CN102985094B - 一种重组肿瘤疫苗及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于预防和治疗肿瘤以及癌症的肿瘤疫苗。肿瘤疫苗可以含有编码用于预防和治疗肿瘤以及癌症的抗原提呈肽、细胞因子和其它因子的核酸，或含有此类核酸的表达载体或病毒，或含有此类核酸或表达载体的宿主细胞。

Description

一种重组肿瘤疫苗及其生产方法

背景技术

抗原提呈是适应性免疫应答中的一个过程，期间抗原提呈细胞捕获抗原并将抗原提呈至其表面以供T细胞识别。抗原和主要组织相容性复合物(MHC)分子位于抗原提呈细胞表面，其能够被T细胞受体识别和结合，藉此促进抗原提呈。一旦T细胞识别了细胞表面的抗原，其活化并产生针对抗原的免疫应答。通过抗原提呈，T细胞能够产生针对外源性抗原和内源性抗原的免疫应答。

细胞因子在免疫应答调控中发挥着重要作用。细胞因子是由免疫系统中的细胞分泌的低分子量蛋白，其具有发送调节免疫系统信号的功能。不同细胞因子能够传送不同信号。例如，某些细胞因子能够刺激免疫细胞的增殖或成熟；某些细胞因子能够引导免疫细胞的迁移；以及某些细胞因子能够增强基于细胞的免疫应答。

据信，癌症或肿瘤至少部分地与人体内对癌变的免疫应答减弱或缺乏相关。多种疗法已被用于治疗癌症，包括基因疗法。用于癌症治疗的基因疗法可以涉及到输送能够杀伤或抑制癌细胞的基因、能够增强针对癌细胞免疫应答的基因、能够修复或代替基因突变或改变的基因、或能够使癌细胞对化疗或放疗更为敏感的基因。

发明概述

本发明涉及用于预防或治疗肿瘤和癌症的重组肿瘤疫苗。该肿瘤疫苗可以包含编码用于预防和治疗肿瘤以及癌症的抗原提呈肽、细胞因子和其它因子的核酸，和/或含有此类核酸的表达载体，和/或含有此类核酸和/或表达载体的宿主细胞。本发明还涉及包含肿瘤疫苗的药物组合物以及使用肿瘤疫苗预防和治疗肿瘤和癌症的方法。

一方面，本发明提供了一种重组肿瘤疫苗，其包含编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸、编码细胞因子的第二多核苷酸、和至少一个启动子的组合物，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种重组肿瘤疫苗，其包含具有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一个启动子的表达载体，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含药学上可接受的载体以及含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸、编码细胞因子的第二多核苷酸、和至少一个启动子的肿瘤疫苗，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，包括向对象给予药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸、编码细胞因子的第二多核苷酸、和至少一个启动子的肿瘤疫苗，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含药学上可接受的载体以及含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一个启动子的肿瘤疫苗，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，包括向对象给予药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一个启动子的肿瘤疫苗，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一个。

前述发明概述仅仅是示例性的，而非旨在以任何方式进行限定。另外除上文所述示例性的方面、实施方式和特征外，更多方面、实施方式和特征将通过引用附图和下文的详细说明给出。

附图的简要说明

图1为表达载体pAd-HSP-hGM-CSF的示意图。

图2为腺病毒基因组Ad-HSP-hGM-CSF的示意图。

图3为腺病毒基因组Ad-HSP-mGM-CSF的示意图。

图4显示了在B16细胞(a)、Hep3B细胞(b)、和Hela细胞(c)中通过ELISA测定的mGM-CSF的表达水平，其分别在10、100和1000的感染复数(MOI)下被Ad-HSP-mGM-CSF感染。

图5显示了在B16细胞(a)、Hep3B细胞(b)、和Hela细胞(c)中通过ELISA测定的hHSP70的表达水平，其分别在10、100和1000的MOI下被Ad-HSP-mGM-CSF感染。

图6显示了在感染复数为300时Ad-HSP-hGM-CSF对不同肿瘤细胞的细胞毒性作用。

图7显示了在感染复数为100时Ad-HSP-hGM-CSF对不同肿瘤细胞的细胞毒性作用。

图8显示了在感染复数为30时Ad-HSP-hGM-CSF对不同肿瘤细胞的细胞毒性作用。

图9显示了Ad-HSP-mGM-CSF对7种不同类型细胞的细胞毒性作用。

图10显示了给予小鼠Ad-HSP-mGM-CSF后肿瘤尺寸的改变。

发明详述

在以下详细说明中，引用附图作为参考，这些附图也为本发明的其中一部分。附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号一般表示类似的组分。在详细说明、附图和权利要求中描述的示例性实施方式不具有限定作用。在不脱离本发明主旨和范围的前提下，可以利用其它实施方式并可以进行其它改变。

核酸组合物

本发明涉及一种重组肿瘤疫苗，其具有含编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸、编码细胞因子的第二多核苷酸、和至少一个启动子的组合物，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一个。

本文使用的术语“重组”指使用一种或多种分子生物学技术对一种或多种生物分子如多核苷酸或多肽分子进行人工处理，以使得此类生物分子处于不同于其自然状态。

本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、或核糖核酸-脱氧核糖核酸的混合物如DNA-RNA杂交物。多核苷酸或核酸可以是单链或双链DNA或RNA或DNA-RNA杂交物。多核苷酸或核酸可以是线性的或环状的。

本文使用的术语“编码”或“为……编码”指能够转录为mRNA和/或翻译为肽或蛋白。“编码序列”或“基因”指编码mRNA、肽或蛋白的多核苷酸序列。在本发明中这两个术语可以互换使用。

本文使用的术语“mRNA”指与模版DNA序列互补并且能够作为蛋白合成模版的RNA分子。

本文使用的术语“抗原提呈多肽”指能够结合抗原、提呈抗原至抗原提呈细胞并且促进抗原提呈细胞识别抗原的多肽或蛋白。

本文使用的术语“抗原提呈细胞”指能够在其表面呈现抗原和其主要组织相容性复合物(MHC)的细胞，这样T细胞能够识别所呈现的抗原。呈现的抗原能够被免疫细胞如T细胞识别，藉此产生针对抗原的免疫应答。在某些实施方式中，抗原提呈细胞是树突状细胞、巨噬细胞、B-细胞或上皮细胞。在某些示例性实施方式中，抗原提呈细胞是树突状细胞。

本文使用的术语“操作性地连接”指所述编码序列以允许其表达的方式直接或间接地连接或关联至一个或多个调控序列

本文使用的术语“表达”指编码序列转录为mRNA和/或编码序列翻译为肽或蛋白。

本文使用的术语“转录”指RNA的合成过程，通过RNA聚合酶读取DNA序列以生成与DNA序列互补的RNA链。

本文使用的术语“翻译”指肽或蛋白的合成过程，通过核糖体读取mRNA序列以根据mRNA序列中含有的氨基酸密码子产生氨基酸链。

本文使用的术语“调控序列”指对编码序列表达所必须的或有益的任意核苷酸序列。调控序列可以包括，但不限于，一个或多个启动子、增强子、转录终止子、多聚腺苷酸化序列和内在核糖体插入位点。

本文使用的术语“启动子”指能够控制编码序列转录的多核苷酸序列。启动子序列包括足以供RNA聚合酶识别、结合和启动转录的特定序列。此外，启动子序列可以包括调节RNA聚合酶的识别、结合和启动转录活性的序列。启动子可以影响与其定位于相同核酸分子的基因或与其定位于不同核酸分子的基因的转录。启动子序列的功能，依据其调控的性质，可以是组成型的或诱导型的。“组成型”启动子指在宿主细胞中具有持续性活化基因表达功能的启动子。“诱导型”启动子指当存在特定刺激物或刺激时在宿主细胞中启动基因表达的启动子。

本文使用的术语“增强子”指使编码序列转录和/或翻译增强的核苷酸序列。增强子可以操作性地连接至编码序列的5’末端或3’末端。在本文中可以使用在真核细胞中可起作用的任意增强子。增强子的实例包括，但不限于，猴病毒40(SV40)早期基因增强子、来自劳氏肉瘤病毒长末端重复(LTR)序列的增强子、以及来自人巨细胞病毒(CMV)的增强子。

本文使用的术语“转录终止子”指可被真核细胞RNA聚合酶识别以终止转录的核苷酸序列。终止子序列可以操作性地连接至编码序列的3’末端。在某些实施方式中，终止子可以包含裂解RNA的信号，这样能够暴露RNA上的多聚腺苷酸化位点。在本文中可以使用在真核细胞中有功能的任意终止子序列。终止子序列的实例包括，但不限于，来自病毒的终止序列如SV40终止子，和来自已知基因的终止序列如牛生长激素终止子序列。

本文使用的术语“多聚腺苷酸化序列”指能够被真核细胞识别为当其转录后，在转录的mRNA上添加多聚腺苷酸残基的信号的核苷酸序列。多聚腺苷酸化序列可以操作性地连接至编码序列的3’末端。在本文中可以使用在真核细胞中可起作用的任意多聚腺苷酸化序列。多聚腺苷酸化序列的实例包括，但不限于，AAUAAA，和SV40多聚腺苷酸化信号。

本文使用的术语“内在核糖体插入位点”(IRES)指允许从mRNA序列的中部起始转录的核苷酸序列。IRES可以用于在一个多核苷酸分子中将两个或多个编码序列分隔开来，以使得两个或多个编码产物分别翻译形成。IRES可以操作性地连接至第一编码序列的3’末端之后和第二编码序列5’末端之前。在本文中可以使用在真核细胞中可起作用的任意IRES序列。IRES的实例包括，但不限于，小核糖核酸病毒IRES、瘟病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、甲肝病毒IRES和丙肝病毒IRES。

本发明提供了一种组合物，其包含编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸和编码细胞因子的第二多核苷酸。在某些实施方式中，第一多核苷酸和第二多核苷酸在不同的核酸分子上。在某些实施方式中，第一多核苷酸和第二多核苷酸在相同的核酸分子上。在某些实施方式中，由单一的启动子控制第一多核苷酸和第二多核苷酸的表达。在某些实施方式中，由不同启动子控制第一多核苷酸和第二多核苷酸的表达。

在某些实施方式中，第一多核苷酸和第二多核苷酸操作性地连接至一个启动子，其控制第一和第二多核苷酸的表达，并且其中第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段由IRES序列分隔。

在某些实施方式中，第一多核苷酸操作性地连接至控制第一多核苷酸表达的第一启动子，第二多核苷酸操作性地连接至控制第二多核苷酸表达的第二启动子。第一启动子和第二启动子可以是相同的或不同的。

在某些实施方式中，本发明的启动子是真核启动子如来自CMV的启动子(例如CMV立即早期启动子(CMV启动子))、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子(例如HIV长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、SV40早期启动子、来自人基因的启动子如人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子、人金属硫蛋白β-肌动蛋白启动子、人泛素C启动子(UBC)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、人胸腺嘧啶激酶启动子(TK)、人延伸因子1α启动子(EF1A)、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、E2F-1启动子(E2F1转录因子1启动子)、α-甲胎蛋白启动子、缩胆囊肽启动子、癌胚抗原启动子、C-erbB2/neu癌基因启动子、环氧合酶启动子、CXC-趋化因子受体4(CXCR4)启动子、人附睾蛋白4(HE4)启动子、II型己糖激酶启动子、L-网素启动子、粘蛋白样糖蛋白(MUC1)启动子、前列腺特异性抗原(PSA)启动子、存活素启动子、酪氨酸酶相关蛋白(TRP1)启动子、和酪氨酸激酶启动子。

在某些实施方式中，本发明的启动子可以是肿瘤特异性启动子。本文使用的术语“肿瘤特异性启动子”指优选地或特异性地在肿瘤细胞中具有启动基因表达的功能且在非肿瘤细胞或非癌细胞中无活性或具有降低活性的启动子。肿瘤特异性启动子的实例包括，但不限于，E2F-1启动子、α-甲胎蛋白启动子、缩胆囊肽启动子、癌胚抗原启动子、C-erbB2/neu癌基因启动子、环氧合酶启动子、CXCR4启动子、HE4启动子、II型己糖激酶启动子、L-网素启动子、MUC1启动子、PSA启动子、存活素启动子、TRP1启动子、和酪氨酸酶启动子。在某些实施方式中，本发明的启动子是E2F-1启动子。在某些实施方式中，E2F-1启动子具有SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列。

上文所述的第一启动子和/或第二启动子可以是组成型启动子。在某些实施方式中，组成型启动子可以是管家基因启动子，其为基本细胞功能所必须的。实例包括，但不限于，β-肌动蛋白启动子、UBC启动子、PGK启动子、TK启动子和EF1A启动子。在某些实施方式中，组成型启动子可以是病毒启动子。实例包括，但不限于，CMV启动子、SV40启动子和CaMV 35S启动子。

在某些实施方式中，本发明的重组核酸组合物包含编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸，其由组成型启动子如CMV启动子调控，以及编码细胞因子的第二多核苷酸，其由肿瘤特异性启动子如E2F-1启动子调控。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽是热休克蛋白。热休克蛋白是当细胞暴露于升高的温度或其它应激状况时表达增加的蛋白家族。已知热休克蛋白在将蛋白折叠成适宜构象中起重要作用。此外，发现热休克蛋白可提呈蛋白片段至免疫系统。

任意热休克蛋白均可作为本发明中的抗原提呈多肽。热休克蛋白的实例包括，但不限于，Hsp10、Hsp20、Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hsp104、Hsp110、α-B-晶体蛋白和葡萄糖调节蛋白。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽是Hsp70。Hsp70蛋白包括，但不限于，Hsp70-1、Hsp70-2、Hsp70-4、Hsp70-5、Hsp70-6、Hsp70-7、Hsp70-8、Hsp70-9、Hsp70-12和Hsp70-14。在某些实施方式中，抗原提呈多肽是Hsp70-1。Hsp70-1蛋白包括，但不限于，Hsp 70-1A和Hsp 70-1B。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽是Hsp90。Hsp90蛋白包括，但不限于，Hsp90-α₁、Hsp90-α₂、Hsp90-β、内源性纤溶酶和TNF受体相关蛋白1。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽是葡萄糖调节蛋白。葡萄糖调节蛋白包括，但不限于，葡萄糖调节蛋白75(Grp75，也称为Hsp70-9)、Grp78(也称为Hsp70-5)、Grp94(也称为内源性纤溶酶)和Grp170。

热休克蛋白的示例性例子及其GenBank登录号列于表1。

表1热休克蛋白的例子

在某些实施方式中，本发明的抗原提呈多肽是完整长度热休克蛋白的片段，其保留了提呈抗原至抗原提呈细胞的功能。在某些实施方式中，本发明的抗原提呈多肽是天然存在的抗原提呈多肽的功能等效物。功能等效物与天然存在的抗原提呈多肽具有结构同源性其具有提呈抗原至抗原提呈细胞的功能。与天然存在的抗原提呈多肽序列相比，天然存在的抗原提呈多肽的功能性等效物可能具有一个或多个保守性或非保守性的氨基酸取代、添加、缺失、修饰或其它改变。

在某些实施方式中，本发明的抗原提呈多肽与一个或多个热休克蛋白具有肽序列同一性。本文中使用的术语“肽序列同一性”指候选序列中的氨基酸残基与模版序列的氨基酸残基具有相同性，其中，如有必要，可进行序列排列和引入罚分以实现在候选序列和模版序列之间相同氨基酸残基的数量最大化，并且不考虑将任意保守性取代作为序列同一性的一部分。

可以通过对两个氨基酸序列的比对确定两个氨基酸序列的同一性。在比对中可以使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定比对时所需的适宜参数，包括为实现被比较的完整序列长度上的最大比对所需的任意算法。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽与Hsp10、Hsp20、Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hsp104、Hsp110、α-B-晶体蛋白、和葡萄糖调节蛋白之一具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的肽序列同一性。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽与Hsp70具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的肽序列同一性。

在某些实施方式中，抗原提呈多肽含有来自一个或多个热休克蛋白的一个或多个功能性结构域。本文中使用的术语“功能性结构域”指具有提呈抗原至抗原提呈细胞功能的热休克蛋白的部分序列，其功能与蛋白上其余的序列和结构无关。在某些实施方式中，抗原提呈多肽含有一个或多个功能性结构域，其来源于Hsp10、Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hsp104、α-B-晶体蛋白、和葡萄糖调节蛋白中的一个或多个热休克蛋白。

在某些实施方式中，核酸组合物含有编码一个或多个热休克蛋白的一个或多个多核苷酸。在某些实施方式中，本发明的多核苷酸可以编码一个、两个、三个或四个热休克蛋白。在某些实施方式中，本发明的组合物含有一个、两个、三个、或四个多核苷酸，其均编码热休克蛋白。在某些实施方式中，组合物含有编码两个或更多热休克蛋白的多核苷酸。

本文中使用的术语“细胞因子”指由细胞分泌且具有免疫调节作用如刺激免疫细胞功能、促进免疫细胞生长或引导免疫细胞至所需位点的蛋白或多肽。

本发明可以使用任意适宜的细胞因子。细胞因子的实例包括，但不限于，集落刺激因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子和促红细胞生成素；干扰素(IFN)如IFNα、IFNβ、IFNγ和IFNω；白介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33和IL-35；肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα和TNFβ；趋化因子如CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2，CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3L1。

在某些实施方式中，本发明的细胞因子能够刺激抗原提呈细胞的功能和/或聚集。在某些实施方式中，细胞因子包括M-CSFs、G-CSFs、GM-CSFs、干细胞因子和促红细胞生成素。在某些实施方式中，本发明的细胞因子是GM-CSFs。GM-CSFs的示例性例子及其GenBank登录号列于表2。

表2GM-CSF示例

在某些实施方式中，本发明的细胞因子是保留了其免疫调节功能的细胞因子片段。

在某些实施方式中，本发明的细胞因子与一个或多个细胞因子具有肽序列同一性。在某些实施方式中，由第二多核苷酸编码的细胞因子与M-CSFs、G-CSFs、GM-CSFs、干细胞因子和促红细胞生成素中的一个或多个具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的肽序列同一性。

在某些实施方式中，由第二多核苷酸编码的细胞因子与GM-CSFs具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的肽序列同一性。

在某些实施方式中，所述细胞因子含有来自一个或多个细胞因子的一个或多个功能性结构域。在某些实施方式中，抗原提呈多肽含有来自一个或多个选自M-CSFs、G-CSFs、GM-CSFs、干细胞因子和促红细胞生成素等细胞因子的一个或多个功能性结构域。

在某些实施方式中，核酸组合物含有编码一个或多个细胞因子的一个或多个多核苷酸。在某些实施方式中，本发明的多核苷酸可以编码一个、两个、三个或四个细胞因子。在某些实施方式中，本发明的组合物含有一个、两个、三个或四个多核苷酸，其均编码细胞因子。在某些实施方式中，组合物含有编码两个或多个细胞因子的多核苷酸。

在某些实施方式中，组合物进一步含有编码细胞毒性基因的第三多核苷酸。本文中使用的术语“细胞毒性基因”指具有诱导或增强细胞毒性包括细胞死亡功能的基因。在某些实施方式中，细胞毒性基因能够改善其它细胞如巨噬细胞对其要裂解的细胞的敏感性。细胞毒性基因的实例包括，但不限于，胸腺嘧啶激酶基因和胞嘧啶脱氨基酶基因。

第三多核苷酸可以操作性地连接至启动子。在某些实施方式中，第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸的表达由相同启动子控制。在某些实施方式中，第一、第二和第三多核苷酸中两个的表达由相同启动子控制。在某些实施方式中，一个或多个IRES序列用于分隔同一多核苷酸分子的多个编码序列，这样多核苷酸分子的编码产物能够分别翻译和表达。

在某些实施方式中，由不同启动子控制第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸的表达。在某些实施方式中，第一多核苷酸操作性地连接至第一启动子，第二多核苷酸操作性地连接至第二启动子，第三多核苷酸操作性地连接至第三启动子。在某些实施方式中，第一、第二和/或第三启动子是真核启动子。在某些实施方式中，第一、第二和/或第三启动子是组成型启动子。在某些实施方式中，第一、第二和/或第三启动子是肿瘤特异性启动子。在某些实施方式中，第一、第二和第三启动子中的至少一个是肿瘤特异性启动子。在某些实施方式中，第一、第二和第三启动子中的至少两个是肿瘤特异性启动子。在某些实施方式中，第一、第二和第三启动子均为肿瘤特异性启动子。

本发明中的核酸序列是公开可用的或是本领域技术人员易于获得的。本发明中的多核苷酸或核酸能够由本领域公知的重组技术制备得到(参见，例如，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)，其全部内容通过引用方式并入本文)。

表达载体

以上所述的多核苷酸可被插入一个或多个表达载体。本发明提供了一种表达载体，其包含编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段和至少一个启动子，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一个。

本文中使用的术语“表达载体”指具有转化或转染细胞能力以及可以在细胞内进行基因表达的多核苷酸载体。本文中使用的术语“片段”指核酸序列的部分或片段。

本发明的表达载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体或粘粒。在某些实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包含来自病毒、质粒、噬菌体或粘粒或其片段的一个或多个基因序列。

在某些实施方式中，本发明中的表达载体是病毒载体。病毒载体可以含有全部或部分病毒基因组。在某个实施方式中，病毒载体含有两种或多种病毒的全部或部分病毒基因组。

在某些实施方式中，病毒载体衍生自腺病毒。腺病毒具有双链线性DNA基因组，其不能被整合至宿主基因组。腺病毒载体的实例包括，但不限于，第一代腺病毒载体(例如，剔除E1a和E1b基因的腺病毒载体，以及剔除E1和E3基因的腺病毒载体)、第二代腺病毒载体(例如，剔除E1和E2基因的腺病毒载体，剔除E1和E4基因的腺病毒载体)、以及裸腺病毒载体，其全部病毒编码序列均被剔除(也称为辅助依赖型腺病毒载体)。

在某些实施方式中，病毒载体衍生自腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒能够感染分裂和非分裂细胞，并且将其基因组整合至宿主细胞。腺相关病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自AAV血清型1、AAV血清型2、AAV血清型3、AAV血清型4、AAV血清型5、AAV血清型6、AAV血清型7、AAV血清型8、AAV血清型9、AAV血清型10、AAV血清型11、和AAV血清型12的载体。

在某些实施方式中，病毒载体衍生自逆转录病毒。逆转录病毒具有RNA基因组，其能够在宿主细胞中通过逆转录酶复制，由RNA基因组产生DNA。逆转录病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自禽白血病病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠源性白血病病毒、牛白血病病毒、大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒、HIV-1(人类免疫缺陷病毒)、HIV-2、SIV(猿免疫缺陷病毒)、EIAV(马传染性贫血病毒)、FIV(猫免疫缺陷病毒)、CAEV(山羊关节炎脑炎病毒)、VMV(维思纳/梅迪病毒)、人泡沫病毒、莫洛尼小鼠白血病病毒、劳氏肉瘤病毒、猫白血病病毒、人嗜T淋巴细胞病毒和猿泡沫病毒的载体。

在某些实施方式中，病毒载体衍生自慢病毒。慢病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自HIV-1、SIV、FIV、CAEV、VMV和EIAV的载体。

在某些实施方式中，病毒载体衍生自甲病毒。甲病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、阿尼昂尼昂病毒、基孔肯雅病毒、马雅罗病毒、罗斯河病毒和巴马森林病毒的载体。

在某些实施方式中，载体衍生自痘病毒。痘病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自牛痘病毒、天花病毒、牛痘病毒、禽痘病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、天花、羊痘病毒、伪牛痘、牛丘疹性口内炎病毒、特纳河痘病毒、雅巴猴肿瘤病毒和传染性软疣病毒的载体。

在某些实施方式中，载体衍生自疱疹病毒。疱疹病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、淋巴隐伏病毒、CMV、疱疹嗜淋巴病毒、玫瑰疹病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的载体。

在某些实施方式中，载体衍生自脊髓灰质炎病毒。脊髓灰质炎病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自脊髓灰质炎病毒血清型1(PV1)、PV2和PV3的载体。

在某些实施方式中，表达载体衍生自杆状病毒。杆状病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、黄杉毒蛾核型多角体病毒(OpMNPV)、中国舞毒蛾多衣壳核型多角体病毒(LdMNPV)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、云杉卷叶蛾核型多角体病毒(CfMNPV)、苹果异形小卷蛾颗粒体病毒(ClGV)、棉铃虫核型多角体病毒(HzSNPV)和苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)的表达载体。

在某些实施方式中，表达载体衍生自乳头瘤病毒。乳头瘤病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自4型牛乳头瘤病毒、2型牛乳头瘤病毒、11型人乳头瘤病毒、5b型人乳头瘤病毒、6b型人乳头瘤病毒、1型牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒(CRPV)、鹿乳头瘤病毒(DPV)、13型人乳头瘤病毒和16型人乳头瘤病毒的载体。

在某些实施方式中，表达载体衍生自多瘤病毒。多瘤病毒载体的实例包括，但不限于，基于虎皮鹦鹉掉羽症病毒(BFPyV)、猴病毒40(SV40)、BK多瘤病毒(BKPyV)、牛多瘤病毒(BPyV)、仓鼠多瘤病毒(HaPyV)、JC多瘤病毒(JCPyV)(JCV)、鼠源性多瘤病毒(MPyV)和嗜B淋巴细胞多瘤病毒(LPV)的载体。

在某些实施方式中，表达载体衍生自细小病毒。细小病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自犬细小病毒、猫传染性粒细胞缺乏症病毒(FPV)、仓鼠细小病毒H1、水貂肠炎病毒(MEV)、鼠源性细小病毒(MVM)、细小病毒LuIII、和猪细小病毒(PPV)的表达载体。

在某些实施方式中，病毒载体衍生自麻疹病毒。在某些实施方式中，病毒载体衍生自水泡性口炎病毒(VSV)。在某些实施方式中，病毒载体衍生自呼肠孤病毒(REO病毒)。在某些实施方式中，病毒载体衍生自新城疫病毒。在某些实施方式中，病毒载体衍生自仙台病毒(SeV)。

在某些实施方式中，病毒载体是衍生自一种或多种选自腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、HSV、VSV、麻疹病毒、REO病毒、新城疫病毒和SeV等病毒的载体。

在某些实施方式中，病毒载体能使细胞裂解。细胞裂解病毒载体能够在宿主细胞中复制并且组装成病毒颗粒，其通过宿主细胞的裂解从细胞中释放。细胞裂解病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、HSV、VSV、麻疹病毒、REO病毒、新城疫病毒、和SeV的载体。

在某些实施方式中，病毒载体含有用于在感染的肿瘤细胞中表达病毒基因的肿瘤特异性启动子。

在某些实施方式中，表达载体是质粒。质粒载体的实例包括，但不限于，pBR322、pTZ19R、pUC18、pUC19、pUC57、pCMV-Script系统和pcDNA3。

在某些实施方式中，表达载体是噬菌体载体。噬菌体载体的实例包括，但不限于，T4噬菌体、λ噬菌体、T7噬菌体、p1噬菌体、pBlueScript II噬菌粒和pBC噬菌粒。

在某些实施方式中，表达载体是粘粒载体。粘粒载体的实例包括，但不限于，SuperCos 1载体、pJC81和pHS262。

本发明的表达载体可以是不整合至宿主细胞的基因组的瞬时表达载体，或者是引入宿主细胞后能够将其基因整合至宿主细胞基因组的稳定表达载体。

在某些实施方式中，表达载体是瞬时表达载体。随着宿主细胞的分裂，瞬时表达载体在宿主细胞中被稀释，这样仅在有限的时间内提供外源性基因的表达。瞬时表达载体的实例包括，但不限于，腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、非整合性质粒或噬菌体。

在某些实施方式中，表达载体是稳定表达载体。稳定表达载体能够在任意随机位点或某些指定位点整合至宿主的基因组。整合的基因能够随着宿主的基因组复制，这样使得基因在宿主细胞中稳定表达。稳定表达载体的实例包括，但不限于，衍生自逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、和整合性质粒的载体。

本发明的表达载体可以是具有复制能力的载体或复制缺陷型载体。在某些实施方式中，表达载体是具有复制能力的载体。本文中使用的术语“具有复制能力的载体”指含有自我复制所必须的序列且能够在宿主细胞中自我复制(不整合至宿主基因组)的载体。在某些实施方式中，具有复制能力的载体可以在某些特定宿主细胞如肿瘤细胞中选择性地或有条件地复制。

在某些实施方式中，具有复制能力的载体可以是病毒载体。具有复制能力的病毒载体的实例包括，但不限于，衍生自腺病毒、牛痘病毒、HSV、VSV、麻疹病毒、REO病毒、新城疫病毒和SeV的载体。在某些实施方式中，具有复制能力的病毒载体含有病毒复制所必须的病毒基因。例如，具有复制能力的腺病毒载体含有腺病毒E1a基因。在某些实施方式中，E1a基因操作性地连接至肿瘤特异性启动子。在某些实施方式中，腺病毒的E1a基因具有核苷酸序列SEQ ID NO：30。

在某些实施方式中，表达载体可以是复制缺陷型载体。本文中使用的术语“复制缺陷型载体”指不能在宿主细胞中自我复制的载体。在某些实施方式中，复制缺陷型载体可以是病毒载体。复制缺陷型病毒载体的实例包括，但不限于，E1a基因功能缺失或缺陷的腺病毒载体。

在某些实施方式中，本发明中的表达载体含有编码抗原提呈肽的第一多核苷酸片段，其中抗原提呈肽是热休克蛋白。在某些实施方式中，表达载体进一步含有编码细胞因子的第二多核苷酸片段，其中细胞因子是GM-CSF。在某些实施方式中，表达载体含有操作性地连接至第一和/或第二多核苷酸片段的一个或多个启动子。

在某些实施方式中，操作性地连接至表达载体的第一和/或第二多核苷酸片段的启动子是真核启动子。在某些实施方式中，启动子是组成型启动子如β-肌动蛋白启动子、UBC启动子、PGK启动子、TK启动子、EF1A启动子、CMV启动子、SV40启动子、和CaMV 35S启动子。在某些实施方式中，启动子是肿瘤特异性启动子如E2F-1启动子、甲胎蛋白启动子、缩胆囊肽启动子、癌胚抗原启动子、C-erbB2/neu癌基因启动子、环氧合酶启动子、CXCR4启动子、HE4启动子、II型己糖激酶启动子、L-网素启动子、MUC1启动子、PSA启动子、存活素启动子、TRP1启动子和酪氨酸酶启动子。

在某些实施方式中，第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的表达由相同启动子控制。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段操作性地连接至一个启动子，其中第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段被IRES序列分离。

在某些实施方式中，第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的表达由不同启动子控制。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段操作性地连接至第一启动子，第二多核苷酸片段操作性地连接至第二启动子。在某些实施方式中，第一启动子是组成型启动子，第二启动子是肿瘤特异性启动子。在某些实施方式中，第一启动子是肿瘤特异性启动子，第二启动子是组成型启动子。在某些实施方式中，第一和第二启动子均为肿瘤特异性启动子。

在某些实施方式中，表达载体进一步含有编码细胞毒性基因的第三多核苷酸片段。第三多核苷酸片段可以操作性地连接至启动子。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段、第二多核苷酸片段和第三多核苷酸片段的表达由相同的启动子控制。在某些实施方式中，第一、第二和第三多核苷酸片段中至少两个的表达由相同的启动子控制。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段和第三多核苷酸片段的表达由相同的启动子控制。在某些实施方式中，第二多核苷酸片段和第三多核苷酸片段的表达由相同的启动子控制。在某些实施方式中，一个或多个IRES序列用于分隔同一多核苷酸分子的多个编码序列，这样多核苷酸分子的编码产物能够分别翻译和表达。

在某些实施方式中，第一多核苷酸片段、第二多核苷酸片段和第三多核苷酸片段的表达由不同启动子控制。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段操作性地连接至第一启动子，第二多核苷酸片段操作性地连接至第二启动子，以及第三多核苷酸片段操作性地连接至第三启动子。在某些实施方式中，第一、第二和/或第三启动子是真核启动子。在某些实施方式中，第一、第二和/或第三启动子是组成型启动子。在某些实施方式中，第一、第二和/或第三启动子是肿瘤特异性启动子。

表达载体能够使用任意适宜的重组技术生产，例如但不限于，涉及使用限制性酶和核酸连接的分子克隆技术，以及涉及两个类似核酸链之间核苷酸序列交换的同源重组技术(详细内容请参见，Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；C.K.Raymond et al，Biotechniques，26(1)：134-141(1999)。例如，可以使用限制性酶将商品化的载体线性化，然后与靶序列连接(例如，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸和/或肿瘤特异性启动子)。靶序列可以使用与靶序列互补的引物，以及含有从含此类靶序列的细胞中分离和纯化的靶序列模板通过PCR反应获得。还可以通过使用产生相应限制性位点的限制性酶从易于获得的载体中消化获得靶序列。可以将连接后获得的载体转化至适宜宿主细胞，在含有选择标记(例如抗生素)的选择培养基中对含有连接载体的宿主细胞进行选择。将所筛选出的宿主细胞扩增，并且可以采用本领域公知的方法如乙醇沉淀法或凝胶提取法从宿主细胞中分离和纯化载体。随后可以使用类似方法将获得的载体插入另一个所关注的序列，或者可以使用限制性酶进行消化以产生供进一步使用的另一个靶序列，或者可以用于与具有类似序列的另一个载体进行同源重组。

本发明中的表达载体可以用于转染宿主细胞，以表达其所编码的序列。另一方面，本发明提供了含有本文所述表达载体的宿主细胞。可供表达载体在其中转染和复制的任意适宜细胞均可以作为宿主细胞。宿主细胞的实例包括但不限于，酵母细胞和哺乳动物细胞。如下文所述的，宿主细胞还可以来自于需要本文所述治疗方法治疗的对象的细胞。可以使用本领域公知的任意适宜方法将表达载体引入宿主细胞，包括但不限于，电穿孔，氯化钙-、氯化锂-、醋酸锂/聚乙烯乙二醇-、磷酸钙-、DEAE-葡聚糖-、脂质体介导的多核苷酸摄取，原生质球，注射，显微注射，基因枪转化法，噬菌体感染，病毒感染或其它已建立的方法。或者，可以将含有所关注的基因序列的表达载体在体外转录，并将得到的mRNA用公知的方法例如注射(参见，Kubo et al.，FEBS Letts.241：119，(1988))导入宿主细胞中进行瞬时表达。例如，可以将表达载体与氯化钙溶液混合，再加入HEPES-缓冲盐，形成与表达载体结合的磷酸钙细沉淀，将其加入细胞培养基后，表达载体连同沉淀一并被细胞摄入。在另一个例子中，可以将表达载体包封于脂质体中并将其引入细胞，当脂质体与细胞膜融合后，其将包封的表达载体释放至细胞中。在又一个例子中，可以通过电击使细胞膜产生微孔，将表达载体递送至细胞中。在又一个例子中，可以将表达载体偶联于惰性固体(例如金颗粒)的纳米粒，然后使用专门的设备如基因枪将其直接射入靶细胞核。在又一个例子中，表达载体本身可以是病毒，其能够感染细胞并在细胞中释放多核苷酸物质。

本文提供的含有表达载体的宿主细胞能够以任意适宜的形式提供。在一个示例性实施方式中，宿主细胞是从细胞培养物中分离的，可以对细胞培养物进行过滤或离心或其它处理，以除去培养基、细胞碎片和/或其它无关物质以获得所需宿主细胞。本领域技术人员可以根据实际情况确定是否需要对宿主细胞进行进一步的纯化处理，以提高其中的表达载体的浓度。可以将组合物制成液体形式或干燥固体形式。

药物组合物

可以将本发明中所述的核酸组合物、表达载体、和宿主细胞用作肿瘤疫苗，以预防和/或治疗肿瘤和/或癌症。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及本文所述的核酸组合物、表达载体、和/或宿主细胞。可以使用本领域公知的方法构建、分离和纯化核酸、表达载体和宿主细胞。本文中使用的术语“药学上可接受的载体”指能够便于本发明的核酸、表达载体、和/或宿主细胞贮存和向对象给药的任意及所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等等。药学上可接受的载体可以包含任意适宜的组分，例如但不限于，盐、脂质体、聚合物赋形剂、胶体或载体颗粒。

在某些实施方式中，药学上可接受的载体是盐，其能够溶解或使本发明中的核酸、表达载体、和/或宿主细胞分散其中。盐的实例包括，但不限于，缓冲盐、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液和聚山梨醇酯溶液。

在某些实施方式中，药学上可接受的载体是脂质体。脂质体是单层或多层囊泡，具有亲脂性材料形成的膜和内部水相部分。可以将本发明的核酸、表达载体、和/或宿主细胞包封于脂质体的水相部分。脂质体的实例包括，但不限于，基于3[N-(N′，N′-二甲基乙胺)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chlo)的脂质体、基于N-(2，3-二油酰基)丙基-N，N，N-三甲胺氯(DOTMA)的脂质体、以及基于1，2-二油酰基-3-三甲胺丙烷(DOTAP)的脂质体。制备脂质体以及将表达载体包封入脂质体的方法是本领域所公知的(参见例如，D.D.Lasic et al，Liposomes in gene delivery，CRC Press出版，1997)。

在某些实施方式中，药学上可接受的载体是聚合物赋形剂，例如但不限于，微球、微囊、聚合物胶束和树枝状大分子。可以采用本领域公知的方法将本发明的核酸、表达载体、和/或宿主细胞包封、粘附、或包衣于基于聚合物的组分(参见例如，W.Heiser，Nonviral gene transfer techniques，Humana Press出版，2004；美国专利6025337；AdvancedDrug Delivery Reviews，57(15)：2177-2202(2005))。

在某些实施方式中，药学上可接受的载体是胶体或载体颗粒如胶体金、纳米颗粒金、二氧化硅纳米颗粒和多段-纳米棒。可以采用本领域公知的任意适宜方法将核酸、表达载体或细胞包衣、粘附、或结合至载体(参见例如，M.Sullivan et al.，Gene Therapy，10：1882-1890(2003)，C.Mclntosh et al.，J.Am.Chem.Soc.，123(31)：7626-7629(2001)，D.Luo et al.，Nature Biotechnology，18：893-895(2000)，和A.Salem et al.，Nature Materials，2：668-671(2003))。

在某些实施方式中，药物组合物可以进一步包含添加剂，例如但不限于，稳定剂、防腐剂和转染促进剂，其可辅助细胞摄入药物。适宜的稳定剂可以包括，但不限于，谷氨酸一钠、甘氨酸、EDTA和白蛋白。适宜的防腐剂可以包括，但不限于，2-苯氧乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟苯甲酯、苯酚、硫柳汞和抗生素。适宜的转染促进剂可以包括，但不限于，钙离子。

在某些实施方式中，药物组合物进一步包含一种或多种抗肿瘤剂。已知具有抗肿瘤或抗癌活性的任意药剂均可用于组合物中。在某些实施方式中，抗肿瘤剂选自化学药剂、多核苷酸、肽、蛋白或其任意组合。

在某些实施方式中，抗肿瘤剂是化学药剂。抗肿瘤化学药剂的实例包括，但不限于，丝裂霉素C、柔红霉素、阿霉素、足叶乙甙、他莫昔芬、紫杉醇、长春新碱和雷帕霉素。

在某些实施方式中，抗肿瘤剂是多核苷酸。抗肿瘤多核苷酸的实例包括，但不限于，反义寡核苷酸如bcl-2反义寡核苷酸、凝聚素反义寡核苷酸和c-myc反义寡核苷酸；以及具有RNA干扰能力的RNA(包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹状RNA(shRNA)和微干扰RNA(miRNA))，如抗-VEGF siRNA、shRNA、或miRNA，抗-bcl-2siRNA、shRNA、或miRNA，以及抗-凝聚素-3siRNA、shRNA、或miRNA。

在某些实施方式中，抗肿瘤剂是肽或蛋白。抗肿瘤肽或蛋白的实例包括，但不限于，抗体，例如，曲妥单抗、利妥昔单抗、依决洛单抗、阿仑单抗、达利珠单抗、尼妥珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗和依决洛单抗，蛋白治疗剂，例如，内皮抑素、血管抑素K1-3、亮丙瑞林、性激素结合球蛋白、和双库尼茨抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤疫苗，其含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸、编码细胞因子的第二多核苷酸、和至少一个启动子，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤疫苗，其含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸、编码细胞因子的第二多核苷酸，其中第一多核苷酸操作性地连接至组成型启动子如CMV启动子，第二多核苷酸操作性地连接至肿瘤特异性启动子如腺病毒E2F-1启动子。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤疫苗，其包含含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段和至少一个启动子的表达载体，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤疫苗，其包含含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段的表达载体，其中第一多核苷酸片段操作性地连接至组成型启动子如CMV启动子，第二多核苷酸片段操作性地连接至肿瘤特异性启动子如腺病毒E2F-1启动子。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤疫苗，其具有包含含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一个启动子的表达载体的宿主细胞，其中至少一个启动子操作性地连接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一个。

另一方面，本发明提供了一种肿瘤疫苗，其具有包含含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、编码细胞因子的第二多核苷酸片段的表达载体的宿主细胞，其中第一多核苷酸片段操作性地连接至组成型启动子如CMV启动子，第二多核苷酸片段操作性地连接至肿瘤特异性启动子如腺病毒E2F-1启动子。

另一方面，本发明提供了一种含有病毒颗粒的肿瘤疫苗，其中病毒基因组含有编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段和编码细胞因子的第二多核苷酸片段。在某些实施方式中，病毒基因组的第一多核苷酸片段操作性地连接至组成型启动子如CMV启动子，病毒基因组的第二多核苷酸片段操作性地连接至肿瘤特异性启动子如腺病毒E2F-1启动子。在某些实施方式中，病毒颗粒是重组的腺病毒。

在某些实施方式中，肿瘤疫苗进一步包含佐剂。本文中使用的术语“佐剂”指当给予本文提供的疫苗组合物时能够非特异性的增强针对疫苗的免疫应答的试剂。

治疗方法

另一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，包括向对象给予包含药学上可接受的载体和本发明中的肿瘤疫苗的药物组合物。

本文中使用的术语“对象”包括动物和人。

可以通过本领域公知的任意适宜途径给予药物组合物，包括但不限于，非肠道、口服、肠内、口腔、鼻内、局部、直肠、阴道、透粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺部和皮下给药途径。

药物组合物可以以适于各给药途径的制剂或制备物的形式向对象给予。适宜药物组合物给药的剂型可以包括，但不限于，溶液剂、分散剂、乳剂、粉剂、混悬剂、气雾剂、喷雾剂、滴鼻剂、基于脂质体的制剂、贴片、植入剂和栓剂。

制剂可以方便地制成单位剂量并且可以采用药物领域公知的任意方法制备。制备这些制剂或组合物的方法包括如下步骤，将本发明的肿瘤疫苗加入一种或多种药学上可接受的载体和任选地一种或多种佐剂。制备此类制剂的方法可以参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19th ed.，A.R.Gennaro(ed)，Mack Publishing Co.，N.J.，1995；R.Stribling et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11277-11281(1992)；T.W.Kim et al.，The Journal ofGene Medicine，7(6)：749-758(2005)；S.F.Jia et al.，Clinical Cancer Research，9：3462(2003)；A.Shahiwala et al.，Recent patents on drug delivery and formulation，1：1-9(2007)；A.Barnes et al.，CurrentOpinion in Molecular Therapeutics 20002：87-93(2000)，其全部内容通过引用并入本文)。

在某些实施方式中，含有本发明的核酸、表达载体和/或宿主细胞的药物组合物通过局部递送至肿瘤部位的靶组织或器官给予所需治疗的对象。在某些实施方式中，使用注射器穿透皮肤将药物组合物直接注射至可触及的肿瘤部位。在某些实施方式中，使用与导管线或其它医疗接入设备连接的植入式给药设备注射药物组合物，其可以与引导至肿瘤部位的成像系统联合使用。在某些实施方式中，在暴露的手术视野中，将有效剂量直接注射至可见的肿瘤部位。在某些实施方式中，使用基因枪直接将药物组合物(例如，载体包被的金颗粒)射入肿瘤部位，其将颗粒直接射入肿瘤(参见，例如，R.Muangmoonchai et al.，Molecular Biology，20(2)：l45-151(2002))。在某些实施方式中，通过静脉注射向对象给予药物组合物。在某些实施方式中，通过口服或透粘膜向对象给予药物组合物。将治疗性核酸导入细胞或动物的方法的参考文献，参见例如，Yang，N-S.，Crit.Rev.Biotechnol.12：335-356(1992)；Anderson，W.F.，Science256：808-813(1992)；Miller，A.S.，Nature 357：455-460(1992)；Crystal，R.G.，Amer.J.Med.92(suppl 6A)：44S-52S(1992)；Zwiebel，J.A.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.618：394-404(1991)；McLachlin，J.R.et al.，Prog.Nucl.Acid Res.Molec.Biol.38：91-135(1990)；Kohn，D.B.et al.，Cancer Invest.7：179-192(1989)。这些参考文献全部内容通过引用并入本文。在某些实施方式中，在治疗有效剂量下给予药物组合物。本文中使用的术语“治疗有效剂量”指给药后能够有效达到期望治疗效果的肿瘤疫苗的量。根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重因素，以及肿瘤疫苗在个体中激发所需应答能力的不同，肿瘤疫苗的治疗有效剂量可以在不同患者间调整。可以通过初始使用较低但安全的剂量随后渐增至更高的剂量，同时监测治疗效果(例如，减少癌细胞生长)以及存在的任何有害副作用的方式确定治疗有效量。

实施例

下文列出实施例的目的是用于帮助对本发明的理解，其不会通过任何方式构成对本申请中权利要求所定义的本发明保护范围的限制。

实施例1：腺病毒载体Ad-HSP-hGM-CSF载体的构建。

如下文所述，构建腺病毒载体Ad-HSP-hGM-CSF。

首先，通过使用IRES片段和E1a片段置换质粒pEGFP中的EGFP片段，构建质粒pIRES-E1a-blunt。使用引物对：

CGGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTAC(正向引物)和

GTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG(反向引物)通过PCR从pIRES质粒(Clontech，Mountain view，CA，目录号#：631605)获得IRES片段。使用BamHI消化该PCR产物。使用引物对：CCGACCGGTGACTGAAAATGAGACATATTATC(正向引物)和CGCTGTACAACCACACACGCAATCACAGG(反向引物)通过PCR从pXC1质粒(Microbix Biosystems Inc.，Ontario，Canada，产品#：PD-01-03；亦可参见McKinnon(1982)Gene 19：33-42)中获得E1a片段。使用AgeI和BsrGI消化该PCR产物。使用BamHI和BsrGI消化质粒pEGFP(Clontech，Mountain view，CA，目录号#：6077-1)，对得到的2.7kb片段进行纯化并将其与获得的IRES片段和E1a片段连接。在载体中E1a序列位于SV40序列的上游。通过限制性酶切对得到的连接产物进行了确认并将其命名为质粒pIRES-E1a-blunt。

然后，通过在质粒pIRES-E1a-blunt中插入含有E2F启动子和人GM-CSF(hGM-CSF)基因的片段构建质粒pE2F-hGM-CSF-IRES-E1a。使用限制性酶Xho I和EcoRI将pIRES-E1a-blunt线性化。使用0.5％的琼脂糖凝胶电泳对5.6kb的线性产物(下文中称为片段A)进行分析，利用凝胶提取法进行纯化。使用Xho I和EcoRI消化质粒pORF9-hGM-CSF(Invivogen，San Diego，CA，目录号#：porf-hgmcsf)，为获得1.3kb片段和2.4kb片段。将含有E2F启动子和hGM-CSF基因的1.3kb片段(下文中称为片段B)纯化，然后与片段A连接。通过限制性酶切对连接产物进行确认并将其命名为质粒pE2F-hGM-CSF-IRES-E1a。在pE2F-hGM-CSF-IRES-E1a中的hGM-CSF具有SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列。利用凝胶提取法对来自质粒pORF9-hGM-CSF的另一2.4kb消化片段(下文称为片段C)也进行纯化备用。

通过在质粒pSL1190(Pharmacia，目录编号27-4386；亦参见Brosius J，DNA，8(10)：759-77(1989))中插入CMV启动子和人热休克蛋白70(hHSP70)基因构建质粒pY1-HSP-amp。使用引物对：CCCAAGCTTATGGCCAAAGCCGCGGC(正向引物)和CGGGATCCACTAGTCTAATCTACCTC(反向引物)通过PCR从人HSP70cDNA克隆(Origene，目录号#SC116766)中获得hHSP70基因。hHSP70基因具有如SEQ IDNO：27所示的核苷酸序列。使用HindIII和BamHI消化该PCR产物。使用引物对GGAATTCCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTG(正向引物)和CCCAAGCTTGTGAGTCGTATTAATTTC(反向引物)通过PCR从pcDNA3.1(Invitrogen，Calsbad，CA，目录号#：V860-20)中获得CMV启动子。使用NdeI和HindIII消化该PCR产物。使用Nde I和BamHI将质粒pSL1190线性化，利用凝胶提取法纯化3.2kb的线性化产物，然后将其与hHSP70片段和CMV启动子片段连接。通过限制性酶切对最终的连接产物进行了确认并将其命名为质粒pY1-HSP-amp。

然后，通过将片段C与含有CMV启动子和hHSP70基因的来自pY1-HSP-amp的片段连接构建质粒pORF9-hHSP70。使用Xho I和EcoR I消化质粒Y1-HSP-amp。利用凝胶提取法纯化得到的含有CMV启动子和hHSP70基因的2.5kb片段，然后将其与片段C连接。通过限制性酶切对获得的连接产物进行确认并将其命名为pORF9-hHSP。

然后，通过将含有CMV启动子、hHSP70基因和SV40pA的片段插入质粒p-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a构建质粒p-CMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a。使用Xho I和Pvu I将质粒p-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a线性化，利用凝胶提取法对线性化的6.7kb产物(下文中称为片段D)进行纯化。使用Xho I和Pac I消化质粒pORF9-hHSP，利用凝胶提取法对得到的含有CMV启动子、hHSP70和SV40pA的3.0kb片段(下文中称为片段E)进行纯化。使用DNA连接酶将片段D和片段E连接。通过限制性酶切对连接产物进行确认并将其命名为pCMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a。

然后，通过将来自pCMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a的CMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a片段插入pShuttle载体构建pShuttle-CMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a。使用Xho I和Ssp I消化p-CMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a，利用凝胶提取法纯化得到含有CMV启动子、hHSP70、SV40pA、E2F启动子、hGM-CSF、IRES以及E1a和SV40的6.0kb片段(下文中称为片段F)。使用EcoR V和Sal I将穿梭质粒pShuttle(Clontech，MountainView，CA，目录号#：K1650-1)线性化，利用凝胶提取法对得到的6.5kb线性产物(下文中称为片段G)进行纯化。使用DNA连接酶将片段F和片段G连接。通过限制性酶切对连接产物进行确认并将其命名为pShuttle-CMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a。

最后，通过将质粒pShuttle-CMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a(称为pShuttle-HSP-hGM-CSF)和pAdEasy-1病毒DNA质粒(Stratagene，La Jolla，CA，目录号#240009)同源重组制备腺病毒载体Ad-HSP-hGM-CSF。使用Pme I对含有左臂同源序列和右臂同源序列的pShuttle-HSP-hGM-CSF线性化，以产生两个同源序列分别位于两个末端的线性化产物。将线性化产物与pAdEasy-1病毒DNA质粒共转化至E.coli菌株BJ5183，pShuttle-HSP-hGM-CSF和pAdEASY之间的同源重组发生在左侧和右侧的同源序列之间。使用卡那霉素抗性对转化体进行筛选，随后对得到的命名为pAd-HSP-hGM-CSF的重组载体进行分离并通过限制性酶切对其进行鉴定。对已鉴定的pAd-HSP-hGM-CSF载体进行测序，以确保在插入的靶基因中没有出现突变。pAd-HSP-hGM-CSF结构的示意图见图1。使用Pac I对pAd-HSP-hGM-CSF载体进行消化，以获得含有腺病毒DNA和两个末端带有反向末端重复序列(ITR)的插入基因的消化产物。将消化产物转染至HEK293细胞，以制备生产腺病毒的293细胞，在其中回收腺病毒Ad-HSP-hGM-CSF。腺病毒Ad-HSP-hGM-CSF基因组结构示意图见图2。

实施例2：腺病毒载体Ad-HSP-mGM-CSF的构建。

如下文所述，构建腺病毒载体Ad-HSP-mGM-CSF。

首先，通过使用IRES片段和E1a片段置换质粒pEGFP中的EGFP片段构建质粒pIRES-E1a-blunt。使用引物对：

CGGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTAC(正向引物)和GTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG(反向引物)通过PCR从pIRES质粒(Clontech，Mountain view，CA，目录号#：631605)获得IRES片段。使用BamHI消化该PCR产物。使用引物对：CCGACCGGTGACTGAAAATGAGACATATTATC(正向引物)和CGCTGTACAACCACACACGCAATCACAGG(反向引物)通过PCR从pXC1质粒(Microbix Biosystems Inc.，Ontario，Canada，产品#：PD-01-03；亦可参见McKinnon(1982)Gene 19：33-42)中获得E1a片段。使用AgeI和BsrGI消化该PCR产物。使用BamHI和BsrCI消化质粒pEGFP(Clontech，Mountain view，CA，目录号#：6077-1)，对得到的2.7kb片段进行纯化并将其与获得的IRES片段和E1a片段连接。在载体中E1a序列位于SV40序列的上游。通过限制性酶切对得到的连接产物进行确认并将其命名为质粒pIRES-E1a-blunt。

然后，通过使用来自质粒pORF9-mGM-CSF的小鼠GM-CSF基因(mGM-CSF)置换质粒pORF9-hGM-CSF中的hGM-CSF基因构建质粒pORF9-mGM-CSF-com。使用SgrA I和Nhe I消化质粒pORF-hGM-CSF(来自Invivogen，San Diego，CA，目录号#：porf-hgmcsf)，利用凝胶提取法纯化得到的3.2kb片段(下文中称为片段H)。使用Age I和Nhe I消化质粒pORF-mGM-CSF(来自Invivogen，San Diego，CA，目录号#：porf-mgmcsf)，利用凝胶提取法纯化得到的含有mGM-CSF基因的452bp片段(下文中称为片段I)。使用DNA连接酶将片段H和片段I连接。通过限制性酶切对连接产物进行确认并将其命名为质粒pORF-mGM-CSF-com。

然后，通过将含有E2F启动子和mGM-CSF基因的片段插入质粒pIRES-E1a-blunt构建质粒pE2F-mGM-CSF-IRES-E1a。使用限制性酶Xho I和EcoRI将pIRES-E1a-blunt线性化。使用0.5％的琼脂糖凝胶电泳对5.6kb的线性化产物(下文中称为片段A’)进行分析，利用凝胶提取法进行纯化。使用Xho I和EcoRI消化质粒pORF9-mGM-CSF-com，消化结果为获得1.3kb片段和2.4kb片段。将含有E2F启动子和mGM-CSF基因的1.3kb片段(下文中称为片段B’)纯化，然后与片段A’连接。通过限制性酶切对连接产物进行确认并将其命名为质粒pE2F-mGM-CSF-IRES-E1a。在pE2F-mGM-CSF-IRES-E1a中的mGM-CSF具有SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。利用凝胶提取法对来自质粒pORF9-hGM-CSF的另一2.4kb消化片段(下文中称为片段C’)也进行纯化备用。

通过将CMV启动子和人热休克蛋白70(hHSP70)基因插入质粒pSL1190(Pharmacia，目录编号27-4386；亦参见Brosius J，DNA，8(10)：759-77(1989))构建质粒pY 1-HSP-amp。使用引物对：CCCAAGCTTATGGCCAAAGCCGCGGC(正向引物)和CGGGATCCACTAGTCTAATCTACCTC(反向引物)通过PCR从人HSP70cDNA克隆(Origene，目录号#SC116766)中获得hHSP70基因。hHSP70基因具有如SEQ IDNO：27所示的核苷酸序列。使用HindIII和BamHI消化该PCR产物。使用引物对GGAATTCCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTG(正向引物)和CCCAAGCTTGTGAGTCGTATTAATTTC(反向引物)通过PCR从pcDNA3.1(Invitrogen，Calsbad，CA，目录号#：V860-20)中获得CMV启动子。使用NdeI和HindIII消化该PCR产物。使用Nde I和BamHI将质粒pSL1190线性化，利用凝胶提取法纯化3.2kb的线性化产物，然后将其与hHSP70片段和CMV启动子片段连接。通过限制性酶切对最终的连接产物进行确认并将其命名为质粒pY1-HSP-amp。

然后，通过将片段C’与含有CMV启动子和hHSP70基因的来自pY1-HSP-amp的片段连接构建质粒pORF9-hHSP70。使用Xho I和EcoR I消化质粒Y1-HSP-amp。利用凝胶提取法纯化得到的含有CMV启动子和hHSP70基因的2.5kb片段，然后将其与片段C’连接。通过限制性酶切对获得的连接产物进行确认并将其命名为pORF9-hHSP。

然后，通过将含有CMV启动子、hHSP70基因和SV40pA的片段插入质粒p-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a构建质粒p-CMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a。使用Xho I和Pvu I将质粒pE2F-mGM-CSF-IRES-E1a线性化，利用凝胶提取法纯化线性化的6.7kb产物(下文中称为D’)。使用Xho I和Pac I消化质粒pORF9-HSP，利用凝胶提取法纯化得到的含CMV启动子、hHSP70和SV40pA的3.0kb片段(下文中称为E’)。使用DNA连接酶将片段D’和片段E’连接。通过限制性酶切对获得的连接产物进行确认并将其命名为pCMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a。

然后，通过将来自pCMV-hHSP70-E2F-hGM-CSF-IRES-E1a的CMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a片段插入pShuttle载体构建pShuttle-CMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a。使用Xho I和Ssp I消化p-CMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a，利用凝胶提取法纯化得到的含有CMV启动子、hHSP70、SV40pA、E2F启动子、mGM-CSF、IRES以及E1a和SV40pA的6.0kb片段(下文中称为片段F’)。使用EcoR V和Sal I将穿梭质粒pShuttle(Clontech，Mountain View，CA，目录号#：K1650-1)线性化，利用凝胶提取法对得到的6.5kb线性化产物(下文中称为片段G’)进行纯化。使用DNA连接酶将片段F’和片段G’连接。通过限制性酶切对连接产物进行确认并将其命名为pShuttle-CMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a。

最后，通过将质粒pShuttle-CMV-hHSP70-E2F-mGM-CSF-IRES-E1a(称为pShuttle-HSP-mGM-CSF)和pAdEasy-1病毒DNA质粒(Stratagene，La Jolla，CA，目录号#240009)同源重组制备腺病毒载体Ad-HSP-mGM-CSF。使用Pme I对含有左臂同源序列和右臂同源序列的pShuttle-HSP-mGM-CSF线性化，以产生带有两个同源序列分别位于两个末端的线性化产物。将线性化产物与pAdEasy-1病毒DNA质粒共转化至E.coli菌株BJ5183，pShuttle-HSP-mGM-CSF和pAdEASY之间的同源重组发生在左侧和右侧的同源序列之间。使用卡那霉素抗性对转化体进行筛选，随后对得到的命名为pAd-HSP-mGM-CSF的重组载体进行分离并通过限制性消化对其进行鉴定。对已鉴定的pAd-HSP-mGM-CSF载体进行测序，以确保在插入的靶基因中没有出现突变。使用Pac I对pAd-HSP-mGM-CSF载体进行消化，以获得含有腺病毒DNA和两个末端带有反向末端重复序列(ITR)的插入基因的消化产物。将消化产物转染至HEK293细胞，以制备生产腺病毒的293细胞，在其中回收腺病毒Ad-HSP-mGM-CSF。腺病毒Ad-HSP-mGM-CSF基因组结构的示意图见图3。

实施例3：在腺病毒感染的细胞中GM-CSF和HSP70蛋白的表达

使用腺病毒载体Ad-HSP-mGM-CSF分别感染包括Hela和HepB细胞的人细胞系，以及鼠源性B16细胞。

在MOI为10(病毒滴度10⁷)、100(病毒滴度10⁸)、或1000(病毒滴度10⁹)下，对各类型细胞中腺病毒载体Ad-HSP-mGM-CSF进行检测。对于各M0I，将细胞分别与腺病毒载体孵育12小时、24小时、36小时、和48小时。在各时间点，每种类型的细胞均收集三孔细胞。这样，每种类型的细胞均有36孔待测样品。对于各类型的细胞，还包括另外3孔细胞作为未感染对照，在孵育12小时后收集未感染对照。M0I为孔中的病毒滴度除以孔中的细胞数得到的比率。采用血细胞计数器测定法计算或测定细胞数。通过病毒滴度检测对病毒复制进行确认。

如下文所述进行实验。在培养板中培养细胞。当细胞达到90％汇合度时，使用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤细胞，然后使用3ml胰酶消化液消化2-3分钟。当贴壁细胞脱壁后，将10ml完全Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基加入培养板使细胞悬浮。计数细胞悬液中的细胞数，使用完全DMEM稀释细胞悬液，使其终浓度为10⁶个细胞/ml。然后将各类型细胞的细胞悬液以1ml/孔的量加入12孔板中。

培养细胞直至其达到充分汇合。弃去培养基，以MOI为10、100、或1000在细胞培养板中加入1ml/孔经完全DMEM稀释的病毒溶液。在第12小时、第24小时、第36小时和第48小时，分别收集三孔各MOI下的各类型细胞。将细胞培养基收集至1.5ml离心管，以供随后测定上清液中的蛋白表达。然后使用PBS对孔中的余留细胞轻柔洗涤3次，然后经胰酶消化并收集至单独的离心管。在2500rpm下将收集得到的细胞离心5分钟，弃去上清液后保存在80℃冰箱中。

经过48小时实验期，当所有的样品收集和制备后，随后进行蛋白提取。使用冰冷(4℃)的去离子水将5×提取试剂稀释至1×并加入蛋白酶抑制剂混合物片(1片/10ml提取溶液)。将提取溶液按照10⁶-10⁷个细胞：1ml蛋白提取溶液的比率加入到收集得到的细胞，将细胞重悬至不含有任何明显细胞团的均质溶液。将重悬细胞置于冰上30分钟，间歇性振荡或短期超声处理。然后将细胞在4℃、21000g条件下离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中，其含有总的蛋白量。

使用ELISA试剂盒确定mGM-CSF和hHSP70的表达水平。使用购自R&D Systems(目录号#：MGM00)的Mouse GM-CSF Immunoassay确定mGM-CSF的表达。使用购自Assay Designs(目录号#：EKS-700B)的Hsp70ELISA试剂盒确定hHSP70的表达。依据ELISA试剂盒的说明书测定mGM-CSF和hHSP70的浓度。结果见图4(a)、4(b)和4(c)，以及图5(a)、5(b)和5(c)。

mGM-CSF的表达水平见图4。mGM-CSF在所有三种类型的细胞中均有表达，mGM-CSF在Hep3B细胞中的表达量最高，在B16细胞中的表达量最低。在所有这三种细胞类型中，表达水平随着孵育时间的增加而升高，Hep3B细胞的表达水平在约48小时达到最高。在同一时间点，MOI从10增至1000时，mGM-CSF的表达量随着MOI的增加而升高。在各时间点，上清液中的蛋白表达水平高于细胞团中的，表明蛋白是分泌型的。

hHSP70的表达水平见图5。hHSP70在所有三种类型的细胞中均有表达，hHSP70在Hep3细胞中的表达量最高，在B16细胞中的表达量最低。在B16细胞中，除了第36小时MOI 100条件下收集的样品外，未检测到其表达。这可能是由于在鼠源性细胞中人腺病毒的感染性较低所致。在所有这三种细胞类型中，表达水平随着孵育时间的增加而升高，Hep3B细胞的表达水平在约24小时达到最高。在同一时间点，MOI从10增至1000时，hHSP70的表达量随着MOI的增加而升高。在Hep3B细胞中，在细胞团中的表达水平高于在上清液中的。在Hela细胞中，在上清液中的表达水平高于在细胞团中的。

实施例4：在细胞中腺病毒载体的扩增

在T形瓶中，在HEK293细胞中扩增病毒载体并使用CsCl梯度离心进行纯化。利用病毒滴度检测和分光光度法确定病毒收率。将病毒在-70℃条件下保存备用。

实施例5：Ad-HSP-hGM-CSF和其它病毒载体的细胞毒性比较

在不同肿瘤细胞系中对腺病毒载体Ad-HSP-hGM-CSF与其它病毒载体的细胞毒性进行比较，其他病毒载体包括A549(腺癌人肺泡基底上皮细胞，购自复旦大学，上海，中国)、Hepal-6(小鼠肝癌细胞，购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，武汉，中国)、MCF-7(人乳腺癌细胞，购自复旦大学，上海，中国)、TCa8113(人舌癌细胞，购自中国科学院，上海)、ACC-M(唾液腺性肺癌高转移细胞，购自CCTCC，武汉，中国)、HeLa(人宫颈癌细胞，购自复旦大学，上海，中国)、Hep3B(人肝癌细胞，购自复旦大学，上海，中国)和Lncap(雄激素敏感性人前列腺癌细胞，购自中国科学院，上海)。对Ad-GM-CSF(通过质粒pORF9-hGM-CSF和pAdEasy-1病毒DNA质粒之间的同源重组构建)、ONYX015(E1B-55k剔除的腺病毒，其选择性地在p53缺陷型癌细胞中复制)(千叶大学惠赠)和Ad-CMV-HSP(上海三维生物技术有限公司惠赠)进行平行检测，以对细胞毒性作用进行比较。

在75cm²细胞培养瓶中培养细胞，直至达到90％汇合度。弃去培养基，加入2ml胰酶溶液对细胞进行消化。当细胞脱壁后，加入10ml含2％胎牛血清的培养基使细胞悬浮。计数细胞悬液中的细胞数，使用含2％胎牛血清的培养基将细胞悬液稀释至终浓度2×10⁵个细胞/ml。采用血细胞计数器测定法计算或测定细胞数。然后将细胞悬液以50μl/孔加入到96-孔板。将96-孔板在CO₂培养箱中培养1天。

用含2％胎牛血清的培养基稀释病毒溶液，以MOI为300、100和30加入细胞培养板中，50μl/孔。对于各MOI，感染均设置3复孔。空白对照含有100μl培养基/孔。将96-孔板在CO₂培养箱中孵育6天。

使用MTS检测试剂盒确定在各细胞类型中各载体的细胞毒性：CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)购自Promega(目录号#G3580)。简言之，将各类型的细胞在96-孔板中接种，在37℃培养直至达到95％汇合度。将相应MOI的病毒加入培养物，在37℃下继续培养。按照v/v为1∶5的比率将AQueous One Solution Reagent加入各培养物。继续在37℃培养1-4小时，使用分光光度计在490nm测定各板的吸收。用病毒感染后细胞测得的光密度除以未经感染的对照细胞测得的光密度计算各类型细胞的细胞活力。

结果见图6-8。在所有检测的细胞类型和所有检测的MOI中，Ad-HSP-hGM-CSF对抑制肿瘤细胞的生长均显示出显著的活性。经Ad-HSP-hGM-CSF处理后，TCa8113、ACC-M、HeLa、Hep3B和Lncap细胞均被杀死50％以上，而经过处理后其它细胞被杀死少于50％。Ad-HSP-hGM-CSF的抗肿瘤活性与载体Ad-GM-CSF、ONYX015和Ad-CMV-HSP相当，并在很多情况下比载体Ad-GM-CSF、ONYX015和Ad-CMV-HSP更好。

实施例6：在不同肿瘤细胞中比较Ad-HSP-mGM-CSF的细胞毒性

在不同的人肿瘤细胞系中对重组溶瘤腺病毒Ad-HSP-mGM-CSF的细胞毒性进行检测：HEK293、Hep3B、A549、7402(肝细胞癌细胞系，购自肝癌研究所，复旦大学，上海，中国)、7721(肝细胞癌细胞系，购自肝癌研究所，复旦大学，上海，中国)和Hela，上述细胞均在在RPMI 1640完全培养基中培养。使用正常细胞系(2BS)作为对照。使用HEK293细胞系作为阳性对照，因为该细胞已经腺病毒E1基因转化，因而其能够支持任意类型的腺病毒生长。对特异性肿瘤杀伤作用进行比较。

将各细胞系均分为5组，分别使用0.1、1、10、100和1000MOI的Ad-HSP-mGM-CSF感染。

以与实施例5中所描述的相同的方式进行该实验。如实施例5中所描述的使用MTS检测试剂盒确定细胞毒性。用病毒感染后细胞测得的光密度除以未经感染的对照细胞测得的光密度计算各细胞类型的细胞活力。如图9所示，腺病毒载体的细胞毒性在正常细胞与肿瘤细胞之间存在差异。当使用MOI 1000的病毒感染时，2BS细胞的细胞活力在80％以上。然而，肿瘤细胞的活力随病毒感染MOI的增加而降低。对于A549细胞和7402细胞，在MOI为100时，病毒开始显示出显著的细胞毒性，当MOI继续增加时，细胞活力迅速降低。对于Hep3B细胞、7721细胞和Hela细胞、以及阳性对照HEK293细胞，在MOI为10时，病毒开始显示出显著的细胞毒性，当MOI继续增加时，细胞活力迅速降低。

实施例7：在小鼠中对肿瘤的缩小作用

在C57小鼠B16肿瘤模型中对Ad-HSP-mGM-CSF的治疗作用进行了研究。共设置了三个实验组，包括高剂量组、中剂量组和低剂量组。还包括空白对照组(10％甘油PBS)和阳性对照组(2mg/kg顺铂(Cisplatin))。各剂量组如表3所示。

表3

将B16细胞皮下接种至C57小鼠的腹部，接种量为每只小鼠7×10⁵个细胞(总量为3.85×10⁷个B16细胞)。在接种后第8天，肿瘤体积达到阈值(50-70mm³)，准备使用这些动物进行研究。

选择具有适宜的肿瘤大小和形状，无并发肿瘤以及状态良好的长有B16肿瘤的C57小鼠。根据肿瘤大小将小鼠分级，然后将其随机分组。在开始给药前一天，通过在外部使用游标卡尺测定皮下肿瘤的长度和宽度在体确定各只小鼠的肿瘤大小。第一天的给药体积为肿瘤大小的25％，随后几天继续使用相同体积。顺铂的给药体积为0.01ml/g，浓度为0.2mg/ml。

通过连续5天每日一次瘤内注射Ad-HSP-mGM-CSF病毒分别给予小鼠预先确定的药物剂量。阳性对照通过腹腔途径连续5天每日一次给药。空白对照组的动物通过瘤内注射给予10％甘油PBS，连续5天每日一次给药。每三天通过在外部使用游标卡尺测定皮下肿瘤的长度和宽度在体确定各只小鼠的肿瘤大小，在相同的时间间隔测定体重。当肿瘤大小超过2000mm³时，处死小鼠。

在不同时间点使用下述公式计算各实验组的肿瘤大小：

研究结果见图10。低剂量组的平均肿瘤大小几乎与空白对照相同，表明低剂量几乎没有肿瘤抑制作用。中剂量组的平均肿瘤大小低于空白对照，但高于阳性对照，表明中剂量组具有中等肿瘤抑制作用。高剂量组的平均肿瘤大小优于阳性对照组，表明高剂量对肿瘤生长具有显著的抑制作用。还记录了小鼠的生存期，在研究结束时，高剂量组的生存率最高，低剂量组的生存率最低。结果显示，病毒的肿瘤抑制作用具有剂量依赖性。结果还表明生存曲线与肿瘤大小曲线基本一致。

关于本文中使用的任意复数和/或单数形式的术语，本领域技术人员能够根据上下文和/或其应用将复数形式转化为单数形式和/或将单数形式转化为复数形式。

此外，当本发明的特征或方面以马库什群组的形式描述时，本领域技术人员将认可本发明还描述了马库什群组中的任意各成员或成员亚群。

尽管本发明已公开了多个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本发明，本发明的实际保护范围和主旨以下述权利要求表示。

Claims (21)

1.一种用于预防或治疗肿瘤和癌症的组合物，所述组合物包含：

编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸，其中所述抗原提呈多肽选自Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hsp104、Hsp110和葡萄糖调节蛋白，其中所述葡萄糖调节蛋白选自Grp75、Grp78、Grp94和Grp170；

编码细胞因子的第二多核苷酸，其中所述细胞因子选自巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子；

和第一启动子和第二启动子，

其中所述第一多核苷酸操作性地连接至控制第一多核苷酸表达的第一启动子，所述第二多核苷酸操作性地连接至控制第二多核苷酸表达的第二启动子。

2.一种用于预防或治疗肿瘤和癌症的表达载体，所述表达载体包含：

编码抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段，其中所述抗原提呈多肽选自Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hsp104、Hsp110和葡萄糖调节蛋白，其中所述葡萄糖调节蛋白选自Grp75、Grp78、Grp94和Grp170；

编码细胞因子的第二多核苷酸片段，其中所述细胞因子选自巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子；

和第一启动子和第二启动子，

其中所述第一多核苷酸操作性地连接至控制第一多核苷酸表达的第一启动子，所述第二多核苷酸操作性地连接至控制第二多核苷酸表达的第二启动子。

3.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述热休克蛋白是Hsp70。

4.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其进一步包括操作性地连接至第三启动子的编码细胞因子的第三多核苷酸。

5.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第一启动子是组成型启动子和所述第二启动子是肿瘤特异性启动子。

6.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第一启动子或第二启动子是真核启动子。

7.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第一启动子或第二启动子中的至少一个是肿瘤特异性启动子。

8.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第二启动子是肿瘤特异性启动子。

9.根据权利要求2所述的表达载体，其中所述表达载体选自质粒、病毒、噬菌体和粘粒。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其中所述病毒载体是衍生自一种或多种病毒的载体，所述病毒选自腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、泡性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒和仙台病毒。

12.根据权利要求10所述的表达载体，其中所述病毒载体是复制型载体。

13.根据权利要求12所述的表达载体，其中所述病毒载体是含有E1a基因的腺病毒载体。

14.根据权利要求13所述的表达载体，其中所述病毒载体含有肿瘤特异性启动子，所述E1a基因操作性地连接至所述肿瘤特异性启动子。

15.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第一启动子是CMV启动子，所述第二启动子是E2F-1，所述抗原提呈多肽是HSP70，所述细胞因子是GM-CSF。

16.根据权利要求15所述的组合物或表达载体，其中所述E2F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。

17.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第一多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11或27所示。

18.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的表达载体，其中所述第二多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、28或31所示。

19.分离的宿主细胞，所述细胞包含如权利要求1所述的组合物或如权利要求2所述的表达载体。

20.药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，以及如权利要求1所述的组合物、如权利要求2所述的表达载体和如权利要求19所述的分离的宿主细胞中的任意一种。

21.根据权利要求20所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤和癌症的药物中的用途。