腺相关病毒反向末端重复序列突变体及其应用
本发明属于生物技术发明领域。本发明具体涉及腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITR)突变体及其应用。本发明设计并合成了一系列AAV的ITR的突变体,对其功能进行了验证和研究。实施例中,本发明利用这些突变体ITR替代AAV中的野生型ITR,构建了多种新型腺相关病毒质粒载体。这些含有“所设计的突变体ITR的新型腺相关病毒质粒载体”可成功地包装成重组腺相关病毒,并能有效地将外源基因转导至细胞中;与野生型ITR的AAV载体相比,这些含有“所设计的突变体ITR的重组AAV”在体内外转导中外源基因的表达水平更高,装载外源基因的容量也更大。本发明扩大了AAV载体在基因治疗及其他基因转移应用方面的应用范围。
背景
一 基因治疗
基因治疗是二十世纪八十年代发展起来的一种全新疾病治疗模式,它有别于传统的药物治疗,而是将产生药物的基因导入人体,以纠正缺陷基因或发挥治疗作用。与传统治疗方法相比,基因治疗的优势是明显的,它一次性给药,长期持续表达目的基因,持续产生治疗效果,且更接近人体基因表达的自然状态,被认为更安全、更有效。据统计,截止至2015年,全世界已经通过的基因治疗临床方案近4000个,所治疗的疾病主要是对人类健康威胁严重的、未被满足临床需求的各种疾病,具体包括如遗传病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、中枢神经系统疾病、血液病、代谢性疾病及其它各种难治性疾病等.
对特定类型的疾病进行基因治疗的关键技术问题,是将恰当的治疗基因安全、有效地导入到人体的预期的组织、器官、细胞中,并使该治疗基因长期稳定、可控地表达。基因导入的通常采用的方法有物理/化学方法和生物方法,或者分类为使用病毒类载体进行基因导入和使用非病毒手段进行基因导入等两类方法。
物理/化学方法是通过使用磷酸钙、电转、脂质体等将治疗基因导入细胞,这种方法安全性好,但效率低,通常处于初级实验研究阶段,有待于产生更有效的技术进步。
生物方法是使用对人体有天然感染能力的生物体,主要是以经人工改造后的病毒,即重组病毒作为载体,通过基因重组技术将治疗基因的表达单元(或者被称做基因表达盒)组装到病毒载体中,通过病毒对目标细胞的感染将治疗基因导入人体。病毒载体的转导效率高,目前绝大多数基因治疗方案都是采用病毒载体这种方法。(Morgan,R.A.andW.F.Anderson,Annu.Rev.Biochem.1993;62:191-217).
二 病毒载体系统
目前已有的病毒载体主要有腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等。
1 逆转录和慢病毒载体
逆转录病毒载体曾经是使用最多的病毒载体,大多是基于莫罗尼小鼠白血病病毒(MMuLV)改造而来的。逆转录病毒载体可以将治疗基因插入人体细胞的染色体并稳定地随细胞的分裂而分裂,使治疗基因稳定而持久表达。但由于其插入是随机的,存在破坏人体正常基因功能的危险。由此人们又开发了基于HIV病毒的慢病毒载体系统,并在血液病的研究和临床治疗中得到越来越广泛的应用。
2 腺病毒载体
腺病毒载体基因不插入人染色体,且可感染的细胞种类也比逆转录病毒多,但由于治疗基因不插入染色体,所以需要多次反复用药,并且腺病毒有很强的免疫原性,在人体中多次使用会激活中和抗体的表达,并降低治疗效果。因此,腺病毒载体多用作疫苗载体。
3 单纯疱疹病毒载体
单纯疱疹病毒载体有转导效率高、可感染分裂和非分裂细胞、在神经系统中可以逆轴突传导等特点,因此在神经系统中有较好的应用前景。2015年一种基于I型单纯疱疹病毒(HSV1)的溶瘤病毒T-Vee在美国被批准上市,成为第一个上市的单纯疱疹病毒药物。
4 腺相关病毒载体(AAV载体)
AAV载体因为安全性好、感染的宿主范围广泛、能稳定表达外源基因而成为有应用前景的病毒载体。2012年,一种基于AAV1的治疗脂蛋白酯酶缺乏症的基因治疗药物Glybera在欧盟批准上市,成为西方国家第一个成功上市的基因治疗药物(-Herttuala S.MolTher.2012;20(10):1831-1832.)。
三 腺相关病毒的基本生物学特征
1 AAV的概述
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)因在腺病毒制品中发现而得名(Atchison RW,et al.Science.1965;149:754-756.Hoggan MD,et al.Proc Natl SciUSA.1966;55:1467-1474.)。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员,依赖病毒属,包含多种血清型,其基因组为单链DNA(Rose JA,et al.Proc Natl Acad Sci USA.1969;64:863-869.),其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是复制依赖型病毒,需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(Geoffroy MC,et al.Curr Gene Ther.2005;5(3):265-271.),或其它辅助因素提供辅助功能才能复制。野生型的AAV感染细胞后,其基因组会整合到细胞染色体中,在没有辅助病毒存在时,整合在细胞染色体中的AAV的基因组会保持潜伏状态(Chiorini JA,et al.Curr Top Microbiol Immunol.1996;218:25-33.),而不产生子代病毒,只有当腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒存在的情况下,整合在细胞染色体中的AAV的基因组才会被拯救并包装、复制产生AAV的子代病毒。
2 AAV的基因组
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)(Atchison RW,etal.Science.1965;149:754-756.)。AAV2基因组长约4.7k,基因组两端为长度145nt的“反向末端重复序列”(inverted terminal repeat,ITR),呈回文-发卡结构(Lusby E,et al.JVirol.1980;34:402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框(ORF),分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ,et al.Proc Natl Acad SciUSA.1982;79:2077-2081.Laughlin CA,et al.Gene.1983;23:65-73.)。
AAV2基因组左侧是rep基因,它编码AAV的非结构蛋白Rep,分别由p5和p19启动子起始,各自分别得到经切割和未经切割的mRNA转录产物,从而得到四种蛋白:Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep蛋白的作用是控制AAV的转录,参与AAV复制,并在子代基因组的产生和病毒颗粒的组装中起重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR种的末端解链位点trs(terminalresolution site)和GAGC重复序列表位(repeat motif)特异性结合,启动AAV基因组由单链向双链的复制过程(Chiorini,J.A.,S.M.Wiener,R.M.Kotin,R.A.Owens,andB.Safer.J.Virol.1994;68:7448-7457)。Rep与DNA结合和末端解链过程也是AAV基因组定点插入19号染色体长臂的AAVS1位点的过程(Kotin,R.M.,J.C.Menninger,D.C.Ward,andK.I.Berns.Genomics 1991;10:831-834)。ITR中trs和GAGC重复序列表位是AAV基因组复制的中心,因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同,但是都能构成发卡结构和存在Rep结合位点(比如AAV2的GAGC)和trs。在rep78、rep68下游处还有另外两个rep基因,分别表达Rep52和Rep40,它们的启动子是p19。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能,而有ATP依赖的DNA解旋酶活性(Smith,R.,and R.M.Kotin.J.Virol.1998;72:4874-4881)。Rep蛋白的保守程度在AAV1、2、3、4、6中较高,其中Rep78在上述病毒中的同源性达到89-93%(Chiorini JA.,L.Yang,Y.Liu,and RM.Kotin.J.Virol.1997;71:6823-6833.Muramatsu.SI.H.Mizukami,NS.Young and KE.Brown.Virology 1996;221:208-217)。
AAV基因组的右半部是cap基因,后者编码核衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中,VP3分子量最小,但数量最多,VP1分子量最大但数量最少,在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例为1∶1∶20。VP1是形成有感染性的AAV所必需的;VP2协助VP3进入细胞核;VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白(Muzyczka.N.Curr.Top.Microbiol.Immunol.1992;158:97-129)。与Rep不同,Cap蛋白在各种血清型AAV中的保守程度较低,这是不同血清型AAV的具有不同宿主范围和特异性的主要原因。
3 各种血清型AAV病毒
继AAV2之后,人们又分离了5个感染灵长类动物的AAV新血清型,即AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6,Gao等(GaoGP,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2002;99(18):11854-9.)从猕猴的组织中分离了两个新的血清型,命名为AAV7和AAV8,其衣壳蛋白在序列水平上与以前分离的各血清型AAV有很大差异。至今得到序列命名的AAV病毒已经有AAV1-12。另外还有300多种AAV的变种,它们不是由分离病毒得到的,而是采用PCR方法从各种人或动物的组织细胞基因组DNA中扩增出来、经过序列分析和比对得到的。
不同血清型的AAV对组织或细胞嗜性不同,AAV1比AAV2能更好地转导肌肉组织(Xiao W et al.J Virol.1999;73:3994-4003),AAV3比其它血清型的AAV能更好地转导巨核细胞(HandaA et al.J Gen Virol.2000;81:2077-2084)。相较AAV2而言,AAV5和AAV6能更有效地转导上呼吸道细胞(Zabner J et al.J Virol.2000;74:3852-3858.Halbert CL,Allen JM,Miller AD.J Virol.2001;75:6615-6624)。AAV2、AAV4和AAV5都能较好地转导中枢神经系统的细胞,但在其中的分布和靶向的细胞类型存在着差异(Davidson BL etal.2000;Proc Natl Acad Sci USA.97:3428-3432)。AAV7和AAV8在肌肉组织中的转导效率都很高,与AAV1近似。许多研究证明了AAV8载体在体内表达具有良好的肝嗜性(Gao G,etal.Curr Gene Ther.2005;5(3):285-97.Davidoff AM,et al.Mol Ther.2005;11(6):875-88.Wang L,et al.Mol Ther.2010;18(1):118-25.),在肝脏中的转基因表达水平比其它血清型AAV高10到100倍以上。AAV9对心脏有相对亲嗜性。不同血清型AAV载体的不同组织亲嗜性为其在基因转移和基因治疗的应用上提供了多种选择。
4 AAV的细胞受体
与Rep相比,AAV各血清型的Cap的同源性较低,AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV4、AAV6的Cap的氨基酸同源性在45~80%之间,其中AAV1与AAV6之间的同源性最高,AAV5与其它血清型的Cap的同源性最低。(Ursula Bantel-Schaal,Hajo Delius and Harald zurHausen.1999;J.Virol.73:939-947.)。这是各血清型具有不同宿主范围和细胞特异性的基础。AAV病毒的宿主范围和细胞特异性是由其感染的细胞上相应受体的种类和多少决定的。目前受体研究较清楚的是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5等血清型。AAV2、AAV3血清型的细胞受体是硫酸肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan),其受体结合位点位于AAV2的VP3蛋白上。其共受体(eoreceptor,功能是帮助AAV病毒进入细胞)是人成纤维生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1)和整合素αVβ5(Qing K et al.Nat.Med.1999;5:71-77.Summerford C et al.Nat.Med.1999;5:78-82.)。AAV4、AAV5的细胞受体是唾液酸(sialic acid)(Walters RW,Yi SM,Keshavjee S,Brown KE,et al.J Biol Chem.2001;276:20610-6.),没有硫酸肝素结合位点,因此AAV5的细胞特异性与AAV2等有很大区别,尤其表现在AAV5在动物和人的神经系统和呼吸道上皮的感染效率比AAV2高得多(AAV4不感染呼吸道上皮)。
四 AAV载体
AAV病毒载体因为安全性好、感染的宿主范围广泛、能稳定表达外源基因而成为有应用前景的病毒载体。
AAV载体通常是用外源基因的表达单位(包括启动子、外源基因、mRNA加尾信号和/或其它调控元件)替代AAV病毒的rep cap基因,保留两端的ITR,包装到AAV病毒颗粒中形成一种“假型病毒”(pseudotyped virus)。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解,AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具,即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框,病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供,降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之,AAV病毒本身不具有致病性,使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。AAV病毒血清型众多,不同的血清型具有不同的组织感染嗜性,因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z,et al.Mol Ther.2006;14(3):316-327.)。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障,将外源基因导致大脑神经元中,为靶向大脑的基因转导提供了可能(Samaranch L,et al.HumGene Ther.2012;23(4):382-389.)。此外,AAV载体的理化性质稳定,对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM, et al.Hum Gene Ther Methods.2015;26(2):71-76.)。由于上述特点,AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗,特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2015年1月,世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有127项(http://www.abedia.com/wiley/vectors.php)。更为重要的是,基于AAV载体的高血脂症基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市,成为西方世界批准的第一个基因治疗药物;血友病B(Kay MA,et al.Nat Genet.2000;24(3):257-261.)和先天性黑朦症(RPE65基因突变引起)(Jacobson SG,et al.Arch Ophthalmol.2012;130(1):9-24.)的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果,预期在不久的将来会上市销售,造福广大患者。
五 AAV载体的包装
1 国际上多采用XiaoXiao和Samulski RJ发明的三质粒共转染方法获得重组AAV2病毒,其中包括AAV载体质粒(含有AAV2的2个ITR)、辅助质粒1(含有AAV2rep cap)和辅助质粒2(含有腺病毒E2a、F4 ORF6、VA RNA)。近年来,其它血清型(AAV1、3、4、5、6、7、8等)AAV病毒载体因其不同的组织细胞嗜性和转染效率而得到广泛研究和应用。(Xiao X,Li J,Samulski RJ.J Virol.1998;72:2224-2232.)
它们的包装多采用“交叉包装”,即将AAV2的rep基因和其它血清型的AAV cap基因连接形成嵌合的rep cap基因,用以包装含有AAV2来源的ITR而病毒外壳是其它血清型来源的假型AAV(pseudotyped AAV)载体,一般表述为AAV2/n(n代表外壳的血清型。如AAV2/1,表明是AAV2的ITR与AAV1的外壳)。
2 我们技术团队的吴小兵等曾用″一种病毒感染一个载体细胞株”的策略高效制备AAV2载体,并在基因治疗研究中得到广泛应用。为了便于将AAV载体质粒转染到细胞中形成稳定的“载体细胞株”,而不是每次都将AAV载体质粒用转染方法导入细胞中,吴小兵等将ITR-CMV-MCS-SV40 polyA-ITR结构插入pSV2neo质粒的BamHI切点中,构建成pSNAV载体质粒(中国专利申请号99119038.6,系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途)。将外源基因克隆到pSNAV或其衍生载体中的启动子下游,转染到生产细胞如BHK21或HEK293等细胞中,加G418 400~800ug/ml选择培养10~15天,即可得到稳定携带所转染的AAV载体质粒的G418抗性细胞。
同样,为了省去每次包装AAV病毒时将两个复制质粒用转染方式导入细胞的麻烦,吴小兵等将AAV2的rep-cap基因置于HSV1基因组中,构建成用于简便而大量生产rAAV病毒的全功能辅助病毒HSV-rc(中国专利申请号98120033.8)。用HSV-rc感染rAAV病毒载体质粒瞬时转染的细胞或上述稳定携带AAV病毒载体质粒的细胞株,就能产生大量有感染性的rAAV毒粒。用这种方法产生的rAAV能将外源基因导入哺乳动物细胞中并表达。(伍志坚,吴小兵等,科学通报。1999,44(5):506-509。伍志坚,吴小兵等,中国科学C辑。2001,31(5):423-430。WU Zhijian,WU Xiaobing,et al.Science in China(Series C).2002,45(1):96-104。WU Zhijian,WU Xiaobing,et al.Chinese Science Bulletin。1999,44(8):715-718)。这种包装策略与目前国际上常用的三质粒或双质粒共转染细胞法生产AAV病毒相比,其优势在于,用“感染方式”替代了“转染方式”之后,该系统有利于AAV病毒大规模生产,这也是该方法的最大的特点。
随后用同样的策略成功地建立了AAV2/1载体包装系统。吴小兵等就一系列用于包装1至6型AAV病毒外壳包装的AAV2ITR载体的全功能辅助病毒,申报了中国发明专利(专利申请号为02117965.4)。这种包装策略比目前国际上常用的三质粒或双质粒共转染细胞法生产AAV病毒的优势在于用“感染方式”替代了“转染方式”,避免了转染方式对于大规模生产AAV载体的不利之处,(三质粒或双质粒共转染细胞法需要大量提取高质量的质粒DNA,以及大量转染细胞)。
3 Urabe等首先建立了三个杆状病毒的AAV载体包装系统(Urabe M,et al.HumGene Ther,2002,13:1935-1943.)。三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框,按一定比例共感染Sf9细胞包装产生AAV病毒。Sf9细胞成熟的悬浮培养体系,以及杆状病毒表达HPV(Touze A,et al.FEMS Microbiol Lett,1996,28:142-146.)和HIV疫苗(Wang Y,et al.Virology,1996,28:142-146.)被批准用于临床试验,显示AAV杆状病毒包装系统未来具有潜力,有可能应用于临床AAV载体生产方法。
考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性,研究人员们随后减少了生产系统中所需杆状病毒种类的个 数,携带不同的AAV包装所需要的基因元件,逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒(Galibert L,et al.J Invertebr Pathol,2011,107Suppl:S80-93.)。Chen利用内含子剪接技术成功建立了由两个杆状病毒组成的AAV载体包装系统(Chen H.Mol Ther,2008,16(5):924-930.)。该系统包装效率好,产量高,1L培养液悬浮体系的AAV的初级产量可达1×1014vg(viral genome),为基因治疗药物的产业化提供了可能。
六 AAV载体的包装容量的限制及对策
Glybera的成功上市让人们看到了AAV载体在基因治疗领域的广阔应用前景。但AAV载体自身存在的一些不足却可能会限制这种前景成为现实的步伐。这些不足主要体现在包装容量小和携带基因表达水平偏低两方面。病毒载体的最大包装容量一般为其基因组大小的105%-110%之间。AAV病毒的基因组大约为4.7kb,因此通常认为AAV载体的包装容量不大于5.0kb;如果是双链AAV载体,包装容量则不大于2.2kb。虽然也有不少报道AAV载体的包装容量大于5.0kb,甚至能够达到6.0kb,但随着包装序列长度增加,AAV载体的包装效率、所包装基因的完整性以及包装获得AAV载体的感染活性显著降低(Dong JY,et al.HumGene Ther.1996;7(17):2101-2112.Grieger JC,et al.J Virol.2005;79(15):9933-9944.)。较小的包装容量限制了AAV载体对一些编码序列较大的基因的包装和携带,成为AAV载体应用于基因治疗的一大障碍。相比腺病毒载体,AAV载体携带基因的表达水平较弱,其特点是可在转导细胞中以染色体外遗传物质的形式稳定表达。因此为了使AAV载体携带治疗基因的表达产物(一般为蛋白质)达到效应浓度需要更多的AAV载体转导靶细胞。这无疑会提高治疗时的给药浓度,增加治疗成本,成为AAV载体应用于基因治疗的一个障碍。
为了将AAV载体能够应用于突变基因编码序列较大的疾病的基因治疗,常用的策略是把编码基因分成两部分,由两个不同的AAV载体携带。然后两个AAV载体同时转导进入细胞中,通过DNA同源重组或RNA反式剪接实现基因的表达。1998年Duan等人研究发现AAV载体能够在小鼠肌肉中形成分子间连环结构,从而以染色体外遗传物质的形式较长时间稳定存在(Duan DS,et al.J Virol.1998;72(11):8568-8577.)。利用AAV载体的这一特点,Duan等人建立了两种两个不同的AAV载体携带超过载体包装容量的系统(Yah ZY,et al.ProcNatl Acad Sci USA.2000;97(12):6716-6721.Ghosh A,et al.Mol Ther.2008;16(1):124-130.)。一种基于DNA同源重组机制,在两个AAV载体中分别插入一定长度的同源序列,两个载体同时转导后同源重组产生完整的编码基因序列。另一种则是借用了mRNA转录过程中的内含子剪接机制,在一个AAV载体中插入mRNA剪接需要的5’端特征序列(5’GU),一个AAV载体则包含mRNA剪接需要的3’端特征序列(5’AG)。两个AAV载体共同转导入细胞,形成异源分子间连环结构,转录后通过内含子剪接产生编码基因mRNA。研究结果表明基于内含子剪接机制系统效率明显高于同源重组机制系统,但二者均低于一个AAV载体携带完整基因编码序列系统。随后,Duan等人将两个系统的机制合二为一,建立一种杂合载体系统,即在一个AAV载体中加入同源序列和mRNA剪接需要的5’端特征序列(5’GU),另一个AAV载体则包含同源序列和mRNA剪接需要的3’端特征序列(5’AG),两个载体共同转导入细胞后既能利用同源重组机制又能借用mRNA的内含子剪接机制,显著提高了基因完整编码序列的产生效率。研究者还进一步缩短了该系统需要的同源序列的大小,增大了AAV载体携带更大外源基因的能力(Ghosh A,et al.Hum Gen Ther.2011;22(1):77-83.)。这种策略已在某些视网膜遗传病和杜氏肌营养不良症的基因治疗研发中得到应用。
虽然上述策略为扩大AAV载体的应用范围提供了一定的可能性,但杂合载体系统相对较低的效率以及同源序列本身的安全性顾虑仍然给其应用带来了不小的障碍。同时进一步提高AAV载体携带外源基因的表达水平从而降低其应用过程中的使用剂量,不仅可以有效地减少基于AAV载体基因治疗药物的开发成本,还能减少高剂量注射AAV载体可能带来的毒性反应。因此有必要研发新的扩大AAV载体包装容量和提高AAV载体携带基因表达效率的策略。
七 AAV载体表达水平的影响因素
AAV载体携带外源基因的表达水平是决定给予AAV载体基因治疗药物使用剂量的重要因素之一。因此提高AAV载体携带外源基因表达水平具有重要的应用价值。通常采用的策略有提高mRNA的转录效率 (Young JL,et al.Gene Ther.2003;10(17):1465-1470.)、增加mRNA的稳定性(Manoharlal R,et al.Antimicrob Agents Chemother.2008;52(4):1481-1492.)和提升蛋白的翻译水平(Robert TM,et al.J Virol.2000;74(17):8111-8118.)。提高mRNA转录效率的方式是采用高效的启动子(Wu ZJ,et al.Mol Ther.2008;16(2):280-289.)和一些有助于RNA加工及出核的元件(如WPRE等)(Loeb JE,et al.Hum GeneTher.1999;10(14):2295-2305.);增加mRNA稳定性则主要依靠合适的polyA加尾信号(Searfoss AM,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2000;97(16):9133-9137.)和删除基因编码区、5’和3’非编码区的miRNA识别结合序列(Fabian MR,et al.Annu Rev Biochem.2010;79:351-379.);提升蛋白的翻译水平主要通过在起始密码子前插入核糖体翻译起始识别序列(Kozak序列)(Kozak M,et al.Cell.1978;13(1):201-212.)以及根据宿主密码子偏好性进行密码子优化(Ko HJ,et al.Infect Immun.2005;73(9):5666-5674.)等实现。
八 AAV载体的新应用
AAV载体具有其自身优势,除在基因治疗领域展现独特的作用外,还可应用于诸多新领域,如AAV8载体在体内表达具有良好的肝嗜性,我们采用AAV8载体做为导入HBV病毒基因组的载体工具。为此,在我们之前的AAV载体包装系统的发明专利的基础上,我们进一步发展了具有包装rAAV2/8病毒的全功能辅助病毒rHSV1-rep2cap8包装系统(专利申请号:200810167070.0,董小岩、吴小兵等,用于重组AAV2/8病毒载体生产的重组I型单纯疱疹病毒及其用途)。使用这个系统可以把将插入了外源基因的pAAV2neo-gene质粒包装产生含有外源基因表达单元的血清型为8型的重组病毒rAAV8-gene。例如,用全功能辅助病毒rHSV1-rep2cap8包装系统将pAAVneo-HBV1.3包装制备成重组病毒rAAV8-HBV1.3。该病毒在注射小鼠后,可用于慢性乙型肝炎小鼠模型,为建立HBV感染的动物模型,对于探索乙肝感染发病机制、研究和筛选乙肝药物、寻找有效的防治方法,具有重要的意义。该病毒载体用于建立慢性乙肝感染的小鼠模型已申请专利(专利申请号:2010102167970,董小岩、吴小兵等,rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型)。
九 AAV载体中的ITR基因元件及其改造
ITR是AAV载体基因组的惟一的顺式作用元件,在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X,et al.J Virol.1997;71(2):941-948.)。
AAV载体中的ITR通常为AAV2的ITR,由145nt构成的特殊结构。其中125nt的构成了双链的长发卡-回文结构,并分别由一个长回文结构A/A’和两个短回文结构B/B’和C/C’,形成一个“T”字型结构。其余的20bp并不构成双链,为D序列(Srivastava A,Lusby EW,BernsKI.1983.J Virol 45:555-564)。
ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site,RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site),能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM,et al.Proc Natl Acad Sci USA.1996;93(15):7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字型二级结构,在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H,et al.JVirol.1989;63(7):3034-3039.)。
近年来的一些有关ITR的研究结果为建立新型的更大容量和更高外源基因表达效率的AAV载体提供了可能的思路。Cataldi等在AAV质粒水平研究发现ITR形成的“T”型空间结构能够降低质粒DNA的稳定性和导致其相邻基因的沉默,从而降低基因的表达水平(Cataldi MP,et al.Gene Ther.2013;20(6):686-693.)。删除ITR形成的“T”型空间结构则可以消除这种抑制作用。Zhu等在美国基因与细胞治疗协会年会上报道删除特殊AAV质粒载体ITR中的部分序列不影响AAV载体的包装和得到重组AAV载体的表达功能(Zhu XD,etal.Mol Ther.2004;9:S6-S6.)。遗憾的是,Zhu等没有进一步的深入研究结果展示,没有报道是否能够将其采用的只包含一个ITR序列的特殊AAV质粒载体获得的研究结果推广到常用的包含两个ITR序列的AAV质粒载体。
美国专利(专利号:US20140271551A1)预测分析了ITR中序列可能的结合蛋白,根据预测结果设计合成了系列ITR序列。人工合成的ITR序列具有病毒包装容量更大、表达水平更高和副作用更小等功能。
基于上述研究成果等基础,在本发明中,我们尝试所描述的建立了一种新的AAV载体系统,其主要 特征是对该系统中的AAV质粒载体的一个或两个ITR进行了系列的缺失突变,获得了系列包含ITR突变体的AAV质粒载体。使用这些质粒载体不仅可以正常包装得到重组AAV载体,还可提高包装获得AAV载体的体内外基因表达水平,扩大AAV载体包装外源基因表达框的容量大小。
十 本技术团队申报过的专利:
1 用于重组AAV5/5病毒载体包装的重组单纯疱疹病毒及其用途,申请公布号CN101768574A
2 rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型,申请公布号CN102311974A
3 一组重组单纯疱疹病毒的构建及其用途,申请公布号CN1461805
4 AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列,申请公布号CN101967496A
5 ITR同向排列的AAV载体构建及其应用,申请公布号CN103014064A
发明概述
本发明具体涉及AAV的ITR突变体及其应用。设计发明了系列截短的新型ITR,并将其应用于AAV的包装。
基于AAV的ITR突变体,本发明设计并构建了系列单个ITR或两个ITR部分序列缺失突变的AAV质粒载体。这些质粒载体连同AAV的Rep和Cap蛋白表达质粒以及来源于腺病毒基因组的辅助质粒共同构成新的AAV载体包装系统。
本发明的AAV的ITR突变体的特征是,单侧ITR的B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)或B/B’+C/C’+A/A’缺失的AAV质粒载体,同野生型ITR的AAV质粒载体具有相同的生物学特性,即使用两类AAV质粒载体包装获得AAV载体的产量和质量无明显差异。
本发明的AAV的ITR突变体的特征是,两侧ITR的B/B’、B/B’+C/C’缺失的AAV质粒载体,同野生型ITR的AAV质粒载体具有相同的生物学特性,即使用两类AAV质粒载体包装获得AAV载体的产量和质量无明显差异。
本发明的AAV的ITR突变体的特征是,两侧ITR的B/B’、B/B’+C/C’缺失的AAV质粒载体包装获得的重组AAV载体ITR序列不能够形成特定的“T”型空间结构。
本发明的AAV的ITR突变体的特征是,两侧ITR的B/B’、B/B’+C/C’缺失的AAV质粒载体包装获得的重组AAV载体,相比两侧均为野生型ITR的AAV载体,能够提高携带基因在体内外的表达水平。
本发明的AAV的ITR突变体的特征是,由于两侧ITR部分序列缺失突变的AAV质粒载体删除了部分ITR序列,因此相比野生型ITR的AAV质粒载体,突变载体能够携带序列长度更大的外源基因表达框(增加序列长度可达68bp)。
本发明的AAV的ITR突变体的特征是,两侧ITR的B/B’、B/B’+C/C’缺失的AAV质粒载体及所包装的AAV能够应用于诸如血友病A、血友病B等多种遗传病基因治疗药物的开发。
发明详述
ITR是AAV载体基因组的唯一顺式作用元件,在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用。AAV载体中的ITR通常为AAV2的ITR,由145nt构成。其中125nt的构成了双链的长发卡-回文结构,并分别由一个长回文结构A/A’和两个短回文结构B/B’和C/C’,形成一个“T”字型结构。其余的20bp并不构成双链,为D序列(SrivastavaA,Lusby EW,Berns KI.1983.J Virol 45:555-564)。其结构图详见图1。
本发明的主要内容为系列腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)突变体的构建及其应用。
我们选择AAV载体中常用的AAV2的ITR为研究对象,分析了AAV2的ITR序列中B/B’、C/C’、A/A’和D序列的序列信息。进一步选择AAV质粒载体中的一个ITR序列,依次删除ITR序列中的B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+I/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’(不含trs、下同)、B/B’+C/C’+A/A’+trs、B/B’+C/C’+A/A’+D,构建得到系列单侧ITR缺失突变的AAV质粒载体。将EGFP和分泌型荧光素酶 Gluc(Gaussia luciferase)基因插入这些单侧ITR缺失突变的AAV质粒载体中,获得系列携带EGFP或Gluc报告基因的AAV质粒载体。
以未经ITR突变的AAV质粒载体为对照,应用AAV载体三质粒包装系统包装获得血清型为DJ的重组AAV载体,根据吴小兵等报道方法(Wu XB,et alChin Sci Bull.2001;46(6):485-489.)分离纯化病毒。采用SDS-PAGE方法检测重组AAV病毒的纯度,定量PCR方法测定重组AAV病毒的基因组滴度,southern blot方法检测重组AAV病毒的基因组完整性。结果发现,相比对照载体,6种单侧ITR缺失突变体的AAV质粒载体包装获得的重组AAV病毒的纯度和基因组滴度未见明显差异,但southern blot检测结果显示单侧ITR缺失B/B’+C/C’+A/A’+trs和B/B’+C/C’+A/A’+D的AAV载体包装得到的重组AAV病毒基因组的弥散性增加。结果表明,单侧ITR的B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)或B/B’+C/C’+A/A’缺失突变不影响AAV载体的包装。
随后,我们进一步研究了获得单侧ITR缺失突变的重组AAV载体的体内外功能实验研究结果。在体外实验研究中,以未经ITR突变的AAV载体做为对照体系,将6种单侧ITR缺失突变的重组AAV-EGFP载体以相同的剂量分别感染HEK293、Huh7、HelaS3、Hepa6细胞,一定时间后检测表达EGFP的阳性细胞的比例。结果显示,在所有检测用细胞中,相比对照,单侧B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’缺失突变的ITR的AAV载体的阳性细胞率未见明显差异;而缺失B/B’+C/C’+A/A’+trs和B/B’+C/C’+A/A’+D序列的ITR突变体的AAV载体的阳性细胞率则显著下降,这与southern blot检测结果显示两种突变体包装得到AAV病毒的基因组完整性降低的结果相一致。
在体内实验研究中,我们同样以未经ITR突变的AAV载体为对照,将6种ITR单侧缺失突变的重组AAV-Gluc载体以相同的剂量经尾静脉注射至C57BL/6J小鼠体内。注射后,在不同时间点进行尾静脉采血,检测血液中Gluc表达水平。实验研究结果与体外实验研究检测的结果呈现一致的趋势:同对照相比,单侧B/B’、B/B’+C/C’和B/B’+C/C’+1/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’缺失突变的ITR的AAV载体的Gluc表达水平未见明显差异;而缺失B/B’+C/C’+A/A’+trs和B/B’+C/C’+A/A’+D的ITR突变体的AAV载体的Gluc表达水平则出现明显下降。体内外功能研究结果表明,AAV的ITR单侧B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’缺失突变不会影响AAV载体的体内外功能。
在此基础上,我们进一步构建了系列两侧ITR均缺失突变的AAV质粒载体,具体为两侧都缺失B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)等3种AAV质粒载体。考虑单侧ITR缺失B/B’+C/C’+A/A’或B/B’+C/C’+A/A’+D序列的AAV载体包装获得重组AAV载体的完整性显著降低,且体内外表达功能受到明显影响,因此我们在双侧ITR缺失突变体的设计过程中并未设计和构建双侧ITR均缺失这两种序列的突变体。同样将EGFP作为报告基因插入突变后的AAV载体,得到3种携带EGFP报告基因的AAV载体。
以双侧ITR均未突变的AAV质粒载体为对照,应用AAV载体三质粒包装系统包装获得血清型为DJ的重组AAV载体,根据吴小兵等报道方法分离纯化病毒。采用SDS-PAGE方法检测重组AAV病毒的纯度,定量PCR方法测定重组AAV病毒的基因组滴度,
结果发现,双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的AAV包装滴度与对照近似,并无明显下降;而双侧ITR缺失B/B’+C/C’+1/2(A/A’)的AAV包装滴度下降极显著,证明双侧ITR缺失B/B’+C/C’+1/2(A/A’)不适用于包装AAV。
southern blot方法检测重组AAV病毒的基因组完整性。结果发现,相比对照载体,结果显示双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的AAV载体包装得到的重组AAV病毒基因组的完整性也未见明显变化。结果表明,双侧B/B’、B/B’+C/C缺失突变不影响AAV载体的包装。由于双侧ITR缺失B/B’+C/C’+1/2(A/A’)的AAV并没有足够量的基因组,故并未进行souther blot的检测。并且由于该结构不适用于包装AAV,放弃对该病毒表达水平的继续研究。
接下来,我们研究了获得双侧ITR缺失突变的重组AAV载体的体内外功能。在体外,以ITR未突变的AAV载体为对照,将3种双侧ITR缺失突变的重组AAV载体以相同的剂量分别感染HEK293、Huh7、HelaS3、Hepa6细胞,一定时间后检测表达EGFP的阳性细胞比例。结果显示,在所有检测用细胞中,相 比对照,双侧ITR均缺失B/B’、B/B’+C/C序列的AAV载体的阳性细胞比例都明显升高,差异具有统计学意义。结果提示,双侧ITR均缺失B/B’、B/B’+C/C’序列能够有效地提高AAV载体携带基因的表达水平,可能与删除ITR中的这些序列破坏了ITR中抑制基因表达结构的形成相关。
为了进一步这两种载体的体内表达水平研究,我们以Gluc作为报告基因,插入这两种突变的AAV载体,包装了双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C的AAV8-Gluc。将2种载体以相同的剂量经尾静脉注射至测C57BL/6J小鼠体内。注射后不同时间点尾静脉采血检测血液中Gluc表达水平。与体外检测结果的趋势一致,同对照相比,双侧B/B’、B/B’+C/C’缺失突变的ITR的AAV载体的Gluc表达水平明显升高。结果表明,删除AAV载体两侧ITR中的B/B’、B/B’+C/C’能够显著提高重组AAV载体携带基因在体内的表达水平,为降低AAV载体在基因治疗中的使用剂量提供了可能。体内外功能研究结果表明,AAV的双侧ITR都缺失B/B’、B/B’+C/C’序列提高了重组AAV载体携带基因在体内外的表达水平具有较强的应用价值。
基于上述研究结果,我们首先设计了系列新型的单链AAV质粒载体,这些AAV载体的两侧ITR都缺失B/B’、B/B’+C/C’序列,采用不同的启动子如CMV启动子、CAG启动子等(Alexopoulou AN,et al.BMC Cell Biology.2008;9:2.刘彦礼等.中国细胞生物学学报.2015;37(10):1370-1376)调节外源基因的表达,不同polyA加尾信号控制转录产物polyA尾巴的形成。应用报告基因(如EGFP、Gluc等)研究发现设计的新型AAV质粒载体能够高效地包装成多种血清型的AAV载体,且能够显著提高同种血清型AAV载体在体内外的基因表达水平。考虑到新型AAV载体删除了部分ITR序列,缩短了重组AAV载体中包装ITR序列的长度,假设改变ITR序列的空间结构不影响AAV载体的包装容量,那么删除双侧ITR中部分序列后AAV载体携带外源DNA序列片段的长度会增加。我们通过插入不同长度的冗余序列研究了新型AAV载体的包装容量。结果显示,删除双侧ITR中的部分序列不影响重组AAV载体的包装容量,表明设计新型AAV载体比原AAV载体能够携带更长的外源DNA序列片段,外源DNA序列片段长度增加值不低于68bp。
我们在此基础上进一步研究双侧缺失B/B’、B/B’+C/C’是否可以包装自我互补双链AAV。于是在新型AAV载体质粒双侧ITR均缺失B/B’或均缺失B/B’+C/C’的基础上,继续缺失其中一侧ITR的D序列及trs位点,得到2种新型的自我互补双链AAV载体质粒(SrivastavaA,Lusby EW,Berns KI.J Virol.1983;45:555-564.Wu J,Davis MD,Owens RA.JVirol.1999;10:8235-8244.Wang Z,et al.Gene Ther.2003;10:2105-2111.)。采用和新型单链AAV质粒载体相同的研究思路,构建了系列携带报告基因的新型双链AAV质粒载体。研究结果发现,这些新型双链AAV质粒载体能够高效地包装成多种血清型的双链AAV载体,且包装获得AAV载体中双链AAV载体的比例不低于80%。包装获得新型双链AAV载体的体内外表达水平也显著提高,可携带外源DNA序列片段的长度也出现了不低于34bp的增加。
上述结果表明我们设计的新型单链AAV和双链AAV载体都能够显著提高携带外源基因的体内外表达水平以及增加可携带外源DNA序列片段的长度,在基于AAV载体的体内外应用中具有重要的价值。这些应用包括遗传病的基因治疗、以AAV载体反向感染技术为基础的生物学活性传感器等。在本发明的实施例中我们分别列举了相关的应用实例,如将新型AAV单链载体用于A型血友病基因治疗药物的开发,将新型AAV双链载体用于B型血友病基因治疗药物的开发等。
附图说明
图1野生型ITR的核酸序列及结构示意图。其中B/B’中存在一个AhdI酶切位点;C/C’中存在两个SmaI酶切位点。
图2单侧ITR突变的AAV载体示意图,从上到下依次为pAAV2wt和pAAV2ΔB、pAAV2ΔBC,pAAV2ΔBC1/2A,pAAV2ΔBCA,pAAV2ΔBCAtrs,pAAV2ΔITR,主要描述了AAV载体中单侧ITR的突变情况。
图3 SDS-PAGE检测包装获得的单侧ITR缺失突变的AAV外壳。泳道从左到右依次为rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP外壳变性后分别上样20μl,SDS-PAGE检测结果。
图4 southern blot检测包装获得的单侧ITR缺失突变的AAV的基因组完整性,泳道从左到右依次为rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP提取基因组DNA分别上样10μl,碱性琼脂糖凝胶电泳后,southern blot检测结果。
图5双侧为野生型ITR的AAV和单侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP感染HEK293细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图6双侧为野生型ITR的AAV和单侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP感染BHK21细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图7双侧为野生型ITR的AAV和单侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP感染Huh7和B16F10细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图8双侧为野生型ITR的AAV和单侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP感染B16F10细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图9双侧为野生型ITR的AAV和单侧ITR缺失突变的AAV体内表达特征比较结果。rAAV8wt-Gluc和rAAV8ΔB-Gluc、rAAV8ΔBC-Gluc、rAAV8ΔBC1/2A-Gluc、rAAV8ΔBCA-Gluc、rAAV8ΔBCAtrs-Gluc、rAAV8ΔITR-Gluc分别通过尾静脉以2×1011vg/只的量注射C57BL/6J小鼠,并在注射1~100天后检测小鼠尾静脉血内Gluc的表达活性。
图10双侧ITR突变的AAV载体示意图,从上到下依次为pAAV2wt、pAAV2biΔB、pAAV2biΔBC,pAAV2biΔBC1/2A,主要描述了AAV载体中双侧ITR的突变情况。
图11 SDS-PAGE检测包装获得的双侧ITR缺失突变的AAV的外壳。泳道从左到右依次为rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP、rAAVDJbiΔBC1/2A-EGFP外壳变性后分别上样20μl,SDS-PAGE检测结果。
图12 southern blot检测包装获得的双侧ITR缺失突变的AAV的基因组完整性,泳道从左到右依次为rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP和对照rAAVDJwt-EGFP提取基因组DNA分别上样10μl,碱性琼脂糖凝胶电泳后,southern blot检测结果。
图13双侧为野生型ITR的AAV和双侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP感染HEK293细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图14双侧为野生型ITR的AAV和双侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP感染BHK21细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图15双侧为野生型ITR的AAV和双侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP感染Huh7细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图16双侧为野生型ITR的AAV和双侧ITR缺失突变的AAV体外表达特征比较结果。rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP感染B16F10细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后,流式细 胞仪检测阳性细胞的比例。
图17双侧为野生型ITR的AAV和双侧ITR缺失突变的AAV体内表达特征比较结果。rAAV8wt-Gluc和rAAV8biΔB-Gluc、rAAV8biΔBC-Gluc分别通过尾静脉以2×1011vg/只的量注射C57BL/6J小鼠,并在注射1~100天后检测小鼠尾静脉血内Gluc的表达活性。
图18双侧ITR突变的scAAV通用型载体示意图,从上到下依次为pscAAVwt、pscAAVbiΔB、pscAAVbiΔBC载体的示意图,主要描述了双链AAV载体中双侧ITR的突变情况。
图19 SDS-PAGE检测包装获得的双侧ITR缺失突变的scAAV的外壳。泳道从左到右依次为rscAAVDJwt-EGFP、rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP外壳变性后分别上样20μl,SDS-PAGE检测结果
图20 southern blot检测包装获得的双侧ITR缺失突变的scAAV的基因组完整性,泳道从左到右依次为rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP和对照rscAAVDJwt-EGFP提取基因组DNA分别上样10μl,碱性琼脂糖凝胶电泳后,southern blot检测结果
图21传统rscAAV和双侧ITR缺失突变的scAAV体外表达特征比较结果。rscAAVDJwt-EGFP和rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP感染HEK29细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图22传统rscAAV和双侧ITR缺失突变的scAAV体外表达特征比较结果。rscAAVDJwt-EGFP和rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP感染B16F10细胞(MOI=1000vg/cell)24、48、72h后流式细胞仪检测阳性细胞的比例。
图23传统scAAV和双侧ITR缺失突变的scAAV体内表达特征比较结果。rscAAV8wt-Gluc和rscAAV8biΔB-Gluc、rscAAV8biΔBC-Gluc分别通过尾静脉以2×1011vg/只的量注射C57BL/6J小鼠,并在注射1~100天后检测小鼠尾静脉血内Gluc的表达活性。
图24双侧ITR缺失突变的scAAV用于体内hFIX表达的结果。rscAAV8wt-hFIX和rscAAV8biΔB-hFIX、rscAAV8biΔBC-hFIX分别通过尾静脉以5×1011vg/只的量注射九因子缺陷的模型小鼠,并在注射1~365天后检测小鼠尾静脉血内hFIX的表达。
图25双侧ITR缺失突变的AAV用于体内hFVIII表达的结果。rAAV8wt-hFVIII和rAAV8biΔB-hFVIII、rAAV8biΔBC-hFVIII分别通过尾静脉以5×1011vg/只的量注射八因子缺陷的模型小鼠,并在注射1~365天后检测小鼠尾静脉血内hFVIII的表达。
具体实施方式
以下实施例对本发明的系列腺相关病毒反向末端重复序列突变体的构建及其应用作了详细说明,但并不意味着限制本发明的内容。
实施例1单侧ITR突变的AAV质粒载体的构建
将本公司原有的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体命名为pAAV2wt,示意图如图2中所示,作为系列单侧ITR突变的AAV质粒载体构建的原始骨架质粒,对其进行了酶切位点分析,选择该载体中离CMV启动子较近的ITR为替换对象,用HpaI和XhoI两种限制性内切酶(New England Biolabs)切除替换的ITR序列。以AAV2全基因组(GenBank:AF043303.1)的ITR序列为基础,依据《费氏病毒学》小DNA病毒科内容(Bern KI.1996.Parvoviridae:theviruses and their replication.Lippincott Raven,Philadelphia,Pa.)分析确定ITR序列的中A/A’、B/B’、C/C’和D具体的序列信息。然后,我们设计并合成系列ITR序列缺失突变体(委托Takara公司进行基因合成,大连,中国),这些ITR缺失突变体分别为ITR-ΔB、ITR-ΔBC、ITR-ΔBC1/2A、ITR-ΔBCA、ITR-ΔBCAtrs,缺失的序列信息依次为B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+I/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’(不含trs)、B/B’+C/C’+A/A’+trs。将合成序列分别克隆入pMD18T simple(Takara,大连, 中国),命名为pMD18T-ITR-ΔB、pMD18T-ITR-ΔBC、pMD18T-ITR-ΔBC1/2A、pMD18T-ITR-ΔBCA、pMD18T-ITR-ΔBCAtrs。在合成序列的两端分别引入XhoI和HpaI(New England Biolabs)酶切位点,用合成序列替换原pAAV2wt距离CMV启动子较近的ITR相关序列。并继续构建一个一侧ITR(即B/B’+C/C’+A/A’+D)完全被删除的AAV载体。所构建的载体分别命名为pAAV2ΔB、pAAV2ΔBC,pAAV2ΔBC1/2A,pAAV2ΔBCA,pAAV2ΔBCAtrs,pAAV2ΔITR。在此基础上连同pAAV2wt一同插入报告基因EGFP的表达框CMV-EGFP-pA(Dong X,et al.PLoS ONE.2010;5(10):e13479.)构成pAAV2wt-CMV-EGFP、pAAV2ΔB-CMV-EGFP、pAAV2ΔBC-CMV-EGFP、pAAV2ΔBC1/2A-CMV-EGFP、pAAV2ΔBCA-CMV-EGFP、pAAV2ΔBCAtrs-CMV-EGFP、pAAV2ΔITR-CMV-EGFP,载体结构如图2所示。突变ITR序列具体如下:
ITR-ΔB
5’TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCT3’(SEQ ID NO:1)
ITR-ΔBC
5’TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCCGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT3’(SEQ ID NO:2)
ITR-ΔBC1/2A
5’TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCAAAGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT3’(SEQ ID NO:3)
ITR-ΔBCA
5’GTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT3’(SEQ ID NO:4)
ITR-ΔBCAtrs
5’CTCCATCACTAGGGGTTCCT3’(SEQ ID NO:5)
实施例2单侧ITR突变对重组AAV载体包装的影响研究
采用Cell Biolabs公司AAV-DJ/8Helper Free Packaging System(货号:VPK-400-DJ-8,Cell Biolabs)包装重组AAVDJ病毒,操作过程参见说明书。以pAAV2wt-CMV-EGFP、pAAV2ΔB-CMV-EGFP、pAAV2ΔBC-CMV-EGFP、pAAV2ΔBC1/2A-CMV-EGFP、pAAV2ΔBCA-CMV-EGFP、pAAV2ΔBCAtrs-CMV-EGFP、pAAV2ΔITR-CMV-EGFP作为AAV的包装质粒,包装得到的rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP病毒,参照吴小兵(Wu XB,et al.Chin Sci Bull.2001;46(6):485-489.)等报道的方法浓缩纯化病毒。SDS-PAGE结果显示(图3),所有病毒的外壳三条特征带清晰明显。定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)检测包装获得rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP、rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP病毒的基因组滴度。
具体过程为,在CMV启动子中设计两条引物CMV-Q-F和CMV-Q-R,
CMV-Q-F:5’cccataaggtcatgtactgggcat3’(SEQ ID NO:6)
CMV-Q-R:5’gttcccatagtaacgccaataggg3’(SEQ ID NO:7)
以CMV-Q-F和CMV-Q-R为引物特异性地扩增CMV启动子长度为175bp片段,采用SYBRGreen染料结合法,以1μg/μl的pAAV2wt-CMV-EGFP质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品,应用SYBR PremixEx Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂(Takara,大连,中国),使用荧光定量PCR仪(型号:ABI 7500fast,ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献(Ulrich-Peter R,etal.Journal of Virological Methods.2002;106:81-88)。结果显示,与双侧均为野生型ITR的rAAVDJwt-EGFP相比,各种ITR突变体的重组AAV病毒产量并无明显下降(表1)。
表1 6种单侧ITR突变AAV载体和野生型ITR AAV载体包装的病毒载体量比较
为了检测包装获得病毒基因组的完整性,我们对包装获得的ITR单侧缺失的AAV进行了southern blot分析。首先,应用病毒基因组DNA提取试剂盒(百泰克,北京,中国)提取系列含有单侧ITR突变的病毒基因组,并同时提取ITR正常的rAAVDJ-EGFP病毒基因组作为对照,操作过程参见试剂盒说明书。然后,提取的所有病毒基因组依次上样,进行碱变性琼脂糖电泳,虹吸法转移至带正电的尼龙膜上,地高辛标记的CMV探针杂交,碱磷酶标记抗地高辛抗体孵育结合,BCIP/NBT检测试剂盒显色,结果如图4所示,除rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP基因组出现明显异质性外,其余病毒基因组主带清晰明显。结果证实一侧ITR缺失B/B’+C/C’+A/A’(不含trs)序列后,不影响基因组的完整性,不影响AAV包装。但一侧ITR删除B/B’+C/C’+A/A’+trs或B/B’+C/C’+A/A’+D时影响AAV的包装。
CMV探针的制备步骤:
1、以前述QPCR使用的CMV-Q-F,CMV-Q-R为引物,pAAV2wt-CMV-EGFP为模板,利用加入地高辛标记的11-dig-dUTP的dNTP扩增获得地高辛标记的PCR产物
2、探针的纯化,向50μl上述PCR反应溶液中加入5μl浓度为4mol/L的LiCl和150μl预冷的无水乙醇,-20C放置2h后,4℃以12000g离心5min,沉淀用70%无水乙醇洗涤,然后用20μl pH8.0的TE缓冲液溶解,放置于-20C保存备用。
实施例3单侧ITR突变对包装获得重组AAV载体体外表达功能的影响研究
为研究单侧ITR突变的rAAV转导细胞的表达特点,我们将rAAVDJwt-EGFP和上述系列单侧ITR突变的rAAV分别以1000vg/cell(viral genome,vg)转导HEK293、BHK21、Huh7和B16F10细胞,细胞均购自ATCC。转导24、48、72h后,利用流式细胞仪(BD,美国)测定EGFP表达情况。结果如图5-图8所示,在4种细胞中,转导rAAVDJΔB-EGFP、rAAVDJΔBC-EGFP、rAAVDJΔBC1/2A-EGFP、rAAVDJΔBCA-EGFP与转导rAAVDJwt-EGFP细胞的EGFP表达效率近似。而rAAVDJΔBCAtrs-EGFP、rAAVDJΔITR-EGFP转导细胞后的EGFP表达效率明显下降。这说明一侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’(不含trs)的rAAV在细胞内的表达水平与ITR未缺失突变的rAAV近似。而一侧ITR缺失B/B’+C/C’+A/A’+trs序列或完全缺失的rAAV在细胞内的表达水平与双侧均为野生型ITR的rAAV相比,降幅极显著。HEK293为人胚肾细胞,BHK21为金黄地鼠肾细胞,Huh7为肝癌来源细胞系,B16F10为黑色素瘤细胞。4种细胞来源各不相同,但报告基因EGFP的表达水平均呈现相似规律,提示单侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)或B/B’+C/C’+A/A’(不含trs)所包装的重组AAV病毒对所携带基因表达的影响不具有细胞特异性。
实施例4单侧ITR突变对包装获得重组AAV载体体内表达功能的影响研究
为研究单侧ITR突变的rAAV转导体内的表达特点,我们在构建的系列通用载体pAAV2wt、pAAV2ΔB、pAAV2ΔBC,pAAV2ΔBC1/2A,pAAV2ΔBCA,pAAV2ΔBCAtrs,pAAV2ΔITR的基础上,利用TaKaRa公司 HD Cloning Plus试剂盒(货号:638909,TaKaRa,大连,中国),将Gluc的表达框CAG-Gluc-pA,插入上述载体中,构建好pAAV2wt-Gluc、pAAV2ΔB-Gluc、pAAV2ΔBC-Gluc、pAAV2ΔBC1/2A-Gluc、pAAV2ΔBCA-Gluc、pAAV2ΔBCAtrs-Gluc、pAAV2ΔITR-Gluc。
其中Gluc基因来源于pGLuc-Basic2质粒(NEB),并将其克隆入pMD18T-CAG-pA载体,该载体为本公司保存。其构建过程为,参照文献(Kiwaki K,et al.Hum Gen Ther.1996;7(7):821-830.)合成CAG启动子插入pMD18T-simple载体中,并在CAG启动子下游插入BGHpolyA(Wu ZJ,et aJ.Mol Ther.2008;16(2):280-289.),两个原件之间存在多克隆位点,便于其它外源基因的插入。
我们在Cell Biolabs公司AAV-DJ/8Helper Free Packaging System(货号:VPK-400-DJ-8,Cell Biolabs)的基础上对其进行改造。首先分析系统中rep cap质粒序列pAAV-DJ/8;再合成AAV8 cap的全序列,AAV8 cap序列来源于pCRAAV8-Fusion质粒(由美国麻省医学院高光坪教授惠赠),该质粒包含完整的AAV8的cap基因(Gao GP.,Alvira M.R.,WangL.,et al.Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors forhuman gene therapy.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:11854-11859.),其包含的AAV8的完整cap基因序列来源于AAV8全基因组序列(基因号:AF513582)。利用TaKaRa公司 HD Cloning Plus试剂盒(货号:638909,TaKaRa,大连,中国),将其重组入pAAV-DJ/8替换其中的cap序列。构建好pAAV-8作为包装AAV8的rep cap质粒。
包装重组AAV8病毒的过程同AAVDJ。以pAAV2wt-Gluc、pAAV2ΔB-Gluc、pAAV2ΔBC-Gluc、pAAV2ΔBC1/2A-Gluc、pAAV2ΔBCA-Gluc、pAAV2ΔBCAtrs-Gluc、pAAV2ΔITR-Gluc为AAV8的载体包装质粒,包装得到的rAAV8wt-Gluc、rAAV8ΔB-Gluc、rAAV8ΔBC-Gluc、rAAV8ΔBC1/2A-Gluc、rAAV8ΔBCA-Gluc、rAAV8ΔBCAtrs-Gluc、rAAV8ΔITR-Gluc病毒。参照吴小兵(Wu XB,et al.Chin Sci Bull.2001;46(6):485-489.)等报道的方法浓缩纯化病毒。分别以2×1011vg/只的用量通过尾静脉注射C57BL/6J小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司,北京,中国)。在注射的1~100天内持续监测小鼠尾静脉血的Gluc表达水平。Gluc检测应用BioLux Gaussia荧光素酶检测试剂盒(NEB)进行检测,操作过程参见说明书。结果如图9显示rAAV8ΔB-Gluc、rAAV8ΔBC-Gluc、rAAV8ΔBC1/2A-Gluc、rAAV8ΔBCA-Gluc的表达水平与rAAV8wt-Gluc近似,它们的时间变化曲线几乎重合。而rAAV8ΔBCAtrs-Gluc、rAAV8ΔITR-Gluc的表达水平比rAAV8-Gluc明显下降。这个结果与体外实验的结果一致,二者相互呼应。这说明一侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C’+1/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’(不含trs)的rAAV在体内的表达水平与ITR未缺失突变的rAAV近似,而一侧ITR缺失B/B’+C/C’+A/A’+trs或者一侧ITR完全缺失的rAAV在体内的表达水平明显下降。
实施例5系列双侧ITR突变AAV质粒载体的构建
以pAAV2ΔB、pAAV2ΔBC、pAAV2ΔBC1/2A作为系列双侧ITR突变的AAV质粒载体构建的原始骨架质粒,对三者进行了酶切位点分析,选择载体中完整的ITR为替换对象,均用Swa I和Sal I两种限制性内切酶(New England Biolabs)切除载体上的野生型完整ITR序列,剩余部分作为载体骨架;再用Hpa I和Xho I两种限制酶酶切并回收pMD18T-ITR-ΔB、pMD18T-ITR-ΔBC、pMD18T-ITR-ΔBC1/2A中的突变ITR连接入对应的载体骨架。所构建的载体分别命名为pAAV2biΔB、pAAV2biΔBC,pAAV2biΔBC1/2A。在此基础上插入报告基因EGFP的表达框CMV-EGFP-pA(Dong X,et al.PLoS ONE.2010;5(10):e13479.)构成pAAV2biΔB-CMV-EGFP、pAAV2biΔBC-CMV-EGFP,pAAV2biΔBC1/2A-CMV-EGFP等表达载体质粒,载体结构示意图如图10所示。
实施例6双侧ITR突变对重组AAV载体包装功能的影响
采用Cell Biolabs公司AAV-DJ/8Helper Free Packaging System(货号:VPK-400-DJ-8,Cell Biolabs)包装重组AAVDJ病毒,操作过程参见说明书。以pAAV2wt-CMV-EGFP(实施例1已构建)、pAAV2biΔB-CMV-EGFP、pAAV2biΔBC-CMV-EGFP,pAAV2biΔBC1/2A-CMV-EGFP作为AAV的包装质粒,包装得到的rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP、rAAVDJbiΔBC1/2A-EGFP病毒,参照吴小兵(Wu XB,et al.Chin Sci Bull.2001;46(6):485-489.)等报道的方法浓缩纯化病毒。SDS-PAGE结果显示(图11),所有病毒的外壳三条特征带清晰明显。qPCR检测集中包装获得双侧ITR突变的病毒滴度。
具体过程为,在CMV启动子中设计两条引物CMV-Q-F和CMV-Q-R,
CMV-Q-F:5’cccataaggtcatgtactgggcat3’(SEQ ID NO:6)
CMV-Q-R:5’gttcccatagtaacgccaataggg3’(SEQ ID NO:7)
以CMV-Q-F和CMV-Q-R为引物特异性地扩增CMV启动子长度为175bp片段,采用SYBRGreen染料结合法,以1μg/μl的pAAV2wt-CMV-EGFP质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品,应用SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂(Takara,大连,中国),使用荧光定量PCR仪(型号:ABI 7500fast,ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献(Ulrich-Peter Rohr,etal.Journal of Virological Methods.2002;106:81-88)。结果显示,与双侧为野生型的rAAVwtDJ-EGFP相比,各种双侧ITR删除B/B’、B/B’+C/C’的突变体重组AAV产量无明显下降,而双侧ITR删除B/B’+C/C’+1/2(A/A’)的突变体重组AAV产量显著下降,基本不能够正常包装。
ITR突变体的重组AAV病毒产量并无明显下降(表2)。
表2 3种双侧ITR突变AAV载体和野生型ITRAAV载体包装的病毒载体量比较
为了检测病双侧ITR突变的AAV毒基因组的完整性,我们进行了southern blot分析。首先,应用病毒基因组DNA提取试剂盒(百泰克,北京,中国)提取含有双侧ITR突变的rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP病毒基因组,并同时提取双侧为野生型ITR的rAAVDJwt-EGFP病毒基因组作为对照。然后,提取的所有病毒基因组依次上样,进行碱变性琼脂糖电泳,虹吸法转移至带正电的尼龙膜上,地高辛标记的CMV探针杂交,碱磷酶标记抗地高辛抗体孵育结合,BCIP/NBT检测试剂盒显色,结果如图12所示,rAAVDJwt-EGFP、rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP病毒基因组主带清晰明显。证实双侧ITR删除B/B’、B/B’+C/C’对基因组完整性无影响,并不影响AAV的包装。
由于不能收集足够的rAAVDJbiΔBC1/2A-EGFP基因组,故未对其的基因组完整性进行检测。由于该结构基本不能用于AAV的包装,故放弃继续对该载体进行体内体外表达水平的研究。
CMV探针的制备步骤:同实施例2。
实施例7双侧ITR突变对包装获得重组AAV载体体外表达功能的影响研究
将包装好的rAAVDJwt-EGFP和rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP分别以1000vg/cell转导HEK293、BHK21、Huh7和B16F10细胞。24、48、72h后,利用流式细胞仪(BD,美国)测定EGFP表达 情况,如图13-图16所示。结果表明,在4种细胞中,转导rAAVDJbiΔB-EGFP、rAAVDJbiΔBC-EGFP均比转导rAAVDJwt-EGFP细胞的EGFP表达效率高,这说明双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的rAAV能够有效地提高外源基因在细胞内的表达水平。HEK293为人胚肾细胞,BHK21为金黄地鼠肾细胞,Huh7为肝癌来源细胞系,B16F10为黑色素瘤细胞。4种细胞来源各不相同,但报告基因EGFP的表达水平均呈现相似规律,这进一步说明双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C的rAAV能够提高外源基因在细胞内表达水平的普遍性。
实施例8双侧ITR突变对包装获得重组AAV载体体内表达功能的影响研究
为研究双侧ITR突变的rAAV转导体内的表达特点,我们在构建的系列通用载体pAAV2biΔB、pAAV2biΔBC的基础上利用TaKaRa公司 HD Cloning Plus试剂盒(货号:638909,TaKaRa,大连,中国),将Gluc的表达框CAG-Gluc-pA,插入上述载体中,构建好pAAV2biΔB-Gluc、pAAV2biΔBC-Gluc。
我们以pAAV2wt-Gluc(实施例4中已构建)、pAAV2biΔB-Gluc、pAAV2biΔBC-Gluc为AAV8的包装质粒,进行rAAV8-Gluc的包装,包装重组AAV8病毒的过程同实施例4,获得rAAV8wt-Gluc、rAAV8biΔB-Gluc、rAAV8biΔBC-Gluc病毒。参照吴小兵(Wu XB,et al.ChinSci Bull.2001;46(6):485-489.)等报道的方法浓缩纯化病毒。分别以2×1011vg/只的用量通过尾静脉注射C57BL/6J小鼠。在注射的1~100天内持续监测小鼠尾静脉血的Gluc表达水平。结果如图17显示rAAV8biΔB-Gluc、rAAV8biΔBC-Gluc的表达水平明显高于rAAV8wt-Gluc,该结果与体外实验的结果一致,二者相互呼应。这说明双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的rAAV在体内的表达水平比双侧为野生型ITR的rAAV高。rAAV8biΔB-Gluc与rAAV8biΔBC-Gluc体内表达水平近似。
实施例9双侧ITR突变的新型scAAV质粒载体的构建
本公司原有的自我互补的双链AAV(self-complementary AAV,scAAV)通用型载体pscAAVwt为scAAV载体的包装质粒,一侧ITR序列为145bp的野生型ITR,另一侧ITR为删除D序列和部分trs的ITR,其构建过程参见文献(Wang Z,et al.Gene Ther.2003;10:2105-2111.)。
设计并合成突变的ITR序列:ITR-ΔBDtrs、ITR-ΔBCDtrs(Takara,大连,中国),它们分别是在ITR-ΔBC、ITR-ΔBC的基础上继续删除D序列及部分trs,目的是用于scAAV包装。合成的ITR-ΔBDtrs、ITR-ΔBCDtrs克隆于pMD18T-simple载体中(Takara,大连,中国),命名为pMD18T-ITR-ΔBDtrs、pMD18T-ITR-ΔBCDtrs。
分析酶切位点,将ITR-ΔB、ITR-ΔBC从pMD18T-ITR-ΔB、pMD18T-ITR-ΔBC切下,分别替换原pscAAV2wt中上游野生型ITR,并在此基础上用ITR-ΔBDtrs、ITR-ΔBCDtrs进一步分别替换缺失D序列及部分trs的下游ITR。于是构建好双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的scAAV通用型载体。将构建的载体分别命名为pscAAVbiΔB、pscAAVbiΔBC(结构示意图如图18所示)。在此基础上,连同pscAAVwt分别插入报告基因EGFP、Gluc的表达框CMV-EGFP-pA、CAG-Gluc-pA,构成了pscAAVwt-CMV-EGFP、pscAAVbiΔB-CMV-EGFP、pscAAVbiΔBC-CMV-EGFP;pscAAVwt-Gluc、pscAAVbiΔB-Gluc、pscAAVbiΔBC-Gluc。
ITR-ΔBDtrs、ITR-ΔBCDtrs及ITR-ΔBC1/2ADtrs序列如下:
ITR-ΔBDtrs
5’TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG3’(SEQ ID NO:8)
ITR-ΔBCDtrs
5’TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCCGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG3’(SEQ ID NO:9)
实施例10基于新型双侧为缺失突变ITR的scAAV质粒的重组scAAV载体包装及体内外表达研究
我们以pscAAVwt-CMV-EGFP、pscAAVbiΔB-CMV-EGFP、pscAAVbiΔBC-CMV-EGFP为scAAV载体 的包装质粒,包装rscAAVDJ-CMV-EGFP,包装方法同实施例2。获得了rscAAVDJwt-EGFP、rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP病毒,根据吴小兵(Wu XB,Dong XY,Wu ZJ,et al.A novel method for purification of recombinant adeno-associated virus vectors on a large scale.Chin Sci Bull,2001,46(6):485-489.)等报道的方法浓缩纯化病毒。SDS-PAGE结果显示(图19),所有病毒的外壳三条特征带清晰明显。qPCR检测集中包装获得双侧ITR突变的scAAV滴度,结果如表3所示与传统的rscAAVDJwt-EGFP相比,产量并无明显下降。
表3 4种双侧ITR突变scAAV载体和传统scAAV载体包装的病毒载体量比较
为了检测病毒基因组的完整性,我们对包装获得的rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP和进行了southern blot分析。首先,我们提取含有双侧ITR突变的rscAAV基因组,并同时提取传统的rscAAVDJwt-EGFP病毒基因组作为对照。然后,提取的所有病毒基因组依次上样,进行碱变性琼脂糖电泳,虹吸法转移至带正电的尼龙膜上,地高辛标记的CMV探针杂交,碱磷酶标记抗地高辛抗体孵育结合,BCIP/NBT检测试剂盒显色,结果如图20所示,rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP基因组主带清晰明显,约80%以上的病毒基因组为双链。证实双侧ITR删除B/B’、B/B’+C/C’对包装scAAV基因组完整性无影响,并不影响scAAV的包装。
为研究双侧ITR突变的rscAAV的体外表达特点,将包装好的rscAAVDJwt-EGFP和rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP分别以1000vg/cell(viral genome,vg)转导HEK293和B16F10细胞。24、48、72h后,利用流式细胞仪(BD,美国)测定EGFP表达情况,如图21-图22所示。结果表明,在2种细胞中,转导rscAAVDJbiΔB-EGFP、rscAAVDJbiΔBC-EGFP均比转导rscAAVDJwt-EGFP细胞的EGFP表达效率高,这说明双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的rscAAV能够有效地提高外源基因在细胞内的表达水平。HEK293为人胚肾细胞,B16F10为黑色素瘤细胞。前者对AAV比较敏感,容易转导;后者则不敏感,转导比较困难,但报告基因的EGFP的表达水平均呈现相似规律,这进一步说明双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的rscAAV能够提高外源基因在细胞内表达水平的普遍性。
为研究双侧ITR突变的rscAAV转导体内的表达特点,我们以pscAAVwt-Gluc、pscAAVbiΔB-Gluc、pscAAVbiΔBC-Gluc为rscAAV8的包装质粒,包装获得rscAAV8wt-Gluc、rscAAV8biΔB-Gluc、rscAAV8biΔBC-Gluc、病毒,包装方法同实施例4。分别以2×1011vg/只的用量通过尾静脉注射C57BL/6J小鼠。在注射的1~100天内持续监测小鼠尾静脉血的Gluc表达水平。结果如图23显示rscAAV8biΔB-Gluc、rscAAV8biΔBC-Gluc的表达水平明显高于rscAAV8wt-Gluc,该结果与体外实验的结果一致,二者相互呼应。这说明双侧ITR缺失B/B’、B/B’+C/C’的rscAAV在体内的表达水平比传统的rscAAV高。rscAAV8biΔB-Gluc与rscAAV8biΔBC-Gluc之间的体内表达水平近似。
实施例11高效表达人凝血九因子的AAV载体及其应用
我们在构建好的pscAAVwt、pscAAVbiΔB、pscAAVbiΔBC通用载体基础上,利用TaKaRa公司HD Cloning Plus试剂盒(货号:638909,TaKaRa,大连,中国)插入人凝血九因子hFIX的表达框LP1-hFIX-pA,构建成pscAAVwt-hFIX、pscAAVbiΔB-hFIX、pscAAVbiΔBC-hFIX等表达载体质粒。 LP1-hFIX-pA表达框参见文献(Nathwani AC,etal.Blood.2006;107:2653-2661.)中载体scAAV-LP1-FIXco中LP1-FIXco表达框,序列信息见该参考文献的补充材料。应用它们进行rscAAV8包装。得到rscAAV8wt-hFIX和rscAAV8biΔB-hFIX、rscAAV8biΔBC-hFIX。包装方法同实施例4。将这3种病毒载体分别以5×1011vg/只的剂量通过尾静脉注射FIX基因敲除的模型小鼠,购于Jackson laboratory(BarHarbor,Maine,USA)。在随后的1~365天内,应用FIX抗原检测试剂盒(Enzyme ResearchLaboratories,UK)检测模型小鼠的hFIX的表达,操作过程参考试剂盒说明书。测定模型小鼠的hFIX的表达后,绘制时间变化曲线,如图24所示rscAAV8biΔB-hFIX、rscAAV8biΔBC-hFIX的hFIX表达量明显高于对照的rscAAV8wt-hFIX。
实施例12高效表达人凝血八因子的AAV载体及其应用
我们在构建好的pAAV2wt、pAAV2biΔB、pAAV2biΔBC通用载体基础上,利用TaKaRa公司HD Cloning Plus试剂盒(货号:638909,TaKaRa,大连,中国)插入人凝血八因子hFVIII的表达框LP1-hFVIII-pA,该表达框结构等同于实施例11中LP1-hFIX-pA表达框,只是用合成的hFVIII编码序列替换其中的hFIX编码序列,hFVIII编码序列结构组成参见文献(Lind P,et al.Eur J Biochem.1995;232:19-27.)中的r-VIII SQ设计,具体序列信息来源于基因序列号NM_000132。构建好pAAV2wt-hFVIII、pAAV2biΔB-hFVIII、pAAV2biΔBC-hFVIII等表达载体质粒。应用它们进行rAAV8包装。得到rAAV8wt-hFVIII和rAAV8biΔB-hFVIII、rAAV8biΔBC-hFVIII。包装方法同实施例4。将这3种病毒载体分别以5×1011vg/只的剂量通过尾静脉注射FVIII缺陷的模型小鼠,购于Jackson laboratory(Bar Harbor,Maine,USA)。在随后的1~365天内,监测小鼠的hFVIII的表达,绘制时间变化曲线,如图25所示rAAV8biΔB-hFVIII、rAAV8biΔBC-hFVIII的hFVIII表达量明显高于对照的rAAV8wt-hFVIII。
名词解释
AAV:adeno-associated virus,腺相关病毒。
ITR:inverted terminal repeat,反向末端重复序列。
EGFP:enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白。
Gluc:Gaussia luciferase,一种来源于海洋桡角类动物Gussia的分泌型荧光素酶。
CAG:一种由人巨细胞增强子、鸡beta-actin基础启动子构成的启动子。
WPRE:woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element。