CN101724608A - 用于重组aav2/8病毒载体生产的重组i型单纯疱疹病毒及其用途 - Google Patents
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Abstract
发明了能够提供腺病毒相关病毒载体AAV2/8包装所需辅助功能的重组单纯疱疹病毒HSV1-rep2cap8。其结构特征是在1型单纯疱疹病毒(HSV1)基因组中插入了rep2cap8基因片段。HSV1-rep2cap8能在细胞上稳定传代，并可用于AAV2/8载体的大规模制备。
Description
本发明属于生物技术发明领域。具体涉及一种携带8型腺相关病毒(AAV8)外壳蛋白基因和AAV2病毒rep基因的重组单纯疱疹病毒HSV1-rep2cap8，以及用HSV1-rep2cap8制备AAV2/8病毒的方法。这种重组单纯疱疹病毒能提供AAV2ITR载体质粒在细胞内复制和包装成rAAV2/8毒粒所需的全部辅助功能，并能用于rAAV2/8的大量制备。HSV1-rep2cap8是通过对一套含有HSV1病毒全基因组的粘性质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)进行基因操作，将rep2cap8片段插入HSV1基因组的非必需基因中得到。
背景
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)因在腺病毒制品中发现而得名。腺伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科(parvovirus)成员，其基因组为4682个核苷酸组成的单链DNA。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”(ITR)，呈回纹-发卡结构。基因组中有两个大开放阅读框(ORF)，分别编码rep和cap基因。AAV-2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中。其中含有2个各145bp长的倒转末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)。它们是AAV基因组的复制起点，并与AAV复制、整合或包装等功能有关。其基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR种的末端解链位点trs(terminal resolutionsite)和GAGY重复基序(repeat motif)特异性结合，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能构成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1∶1∶20。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
AAV病毒载体因为安全性好、感染的宿主范围广泛、能稳定表达外源基因而成为有应用前景的病毒载体。AAV载体通常是用外源基因的表达单位(包括启动子、外源基因、mRNA加尾信号和/或其它调控元件)替代AAV病毒的repcap基因，保留两端的ITR，包装到AAV病毒颗粒中形成一种“假型病毒”(pseudotyped virus)。
产生rAAV病毒的最经典方法为将rAAV载体质粒与含有rep-cap基因的辅助质粒导入腺病毒或单纯疱疹病毒感染的细胞中。2-3天后从培养上清及病变的细胞中即可收获到rAAV病毒，同时还含有所用的腺病毒或单纯疱疹病毒。腺病毒和单纯疱疹病毒都可用热处理(55℃30分钟至2小时)而灭活，但不影响AAV病毒的活性。虽然这种生产rAAV病毒的方法比较简单，但仍存在许多明显的缺点。首先，每次制备rAAV病毒时都需要转染细胞。由于转染方法自身的限制，转染及共转染效率较低，是产生rAAV病毒滴度较低的原因之一。而且，用转染方法目前还难以大规模转导细胞，因此不适应大量生产rAAV病毒的需要。因此，有必要研究一种能用于大量生产rAAV病毒的系统和方法。
早期的AAV载体是通过对在2型AAV(AAV2)病毒基因组克隆进行基因操作而实现的。AAV2基因组长度约4.7kb，由两端的ITR(145bp)、rep ORF、capORF三部分组成。为了使AAV载体能够携带外源基因及表达元件，往往将两个ITR之间的rep和capORF除去，代之以外源基因的表达单位，比如CMV-EGFP-polyA，构建成ITR-CMV-MCS-polyA-ITR的结构。用带有大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因(如ampR，氨苄抗性基因)的质粒骨架携带ITR-CMV-MCS-polyA-ITR结构即构成AAV2载体质粒(MCS，multiple cloning sites多克隆位点)，比如Stratagene公司商品化的pAAV-MCS质粒。
为了便于将AAV载体质粒转染到细胞中形成稳定的“载体细胞株”，而不是每次都将AAV载体质粒用转染方法导入细胞中，吴小兵等将ITR-CMV-MCS-SV40polyA-ITR结构插入pSV2neo质粒的BamHI切点中，构建成pSNAV载体质粒(中国专利申请号99119038.6，系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途)。将外源基因克隆到pSNAV或其衍生载体中的启动子下游，转染到生产细胞如BHK21或HEK293等细胞中，加G418400～800ug/ml选择培养10～15天，即可得到稳定携带所转染的AAV载体质粒的G418抗性细胞。
同样，为了省去每次包装AAV病毒时将两个复制质粒用转染方式导入细胞的麻烦，吴小兵等将AAV2的rep-cap基因置于HSV1基因组中，构建成用于简便而大量生产rAAV病毒的全功能辅助病毒HSV-rc(中国专利申请号98120033.8)。用HSV-rc感染rAAV病毒载体质粒瞬时转染的细胞或上述稳定携带AAV病毒载体质粒的细胞株，就能产生大量有感染性的rAAV毒粒。用这种方法产生的rAAV能将外源基因导入哺乳动物细胞中并表达。(伍志坚，吴小兵等，科学通报。1999，44(5)：506-509。伍志坚，吴小兵等，中国科学C辑。2001，31(5)：423-430。WU Zhijian，WU Xiaobing，et al.Science in China(Series C).2002，45(1)：96-104。WU Zhijian，WU Xiaobing，et al.Chinese Science Bulletin。1999，44(8)：715-718。)这种包装策略比目前国际上常用的三质粒或双质粒共转染细胞法生产AAV病毒的优势在于用“感染方式”替代了“转染方式”，最大的特点是便于AAV病毒大规模生产。
随后用同样的策略，吴小兵等就一系列用于包装1至6型AAV病毒外壳包装的AAV2ITR载体的全功能辅助病毒，申报了中国发明专利(专利申请号为02117965.4)。主要的发明内容是将AAV2的rep基因分别与不同血清型(1至6)的AAV病毒的cap基因连接得到rep2cap(1-6)，插入到重组单纯疱疹病毒的HSV1UL2基因(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或者HSV1UL44基因(编码糖蛋白C)的XbaI位点中，构建成为重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c1、HSV1-r2c3、HSV1-r2c4、HSV1-r2c5、HSV1-r2c6。这种策略在HSV-r2c1包装rAAV2/1载体获得了与包装AAV2/2相似的高包装效率，用这种方法制备的AAV2/1在骨骼肌、心肌、神经系统等方面得到了广泛应用。然而，我们的实验中发现无论是把rep2cap5插入在UL2或UL44中，获得的HSV1-r2c5包装AAV2/5却效率极低。这一事实说明用这一策略构建的HSV-RC是否能高效包装相应的AAV病毒，还需要用实验来证明。
选择HSV1UL2基因和HSV1UL44基因作为rep-cap基因的插入位点，是因为它们含有一个XbaI单切点、便于XbaI-repcap-XbaI片段插入。HSV1UL2基因位于cos6所携带的HSV1片段中，UL2中的XbaI切点在整个粘粒中是单切点；HSV1UL44基因位于cos56所携带的HSV1片段中，UL44中的XbaI切点在整个粘粒中是单切点。除此之外，选择了HSV1UL2基因和HSV1UL44基因作为rep-cap基因的插入位点还因为它们所编码的蛋白(UL44基因编码糖蛋白C，UL2基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶)对于病毒在细胞中的复制和增殖是非必需的。
AAV7和AAV8是美国宾西法尼亚大学James M.Wilson实验室的高光坪博士首次报道的(11854-11859_PNAS_September 3，2002_vol.99_no.18)。作者在该论文中强调了AAV7和AAV8作为载体将在基因治疗中具有价值。有趣的是，这两种病毒的基因和序列并不是通过传统的病毒分离方法获得病毒得到的，而是依据已经发现的各种AAV病毒序列的同源性设计引物采用PCR方法从恒河猴组织中扩增出来的。AAV7和AAV8的全长序列登录在GenBank(accession numbers：AAV7，AF513851；and AAV8，AF513852)中。随着对AAV2/8载体的研究和应用的深入，科学家们发现AAV2/8载体在肝脏、肌肉、视网膜、神经系统、胰腺等组织中都具有良好的组织嗜性和转导效率。尤其是发现随着剂量的增大，AAV2/8载体能够转染几乎100％的肝细胞。AAV8载体的这些特点使得它具有广泛的应用潜力。然而，高效、低廉地大量制备rAAV2/8病毒成为其深入研究和应用的技术关键。在国际上，rAAV2/8病毒的制备方法最常用的还是与rAAV2病毒的制备一样，即用三质粒共转染方法，将AAV2ITR载体质粒、rep2cap8质粒和腺病毒辅助质粒(含有腺病毒E2A、E4ORF6、VA RNA基因)共转染293细胞。这种方法能够快速、高效地制备rAAV2/8病毒，但是需要大量转染细胞，不利于规模化生产。
本发明拟解决rAAV2/8病毒的规模化生产问题。为此，设计和实施了所述的携带rep2cap8基因的重组单纯疱疹病毒，提供在哺乳动物细胞中包装rAAV2/8病毒的全部辅助功能。
发明概述
本发明提供了具有包装rAAV2/8病毒的全功能辅助病毒rHSV1-rep2cap8及其用途和使用方法。具体地提供了HSV1-rep2cap8/ΔUL23和HSV1-rep2cap8/ΔUL2两种重组单纯疱疹病毒。rHSV1-rep2cap8/ΔUL23病毒的特征在于在HSV-1基因组的UL23基因中插入了一个拷贝的rep2-cap8基因(4.3kb，方向不限定)。HSV1-rep2cap8/ΔUL2病毒特征在于在HSV-1基因组的UL2基因中插入了一个拷贝的rep2-cap8基因(4.3kb，方向不限定)。
这两种重组单纯疱疹病毒都具有将含有AAV2病毒2个ITR的AAV载体有效包装成重组AAV2/8病毒的功能。
发明详述
本发明的目的是构建携带rep2cap8基因的重组单纯疱疹病毒作为辅助病毒，用来组建rAAV2/8载体的高效包装系统，用于大量制备重组腺相关病毒rAAV2/8。所构建的辅助病毒的特征是在I型人单纯疱疹病毒的基因组中插入了rep2cap8基因。
研究中我们发现，将repcap基因插入UL44中获得的HSV1-rc/ΔUL44病毒在细胞中的增殖能力被减弱，主要因为病毒的经培养液播散受阻，而细胞-细胞之间的播散不受影响。而将repcap基因插入HSV1UL2基因中获得的HSV1-rc/ΔUL2病毒的增殖能力则与野生型HSV1相似。由此，我们更倾向于将repcap片段插入由UL2基因中。除了UL2和UL44以外，UL23是另一个可供选择的插入基因。UL23编码胸苷激酶基因(TK基因)。
本发明选择了HSV1的UL2基因和UL23基因作为插入位置。UL2和UL23基因分别编码尿嘧啶DNA糖基化酶和胸苷激酶，对于HSV1病毒在细胞培养中的复制和增殖都是非必需的。
本发明用于构建重组病毒HSV-rc的原始生物材料有：
1)setC粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56。
由Dr.Davision AJ惠赠提供。setC粘粒包括名称分别为cos6，cos14，cos28，cos48，cos56的重组粘粒一共五个，每个粘粒都携带一段I型单纯疱疹病毒17株(HSV1 17strain)的基因组，每个粘粒中所装载的每一HSV-1病毒基因组片段的末端与装载于另一粘粒中的HSV-1片段的末端序列是有重叠的，这是5个HSV-1基因组片段在细胞中发生同源重组的基础。HSV117strain的全长152261bp，在基因库(gene bank)中的序列号是NC_001806。依据文献(CharlesCunningham，Andrew J Davison，A Cosmid-Based System for Constructing Mutants of HernesSimplex Virus Type 1，Virology，197，116-124，1993)报道，cos6中插入了HSV1病毒17株(HSV1strain17)基因组141221至29733位(首尾相接)；cos14中插入了HSV1病毒17株(HSV1strain17)基因组24599至64405位；cos28中插入了HSV1病毒17株(HSV1strain17)基因组54445至90477位；cos48中插入了HSV1病毒17株(HSV1strain17)基因组79442至115152位；cos56中插入了HSV1病毒17株(HSV1strain17)基因组107496至144681位。
2)pAAV2/8质粒，携带了rep2cap8基因。rep2cap8基因是由来源于AAV2(Genbank号NC001401)的rep基因ORF(1737bp)和来源于AAV8(Genbank号NC 006261)的cap基因ORF(2214bp)连接而成，总长度3970bp，具体结构和序列见United States Patent 7,282,199。
rHSV1-rep2cap8重组病毒的制备方法：
setC的5个粘粒中的每个HSV1基因组片段都是用PacI位点插入的，因此用PacI酶切可以将其中的HSV1基因组片段完整切出；每个粘粒中的HSV1基因片段末端与另一个粘粒中所携带的临近HSV1基因组片段的末端在序列上有重叠。当将setC的5个粘粒按等摩尔数混合，用PacI酶切获得5个首尾相互在序列上有重叠的HSV1基因组片段(它们覆盖了HSV1基因组全长)，用脂质体方法转染BHK21细胞，或用磷酸钙共沉淀方法共转染293细胞，2.5～3天后即可观察到病毒噬斑(plaques)和CPE(细胞病理变化)现象，产生的是HSV1strain17病毒。setC粘粒的这种重组出感染性HSV1病毒的特性是本发明获得rHSV1-rep2cap8病毒的基础。
本发明的rHSV1-rep2cap8病毒的特征是在HSV1strain17病毒基因组中插入了rep2cap8基因。其中插入到HSV1UL23基因中形成的重组病毒命名为rHSV1-rep2cap8/ΔUL23；插入到HSV1UL2基因中形成的重组病毒命名为rHSV1-rep2cap8/ΔUL2。在本发明中，我们用rHSV1-rep2cap8代表rHSV1-rep2cap8/ΔUL23或rHSV1-rep2cap8/ΔUL2两种病毒中任意一种。
本发明所产生的rHSV1-rep2cap8/ΔUL23病毒的生产过程是，用PCR方法在rep2cap8基因片段两端加NsiI位点；将NsiI-rep2cap8-NsiI片段插入cos28的UL23基因NsiI位点中，获得重组粘粒cos28-rep2cap8；将cos28-rep2cap8与cos6，cos14，cos48，cos56组合命名为set8-ΔUL23。将set8-ΔUL23等摩尔混合，用PacI酶切切去粘粒骨架部分后，用脂质体方法共转染HSV1敏感细胞如BHK-21，5～9天后出现病毒噬斑和CPE。5个HSV-1片段在细胞中发生同源重组而产生重组病毒rHSV1-rep2cap8/ΔUL23。
本发明所产生的rHSV1-rep2cap8/ΔUL2病毒的生产过程是，用XbaI将rep2cap8基因从pAAV2/8中切出回收，插入cos6的UL2基因XbaI位点中，获得重组粘粒cos6-rep2cap8；将cos6-rep2cap8与cos14，cos28，cos48，cos56组合命名为set8-ΔUL2。将set8-ΔUL2粘粒等摩尔混合，用PacI酶切切去粘粒骨架部分后，用脂质体方法共转染HSV1敏感细胞如BHK-21，5～9天后出现病毒噬斑和CPE。5个HSV-1片段在细胞中发生同源重组而产生重组病毒rHSV1-rep2cap8/ΔUL2。
rHSV1-rep2cap8病毒的功能：
用rHSV1-rep2cap8病毒感染AAV载体质粒转染的细胞(BHK21，293细胞或其它对HSV1病毒敏感的细胞)，rHSV1-rep2cap8病毒能在细胞中复制并表达rep2和cap8基因；rep2基因编码4种蛋白(rep78，rep68，rep52，rep40)，它们能将AAV2载体质粒上的2个ITR及其间的序列从质粒骨架上“拯救”下来，并大量复制，产生单链的基因组DNA(ss DNA)；cap8基因编码3种cap蛋白(VP1，VP2，VP3)，它们装配形成AAV8外壳颗粒；最后ssDNA包装到AAV8外壳中形成重组AAV2/8病毒。为了避免AAV病毒包装过程中的转染步骤，可将AAV载体质粒转染到细胞中，利用质粒骨架上的新霉素抗性基因(neo基因)的特性，加G418(200～800ug/ml)至细胞培养液中进行筛选，获得G418抗性细胞，AAV载体基因组即能稳定存在于细胞中；再加rHSV1-rep2cap8病毒感染这种G418抗性细胞，rHSV1-rep2cap8病毒可在细胞中复制并表达rep2和cap8基因、拯救和包装出重组AAV载体病毒。
除了可用于包装携带AAV2ITR的AAV载体之外，rHSV1-rep2cap8病毒还可以用来包装scAAV或称为dsAAV病毒。
以下实施例对本发明的用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的制备和用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。
实施例1pAAV2neo质粒的构建
从pSNAV质粒中用BglII和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳收集大片段，弃去小片段SV40polyA，用PCR方法从pcDNA3.1(商品化)质粒中扩增出bGH polyA(牛生长激素polyA)片段，引物上游加BglII位点，引物下游加BamHI位点；将BglII-bGH polyA-BamHI片段连入上述大片段，获得pAAV2neo质粒。该质粒结构包含的AAV载体相关结构是ITR-CMV-MCS-bGH polyA-ITR，MCS是多克隆位点，从5’端至3’端的克隆位点依次是KpnI、EcoRI、SalI、BglII。在CMV启动子与上游ITR之间有一个XhoI单切点，可用于卸下CMV启动子，换成其它启动子等调控元件；bGH polyA与下游ITR之间有一个单一的BamHI切点。之所以用bGH polyA替代SV40polyA，是因为考虑到pSNAV质粒骨架中还含有一个SV40polyA(在neo基因下游)，另外还因为bGH polyA能使产生的mRNA更稳定。
实施例2pAAV2neo-EGFP质粒的构建
将绿色荧光蛋白(EGFP)基因用PCR方法扩增出来，PCR的上游引物上设计KpnI位点，下游引物上设计SalI位点；用KpnI和SalI双酶切pAAV2neo DNA；将EGFP片段与双酶切的pAAV2neo载体连接，转化DH5α感受态菌，对转化菌落进行质粒提取和酶切鉴定，最后获得pAAV2neo-EGFP质粒。
实施例3cos6-rep2cap8的构建
用XbaI单酶切pAAV2/8质粒，电泳可见2.9kb与4.3kb两条片段；回收4.3kb的片段(为rep2cap8)；用XbaI单酶切cos6DNA并用碱性磷酸酶对切点端进行去磷酸化；将4.3kb的rep2cap8基因片段与酶切和去磷处理的cos6DNA连接；转化DH5α感受态菌，对转化菌落进行质粒提取和酶切鉴定，挑选出在XbaI位点插入了4.3kb片段的重组质粒(不考虑插入方向，正反都可以)；用PCR方法进一步证实rep2cap8基因的存在；并在cos6的XbaI位点两侧设计引物对插入片段两端进行测序，证实了rep2cap8的插入并可判断插入方向。
实施例4cos28-rep2cap8的构建
先用PCR方法对pAAV2/8质粒的rep2cap8片段两端加上NsiI，克隆到T载体中，构建成pT-rep2cap8/NsiI；全长测序证明rep2cap8序列正确。
用NsiI单酶切pT-rep2cap8/NsiI DNA，电泳可见2.9kb与4.3kb两条片段；回收4.3kb的片段(为rep2cap8)；用NsiI单酶切cos28DNA并用碱性磷酸酶对切点端进行去磷酸化；将4.3kb的rep2cap8基因片段与酶切和去磷处理的cos28DNA连接；转化DH5α感受态菌，对转化菌落进行质粒提取和酶切鉴定，挑选出在XbaI位点插入了4.3kb片段的重组质粒(不考虑插入方向，正反都可以)；用PCR方法进一步证实rep2cap8基因的存在；并在cos28的NsiI位点两侧设计引物对插入片段两端进行测序，证实了rep2cap8的插入并可判断插入方向。
实施例5rHSV1-rep2cap8/ΔUL2的制备
将cos6-rep2cap8与cos14，cos28，cos48，cos56共5个粘粒等摩尔混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分离去除骨架片段)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍无水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul与10ug DNA按产品说明书共转染80％铺满的BHK-21细胞(约2×106)细胞，5个HSV-1片段将在细胞内发生同源重组而产生HSV-rc重组病毒。转染24h后换用含2％FBS的1640培养液37℃培养，1～2天换液一次。5～9天后细胞开始出现病变，待细胞完全病变后收培养液上清，2000r/min离心5min，上清作为原始毒种分装保存于-70℃。对获得的重组病毒进行3次空斑纯化，可得到纯一的rHSV1-rep2cap8/ΔUL2病毒。
实施例6rHSV1-rep2cap8/ΔUL23的制备
将cos28-rep2cap8与cos6，，cos14，cos48，cos56共5个粘粒等摩尔混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分离去除骨架片段)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍无水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul与10ug DNA按产品说明书共转染80％铺满的BHK-21细胞(约2×106)细胞，5个HSV-1片段将在细胞内发生同源重组而产生HSV-rc重组病毒。转染24h后换用含2％FBS的1640培养液37℃培养，1～2天换液一次。5～9天后细胞开始出现病变，待细胞完全病变后收培养液上清，2000r/min离心5min，上清作为原始毒种分装保存于-70℃。对获得的重组病毒进行3次空斑纯化，可得到纯一的rHSV1-rep2cap8/ΔUL23病毒。
实施例7稳定转染pAAV2neo-EGFP质粒DNA的细胞建立
将pAAV2neo-EGFP质粒DNA用lipofectamine2000按Invitrogen公司说明书操作方法分别转染到BHK21和293细胞中，24hr后加G418800ug/ml选择培养15天，获得G418抗性细胞。即为BHK21/pAAV2neo-EGFP细胞或293/pAAV2neo-EGFP细胞。这些细胞携带了AAV载体DNA，可以用于包装重组AAV病毒。对这些G418抗性细胞进行单克隆化，挑选出表达目的基因(绿色荧光蛋白)的细胞株分别保种。
再用rHSV1-rep2cap8病毒感染各个细胞株，48hr后收集细胞和上清，反复冻融3次，离心取上清，感染24孔板中新鲜的BHK21细胞，36hr后观察绿色荧光细胞的比率和强度，选出比率和强度高的细胞株备AAV载体包装用。
实施例8用rHSV1-rep2cap8感染pAAV2neo-EGFP转染的细胞制备rAAV2/8-EGFP
用rHSV1-rep2cap8病毒感染瞬时转染了pAAV2neo-EGFP质粒DNA的BHK21细胞，或稳定携带了pAAV2neo-EGFP DNA的BHK21(BHK21/pAAV2neo-EGFP)细胞，细胞病变(36-72h)后反复冻融3次裂解细胞以释放细胞中的rAAV-GFP，低速离心去除细胞碎片，取上清56℃30～60min灭活辅助病毒，其中即含有rAAV2/8-EGFP，可用于感染培养的哺乳动物细胞。
实施例9用rHSV1-rep2cap8感染pdsAAV2-EGFP转染的细胞制备双链AAV2/8-EGFP(dsAAV2/8-EGFP)
pdsAAV2-EGFP质粒由XIAO XIAO博士提供。它的主要特征是所携带的2个AAV2ITR中的一个ITR是缺失突变的，在包装过程中突变的ITR不能被切割，从而形成dsAAV。在pdsAAV2-EGFP的质粒骨架上插入neo基因表达单位，形成pdsAAV2neo-EGFP。
在用rHSV1-rep2cap8病毒感染瞬时转染了pdsAAV2neo-EGFP质粒DNA的BHK21细胞，或稳定携带了pdsAAV2neo-EGFP DNA的BHK21(BHK21/pAAV2neo-EGFP)细胞，细胞病变(36-72h)后反复冻融3次裂解细胞以释放细胞中的rAAV-GFP，低速离心去除细胞碎片，取上清56℃30～60min灭活辅助病毒，其中即含有rdsAAV2/8-EGFP，可用于感染培养的哺乳动物细胞。
实施例10rAAV病毒转导培养细胞
取上述rAAV2/8-EGFP病毒上清和rdsAAV2/8-EGFP上清1ml分别加入培养的BHK21细胞(80％铺满)中，24-48h后在荧光显微镜下(激发光波长490nm)观察，均可见到大量的绿色细胞。表明产生的rAAV2/8-EGFP病毒具有感染性，并能将外源基因导入细胞中表达。
相关专利文献
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引用专利文献：
United States Patent 7,282,199 October，2007 Gao，et al.
名词及缩写词解释
1、AAV：adeno-associated virus，腺相关病毒。
2、ITR：inverted terminal repeat，倒转末端重复。
3、AAV2：2型AAV病毒。
4、AAV8：8型AAV病毒。
5、AAV2/8：假8型AAV病毒，由8型AAV病毒的外壳包裹携带2型AAV病毒2个ITR及其间的其它序列组成。
6、AAV2载体质粒：是指携带了AAV2病毒ITR的质粒DNA。本发明中所用的ITR都是来自AAV2的ITR。所述的AAV载体质粒一般由ITR-启动子-目的基因或阻断序列-ployA-ITR以及E.coli质粒骨架组成。质粒骨架上携带了neo基因的表达单位。
7、ssAAV载体：单链AAV载体。通常AAV病毒基因组即是单链结构。
8、dsAAV：双链AAV载体，又称为自身互补AAV载体，是由2个拷贝的AAV病毒基因组连接形成自身互补的发夹DNA而构成“双链”DNA。
9、rep2cap8基因：由AAV2的rep和AAV8的cap连接而成。
10、HSV1：单纯疱疹病毒1型
11、rHSV1-rep2cap8：在基因组中插入了rep2cap8基因的重组HSV1病毒，在本发明中又特指HSV1-rep2cap8/ΔUL23和HSV1-rep2cap8/ΔUL2，分别是将rep2cap8基因插入HSV1基因组的UL23基因和UL2基因中。
12、HSV1UL2：尿嘧啶DNA糖基化酶基因
13、HSV1UL23：胸苷激酶基因
14、cos：cosmid，粘粒
Claims (9)
1.本发明涉及生产重组腺伴随病毒rAAV2/8所需的复制和包装功能系统。本发明提供一种装载了2型腺相关病毒(AAV-2)rep和8型腺相关病毒cap基因(约4.3kb)的重组单纯疱疹病毒(rHSV1-rep2cap8)及其产生方法和其在重组腺伴随病毒rAAV2/8生产中的用途。本发明提出的能提供rAAV2/8复制和包装所需的全部功能的辅助病毒rHSV1-rep2cap8其特征在于，通过对一套含有HSV-1全基因组的粘粒(SetC)进行基因操作，将rep2cap8基因插入到在HSV-1基因组片段中，然后将其与其余4个粘粒共转染细胞，获得含有rep2cap8的重组HSV-1。该重组病毒既能作为在细胞中产生rAAV2/8所需要的辅助病毒功能，又能提供rep2cap8基因的功能，因此是一种在细胞中生产rAAV2/8的全功能辅助病毒。
2.依据权利要求1，本发明所述的rHSV1-rep2cap8，其特征在于rep2cap8基因分别插入在HSV-1 UL2基因(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)和HSV-1 UL23基因(编码胸苷激酶基因)中，获得的重组病毒分别称为rHSV1-rep2cap8/ΔUL2和rHsV1-rep2cap8/ΔUL23。
3.依据权利要求1，本发明所述的rHSV1-rep2cap8病毒用于rAAV2/8病毒的生产。
4.依据权利要求1，本发明所述的rHSV1-rep2cap8病毒用于rAAV2/8病毒的生产的方法是用rHSV1-rep2cap8病毒感染携带了AAV2ITR及其间插入序列的载体细胞，包装产生rAAV2/8病毒。
5.依据权利要求4，所述的载体细胞是瞬时转染了AAV载体质粒的细胞。
6.依据权利要求4，所述的载体细胞是稳定转染了AAV载体质粒的细胞。
7.依据权利要求4，所述的载体细胞是瞬时转染了双链AAV载体质粒的细胞。
8.依据权利要求4，所述的载体细胞是稳定转染了双链AAV载体质粒的细胞。
9.依据权利要求4，所述的插入序列可包括了启动子、目的基因、polyA加尾信号等。
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