JP7277926B2 - 安全を確保しながら転移性がんまで効果的に治療可能な、搭載する免疫誘導遺伝子の最適発現レベルを与える発現制御システムを有する腫瘍溶解性ウイルス(腫瘍溶解性免疫治療) - Google Patents
安全を確保しながら転移性がんまで効果的に治療可能な、搭載する免疫誘導遺伝子の最適発現レベルを与える発現制御システムを有する腫瘍溶解性ウイルス(腫瘍溶解性免疫治療) Download PDFInfo
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Description
(1) E2Fプロモーター(E2Fp)、又はこれと同等の活性を示すプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルス。
(2) 前記E2Fプロモーター(E2Fp)と同等の活性を示すプロモーターが、サバイビンプロモーター、AuroraキナーゼA遺伝子プロモーター、又はAuroraキナーゼB遺伝子プロモーターである、(1)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(3) 前記プロモーターが、E2Fプロモーター(E2Fp)、又はサバイビンプロモーターである、(1)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(4) 前記プロモーターが、E2Fプロモーター(E2Fp)である、(1)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(5) 前記免疫誘導遺伝子が、サイトカイン遺伝子である、(1)~(4)のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(6) 前記サイトカイン遺伝子が、Activin A、ANGPTL5、BAFF、BD-2(β-Defensin-2)、BD-3(β-Defensin-3)、BDNF、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-10、CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7(MCP-3)、CCL8(MCP-2)、CCL9(MIP-1γ)、CCL11(Eotaxin-1)、CCL12(MCP-5)、CCL13(MCP-4)、CCL14、CCL15(MIP-1δ)、CCL16、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3β)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(Exodus-2)、CCL22、CCL23、CCL24(Eotaxin-2)、CCL25(TECK)、CCL26(MIP-4α)、CCL27、CCL28、CO40-Ligand(TRAP)、CD137(4-1BB)-Ligand、CNTF、CT-1、CX3CL1(Fractalkine)、CXCL1(GRO1)、CXCL2(MIP-2α、GRO2)、CXCL3(MIP-2β、GRO3)、CXCL4(PF4)、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12(SDF-1α)、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、DKK-1、DLL1、EGFs、EG-VEGF(Prokineticin 1)、FasL、FGF-1(acidic FGF)、FGF-2(basic FGF)、FGF-3、FGF-4(HGBF-4)、FGF-5、FGF-6、FGF-7(KGF、HBGF-7)、FGF-8、FGF-9 (HBGF-9)、FGF-10 (KGF-2)、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23、Flt3-Ligand、Galectin-1、Galectin-3、G-CSF、GDF-11、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-β1a、IFN-β1b、IFN-γ1b、IGF-1、IGF-2、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、LIF、M-CSF、MIF、NGF-β、Noggin、NT-3(NTF-3)、NT-4(NTF-4)、Oncostatin M、OPG(TNFRSF11B)、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、Pleiotrophin、Prolactin(Mammotropin)、RANKL、R-Spondin-1、R-Spondin-2、R-Spondin-3、SCF(c-kit Ligand)、SHH(C24II)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β3、TNF-α、TNF-β、TPO(MDGF)、TRAIL、TSLP、VEGF、XCL1、及びXCL2からなる群から選択される1つのサイトカインの遺伝子である、(5)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(7) 前記サイトカイン遺伝子がGM-CSFである、(6)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(8) 更に、少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターで置換されていることを特徴とする、(1)~(7)のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(9) 前記臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、アルブミンプロモーター、α-フェトプロテインプロモーター、前立腺特異的抗原(PSA)プロモーター、ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質(MB)プロモーター、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)プロモーター、及び神経特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターから選択されるプロモーターである、(8)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(10) 前記がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)プロモーター、がん胎児性抗原(CEA)プロモーター、低酸素応答性領域(HRE)プロモーター、Grp78プロモーター、L-プラスチンプロモーター、ヘキソキナーゼIIプロモーター、サバイビンプロモーター、及びAuroraキナーゼプロモーターから選択されるプロモーターである、(8)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(11) 前記がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、サバイビンプロモーター、ヒトAuroraキナーゼA遺伝子のプロモーター、又は、ヒトAuroraキナーゼB遺伝子のプロモーターである、(10)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(12) 前記がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、サバイビンプロモーターである、(10)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(13) アデノウイルスである、(1)~(12)のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(14) 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24、E1B、およびE1BΔ55Kから選択される因子である、(13)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(15) 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1Aである、(13)に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(16) 更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に連結した、外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する(1)~(15)のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(17) (1)~(16)のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。
アデノウイルスの増殖に必須の初期遺伝子であるE1Aの上流にSurvivin promoterを組み込んだSurv.m-CRA内に、E2Fプロモーター、RSVプロモーター、及びCAプロモーターの各プロモーターとmouse GM-CSF cDNAを連結した発現カセットを挿入し、以下の3種のGM-CSF発現Surv.m-CRAを構築した(図1)。アデノウイルスの構築はNagano et al, Gene Therapy (2005) 12,1385-1393に記載の方法に基づいて行った。
作製の第一段階として、増殖制御プラスミドP1とアデノウイルスバックボーンプラスミドP3(pAd.HM4,pAd.HM10;Mizuguchi and Kay,Hum.Gene Ther.1999)から制限酵素処理によりP1+3を作製した。
作製の第二段階として、3種のプロモーター(CAプロモーター、E2Fプロモーター、及びRSVプロモーター)それぞれの下流に、治療遺伝子としてマウスのGM-CSF cDNAを連結した、治療遺伝子導入プラスミドP2を作製した。
(2)-1:pUni/CApr-mGM-CSF
作製順序として、まずLoxP配列とBGH poly A配列を持つプラスミドpUni/V5-HisC-tet(c)(以下、pUni)にCAプロモーターを挿入したのち、さらにその下流に治療遺伝子としてmGM-CSFのCording sequence(CDS)を挿入した。
E2Fプロモーター配列を含むpABS4-E2Fp-GFPを鋳型とし、5’側にXho IとNco Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCCTCGAGCCATGGGGTACCATCCGGACAAAGCC-3’(配列番号10)、及び、3’側にAge I、Sal l及びSpe Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTACCGGTGTCGACACTAGTCGAGGGCTCGATCCCGCTCC-3’(配列番号11)を用いてPCRを行い、E2Fプロモーター配列を増幅した。その後、Xho I及びAge Iにて切断後、pUniのXho I及びAge Iサイトに挿入し、pUni/E2Fprを作製した。一方、pBluescript SKII+mGM-CSFを鋳型とし、5’側にAge Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCACCGGTAGGAGGATGTGGCTGCAGAATTTACT-3’(配列番号12)、及び、3’側にApa Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTGGGCCCTCATTTTTGGCCTGGTTTTT-3’(配列番号13)を用いてPCRを行い、mGM-CSF cDNA配列を増幅した。その後、Age I及びStu Iにて切断後、pUni/E2FprのAge I及びStu Iサイトに挿入し、pUni/E2Fpr-mGM-CSFを作製した。
RSVプロモーター配列を含むpGEM-RSV-Sを鋳型とし、5’側にXho Iと Nco Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCCTCGAGCCATGGGCTTCGCGATGTACGGGCCA-3’(配列番号14)、及び、3’側にAge I、Sal l及びSpe Iサトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTACCGGTGTCGACACTAGTACACCAATGTGGTGAATGGT-3’(配列番号15)を用いてPCRを行い、RSVプロモーター配列を増幅した。その後、Xho I及びAge Iにて切断後、pUniのXho I及びAge Iサイトに挿入し、pUni/RSVprを作製した。一方、pBluescript SKII+mGM-CSFを鋳型とし、5’側にAge Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCACCGGTAGGAGGATGTGGCTGCAGAATTTACT-3’(配列番号12)、及び、3’側にApa Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GACGTGGGCCCTCATTTTTGGCCTGGTTTTT-3’(配列番号13)を用いてPCRを行い、mGM-CSF cDNA配列を増幅した。その後、Age I及びStu Iにて切断後、pUni/RSVprのAge I及びStu Iサイトに挿入し、pUni/RSVpr-mGM-CSFを作製した。
最終段階として、前述で説明したP1+3プラスミドとP2プラスミドから、配列特異的組み換え酵素であるCreを用いた特定配列(LoxP)同士間での相同組み換えによってP1+2+3プラスミドを作製した。まず、P1+3プラスミド(pAd.HM4-Surv.m-CRA)とP2プラスミド(pUni/CApr-mGM-CSF)をそれぞれ1:0.3のモル比で、Cre/LoxP相同組み換えを行い、P1+2+3プラスミド(pAd.HM4-Surv.m-CRA/CApr-mGM-CSF)を作製した。同様に、P1+3プラスミド(pAd.HM10.Surv.m-CRA)とpUni/E2Fpr-mGM-CSFあるいはpUni/RSVpr-mGM-CSF)をそれぞれ1:0.3のモル比で、Cre/LoxP相同組み換えを行い、P1+2+3プラスミド(pAd.HM10-Surv.m-CRA/E2Fpr-mGM-CSF及びpAd.HM10-Surv.m-CRA/RSVpr-mGM-CSF)をそれぞれ作製した。
プラスミドpAd.Surv.E1A-CMV.E1B19K、pAd.HM4-Surv.m-CRA/CApr-mGM-CSF、pAd.HM10-Surv.m-CRA/E2Fpr-mGM-CSF及びpAd.HM10-Surv.m-CRA/RSVpr-mGM-CSFをそれぞれ制限酵素Pac Iで切断したのち、アデノウイルス産生細胞であるHEK293細胞にトランスフェクション後、ウイルスプラークを単離し、シードウイルスとした。
各シードウイルスを24ウェルプレートに播種したHEK293細胞にインフェクションし、90%の細胞変性効果(cytopathic effect:CPE)が観察された時点で細胞及び培養液を回収した。これらウイルス感染細胞懸濁液を3回の凍結、融解操作を繰り返した後、10cmディッシュに播種したHEK293細胞にインフェクションした。このようなウイルス感染、回収の操作を徐々にスケールアップさせ、最終的に15cmディッシュ40枚分へと増幅し、これらの細胞及び培養液を回収し、凍結保存した。
上記の回収細胞液から、各アデノウイルスを塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製した。まず、35,000rpm、10℃、1時間の超遠心による1次精製を行い、ウイルスバンドを回収した。その後、35,000rpm、10℃、18時間の超遠心による2次精製を行い、ウイルスバンドを回収した。回収したウイルス液を、Econo-pac 10DG脱塩カラム(Bio-Rad Laboratories社)によりフラクショネーションを行い、精製アデノウイルス液を得た。その後、OD260によりウイルス粒子数を概算後、グリセロールを最終濃度10%となるよう加え、凍結保存した。
(7-1)ヒトIL-2発現Surv.m-CRAの作製
まず、E2Fプロモーターの下流に、ヒトのIL-2 cDNAを連結した、治療遺伝子導入プラスミドP2(pUni/E2Fpr-hIL-2)を作製した。その際、pBluescript SKII+hIL-2を鋳型とし、5’側にAge Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCACCGGTGCCACAATGTACAGGATGCAACTCCT-3’(配列番号16)、及び、3’側にApa Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTGGGCCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGA-3’(配列番号17)を用いてPCRを行い、hIL-2 cDNA配列を増幅した。その後、Age I及びStu Iにて切断後、pUni/E2FprのAge I及びStu Iサイトに挿入し、pUni/E2Fpr-hIL-2を作製した。その後、P1+2+3プラスミド(pAd.HM4-Surv.m-CRA/E2Fpr-hIL-2)を作製した。
まず、E2Fプロモーターの下流に、マウスのIL-2 cDNAを連結した、治療遺伝子導入プラスミドP2(pUni/E2Fpr-mIL-2)を作製した。その際、pBluescript SKII+mIL-2を鋳型とし、5’側にAge Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCACCGGTGCAGGCATGTACAGCATGCAGCTCGC-3’(配列番号18)、及び、3’側にApa Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTGGGCCCTTATTGAGGGCTTGTTGAGA-3’(配列番号19)を用いてPCRを行い、mIL-2 cDNA配列を増幅した。その後、Age I及びStu Iにて切断後、pUni/E2FprのAge I及びStu Iサイトに挿入し、pUni/E2Fpr-mIL-2を作製した。その後、P1+2+3プラスミド(pAd.HM4-Surv.m-CRA/E2Fpr-mIL-2)を作製した。
まず、E2Fプロモーターの下流に、ヒトのIL-15 cDNAを連結した、治療遺伝子導入プラスミドP2(pUni/E2Fpr-hIL-15)を作製した。その際、hIL-15 cDNAを鋳型とし、5’側にAge Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCACCGGTTGAGTAATGAGAATTTCGAAACCACA-3’(配列番号20)、及び、3’側にApa Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTGGGCCCTCAAGAAGTGTTGATGAACA-3’(配列番号21)を用いてPCRを行い、hIL-15 cDNA配列を増幅した。その後、Age I及びStu Iにて切断後、pUni/E2FprのAge I及びStu Iサイトに挿入し、pUni/E2Fpr-hIL-15を作製した。その後、P1+2+3プラスミド(pAd.HM4-Surv.m-CRA/E2Fpr-hIL-15)を作製した。
まず、E2Fプロモーターの下流に、マウスのIL-15 cDNAを連結した、治療遺伝子導入プラスミドP2(pUni/E2Fpr-mIL-15)を作製した。その際、mIL-15 cDNAを鋳型とし、5’側にAge Iサイトを付加したセンスプライマー;5’-TCAGTCACCGGTTAAGTAATGAAAATTTTGAAACCATA-3’(配列番号22)、及び、3’側にApa Iサイトを付加したアンチセンスPrimer;5’-GGACGTGGGCCCTCAGGACGTGTTGATGAACA-3’(配列番号23)を用いてPCRを行い、mIL-15 cDNA配列を増幅した。その後、Age I及びStu Iにて切断後、pUni/E2FprのAge I及びStu Iサイトに挿入し、pUni/E2Fpr-mIL-15を作製した。その後、P1+2+3プラスミド(pAd.HM4-Surv.m-CRA/E2Fpr-mIL-15)を作製した。
ハムスター由来のがん細胞(HaK及びHaP-T1)及び正常細胞(BHK-21)におけるアデノウイルスの感染効率を検討した。
Syrian hamster kidney tumor由来HaK細胞は、Saint Louis University School of MedicineのProf.M.Woldにご供与頂いた。培養は、10%Fetal Bovine Serum(FBS;Biowest)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ナカライテスク)含有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;ナカライテスク)にて37℃、5%CO2条件下で行った。Syrian hamster pancreatic tumor由来HaP-T1細胞は、理化学研究所BRC cell bankより購入した(RBRC-RCB0411)。培養は、10%FBS、1%non-essential amino acids(NEAA;SIGMA)、1mM Sodium Pyruvate(Thermo Fisher Scientific)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン含有MEM(Minimum Essential Medium;SIGMA)にて37℃、5%CO2条件下で行った。Syrian hamsterの新生児腎臓由来BHK-21細胞は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入した(JCRB9020)。培養は、10%FBS、1%NEAA、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ナカライテスク)含有MEMにて37℃、5%CO2条件下で行った。
ハムスター由来のがん細胞(HaK及びHaP-T1)及び正常細胞(BHK-21)における、E2F、RSV及びSurvivinの各プロモーター活性を検討した。前日に6well plateへ播種した各細胞を感染当日にカウントした結果、HaK:1.29×106cells/well、HaP-T1:1.0×106cells/well、BHK-21:1.7×106cells/wellであった。その後、ウイルス増殖に重要な遺伝子E1及びE3を欠損させたAd.dE1.3(Control)、及び各プロモーター制御下にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(LacZ)を発現する、Ad.E2Fp-LacZ、Ad.RSVp-LacZ、及びAd.Survp-LacZをMOI30にて1時間感染させた後、48時間培養した。その後、Beta-Glo(登録商標)Assay System(Promega)を用いて、細胞溶解液中のβ-ガラクトシダーゼ活性を検討した。実験は各条件にて3wellずつ施行し、データは平均値±標準誤差で示した。
ハムスターGM‐CSFの遺伝子配列は確かなものが報告されていないため、マウスGM‐CSF(mGM-CSF)を用いた。各mGM-CSF発現Surv.m-CRAを感染させたハムスター由来のがん細胞(HaK及びHaP-T1)及び正常細胞(BHK-21)におけるmGM-CSFのタンパク質発現レベルをELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法にて検討した。前日に6well plateへ播種した各細胞を感染当日にカウントした結果、HaK:1.4×106cells/well、HaP-T1:1.47×106cells/well、BHK-21:2.2×106cells/wellであった。Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/CAp-mGM-CSFをそれぞれMOI1、10、100条件にて1時間感染後、48時間培養した。その後、培養上清を回収し、Mouse GM-CSF Quantikine ELISA Kit(R&D systems)にてmGM-CSFタンパク質の発現量を検討した。ELISA測定は各細胞上清につき2wellずつ施行し、データは平均値±標準誤差にて示した。各条件間の統計学的有意差についてはStudent’s t testにて検定した(*,P<0.05)。加えて、ヒトGM‐CSF(hGM-CSF)を発現する各Surv.m-CRA(Surv.m-CRA/E2Fp-hGM-CSF、Surv.h-CRA/RSVp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/CAp-hGM-CSF)についても同様に検討を行った。
各mGM-CSF発現Surv.m-CRAを感染させたハムスター由来のがん細胞(HaK及びHaP-T1)及び正常細胞(BHK-21)に対する細胞傷害効果について、生細胞数測定にて検討した。前日に96well plateへ各細胞とも5×102cells/wellにて播種した。Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/CAp-mGM-CSFをMOI3及び30にて1時間感染後、培養を行った。感染後、3及び5日後の時点で生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク)を用いたWST-8アッセイにより細胞傷害性を評価した。
メス5週齢のSyrianハムスターに1×107個のHaKを背側に1カ所皮下移植した。その際、HaK細胞は50%マトリゲル中1×107cells/200μlとなるよう、Corning(登録商標)マトリゲル基底膜マトリックス(Corning)にて調製した。約33日後に、移植腫瘍の直径が6-10mmに達した段階で、Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、及びSurv.m-CRA/CAp-mGM-CSFの各ウイルスをPBSにて1×109PFU/100μlに調整後、腫瘍内に単回注入し、継時的な腫瘍径の変化を評価した(図7)。Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、及びSurv.m-CRA/CAp-mGM-CSFウイルス投与した各群の匹数は、それぞれ、n=12、9、11、11、及び12であった。腫瘍の大きさはデジタルノギスを使用し、週に2回測定した。腫瘍体積は、長軸(mm)×短軸(mm)×短軸(mm)×0.5(mm3)にて算出した。データは平均値±標準誤差にて示し、各群間の統計学的有意差についてはStudent’s t testにて検定した(*,P<0.05 vs Ad.dE1.3;#,P<0.05 vs Surv.m-CRA)。
上記各ウイルス単回注入によるHaK移植ハムスターの生存への影響をKaplan-Meier法による生存曲線解析により評価した。各群間の統計学的有意差についてはlog-rank testにて検定した。
メス5週齢のSyrianハムスターに1×107個のHaKを背側に1カ所皮下移植した。その際、細胞は50%マトリゲル中に1×107cells/200μlとなるよう、Corning(登録商標)マトリゲル基底膜マトリックス(Corning)にて調製した。約28日後に、移植腫瘍の直径が6-10mmに達した段階で、Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、及びSurv.m-CRA/CAp-mGM-CSFの各ウイルスをPBSにて1×109PFU/100μlに調整後、腫瘍内に単回注入した。Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、及びSurv.m-CRA/CAp-mGM-CSFウイルス投与した各群の匹数は、それぞれ、n=4、5、4、3、及び3であった。ウイルス注入の14日後に、7.5×106個のHaK及びHaP-T1をそれぞれ50%マトリゲル中に7.5×106cells/200μlとなるよう調製後、背側に皮下移植し、その15日後に2次移植腫瘍の形成を評価した。
メス5週齢のSyrianハムスターに1×107個のHaKを背側に1カ所皮下移植した。その際、細胞は50%マトリゲル中1×107cells/200μlとなるよう、Corning(登録商標)マトリゲル基底膜マトリックス(Corning)にて調製した。約42日後に、移植腫瘍の直径が6-10mmに達した段階で、Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、及びSurv.m-CRA/CAp-mGM-CSFの各ウイルスをPBSにて1×109PFU/100μlに調整後、腫瘍内に単回注入した。その後2及び7日後に血清、腫瘍、脾臓を単離し、組織内mGM-CSF発現レベルをELISA法により検討した。ウイルス投与した各群の匹数は各Dayそれぞれ全てn=3であった。データは平均値±標準誤差にて示し、各群間の統計学的有意差についてはStudent’s t testにて検定した(*,P<0.05 vs Surv.m-CRA/E2Fpr-mGM-CSF;#,P<0.05 vs Surv.m-CRA/RSVpr-mGM-CSF)。
1×107個のハムスター腎がん由来HaKをメス5週齢のSyrianハムスターの片側腎臓へ移植した。その際、細胞は50%マトリゲル中に1×107cells/200μlとなるよう、Corning(登録商標)マトリゲル基底膜マトリックス(Corning)にて調製した。約14日後に、Ad.dE1.3(Control)、Surv.m-CRA、Surv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSF、Surv.m-CRA/RSVp-mGM-CSF、及びSurv.m-CRA/CAp-mGM-CSFの各ウイルスをPBSにて1×109PFU/100μlに調整後、腫瘍を移植した側の腎臓内に単回注入した。その後、同所移植担がんハムスターモデルにおける上記各ウイルス単回注入による生存への影響をKaplan-Meier法による生存曲線解析により評価した。各群間の統計学的有意差についてはlog-rank testにて検定した。
1×107個のハムスター腎がん由来HaKをメス5週齢のSyrianハムスターの片側腎臓へ移植した。その際、細胞は50%マトリゲル中に1×107cells/200μLとなるよう、Corning(登録商標)マトリゲル基底膜マトリックス(Corning)にて調製した。約14日後に、Ad.dE1.3(Control)、あるいはSurv.m-CRA/E2Fp-mGM-CSFの各ウイルスをPBSにて1×109PFU/100μLに調整後、腫瘍を移植した側の腎臓内に単回注入した。さらに、同日に500μgの抗mouse PD-1抗体、あるいはIsotype Control抗体をそれぞれ腹腔内投与した。この日をDay0とし、同量の同抗体をDay2、4、6、8にも同様に投与した。その後、生存への影響を同様に解析した。
Claims (12)
- E2Fプロモーター(E2Fp)の下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有し、かつ、少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターが、サバイビンプロモーターで置換されていることを特徴とする、腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記免疫誘導遺伝子が、サイトカイン遺伝子である、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記サイトカイン遺伝子が、Activin A、ANGPTL5、BAFF、BD-2(β-Defensin-2)、BD-3(β-Defensin-3)、BDNF、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-10、CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7(MCP-3)、CCL8(MCP-2)、CCL9(MIP-1γ)、CCL11(Eotaxin-1)、CCL12(MCP-5)、CCL13(MCP-4)、CCL14、CCL15(MIP-1δ)、CCL16、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3β)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(Exodus-2)、CCL22、CCL23、CCL24(Eotaxin-2)、CCL25(TECK)、CCL26(MIP-4α)、CCL27、CCL28、CD40-Ligand(TRAP)、CD137(4-1BB)-Ligand、CNTF、CT-1、CX3CL1(Fractalkine)、CXCL1(GRO1)、CXCL2(MIP-2α、GRO2)、CXCL3(MIP-2β、GRO3)、CXCL4(PF4)、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12(SDF-1α)、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、DKK-1、DLL1、EGFs、EG-VEGF(Prokineticin 1)、FasL、FGF-1(acidic FGF)、FGF-2(basic FGF)、FGF-3、FGF-4(HGBF-4)、FGF-5、FGF-6、FGF-7(KGF、HBGF-7)、FGF-8、FGF-9 (HBGF-9)、FGF-10 (KGF-2)、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23、Flt3-Ligand、Galectin-1、Galectin-3、G-CSF、GDF-11、GDNF、GM-CSF、HB-EGF、HGF、IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-β1a、IFN-β1b、IFN-γ1b、IGF-1、IGF-2、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、LIF、M-CSF、MIF、NGF-β、Noggin、NT-3(NTF-3)、NT-4(NTF-4)、Oncostatin M、OPG(TNFRSF11B)、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、Pleiotrophin、Prolactin(Mammotropin)、RANKL、R-Spondin-1、R-Spondin-2、R-Spondin-3、SCF(c-kit Ligand)、SHH(C24II)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β3、TNF-α、TNF-β、TPO(MDGF)、TRAIL、TSLP、VEGF、XCL1、及びXCL2からなる群から選択される1つのサイトカインの遺伝子である、請求項2に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 前記サイトカイン遺伝子がGM-CSFである、請求項3に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- アデノウイルスである、請求項1~4のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1A、E1AΔ24、E1B、およびE1BΔ55Kから選択される因子である、請求項5に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 少なくとも1つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、E1Aである、
請求項5に記載の腫瘍溶解性ウイルス。 - 更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に連結した、外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する請求項1~7のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。
- 非標的細胞への傷害が少ない、請求項9に記載のがん治療剤。
- サイトカインを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含むがん治療方法において用いられ、脾臓又は血清における前記サイトカインの量が、CAプロモーター又はRSVプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合と比較して少ないことを特徴とする、請求項1~8いずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、又は前記腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。
- サイトカインを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含むがん治療方法において用いられ、脾臓における前記サイトカインの消失が、CAプロモーター又はRSVプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合と比較して早いことを特徴とする、請求項1~8のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、又は前記腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。
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