración de las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, el círculo lleno representa los resultados obtenidos por la administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, y el romboide abierto representa los resultados obtenidos sin la administración de las células T que expresan CAR en el grupo sin tratamiento. En la Figura 20, la abscisa muestra los días después de la administración intravenosa de las células a los ratones, y la ordenada muestra el volumen del tumor (mm3). En la Figura 21, la abscisa muestra las semanas después de la administración intravenosa de las células a los ratones, y la ordenada muestra la tasa de supervivencia (%).

(Resultados)

Como se muestra en las Figuras 20 y 21, se confirmó que la administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano exhibe el efecto de disminuir un volumen tumoral y mejorar la tasa de supervivencia (efecto de prolongación del período de supervivencia) en comparación con la administración de las células T que expresan CAR anti-CD20 humano o ninguna administración de las células T que expresan CAR. Por lo tanto, se mostró que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano tienen una excelente actividad antitumoral.

(Inoculación de un agente anticancerígeno y células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a ratones)

Se inocularon subcutáneamente 5x105 células P815-hCD20 en cada ratón. En el día 10 después de la inoculación, se les administró por vía intraperitoneal un agente anticancerígeno ciclofosfamida (CPA, 100 mg/kg), y el día 14, se les administraron por vía intravenosa 1x106 células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano o células T que expresan CAR anti-CD20 humano. Los resultados de examinar la tasa de supervivencia de los ratones se muestran en la Figura 22, y los resultados de examinar sus volúmenes tumorales se muestran en las Figuras 23 y 24. En las Figuras 22 a 24, la abscisa muestra los días después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20 (la fecha de la inoculación subcutánea de P815-hCD20 a los ratones se definió como el día 0), y la ordenada muestra la tasa de supervivencia (Figura 22) o el volumen del tumor (Eje mayor del tumor) x (Eje menor del tumor)2 /2 (mm3)) (Figuras 23 y 24). "Sin tratamiento" representa los resultados obtenidos en un grupo no tratado, "CPA" representa los resultados obtenidos en un grupo que recibió solo CPA, "CPA Cont." representa los resultados obtenidos en el grupo que recibió las células T que expresan CAR anti-CD20 humano después de la administración de CPA, "CPA 7x19" representa los resultados obtenidos en el grupo que recibió las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano después de la administración de CPA, y f representa la muerte de un ratón. La Figura 24 es un diagrama que muestra 1/10 de valores numéricos en la ordenada del gráfico de CPA+7x19 en la Figura 23.

(Resultados)

Como se muestra en la Figura 22, se mostró que el uso combinado de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano de la presente invención y el agente anticancerígeno conseguía una tasa de supervivencia muy alta. Como se muestra en las Figuras 23 y 24, se mostró que el uso combinado de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano de la presente invención y el agente anticancerígeno conseguía la desaparición completa del tumor. Como se muestra en la Figura 24, el volumen tumoral fue mayor en el día 10 después de la inoculación subcutánea de P815-hCD20. A este respecto, el eje menor era de 4,86 mm a 7,25 mm, el eje mayor era 5,92 mm a 8,39 mm y el volumen tumoral era 69,91 mm3 a 220,50 mm3 con un promedio de 140,02 mm3. Los resultados descritos anteriormente también indicaron que el tumor que proliferaba desapareció temporalmente por el tratamiento con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. En el caso de utilizar células T que expresan CAR de la presente invención en combinación con un agente anticancerígeno adicional, se prefiere, para potenciar aún más la actividad antitumoral de las células T que expresan CAR de la presente invención, disminuir primero el número celular de linfocitos mediante el uso del agente anticancerígeno adicional y posteriormente administrar las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, como en el método descrito anteriormente. Dicho método puede potenciar la homeostasis in vivo de las células T que expresan CAR.

Ejemplo 9

[Efecto de la infiltración en los tejidos tumorales]

Se inocularon subcutáneamente 5x105 células P815-hCD20 a cada ratón. En el día 3 después de la inoculación, se administraron 1x106 células T CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano a los mismos. El día 21 después de la inoculación, se cortaron los tejidos tumorales. El tejido de cada ratón se dividió en dos porciones. Una de estas dos porciones se tiñó con hematoxilina-eosina (H&E), y la otra porción se utilizó en análisis inmunohistoquímico. El análisis inmunohistoquímico se realizó utilizando la combinación de anticuerpos monoclonales anti-CD4 y anti-CD8 o la combinación de anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-DEC205 como anticuerpos primarios. Se utilizaron IgG2a anti-rata unidos a Alexa Fluor (R) 488 (verde) e IgG2b anti-rata unido a Alexa Fluor (R) 647 (rojo) como anticuerpos secundarios. Los núcleos de las células se tiñeron con DAPI (azul). Las muestras teñidas con H&E y los fragmentos inmunomarcados se observaron microscópicamente con un aumento de x100 o x200. CD4 y CD8 son marcadores para las células T, y DEC205 es un marcador para las células dendríticas. Los resultados de la tinción con H&E se muestran en la Figura 25, y los resultados del análisis inmunohistoquímico se muestran en las Figuras 26 (a) y 26 (b). Los resultados de cuantificar la región positiva marcada por cada tinción fluorescente (tinción CD4 (rojo), tinción CD8 (verde), tinción CD3 (rojo), tinción DEC205 (verde) y la coexistencia de CD3 y DEC205 (amarillo)) en el los datos de las Figuras 26 (a) y 26 (b) utilizando el programa Hybrid Cell Count (fabricado por Keyence Corp.) se muestran en las Figuras 27 (a) y 27 (b), respectivamente. En las Figuras 25 a 27, "sin tratamiento" o "sin trat.". representa los resultados obtenidos en un grupo no tratado, "Cont." representa los resultados obtenidos en el grupo tratado con las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, y 7x19 representa a el grupo tratado con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

(Resultados)

A partir de los resultados de la Figura 25, el tratamiento con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, aceleró la necrosis (regiones indicadas por las flechas), y se observaron regiones donde desaparecieron los núcleos. Los resultados de las Figuras 26 (a) y 27 (a) demostraron que las células T se infiltran en los tejidos cancerosos mediante el tratamiento con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. Los resultados de las Figuras 26 (b) y 27 (b) demostraron que las células dendríticas junto con las células T se infiltran en los tejidos cancerosos mediante el tratamiento con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

Ejemplo 10

[Efecto terapéutico provocado por la combinación de IL-7 y CCL19 sobre el tumor]

Se inocularon subcutáneamente 5x105 células P815-hCD20 a cada ratón DBA/2. En el día 3 después de la inoculación, se administraron por vía intravenosa 1x106 células T que expresan CAR anti-CD20 humano, células T que expresan CAR-IL-7 anti-CD20 humano que expresan IL-7 solo como el factor potenciador de la función inmune (que no expresan CCL19), células T que expresan CAR-CCL19 anti-CD20 humano que expresan CCL19 solo como factor potenciador de la función inmune (que no expresan IL-7), o células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano que expresan IL-7 y CCL19, a los mismos. Se estableció un grupo de ratón control sin la administración de las células T que expresan CAR que no expresaban IL-7 ni CCL19. En el día 10 después de la administración, se midieron el eje mayor y el eje menor del tumor, y el volumen tumoral (mm3) se calculó de la misma manera que anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 28. En la Figura 28, "Sin tratar" representa los resultados obtenidos sin la administración de las células T que expresan CAR, "CAR control" representa los resultados obtenidos por la administración de células T que expresan CAR anti-CD20 humano, "CAR IL-7" representan los resultados obtenidos por la administración de las células T que expresan CAR-IL-7 anti-CD20 humano, "CAR CCL19" representa los resultados obtenidos por la administración de células T que expresan CAR-CCL19 anti-CD20 humano, y "CAR IL-7/CCL19" representa los resultados obtenidos por la administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

Las células T que expresan CAR-IL-7 anti-CD20 humano se obtuvieron preparando un vector pMSGV que contenía CAR-F2A-IL-7 anti-CD20 humano (vector de expresión de CAR IL-7 anti-CD20 humano) y transfiriendo este vector a células T de ratón de la misma manera que en "Transducción de células T de ratón" del Ejemplo 1. Del mismo modo, las células T que expresan CAR-CCL19 anti-CD20 humano se obtuvieron preparando un vector pMSGV que contenía CAR-F2A-CCL19 anti-CD20 humano (vector de expresión de CAR CCL19 anti-CD20 humano) y transfiriendo este vector a las células T de ratón de la misma manera que en "Transducción de células T de ratón" del Ejemplo 1. La preparación de cada vector se realizó de acuerdo con el método de " Preparación del vector de expresión de un CAR anti-CD20 para la expresión de IL-7 y CCL19" o "Preparación del vector de expresión de CAR anti-FITC para la expresión de IL-7 y CCL19" o "Preparación del vector de expresión de CAR anti-CD20 para la expresión de IL-7 y CCL19" del Ejemplo 1. Una secuencia de posiciones 1 a 462 y un codón de parada que sigue a estas posiciones en la SEQ ID NO: 9 se utilizó como una secuencia que codifica IL-7. Se utilizó una secuencia de posiciones 538 a 864 en la SEQ ID NO: 9 como una secuencia que codifica CCL19. Los resultados se muestran en la Figura 28.

(Resultados)

Como se muestra en la Figura 28, la administración de las células T que expresan CAR-IL-7 anti-CD20 humano o las células T que expresan CAR-CCL19 anti-CD20 humano simplemente exhibieron un efecto inhibidor del crecimiento tumoral equivalente a o ligeramente menor que mediante la administración de las células T control que expresan CAR anti-CD20 humano, mientras que el tumor casi desapareció por la administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. Por lo tanto, aunque IL-7 o CCL19 solos apenas tiene un efecto inhibidor del crecimiento tumoral, se mostró que la combinación de IL-7 y CCL19 produce un efecto inhibidor muy alto del crecimiento tumoral.

Ejemplo 11

[Actividad citotóxica contra las células tumorales en el ensayo de liberación de 51Cr - 1]

(Selección del factor potenciador de la función inmune de las células T)

En el microambiente de los tejidos cancerosos, las señales inhibidoras se transducen a los inmunocitos de modo que se inhibe la respuesta inmune antitumoral para atenuar así el efecto de la inmunoterapia. Las señales inhibidoras a los inmunocitos son transducidas por SHP-1 o SHP-2. Por lo tanto, en la terapia con células T contra el cáncer, el efecto antitumoral puede potenciarse al permitir que las células T produzcan por sí mismas un mutante negativo dominante que inhiba el efecto de SHP-1 o SHP-2. En consecuencia, se preparó un vector para la coexpresión de un mutante negativo dominante que inhibe los efectos de SHP-1 o SHP-2, y un CAR, y se examinó la actividad citotóxica contra las células tumorales.

(Preparación del vector de expresión de CAR para la expresión del mutante negativo dominante de SHP1 o SHP2)

Se preparó un fragmento de ADN que codificaba un mutante negativo dominante de SHP1 de ratón (SHP1DN) que contenía una mutación de un residuo de cisteína catalítico en la posición 453 a serina (C453S) mediante mutagénesis dirigida a sitio mediada por PCR. Se sintetizó por Life Technologies Corp. y se utilizó un fragmento de ADN que codificaba un mutante negativo dominante de SHP2 de ratón (SHP2DN) que contenía una mutación de un residuo de cisteína catalítico en la posición 459 a serina (C459S). Una secuencia de nucleótidos que codifica el SHP1 DN de ratón se muestra en la SEQ ID NO: 11, y una secuencia de nucleótidos que codifica el SHP2DN de ratón se muestra en la SEQ ID NO: 12. 3 bases en las posiciones 1357 a 1359 en la SEQ ID NO: 11 y en las posiciones 1375 a 1377 en la SEQ ID NO: 12 son sitios mutados. El fragmento de ADN que codifica SHP1 d N o SHP2DN se insertó en el MCS del vector pMSGV que contenía scFv CAR-F2A-MCS anti-CD20 humano en el curso de la preparación del vector de expresión de CAR IL-7/CCL19 anti-CD20 humano en el Ejemplo 2 para obtener un vector de expresión de CAR SHP1DN anti-CD20 humano y un vector de expresión de CAR SHP2DN anti-CD20 humano, respectivamente. Los mapas de los vectores obtenidos se muestran en la Figura 29.

(Transducción de las células T de ratón)

El vector de expresión CAR SHP1 DN anti-CD20 humano o el vector de expresión CAR SHP2DN anti-CD20 humano se transfirió a células T de ratón de la misma manera que en el Ejemplo 1 para obtener células T que expresan CAR-SHP1DN anti-CD20 humano y células T que expresan CAR-SHP2DN anti-CD20 humano, respectivamente. Las células T que expresan CAR anti-CD20 humano preparadas en el Ejemplo 1 se utilizaron como control.

(Actividad citotóxica contra células tumorales en el ensayo de liberación de 51Cr)

La actividad citotóxica de las células T que expresan CAR contra el tumor se midió mediante el ensayo estándar de liberación de 51Cr de 4 horas. Se usó P815 que expresa CD20 humano (P815-hCD20) como células tumorales diana. Las células tumorales se recogieron, se cultivaron a 37 °C durante 1 hora en presencia de 100 pCi de Na251CrO4, y luego se lavaron tres veces. Posteriormente, las células tumorales se cocultivaron con las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, las células T que expresan CAR-SHP1 DN anti-CD20 humano o las células T que expresan CAR-SHP2DN anti-CD20 humano como células T efectoras. La proporción efector/diana se ajustó a 0,6, 1,25, 2,5, 5 o 10. La liberación máxima y la liberación espontánea de las células diana se midieron cultivando las células en un medio de cultivo que contenía Tritón-X al 10 % (fabricado por Sigma- Aldrich Co. LLC.) o el medio de cultivo solo. La liberación de 51Cr del sobrenadante se midió utilizando el contador de centelleo TopCount (fabricado por PerkinElmer, Inc.). El porcentaje de citotoxicidad específica se calculó de acuerdo con la ecuación: Citotoxicidad específica (%) = [(Liberación de ensayo - Liberación espontánea) / (Liberación máxima - Liberación espontánea)] x 100. Los resultados se muestran en la Figura 30. En la Figura 30 (a), el círculo abierto representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, y el círculo lleno representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-SHP1 DN anti-CD20 humano. En la Figura 30 (b), el círculo abierto representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, y el círculo lleno representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-SHP2DN anti-CD20 humano. La abscisa indica la proporción entre el efector (células T) y la diana (células tumorales) por una proporción E/T, y la ordenada muestra la citotoxicidad específica (%). La diferencia estadísticamente significativa se estudió mediante la prueba t de Student (* p <0,05).

Como se muestra en la Figura 30, las células T que expresan CAR-SHP1DN anti-CD20 humano y las células T que expresan CAR-SHP2DN anti-CD20 humano mostraron tener una actividad citotóxica significativamente mayor contra las células tumorales que la de las células T que expresan CAR anti-CD20 humano.

Ejemplo 12

[Actividad citotóxica contra células tumorales en el ensayo de liberación de 51Cr -2]

Se mezcló P815-hCD20 (1x104 células/pocillo) con las células T que expresan CAR anti-FITC (Cont., círculo) o las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC (7x19, cuadrado) en una relación efector/diana (E/T) de 0,15625, 0,3125, 0,625, 2,5, 5 o 10 en presencia de rituximab sin etiquetar (Ab, abierto) o unido a FITC (FITC-Ab, lleno). De la misma manera que anteriormente, se midió la liberación de 51Cr del sobrenadante y se calculó el porcentaje de actividad citotóxica. Los resultados se muestran en la Figura 31. En la Figura 31, el "círculo lleno" representa los resultados obtenidos mediante el mezclado con las células T que expresan CAR anti-FITC en presencia de rituximab unido a FITC, el "círculo abierto" representa los resultados obtenidos mediante el mezclado con las células T que expresan CAR anti-FITC en presencia de rituximab sin etiquetar, el "cuadrado lleno" representa los resultados obtenidos mediante el mezclado con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC en presencia de rituximab unido a FITC, y el "cuadrado abierto" representa los resultados obtenidos mediante el mezclado con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC en presencia de rituximab sin etiquetar.

Se mezcló 815-hCD20 (1 x104 células/pocillo) con las células T que expresan CAR anti-CD20 humano o las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano en una proporción efector/diana (E/T) de 0,3125, 0,625, 2,5, 5, 10 o 20. De la misma manera que anteriormente, se midió la liberación de 51Cr del sobrenadante y se calculó el porcentaje de actividad citotóxica. Los resultados se muestran en la Figura 32. En la Figura 32, el "círculo lleno" representa los resultados obtenidos mediante el mezclado con las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, y el "círculo abierto" representa el resultado obtenido mediante el mezclado con las células T que expresan CAR anti-CD20 humano.

(Resultados)

Como se muestra en las Figuras 31 y 32, se mostró que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-FITC mantienen actividad citotóxica por célula contra células tumorales al mismo nivel que la de las células T que expresan CAR anti-FITC . Del mismo modo, se mostró que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano mantienen actividad citotóxica por célula contra células tumorales al mismo nivel que la de las células T que expresan CAR anti-CD20 humano.

Ejemplo 13

[Supervivencia in vivo de las células T que expresan CAR y diferenciación en células T de memoria]

(Análisis mediante citometría de flujo)

Se inocularon subcutáneamente 5x105 células P815-hCD20 a cada ratón DBA/2. El día 10 después de la inoculación, se administró a los mismos por vía intraperitoneal un agente anticancerígeno ciclofosfamida (CPA, 100 mg/kg), y el día 14, se administraron por vía intravenosa 1x106 células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano o células T que expresan CAR anti-CD20 humano a los mismos. El día 21 después de la administración de las células T que expresan CAR, los leucocitos se aislaron del bazo o los ganglios linfáticos regionales del tumor (área subaxilar, parte superior del brazo e ingle). Los resultados del análisis de CD4, CD8, CD44 y CD62L para los fenotipos superficiales de los leucocitos mediante citometría de flujo se muestran en la Figura 33. Los leucocitos del bazo fueron estimulados por cultivo durante 4 días con P815-hCD20 tratado con mitomicina C. Los resultados del examen de la proliferación de las células T mediante citometría de flujo se muestran en la Figura 34. La expresión del CAR se confirmó utilizando proteína L biotinilada y estreptavidina unida a APC. En la Figura 33, los numerales representan las proporciones de las regiones respectivas clasificadas como células T CD4+ y las células T CD8+ (CD62+CD44-: células T sin estimular, CD62L+CD44+: células T de memoria central, CD62L-CD44+: células T de memoria efectora). En la Figura 34, los numerales representan la proporción de las células T positivas para proteínas L. En las Figuras 33 y 34, "Cont." representa los resultados sobre las células T que expresan CAR anti-CD20 humano, y "7x19" representa los resultados sobre las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.

(Resultados)

Los resultados mostrados en las Figuras 33 y 34 demostraron que las células T de memoria aumentan en los bazos y los ganglios linfáticos de los ratones que reciben las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, y las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano que sobreviven en los ratones, proliferan fuertemente por cocultivo con las células tumorales que expresan CD20 humano. Junto con los resultados de la tasa de supervivencia en las Figuras 21 y 22, estos resultados sugieren que las células T que expresan CAR de la presente

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), interleuquina-7 y CCL19, que comprende introducir un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las células T usando uno o más vectores en la célula T, en el que el ácido nucleico que codifica un factor potenciador de la función inmune de las célula T comprende un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19.

2. El método para preparar una célula T según la reivindicación 1, que comprende introducir en la célula T un vector que comprende un ácido nucleico que codifica CAR, un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19.

3. El método para preparar una célula T según la reivindicación 2, en el que un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7, y el ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19, se unen mediante un ácido nucleico que codifica un péptido auto-escindible.

4. El método para preparar una célula T según la reivindicación 1, que comprende introducir en la célula T un vector que comprende un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7 y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica CCL19.

5. El método para preparar una célula T según la reivindicación 4, en el que un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica interleuquina-7, y un ácido nucleico que codifica CAR y un ácido nucleico que codifica CCL19, respectivamente, se unen mediante un ácido nucleico que codifica un péptido auto-escindible.

6. El método para preparar una célula T según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el CAR comprende un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variante de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA, y EpCAM.

7. El método para preparar una célula T según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico que codifica CAR comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de una región transmembrana de CD8.

8. El método para preparar una célula T según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico que codifica CAR comprende ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de una región intracelular de CD28, una región intracelular de 4-1BB, y una región intracelular de CD3Z.

9. El método para preparar una célula T según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que el vector es un vector de retrovirus.

10. Un agente anticancerígeno que comprende una célula T que expresa CAR, interleuquina-7 y CCL19 y un aditivo farmacéuticamente aceptable, en el que el CAR comprende un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, Eg Fr , FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variante de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, c S1(CD319), IL-13Ra2, b Cm A, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA, y EpCAM.

11. Una célula T que expresa CAR, interleuquina-7 y CCL19, en el que el CAR comprende un anticuerpo de cadena única que reconoce un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, variante de EGFR, ROR1, c-Met, HER2, CEA, mesotelina, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123 CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, Lewis Y, cadena kappa de IgG, receptor de folato alfa, PSCA, y EpCAM.