WO2019245353A1 - 사이토카인 융합 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 사이토카인 라이브러리 - Google Patents

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WO2019245353A1
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homo sapiens
dh10b
reverse
tona
cytokine
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PCT/KR2019/007602
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예경무
김민석
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재단법인 대구경북과학기술원
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • Cytokine fusion polypeptides and cytokine libraries comprising the same.
  • Cytokines refer to proteins, peptides, and glycoproteins secreted by a variety of cells, including immune cells, and through autocrine, paracrine, cell activation, differentiation, cell migration, Regulates a variety of biological activities, including aging and death. Changes in cell activity by cytokines can be cytokine specific, due to interactions with receptors on the cell surface and resulting cell signal transduction.
  • receptors expressed on the surface of all cells have a specific function, and the above functions are known to have a high correlation with cell specific functions.
  • Receptors present on the surface of these cells serve to sense signals from the outside and amplify the signals they receive in the form of secondary messengers, enabling cellular activities such as metabolism, secretion, release and cell growth. do.
  • a specific ligand is bound to an extracellular part, specifically a part located on a cell membrane
  • the receptor induces modification in the intracellular part by interacting with the ligand and performs various functions of the cell by initiating signal transmission.
  • Cytokines are protein mediators and can have a significant impact on this series of biological processes. That is, cytokines are regulated by activation or inactivation of cytokine genes by specific cell signaling, which are closely involved in biological or pathological changes in the cell.
  • cytokine One aspect is cytokine; Transmembrane domain; And it provides a fusion polypeptide comprising a linker connecting the cytokine and the cell membrane penetration domain.
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the fusion polypeptide.
  • Another aspect is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Another aspect is to provide a host cell comprising the vector.
  • Another aspect is to provide a cytokine library comprising the fusion polypeptide, polynucleotide, vector, or host cell.
  • Another aspect includes identifying a change in any one selected from the group consisting of a biological change in a cell by cytokines, a change in expression or activity of an exogenous or endogenous gene or protein, and a combination thereof, from the host cell, It is to provide a method for screening cytokines.
  • One aspect is cytokine; Cell membrane penetration domain; And / or a linker linking the cytokine with the cell membrane penetrating domain.
  • cytokine is a signal substance that controls the defense system in the body and stimulates the living body, and is one of bioactive regulatory peptides. Cytokines regulate various biological activities such as activation, saint, differentiation, migration, aging, and death in various cells through autocrine and paracrine action. In the present specification, the cytokine may be included without limitation as long as it is an in vivo peptide having the above-described properties.
  • the cytokine may be, for example, any one or more selected from the cytokines shown in Tables 1 to 7, and may be, for example, a BMP (Bone morphogenetic protein) family, a CCL (Cheomkine ligands) family, or a CMTM (CKLF-like).
  • BMP Bis morphogenetic protein
  • CCL Cheomkine ligands
  • CMTM CKLF-like
  • transmembrane domain refers to a region that penetrates the cell membrane from a protein that penetrates the cell membrane and is present, and most of them are known to be composed of hydrophobic amino acids having an ⁇ -helix structure.
  • the cell membrane transmembrane domain fixes the cytokine to the cell membrane or plasma membrane of the target cell, displays the cytokine bound thereto on the surface of the target cell, or binds the cytokine to the cell membrane receptor of the target cell. It can play a role in the sustained stimulation by cain.
  • the cell membrane penetrating domain may be a cell membrane penetrating domain of receptor tyrosine kinases (RTKs).
  • the membrane transmembrane domains of tyrosine kinase are epidermal growth factor receptor, insulin receptor, platelet derived growth factor receptor, vascular endothelial growth factor receptor, fibroblast growth factor receptor, Cholecystokinin (CCK) receptor, neurotrophic factor (Neurotrophic factor) : NGF) receptor, Hepatocyte growth factor (HGF) receptor, Ephrin (Eph) receptor, angiopoietin receptor, and related to receptor tyrosine kinase (RYK) receptor It may be the cell membrane penetrating domain of the receptor.
  • the cytokine and cell membrane penetration domain may be linked via a linker.
  • the linker not only connects the cytokine with the cell membrane penetrating domain, but may also serve to expose the cytokine to the surface of the target cell depending on the fluidity of the linker.
  • a linker for example, a flexible linker may be applied.
  • the linker may be one having resistance to protease resistance, which may be used by suitably changing its type and / or length according to cytokines or target cells.
  • the linker may be a polypeptide consisting of 1 to 400, 1 to 200, or 2 to 200 any amino acid.
  • the peptide linker may comprise Gly, Asn and Ser residues, and may also include neutral amino acids such as Thr and Ala. Suitable amino acid sequences for peptide linkers are known in the art. The copy number “n” can also be adjusted to account for linker optimization to achieve proper separation between functional parts or to maintain the necessary inter-moiety interaction.
  • Other flexible linkers are known in the art, for example G and S linkers that add amino acid residues such as T and A to maintain flexibility as well as adding polar amino acid residues to enhance water solubility. Can be.
  • the linker may be a flexible linker comprising G, S, and / or T residues.
  • linkers include (GGGGS) n (SEQ ID NO: 1), (SGGGG) n (SEQ ID NO: 2), (SRSSG) n (SEQ ID NO: 3), (SGSSC) n (SEQ ID NO: 4), (GKSSGSGSESKS) n (SEQ ID NO: 5), (RPPPPC) n (SEQ ID NO: 6), (SSPPPPC) n (SEQ ID NO: 7), (GSTSGSGKSSEGKG) n (SEQ ID NO: 8), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG) n (SEQ ID NO: 9), (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) n (SEQ ID NO: 10), or (EGKSSGSGSESKEF) n (SEQ ID NO: 11), wherein n is an integer of 1 to 20, or 1 to 10.
  • the cytokine fusion polypeptides can self-secrete cytokines to target cells, thereby providing sustained stimulation to the target cells. Therefore, the cell membrane penetrating domain is fixed through the cell membrane of the target cell, the cytokine may be to bind to the cell membrane receptor of the target cell to stimulate the target cell.
  • Another aspect provides a polynucleotide encoding the fusion polypeptide.
  • polynucleotide refers to a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides present in single- or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom and includes natural polynucleotides, as well as analogs thereof, in which sugar or base sites are modified, unless specifically stated otherwise.
  • the polynucleotide is a short chain polynucleotide.
  • Another aspect provides a vector comprising the polynucleotide.
  • vector refers to a gene construct that is a vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell and that includes a regulatory element operably linked to express the gene insert.
  • Vectors may comprise expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, and / or enhancers, and the promoters of the vectors may be constitutive or inducible.
  • the vector may be an expression vector, which can stably express the fusion protein in a host cell.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the vector may include a selective marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable vector, may include a replication origin.
  • the vector can be autonomously replicated or introduced into the host DNA, which vector is selected from the group consisting of plasmids, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, retroviruses, herpes simplex virus, and basinia virus. It may be.
  • the vector comprises a promoter operable in an animal cell, for example a mammalian cell.
  • Suitable promoters include promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from the genome of mammalian cells, including, for example, the Cytomegalovirus (CMV) promoter, the U6 promoter and the H1 promoter, the Murine Leukemia Virus (MLV) LTR.
  • CMV Cytomegalovirus
  • U6 the U6 promoter
  • H1 the Murine Leukemia Virus
  • (Long terminal repeat) promoter adenovirus early promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter, beta-actin promoter, Promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, promoter of human GM-CSF gene, human phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, mouse force Poglycerate Kinase (PGK) Promoter and Survivin Promoter It may include a site.
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • the aforementioned cytokine library sequences may be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, thereby The regulatory sequence will control the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • Another aspect provides a host cell comprising any one of the fusion polypeptides, polynucleotides, or vectors selected from the cytokine libraries.
  • cytokines cell membrane transmembrane domains, vectors and the like are the same as described in the aforementioned cytokyl library.
  • Such cells may be yeast, fungi, protozoa, plants, higher plants and insects, or cells of amphibians, or cells of mammals such as CHO, HeLa, HEK293, and COS-1.
  • Cultured cells in vitro
  • transplanted cells and primary cell cultures invitro and ex vivo
  • in vivo in vitro cells, and also mammalian cells, including humans.
  • the organism may be a yeast, fungus, protozoa, plant, higher plant and insect, amphibian, or mammal.
  • the cells may be animal cells or plant cells.
  • Another aspect provides a cytokine library comprising the fusion polypeptide, the polynucleotide, the vector or the host cell.
  • cytokine library refers to a collection comprising cytokines with various biological activities, in which individual members of the cytokine library commonly share cytokines, linkers, and cell membrane penetrations. Fusion polypeptides, polynucleotides, vectors, or cells comprising a domain.
  • the cytokine library can be used to assess the functionality of cytokines on target cells, ie, for screening functional cytokines on target cells.
  • the cytokine library is introduced into a variety of target cells, including vascular endothelial cells, etc., thereby providing a continuous stimulation by cytokines to the target cells, thereby providing biological activity including anti-angiogenic activity and the like. Changes could be effectively observed, allowing screening of the functionality of cytokines on target cells.
  • Another aspect comprises screening a cytokine from the host cell for identifying any one selected from the group consisting of biological changes in cells by cytokines, changes in exogenous or endogenous genes or proteins, and combinations thereof. Provide a method.
  • cytokines cell membrane penetrating domains, vectors and the like are as described above.
  • the vector containing the cytokine library by transfecting the vector containing the cytokine library to the target cell, it was possible to effectively induce a biological change of the host cell or target cell by the continuous stimulation of the cytokine, through which a single cell level The cytokine's functionality could be assessed effectively.
  • the target cell is a cell isolated from the living body, stem cells, somatic cells and the like, and is not limited to its type, characteristics, and origin, it may be a general term for all the cells.
  • Transfection of the target cells is carried out by the conventional transfection method, for example, DEAE-dextran, calcium phosphate method, microinjection method, DNA-containing liposome method, lipofectamine-DNA complex method and the like. This can be done through the process of introducing a vector containing a Cain library.
  • transfection methods are known in the art.
  • the method may further include incubating the host cell with another biologically active substance.
  • the biologically active substance may include, for example, low molecular weight compounds, antibodies, antisense nucleotides, short interfering RNA, short hairpin RNA, nucleic acids, proteins, peptides, other extracts or natural products. .
  • the step of identifying the biological change, etc. may be carried out by appropriately selecting a method known in the art according to the type of biological change to be screened.
  • the biological change may be, for example, a series of reactions resulting from binding to membrane receptors on the cell surface, for example, growth, differentiation, migration, cell aging or cell death, and the like.
  • Cytokine fusion polypeptides or cytokine libraries comprising the same according to one aspect allow for continuous stimulation by cytokines on target cells, thereby providing an easy and accurate evaluation of the functionality of cytokines at the single cell level. .
  • FIG. 1A shows the structure of a cytokine library according to an embodiment, and is a diagram schematically illustrating the structure of any one polypeptide or polynucleotide constituting the cytokine library.
  • FIG. 1B shows the structure of a cytokine library according to an embodiment, and is a diagram schematically illustrating a lentiviral vector prepared from any one polypeptide or polynucleotide constituting the cytokine library.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating a screening process of functional cytokines using a cytokine library according to an embodiment.
  • 3 is a result of screening cytokines affecting VEGF-dependent proliferation of HMVEC-L using a cytokine library according to one embodiment.
  • 4 shows the effect of IL-5 on the proliferation of VEGF induced vascular endothelial cells through MTT analysis. ego; 4B is a result of confirming the change in the proliferative capacity of vascular endothelial cells according to the treatment of IL-5 over time.
  • FIG. 5 is a result of confirming the effect of IL-5 on the migration ability of VEGF-induced vascular endothelial cells through wound-healing analysis
  • Figure 5A is the result of observing the closure of the wound through the Image J software module
  • 5B is a result quantitatively showing the closure rate for the wound.
  • FIG. 6 is a result of confirming the effect of IL-5 on the tube formation ability of VEGF-induced vascular endothelial cells through tube formation analysis method
  • Figure 6A is a branch formed by the Image J analysis software and the formed tube Observed
  • 6B is a result quantitatively showing the total number of generated branching points
  • FIG. 6C is a result of confirming the effect of IL-5 on the tube formation ability of VEGF-induced vascular endothelial cells through tube formation analysis, and quantitatively showing the total length of the formed tube.
  • Figure 7 shows the results confirmed by Western blot phosphorylation of STAT5 by IL-treatment.
  • 8A shows the effects of IL-5 treatment on VEGF-induced anti-angiogenic effects on HMVEC-L knocked down STAT5, and the results of vascular endothelial cell proliferation confirmed by MTT analysis. to be.
  • FIG. 8B shows the effect of IL-5 treatment on VEGF-induced anti-angiogenic effects on HMVEC-L knocked down STAT5. This is the result confirmed.
  • FIG. 8C shows the effect of IL-5 treatment on VEGF-induced anti-angiogenic effects on HMVEC-L knocked down STAT5. The result is confirmed.
  • FIGS. 1A and 1B are schematic views of the structure of any one polypeptide or polynucleotide constituting a cytokine library according to an embodiment, and the lentiviral vector prepared from the above.
  • human cytokine gene cDNA was obtained from GE cytokine library.
  • PCR primers were designed such that each cDNA could be introduced at a pair of Sfil restriction enzyme recognition sites compatible with the ends of each of the PCR amplification inserts (inserts) in the lentiviral vector pLV2-EF1a-MTA. After digesting the Sfil recognition region, the inserts were individually linked to Sfil-cleaved lentiviral vectors to construct a lentiviral cytokine plasmid for each cytokine.
  • the insert was designed to include the structure of [cytokine-flexible linker-cell membrane transmembrane domain], the specific structure of the plasmid is shown in Figure 1A.
  • the plurality of cytokines applied in this embodiment are as shown in Tables 1 to 7.
  • coli 4982 TNFRSF11B [Homo sapiens] 4982 TNFRSF11B 24 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E.
  • coli 5154 PDGFA [Homo sapiens] 5154 PDGFA 25 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E.
  • coli 10572 SIVA1 [Homo sapiens] 10572 SIVA1 46 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 3589 IL11 [Homo sapiens] 3589 IL11 47 Amp pBSK-.2 T7, T3 E.
  • coli 6364 CCL20 [Homo sapiens] 6364 CCL20 55 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 4049 LTA [Homo sapiens] 4049 LTA 56 Amp pSPORT1 T7, sp6, -21M13, M13 reverse E. coli 64388 GREM2 [Homo sapiens] 64388 GREM2 57 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E.
  • coli 5827 PXMP2 [Homo sapiens] 5827 PXMP2 74 Amp pSPORT1 T7, sp6, -21M13, M13 reverse E. coli 8741 TNFSF13 [Homo sapiens] 8741 TNFSF13 75 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating the screening process of cytokines in cells after transfection of the fusion polypeptides into cells according to an embodiment.
  • the lentiviral plasmids prepared in Example 1-1 above were simultaneously transfected into HEK-293FT cells with the pCMVD8.9 and pVSVg virus packaging vectors in a ratio of 1: 1. After incubating the cells overnight, the DNA lipid complex was removed and fresh medium was added to the cells. After 48 hours from this, the supernatant containing virus was collected and the collected supernatant was filtered using a 0.22- ⁇ m polyether sulfone membrane filter unit (Millipore).
  • the lentiviral particles obtained therefrom are added to human microvascular endothelial cells (HMVEC-L) in growth medium containing 5 ⁇ g / mL polybrene, which is 37 ° C., 5% CO 2. Incubate for 24 hours at conditions.
  • the medium was purchased from Lonza (Basel, Switzerland).
  • the cytokine library fixes the cytokine to the plasma membrane of the target cell by the cell membrane penetrating domain and displays it on the surface of the cell.
  • the display of cytokines bound to the plasma membrane can enhance intracellular receptor-mediated endocytosis and increase the effective molar concentration for the target receptor, thereby enhancing the effects of cytokines on the target cells.
  • it may enable sustained cellular stimulation by cytokines.
  • the cytokines capable of inhibiting vascular endothelial growth factor (VEGF) dependent proliferation of HMVEC-L are screened by using the cytokine library of Example 1, as described above. We tried experimentally to verify the effect of the same pattern. Interleukin family (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15 , IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-27, and IL-28) Lentiviruses were transfected independently of HMVEC-L. Then, by calculating the fold change of the proliferation of non-transfected HMVEC-L, the effect of the cytokine on the VEGF-dependent proliferation of HMVEC-L was confirmed.
  • Interleukin family IL-1, IL-2, IL-3, IL-4,
  • FIG. 3 is a result of screening cytokines affecting VEGF-dependent proliferation of HMVEC-L using a cytokine library according to one embodiment.
  • IL-4, IL-5, IL-13, and IL-33 were identified as cytokines that inhibit VEGF-dependent proliferation of HMVEC-L. Since vascular endothelial proliferation inhibitory effects of IL-4, IL-13, and IL-33 have been reported in a large number of documents, these results demonstrate the effectiveness of the screening according to the present embodiment.
  • the library indicates that it can be used to screen biological function changes following cytokine treatment.
  • the anti-angiogenic effect of IL-5 is confirmed through the proliferative capacity, the migration capacity, and the tube formation effect of vascular endothelial cells, and the specific mechanism for this is confirmed, thereby confirming the effectiveness of the screening according to the present embodiment.
  • the specific mechanism for this is confirmed, thereby confirming the effectiveness of the screening according to the present embodiment.
  • HMVEC-L Proliferation of HMVEC-L was assessed by MTT assay using Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA). Specifically, recombinant human IL-5 and VEGF (type A, 10 ng / ml) at various concentrations (0.1, 0.5, 1, or 10 ng / ml) in 96-plate wells containing 2000 HMVEC-L (R & D Systems) After treatment and incubation for 72 hours, proliferation of HMVEC-L was assessed at a wavelength of 490 nm using a micro plate reader (Bio-Rad, USA).
  • 96-plate wells containing HMVEC-L were treated with 5ng / ml IL-5 and 10ng / ml VEGF and incubated for 1-5 days. Thereafter, 100 ⁇ l of 5% MTS was added to the 96-well plate, incubated for 2 hours, and the proliferation of HMVEC-L was evaluated in the same manner as above. Meanwhile, the control group was set to the group treated with IL-5 and PBS.
  • FIG. 4 is a result confirming the effect of IL-5 on the proliferation of VEGF-induced vascular endothelial cells through MTT analysis.
  • IL-5 inhibited basal proliferation of HMVEC-Ls in a concentration dependent manner.
  • the concentration of IL-5 was 1 ng / ml or more, and IL-5 was a blood vessel induced by VEGF of HMVEC-Ls. It inhibited the proliferation of endothelial cells.
  • FIG. 4B as the treatment time of IL-5 increased, the proliferation rate of VEGF-induced vascular endothelial cells was significantly decreased.
  • HMVEC-L The migration capacity of HMVEC-L was assessed by a wound-healing assay. Specifically, HMVEC-L was seeded on 24-well culture plates. Then, using the CytoSelect® 24-Well Wound Healing Assay kit (Cell Biolabs, INC), HMVEC-L induced a recoverable wound. Thereafter, IL-5 and / or VEGF was added thereto, followed by incubation for 18 hours, and then closure of the wound was observed through the Image J software module. The closure rate was calculated by the following formula.
  • Closure Rate (%) W 0 -W n / W 0 ⁇ 100
  • FIG. 5 is a result confirming the effect of IL-5 on the migration ability of vascular endothelial cells induced by VEGF through wound-healing analysis.
  • the treatment of IL-5 against HMVEC-L reduced the wound closure rate by about 27% compared to the PBS-treated control, and IL-5 was treated in the VEGF alone group even under conditions treated with VEGF. In comparison, wound healing was inhibited by about 33%.
  • HMVEC-L Tube formation ability of HMVEC-L was evaluated by conventional tube formation assays. Specifically, 10000 HMVEC-L was 25 hours with 5 ng / ml IL-5 and / or 10 ng / ml VEGF in Metagel (Standard Bio- tions) in u-plate neovascularized 96 well plates (Ibidi). During incubation. Then, the total number of branch points generated and the total length of the formed tubes were calculated using Image J analysis software.
  • FIG. 6 is a result confirming the effect of IL-5 on the tube formation ability of vascular endothelial cells induced by VEGF through the tube formation assay. As shown in FIG. 6, in conditions treated with VEGF, treatment with IL-5 significantly reduced the total number of branching points and the total length of the tube formed compared to the VEGF alone treatment group.
  • HMVEC-L In order to confirm the intracellular signal transduction mechanism of anti-angiogenesis by treatment of IL-5, STAT5 expression of HMVEC-L was knocked down and the anti-angiogenic effect thereof was experimentally confirmed. Specifically, STAT5 expression of HMVEC-L was knocked down by ON-TARGET and SMARTpool STAT siRNA (Dharmacon). Transfection of endothelial cell monolayers proceeded by incubating 300,000 cells per well for 6 hours with siRNA at 50 nM final concentration in Oligofectamine and serum-free Opti-MEM (Invitrogen).
  • HMVEC-L was washed and 2 ml of complete ECGM medium was added to each well. After transfection, cells were transferred to 96 well plates for functional analysis.
  • HMVEC-L derived lysates were denatured in Laemmli sample buffer (5 min at 95 ° C.), separated by SDS-PAGE, and transferred to nitro cellulose membranes. The nitro cellulose membrane was blocked for 1 hour in PBST containing 5% BSA and then incubated with primary antibody overnight at 4 ° C.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIG. 7 shows the results of Western blot phosphorylation of STAT5 by IL-treatment.
  • FIGS. 8A-8C show anti-vascular treatment of IL-5 induced by VEGF for HMVEC-L knocked down STAT5. This is the result of confirming the effect on the newborn effect.
  • IL-5 treatment strongly induced phosphorylation of STAT5 in HMVEC-Ls.
  • knock down of STAT5 canceled the proliferative, migrating and inhibitory effects of IL-5 on HMVEC-Ls. This indicates that activation of STAT5 mediates the anti-angiogenic effect of IL-5 on vascular endothelial cells.

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Abstract

사이토카인 융합 폴리펩티드 또는 그를 포함하는 사이토카인 라이브러리에 관한 것으로서, 일 양상에 따른 사이토카인 융합 폴리펩티드 또는 그를 포함하는 사이토카인 라이브러리에 의하면, 표적 세포에 대한 사이토카인에 의한 지속적인 자극을 가능하게 하므로, 단일 세포 수준에서 사이토카인의 기능성을 간편하고 정확하게 평가할 수 있는 효과가 있다.

Description

사이토카인 융합 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 사이토카인 라이브러리
사이토카인 융합폴리펩티드, 및 이를 포함하는 사이토카인 라이브러리에 관한 것이다.
사이토카인은 면역 세포를 포함한 여러 종류의 세포에서 분비되는 단백질, 펩티드 및 당단백질들을 지칭하며, 자가분비 (autocrine), 파라크라인 (paracrine) 작용을 통하여 다양한 세포에서 세포 활성화, 분화, 세포 이동, 노화, 사멸 유도 등 다양한 생물학적 활성을 조절한다. 사이토카인에 의한 세포 활성 변화는 세포 표면의 수용체와의 상호 작용 및 이로 인해 발생되는 세포 신호 전달에 의하여, 사이토카인 특이적으로 진행될 수 있다.
또한, 모든 세포의 표면에 발현되어 있는 수용체들은 각각 특이적인 기능을 가지고 있으며, 상기의 기능은 세포 특이적 기능과 높은 상관 관계를 가지는 것으로 알려져 있다. 이러한 세포 표면에 존재하는 수용체는 외부로부터 받은 신호를 감지하는 역할을 하는 동시에, 받아들인 신호들을 2차 전달자 형태로 증폭시켜, 대사, 분비, 방출 및 세포 성장과 같은 세포 활동을 가능하게 하는 역할을 한다. 수용체는 세포 외 부분, 구체적으로 세포막 상에 위치하는 부분에 특정 리간드 등이 결합하면, 리간드와의 상호작용으로 세포 내 부분에서 변형이 유도되고, 신호 전달의 개시로 세포의 다양한 기능을 수행하게 된다. 사이토카인은 단밸질 매개자 (protein mediator)로서, 이러한 일련의 생물학적 과정 (biological process)에 큰 영향을 미칠 수 있다. 즉, 사이토카인은 특이적 세포 신호전달에 의한 사이토카인 유전자의 활성화 또는 비활성화에 의해 조절되며, 이는 세포의 생물학적 또는 병리학적 변화에 밀접하게 관여한다.
이러한 기술적 배경 하에서, 세포의 생물학적 활성 변화와 연관된 사이토카인의 기능성에 대한 다양한 연구가 진행되고 있으나 (한국 공개특허 10-2013-0032606), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 사이토카인; 세포막 관통 도메인 (Transmembrane domain); 및 상기 사이토카인과 세포막 관통 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 숙주 세포를 포함하는 사이토카인 라이브러리를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 숙주 세포로부터 사이토카인에 의한 세포의 생물학적 변화, 외인성 또는 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 변화, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 변화를 확인하는 단계를 포함하는, 사이토카인을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 사이토카인; 세포막 관통 도메인; 및/또는 상기 사이토카인과 세포막 관통 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사이토카인 (Cytokine)"은 신체 내 방어 체계를 제어하고, 생체를 자극하는 신호 물질로서, 생리활성 조절 펩티드 중 하나이다. 사이토카인은 자가분비 (autocrine), 파라크라인 (paracrine) 작용을 통하여 다양한 세포에서 활성화, 성자, 분화, 이동, 노화, 사멸 유도 등 다양한 생물학적 활성을 조절한다. 본 명세서에서, 상기 사이토카인은 전술한 특성을 갖는 생체 내 펩티드라면, 비제한적으로 포함될 수 있다. 상기 사이토카인은 예를 들어, 표 1 내지 표 7에 제시된 사이토카인으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 예를 들어, BMP (Bone morphogenetic protein) 패밀리, CCL (Cheomkine ligands) 패밀리, CMTM (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member) 패밀리, CXCL (C-X-C motif ligand ligand) 패밀리, GDF (Growth/differentiation factor) 패밀리, 성장 호르몬, IFN (Interferon) 패밀리, IL (Interleukin) 패밀리, TNF (Tumor necrosis factors) 패밀리, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "세포막 관통 도메인 (Transmembrane domain)"은 세포막을 뚫고 나와 존재하는 단백질에서 세포막을 관통하는 영역을 의미하며, 대부분은 α나선 구조를 갖는 소수성 아미노산으로 이루어지는 것으로 알려져 있다. 상기 세포막 관통 도메인은 표적 세포의 세포막 또는 원형질 막에 사이토카인을 고정시키고, 이와 결합된 사이토카인을 표적 세포의 표면에 디스플레이(display)시키거나, 사이토카인을 표적 세포의 세포막 수용체에 결합시킴으로써, 사이토카인에 의한 지속적인 자극을 가능하게 하는 역할을 할 수 있다. 상기 세포막 관통 도메인은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)의 세포막 관통 도메인일 수 있다. 더욱 구체적으로, 타이로신 카이네이즈의 세포막 관통 도메인은 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 수용체의 세포막 관통 도메인일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사이토카인 및 세포막 관통 도메인은 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다. 상기 링커는 단지 사이토카인과 세포막 관통 도메인을 연결시킬 뿐만 아니라, 링커의 유동성에 따라 표적 세포의 표면으로 사이토카인을 노출시키는 역할을 수행할 수 있다. 상기 링커로는 예를 들어, 가요성 링커가 적용될 수 있다. 또한, 상기 링커는 단백질 가수 분해효소 (Protease resistance)에 대한 저항성을 갖는 것일 수 있고, 이는 사이토카인 또는 표적 세포에 따라, 그 종류 및/또는 길이를 적의 변경하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는, 1 내지 400개, 1 내지 200개, 또는 2 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 “n”을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 가요성　링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서 일 구체예에 있어서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (GpSs)n 및 (SpGs)n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)n (서열번호 1), (SGGGG)n　(서열번호 2), (SRSSG)n (서열번호 3), (SGSSC)n (서열번호 4), (GKSSGSGSESKS)n (서열번호 5), (RPPPPC)n (서열번호 6), (SSPPPPC)n (서열번호 7),　 (GSTSGSGKSSEGKG)n (서열번호 8), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n (서열번호 9),　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n　(서열번호 10), 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n (서열번호 11)이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다.
또한, 상기 사이토카인 융합 폴리펩티드는 사이토카인을 표적 세포에 자가 분비시킴으로써, 표적 세포에 대한 지속적인 자극을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 세포막 관통 도메인은 표적 세포의 세포막을 관통하여 고정되고, 상기 사이토카인은 표적 세포의 세포막 수용체에 결합하여 표적 세포를 자극하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단쇄 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유 하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 벡터는 동물세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 사이토카인 라이브러리 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또 다른 양상은 상기 사이토카인 라이브러리로부터 선택되는 어느 하나의 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
상기 사이토카인, 세포막 관통 도메인, 벡터 등에 대해서는 전술한 사이토카일 라이브러리에서 기술한 바와 같다.
상기 세포, 예를 들면, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다. 또한, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물세포일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 융합 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터 또는 상기 숙주 세포를 포함하는 사이토카인 라이브러리를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사이토카인 라이브러리 (Cytokine library)"는 다양한 생물학적 활성을 갖는 사이토카인들을 포함하는 집합을 의미하며, 상기 사이토카인 라이브러리의 개별 구성원들은 공통적으로 사이토카인, 링커, 및 세포막 관통 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 세포를 포함할 수 있다.
상기 사이토카인 라이브러리는 표적 세포에 대한 사이토카인의 기능성을 평가하기 위한 것, 즉, 표적 세포에 대한 기능성 사이토카인을 스크리닝하기 위한 것으로 사용될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 사이토카인 라이브러리는 혈관 내피세포 등을 포함하는 다양한 표적 세포에 도입되어, 사이토카인에 의한 지속적인 자극을 표적 세포에 제공함으로써, 항-혈관신생 능 등을 포함하는 생물학적 활성의 변화를 효과적으로 관찰할 수 있었으며, 이를 통해 표적 세포에 대한 사이토카인의 기능성을 스크리닝할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 숙주 세포로부터 사이토카인에 의한 세포의 생물학적 변화, 외인성 또는 내인성 유전자 또는 단백질의 변화, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 확인하는 단계를 포함하는, 사이토카인을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 사이토카인, 세포막 관통 도메인, 벡터 등에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 실시예에 따르면, 상기 사이토카인 라이브러리를 포함하는 벡터를 표적 세포에 형질감염시킴으로써, 사이토카인의 지속적인 자극에 의한 숙주 세포 또는 표적 세포의 생물학적 변화를 효과적으로 유도할 수 있었으며, 이를 통하여, 단일 세포 수준에서 사이토카인의 기능성을 효과적으로 평가할 수 있었다.
일 구체예에 있어서, 상기 표적 세포는 생체로부터 분리된 세포로서, 줄기 세포, 체세포 등 그 종류, 특성, 및 기원에 제한되지 않으며, 실질적으로 모든 세포들을 총칭하는 것일 수 있다.
상기 표적 세포에 대한 형질감염은 통상의 형질 감염법, 예를 들어, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 미세주사법, DNA-함유 리포좀 방법, 리포펙타민-DNA 복합체 방법 등에 의해 표적 세포에 상기 사이토카인 라이브러리를 포함하는 벡터를 도입시키는 과정을 통해 진행될 수 있다. 상기 형질감염 방법은 당업계에 공지되어 있다.
또한, 상기 스크리닝하는 방법에서, 상기 숙주 세포를 또 다른 생물학적 활성 물질과 함께 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 생물학적 활성 물질은 예를 들어, 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다.
상기 생물학적 변화 등을 확인하는 단계는 스크리닝하고자 하는 생물학적 변화의 종류에 따라, 당업계에 공지되어 있는 방법을 적의 선택하여 실시할 수 있다. 상기 생물학적 변화는 예를 들어, 세포 표면의 막 수용체와의 결합으로부터 이루어지는 일련의 반응일 수 있고, 예를 들어, 성장, 분화, 이동, 세포 노화 또는 세포 사멸 등일 수 있다.
일 양상에 따른 사이토카인 융합 폴리펩티드 또는 그를 포함하는 사이토카인 라이브러리에 의하면 표적 세포에 대한 사이토카인에 의한 지속적인 자극을 가능하게 하므로, 단일 세포 수준에서 사이토카인의 기능성을 간편하고 정확하게 평가할 수 있는 효과가 있다.
도 1A는 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리의 구조를 나타낸 것으로서, 사이토카인 라이브러리를 구성하는 어느 하나의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 구조를 모식화한 도이다.
도 1B는 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리의 구조를 나타낸 것으로서, 사이토카인 라이브러리를 구성하는 어느 하나의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로부터 제조된 렌티바이러스 벡터를 모식화한 도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리를 이용한 기능성 사이토카인의 스크리닝 과정을 모식화한 도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리를 이용하여, HMVEC-L의 VEGF-의존성 증식에 영향을 미치는 사이토카인을 스크리닝한 결과이다.
도 4는 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 증식에 IL-5가 미치는 영향을 MTT 분석을 통해 확인한 결과로서, 도 4의 A는 IL-5의 농도에 따른 혈관 내피세포의 증식능 변화를 확인한 결과이고; 및 도 4의 B는 IL-5의 처리에 따른 혈관 내피세포의 증식능 변화를 시간의 경과에 따라 확인한 결과이다.
도 5는 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 이주능에 IL-5가 미치는 영향을 상처-치유 분석을 통해 확인한 결과로서, 도 5의 A는 Image J software 모듈을 통해 상처의 폐쇄를 관찰한 결과이고; 및 도 5의 B는 상처에 대한 폐쇄율을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 6은 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 관 형성능에 IL-5가 미치는 영향을 관 형성 분석법을 통해 확인한 결과로서, 도 6의 A는 Image J analysis software를 통해 생성된 분지점 및 형성된 관을 관찰한 결과이고; 도 6의 B는 생성된 분지점의 총 수를 정량적으로 나타낸 결과이고; 및 도 6의 C는 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 관 형성능에 IL-5가 미치는 영향을 관 형성 분석법을 통해 확인한 결과로서, 형성된 관의 총 길이를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 7은 IL-처리에 의한 STAT5의 인산화를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과이다.
도 8A는 STAT5가 넉 다운된 HMVEC-L에 대하여, IL-5의 처리가 VEGF에 의해 유도된 항-혈관신생 효과에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 혈관 내피세포의 증식을 MTT 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 8B는 STAT5가 넉 다운된 HMVEC-L에 대하여, IL-5의 처리가 VEGF에 의해 유도된 항-혈관신생 효과에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 혈관 내피세포의 이주능을 상처-치유 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 8C는 STAT5가 넉 다운된 HMVEC-L에 대하여, IL-5의 처리가 VEGF에 의해 유도된 항-혈관신생 효과에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 혈관 내피세포의 관 형성능을 관 형성 분석법을 통해 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료 및 실험 준비
1-1. 사이토카인 라이브러리의 구축
도 1A 및 1B은 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리를 구성하는 어느 하나의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 구조, 및 상기로부터 제조된 렌티바이러스 벡터를 모식화한 도이다. 구체적으로, 인간 사이토카인 유전자 cDNA는 GE 사이토카인 라이브러리로부터 입수하였다. PCR 프라이머는 렌티바이러스 벡터 pLV2-EF1a-MTA 내 PCR 증폭 삽입물 (인서트, insert) 각각의 말단과 양립 가능한 한 쌍의 Sfil 제한 효소 인식 자리에 각각의 cDNA가 도입될 수 있도록 설계하였다. Sfil 인식 영역을 절단 (digest)한 후, 상기 인서트를 Sfil-절단된 렌티바이러스 벡터에 개별적으로 연결시켜 각 사이토카인에 대한 렌티바이러스 사이토카인 플라스미드를 구축하였다. 상기 인서트는 [사이토카인-가요성 링커-세포막 관통 도메인]의 구조를 포함하도록 설계하였으며, 상기 플라스미드의 구체적인 구조는 도 1A에 나타낸 바와 같다. 또한, 본 실시예에서 적용된 복수 개의 사이토카인은 하기 표 1 내지 표 7과 같다.
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
1 Amp pDrive T7, sp6 E. coli 6355 CCL8 [Homo sapiens] 6355 CCL8
2 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 9997 SCO2 [Homo sapiens] 9997 SCO2
3 Amp pSPORT1 T7, sp6, -21M13, M13 reverse E. coli 2323 FLT3LG[Homo sapiens] 2323 FLT3LG
4 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 1440 CSF3[Homo sapiens] 1440 CSF3
5 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 6357 CCL13 [Homo sapiens] 6357 CCL13
6 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 131177 FAM3D [Homo sapiens] 131177 FAM3D
7 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 652 BMP4 [Homo sapiens] 652 BMP4
8 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 51752 ERAP1 [Homo sapiens] 51752 ERAP1
9 Amp pCMV-SPORT6.ccdb sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 7424 VEGFC [Homo apiens] 7424 VEGFC
10 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6367 CCL22 [Homo sapiens] 6367 CCL22
11 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 2662 GDF10 [Homo sapiens] 2662 GDF10
12 Amp pDrive T7, sp6 E. coli 9235 IL32 [Homo sapiens] 9235 IL32
13 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 2257 FGF12 [Homo sapiens] 2257 FGF12
14 Amp pDrive T7, sp6 E. coli 54097 FAM3B [Homo sapiens] 54097 FAM3B
15 Amp pBluescript M13(-21), M13 reverse, T7, T3 E. coli 3557 IL1RN [Homo sapiens] 3557 IL1RN
16 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 655 BMP7 [Homo sapiens] 655 BMP7
17 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 3569 IL6 [Homo sapiens] 3569 IL6
18 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 23529 CLCF1 [Homo sapiens] 23529 CLCF1
19 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 3625 INHBB [Homo sapiens] 3625 INHBB
20 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 26525 IL1F5 [Homo sapiens] 26525 IL1F5
21 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6366 CCL21 [Homo sapiens] 6366 CCL21
22 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 8200 GDF5 [Homo sapiens] 8200 GDF5
23 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 4982 TNFRSF11B [Homo sapiens] 4982 TNFRSF11B
24 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 5154 PDGFA [Homo sapiens] 5154 PDGFA
25 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 9560 CCL4L1 [Homo sapiens] 9560, 388372 CCL4L1, CCL4L2
26 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 6352 CCL5 [Homo sapiens] 6352 CCL5
27 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 3576 IL8 [Homo sapiens] 3576 IL8
28 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 6372 CXCL6 [Homo sapiens] 6372 CXCL6
29 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 53342 IL17D [Homo sapiens] 53342 IL17D
30 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 7205 TRIP6 [Homo sapiens] 7205 TRIP6
31 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6363 CCL19 [Homo sapiens] 6363 CCL19
32 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 8743 TNFSF10 [Homo sapiens] 8743 TNFSF10
33 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 90865 IL33 [Homo sapiens] 90865 IL33
34 Amp pDrive T7, sp6 E. coli 6368 CCL23 [Homo sapiens] 6368 CCL23
35 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 7857 SCG2 [Homo sapiens] 7857 SCG2
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
36 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 970 CD70 [Homo sapiens] 970 CD70
37 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 51192 CKLF [Homo sapiens] 51192 CKLF
38 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 11009 IL24 [Homo sapiens] 11009 IL24
39 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 1890 TYMP [Homo sapiens] 1890 TYMP
40 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 2896 GRN [Homo sapiens] 2896 GRN
41 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 653 BMP5 [Homo sapiens] 653 BMP5
42 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 3603 IL16 [Homo sapiens] 3603 IL16
43 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 7044 LEFTY2 [Homo sapiens] 7044 LEFTY2
44 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 1442, 1443, 81848 CSH1 [Homo sapiens], CSH2 [Homo sapiens], SPRY4 [Homo sapiens] 1442 CSH1
45 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 10572 SIVA1 [Homo sapiens] 10572 SIVA1
46 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 3589 IL11 [Homo sapiens] 3589 IL11
47 Amp pBSK-.2 T7, T3 E. coli 6386 SDCBP [Homo sapiens] 6386 SDCBP
48 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 3552 IL1A [Homo sapiens] 3552 IL1A
49 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 10148 EBI3 [Homo sapiens] 10148 EBI3
50 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 3600 IL15 [Homo sapiens] 3600 IL15
51 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 2277 FIGF [Homo sapiens] 2277 FIGF
52 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 92304 SCGB3A1 [Homo sapiens] 92304 SCGB3A1
53 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6387 CXCL12 [Homo sapiens] 6387 CXCL12
54 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 6364 CCL20 [Homo sapiens] 6364 CCL20
55 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 4049 LTA [Homo sapiens] 4049 LTA
56 Amp pSPORT1 T7, sp6, -21M13, M13 reverse E. coli 64388 GREM2 [Homo sapiens] 64388 GREM2
57 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 5197 PF4V1 [Homo sapiens] 5197 PF4V1
58 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 3553 IL1B [Homo sapiens] 3553 IL1B
59 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 116173 CMTM5 [Homo sapiens] 116173 CMTM5
60 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6351 CCL4 [Homo sapiens] 6351 CCL4
61 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 5155 PDGFB [Homo sapiens] 5155 PDGFB
62 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 58191 CXCL16 [Homo sapiens] 58191 CXCL16
63 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 113540 CMTM1 [Homo sapiens] 113540 CMTM1
64 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 3084 NRG1 [Homo sapiens] 3084 NRG1
65 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 29949 IL19 [Homo sapiens] 29949 IL19
66 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 650 BMP2 [Homo sapiens] 650 BMP2
67 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 6347 CCL2 [Homo sapiens] 6347 CCL2
68 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 6398 SECTM1 [Homo sapiens] 6398 SECTM1
69 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 8740 TNFSF14 [Homo sapiens] 8740 TNFSF14
70 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 10637 LEFTY1 [Homo sapiens] 10637 LEFTY1
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
71 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 54918 CMTM6 [Homo sapiens] 54918 CMTM6
72 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 123920 CMTM3 [Homo sapiens] 123920 CMTM3
73 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 5827 PXMP2 [Homo sapiens] 5827 PXMP2
74 Amp pSPORT1 T7, sp6, -21M13, M13 reverse E. coli 8741 TNFSF13 [Homo sapiens] 8741 TNFSF13
75 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 152189 CMTM8 [Homo sapiens] 152189 CMTM8
76 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 9577 BRE [Homo sapiens] 9577 BRE
77 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 2919 CXCL1 [Homo sapiens] 2919 CXCL1
78 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 8565 YARS [Homo sapiens] 8565 YARS
79 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 113540 CMTM1 [Homo sapiens] 23433 RHOQ
80 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 414062 CCL3L3 [Homo sapiens] 6349 CCL3L1
81 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 5473 PPBP [Homo sapiens] 5473 PPBP
82 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 85480 TSLP [Homo sapiens] 85480 TSLP
83 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 10447 FAM3C [Homo sapiens] 10447 FAM3C
84 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 1489 CTF1 [Homo sapiens] 1489 CTF1
85 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3567 IL5 [Homo sapiens] 3567 IL5
86 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3558 IL2 [Homo sapiens] 3558 IL2
87 Amp pCMV-SPORT6.1 M13(-21), M13 reverse, sp6 DH10B TonA 2688 GH1 [Homo sapiens] 2688 GH1
88 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3441 IFNA4 [Homo sapiens] 3441 IFNA4
89 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 146223 CMTM4 [Homo sapiens] 146223 CMTM4
90 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 7422 VEGFA [Homo sapiens] 7422 VEGFA
91 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3605 IL17A [Homo sapiens] 3605 IL17A
92 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 59067 IL21 [Homo sapiens] 59067 IL21
93 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6696 SPP1 [Homo sapiens] 6696 SPP1
94 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 10715 LASS1 [Homo sapiens] 10715 LASS1
95 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3439 IFNA1 [Homo sapiens] 3439 IFNA1
96 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 282618 IL29 [Homo sapiens] 282618 IL29
97 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3442 IFNA5 [Homo sapiens] 3442 IFNA5
98 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6358 CCL14 [Homo sapiens] 6358 CCL14
99 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 5295 PIK3R1 [Homo sapiens] 5295 PIK3R1
100 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6373 CXCL11 [Homo sapiens] 6373 CXCL11
101 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 2660 MSTN [Homo sapiens] 2660 MSTN
102 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3444 IFNA7 [Homo sapiens] 3444 IFNA7
103 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 3574 IL7 [Homo sapiens] 3574 IL7
104 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 50616 IL22 [Homo sapiens] 50616 IL22
105 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 10135 NAMPT [Homo sapiens] 10135 NAMPT
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
106 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3440 IFNA2 [Homo sapiens] 3440 IFNA2
107 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3448 IFNA14 [Homo sapiens] 3448 IFNA14
108 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3976 LIF [Homo sapiens] 3976 LIF
109 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 51561 IL23A [Homo sapiens] 51561 IL23A
110 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3593 IL12B [Homo sapiens] 3593 IL12B
111 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 4283 CXCL9 [Homo sapiens] 4283 CXCL9
112 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 1437 CSF2 [Homo sapiens] 1437 CSF2
113 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 9966 TNFSF15 [Homo sapiens] 9966 TNFSF15
114 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 2658 GDF2 [Homo sapiens] 2658 GDF2
115 Amp pBluescriptR T3, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 6579 SLCO1A2 [Homo sapiens] 6579 SLCO1A2
116 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 656 BMP8B [Homo sapiens] 656 BMP8B
117 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 8600 TNFSF11 [Homo sapiens] 8600 TNFSF11
118 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 2056 EPO [Homo sapiens] 2056 EPO
119 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 10344 CCL26 [Homo sapiens] 10344 CCL26
120 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B TonA 4282 MIF [Homo sapiens] 4282 MIF
121 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3565 IL4 [Homo sapiens] 3565 IL4
122 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 4254 KITLG [Homo sapiens] 4254 KITLG
123 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 50604 IL20 [Homo sapiens] 50604 IL20
124 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 944 TNFSF8 [Homo sapiens] 944 TNFSF8
125 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 26585 GREM1 [Homo sapiens] 26585 GREM1
126 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3578 IL9 [Homo sapiens] 3578 IL9
127 Amp pDNR-Dual M13(-21), T7 DH10B TonA 3562 IL3 [Homo sapiens] 3562 IL3
128 Amp pCMV-SPORT6.1 M13(-21), M13 reverse, sp6 DH10B TonA 1270 CNTF [Homo sapiens] 1270 CNTF
129 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 959 CD40LG [Homo sapiens] 959 CD40LG
130 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 5196 PF4 [Homo sapiens] 5196 PF4
131 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 27177 IL1F8 [Homo sapiens] 27177 IL1F8
132 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3592 IL12A [Homo sapiens] 3592 IL12A
133 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 6346 CCL1 [Homo sapiens] 6346 CCL1
134 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 XL10 Gold 3443 IFNA6 [Homo sapiens] 3443 IFNA6
135 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 6354 CCL7 [Homo sapiens] 6354 CCL7
136 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 9210 BMP15 [Homo sapiens] 9210 BMP15
137 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3447 IFNA13 [Homo sapiens] 3447 IFNA13
138 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 64806 IL25 [Homo sapiens] 64806 IL25
139 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 XL10 Gold 56477 CCL28 [Homo sapiens] 56477 CCL28
140 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 7066 THPO [Homo sapiens] 7066 THPO
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
141 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 8995 TNFSF18 [Homo sapiens] 8995 TNFSF18
142 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 27189 IL17C [Homo sapiens] 27189 IL17C
143 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 57152 SLURP1 [Homo sapiens] 57152 SLURP1
144 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 282616 IL28A [Homo sapiens] 282616 IL28A
145 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 1896 EDA [Homo sapiens] 1896 EDA
146 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3452 IFNA21 [Homo sapiens] 3452 IFNA21
147 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 8744 TNFSF9 [Homo sapiens] 8744 TNFSF9
148 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 4050 LTB [Homo sapiens] 4050 LTB
149 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3467 IFNW1 [Homo sapiens] 3467 IFNW1
150 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 6370 CCL25 [Homo sapiens] 6370 CCL25
151 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3445 IFNA8 [Homo sapiens] 3445 IFNA8
152 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 9350 CER1 [Homo sapiens] 9350 CER1
153 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 353500 BMP8A [Homo sapiens] 353500 BMP8A
154 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 27302 BMP10 [Homo sapiens] 27302 BMP10
155 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 4838 NODAL [Homo sapiens] 4838 NODAL
156 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 6361 CCL17 [Homo sapiens] 6361 CCL17
157 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 XL10 Gold 3446 IFNA10 [Homo sapiens] 3446 IFNA10
158 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 56603 CYP26B1 [Homo sapiens] 56603 CYP26B1
159 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 200734 SPRED2 [Homo sapiens] 200734 SPRED2
160 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 51384 WNT16 [Homo sapiens] 51384 WNT16
161 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 2255 FGF10 [Homo sapiens] 2255 FGF10
162 Amp pPCR-Script Amp SK(+) M13(-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 6362 CCL18 [Homo sapiens] 6362 CCL18
163 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 282617 IL28B [Homo sapiens] 282617 IL28B
164 Amp pCMV-SPORT6 sp6, T7, -21M13, M13 reverse DH10B 11146 GLMN [Homo sapiens] 11146 GLMN
165 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 7423 VEGFB [Homo sapiens] 7423 VEGFB
166 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 3606 IL18 [Homo sapiens] 3606 IL18
167 Cam pDNR-LIB -21M13 DH10B TonA 112744 IL17F [Homo sapiens] 112744 IL17F
168 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 10563 CXCL13 [Homo sapiens] 10563 CXCL13
169 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 2921 CXCL3 [Homo sapiens] 2921 CXCL3
170 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 146225 CMTM2 [Homo sapiens] 146225 CMTM2
171 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 27178 IL1F7 [Homo sapiens] 27178 IL1F7
172 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 9518 GDF15 [Homo sapiens] 9518 GDF15
173 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 9547 CXCL14 [Homo sapiens] 9547 CXCL14
174 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 5728 PTEN [Homo sapiens] 5728 PTEN
175 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 6374 CXCL5 [Homo sapiens] 6374 CXCL5
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
176 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 3627 CXCL10 [Homo sapiens] 3627 CXCL10
177 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 356 FASLG [Homo sapiens] 356 FASLG
178 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 6376 CX3CL1 [Homo sapiens] 6376 CX3CL1
179 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 8717, 8741 TNFSF13 [Homo sapiens], TRADD [Homo sapiens] 8717 TRADD
180 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 3623 INHA [Homo sapiens] 3623 INHA
181 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 4192 MDK [Homo sapiens] 4192 MDK
182 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 2920 CXCL2 [Homo sapiens] 2920 CXCL2
183 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 5617 PRL [Homo sapiens] 5617 PRL
184 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 246778 IL27 [Homo sapiens] 246778 IL27
185 Cam pDNR-LIB -21M13 DH10B TonA 3458 IFNG [Homo sapiens] 3458 IFNG
186 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 10131 TRAP1 [Homo sapiens] 10131 TRAP1
187 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 414062 CCL3L3 [Homo sapiens], CCL3L3 [Homo sapiens] 414062 CCL3L3
188 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 374 AREG [Homo sapiens] 374 AREG
189 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 112616 CMTM7 [Homo sapiens] 112616 CMTM7
190 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 1443 CSH2 [Homo sapiens] 1443 CSH2
191 Cam pDNR-LIB -21M13 DH10B TonA 6846 XCL2 [Homo sapiens] 6846 XCL2
192 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 2821 GPI [Homo sapiens] 2821 GPI
193 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 7356 SCGB1A1 [Homo sapiens] 7356 SCGB1A1
194 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 3624 INHBA [Homo sapiens] 3624 INHBA
195 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 8835 SOCS2 [Homo sapiens] 8835 SOCS2
196 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 9255 SCYE1 [Homo sapiens] 9255 SCYE1
197 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 1435 CSF1 [Homo sapiens] 1435 CSF1
198 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 6356 CCL11 [Homo sapiens] 6356 CCL11
199 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 9573 GDF3 [Homo sapiens] 9573 GDF3
200 Cam pDNR-LIB -21M13 DH10B TonA 6375 XCL1 [Homo sapiens] 6375 XCL1
201 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 8741 TNFSF13 [Homo sapiens] 8742 TNFSF12
202 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 5764 PTN [Homo sapiens] 5764 PTN
203 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 5008 OSM [Homo sapiens] 5008 OSM
204 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 6348 CCL3 [Homo sapiens] 6348 CCL3
205 Cam pDNR-LIB -21M13 GeneHogs DH10B 10673 TNFSF13B [Homo sapiens] 10673 TNFSF13B
206 Cam pDNR-LIB -21M13 DH10B TonA 3535, 3576 IGL@ [Homo sapiens], IL8 [Homo sapiens] 3535 IGL@
207 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 DH10B TonA 3550 IK [Homo sapiens] 3550 IK
208 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 DH10B TonA 200081 TXLNA [Homo sapiens] 200081 TXLNA
209 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 537 ATP6AP1 [Homo sapiens] 537 ATP6AP1
210 Cam pOTB7 -21M13, M13 reverse, sp6, T7 GeneHogs DH10B 1020 CDK5 [Homo sapiens] 1020 CDK5
NO Antibiotic Resistance Vector Name Sequence Primer Host Name Entrez Gene List Gene Symbol NCBI. GeneID List NCBI. GeneSymbol List
211 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 651 BMP3 [Homo sapiens] 651 BMP3
212 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 27190 IL17B [Homo sapiens] 27190 IL17B
213 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 27179 IL1F6 [Homo sapiens] 27179 IL1F6
214 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 3586 IL10 [Homo sapiens] 3586 IL10
215 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 84639 IL1F10 [Homo sapiens] 84639 IL1F10
216 Kan pCR-XL-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7 DH10B TonA 727 C5 [Homo sapiens] 727 C5
217 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 55914 ERBB2IP [Homo sapiens] 55914 ERBB2IP
218 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 3451 IFNA17 [Homo sapiens] 3451 IFNA17
219 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 338376 IFNE1 [Homo sapiens] 338376 IFNE1
220 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 3456 IFNB1 [Homo sapiens] 3456 IFNB1
221 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 56300 IL1F9 [Homo sapiens] 56300 IL1F9
222 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 6360 CCL16 [Homo sapiens] 6360 CCL16
223 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 2661 GDF9 [Homo sapiens] 2661 GDF9
224 Kan pCR-BluntII-TOPO M13(-21), M13 reverse, T7, sp6 DH10B TonA 3596 IL13 [Homo sapiens] 3596 IL13
225 Amp pDrive T7, sp6 E. coli 7124 TNF [Homo sapiens] 7124 TNF
226 Amp pINCY -21M13, M13 reverse, T7, sp6 E. coli 6369 CCL24 [Homo sapiens] 6369 CCL24
227 Amp pCR4-TOPO M13 (-21), M13 reverse, T7, T3 DH10B TonA 3716 JAK1 [Homo sapiens] 3716 JAK1
1-2. 렌티바이러스의 패키징 및 형질감염
도 2는 일 실시예에 따른 융합 폴리펩티드를 세포에 형질감염 시킨 후 세포에서의 사이토카인의 스크리닝 과정을 모식화한 도이다. HEK-293FT 세포에 pCMVD8.9 및 pVSVg 바이러스 패키징 벡터와 함께, 상기 실시예 1-1에서 제조된 렌티바이러스 플라스미드를 1: 1: 1의 비율로 동시에 형질감염시켰다. 상기 세포를 하룻밤 동안 인큐베이션시킨 후, DNA 지질 복합체를 제거하고, 여기에 신선한 배지를 세포에 첨가하였다. 이로부터 48 시간 후, 바이러스를 함유하는 상청액을 수집하고, 상기 수집된 상청액을 0.22-μm 폴리 에테르 설폰 멤브레인 필터 유닛 (Millipore)을 사용하여 여과하였다. 이로부터 수득된 렌티바이러스 파티클을 5μg/mL의 폴리브랜 (polybrene)을 함유하는 성장 배지 내 인간 미세혈관 내피세포 (human microvascular endothelial cells: HMVEC-L)에 첨가하고, 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 인큐베이팅시켰다. 상기 배지는 Lonza 사(Basel, Switzerland)로부터 구입하여 사용하였다.
1-3. 통계 분석
통계 분석은 분산분석(ANOVA) 검정, 이원배치 분산분석(two-way ANOVA) 검정, 비모수적(nonparametric) T-검정, 만-위트니(Mann-Whitney) 검정을 사용하여 실시되었으며, 실험 데이터는 평균±표준편차 (SD)로 나타내었다. P value <0.05인 경우, 유의적인 것으로 간주되었다.
실시예 2. 사이토카인 라이브러리를 이용한 기능성 사이토카인에 대한 스크리닝
도 2에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리는 세포막 관통 도메인에 의해 표적 세포의 원형질 막에 사이토카인이 고정되고, 세포의 표면에 이를 디스플레이(displayed)한다. 즉, 원형질 막에 결합된 사이토카인의 디스플레이는 세포 내 수용체-매개 엔도사이토시스를 감소시키고, 표적 수용체에 대한 유효 몰 농도가 증가시킬 수 있기 때문에, 표적 세포에 미치는 사이토카인의 영향을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 사이토카인에 의한 지속적인 세포 자극을 가능하게 할 수 있다.
이에, 본 실시예에서는 HMVEC-L의 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 의존적인 증식을 억제시킬 수 있는 사이토카인을 실시예 1의 사이토카인 라이브러리를 사용하여 스크링함으로써, 전술한 바와 같은 양상이 실제로 나타내는지 그 효과를 실험적으로 확인하고자 하였다. 인터류킨 패밀리 (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-27, 및 IL-28)에 대한 각각의 렌티바이러스가 HMVEC-L에 독립적으로 형질감염되었다. 이후, 비형질감염된 HMVEC-L의 증식에 대한 배수변화를 산출함으로써, 상기 사이토카인이 HMVEC-L의 VEGF-의존성 증식에 미치는 영향을 확인하였다.
도 3은 일 실시예에 따른 사이토카인 라이브러리를 이용하여, HMVEC-L의 VEGF-의존성 증식에 영향을 미치는 사이토카인을 스크리닝한 결과이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, HMVEC-L의 VEGF-의존성 증식을 억제하는 사이토카인으로서, IL-4, IL-5, IL-13, 및 IL-33을 확인하였다. IL-4, IL-13, 및 IL-33의 혈관 내피세포 증식 억제 효과는 종래 다수의 문헌을 통해 보고된 바 있으므로, 이러한 결과는 본 실시예에 따른 스크리닝의 유효성을 입증하는 것이며, 본 사이토카인 라이브러리는 사이토카인 처리에 따른 생물학적 기능 변화를 스크리닝함에 이용될 수 있음을 나타낸다. 이와 더불어, 이하에서는 HMVEC-L의 VEGF-의존성 증식을 억제하는 사이토카인 중 가장 강력한 효과를 나타낸 IL-5의 항-혈관신생 효과를 확인함으로서, 본 실시예에 따른 스크리닝의 유효성을 재차 검증하고자 하였다.
실시예 3. 기능성 사이토카인에 대한 스크리닝의 유효성 검증
본 실시예에서는 IL-5의 항-혈관신생 효과를 혈관 내피세포의 증식능, 이주능, 및 관 형성 효능을 통해 확인하고, 이에 대한 구체적인 메커니즘을 확인함으로써, 본 실시예에 따른 스크리닝의 유효성을 확인하고자 하였다.
3-1. 혈관 내피세포의 증식능 변화
HMVEC-L의 증식은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)을 사용한 MTT 분석에 의해 평가하였다. 구체적으로, 2000개의 HMVEC-L을 포함하는 96-플레이트 웰에 다양한 농도 (0.1, 0.5, 1, 또는 10ng/ml)의 재조합 인간 IL-5 및 VEGF (A 형, 10ng/ml) (R&D Systems)을 처리하고, 72 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 마이크로 플레이트 판독기 (Bio-Rad, USA)를 사용하여 490nm의 파장에서 HMVEC-L의 증식을 평가하였다. 또한, HMVEC-L을 포함하는 96-플레이트 웰에 5ng/ml의 IL-5 및 10ng/ml의 VEGF를 처리하고, 이를 1 내지 5일 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 100μl의 5% MTS를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 이를 2시간 동안 인큐베이션시킨 뒤, 상기와 동일한 방법으로 HMVEC-L의 증식을 평가하였다. 한편, 대조군은 IL-5 및 PBS를 처리한 군으로 설정하였다.
도 4는 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 증식에 IL-5가 미치는 영향을 MTT 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, IL-5는 농도 의존적인 방식으로 HMVEC-Ls의 기저 증식(basal proliferation)을 저해하였다. 더욱이, IL-5 및 VEGF를 함께 처리한 경우에도, IL-5의 처리 농도가 1ng/ml 이상인 때부터 상기와 동일한 효과가 관찰되었는바, IL-5는 HMVEC-Ls의 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 증식을 저해하였다. 또한, 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, IL-5의 처리 시간의 증가함에 따라, VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 증식률은 유의적으로 감소되었다.
3-2. 혈관 내피세포의 이주능 변화
HMVEC-L의 이주능은 상처-치유 분석 (Wound-healing assay)에 의해 평가되었다. 구체적으로, HMVEC-L을 24-웰 배양 플레이트 상에 씨딩하였다. 이후, CytoSelect쪠 24-Well Wound Healing Assay kit (Cell Biolabs, INC)를 사용하여, HMVEC-L에 회복 가능한 상처를 유발시켰다. 이후, 여기에 IL-5 및/또는 VEGF를 첨가한 뒤, 18시간 동안 인큐베이션시킨 후, Image J software 모듈을 통해 상처의 폐쇄를 관찰하였다. 폐쇄율을 하기의 식에 의해 산출되었다.
[식]
폐쇄율 (%) = W0-Wn/W0 × 100
(W0: 0시간째 상처의 너비, Wn: n시간째 상처의 너비)
도 5는 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 이주능에 IL-5가 미치는 영향을 상처-치유 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, HMVEC-L에 대한 IL-5의 처리는 PBS-처리 대조군에 비해 상처 폐쇄율을 약 27% 감소시켰고, VEGF와 함께 처리된 조건에서도 IL-5는 VEGF 단독 처리 군에 비해 상처 치유를 약 33% 저해하였다.
3-3. 혈관 내피세포의 관 형성능 변화
HMVEC-L의 관 형성능은 기존의 관 형성 분석법에 의해 평가되었다. 구체적으로, 10000개의 HMVEC-L을 u-플레이트 혈관신생 96 웰 플레이트 (Ibidi) 내 메트리겔(Standard Formulation, BD Biosciences)에서 5ng/ml의 IL-5 및/또는 10ng/ml의 VEGF와 함게 25시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, Image J analysis software를 통해 생성된 분지점 (branch point)의 총 수 및 형성된 관의 총 길이를 산출하였다.
도 6은 VEGF에 의해 유도된 혈관 내피세포의 관 형성능에 IL-5가 미치는 영향을 관 형성 분석법을 통해 확인한 결과이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, VEGF와 함께 처리된 조건에서, IL-5의 처리는 VEGF 단독 처리 군에 비해 분지점의 총 수 및 형성된 관의 총 길이를 유의적으로 감소시켰다.
3-4. 항-혈관신생의 메커니즘 확인
IL-5의 처리에 의한 항-혈관신생의 세포 내 신호 전달 메커니즘을 확인하기 위하여, HMVEC-L의 STAT5 발현을 넉 다운시키고, 이에 따른 항-혈관신생 효과를 실험적으로 확인하였다. 구체적으로, HMVEC-L의 STAT5 발현은 ON-TARGET 및 SMARTpool STAT siRNA (Dharmacon)에 의해 넉 다운되었다. 내피 세포 단일 층의 형질 감염은 Oligofectamine 및 무혈청 Opti-MEM (Invitrogen)에서 50 nM 최종 농도의 siRNA와 함께, 웰 당 300,000개의 세포를 6시간 동안 인큐베이션시킴으로써 진행되었다. siRNA / Oligofectamine mix와 함께 6시간 동안 인큐베이션시킨 후, HMVEC-L을 세척하고 2ml의 완전한 ECGM 배지를 각 웰에 첨가하였다. 형질감염 후, 세포를 기능 분석을 위해 96 웰 플레이트로 옮겼다. 한편, 웨스턴 블럿 분석을 위하여, HMVEC-L 유래 용해물을 Laemmli 샘플 완충액 (95℃에서 5 분)에서 변성시키고 SDS-PAGE로 분리한 다음, 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 상기 니트로 셀룰로오스 막을 5 % BSA가 포함된 PBST에서 1 시간 동안 블로킹시킨 후, 1차 항체와 4 ℃에서 밤새 항온 인큐베이션시켰다. 상기 니트로 셀룰로오스 막을 PBST로 여러 번 세척한 후, 블롯을 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-인간 항체 또는 항- 토끼 항체와 함께 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 상기 니트로 셀룰로오스 막을 PBST로 세척하고 ECL로 현상하였다. 항 IL-5RA, 항 IL-5RB, STAT1, STAT5, pSTAT1 및 pSTAT5 항체는 Cell Signaling Technology로부터 입수하였다.
도 7은 IL-처리에 의한 STAT5의 인산화를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과이고, 도 8A 내지 8C는 STAT5가 넉 다운된 HMVEC-L에 대하여, IL-5의 처리가 VEGF에 의해 유도된 항-혈관신생 효과에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, IL-5 처리는 HMVEC-Ls 내 STAT5의 인산화를 강력하게 유도하였다. 또한, 도 8A 내지 8C에 나타낸 바와 같이, STAT5의 넉 다운은 HMVEC-Ls에 대한 IL-5의 증식능, 이주능, 및 관 형성능 억제 효과를 상쇄시켰다. 이는 STAT5의 활성화가 혈관 내피세포에 대한 IL-5의 항-혈관신생 효과를 매개하는 것임을 나타낸다.
이러한 일련의 실험 결과들은 IL-5가 강역한 전-혈관생성 인자, VEGF의 존재 하에서도, 혈관 내피세포에 대한 항-혈관신행 효과가 발휘될 수 있음을 제시하는 것이며, 이는 본 실시예에 따른 스크리닝의 유효성을 검증하는 결과이다.

Claims (16)

  1. 사이토카인;
    세포막 관통 도메인 (Transmembrane domain); 및
    상기 사이토카인과 세포막 관통 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포막 관통 도메인은 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor tyrosine kinases: RTKs)의 세포막 관통 도메인인 것인 융합 폴리펩티드.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈의 세포막 관통 도메인은 표피 성장인자 수용체, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈관내피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인 수용체, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin: CCK) 수용체, 신경영양인자(Neurotrophic factor: NGF) 수용체, 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF) 수용체, 에프린(Ephrin: Eph) 수용체, 안지오포이에틴 수용체, 및 RYK(related to receptor tyrosine kinase) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 수용체의 세포막 관통 도메인인 것인 융합 폴리펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인은 BMP (Bone morphogenetic protein) 패밀리, CCL (Cheomkine ligands) 패밀리, CMTM (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member) 패밀리, CXCL (C-X-C motif ligand ligand) 패밀리, GDF (Growth/differentiation factor) 패밀리, 성장 호르몬, IFN (Interferon) 패밀리, IL (Interleukin) 패밀리, TNF (Tumor necrosis factors) 패밀리 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 융합 폴리펩티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인은 REG, ATP6AP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP7, BMP8A, BMP8B, BRE, C5, CCL1, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L1, CCL4L2, CCL5, CCL7, CD40LG, CD70, CDK5, CER1, CKLF, CLCF1, CMTM1, CMTM2, CMTM3, CMTM4, CMTM5, CMTM6, CMTM7, CMTM8, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CSH1, CSH2, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, CYP26B1, EBI3, EDA, EPO, ERAP1, ERBB2IP, FAM3B, FAM3C, FAM3D, FASLG, FGF10, FGF12, FIGF, FLT3LG, GDF10, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF9, GH1, GLMN, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE1, IFNG, IFNW1, IGL1, IK, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL1RN, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL32, IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, INHA, INHBA,INHBB, JAK1, KITLG, LASS1, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, LTB, MDK, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, NRG1, OSM, PDGFA, PDGFB, PF4, PF4V1, PIK3R1, PPBP, PRL, PTEN, PTN, PXMP2, RHOQ, SCG2, SCGB1A1, SCGB3A1, SCO2, SCYE1, SDCBP, SECTM1, SIVA1, SLCO1A2, SLURP1, SOCS2, SPP1, SPRED2, THPO, TNF, TNFRSF11B, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, TNFSF8, TNFSF9, TRADD, TRAP1, TRIP6, TSLP, TXLNA, TYMP, VEGFA, VEGFB, VEGFC, WNT16, XCL1, XCL2, YARS 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 융합 폴리펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인은 표적 세포에 자가분비 (autocrine)되는 것인 융합 폴리펩티드.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 세포막 관통 도메인은 표적 세포의 세포막을 관통하여 고정되고, 상기 사이토카인은 표적 세포의 세포막 수용체에 결합하여 표적 세포를 자극하는 것인 융합 폴리펩티드.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 가요성 링커이고, 1 내지 400개의 아미노산 잔기로 이루어진 것인 융합 폴리펩티드.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 (GGGGS)n (서열번호 1), (SGGGG)n　(서열번호 2), (SRSSG)n (서열번호 3), (SGSSC)n (서열번호 4), (GKSSGSGSESKS)n (서열번호 5), (RPPPPC)n (서열번호 6), (SSPPPPC)n (서열번호 7),　 (GSTSGSGKSSEGKG)n (서열번호 8), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n (서열번호 9),　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n　(서열번호 10), 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n (서열번호 11)이고, 상기 n은 1 내지 20의 정수인 것인 융합 폴리펩티드.
  10. 청구항 1의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 청구항 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  13. 청구항 11의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포 또는 식물 세포인 것인 숙주 세포.
  15. 복수 개의 청구항 1의 융합 폴리펩티드, 청구항 10의 폴리뉴클레오티드, 청구항 11의 벡터, 또는 청구항 13의 숙주 세포를 포함하는 사이토카인 라이브러리.
  16. 청구항 10의 숙주 세포로부터 사이토카인에 의한 세포의 생물학적 변화, 외인성 또는 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 변화, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 변화를 확인하는 단계를 포함하는, 사이토카인을 스크리닝하는 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022135357A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. A hIL7/hCCL19 DOUBLE GENE RECOMBINANT ONCOLYTIC VIRUS AND ITS PREPARATION METHOD AND USE
WO2023278335A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 Cytoimmune Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cell expansion
EP4241790A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-13 InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. Expression system for the treatment of cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010012809A (ko) * 1997-05-21 2001-02-26 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 생체막을 통한 수송을 증진시키는 조성물 및 방법
KR20160028754A (ko) * 2014-09-04 2016-03-14 디오셀 주식회사 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010012809A (ko) * 1997-05-21 2001-02-26 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 생체막을 통한 수송을 증진시키는 조성물 및 방법
KR20160028754A (ko) * 2014-09-04 2016-03-14 디오셀 주식회사 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI, JINGJING ET AL.: "Development of a membrane-anchored ligand and receptor yeast two-hybrid system for ligand-receptor interaction identification", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, no. 35631, 2016, pages 1 - 13, XP055444241 *
LIU, TAO ET AL.: "Construction and screening of a lentiviral secretome library", CELL CHEMICAL BIOLOGY, vol. 24, 2017, pages 767 - 771, XP085092796 *
YANG, YUFANG ET AL.: "A novel method to incorporate bioactive cytokines as adjuvants on the surface of virus particles", JOURNAL OF INTERFERON & CYTOKINE RESEARCH, vol. 29, no. 1, 2009, pages 9 - 22, XP055664997 *
ZHA, ZHAO ET AL.: "Interferon-gamma is a master checkpoint regulator of cytokine-induced differentiation", PNAS, vol. 1 14, no. 33, 2017, pages E6867 - E6874, XP055664994 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022135357A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. A hIL7/hCCL19 DOUBLE GENE RECOMBINANT ONCOLYTIC VIRUS AND ITS PREPARATION METHOD AND USE
WO2023278335A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 Cytoimmune Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cell expansion
EP4241790A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-13 InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. Expression system for the treatment of cancer
WO2023170087A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Innather Gene Therapy S. À R.L. Expression system for the treatment of cancer

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