CN101643749A - 腺相关病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种腺相关病毒载体，包括能够有效干扰乙型肝炎病毒表面抗原表达的靶位点及相关顺序，编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因(shRNA)顺序，人工a干扰素编码基因和由不同启动子调控人工a干扰素编码基因的表达盒。该腺相关病毒载体，充分结合了shRNA、a干扰素和腺相关病毒载体三方面的优势，能够抑制乙型肝炎病毒的复制能力和肝癌细胞增殖。本发明还提供了一种腺相关病毒载体的制备方法和应用。

Description

腺相关病毒载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种具有抑制乙型肝炎病毒复制能力和肝癌细胞生长和转移的腺相关病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是我国最主要的传染病，据统计目前乙肝病毒携带者约1.5亿，占全国总人口的百分之十以上。大量临床和亚临床乙肝患者的存在，不仅严重损害了人民群众的身体健康，造成巨大的社会劳动力丧失及社会健康成本增加。同时，许多资料证实，乙肝病毒也是引起原发性肝细胞癌的主要原因之一。而肝细胞癌是预后最差的恶性肿癌之一，目前无有效的治疗方法，五年生存率低于5％。

乙肝疫苗的应用，对未感染乙肝病毒的人群起到了有效的保护作用，但对感染者无治疗作用。目前对乙肝患者仅有的治疗手段为a干扰素和类核苷物，“Lamivudine”和“Adefovir dipivoxil”，但临床效果仍不理想。

siRNA现象为近年生物学上一革命性的发现，它通过特异性地与靶基因结合，选择性抑制靶基因表达，从而干扰靶基因的功能。目前的研究证实，siRNA技术可以应用到许多病毒性疾病，如HBV、HCV，HIV等，干扰相关病毒的复制，以及肿瘤性疾病，如肝癌、鼻咽癌、肺癌等，或选择性杀伤肿瘤细胞，增强机体的免疫能力，达到治疗病毒性疾病或肿瘤的目的。

乙型肝炎病毒为双链DNA病毒，其基因物质相对于突变频繁的HIV等病毒，十分保守，突变少。乙型肝炎病毒少突变的生物学特性特别适合siRNA治疗。各国实验室对乙肝病毒进行了大量的体外及动物体内siRNA抑制有效性研究，是利用siRNA干扰技术进行人体临床试验准备最充足的一个病毒。

由于siRNA干扰在动物体内实验的结果令人十分鼓舞，加之目前对病毒性疾病、肿瘤性疾病缺乏有效的治疗措施，siRNA干扰技术被广泛应用于病毒性疾病及恶性肿瘤的治疗方面，因此，仅在美国就有115家商业性公司从事siRNA方面的研究(www.researchandmarkets.com)，在众多公司中，Sirna、RNAiTechnologies、OligoEngine、Ambion和Stratagen为其中的佼佼者。

干扰素(interferon)的发现和研究已有五十多年的历史。干扰素为脊椎动物在外源性抗原的刺激下免疫系统所产生的一组糖蛋白。不同亚型干扰素对外源性抗原如病毒、病菌，内源性的肿瘤细胞有着不同程度的非特异性的杀伤和抑制作用，已被应用于临床，并被证实是有效的。

近年来，随着高效干扰素(RECOMBINANT SUPER COMPOUNDINTERFERON，rSIFN-co)的发现和其对病毒、肿瘤细胞的高效杀伤作用，引起医学界对干扰素抗病毒和抗肿瘤的再认识。

高效干扰素是根据不同类型干扰素氨基酸顺序的保守性，人工产生的一种新的干扰素，有别于普通干扰素，可产生超强的抗病毒及抗肿瘤作用。目前在国内外都有高效干扰素进入临床试验阶段。但都为利用基因工程技术在大肠杆菌等原核细胞中表达、进而纯化的干扰素。

腺相关病毒(AAV)载体是目前唯一一个被美国食品和药物管理局(FDA)批准可以用于临床基因治疗的载体，AAV载体最大的特点是：不致病，十分安全；根据血清型的不同，可选择性感染不同类型的组织或细胞；可以较长时间稳定表达所携带的基因；通常情况下重组的AAV以核外染色体形式存在，野生型AAV的整合部位也很清楚，不会诱发被感染的细胞癌变。但是，AAV载体的生产和纯化技术复杂，要求很高的技术和经验，较难推广。

因此，需要发明一种新的腺相关病毒载体以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种腺相关病毒载体，充分结合shRNA、a干扰素和腺相关病毒载体三方面的优势，能够抑制乙型肝炎病毒的复制能力和肝癌细胞生长和转移。

本发明还提供了一种腺相关病毒载体的制备方法和应用。

本发明提供了一种腺相关病毒载体，包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因shRNA和人工a干扰素编码基因。

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的腺相关病毒的载体非选择性或选择性在肝组织或肝癌细胞中表达。

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的腺相关病毒的载体包括各种血清型，特别是1型、2型、8型及嵌合型。

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因shRNA的序列为GATCCCCCCTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAATTTTTGGAAA(SEQ ID NO.2)或GATCCGTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTTTTTTGGAAA(SEQ ID NO.3)。

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的人工a干扰素编码基因的序列为atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctcctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccattctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga(SEQID NO.5)或其互补序列。

作为本发明腺相关病毒载体的优选实施方式，所述的人工a干扰素的氨基酸序列为M A L T F A L L V A L L V L S C K S S C S V G C D L P Q T H S L G NR R A L I L L A Q M R R I S P F S C L K D R H D F G F P Q E E F D G N Q F Q KA Q A I S V L H E M I Q Q T F N L F S T K D S S A A W D E S L L E K F Y T E LY Q Q L N D L E A C V I Q E V G V E E T P L M N V D S I L A V K K Y F Q R I TL Y L T E K K Y S P C A W E V V R A E I M R S F S L S T N L Q E R L R R K E(SEQ ID NO.4)。

本发明提供了一种腺相关病毒的载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计合成抗乙型肝炎病毒的siRNA；

(2)构建表达抗乙型肝炎病毒的siRNA的真核表达载体和病毒表达载体，在真核表达载体和病毒表达载体中表达抗乙型肝炎病毒的siRNA；

(3)设计合成针对乙型肝炎病毒的a干扰素；

(4)构建表达抗乙型肝炎病毒的a干扰素的真核表达载体和病毒表达载体，其特征在于采用可以在多种组织中表达的启动子(包括人巨细胞病毒基因启动子CMV或人延长因子基因the human elongation factor启动子，EF1)，选择性在肝细胞中表达的启动子(包括白蛋白Albumin基因启动子)，以及选择性在肝癌细胞中表达的启动子(甲胎蛋白基因启动子AFP)，调控a干扰素非选择性或选择性在肝细胞、或肝癌细胞中表达；

(5)将步骤(2)得到的抗乙型肝炎病毒的siRNA和步骤(4)得到的抗乙型肝炎病毒和肝癌细胞的a干扰素的基因与腺相关病毒的载体重组，得到抗乙型肝炎病毒的siRNA和抗乙型肝炎病毒及肝癌细胞的a干扰素的腺相关病毒载体。

本发明涉及一种腺相关病毒载体在抑制乙肝病毒复制和肝癌细胞生长和转移方面的应用，所述的腺相关病毒载体包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因(shRNA)和人工a干扰素编码基因。

本发明一种腺相关病毒载体在制备抗肝癌生长和转移药物的应用，所述的腺相关病毒载体包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因(shRNA)和人工a干扰素编码基因。

本发明一种腺相关病毒载体，充分结合shRNA、a干扰素和腺相关病毒载体三方面的优势，能够抑制乙型肝炎病毒的复制能力和肝癌细胞生长和转移

附图说明

图1为本发明腺相关病毒载体实施例1中含有干扰乙型肝炎病毒表面抗原表达的siRNA的表达盒的示意图；

图2-1为本发明腺相关病毒载体实施例1中联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的腺相关病毒载体结构示意图；

图2-2为本发明腺相关病毒载体实施例1中联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的另一个腺相关病毒载体结构示意图；

图2-3为本发明腺相关病毒载体实施例1中联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的另一个腺相关病毒载体结构示意图；

图2-4为本发明腺相关病毒载体实施例1中联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的另一个腺相关病毒载体结构示意图；

图3为本发明腺相关病毒载体实施例3的Luc基因在肝区表达的示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

本发明中所用的“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的“蛋白质核酸”(PNA)。它还包括含有修饰碱基的核酸。这里所用的核酸序列的“互补序列”是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。

本发明旨在构建一种含有针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因(shRNA)顺序和新型α干扰素的腺相关病毒载体，赋予这种新型腺相关病毒载体具有抑制乙肝病毒复制及抑制肝癌细胞生长和转移的能力，以及构建该载体的具体方法和该载体的用途。

实施例1构建本发明的腺相关病毒载体的方法

1、能够干扰乙型肝炎病毒表面抗原编码基因表达的siRNA靶序列的设计和筛选：我们首先确定以19-22个碱基作为siRNA靶序列长度，筛选原则是能够特异地与编码乙型肝炎病毒表面抗原基因所转录mRNA配对并结合，并能够选择性使之降解，导致乙型肝炎病毒表面抗原基因表达产物下调及失活。我们根据乙肝病毒中表面抗原编码基因的碱基顺序，寻找了多个长度分别为19，20，21，22个碱基的靶序列。最有效的能够干扰乙型肝炎病毒表面抗原表达的靶位点UUACUAGUGCCAUUUGUUC和siRNA序列：AAUGAUCACGGUAAACAAG(SEQ ID NO.1)。

2、编码干扰乙型肝炎病毒表面抗原表达的siRNA的人工基因的设计与合成：为了让siRNA能够人工产生且稳定，我们采用了shRNA的方式。shRNA由编码针对siRNA靶序列的正义和反义顺序组成，在正义和反义顺序间加入了与正义和反义顺序不配对的碱基顺序，我们选择了7-9个碱基，使人工合成的siRNA编码基因能够自行折叠并配对，形成发卡样结构，保证其稳定性。即shRNA1：SEQ ID NO.2(GATCCCCCCTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAATTTTTGGAAA)或shRNA2：SEQ ID NO.3(GATCCGTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTTTTTTGGAAA)。为了保证双链shRNA顺序能够有效产生，我们除了设计编码shRNA的人工基因顺序，还在其3’端加入了终止信号，5’端加入了启动子。我们分别采用了H1及U6RNA聚合酶III两种不同的启动子。我们在设计编码shRNA的人工基因顺序时还在shRNA顺序与启动子间加入了两种不同顺序的碱基，我们发现不同的碱基顺序明显影响shRNA的效率及其对靶基因表达的抑制作用。

3、表达干扰乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的表达载体的构建。我们利用表达载体介导编码shRNA的人工基因转移，并在表达HBVS抗原的细胞内检测shRNA的表达效率和功能。为了方便制备并稳定、高效产生shRNA，我们将编码针对HBVS抗原的shRNA的人工基因插入到表达载体pSilencer 3.1-H1及pSilencer 2.1U6(Ambion公司商业产品)中，构建表达针对HBVS抗原的shRNA的表达载体pSilencer 3.1-H1-HBVSAg-shRNA及pSilencer 2.1U6-HBVSAg-shRNA。为了鉴定表达载体产生siRNA干扰HBVS抗原表达的效率，我们同时共转染编码HBVS抗原的表达质粒和pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA或pSilencer 2.1 U6-HBVSAg-shRNA。并以单独转染编码HBVS抗原的表达质粒的细胞作为对照，ELISA检测细胞培养液中HBVS抗原的表达水平，确定哪个siRNA顺序及载体最有效，为后续构建腺相关病毒载体奠定基础。

4、构建并包装单独表达针对HBVS抗原siRNA的腺相关病毒。用限制性内切酶从已鉴定有功能的pSilencer 3.1-H1-HBVSAg-shRNA或pSilencer 2.1U6-HBVSAg-shRNA载体上切下编码针对HBVS抗原siRNA的完整表达盒，并插入到腺相关病毒穿梭质粒(pAAV-MCS，Stratagene公司商业产品)中，经酶切鉴定正确，并转染培养细胞证实能表达siRNA并干扰HBVS抗原表达后，与编码腺相关病毒rep和cap蛋白的质粒或腺病毒或单疱病毒一起转染或感染包装细胞，制备携带针对HBVS抗原siRNA的1型、2型、2/1嵌合型、以及8型重组腺相关病毒载体。

5、设计新型人工α干扰素蛋白顺序。分析已知的各种人α干扰素的氨基酸顺序，选出高度保守顺序和变异顺序，根据变异顺序在不同干扰素中出现的频率，确定变异顺序用哪个氨基酸。设计新型人工α干扰素蛋白顺序(SEQ ID NO.4)如下：M A L T F A L L V A L L V L S C K S S C S V G C D L P Q T H S L G N R RA L I L L A Q M R R I S P F S C L K D R H D F G F P Q E E F D G N Q F Q K A QA I S V L H E M I Q Q T F N L F S T K D S S A A W D E S L L E K F Y T E L Y QQ L N D L E A C V I Q E V G V E E T P L M N V D S I L A V K K Y F Q R I T L YL T E K K Y S P C A W E V V R A E I M R S F S L S T N L Q E R L R R K E。

6、设计新型人工α干扰素编码基因顺序。在获得新型人工α干扰素蛋白顺序的基础上，根据真核细胞对氨基酸编码子的偏好，选择编码各氨基酸的密码子，设计出编码人工α干扰素基因的cDNA顺序。为了便于人工α干扰素分泌到生产细胞外，以扩大其作用和疗效，人工α干扰素还包括了信号肽顺序，使得细胞内产生的干扰素能够源源不断产生并自动转移到细胞外发挥作用。也使得人工α干扰素生产细胞免受人工α干扰素的影响，可以长期存活。此外，为了提高人工α干扰素的转录和表达效率，我们还在人工基因的5’端加入了cozak顺序。人工a干扰素编码基因的cDNA序列为atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctcctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccattctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga(SEQID NO.5)或其互补序列。

7、人工合成全长α干扰素基因。按上述方法设计出人工α干扰素基因的cDNA顺序后，人工合成了全长α干扰素基因。为了便于进一步构建真核表达载体或腺相关病毒载体，我们在人工合成全长α干扰素基因时，还在其5’和3’端加入了限制性内切酶识别顺序和保护碱基。

8、构建表达人工α干扰素的真核表达载体并鉴定人工α干扰素的表达效率。将人工合成的α干扰素编码基因順序插入到真核表达载体内，构建受CMV、EF1、Albumin、AFP、以及其他真核启动子调控表达的人工α干扰素真核表达载体(图2-1、2-2、2-3、2-4)。并将所构建的载体转染培养的细胞，收集细胞培养液，ELISA检测细胞培养液中是否含有α干扰素及α干扰素的含量，确定人工α干扰素编码基因是否有效。

9、构建并包装单独表达人工α干扰素的重组腺相关病毒载体。用限制性内切酶从人工α干扰素真核表达载体上将人工α干扰素基因连同启动子和polyA序列一同切下，将完整的人工α干扰素基因表达盒插入到腺相关病毒穿梭载体上，构建含人工α干扰素基因的腺相关病毒载体，然后与编码腺相关病毒rep和cap蛋白的质粒或腺病毒或单疱病毒一起转染或感染包装细胞，制备携带人工α干扰素基因的1型、2型、2/1嵌合型、以及8型重组腺相关病毒载体。

10、构建并包装联合表达针对HBVS抗原的siRNA及人工α干扰素的重组腺相关病毒载体。用限制性内切酶从人工a干扰素真核表达载体上将人工α干扰素基因连同启动子和polyA序列一同切下，将完整的人工α干扰素基因表达盒插入到表达能够干扰乙型肝炎表面抗原表达的AAV载体中，构建联合表达抗乙型肝炎病毒表面抗原siRNA和人工α干扰素基因的腺相关病毒载体，然后与编码腺相关病毒rep和cap蛋白的质粒或腺病毒或单疱病毒一起转染或感染包装细胞，制备携带抗乙型肝炎病毒表面抗原siRNA和人工α干扰素基因的1型、2型、2/1嵌合型、以及8型重组腺相关病毒载体。

实施例2

不同的shRNA人工基因干扰乙型肝炎病毒表面抗原表达的效率存在差异。

我们分别构建了以H1或U6作为启动子、携带编码不同的、针对乙型肝炎病毒表面抗原编码基因的siRNA的人工基因，即shRNA1：SEQ ID NO.2(GATCCCCCCTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAATTTTTGGAAA)或shRNA2：SEQ ID NO.3(GATCCGTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTTTTTTGGAAA)的真核表达载体，我们命名为pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA1、pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA2、pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA1、pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA2。为了检测两种人工基因对乙型肝炎病毒表面抗原表达的干扰效率。我们利用脂质体，分别将2μg编码乙肝病毒表面抗原的表达质粒(阳性对照)，以及2μg编码乙肝病毒表面抗原的表达质粒和2μg编码干扰乙肝病毒表面抗原表达的shRNA的表达质粒(实验组)转染培养在6孔板中的239细胞，分别于24及48小时后收集细胞培养液，ELISA检测培养液中乙肝病毒表面抗原的含量。检测结果如表1：

表1

Plasmid	OD值
		pHBVSAg 2μg(阳性对照)	1.036
pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA1 2μg(实验组)	0.811
		pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA2 2μg(实验组)	0.315
pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA1 2μg(实验组)	1.164
		pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA2 2μg(实验组)	0.412

上述结果表明尽管siRNA的靶序列相同，但含有人工基因顺序2(shRNA2)的表达质粒能更明显抑制乙肝病毒表面抗原的表达，二种人工基因的抑制效果存在明显差异。

实施例3

表达载体选择性在肝脏内表达。

采用水动力转染(Hydrodynamic transfection)的方式，将溶于2ml生理盐水内的20μg编码萤火虫荧光蛋白(Luc)报告基因的表达质粒从小白鼠尾静脉注射，分别于24、48和96小时后，采用小动物成像系统观察报告基因表达量和部位，可见Luc基因可在肝区高水平表达(见图3)。

实施例4

携带编码人工a干扰素基因的表达载体在体外培养的细胞中高水平表达人工a干扰素。

由脂质体介导，将2μg编码人工a干扰素基因的表达载体转染培养在6孔板中的293细胞，分别于24及48小时后收集细胞培养液，ELISA检测培养液中人工a干扰素的含量。检测结果如表2：

表2

标准品	OD值	浓度
			500pg/ml	2.398	500pg/ml
200pg/ml	1.309	200pg/ml
			100pg/ml	0.787	100pg/ml
50pg/ml	0.502	50pg/ml
			25pg/ml	0.340	25pg/ml
空白对照	0.174
			阴性对照	0.256
pCMV-INF a1	3.545(1∶50稀释)	＞25000pg/ml
			pCMV-INF a2	3.525(1∶50稀释)	＞25000pg/ml
pCMV-INF a3	3.531(1∶50稀释)	＞25000pg/ml
			pCMV-INF a4	3.465(1∶50稀释)	＞25000pg/ml

上述结果表明编码人工a干扰素基因的表达载体在体外培养的细胞中能高水平表达新型人工a干扰素。

实施例5

联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的表达载体在体外抑制HBVS抗原表达并高水平表达a干扰素。

由脂质体介导，分别将2μg编码乙肝病毒表面抗原的表达质粒，以及2μg编码乙肝病毒表面抗原的表达质粒和2μg编码干扰乙肝病毒表面抗原表达的siRNA的人工基因和人工a干扰素的表达质粒共转染培养在6孔板中的239细胞，分别于24及48小时后收集细胞培养液，ELISA检测培养液中乙肝病毒表面抗原和人工a干扰素的含量。检测结果如表3、表4：

表3HBVS抗原检测结果

Plasmid	OD值
		pHBVSAg 2μg	2.418
pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA1 2μg	0.126
		pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-H1-HBVSAg-shRNA2 2μg	0.115
pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA1 2μg	0.101
		pHBVSAg 2μg+pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA2 2μg	0.109

表4a干扰素含量检测结果

标准品	OD值	浓度
			500pg/ml	2.398	500pg/ml
200pg/ml	1.309	200pg/ml
			100pg/ml	0.787	100pg/ml
50pg/ml	0.502	50pg/ml
			25pg/ml	0.34	25pg/ml
空白对照	0.174
			阴性对照	0.256	200pg/ml
pCMV-INFa-H1-HBVSAg-shRNA2 1	3.445(1∶50稀释)	＞25000pg/ml
			pCMV-INFa-H1-HBVSAg-shRNA2 2	3.448(1∶50稀释)	＞25000pg/ml
pCMV-INFa-U6-HBVSAg-shRNA2 1	3.539(1∶50稀释)	＞25000pg/ml
			pCMV-INFa-U6-HBVSAg-shRNA2 2	3.483(1∶50稀释)	＞25000pg/ml

上述结果表明联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的表达载体在体外能抑制HBVS抗原表达并高水平表达a干扰素。

实施例6

联合表达针对HBVS抗原siRNA及人工a干扰素的表达载体在体内抑制HBVS抗原表达并高水平表达a干扰素。

采用水动力转染的方式，分别将20μg编码乙肝病毒表面抗原的表达质粒，以及20μg编码乙肝病毒表面抗原的表达质粒和20μg编码干扰乙肝病毒表面抗原表达的siRNA的人工基因和人工a干扰素的表达质粒作小白鼠尾静脉注射，分别于24及48小时后眼眶取血，分离血清，ELISA检测血清中乙肝病毒表面抗原和人工a干扰素的含量。检测结果如表5、表6：

表5血清HBVS抗原检测结果

Sample	OD值
		HBVSAg 12μg	0.405
HBVSAg 12μg+AAV-CMV-INFa-H1-HBVSAg-shRNA2 20μg	0.122
		HBVSAg 12μg+AAV-CMV-INFa-U6-HBVSAg-shRNA2 20μg	0.045

表6血清a干扰素含量检测结果

标准品	OD值	浓度
			500pg/ml	3.336	500pg/ml
200pg/ml	2.149	200pg/ml
			100pg/ml	1.243	100pg/ml
50pg/ml	0.858	50pg/ml
			25pg/ml	0.517	25pg/ml
空白对照	0.154
			AAV-CMV-INFa-H1-HBVSAg-shRNA220μg(1∶4稀释)	3.469	＞2000pg/ml
AAV-CMV-INFa-H1-HBVSAg-shRNA220μg(1∶4稀释)	3.446	＞2000pg/ml
			AAV-CMV-INFa-U6-HBVSAg-shRNA220μg(1∶4稀释)	1.418	＞500pg/ml
AAV-CMV-INFa-U6-HBVSAg-shRNA2	1.252	＞500pg/ml

20μg(1∶4稀释)

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110>吴，沛宏

     黄，亚森

     李，川源

     黄，倩

<120>腺相关病毒载体及其构建制备方法和应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>1

aaugaucacg guaaacaag                                                 19

<210>2

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gatcccccct tactagtgcc atttgttctt caagagagaa caaatggcac tagtaatttt    60

tggaaa                                                               66

<210>3

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gatccgttac tagtgccatt tgttcttcaa gagagaacaa atggcactag taaacttttt    60

tggaaa                                                               66

<210>4

<211>189

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys

1                 5                      10                      15

Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu

              20                     25                      30

Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser

         35                  40                         45

Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu

     50                     55                     60

Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu

65                    70                      75                   80

His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser

                   85                     90                       95

Ser Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu

               100                   105                     110

Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly

         115                    120                     125

Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp SerIle Leu Ala Val Lys

     130                    135                    140

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser

145                     150                     155                160

Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser

                   165                      170                    175

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

              180                       185

<210>5

<211>570

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc  60

tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta acaggagggc cttgatcctc  120

ctggcacaga tgaggagaat ctctcccttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga  180

tttccccagg aggagtttga cggcaaccag ttccaaaagg ctcaagctat ctctgtcctc  240

catgagatga tccagcagac cttcaatctc ttcagcacaa aggactcatc tgctgcttgg  300

gatgagtctc tcctagaaaa attctacact gaactctacc agcagctgaa tgacctggaa  360

gcctgtgtga tacaggaagt gggggtggaa gagactcccc tgatgaacgt ggactccatt  420

ctggctgtga aaaaatactt ccaaagaatc actctctatc tgactgagaa gaaatacagc    480

ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ctttttcttt gtcaacaaac    540

ttgcaagaaa gattaagaag aaaggaatga                                     570

Claims (13)

1、一种腺相关病毒载体，包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因的shRNA和人工a干扰素编码基因。

2、根据权利要求1所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的腺相关病毒的载体非选择性或选择性在肝组织或肝癌细胞中表达。

3、根据权利要求1所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的腺相关病毒的人工a干扰素编码基因由启动子调控。

4、根据权利要求3所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的启动子为人巨细胞病毒基因启动子(CMV)、人延长因子基因启动子(EF1)、白蛋白Albumin基因启动子或甲胎蛋白基因启动子(AFP)。

5、根据权利要求1所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的腺相关病毒的载体的血清型为1型、2型、8型或嵌合型。

6、根据权利要求1所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的编码针对乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的编码基因shRNA的序列为GATCCCCCCTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAATTTTTGGAAA(SEQ ID NO.2)或GATCCGTTACTAGTGCCATTTGTTCTTCAAGAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTTTTTTGGAAA(SEQ ID NO.3)。

7、根据权利要求1所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的人工a干扰素编码基因的cDNA序列为atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctcctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccattctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga(SEQID NO.5)或其互补序列。

8、根据权利要求4所述的腺相关病毒的载体，其特征在于，所述的人工a干扰素的氨基酸序列为M A L T F A L L V A L L V L S C K S S C S V G C D L PQ T H S L G N R R A L I L L A Q M R R I S P F S C L K D R H D F G F P Q E E FD G N Q F Q K A Q A I S V L H E M I Q Q T F N L F S T K D S S A A W D E S L LE K F Y T E L Y Q Q L N D L E A C V I Q E V G V E E T P L M N V D S I L A V KK Y F Q R I T L Y L T E K K Y S P C A W E V V R A E I M R S F S L S T N L Q ER L R R K E(SEQ ID NO.4)。

9、根据权利要求1所述的腺相关病毒的载体，人工a干扰素编码基因由不同启动子调控，人工a干扰素编码基因非选择性或选择性在肝组织或肝癌细胞中表达。

10、一种腺相关病毒的载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计合成抗乙型肝炎病毒的siRNA；

(2)构建表达抗乙型肝炎病毒的siRNA的真核表达载体和病毒表达载体，在真核表达载体和病毒表达载体中表达抗乙型肝炎病毒的siRNA；

(3)设计合成针对乙型肝炎病毒和肝癌细胞的a干扰素；

(4)构建表达抗乙型肝炎病毒和肝癌细胞的a干扰素的真核表达载体和病毒表达载体，采用在多种组织中表达的启动子、选择性在肝细胞中表达的启动子和选择性在肝癌细胞中表达的启动子，所述的启动子调控a干扰素非选择性或选择性在肝细胞或肝癌细胞中表达；

(5)将步骤(2)得到的抗乙型肝炎病毒的siRNA和步骤(4)得到的抗乙型肝炎病毒和肝癌细胞的a干扰素的基因与腺相关病毒的载体重组，得到抗乙型肝炎病毒的siRNA和抗乙型肝炎病毒及肝癌细胞的a干扰素的腺相关病毒载体。

11、根据权利要求10所述的一种腺相关病毒的载体的制备方法，其特征在于，所述的在多种组织中表达的启动子为人巨细胞病毒基因启动子CMV或人延长因子基因启动子，选择性在肝细胞中表达的启动子为白蛋白Albumin基因启动子，选择性在肝癌细胞中表达的启动子为甲胎蛋白基因启动子AFP。

12、一种腺相关病毒载体在制备抑制乙肝病毒复制的药物的应用，所述的腺相关病毒载体包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原编码基因的shRNA和人工a干扰素编码基因。

13、一种腺相关病毒载体在制备抗肝癌生长和转移药物的应用，所述的腺相关病毒载体包括编码针对乙型肝炎病毒表面抗原编码基因的shRNA和人工a干扰素编码基因。

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