CN114717203B - 一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途。本发明提供一种重组溶瘤病毒，其基因组中整合了两个具有较强协同效果的基因IL7与CCL19，增强了溶瘤病毒的效果，相较于改造后敏感性通常会下降的溶瘤病毒，本发明构建的双基因携带型病毒保持了对肿瘤细胞的敏感性，同时病毒复制能力没有下降。

Description

一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途。

背景技术

目前的溶瘤病毒所面临的最大问题是疗效，溶瘤病毒的抗肿瘤作用显著，但效果并不理想，而经过FDA批准上市的T-vec产品，溶瘤治疗组的总体缓解率仅为26％，如何改造溶瘤病毒或进行联用才能使得肿瘤彻底消除是大部分研究者的主要工作。CCL19由于分子性质的原因，需要反复高浓度给药，有较大副反应无法得到很好的应用，利用病毒载体携带CCL19因子进行持续局部表达，避免CCL19被快速清除。携带多个外源基因可有效弥补溶瘤病毒抗肿瘤效果有限的缺陷，但一般而言，对病毒进行改造会导致病毒杀伤及复制能力不及野生型病毒，相较于野生型病毒，改造后的病毒往往对肿瘤敏感性会明显降低，例如Mckie E A等的研究显示可降低100倍(Mckie E A,Maclean A R,Lewis A D,etal.Selective in vitro replication of herpes simplex virus type 1(HSV-1)ICP34.5 null mutants in primary human CNS tumours--evaluation of apotentially effective clinical therapy.[J].British Journal of Cancer,1996,74(5):745-752.)

因此，亟需开发一种保持对肿瘤细胞的敏感性，同时复制能力没有下降的携带外源基因的溶瘤病毒及其制备方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供一种重组溶瘤病毒，其基因组中整合了两个具有较强协同效果的基因IL7与CCL19，增强了溶瘤病毒的效果，相较于改造后敏感性通常会下降的溶瘤病毒，本发明构建的双基因携带型病毒保持了对肿瘤细胞的敏感性，同时病毒复制能力没有下降。

为此，本发明第一方面提供一种重组溶瘤病毒。根据本发明的实施例，所述重组溶瘤病毒含有：

第一核酸序列，所述第一核酸序列编码IL7或其功能类似物；和

第二核酸序列，所述第二核酸序列编码CCL19或其功能类似物。

目前临床中大部分产品只插入了单个治疗性基因，这对于溶瘤病毒的疗效并没有得到突出的提高，本发明将两个具有较强协同效果的免疫治疗基因IL7与CCL19整合到减毒溶瘤病毒基因组中，在肿瘤患者治疗中，CCL19的表达可有效地提升机体免疫细胞的浸润能力，改善肿瘤免疫微环境，此外IL7将趋化而来的免疫细胞稳定在肿瘤部位，协同增强溶瘤病毒的治疗效果。其中，CCL19可趋化体内免疫细胞，IL7是免疫细胞成熟的关键因子。IL7在T细胞的发育、存活和记忆性T细胞的生成中起着重要作用，其在淋巴细胞减少的情况下通过促进稳态增殖来恢复T细胞数量尤其关键。目前，未有装载这两个基因的溶瘤病毒的相关报道，同时，发明人创造性的发现，相较于以往改造后敏感性通常会下降的溶瘤病毒，本发明构建的双基因携带型病毒保持了对肿瘤细胞的敏感性，同时复制能力没有下降。

根据本发明实施例的重组溶瘤病毒，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，所述IL7为源自哺乳动物的IL7蛋白；所述CCL19为源自哺乳动物的CCL19蛋白。

根据本发明优选的实施例，所述IL7蛋白为hIL7蛋白，所述CCL19蛋白为hCCL19蛋白。

根据本发明的实施例，编码hIL7的核酸序列选自SEQ ID NO:1所示的核酸序列，或者与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核酸序列；

编码hCCL19的核酸序列选自SEQ ID NO:2所示的核酸序列，或者与SEQ ID NO:2所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核酸序列。

根据本发明的实施例，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列插入至所述重组溶瘤病毒的基因组中的ICP34.5基因位置。

根据本发明的实施例，所述重组溶瘤病毒为经优化改造后的重组溶瘤病毒。

根据本发明的实施例，所述改造包括敲除ICP47基因。

根据本发明的实施例，所述重组溶瘤病毒来源于减毒的溶瘤病毒。

根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒为溶瘤RNA病毒或溶瘤DNA病毒；

根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒选自溶瘤腺病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤甲病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤柯萨奇病毒和溶瘤牛痘病毒。

根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒的类型选自HSV-1、HSV-2。

根据本发明的实施例，所述HSV-1包括F毒株、HF毒株、KOS毒株、HrR3毒株和17毒株。

根据本发明的实施例，所述HSV-2包括HG52毒株。

本发明第二方面提供一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中含有第一方面所述的重组溶瘤病毒的核酸分子。

所述核酸分子是指整合了基因IL7与CCL19的所述重组溶瘤病毒的基因组。

本发明第三方面提供一种载体。根据本发明的实施例，所述载体包括IL7和CCL19基因的表达盒。

根据本发明的实施例，所述IL7基因的表达盒与CCL19基因的表达盒方向相反，且通过不同的启动子启动基因表达。

根据本发明的实施例，所述IL7为源自哺乳动物的IL7蛋白；所述CCL19为源自哺乳动物的CCL19蛋白。

根据本发明优选的实施例，所述IL7为hIL7，所述CCL19为hCCL19。

本发明第四方面提供一种制备第一方面所述的重组溶瘤病毒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

1)制备第三方面所述的载体，其中，所述IL7和CCL19基因的表达盒的整体的两翼具有溶瘤病毒基因组同源臂；

2)制备靶向所述溶瘤病毒基因组预定基因位置并实现剪切的基因靶向核酸序列；

3)将所述载体、所述靶向核酸序列以及所述溶瘤病毒基因组同时转染，进行同源重组，以便获得重组溶瘤病毒。

根据本发明的实施例，靶向所述溶瘤病毒基因组预定基因位置并实现剪切通过Crisper-Cas9基因编辑系统实现。

根据本发明的实施例，靶向所述溶瘤病毒基因组预定基因位置中的基因为ICP34.5基因。

根据本发明的实施例，所述IL7为源自哺乳动物的IL7蛋白；所述CCL19为源自哺乳动物的CCL19蛋白。

根据本发明优选的实施例，所述IL7为hIL7，所述CCL19为hCCL19。

本发明第五方面提供一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包含第一方面所述的重组溶瘤病毒或第三方面所述的载体或第四方面所述的方法制备的重组溶瘤病毒。

根据本发明的实施例，每单位剂量的所述药物组合物中包含10²-10¹¹pfu的重组溶瘤病毒。

本发明第六方面提供第一方面所述的重组溶瘤病毒或第三方面所述的载体或第四方面所述的方法制备的重组溶瘤病毒在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。根据本发明的实施例，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、食管癌和胰腺癌。

本发明第七方面提供一种将免疫细胞募集至肿瘤的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使所述肿瘤与第一方面所述的重组溶瘤病毒或第四方面所述的方法制备的重组溶瘤病毒接触。

本发明第八方面提供一种抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞死亡的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使所述肿瘤细胞与第一方面所述的重组溶瘤病毒或第四方面所述的方法制备的重组溶瘤病毒接触。

根据本发明的实施例，所述肿瘤细胞选自肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、骨肉瘤细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞、神经胶质瘤细胞、黑色素瘤细胞、结直肠癌细胞、食管癌细胞和胰腺癌细胞。

根据本发明的实施例，所述重组溶瘤病毒以足以引起所述肿瘤细胞死亡的剂量提供。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了pMD18T-HOM-hIL7-hCCL19供体质粒图谱；

图2显示了发生重组后的重组溶瘤病毒单克隆Δ47-hIL7-hCCL19鉴定结果，图中M代表DL5000marker，2-5泳道为重组溶瘤病毒单克隆Δ47-hIL7-hCCL19-1的鉴定结果，7-10泳道为重组溶瘤病毒单克隆Δ47-hIL7-hCCL19-2的鉴定结果；

图3A-3B分别显示了测序验证Δ47-hIL7-hCCL19-1和Δ47-hIL7-hCCL19-2的双基因表达盒序列是否含有突变的结果；

图4显示了hCCL19在Vero细胞中的表达结果；

图5显示了hIL7在Vero细胞中的表达结果；

图6A-6C显示了抑制率拟合IC50的曲线图；

图7显示了实验组(Δ47-hIL7-hCCL19)和对照组(Δ47)的滴度测定结果。

具体实施方式

根据本发明的实施例，本发明提供一种重组溶瘤病毒，其含有第一核酸序列，所述第一核酸序列编码IL7或其功能类似物；和

第二核酸序列，所述第二核酸序列编码CCL19或其功能类似物。

功能类似物是指保持IL7或CCL19本身功能活性的类似物，其氨基酸序列可与IL7和CCL19的氨基酸序列稍有不同(例如与IL7或CCL19氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性)，但活性类似。

根据本发明的实施例，所述IL7为源自哺乳动物的IL7蛋白；所述CCL19为源自哺乳动物的CCL19蛋白。

哺乳动物例如人、猴、兔、犬、牛等。

根据本发明优选的实施例，所述IL7和CCL19源自人，即分别为hIL7和hCCL19。

编码hIL7的核酸序列选自SEQ ID NO:1所示的核酸序列，或者与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核酸序列。

SEQ ID NO:1序列具体为：

ATGTTCCACGTGTCCTTTCGGTACATCTTCGGCCTGCCCCCTCTGATCCTGGTGCTGCTGCCAGTGGCCAGCTCCGACTGCGATATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTATGAGTCTGTGCTGATGGTGAGCATCGACCAGCTGCTGGATTCCATGAAGGAGATCGGCTCTAACTGCCTGAACAATGAGTTTAATTTCTTTAAGAGGCACATCTGTGATGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTTAGGGCCGCCAGAAAGCTGCGGCAGTTTCTGAAGATGAATTCTACCGGCGACTTCGATCTGCACCTGCTGAAGGTGAGCGAGGGCACCACAATCCTGCTGAACTGTACCGGCCAGGTGAAGGGAAGGAAGCCAGCCGCCCTGGGAGAGGCCCAGCCCACAAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAATGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGTTGGAATAAGATCCTGATGGGCACAAAGGAGCACTGA。

编码hCCL19的核酸序列选自SEQ ID NO:2所示的核酸序列，或者与SEQ ID NO:2所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核酸序列。SEQ ID NO:2序列具体为：

ATGGCACTGCTGCTGGCCCTGTCCCTGCTGGTGCTGTGGACCTCTCCAGCACCCACCCTGAGCGGAACAAACGACGCAGAGGATTGCTGTCTGTCTGTGACACAGAAGCCTATCCCAGGCTACATCGTGAGGAATTTCCACTATCTGCTGATCAAGGACGGATGCAGGGTGCCAGCAGTGGTGTTTACCACACTGAGGGGCCGCCAGCTGTGCGCACCACCTGATCAGCCTTGGGTGGAGCGGATCATCCAGCGGCTGCAGAGAACCAGCGCCAAGATGAAGCGGAGAAGCTCCTGA。

hIL7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：

MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQP TKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH。

hCCL19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：

MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS。

根据本发明的实施例，所述hIL7和hCCL19插入至所述重组溶瘤病毒的基因组中的ICP34.5基因的编码区。

CCL19能够趋化幼稚T细胞和成熟DC细胞，IL-7是T细胞发育所必需的细胞因子，能够维持T细胞数量的稳定。

ICP34.5是HSV-1和HSV-2中(ICP34.5基因在HSV-1和HSV-2中序列同源性较高，序列比较保守，其在HSV-1和HSV-2中功能类似)的神经毒性因子，敲除后可提高病毒的安全性，同时，缺失了ICP34.5的病毒能选择性地杀伤肿瘤细胞。

将两个具有较强协同效果的免疫治疗基因IL7与CCL19整合到减毒溶瘤病毒基因组中，能够增强溶瘤病毒的治疗效果。并且本发明构建的双基因携带型病毒保持了对肿瘤细胞的敏感性，同时复制能力没有下降。

在本发明的一些具体的实施例中，所述重组溶瘤病毒为经优化改造后的重组溶瘤病毒。

“优化改造”即对溶瘤病毒进行进一步的改造，例如敲除某些阻碍或抑制引发免疫反应的因子，或者敲除影响病毒安全性的基因。优化改造可以发生在本发明中的IL7和CCL19重组至病毒基因组之前，也可以发生在重组之后。

例如，所述改造可以是敲除溶瘤病毒基因组中的ICP47基因。ICP47基因在HSV感染的细胞中，能够阻止细胞抗原递呈，敲除溶瘤病毒中该基因可以提高被病毒感染的肿瘤细胞表面MHC I的表达，提高抗原递呈的能力，从而有助于溶瘤病毒杀死肿瘤细胞。

根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒为溶瘤RNA病毒或溶瘤DNA病毒。所述溶瘤病毒选自溶瘤腺病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤甲病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤柯萨奇病毒和溶瘤牛痘病毒。

在本发明的一些具体的实施例中，所述溶瘤病毒的类型选自HSV-1、HSV-2，包括任何实验室菌株或临床分离物；所述HSV-1可以是任何现有的HSV-1毒株，例如F毒株、HF毒株、KOS毒株、17毒株、HrR3毒株；

所述HSV-2可以是任何现有的HSV-2毒株，例如可以是HG52毒株。

在本发明的一些实施例中，提供一种制备重组溶瘤病毒的方法，所述方法包括：

1)制备包括IL7和CCL19基因的表达盒，所述IL7和CCL19基因的表达盒的整体的两翼具有溶瘤病毒基因组同源臂；

2)制备靶向所述溶瘤病毒基因组预定基因位置并实现剪切的基因靶向核酸序列；

3)将所述载体、所述靶向核酸序列以及所述溶瘤病毒基因组同时转染，进行同源重组，以便获得重组溶瘤病毒。

在本发明的一些具体的实施例中，所述IL7为hIL7，所述CCL19为hCCL19。

在hIL7和hCCL19基因的表达盒中，编码框与启动子可操作地连接，所述启动子包括选自CMV、CAG、EF1α、劳斯肉瘤氏病毒长末端重复序列(RSV LTR)、金属硫蛋白I(MTI)的至少之一。

在本发明的一些具体的实施例中，将hIL7和hCCL19基因分别克隆到带有RSV和CMV启动子的载体上，再通过PCR技术扩增两个表达盒，利用同源重组技术先后连接到两端带有病毒基因组同源臂的T载体上，两个表达盒的转录方向相反，经过验证测序得到供体质粒；将设计好的CRISP/Cas9引物sgRNA序列连接至cas9蛋白表达质粒构建打靶质粒，利用脂质体试剂盒转染病毒基因组和两个质粒进入293FT细胞中，利用CRISPR/Cas9原理进行病毒改造。经过筛选验证，对改造后的双基因重组病毒进行蛋白表达鉴定，肿瘤细胞杀伤复制评价。

构建体的部分序列如SEQ ID NO:5所示(SEQ ID NO:5所示序列包括如附图1所示的hIL7、hCCL19基因的表达盒以及两个表达盒两翼的HOM1+HOM2序列)，具体为：

AGCCCGGGCCCCCCGCGGGCTGAGACTAGCGAGTTAGACAGGCAAGCACTACTCGCCTCTGCACGCACATGCTTGCCTGTCAAACTCTACCACCCCGGCACGCTCTCTGTCTCCATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTGGTCAGGAGCGCGCCCgcggccgcGACCCTTAATTAATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACACTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACAGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATAATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCATTGCGTTGCGCTCACTGTCTAGAATGTTCCACGTGTCCTTTCGGTACATCTTCGGCCTGCCCCCTCTGATCCTGGTGCTGCTGCCAGTGGCCAGCTCCGACTGCGATATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTATGAGTCTGTGCTGATGGTGAGCATCGACCAGCTGCTGGATTCCATGAAGGAGATCGGCTCTAACTGCCTGAACAATGAGTTTAATTTCTTTAAGAGGCACATCTGTGATGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTTAGGGCCGCCAGAAAGCTGCGGCAGTTTCTGAAGATGAATTCTACCGGCGACTTCGATCTGCACCTGCTGAAGGTGAGCGAGGGCACCACAATCCTGCTGAACTGTACCGGCCAGGTGAAGGGAAGGAAGCCAGCCGCCCTGGGAGAGGCCCAGCCCACAAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAATGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGTTGGAATAAGATCCTGATGGGCACAAAGGAGCACTGAGTCGACGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATTAATTAAGGGGATATCccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggctgatcagcgggtttaaacgggccctctagactcgagcggccgccactgtgctggatatctgTCAGGAGCTTCTCCGCTTCATCTTGGCGCTGGTTCTCTGCAGCCGCTGGATGATCCGCTCCACCCAAGGCTGATCAGGTGGTGCGCACAGCTGGCGGCCCCTCAGTGTGGTAAACACCACTGCTGGCACCCTGCATCCGTCCTTGATCAGCAGATAGTGGAAATTCCTCACGATGTAGCCTGGGATAGGCTTCTGTGTCACAGACAGACAGCAATCCTCTGCGTCGTTTGTTCCGCTCAGGGTGGGTGCTGGAGAGGTCCACAGCACCAGCAGGGACAGGGCCAGCAGCAGTGCCATccacactggactagtggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagccagcttgggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgataagccagtaagcagtgggttctctagttagccagagagctctgcttatatagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagttgttacgacattttggaaagtcccgttgattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtggagacttggaaatccccgtgagtcaaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcaccatggtaatagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccgtcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccgtaaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattgacgtcaatgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaactccatatatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaataactagtcaataatcaatgtcaacgcgtatatctggcGTTCCCTTTAGTGAGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCGAGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCACTTCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTCCCGGTATGGTAATTAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCGGCAATTCCCGCGGCCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCGTAACCACTCCCCTGGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGCCCCTCGCGCATTGGCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGTTTCCGGGTATGGTAATGAGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCCAAGCCCCTGTTGCGTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGGGTTGGTCCCCCAAATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGCCGGGTTGGTCCCCGGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCGCGGCCATTGGGGGAATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGTGTGGGGTATAAGTTAGCCCTGGCCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGACGCAGCAGCCAGGCAGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCTACGTTGCGACCCCCAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCATGGAGCCCCGCCCCGGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTGAGGGGCCGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGACCCCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCACTCATACACGGGAGCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCCGTGACACTATATATACAGGGGCCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGACCCTATATATACAGGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGA。

本发明以下实施例中所用的HSV-1溶瘤病毒为KOS毒株，“Δ47病毒基因组”是指敲除了ICP47基因的HSV-1溶瘤病毒基因组。

“Δ47”是指敲除了ICP47基因的对照组HSV-1溶瘤病毒，“Δ47-hIL7-hCCL19”是指敲除了ICP47基因的双基因(hIL7和hCCL19基因)重组病毒(其中ICP34.5基因位置插入了hIL7和hCCL19双基因)，“Δ47-hIL7-hCCL19-1”、“Δ47-hIL7-hCCL19-2”分别表示敲除了ICP47基因的双基因重组病毒的两个克隆。

“CRISPR-Cas9-sgRNA-34.5”是指利用Crisper-Cas9基因编辑系统剪切溶瘤病毒基因组ICP34.5基因的质粒构建体。

“pMD18-T-HOM-hIL7-hCCL19”是指连接有hIL7和hCCL19基因的供体质粒，其通过基因重组将hIL7和hCCL19插入至HSV-1溶瘤病毒基因组中的ICP34.5基因位置。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1构建重组病毒

将编码hIL7和hCCL19基因序列插入至含ICP34.5基因左右两侧同源臂序列之间，获得pMD18T-HOM-hIL7-hCCL19供体质粒，如附图1，通过Crisper-Cas9系统将HSV-1/ICP47-敲除病毒株的ICP34.5基因替换为治疗性基因hIL7(人类IL7)和hCCL19(人类CCL19)，构建重组病毒，并筛选构建成功的病毒。以ICP34.5基因起始密码子的第一位核苷酸为第1位进行顺序编码，基因插入位置为起始密码子第134位核苷酸和终止密码子下游第160位核苷酸之间，对应于野生型HSV-1基因组(GeneBank：JQ780693.1)的nt522-nt1271以及nt124324-nt125073之间。

利用Crisper-Cas9基因编辑系统剪切溶瘤病毒基因组ICP34.5基因的Target DNA(靶向DNA)制备过程：

用BbsI酶将Cas9-sgRNA-puro载体(上海生工)线性化，胶回收载体片段；设计合成的sgRNA引物(sgRNA-F靶点序列：5’-tcggtctaacgttacacccgAGG-3’，如SEQ ID NO:6所示；sgRNA-R靶点序列：5’-gagccgcgcatatatacgctTGG-3’，如SEQ ID NO:7所示)通过引物退火互补反应得到sgRNA片段，利用T4 DNA连接酶将具有相同粘性末端的载体片段与sgRNA片段连接得到打靶质粒。

1、293FT细胞铺12孔板

取293FT细胞悬浮液接种于十二孔板，每孔1ml，接种密度分别为5*10^4和10^5，放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，期间需要观察细胞生长密度，待细胞融合度达70％～90％，进行转染。

2、使用

3000转染试剂进行转染

(1)使用

培养基稀释/>

试剂，然后充分混匀：

(2)使用

培养基稀释质粒，制备质粒预混液，然后添加P3000^TM试剂，然后充分混匀：

(3)在每管已稀释的

3000试剂中加入稀释的DNA(体积比1:1)，充分混匀后室温孵育15min。

(4)加入120μL DNA-脂质体复合物至293FT细胞中，37℃、5％CO2培养箱中孵育，4h后换一次液，放回培养箱继续培养。

(5)转染72h，将细胞和病毒一起收集。冻融三次。保存于-20℃。

实施例2 PCR验证

根据病毒滴度将病毒(实施例1中获得的重组病毒)感染铺满六孔板的VERO细胞，观察病毒斑大小，加入含有0.01％中性红的DMEM培养基染色，挑取每孔中只有单克隆的病毒斑，扩繁后提取基因组进行PCR验证。

(1)实验材料：

多轮筛选后的病毒单克隆Δ47-hIL7-hCCL19-1和Δ47-hIL7-hCCL19-2。

(2)PCR验证：引物为HOM1-F/34.5-flank-seq，PCR产物大小3975bp，

HOM1-F：5’-CGCACAGTCCCAGGTAACCTC-3’，如SEQ ID NO:8所示；

34.5-flank-seq：5’-GGCGTGTCTCTGTGTATGAGTCAGGGGGTCC-3’，如SEQ ID NO:9所示。

PCR体系

PCR程序：98℃，3min；(98℃，10s；55℃，15s；68℃，3min)x 35个循环；72℃，5min；12℃，forever。

(3)测序结果与分析：PCR产物进行凝胶电泳检测，如图2所示，产物回收后进行测序，如图3A、3B所示，测序验证Δ47-hIL7-hCCL19-1和Δ47-hIL7-hCCL19-2的双基因表达盒序列完整无突变。

实施例3蛋白ELISA鉴定

(1)实验材料：

实验组Δ47-hIL7-hCCL19指代Δ47-hIL7-hCCL19-1重组溶瘤病毒，阴性对照为Δ47溶瘤病毒。

(2)ELISA验证：以Vero(非洲绿猴肾细胞)为宿主细胞，条件如下：Δ47-hIL7-hCCL19、Δ47感染MOI(病毒与细胞数量的比值)为0.01，分别在感染Vero细胞后，24、48、72小时收取培养病毒培养上清。

(3)hCCL19表达结果：

hCCL19在Vero细胞中的表达结果如表1所示。

表1：

hCCL19在Vero细胞中的表达结果如图4所示，显示了三个时间点(24h、48h、72h)hCCL19蛋白的表达量，图中显示了随着感染时间增加，hCCL19的表达量先增加后减少，在48h左右表达量达到最大，随后细胞死亡蛋白降解导致含量逐渐下降。

(4)IL7表达结果：

IL7在Vero细胞中的表达结果如表2所示。

表2：

IL7在Vero细胞中的表达结果如图5所示。图中结果表明随感染时间增加，hIL7蛋白的表达量逐渐增加，72h时增加量减少，进入平台期，表达量可达到1.43ng/mL。

实施例4Δ47-hIL7-hCCL19病毒细胞毒性及增殖能力实验

对双基因病毒进行评价，发现病毒经过改造后，保留了对肿瘤细胞良好的感染杀伤活性，同时复制能力不会发生显著变化。

(1)实验材料：Δ47-hIL7-hCCL19、Δ47，细胞为Fadu(人咽鳞癌细胞)；143B(骨肉瘤细胞)；NCI-H460(非小细胞肺癌细胞)。

(2)细胞杀伤验证：以合适的细胞密度接种于96孔培养板，培养过夜后，分别加入7个梯度浓度(MOI＝10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01)的两种病毒，再分别培养24、48小时，依照CCK8试剂盒说明书进行细胞活力的检测。

细胞杀伤结果：

Δ47-hIL7-hCCL19、Δ47对不同肿瘤细胞的毒性如表3所示。

表3：

备注：N/A表示因量效关系差或未测，未能做出的非线性拟合，其中拟合度＜80％表示拟合度较差，其对应的MOI IC₅₀值仅作参考

图6A-6C为使用Graphpad抑制率拟合的IC50曲线图，表明双基因携带型病毒Δ47-hIL7-hCCL19在多种肿瘤细胞中保持了对肿瘤细胞的敏感性。

(3)病毒增殖能力验证：以合适的细胞密度接种于六孔板中，培养过夜后，分别以MOI＝0.1加入两种病毒进行感染，37℃，5％CO₂培养1.25h，期间每隔15min轻摇平板，吸去病毒液加入培养基再分别培养24h，48h，收取培养液和细胞，冻融三次后测定培养液病毒的滴度，进行增值能力的比较。

(4)复制增殖能力评价结果：

样品的滴度测定情况如表4所示，图7为相对应的复制能力对比图。

表4：

图7以及表4结果表明，Δ47-hIL7-hCCL19重组病毒在肿瘤细胞上有较好的杀伤复制能力，与骨架病毒对比无显著差异。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 广东东阳光药业有限公司

<120> 一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途

<130> BI3212138

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgttccacg tgtcctttcg gtacatcttc ggcctgcccc ctctgatcct ggtgctgctg 60

ccagtggcca gctccgactg cgatatcgag ggcaaggacg gcaagcagta tgagtctgtg 120

ctgatggtga gcatcgacca gctgctggat tccatgaagg agatcggctc taactgcctg 180

aacaatgagt ttaatttctt taagaggcac atctgtgatg ccaacaagga gggcatgttc 240

ctgtttaggg ccgccagaaa gctgcggcag tttctgaaga tgaattctac cggcgacttc 300

gatctgcacc tgctgaaggt gagcgagggc accacaatcc tgctgaactg taccggccag 360

gtgaagggaa ggaagccagc cgccctggga gaggcccagc ccacaaagag cctggaggag 420

aacaagtccc tgaaggagca gaagaagctg aatgacctgt gcttcctgaa gaggctgctg 480

caggagatca agacctgttg gaataagatc ctgatgggca caaaggagca ctga 534

<210> 2

<211> 297

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggcactgc tgctggccct gtccctgctg gtgctgtgga cctctccagc acccaccctg 60

agcggaacaa acgacgcaga ggattgctgt ctgtctgtga cacagaagcc tatcccaggc 120

tacatcgtga ggaatttcca ctatctgctg atcaaggacg gatgcagggt gccagcagtg 180

gtgtttacca cactgagggg ccgccagctg tgcgcaccac ctgatcagcc ttgggtggag 240

cggatcatcc agcggctgca gagaaccagc gccaagatga agcggagaag ctcctga 297

<210> 3

<211> 177

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser

20 25 30

Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr

35 40 45

Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr

50 55 60

Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg

85 90 95

Ser Ser

<210> 5

<211> 4054

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hIL7、hCCL19基因的表达盒以及两个表达盒两翼的HOM1+ HOM2序列

<400> 5

agcccgggcc ccccgcgggc tgagactagc gagttagaca ggcaagcact actcgcctct 60

gcacgcacat gcttgcctgt caaactctac caccccggca cgctctctgt ctccatggcc 120

cgccgccgcc atcgcggccc ccgccgcccc cggccgcccg ggcccacggg cgcggtccca 180

accgcacagt cccaggtaac ctccacgccc aactcggaac ccgtggtcag gagcgcgccc 240

gcggccgcga cccttaatta atgtacgggc cagatatacg cgtatctgag gggactaggg 300

tgtgtttagg cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagtcccc tcaggatata 360

gtagtttcgc ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaataca cttgtagtct 420

tgcaacatgg taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca 480

tgccgattgg tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacaggt 540

ctgacatgga ttggacgaac cactgaattc cgcattgcag agataattgt atttaagtgc 600

ctagctcgat acaataaacg ccatttgacc attcaccaca ttggtgtgca cctccattgc 660

gttgcgctca ctgtctagaa tgttccacgt gtcctttcgg tacatcttcg gcctgccccc 720

tctgatcctg gtgctgctgc cagtggccag ctccgactgc gatatcgagg gcaaggacgg 780

caagcagtat gagtctgtgc tgatggtgag catcgaccag ctgctggatt ccatgaagga 840

gatcggctct aactgcctga acaatgagtt taatttcttt aagaggcaca tctgtgatgc 900

caacaaggag ggcatgttcc tgtttagggc cgccagaaag ctgcggcagt ttctgaagat 960

gaattctacc ggcgacttcg atctgcacct gctgaaggtg agcgagggca ccacaatcct 1020

gctgaactgt accggccagg tgaagggaag gaagccagcc gccctgggag aggcccagcc 1080

cacaaagagc ctggaggaga acaagtccct gaaggagcag aagaagctga atgacctgtg 1140

cttcctgaag aggctgctgc aggagatcaa gacctgttgg aataagatcc tgatgggcac 1200

aaaggagcac tgagtcgacg acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 1260

tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 1320

gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 1380

aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa 1440

agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatt aattaagggg atatcccata gagcccaccg 1500

catccccagc atgcctgcta ttgtcttccc aatcctcccc cttgctgtcc tgccccaccc 1560

caccccccag aatagaatga cacctactca gacaatgcga tgcaatttcc tcattttatt 1620

aggaaaggac agtgggagtg gcaccttcca gggtcaagga aggcacgggg gaggggcaaa 1680

caacagatgg ctggcaacta gaaggcacag tcgaggctga tcagcgggtt taaacgggcc 1740

ctctagactc gagcggccgc cactgtgctg gatatctgtc aggagcttct ccgcttcatc 1800

ttggcgctgg ttctctgcag ccgctggatg atccgctcca cccaaggctg atcaggtggt 1860

gcgcacagct ggcggcccct cagtgtggta aacaccactg ctggcaccct gcatccgtcc 1920

ttgatcagca gatagtggaa attcctcacg atgtagcctg ggataggctt ctgtgtcaca 1980

gacagacagc aatcctctgc gtcgtttgtt ccgctcaggg tgggtgctgg agaggtccac 2040

agcaccagca gggacagggc cagcagcagt gccatccaca ctggactagt ggatccgagc 2100

tcggtaccaa gcttaagttt aaacgctagc cagcttgggt ctccctatag tgagtcgtat 2160

taatttcgat aagccagtaa gcagtgggtt ctctagttag ccagagagct ctgcttatat 2220

agacctccca ccgtacacgc ctaccgccca tttgcgtcaa tggggcggag ttgttacgac 2280

attttggaaa gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg tcaatggggt 2340

ggagacttgg aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg cccattgatg tactgccaaa 2400

accgcatcac catggtaata gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt 2460

cccataaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa 2520

tagggggcgt acttggcata tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta 2580

aatactccac ccattgacgt caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg 2640

tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg 2700

taagttatgt aacgcggaac tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt 2760

actattaata actagtcaat aatcaatgtc aacgcgtata tctggcgttc cctttagtga 2820

ggcggccgcc agcgcggcgg ggcccggcca accagcgtcc gccgagtcgt cggggcccgg 2880

cccactgggc ggtaactccc gcccagtggg ccgggccgcc cacttcccgg tatggtaatt 2940

aaaaacttgc agaggccttg ttccgcttcc cggtatggta attagaaact cattaatggg 3000

cggccccggc cgcccttccc gcttccggca attcccgcgg cccttaatgg gcaaccccgg 3060

tattccccgc ctcccgcgcc gcgcgtaacc actcccctgg ggttccgggt tatgttaatt 3120

gcttttttgg cggaacacac ggcccctcgc gcattggccc gcgggtcgct caatgaaccc 3180

gcattggtcc cctgggtttc cgggtatggt aatgagtttc ttcgggaagg cgggaagccc 3240

cggggcaccg acgcaggcca agcccctgtt gcgtcggcgg gaggggcatg ctaatggggt 3300

tctttggggg acaccgggtt ggtcccccaa atcgggggcc gggccgtgca tgctaatgat 3360

attctttggg ggcgccgggt tggtccccgg ggacggggcc gccccgcggt gggcctgcct 3420

cccctgggac gcgcggccat tgggggaatc gtcactgccg cccctttggg gaggggaaag 3480

gtgtggggta taagttagcc ctggcccgac ggtctggtcg catttgcacc tcggcactcg 3540

gagcgagacg cagcagccag gcagactcgg gccgccccct ctccgcatca ccacagaagc 3600

cccgcctacg ttgcgacccc cagggaccct ccgtcagcga ccctccagcc gcatacgacc 3660

cccatggagc cccgccccgg agcgagtacc cgccggcctg agggccgccc ccagcgcgag 3720

gtgaggggcc gggcgccatg tctggggcgc catgtctggg gcgccatgtc tggggcgcca 3780

tgtctggggc gccatgttgg ggggcgccat gttggggggc gccatgttgg gggacccccg 3840

acccttacac tggaaccggc cgccatgttg ggggaccccc actcatacac gggagccggg 3900

cgccatgttg gggcgccatg ttagggggcg tggaaccccg tgacactata tatacagggg 3960

ccgggggcgc catgttaggg ggcgcggaac cccctgaccc tatatataca gggaccgggg 4020

tcgccctgtt aggggtcgcc atgtgacccc ctga 4054

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sgRNA-F靶点序列

<400> 6

tcggtctaac gttacacccg agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sgRNA-R靶点序列

<400> 7

gagccgcgca tatatacgct tgg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HOM1-F

<400> 8

cgcacagtcc caggtaacct c 21

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 34.5-flank-seq

<400> 9

ggcgtgtctc tgtgtatgag tcagggggtc c 31

Claims (15)

1.一种重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒为溶瘤疱疹病毒，含有：

第一核酸，所述第一核酸的核酸序列编码hIL7；和

第二核酸，所述第二核酸的核酸序列编码hCCL19，

所述第一核酸的核酸序列和所述第二核酸的核酸序列插入至所述重组溶瘤病毒的基因组中的ICP34.5基因位置。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒为经优化改造后的重组溶瘤病毒，所述优化改造为敲除ICP47基因。

3.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤疱疹病毒的类型为HSV-1或HSV-2。

4.根据权利要求3所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述HSV-1选自F毒株、HF毒株、KOS毒株、HrR3毒株和17毒株。

5.根据权利要求3所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述HSV-2为HG52毒株。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～5中任一项所述的重组溶瘤病毒的核酸分子，所述核酸分子为整合了所述第一核酸和所述第二核酸的重组溶瘤病毒的基因组。

7.一种制备权利要求1～5中任一项所述的重组溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)制备载体，所述载体包括hIL7和hCCL19基因的表达盒，其中，所述hIL7和hCCL19基因的表达盒的整体的两翼具有溶瘤病毒基因组同源臂；

2)制备靶向所述溶瘤病毒基因组预定基因位置并实现剪切的基因靶向核酸序列；

3)将所述载体、所述靶向核酸序列以及所述溶瘤病毒基因组同时转染，进行同源重组，以便获得重组溶瘤病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述hIL7和hCCL19基因的表达盒方向相反，且通过不同的启动子启动基因表达。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，靶向所述溶瘤病毒基因组预定基因位置并实现剪切通过Crisper-Cas9基因编辑系统实现。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～5中任一项所述的重组溶瘤病毒。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，每单位剂量的所述药物组合物中包含10²-10¹¹pfu的重组溶瘤病毒。

12.权利要求1～5任一项所述的重组溶瘤病毒在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、食管癌和胰腺癌。

13.一种抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞死亡的方法，其特征在于，所述方法包括使所述肿瘤细胞与权利要求1～5中任一项所述的重组溶瘤病毒接触，其中，所述接触在体外进行。

14.根据权利13所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、骨肉瘤细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞、神经胶质瘤细胞、黑色素瘤细胞、结直肠癌细胞、食管癌细胞和胰腺癌细胞。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述重组溶瘤病毒以足以引起所述肿瘤细胞死亡的剂量提供。

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