BR112021009111A2 - Anticorpos anti-nkg2a e usos dos mesmos - Google Patents

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Christine BEE
Xiang Shao
Alan J. Korman
Shrikant Deshpande
Amy D Jhatakia
Richard Y. HUANG
Guodong Chen
Ginger C. Rakestraw
Karla Ann Henning
Vangipuram S. RANGAN
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Abstract

ANTICORPOS ANTI-NKG2A E USOS DOS MESMOS. A presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados (por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados e humanos), ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que especificamente se ligam à proteína do grupo de receptores inibidores de células exterminadoras naturais humanas 2A (NKG2A) com alta afinidade e apresentam propriedades funcionais terapeuticamente desejáveis, tais como para o tratamento de, por exemplo, câncer. Imunoconjugados, moléculas biespecíficas, e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-NKG2A da invenção são também fornecidos. Moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos, vetores de expressão, células hospedeiras, e métodos de tratamento de, por exemplo, câncer usando os anticorpos são ainda fornecidos. Terapia de combinação, em que um anticorpo anti-NKG2A na presente invenção é coadministrado com pelo menos um agente adicional, tal como outro anticorpo (por exemplo, anticorpos anti-PD-1, anti-PD-L1 e/ou anti-CTLA-4), é também fornecida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTI- CORPOS ANTI-NKG2A E USOS DOS MESMOS”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos EUA Nº. 62/768.471, depositado em 16 de novembro de 2018, e Pedido Provisório dos EUA Nº. 62/927.211, depositado em 29 de outubro de 2019, ambos os quais são no presente documento incor- porados por referência em suas totalidades.
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a anticorpos anti-NKG2A (grupo de receptores inibidores de células exterminadoras naturais hu- manas 2A) e composições farmacêuticas dos mesmos. A invenção tam- bém se refere a métodos para usar tais anticorpos, incluindo métodos para tratar doenças, tais como câncer administrando os anticorpos anti- NKG2A e composições farmacêuticas dos mesmos. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE- TRONICAMENTE VIA EFS-WEB O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é no presente docu- mento incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 4 de novembro de 2019, é denominada 13119-WO- PCT_SL.txt e tem 273,467 bytes de tamanho.
ANTECEDENTES O câncer é uma epidemia global. De acordo com o Global Health Data Exchange, o câncer é uma das principais causas de doença e a segunda maior causa de morte, causando cerca de 17% das mortes no mundo. (Hannah Ritchie e Max Roser, “Causes of Death - Share of death by cause, World, 2017”, OurWorldInData.org, 2018, disponível em https://ourworldindata.org/grapher/share-of-deaths-by-causa-2016). De acordo com a Organização Mundial da Saúde, ainda em 2010, o im- pacto econômico do câncer foi de US$1,16 trilhão; em 2018, o câncer foi responsável por cerca de 9,6 milhões de mortes em todo o mundo. (“Cancer.” World Health Organization.
World Health Organization, 2018, disponível em https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/can- cer). Segundo estimativas do Instituto Nacional do Câncer, em 2019, mais de 1,7 milhão de novos pacientes serão diagnosticados com cân- cer, e mais de 600 mil pacientes morrerão de câncer nos Estados Uni- dos. (“Cancer Stat Facts: Cancer of Any Site.” Módulos de Treinamento SEER, Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, Instituto Nacional do Câncer, 2019 <https://seer.cancer.gov/statfacts/html/all.html>). Os tratamentos tradicionais do câncer incluem cirurgia, radi- oterapia e quimioterapia, entre outras terapias.
Nos últimos anos, a imuno-oncologia ou imunoterapia surgiram como uma nova opção para o tratamento de câncer a partir do sistema imune do organismo.
A imuno-oncologia é diferente dos tratamentos tradicionais de câncer, que, por exemplo, tentavam atingir os tumores diretamente e/ou inter- romper o fornecimento de sangue ao tumor.
Em vez disso, a imuno- oncologia é projetada para aproveitar o próprio sistema imune do paci- ente para ajudar a restaurar ou aumentar a resposta imune antitumoral do paciente.
Sem uma abordagem imuno-oncológica, as próprias res- postas imunes de um paciente frequentemente falham em prevenir o crescimento do tumor por várias razões.
Por exemplo, muitos tumores desenvolveram mecanismos especializados para evitar as respostas imunes do paciente.
As células tumorais também podem perder a ex- pressão de antígenos que podem ser reconhecidos pelo sistema imune do paciente.
Em outros casos, o crescimento rápido de um tumor pode até sobrecarregar a capacidade do sistema imune de controlar o tumor de maneira eficaz. (Abbas et al., “Cap. 18: Immunity to Tumors”, em
Cellular and Molecular Immunology, 9ª ed. Elsevier, Inc., (2018)). Com- preender como o sistema imune afeta o desenvolvimento do câncer e como o sistema imune pode ser usado para tratar o câncer apresentou problemas desafiadores e multifacetados. Por exemplo, muitos pacien- tes não respondem aos tratamentos imuno-oncológicos existentes, e al- guns desenvolvem mecanismos de resistência, tais como exaustão de células T, que é quando uma célula T, um tipo específico de glóbulo branco, deixa de funcionar adequadamente. (Dempke et al., Eur. J. of Cancer, 74: 55-72 (2017)). Os pacientes precisam de tratamentos melhorados para do- enças, tais como câncer, para melhorar as terapias tradicionais, inclu- indo as imunoterapias contra câncer atualmente disponíveis. Há uma grande necessidade de novos agentes imuno-oncológicos usados sozi- nhos ou em combinação com os agentes existentes para melhorar as taxas de resposta dos pacientes e para superar a resistência o fárma- cos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece, em alguns aspectos, anticor- pos monoclonais isolados (por exemplo, anticorpos monoclonais huma- nizados e humanos) que se ligam à proteína NKG2A humana (SEQ ID NO: 1), isto é, anticorpos anti-NKG2A, incluindo anticorpos anti- hNKG2A que mostram propriedades funcionais desejáveis. Em um as- pecto, as propriedades funcionais desejáveis dos anticorpos anti- NKG2A descritos neste documento incluem estimular respostas imunes, por exemplo, para tratar câncer. Em outro aspecto, as propriedades fun- cionais desejáveis dos anticorpos anti-NKG2A descritos neste docu- mento incluem tratar indivíduos infectados com vírus, incluindo pacien- tes humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A des- critos neste documento tratam doenças infecciosas. Em outro aspecto, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento tratam condições autoimunes.
Em outras modalidades, os anticorpos anti-NKG2A da in- venção são usados como anticorpos anti-NKG2A antagonísticos para estimular e/ou aumentar uma resposta imune em um indivíduo, por exemplo, para estimular e/ou aumentar as respostas antitumorais do sistema imune, incluindo células exterminadoras naturais e/ou células T.
Em outras modalidades, os anticorpos anti-NKG2A da invenção são usados em combinação com outros anticorpos para tratar várias condi- ções, incluindo câncer, doenças infecciosas, incluindo infecções virais, e doenças autoimune.
Por conseguinte, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento, isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, tais como outros tratamentos imuno-oncológicos e/ou quimioterapia e/ou cirurgia, são usados para tratar várias condições ou doenças, incluindo câncer e infecções virais.
Em outras modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste do- cumento são usados em métodos para detectar proteína NKG2A em uma amostra.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, especificamente liga NKG2A humana e apresenta pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) reduz (por exemplo, bloqueia) a ligação e/ou interação de um ligando de NKG2A (por exemplo, HLA-E em seres humanos) à pro- teína NKG2A humana; (b) reverte sinalização inibidora mediada por NKG2A; (c) não liga, ou liga com baixa afinidade para, proteína NKG2C humana; (d) liga-se a NKG2A humana e/ou de cinomolgo; (e) aumenta a resposta de célula exterminadora natural; (f) aumenta a atividade funcional de células T;
(g) tem ligação reduzida a receptor Fc gama humano (FcγR); (h) induz e/ou aumenta uma resposta imune antitumor; (i) induz e/ou aumenta uma resposta imune antiviral; e/ou (j) tem baixa imunogenicidade em indivíduos, incluindo indi- víduos humanos.
Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem uma ou mais das se- guintes propriedades: (a) tem um valor de EC50 de cerca de 0,6 nM ou menos para ligação à proteína NKG2A humana como medido por ensaio de ligação celular; (b) tem um valor de EC50 de cerca de 9,0 nM ou mais para ligação à proteína NKG2C humana como medido por ensaio de ligação celular; (c) tem um valor de EC50 para ligação à proteína NKG2A hu- mana que é cerca de 15 vezes menor do que um segundo valor de EC50 para ligação à proteína NKG2C humana; (d) tem um valor de IC50 de cerca de 1,0 nM ou menos para reduzir a ligação e/ou interação de HLA-E à proteína NKG2A humana como medido por ensaio de bloqueio celular; (e) liga-se à proteína NKG2A humana com uma KD de cerca de 0,4 nM ou menos como medido por análise de Scatchard; (f) liga-se à NKG2A humana com uma KD de cerca de 61 nM ou menos como medido por ressonância de plasmons de superfície; (g) liga-se à NKG2A de cinomolgo com uma KD de cerca de 1,0 nM ou menos como medido por análise de Scatchard; (h) é internalizado mediante ligação a células que expressão NKG2A; (i) aumenta a produção de interferon-gama (IFNγ);
(j) apresenta internacionalização com um valor de EC50 de cerca de 0,5 nM ou menor; e/ou (k) em que a meia-vida do complexo de anticorpo NKG2A:NKG2A é cerca de 40 segundos ou mais.
Em algumas modali- dades, a meia-vida do complexo de anticorpo NKG2A:NKG2A é medida usando análise de ressonância de plasmons de superfície.
Em uma modalidade, os anticorpos anti-NKG2A, ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos neste documento reduzem (por exemplo, bloqueiam) a interação de proteína NKG2A hu- mana e ligando de NKG2A humana (isto é, HLA-E). Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, em que o anti- corpo compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 11, 12, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 13, 14, e 15; (b) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 11, e 12, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 154, 14, e 15; ou (c) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 11, e 12, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 155, 14, e 15. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo mono- clonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que es- pecificamente se liga à proteína NKG2A humana, e compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que
(a) a região variável de cadeia pesada compreende uma se- quência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85% pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 167; e/ou (b) a região variável de cadeia leve compreende uma se- quência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85% pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 164, ou SEQ ID NO: 169, respectivamente.
Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequên- cia de aminoácido de SEQ ID NO: 164. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID
NO: 167, e uma região variável de cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 169. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo mono- clonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que es- pecificamente se liga à proteína NKG2A humana, em que as cadeias leves e pesadas consistem essencialmente em: (a) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7 e 5, res- pectivamente; (b) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7 e 19, respectivamente; ou (c) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente.
Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compete para ligação à proteína NKG2A com ou se liga ao mesmo epítopo que os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo mono- clonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que, quando ligado à proteína NKG2A humana, o anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, especificamente se liga aos seguin- tes resíduos de aminoácido como determinado por espectrometria de massa com troca hidrogênio-deutério (HDX-MS): (a) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156); (b) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157); (c) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158); e (d) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159). Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação de um ligando de NKG2A (por exemplo, HLA-E em seres hu- manos) à proteína NKG2A humana.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo mono- clonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que, quando ligado à NKG2A humana, especificamente se liga aos seguintes resíduos de aminoácido como determinado por HDX-MS e/ou mapea- mento de epítopo por oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP): (a) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156) (b) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157) (c) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158) (d) L; e (e) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159). Em algumas modalidades, o anticorpo bloqueia a ligação de um ligando de NKG2A (por exemplo, HLA-E em seres humanos) à pro- teína NKG2A humana.
Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado é um anticorpo de comprimento total.
Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal isolado é um anticorpo IgG1 de comprimento total.
Em al- gumas outras modalidades, o anticorpo monoclonal isolado é um frag- mento de anticorpo.
Em outras modalidades, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv ou scFv.
Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal isolado é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclo- nal de comprimento total isolado que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, em que (a) a cadeia pesada compreende uma sequência de amino- ácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 7, e/ou
(b) a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo mo- noclonal de comprimento total isolado compreende a sequência de ami- noácido estabelecida na SEQ ID NO: 7, e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto, o anticorpo monoclonal de comprimento total isolado especificamente se liga à proteína NKG2A humana, em que a cadeia pesada consiste essencialmente na sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7, e a cadeia leve consiste essencialmente na sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a região variável de cadeia pesada e/ou região variável de cadeia leve dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos neste documento.
Em algu- mas modalidades, a molécula de ácido nucleico é DNA complementar (cDNA). Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor de expressão compreendendo as moléculas de ácido nucleico descritas neste docu- mento.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão descrito neste documento.
Em outro aspecto, a invenção fornece um imunoconjugado que compreende os anticorpos descritos neste documento ligados a um agente.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de produzir o anticorpo compreendendo cultivar a célula hospedeira descrita neste documento.
Em algumas modalidades, os métodos ainda compreen- dem recuperar o anticorpo da célula hospedeira.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula biespe- cífica compreendendo os anticorpos anti-NKG2A descritos neste docu- mento ligados a uma segunda porção funcional.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição com- preendendo os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento, ou as moléculas biespecíficas descritas neste documento, e um veículo far- maceuticamente aceitável e/ou uma glicoproteína de hialuronidase neu- tra-ativa solúvel.
Em algumas modalidades, a composição ainda com- preende um agente terapêutico adicional.
Em outras modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti- PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA-4. Em outras modalidades, o anti- corpo anti-PD-1 é nivolumab, e o anticorpo anti-CTLA é ipilimumab.
Em outras modalidades, os anticorpos descritos neste documento são para uso como um medicamento para tratar câncer.
Em algumas modalidades, o câncer que é tratado usando os anticorpos anti-NKG2A, imunoconjugados, moléculas biespecíficas e composições descritas neste documento é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer testicular, câncer esofágico, câncer gastrointestinal, câncer pan- creático, câncer colorretal, câncer renal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de células germinativas, câncer ósseo, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de pele, ne- oplasia do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sar- coma, endometrial, cervical, gástrico, melanoma, renal, urotelial, glioblastoma multiforme ou câncer relacionado a vírus.
Em outras mo- dalidades, o câncer é cervical, carcinoma de células escamosas de ca- beça e pescoço (HNSCC), pancreático, câncer de pulmão de células não pequenas do tipo adenocarcinoma (NSCLC-AD), câncer de pulmão de células não pequenas do tipo células escamosas (NSCLC-SQC), gástrico, melanoma, colorretal (CRC), endometrial, ovariano, carcinoma de células renais (RCC), carcinoma urotelial (UCC), mama, pulmão de células pequenas, glioblastoma multiforme, câncer de próstata (também conhecido como adenocarcinoma da próstata ou PRC), ou linfoma não Hodgkin.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A são para uso no aumento de uma resposta imune.
Em outras modalidades, a invenção prevê o uso dos anticorpos anti-NKG2A descritos neste do- cumento na fabricação de um medicamento para tratamento de câncer.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ou retardar a progressão de câncer em um indivíduo humano compreen- dendo administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz dos an- ticorpos anti-NKG2A, imunoconjugados, moléculas biespecíficas, ou composições descritas neste documento.
Em algumas modalidades, o câncer é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer testicular, câncer esofá- gico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colorretal, cân- cer renal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de células germinativas, câncer ósseo, câncer de fí- gado, câncer de tireoide, câncer de pele, neoplasia do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, endometrial, cervical, gástrico, melanoma, renal, urotelial, glioblastoma multiforme, ou câncer relacionado a vírus.
Em outras modalidades, o câncer é cervical, carci- noma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), pancreá- tico, câncer de pulmão de células não pequenas do tipo adenocarci- noma (NSCLC-AD), câncer de pulmão de células não pequenas do tipo células escamosas (NSCLC-SQC), gástrico, melanoma, colorretal (CRC), endometrial, ovariano, carcinoma de células renais (RCC), car-
cinoma urotelial (UCC), mama, pulmão de células pequenas, glioblas- toma multiforme, câncer de próstata (também conhecido como adeno- carcinoma da próstata ou PRC), ou linfoma não Hodgkin.
Em outras modalidades, os métodos ainda compreendem administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao indivíduo hu- mano.
Em algumas modalidades, os um ou mais agentes terapêuticos adicionais são um agente quimioterápico, um agente radioterápico e/ou um agente imunoterápico.
Em outras modalidades, os um ou mais agen- tes terapêuticos adicionais são um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA-4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab, e o anticorpo anti-CTLA-4 é ipililumab.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de estimular uma resposta imune em um indivíduo humano compreendendo admi- nistrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz dos anticorpos anti- NKG2A, moléculas biespecíficas ou composições descritas neste docu- mento.
Em algumas modalidades, o indivíduo humano tem um tumor, e uma resposta imune antitumor é estimulada.
Em outras modalidades, o indivíduo humano tem uma infecção viral crônica e uma resposta imune antiviral é estimulada.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de detectar a presença de proteína NKG2A em uma amostra compreendendo con- tactar a amostra com o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos neste documento, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e proteína NKG2A, e detectar a formação do complexo.
Em algumas modalidades do método, o anticorpo, ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, forma um complexo 15 vezes mais rapidamente com proteína NKG2A do que com proteína NKG2C.
Outras características e vantagens da presente invenção se- rão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos, que não devem ser interpretados como limitantes. O conteúdo de todas as referências, GenBank e outras entradas de sequência, patentes e pedi- dos de patente publicados citados ao longo deste pedido são expressa- mente incorporados neste documento por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS As Figuras 1A-C ilustram três métodos que foram usados para descobrir e testar os anticorpos anti-NKG2A descritos neste docu- mento. A Figura 1A ilustra o método de hibridoma e etapas de desco- berta e desenvolvimento de anticorpo anti-NKG2A em um alto nível. A Figura 1B ilustra o método de geração de biblioteca de anticorpos usado para descoberta de anticorpo. A Figura 1C ilustra o método de clonagem de células B simples (SBCC). A Figura 2 ilustra a análise de varredura mutacional usada para otimizar os anticorpos anti-NKG2A que foram descobertos. Espe- cificamente, a Figura 2 mostra as etapas para gerar variantes do anti- corpo 13F3.A4 I107T e para caracterizar sua ligação à proteína NKG2A. Essa análise permitiu aos inventores gerar variantes do anticorpo 13F3.A4 I107T com propriedades melhoradas, e forneceu um rico con- junto de informações sobre o efeito de substituições de aminoácidos in- dividuais na ligação do anticorpo 13F3.A4 I107T com a proteína NKG2A. A Figura 2 descreve SEQ ID NOs: 183-190, respectivamente, na ordem de aparecimento de cima para baixo. A Figura 3 é um mapa de calor (heat map) exemplificativo que foi gerado usando análise de varredura mutacional, e permite a in- terpretação da relação sequência-atividade de substituições de amino- ácido individuais. A Figura 3 descreve SEQ ID NOs: 191 (linha germinal) e SEQ ID NO: 192 (parental). A Figura 4 mostra as posições de CDR que foram analisadas para o anticorpo anti-NKG2A 13F3.A4 I107T usando análise de varredura mutacional. A Figura 4 descreve SEQ ID
NOs: 30, 15, 192, 11, e 193, respectivamente, em ordem de apareci- mento.
As Figuras 5A-E são os mapas de calor que foram gerados usando a análise de varredura mutacional de anticorpo 13F3.A4 I107T para substituições de LCDR1 (SEQ ID NOs: 194 e 30, linha germinativa e parental, respectivamente) (Figura 5A); substituições de LCDR3 (SEQ ID NOs: 195 e 15, linha germinativa e parental, respectivamente) (Figura 5B); substituições de HCDR1 (SEQ ID NOs: 196 e 192, linha germina- tiva e parental, respectivamente) (Figura 5C); substituições de HCDR2 (SEQ ID NOS: 42 e 11, linha germinativa e parental, respectivamente) (Figura 5D); e substituições de HCDR3 (SEQ ID NOS: 193 e 193, linha germinativa e parental, respectivamente (Figura 5E). A Figura 6 mostra o alinhamento da sequência canônica de sequências de aminoácido de NKG2A humana de comprimento total (SEQ ID NO: 182) e NKG2C humana (SEQ ID NO: 3). Cerca de 76% dos resíduos de aminoácido (177 de 233 resíduos de aminoácidos) são conservados, cerca de 6% dos resíduos de aminoácido (14 de 233 re- síduos de aminoácido) são similares, e apenas cerca de 18% dos resí- duos de aminoácido ( 42 de 233 resíduos de aminoácidos) são diferen- tes entre as proteínas NKG2A humana e NKG2C humana.
A Figura 7A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 166) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 167 sem sequência de sinal) da região variável da cadeia pesada madura (VH) do anticorpo anti-NKG2A 13F3.A4. As sequências de aminoácido das sequências de VH CDR1 (SEQ ID NO: 27), VH CDR2 (SEQ ID NO: 28) e VH CDR3 (SEQ ID NO: 29) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 7B mostra as sequências de nucleotídeo (SEQ ID NO: 168) e sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 169) da região va- riável de cadeia leve do anticorpo 13F3.A4. As sequências de aminoá- cido das sequências de VL CDR1 (SEQ ID NO: 30), VL CDR2 (SEQ ID
NO: 31) e VL CDR3 (SEQ ID NO: 32) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 8A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 51) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 52) da região de VH madura do anticorpo anti-NKG2A 2G6.C2. As sequências de aminoá- cido das sequências de VH CDR1 (SEQ ID NO: 55), VH CDR2 (SEQ ID NO: 56) e VH CDR3 (SEQ ID NO: 57) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 8B mostra as sequências de nucleotídeo (SEQ ID NO: 53) e sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 54) da região de VL madura do anticorpo anti-NKG2A 2G6.C2. As sequências de aminoá- cido das sequências de VL CDR1 (SEQ ID NO: 58), VL CDR2 (SEQ ID NO: 59) e VL CDR3 (SEQ ID NO: 60) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 9A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 170) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 171) da região variável de cadeia pesada madura (VH) do anticorpo anti-NKG2A 11H9.A1. As sequências de aminoácido das sequências de VH CDR1 (SEQ ID NO: 41), VH CDR2 (SEQ ID NO: 42) e VH CDR3 (SEQ ID NO: 43) são mos- tradas em caixas cinza.
A Figura 9B mostra as sequências de nucleotídeo (SEQ ID NO: 172) e sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 173) da região va- riável de cadeia leve do anticorpo anti-NKG2A maduro 11H9.A1. As se- quências de aminoácido das sequências VL CDR1 (SEQ ID NO: 44), VL CDR2 (SEQ ID NO: 45), e VL CDR3 (SEQ ID NO: 46) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 10A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 174) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 175) da região de VH madura do anticorpo anti-NKG2A 4G5.D1. As sequências de amino- ácido das sequências VH CDR1 (SEQ ID NO: 69), VH CDR2 (SEQ ID NO: 70), e VH CDR3 (SEQ ID NO: 71) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 10B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID
NO: 176) e sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 177) da VL do an- ticorpo 4G5.D1. As sequências de aminoácido das sequências de VL CDR1 (SEQ ID NO: 72), VL CDR2 (SEQ ID NO: 73) e VL CDR3 (SEQ ID NO: 74) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 11A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 178) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 179) da região de VH madura do anticorpo anti-NKG2A 1G5.B2. As sequências de amino- ácido das sequências VH CDR1 (SEQ ID NO: 83), VH CDR2 (SEQ ID NO: 84) e VH CDR3 (SEQ ID NO: 85) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 11B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 180) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 181) de uma região de VL do anticorpo 1G5.B2. As sequências de aminoácido das sequên- cias de VL CDR1 (SEQ ID NO: 86), VL CDR2 (SEQ ID NO: 87) e VL CDR3 (SEQ ID NO: 88) são mostradas em caixas cinza.
A Figura 12 mostra os riscos de sequência de aminoácido que foram avaliados no anticorpo 13F3.A4. As derivações de linha ger- minativa V, D e J são indicadas.
As sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo 13F3.A4 (SEQ ID NO: 167) são mostradas à esquerda, e as sequências de aminoácido da região variá- vel de cadeia leve do anticorpo 13F3.A4 (SEQ ID NO: 169) são mostra- das à direita.
As sequências de aminoácido das sequências VL CDR1 (SEQ ID NO: 30), VL CDR2 (SEQ ID NO: 31) e VL CDR3 (SEQ ID NO: 32) estão sublinhadas.
As sequências de aminoácido das sequências VH CDR1 (SEQ ID NO: 27), VH CDR2 (SEQ ID NO: 28) e VH CDR3 (SEQ ID NO: 29) estão sublinhadas.
Os riscos de sequência que foram avaliados são circulados e rotulados.
A Figura 13 mostra a sequência de aminoácido de compri- mento total de anticorpo anti-NKG2A NKG2A.9. A sequência de amino- ácido de cadeia leve é estabelecida na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácido de cadeia pesada é estabelecida na SEQ ID NO: 163 (mos- trada com a lisina terminal, que, em outra modalidade, está ausente). A Figura 13 identifica com um oval duas mutações feitas na sequência 13F3.A4 VL (N30S) e sequência VH (I107T) para resultar na sequência NKG2A.9. O motivo de N-glicosilação é mostrado com um oval trace- jado.
Três mutações (L234A, L235E e G273A) que foram feitas na re- gião Fc são mostradas em itálico negrito.
O aminoácido terminal lisina na sequência da cadeia pesada foi removido da sequência madura.
As sequências de aminoácido das sequências de VL CDR1 (SEQ ID NO: 13), VL CDR2 (SEQ ID NO: 14) e VL CDR3 (SEQ ID NO: 15) estão em negrito e sublinhadas.
As sequências de aminoácido das sequências de VH CDR1 (SEQ ID NO: 10), VH CDR2 (SEQ ID NO: 11) e VH CDR3 (SEQ ID NO: 12) estão em negrito e sublinhadas.
A Figura 14 mostra a sequência de aminoácido de compri- mento total de anticorpo anti-NKG2A NKG2A.9. A sequência de amino- ácido de cadeia leve é estabelecida na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácido de cadeia pesada é estabelecida na SEQ ID NO: 7. A Figura 15 mostra a sequência de aminoácido de compri- mento total de anticorpo anti-NKG2A NKG2A.11. A sequência de ami- noácido de cadeia leve é estabelecida na SEQ ID NO: 19, e a sequência de aminoácido de cadeia pesada é estabelecida na SEQ ID NO: 7. A Figura 16 mostra um diagrama de círculo de resultados de binning de epítopos de anticorpos exemplificativos gerados pelo método de clonagem de célula B simples (SBCC), e mostra a diversidade des- ses anticorpos.
Os anticorpos que bloqueiam uns aos outros de forma cruzada são conectados por uma linha.
Os anticorpos de amostra que têm um perfil de bloqueio similar em comparação com os anticorpos de referência (13F3.A4, Z270, RD-ahNKG2a (clone 131411, Catálogo Nº.
MAB1059), e RD-ahCD94 (clone 131412, Catálogo Nº.
MAB1058)) são agrupados juntos nos grupos 1-4, 6-7, e 9. Anticorpos de referência com perfis de bloqueio similares como conjuntos de anticorpo de amostra são também agrupados nos grupos 5, 8 e 10. A Figura 17A mostra o método de ensaio para avaliar a ca- pacidade de anticorpos anti-NKG2A anti-humanos gerados usando o método SBCC para bloquear a interação de NKG2A/HLA-E.
A Figura 17B mostra que os anticorpos de amostra bloquearam apenas parcial- mente ou não bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E, em compara- ção com o controle positivo (anticorpo NKG2A.9) e controle negativo (isótipo). A Figura 18A-C mostra o método de ensaio de ligação (Fi- gura 18A) para avaliar a ligação de anticorpos anti-NKG2A a células CHO que expressam NK2GA humana (Figura 18B) e expressam NKG2C (Figura 18C). Como mostrado na Figura 18B, os anticorpos 13F3.A4, 11H9.A1 e 2EB.B1 mostraram ligação específica às células CHO que expressam NKG2A humana.
A Figura 18D-F mostram o mé- todo de ensaio de bloqueio (Figura 18D) usado para avaliar o bloqueio de anticorpos anti-NKG2A da interação de NKG2A/HLA-E (Figura 18E) e interação de NKG2C/HLA-E (Figura 18F). Os anticorpos 13F3.A4 e 11H9.A1 mostraram ligação específica a células CHO que expressam NKG2A humana (como mostrado na Figura 18E), e não bloquearam a interação de NKG2C/HLA-E (como mostrado na Figura 18F). As Figuras 19A-B ilustram um método de ensaio de ligação (Figura 19A) usado, que avaliou a capacidade do anticorpos anti- NKG2A de se ligarem a uma linhagem de células exterminadoras natu- rais +NKG2A humanas (NKL) (como mostrado na Figura 19B). As Figu- ras 19C-D ilustram o método de ensaio de bloqueio (Figura 19C) usado, que mostrou que os anticorpos anti-NKG2A testaram a ligação de HLA- E bloqueada a NKG2A humana expressando células NKL, como mos- trado na Figura 19D.
As Figuras 20A-C ilustram o método de ensaio de bloqueio
(Figura 20A) usado, que mostrou que os anticorpos NKG2A anti-huma- nos testados bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E em células CHO que expressam hNKG2A, como mostrado na Figura 20B-C.
As Figuras 21A-C ilustram o método de ensaio de ligação (Figura 21A) usado, que mostrou que os anticorpos anti-NKG2A testa- dos se ligaram a células CHO expressando NKG2A humana, como mos- trado nas Figuras 21B-C.
As Figuras 22A-C ilustram o método de ensaio de ligação (Figura 22A) usado, que avaliou a capacidade de anticorpos anti- NKG2A de se ligarem a células CHO que expressam NKG2A de cino- molgo (resultados mostrados nas Figuras 22B-C). As Figuras 23A-B ilustram o método de ensaio de bloqueio (Figura 23A) usado para avaliar a capacidade de anticorpos anti-NKG2A de bloquearem desejavelmente a interação de NKG2A/HLA-E (Figura 23B). As Figuras 23C-D mostram um método de ensaio de ligação usado (Figura 23C) que mostrou a capacidade de anticorpos anti- NKG2A de se ligarem a células CHO que expressam NKG2A (Figura 23D). As Figuras 24A-B mostram o método de ensaio de ligação (Figura 24A) usado para avaliar se os anticorpos anti-NKG2A se ligaram a NKG2A+ NKLs de cinomolgo (Figura 24B). Como mostrado na Figura 24B, os anticorpos 11H9.A1 e 4G5.D1 não se ligaram a células NKG2A+ NK de cinomolgo, enquanto o anticorpo 13F3.A4, desejavelmente se li- gou a células NKG2A+ NK de macaco cinomolgo, como indicado pelo valor de EC50 de 0,2 nM.
A Figura 25A ilustra o método in vitro usado para avaliar se os anticorpos anti-NKGA aumentaram a desgranulação de células NK.
As Figuras 25B-C são gráficos dos resultados da análise de citometria de fluxo, e mostra que todos os anticorpos anti-NKG2A testados (os an- ticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14,
NKG2A.15, NKG2A.5, 2G6.C2 e 4G5.D1) aumentaram a desgranulação de células NK (como medido alteração de dobra em % de CD107a em comparação com o isótipo controle) entre células NKG2A+ NK.
O clone 25E7.G8 (como mostrado na Figura 25B) é um anticorpo de não blo- queio que foi usado como um controle negativo.
A Figura 26A ilustra os experimentos in vitro usando células NKL e CHO/MICA/HLA-E para mostrar que os anticorpos anti-NKG2A bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E entre células NK ativadas e aumentaram a produção de IFN-γ.
A Figura 26B mostra que os anticor- pos 13F3.A4, 11H9.A1 e 4G5.D1 aumentaram desejavelmente a produ- ção de IFN-γ em comparação com o isótipo controle (anticorpo IgG1.3 humano). O clone 25E7.G8 foi usado como controle negativo.
A Figura 27A ilustra os experimentos in vitro usados para avaliar se os anticorpos anti-NKG2A aumentaram a resposta de células T CD8+ de IFNγ elevado em células-alvo Hs766T, uma linhagem celular de carcinoma pancreático.
A Figura 27B é uma representação gráfica dos resultados do ensaio e mostrou que os anticorpos 13F3.A4 e 11H9.A1 aumentaram a produção de IFN-γ em comparação com o isó- tipo controle.
O clone 25E7.G8 foi usado como controle negativo.
As Figuras 28A-B mostram os resultados da análise de troca de hidrogênio-deutério (HDX) diferencial de mFc-hNKG2A-hCD94 me- diante interação com o anticorpo NKG2A.9 (Figura 28A) e com o anti- corpo 13F3.A4 (Figura 28B), respectivamente.
As sequências de epí- topo são marcadas nas Figuras 28A-B (SEQ ID NOS: 119-122, descritas da esquerda para a direita ao longo da análise). As Figuras 29A-B mostram porcentagens de proteção FPOP para quatro resíduos (M163, F179, H184, L206) em hNKG2A após inte- ração com Anticorpo NKG2A.9 (Figura 29A) e com anticorpo13F3.A4 (Figura 29B), respectivamente.
A Figura 30 mostra os epítopos de anticorpos NKG2A.9 e
13F3.A4 como determinado por HDX-MS e por FPOP mapeado para a sequência mFc-hNKG2A-hCD94 (SEQ ID NO: 125). Os epítopos em negrito e sublinhados foram determinados por HDX-MS, e os epítopos circulados foram determinados por análise FPOP.
A Figura 31 mostra o epítopo de anticorpo anti-NKG2A (por exemplo, dos anticorpos NKG2A.9 e 13F3.A4) visualizado na estrutura cristalina de NKG2A/CD94/HLA-E.
O epítopo de anticorpo anti-NKG2A é mostrado em preto.
A Figura 32A-B mostra o alinhamento da região de VH (SEQ ID NOS: 167, 8 e 8, respectivamente, em ordem de aparecimento de cima para baixo) (Figura 32A) e regiões de VL (SEQ ID NOS: 169, 9 e 164, respectivamente, em ordem de aparecimento de cima para baixo) (Figura 32B) de certas porções dos anticorpos anti-NKG2A (13F3.A4, NKG2A.9 e NKG2A.11). Esse alinhamento resultou na descoberta de anticorpos anti-NKG2A com sequências de CDR de consenso mostra- das em caixas.
A Figura 33 mostra resultados do ensaio que o anticorpo NKG2A.9, em comparação com o isótipo, reverteu a inibição da sinali- zação de NK-κB em células T Jurkat que expressam NKG2A estimula- das por CHO/scOKT3/HLA-E.
A Figura 34A ilustra o método experimental usado para ana- lisar o efeito de anticorpos NKG2A.9 e anti-PD-L1, isoladamente ou em combinação, na indução de IFN-γ por células T CD8+ NKG2A+ isoladas de células mononucleares de sangue periférico saudáveis (PBMCs). A Figura 34B mostra os resultados do método, em que a combinação de anticorpos NKG2A.9 e anti-PD-L1 aumentou a produção de IFN-γ por células T CD8+ NKG2A+ de maneira dose-dependente.
A Figura 35A-B ilustra o método de ensaio (Figura 35A) usado para mostrar que anticorpos NKG2A.9 e/ou anti-PD-L1 aumenta-
ram a produção de IFN-γ em células T CD8+ NKG2A+ isoladas de tu- mores humanos cocultivados com CHO/scOKT3/HLA-E/PD-L1 (Figura 35B). A Figura 36A é um gráfico que mostra que o anticorpo NKG2A.9 foi internalizado após ligação a células que expressam NKG2A.
A Figura 36B é um gráfico que mostra a cinética de ligação do anticorpo NKG2A.9 e demonstra que o anticorpo NKG2A.9 foi internali- zado de forma dose-dependente com um EC50 de 0,5 nM.
As Figuras 37A-B ilustram o método usado (Figura 37A) para mostrar que o anticorpo NKG2A.9, em comparação com o isótipo, au- mentou a degranulação de células NK de maneira dose-dependente, como medido por % de expressão de CD107a medida por citometria de fluxo.
As Figuras 37C-D ilustram o método experimental usado (Figura 37C) que mostrou que o anticorpo NKG2A.9, em comparação com o isótipo, aumentou a lise de células tumorais que expressam HLA-E de maneira dose-dependente (Figura 37D). A Figura 38A ilustra o método usado para medir o efeito do anticorpo 13F3.A4 na produção de IFN-γ em NKLs cocultivados com CHO/MICA/HLA-E.
A Figura 38B mostra que o anticorpo 13F3.A4 au- mentou a produção de IFN-γ em NKLs em comparação com o isótipo.
A Figura 39 mostra os resultados de um estudo de titulação de dose em que 10 mg/kg, 3 mg/kg e 1 mg/kg de um anticorpo anti- mNKG2A (NKG2A.3) foram administrados como monoterapia, e inibi- ram o crescimento tumoral em um modelo de tumor de carcinoma de cólon com uma redução de 48%, 56% e 30% no volume tumoral médio, respectivamente.
Nenhuma eficácia foi observada para a dose de 0,3 mg/kg.
As Figuras 40A-E mostram os resultados de estudos in vivo, em que anticorpos anti-mNKG2A e anti-mPD-1 reduziram o crescimento tumoral em modelos de camundongo, em que a monoterapia com anti- corpo anti-mNKG2A mostrou atividade de agente único no modelo de camundongo de tumor colorretal CT26. As Figuras 40A-D mostram o volume do tumor em vários pontos de tempo após a implantação do tu- mor em camundongos (n=10/grupo) tratados com isótipo (Figura 40A), anticorpo anti-mNKG2A sozinho (Figura 40B), anticorpo anti-mPD-1 so- zinho (Figura 40C), ou uma combinação de anticorpos anti-mNKG2A e anti-mPD1 (Figura 40D). A Figura 40E mostra o volume médio de tumor em função do tempo (dias após a implantação do tumor) em camundon- gos tratados com isótipo, anticorpo anti-mNKG2A sozinho, anticorpo anti-mPD-1 sozinho, ou uma combinação de anticorpos anti-mNKG2A e anti-mPD-1. As Figuras 41A-C são gráficos que mostram os resultados de estudos in vivo em que anticorpos anti-NKG2A e anti-PD-1 aumen- taram NK (Figura 41A) e citotoxicidade de células T CD8+ específicas de tumor e IFN-γ em um modelo de carcinoma de cólon de murino (Fi- guras 41B-C). As Figuras 42A-E mostram a atividade antitumoral de anti- corpos anti-mNKG2A e anti-mCTLA-4, isoladamente ou em combina- ção, no modelo de sarcoma de camundongo 1956. As Figuras 42A-D mostram o volume do tumor em vários pontos de tempo após a implan- tação do tumor em camundongos tratados com isótipo (Figura 42A), an- ticorpo anti-mCTLA-4 (Figura 42B, CTLA-4 IgG2a, 0,1 mg/kg), anticorpo anti-mNKG2A (Figura 42C, 10 mg/kg), ou uma combinação de anti- mNKG2A e anti-mCTLA-4 (Figura 42D). A Figura 42E mostra o volume médio do tumor em função do tempo (dias após a implantação do tumor) em camundongos tratados com isótipo, anti-mCTLA-4 sozinho, anti- mNKG2A sozinho, ou combinação de anti-mNKG2A e anti-mCTLA-4. A Figura 43 mostra atividade antitumoral de anticorpos anti-
NKG2A, anti-PD-1 e anti-LAG3 e combinações dos mesmos em um mo- delo de linfoma de murino.
A administração de anticorpo anti-NKG2A sozinho teve um benefício de sobrevivência, com uma taxa de sobrevi- vência de 10%. Terapia de combinação de anticorpo anti-NKG2A com anticorpos anti-mPD-1 ou anti-mLAG-3 estendeu a taxa de sobrevivên- cia para 50% e 70%, respectivamente.
A combinação tripla de anticor- pos anti-mNKG2A, anti-mPD-1 e anti-mLAG-3 proporcionou o maior be- nefício com uma taxa de sobrevivência de 80%. A Figura 44 mostra que, após o tratamento com anticorpo anti-mNKG2A em um modelo de carcinoma de cólon CT26 de murino, o nível de expressão de NKG2A foi reduzido em células NK de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) e esplênicas em comparação com o isótipo.
A Figura 45 mostra os resultados da expressão de NKG2A avaliados por imuno-histoquímica em diferentes tipos de tumor.
A Figura 46 mostra o perfil de ligação do anticorpo NKG2A.6 conjugado com FITC em tumores múltiplos.
A Figura 47 mostra os resultados da expressão de HLA-E em 7 diferentes tipos de tumor avaliados por imuno-histoquímica.
A Figura 48 mostra imagens representativas da expressão de HLA-E em diferentes tipos de tumor avaliados por imuno-histoquí- mica.
As Figuras 49A-B mostram os níveis de níveis de HLA-E so- lúveis em pacientes controle saudáveis e pacientes com câncer.
A Figura 50 mostra o plano de desenvolvimento clínico para anticorpos anti-NKG2A no presente documento discutido, incluindo eta- pas de seleção de pacientes e várias terapias de combinação com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento.
As Figuras 51A-D são gráficos que mostram a afinidade de ligação e cinética do anticorpo NKG2A.9 como determinado por análise Biacore.
As Figuras 52A-B mostram as afinidades de ligação e ciné- tica de NKG2A.9 como medido por análise de Scatchard. A Figura 53 mostra os resultados do ensaio de desgranula- ção de NK em comparação com P1-069366 com NKG2A.9 e isótipo. O anticorpo NKG2A.9 apresentou funcionalidade no ensaio de desgranu- lação de NK, enquanto o anticorpo P1-069366 não. As Figuras 54A-C mostram os resultados de usar uma ferra- menta de ligação de HLA in silico para analisar o anticorpo 13F3.A4 para agrupamentos de ligação indesejáveis. As Figuras 54A-C divulgam as SEQ ID NOS: 197-204, respectivamente, na ordem de aparecimento de cima para baixo. A Figura 55 mostra os resultados de um ensaio de prolifera- ção de células T:DC in vitro demonstrando o baixo risco de imunogeni- cidade de anticorpos anti-NKG2A, especificamente, dos anticorpos NKG2A.6, NKG2A.9 e NKG2A.11. As Figuras 56A-D mostram a afinidade de ligação do anti- corpo NKG2A.9 a heterodímeros NKG2A-CD94 humanos (Figuras 56A- B) e heterodímeros NKG2C-CD94 (Figuras 56C-D) a 37 ºC, como de- terminado por Biacore usando cinética de ciclo único (Figuras 56A e 56C) e cinética de ciclo múltiplo (Figuras 56B e 56D). A resposta SPR é mostrada em função da associação e dissociação de analito. A Figura 57 mostra um boxplot de pontuação de positividade de HLA-E total em 16 diferentes tipos de tumor, como avaliado por imuno-histoquímica. A pontuação de HLA-E total é definida como a por- centagem de positividade de HLA-E citoplasmática e/ou membranar combinada nas células tumorais.
DESCRIÇÃO DETALHADA Em alguns aspectos, a presente invenção fornece anticorpos isolados, tais como anticorpos monoclonais, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados, humanos e quiméricos, que especifica- mente se ligam a NKG2A humana (“hNKG2A”) e têm atividade antago- nística para estimular uma resposta imune antitumor.
Em algumas mo- dalidades, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento com- preendem características estruturais particulares, tais como regiões CDR compreendendo sequências de aminoácido particulares.
Em ou- tras modalidades, os anticorpos anti-NKG2A competem para ligação à proteína NKG2A humana com, ou se ligam ao mesmo epítopo ou similar que, os anticorpos anti-NKG2A da presente invenção.
Em alguns aspectos, a presente invenção fornece métodos de produzir tais anticorpos anti-NKG2A, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo tais anticorpos anti-NKG2A ou fragmen- tos de ligação ao antígeno dos mesmos, e composições farmacêuticas formuladas para conter os anticorpos anti-NKG2A ou fragmentos de li- gação ao antígeno dos mesmos.
Em alguns aspectos, a presente inven- ção fornece métodos de usar os anticorpos anti-NKG2A, isoladamente ou em combinação com outros agentes, por exemplo, outros agentes imuno-oncológicos (por exemplo, anticorpos), quimioterapia, radiotera- pia e/ou cirurgia, para aumentar a resposta imune.
Por conseguinte, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste docu- mento são usados para tratar uma variedade de condições, incluindo, por exemplo, tratar de forma segura e eficaz câncer e/ou infecções.
Um papel importante do sistema imune é sua capacidade de diferenciar entre células normais e células “estranhas”. O sistema imune pode, portanto, atacar as células estranhas e sem atacar as células nor- mais.
Os tumores expressam antígenos que são reconhecidos como es- tranhos pelo hospedeiro.
O sistema imune usa “pontos de verificação”, que são moléculas em certas células imunes que precisam ser ativadas ou inativadas para iniciar uma resposta imune.
As células tumorais às vezes podem usar esses pontos de verificação para evitar serem ataca- das pelo sistema imune.
Algumas fármacos imuno-oncológicos têm como alvo esses pontos de verificação agindo como inibidores de pon- tos de verificação.
A proteína de morte programada 1 (PD-1) é um inibi- dor de ponto de verificação que atua como um freio para evitar que as células T ataquem outras células do corpo.
PD-1 faz isso quando se liga a um ligando de morte programada 1 (PD-L1), uma proteína em algu- mas células normais (e cancerosas). Quando PD-1 se liga a PD-L1, essa interação sinaliza à célula T para não atacar outras células.
Algu- mas células cancerosas têm grandes quantidades de PD-L1, o que as ajuda a escapar do ataque imune.
Agentes terapêuticos, tais como an- ticorpos monoclonais que têm como alvo essa interação de PD-1/PD- L1, tais como nivolumab (Opdivo®), podem bloquear a ligação de PD- 1/PD-L1 para aumentar a resposta imune do corpo contra as células tumorais.
O grupo de receptores inibidores de células exterminadoras naturais 2A (NKG2A) é um membro da família de receptores de lectina NKG2, que também inclui NKG2C, NKG2D e NKG2E. (Iwaszko e Bogu- nia-Kubik, Arch Immunol Ther Exp, 59:353-67 (2011)). NKG2A, NKG2C e NKG2E têm alta homologia em sua sequência de aminoácido dos do- mínios extracelulares, enquanto NKG2D é um tipo de receptor funcio- nalmente distinto.
NKG2A forma um heterodímero com CD94. Dentre os heterodímeros NKG2/CD94, NKG2A/CD94 é o único receptor que tem função inibidora, enquanto NKG2C/CD94 e NKG2E/CD94 são re- ceptores ativadores.
O NKG2D é também um receptor ativador, mas não forma um heterodímero com CD94, nem NKG2D se liga a HLA-E.
Os receptores NKG2/CD94 reconhecem moléculas não clássicas de histocompatibilidade maior (MHC) classe I, que é o Antígeno Leucocitá- rio Humano-E (HLA-E) em seres humanos e Qa-1 em camundongos. (Braud et al, Nature, 391:795-99 (1998), Vance et al., J.
Exp.
Med.
188:1841-48 (1998). NKG2A/CD94 se liga a HLA-E com uma afinidade cerca de seis vezes maior do que NKG2C/CD94. Id. NKG2A é expresso em células T exterminadoras naturais (NK), CD8+ efetoras/memória, NKT, e gama delta (γδ). Expressão de NKG2A é induzida por engaja- mento de receptor de célula T (TCR) e, após estimulação com certas citocinas, incluindo IL-2, IL-10, IL-15, IL-18, IL-21, embora a capacidade de as citocinas induzirem a expressão de NKG2A dependa do engaja- mento de TCR (Cho, Blood, 118:116-28 (2011). NKG2A tem dois moti- vos inibidores baseados em imunorreceptor tirosina (ITIMS) que trans- mitem sinais inibidores intracelulares. (Kabat et al, J. Immunol, 169:1948-58 (2002); Le Dréan El, Eur. J. Immunol 28:264076 (1998). Os anticorpos anti-NKG2A neste documento inibem a proteína NKG2A e, portanto, atuam como inibidores de ponto de verificação.
DEFINIÇÕES Para que a presente descrição possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos primeiro. A menos que defi- nido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção está relacionada. Defi- nições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada. Os títulos fornecidos neste documento não são limitações dos vários aspectos da invenção, que podem ser entendidos por referência ao re- latório descritivo como um todo. Por conseguinte, os termos definidos imediatamente a seguir são definidos de forma mais completa por refe- rência à especificação em sua totalidade. Como no presente documento utilizado, “NKG2A” refere-se à proteína do grupo de receptores inibidores de células exterminadoras naturais 2 que, em seres humanos, é codificada pelo gene NKG2A. NKG2A é também conhecido como, por exemplo, membro A da família similar a antígeno CD159, receptor A de célula NK, receptor NK ativador de NKG2A, receptor NK ativador de NKG2-A/B, receptor C1 tipo lectina de célula exterminadora (CD159a), e proteína de membrana integral tipo II NKG2-A/NKG2-B.
Três isoformas de proteína NKG2A humana que correspon- dem a cinco variantes do transcrito de mRNA foram identificadas.
A isoforma 1 que corresponde à variante 1 (sequência de nu- cleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 209, e sequência de amino- ácido estabelecida na SEQ ID NO: 2) e variante 3 (sequência de nucle- otídeo estabelecida na SEQ ID NO: 212, e sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 182) consiste em 233 aminoácidos e re- presenta a sequência de NGK2A canônica.
A isoforma 1 variante 3 é também uma variante de ocorrência natural que é um Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP) no resíduo 29 em que asparagina (N) é alte- rada para uma serina (S), isto é, N29S (SEQ ID NO: 182). A isoforma 2 que corresponde à variante 2 (sequência de nu- cleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 210, e sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 206) e variante 4 (sequência de nucleotí- deo estabelecida na SEQ ID NO: 211, e sequência de aminoácido esta- belecida na SEQ ID NO: 207) não contém um éxon de codificação em- quadro resultando na ausência de resíduos 96-113 em comparação com a variante 1 e variante 3, respectivamente, e é também referida como NKG2A isoforma NKG2-B.
A variante 4 tem o SNP N29S.
A isoforma 3 que corresponde à variante 5 (sequência de nu- cleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 208, e sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 205) consiste em 228 aminoácidos, e não contém resíduos 229-233 que codificam cinco aminoácidos C-terminais.
Esta variante também tem o SNP N29S.
Abaixo estão as sequências de aminoácido das variantes de NGK2A humanas conhecidas.
(1) Variante 1: NGK2A humana isoforma 1 (sequência de nu- cleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 209 (Acesso Nº.NM
002259.5), e sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 2 (Acesso Nº.NP 002250,2; UniProt ID P26715-1)): MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKNS ILATEQEITY AELN- LQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSAPEK LIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSTLIQR 100 HNNSSLNTRT QKARHCGHCP EEWITYSNSC YYIGKERRTW EESLLACTSK 150 NSSLLSIDNE EEMKFLSIIS PSSWIGVFRN SSHHPWVTMN GLAFKHEIKD 200 SDNAELNCAV LQVN- RLKSAQ CGSSIIYHCK HKL 233 (SEQ ID NO: 2) (2) Variante 2: NGK2A humana isoforma 2 é também referida como NKG2A isoforma NKG2B (sequência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 210 (Acesso Nº. NM 007328.4), e sequência de amino- ácido estabelecida na SEQ ID NO: 206 (Acesso Nº. NP 015567.2; Uni- Prot ID P26715-2)): MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKNS ILATEQEITY AELN- LQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSAPEK LIVGILGIIC LILMAS- VVTI VVIPSRHCGH 100 CPEEWITYSN SCYYIGKERR TWEESLLACT SKNSSLLSID NEEEMKFLSI 150 ISPSSWIGVF RNSSHHPWVT MNGLAFKHEI KDSDNAELNC AVLQVNRLKS 200 AQCGSSIIYH CKHKL 215 (SEQ ID NO: 206) (3) Variante 3: NGK2A humana isoforma 1 com o SNP N29S em negrito e destacado (sequência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 212 (Acesso Nº. NM 213658.2), e sequência de aminoácido es- tabelecida na SEQ ID NO: 182 (Acesso Nº. NP 998823.1 ou AAL65234.1): MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKSS ILATEQEITY AELN- LQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSAPEK LIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSTLIQR 100 HNNSSLNTRT QKARHCGHCP EEWITYSNSC
YYIGKERRTW EESLLACTSK 150 NSSLLSIDNE EEMKFLSIIS PSSWIGVFRN SSHHPWVTMN GLAFKHEIKD 200 SDNAELNCAV LQVN- RLKSAQ CGSSIIYHCK HKL 233 (SEQ ID NO: 182) (4) Variante 4: NKG2A humana isoforma 2 também corres- ponde à variante 4 (sequência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 211 (Acesso Nº.
NM_213657.2), e sequência de aminoácido esta- belecida na SEQ ID NO: 207 (Acesso Nº.
NP 998822.1)): MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKSS ILATEQEITY AELN- LQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSAPEK LIVGILGIIC LILMAS- VVTI VVIPSRHCGH 100 CPEEWITYSN SCYYIGKERR TWEESLLACT SKNSSLLSID NEEEMKFLSI 150 ISPSSWIGVF RNSSHHPWVT MNGLAFKHEI KDSDNAELNC AVLQVNRLKS 200 AQCGSSIIYH CKHKL 215 (SEQ ID NO: 207) (5) Variante 5: NGK2A humana isoforma 3 é também referida como NKG2A isoforma C (sequência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 208 (Acesso Nº.
NM 001304448.1), e sequência de amino- ácido estabelecida na SEQ ID NO: 205 (Acesso Nº.
NM 001291377.1)): MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKSS ILATEQEITY AELN- LQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSAPEK LIVGILGIIC LILMAS- VVTI VVIPSTLIQR 100 HNNSSLNTRT QKARHCGHCP EEWITYSNSC YYIGKERRTW EESLLACTSK 150 NSSLLSIDNE EEMKFLSIIS PSSWIGVFRN SSHHPWVTMN GLAFKHEIKD 200 SDNAELNCAV LQVNRLKSAQ CGSSIIYH 228 (SEQ ID NO: 205) A Tabela abaixo fornece um resumo dos números de acesso de DNA e proteína e SEQ ID NOs correspondentes descritas acima.
Variante NKG2A SEQ ID NO DNA Acesso Nº. (GenBank Proteína correspondente Proteína Acesso Nº. salvo indicação em contrário) SEQ ID NO (GenBank salvo indicação em contrário) 1 1 ou 209 NM 002259.5 2 NP 002250,2; UniProt ID P26715-1
2 210 NM 007328.4 206 NP 015567,2; UnitProt ID P26715-2
3 212 NM 213658.2 182 NP 998823.1; AAL65234.1 4 211 NM 213657.2 207 NP 998822.1
5 208 NM 001304448.1 205 NP 001291377.1
O termo “anticorpo” ou “imunoglobulina”, que é no presente documento utilizado indistintamente, refere-se a uma proteína compre- endendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto.
Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (no presente documento abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada (no pre- sente documento abreviada como CH). Em certos anticorpos, por exem- plo, anticorpos IgG de ocorrência natural, a região constante de cadeia pesada é composta por uma dobradiça e três domínios, CH1, CH2 e CH3. Em certos anticorpos, por exemplo, anticorpos IgG de ocorrência natural, cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (no presente documento abreviada como VL) e uma região cons- tante de cadeia leve.
A região constante de cadeia leve é composta por um domínio (no presente documento abreviado como CL). As regiões de VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabili- dade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denomina- das regiões de quadro (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que inte- rage com um antígeno.
As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efeto- ras) e o primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico.
Uma cadeia pesada pode não ter a lisina C-terminal.
Salvo indicação em contrário neste documento, os aminoácidos nas regiões variáveis são numerados usando o sistema de numeração de Kabat e aqueles nas regiões constantes são numerados usando o sistema EU.
Uma imu- noglobulina pode ser de qualquer dos isótipos conhecidos, incluindo IgA, IgA secretora, IgD, IgE, IgG e IgM.
O isótipo IgG é dividido em sub- classes em certas espécies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 em seres huma- nos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 em camundongos.
Em certas moda- lidades, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento são do subtipo IgG1. As imunoglobulinas, por exemplo, IgG1, existem em vá- rios alótipos, que diferem entre si em no máximo alguns aminoácidos. “Anticorpo” inclui, a título de exemplo, tanto anticorpos de ocorrência natural quanto de ocorrência não natural; anticorpos monoclonais e po- liclonais; anticorpos quiméricos e humanizados; anticorpos humanos e não humanos e anticorpos totalmente sintéticos.
Como no presente documento utilizado, um “anticorpo IgG” tem a estrutura de um anticorpo IgG de ocorrência natural, isto é, tem o mesmo número de cadeias pesadas e leves e ligações dissulfeto que um anticorpo IgG de ocorrência natural da mesma subclasse.
Por exem- plo, um anticorpo anti-NKG2A IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 consiste em duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs), em que as duas cadeias pesadas e cadeias leves são ligadas pelo mesmo número e localização de pontes dissulfeto que ocorrem em anticorpos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de ocorrência natural, respectivamente (a menos que o anticorpo tenha sido mutado para modificar as ligações dissulfeto). Um “antígeno” é uma molécula ou substância que desenca- deia uma resposta imune e à qual um anticorpo se liga.
Anticorpos tipi- camente se ligam especificamente a seu antígeno cognato com alta afi- nidade, refletido por uma constante de dissociação (KD) de 10-5 a 10-11 M ou menos, mas não se liga com alta afinidade a antígenos não rela- cionados.
Qualquer KD maior do que cerca de 10-4 M é geralmente con- siderada como indicando ligação não específica.
Como no presente do-
cumento utilizado, um anticorpo que “se liga especificamente” a um an- tígeno refere-se a um anticorpo que se liga ao antígeno e, em alguns casos, antígenos substancialmente idênticos, com alta afinidade, o que significa ter uma KD de 10-6 M ou menor, KD de 10-7 M ou menor, 10-8 M ou menor, 10-9 M ou menor, ou entre 10-8 M e 10-10 M ou menor, mas não se liga com alta afinidade a antígenos não relacionados.
Um antí- geno é “substancialmente idêntico” a um determinado antígeno caso apresente um alto grau de identidade de sequência para o determinado antígeno, por exemplo, se ele apresentar pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência do determinado antígeno.
A título de exemplo, um an- ticorpo que se liga especificamente a NKG2A humana, em algumas mo- dalidades, também reage de forma cruzada com antígenos NKG2A de determinadas espécies primatas não humanas (por exemplo, NKG2A de macaco cinomolgo), mas não reage de forma cruzada com antígenos NKG2A de outras espécies ou com um antígeno diferente de NKG2A.
Como usado neste documento, o termo “porção de ligação ao antígeno” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo são usados indistintivamente neste documento, e se refere a uma ou mais partes de um anticorpo que mantêm a capacidade de especificamente se ligar a um antígeno (por exemplo, NKG2A humana). Demonstrou-se que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos ou porções de um anticorpo de comprimento total.
Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo “por- ção de ligação ao antígeno” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-NKG2A descrito neste do- cumento, incluem: (1) um fragmento Fab (fragmento de clivagem de papaína) ou um fragmento monovalente similar consistindo nos domínios VL, VH,
LC e CH1; (2) um fragmento F(ab’)2 (fragmento de clivagem de pep- sina) ou um fragmento bivalente similar compreendendo dois fragmen- tos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (3) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (4) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (5) um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al., (1989) Nature 341:544-46), que consiste em um domínio VH; (6) uma região de determinação de complementaridade iso- lada (CDR); e (7) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas, que podem ser opcionalmente unidas por um ligante sintético.
Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitos como uma cadeia de proteína única em que um par de regiões de VL e VH para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única são também engloba- dos no termo “porção de ligação ao antígeno” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo.
Esses fragmentos são obtidos por meio de técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica, e os fragmentos são triados quanto à utilidade da mesma forma que são os anticorpos intactos.
Porções de ligação ao antígeno podem ser produzi- das por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.
Um “anticorpo bifuncional” ou “biespecífico” é um anticorpo híbrido artificial com duas especificidades de ligação diferentes, por exemplo, dois pares de cadeia pesada/leve diferentes, dando origem a dois sítios de ligação ao antígeno com especificidade para diferentes antígenos.
Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma va- riedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de frag- mentos Fab’. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin.
Exp.
Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J.
Immunol. 148, 1547- 1553 (1992). Como no presente documento utilizado, o termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anti- corpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais na população são substancialmente similares e ligam o(s) mesmo(s) epítopo(s) (por exemplo, os anticorpos apresentam uma única especifi- cidade e afinidade de ligação), exceto para possíveis variantes que po- dem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores.
O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como tendo sido obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não re- quer a produção do anticorpo por nenhum método específico.
O termo “anticorpo monoclonal humano” refere-se a um anticorpo de uma popu- lação de anticorpos substancialmente homogêneos que exibe uma única especificidade de ligação e que tem regiões constantes opcionais e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germi- nativa humana.
Em uma modalidade, anticorpos monoclonais humanos são produzidos usando um método de hibridoma.
Usando o método de hibridoma, um animal transgênico não humano, por exemplo, um ca- mundongo transgênico, é exposto a um antígeno, e um glóbulo branco conhecido como célula B produz anticorpos que se ligam ao antígeno, que é colhido do animal transgênico não humano.
As células B isoladas são fundidas com uma célula imortalizada para produzir uma linhagem celular híbrida chamada de hibridoma.
Em uma modalidade, o hibridoma tem um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada hu- mano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.
Como usado neste documento, o termo “anticorpo humano recombinante” inclui todos os anticorpos humanos preparados, expres- sos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (1) anti- corpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina hu- mana ou um hibridoma preparado a partir deles; (2) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma; (3) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpo humano recombinante; e (4) anticorpos pre- parados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências do gene da imunoglobulina humana com outras sequências de DNA.
Esses anticorpos humanos recombi- nantes compreendem regiões variáveis e constantes que usam deter- minadas sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana e são codificados pelos genes da linha germinativa, mas incluem rearran- jos e mutações subsequentes que ocorrem, por exemplo, durante a ma- turação do anticorpo.
Como é conhecido na técnica (vide, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), a região variável con- tém o domínio de ligação ao antígeno, que é codificado por vários genes que se rearranjam para formar um anticorpo específico para um antí- geno estranho.
Além do rearranjo, a região variável pode ser ainda mo- dificada por múltiplas alterações de aminoácido individuais (referidas como mutação ou hipermutação somática) para aumentar a afinidade de anticorpo para o antígeno estranho.
A região constante mudará ainda em resposta a um antígeno (isto é, troca de isótipo). Assim, as molécu- las de ácido nucleico rearranjadas e somaticamente mutadas que codi- ficam os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia leve e cadeia pe-
sada em resposta a um antígeno não podem ter identidade de sequên- cia com as moléculas de ácido nucleico originais, mas em vez disso se- rão substancialmente idênticas ou similares (por exemplo, têm pelo me- nos 80% de identidade). Como usado neste documento, um “anticorpo humano” re- fere-se a um anticorpo com regiões variáveis em que tanto as regiões de quadro quanto as CDR são derivadas de sequências de imunoglo- bulina de linha germinativa humana.
Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de se- quências de imunoglobulina de linha germinativa humana.
Os anticor- pos anti-NKG2A descritos neste documento podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, devido às mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação so- mática in vivo) No entanto, o termo “anticorpo humano” não se destina a incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha ger- minativa de outra espécie de mamífero não humano, tal como um rato, foram enxertadas em sequências de quadro humanas.
Como usado neste documento, os termos anticorpos “humanos” e “totalmente huma- nos” são usados de forma intercambiável.
Um “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo em que alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora dos domínios CDR de um anticorpo não-humano são substituídos por aminoácidos correspon- dentes derivados de anticorpos humanos.
Em uma modalidade de uma forma humanizada de um anticorpo, alguns, a maioria ou todos os ami- noácidos fora dos domínios CDR foram substituídos por aminoácidos de anticorpos humanos, enquanto alguns, a maioria ou todos os amino- ácidos dentro de uma ou mais regiões CDR ficam inalterados.
Pequenas adições, exclusões, inserções, substituições ou modificações de amino- ácidos são permitidas, desde que não impeçam o anticorpo de se ligar a um determinado antígeno.
Um “anticorpo humanizado” mantém uma especificidade antigênica similar à do anticorpo original.
Um “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as regiões cons- tantes são derivadas de outra espécie, tais como um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de camundongo e as regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano.
Como no presente documento utilizado, “isótipo” refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, anticorpo IgG (incluindo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM, IgA (incluindo IgA1 e IgA2), IgD e IgE) que é codifi- cado por genes de região constante de cadeia pesada do anticorpo. “Alótipo” refere-se a variantes de ocorrência natural dentro de um grupo de isótipos específico, onde as variantes diferem em al- guns aminoácidos. (Vide, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Anticorpos anti-NKG2A neste documento podem ser de qualquer aló- tipo.
Como no presente documento utilizado, anticorpos referidos como isótipo “IgG1f,” “IgG1.1f,” ou “IgG1.3f” são anticorpos IgG1, IgG1.1 sem efetor, ou IgG1.3 sem efetor do alótipo “f”, respectivamente.
As frases “um anticorpo reconhecendo um antígeno” e “um anticorpo específico para um antígeno” são usados no presente docu- mento indistintamente com a frase “um anticorpo que se liga especifica- mente a um antígeno”. Como no presente documento utilizado, um “anticorpo iso- lado” refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outras proteínas e materiais celulares.
Como no presente documento utilizado, uma “função efe- tora” refere-se à interação de uma região Fc de anticorpo com um re- ceptor ou ligando Fc, ou um evento bioquímico que dele resulte. “Fun- ções efetoras” exemplificativas incluem ligação C1q, citotoxicidade de-
pendente de complemento (CDC), ligação a receptor Fc, funções efeto- ras mediadas por FcγR, tais como ADCC e fagocitose mediada por cé- lulas dependentes de anticorpo (ADCP), e regulação negativa de um receptor de superfície celular (por exemplo, o receptor de células B; BCR). Essas funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo). Um “receptor Fc” ou “FcR” é um receptor que se liga à região Fc de uma imunoglobulina.
FcRs que se ligam a um anticorpo IgG com- preendem receptores da família FcγR, incluindo variantes alélicas e al- ternativamente formas submetidas a splicing desses receptores.
A fa- mília FcγR consiste em três receptores ativadores (FcγRI, FcγRIII e FcγRIV em camundongos; FcγRIA, FcγRIIA e FcγRIIIA em seres huma- nos) e um inibidor (FcγRIIb, ou equivalentemente FcγRIIB). Várias pro- priedades exemplificativas de FcγRs humanos são conhecidas na téc- nica.
A maioria dos tipos de células efetoras inatas coexpressam um ou mais FcγR de ativação e o FcγRIIb inibidor, enquanto células extermi- nadoras naturais (NK) expressam seletivamente um receptor Fc ativa- dor (FcγRIII em camundongos e FcγRIIIA em seres humanos), mas não o FcγRIIb inibidor em camundongos e seres humanos.
A IgG1 humana se liga à maioria dos receptores Fc humanos e é considerada equiva- lente a IgG2a murina em relação aos tipos de receptores Fc ativadores a que se liga.
Como no presente documento utilizado, uma “região Fc” (re- gião cristalizável de fragmento) ou “domínio Fc” ou “Fc” refere-se à re- gião C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo que medeia uma li- gação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo ligação a receptores Fc localizados em várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico.
Assim, uma região Fc compreende a re- gião constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imuno- globulina de região constante (por exemplo, CH1 ou CL). Nos isotipos de anticorpo IgG, IgA e IgD, a região Fc compreende dois fragmentos de proteína idênticos, derivados do segundo (CH2) e terceiro (CH3) do- mínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo.
Nos isóto- pos de anticorpo IgM e IgE, as regiões Fc compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (domínios CH 2-4) em cada cadeia poli- peptídica.
Para IgG, a região Fc compreende domínios de imunoglobu- lina CH2 e CH3 e a dobradiça entre os domínios CH1 e CH2. Embora a definição dos limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglo- bulina possa variar, como definido neste documento, a região Fc de ca- deia pesada de IgG humana é definida para se estender de um resíduo de aminoácido D221 para IgG1, V222 para IgG2, L221 para IgG3, e P224 para IgG4 ao terminal carbóxi da cadeia pesada, em que a nume- ração é de acordo com o índice EU como em Kabat (Kabat, et al., 1991). O domínio CH2 de uma região Fc de IgG humana se estende do ami- noácido 237 ao aminoácido 340, e o domínio CH3 é posicionado no lado C-terminal de um domínio CH2 em uma região Fc, isto é, estende-se do aminoácido 341 ao aminoácido 447 ou 446 (se o resíduo de lisina C- terminal estiver ausente) ou 445 (se os resíduos de glicina e lisina C- terminais estiverem ausentes) de uma IgG.
Como usado neste docu- mento, a região Fc pode ser um Fc de sequência nativa, incluindo qual- quer variante alotípica, ou uma variante Fc (por exemplo, Fc de ocor- rência não natural). Fc pode também se referir a essa região isolada- mente ou no contexto de um polipeptídeo de proteína compreendendo Fc, tal como uma “proteína de ligação compreendendo uma região Fc”, também referida como uma “proteína de fusão Fc” (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesina). Uma “região Fc de sequência nativa” ou “Fc de sequência nativa” tem uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza.
As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fch de IgG1 humana de sequência nativa; região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; região Fc de IgG4 hu- mana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas.
O Fc de sequência nativa inclui os vários alótipos de Fc. (Vide, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). O termo “epítopo” ou “determinante antigênico” refere-se a um sítio em um antígeno (por exemplo, proteína hNKG2A) ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo especificamente se liga, por exemplo, como definido pelo método específico usado para identificá-la.
Os epí- topos podem ser formados tanto a partir de (1) aminoácidos contíguos (geralmente um epítopo linear) ou (2) aminoácidos não contíguos justa- postos por dobramento terciário da proteína (geralmente um epítopo conformacional). Os epítopos formados por aminoácidos contíguos são tipicamente, mas nem sempre, retidos na exposição a solventes desna- turantes, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes.
Um epítopo normalmente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 aminoácidos em uma única confor- mação espacial.
O termo “mapeamento de epítopo” refere-se ao processo de identificação dos determinantes moleculares para o reconhecimento de anticorpo-antígeno.
Métodos para determinar quais epítopos são liga- dos por um determinado anticorpo (isto é, mapeamento de epítopos) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, immunoblotting e ensaios de imunoprecipitação, em que peptídeos sobrepostos ou con- tíguos da proteína (por exemplo, de NKG2A) são testados quanto à re- atividade com um determinado anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-
NKG2A). Métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem técnicas conhecidas na técnica e aquelas descritas neste docu- mento, por exemplo, cristalografia de raios-X; análise mutacional de an- tígeno, ressonância magnética nuclear bidimensional; exibição de leve- dura; e espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério (HDX- MS) (vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Mole- cular Biology, Vol. 66, G.
E.
Morris, Ed. (1996)). O termo “liga-se ao mesmo epítopo” com referência a dois ou mais anticorpos significa que os anticorpos se ligam ao mesmo seg- mento de resíduos de aminoácido, como determinado por um dado mé- todo.
As técnicas para determinar se os anticorpos se ligam ao “mesmo epítopo em NKG2A” com os anticorpos descritos neste documento in- cluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítopos, tais como análises por raio-x de cristais de complexos de antígeno:anticorpo, que fornecem a resolução atômica do epítopo, HDX-MS, e oxidação fotoquí- mica rápida de proteínas (FPOP). Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fragmentos de antígeno (por exemplo, fragmentos prote- olíticos) ou a variações mutadas do antígeno, em que a perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da se- quência de antígeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epítopo, tal como mutagênese de varredura de ala- nina (Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081) ou exibição de le- vedura de variantes de sequência alvo mutantes.
Além disso, métodos computacionais combinatórios para mapeamento de epítopo também podem ser usados.
Esses métodos baseiam-se na capacidade do anti- corpo de interesse isolar por afinidade peptídeos curtos específicos de bibliotecas combinatórias de peptídeos de exibição de fago.
Prevê-se que os anticorpos com a mesma VH e VL ou as mesmas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 se liguem ao mesmo epítopo.
Anticorpos que “competem com outro anticorpo para ligação a um alvo” referem-se a anticorpos que inibem (parcialmente ou com- pletamente) a ligação do outro anticorpo ao alvo.
Se dois anticorpos competirem entre si para ligação a um alvo, isto é, se e em que medida um anticorpo inibir a ligação do outro anticorpo a um alvo, pode ser de- terminado usando experimentos de competição de ligação conhecidos, por exemplo, análise por ressonância de plasmons de superfície (SPR) Biacore®. Em certas modalidades, um anticorpo compete com, e inibe a ligação de outro anticorpo a, um alvo em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. O nível de inibição ou competição pode ser dife- rente dependendo de qual anticorpo é o “anticorpo de bloqueio” (isto é, o anticorpo frio que é incubado primeiramente com o alvo). Os ensaios de competição podem ser conduzidos como descrito, por exemplo, em Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harb.
Protoc. 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 ou no Capítulo 11 de “Using Antibodies” de Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA 1999. Dois anticorpos “competem de forma cru- zada” se os anticorpos bloquearem um ao outro em pelo menos 50%, isto é, independentemente de um ou o outro anticorpo ter sido contac- tado primeiro com o antígeno no experimento de competição.
Os ensaios de ligação competitiva para determinar se dois anticorpos competem ou competem de forma cruzada para ligação in- cluem competição para ligação a células T que expressam NKG2A, por exemplo, por citometria de fluxo.
Outros métodos incluem: SPR (por exemplo, Biacore®); radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA); imunoensaio enzimático direto ou indireto de fase sólida (EIA); ensaio de competição de sanduíche (vide Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (vide Kirkland et al., J.
Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio rotulado di- reto de fase sólida; ensaio de sanduíche rotulado direto de fase sólida
(vide Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Har- bor Press (1988)); RIA rotulado direto de fase sólida usando rótulo 1- 125 (vide Morel et al., Mol.
Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotina- avidina direta de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA rotulado direto. (Moldenhauer et al., Scand.
J.
Immunol. 32:77 (1990)). Como usado neste documento, os termos “ligação especí- fica”, “ligação seletiva”, “seletivamente liga” e “especificamente liga” se referem a ligação de anticorpo a um epítopo em um antígeno predeter- minado.
Em algumas modalidades, o anticorpo: (1) liga-se com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de aproximadamente menos do que 10-6 M, tal como aproximadamente menos do que 10-7 M, 10 -8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor quando determinado por exemplo, por tecnologia SPR em um instrumento SPR Biacore® usando o antí- geno predeterminado, por exemplo, NKG2A humana recombinante como o analito e o anticorpo como o ligando, ou análise de Scatchard de ligação do anticorpo a células positivas de antígeno; e (2) liga-se ao antígeno predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não es- pecífico (por exemplo, BSA, caseína) que não o antígeno predetermi- nado ou um antígeno intimamente relacionado.
Por conseguinte, um an- ticorpo que “especificamente se liga à NKG2A humana” se refere a um anticorpo que se liga a NKG2A humana solúvel ou ligada à célula com uma KD de 10-6 M ou menos, tal como aproximadamente menos do que 10-7 M, 10 -8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor.
Um anticorpo que “reage de forma cruzada com NKG2A de cinomolgo” se refere a um an- ticorpo que se liga à NKG2A de cinomolgo com uma KD de 10-6 M ou menos, tal como aproximadamente menos do que 10-7, 10 -8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor.
Os termos “ka”, “kassoc”, ou “kon” são usados indistintivamente neste documento para se referir à constante de taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular.
Os termos “kd,” “kdis” ou “koff” são usados indistintivamente neste documento para se referir à constante de taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.
O termo “KD”, como usado neste documento, se refere à cons- tante de dissociação de equilíbrio, que é obtida da razão de kd a ka (isto é, kd/ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD para os anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica.
Os métodos disponíveis para a determinação de KD de um anticorpo incluem, mas sem limitação, ressonância de plas- mons de superfície (SPR) usando, por exemplo, um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore®, citometria de fluxo e análise de Scatchard.
O termo “IC50” significa metade da concentração inibidora máxima, e mede a potência de uma substância, por exemplo, um anti- corpo, para inibir uma resposta biológica ou bioquímica específica.
Em outras palavras, IC50 é usado como medida de potência; quanto menor o IC50, mais potente é a substância.
No contexto de um ensaio in vitro ou in vivo usando um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, IC50 se refere à concentração do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reduz a resposta biológica ou bio- química máxima em 50%. O termo “EC50” significa metade da concentração efetiva má- xima, e mede a potência de uma substância, por exemplo, um anticorpo, para induzir uma resposta biológica ou bioquímica específica.
Como com IC50, o EC50 é usado como medida de potência; quanto menor o EC50, mais potente é a substância.
No contexto de um ensaio in vitro ou in vivo usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o EC50 se refere à concentração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que induz uma resposta que é 50% da resposta biológica ou bioquímica máxima. “Ocupação de receptor” ou “ocupação de receptor”, como usado neste documento, se refere à quantidade de anticorpo (por exem- plo, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento) que é ligado ao receptor imunoestimulador (por exemplo, NKG2A humana). “Porcen- tagem (%) de ocupação de receptor” ou “porcentagem (%) de ocupação de receptor” pode ser calculada usando a seguinte fórmula: ([ΔMFI de Teste]/[ΔMFI de Total]) x 100. Alteração na unidade de fluorescência média (ΔMFI) é calculada subtraindo a MFI de coloração de fundo com um anticorpo de controle de isótipo da MFI do anticorpo ligado.
O nível total do receptor é determinado pela adição de uma quantidade satu- rante de anticorpo para determinar a expressão máxima e, portanto, a MFI do receptor imunoestimulador particular.
Um meio alternativo para calcular a expressão total do receptor é usar um anticorpo contra o mesmo receptor imunoestimulador que não compete com o anticorpo para o qual a ocupação de receptor está sendo calculada.
Como usado neste documento, o termo “de ocorrência natu- ral” aplicado a uma substância é uma substância que está presente na natureza que não foi intencionalmente modificada por pessoas.
Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeo que está pre- sente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado por pes- soas no laboratório é de ocorrência natural.
Um “polipeptídeo” se refere a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivamente ligados, sem limite superior no comprimento da cadeia.
Um ou mais resíduos de aminoácido na proteína podem conter uma modificação, tal como, mas sem limitação, glicosilação, fosforilação ou uma ligação dissulfeto.
Uma “proteína” compreende um ou mais polipeptídeos.
O termo “molécula de ácido nucleico”, como usado neste do- cumento, destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA.
Uma molécula de ácido nucleico é de filamento simples ou de filamento duplo, podendo ser DNA complementar (cDNA). O termo “cDNA” ou “DNA complementar” se refere a uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural que foi criada ou derivada de mRNA, isto é, as regiões de não codificação foram removi- das.
Como usado neste documento, o termo “modificações de se- quência conservadoras” se refere a modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido.
Essas modificações conservadoras incluem substituições, adições e deleções de aminoá- cido.
As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da in- venção por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagê- nese dirigida a sítio e mutagênese mediada por reação em cadeia de polimerase (PCR). “Substituições conservadoras de aminoácido” se re- ferem a substituições de um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.
As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica.
Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exem- plo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não car- regadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), ca- deias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, iso- leucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilala- nina, triptofano, histidina). Em certas modalidades, um resíduo de ami-
noácido não essencial previsto em um anticorpo anti-NKG2A é substi- tuído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia la- teral.
Os métodos de identificação de substituições conservadoras de nucleotídeo e aminoácido que não eliminam a ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Brummell et al., Bio- chem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al.
Protein Eng. 12(10):879- 884 (1999); e Burks et al.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 94:412-417 (1997)). Para ácidos nucleicos, o termo “homologia substancial” in- dica que dois ácidos nucleicos, ou sequências designadas dos mesmos, quando otimamente alinhadas e comparadas, são idênticos, com inser- ções ou deleções de nucleotídeos apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, pelo menos cerca de 90% a 95%, ou pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos.
Alternativamente, existe homologia substancial quando os segmentos hibridizarem sob condições de hibridização seletiva para o complemento do filamento de ácido nucleico.
Para polipeptídeos, o termo “homologia substancial” indica que dois polipeptídeos, ou sequências designadas dos mesmos, quando otimamente alinhadas e comparadas, são idênticos, com inser- ções ou deleções de aminoácido apropriadas, pelo menos cerca de 80% dos aminoácidos, pelo menos cerca de 90% a 95%, ou pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos aminoácidos.
A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, homologia percentual = (número de posições idênticas)/(número total de posições) x 100), levando em conta o número de lacunas e o com- primento de cada lacuna que precisa ser introduzida para o alinhamento ótimo das duas sequências.
A comparação de sequências e a determi- nação da identidade percentual entre duas sequências podem ser rea-
lizadas utilizando um algoritmo matemático, como descrito nos exem- plos não limitantes abaixo. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotí- deo pode ser determinada, por exemplo, usando o programa GAP no pacote de software GCG, usando uma matriz nwsgapdna.cmp e o peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre duas sequências de nucleo- tídeo ou aminoácido também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989 )), que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algo- ritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG, usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. As sequências de ácido nucleico e proteína aprovadas neste documento ainda podem ser utilizadas como uma “sequência de con- sulta” para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Essas pesquisas po- dem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão
2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obtenção de se- quências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas neste documento. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obtenção de sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína descritas neste documento.
Para obter alinha- mentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser usado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. (Vide, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI), disponível em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células intei- ras, por exemplo, uma célula hospedeira, em um lisado celular ou forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
Um ácido nucleico é “isolado” ou “tornado substancialmente puro” quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exem- plo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, as outras partes do cromossomo) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, banda CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. (Vide F.
Ausubel, et al., ed.
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova York (1987)). O termo “vetor”, como usado neste documento, pretende se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela tenha sido ligada.
Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circu- lar em, que segmentos de DNA adicionais, podem ser ligados.
Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral.
Certos vetores são capazes de re- plicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introdu- zidos (por exemplo, vetores bacterianos com origem bacteriana de re- plicação e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira ao serem introduzidos na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma do hos- pedeiro.
Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expres- são de genes aos quais são operativamente ligados.
Esses vetores são referidos neste documento como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante incluem plasmídeos.
Como usado neste documento, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados indistintiva- mente, visto que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada.
No entanto, também estão incluídas são outras formas de veto- res de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de- feituosos de replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que têm funções equivalentes.
O termo “célula hospedeira” ou “célula hospedeira recombi- nante”, que são usados indistintivamente, se refere a uma célula que compreende um ácido nucleico que não está naturalmente presente na célula, e pode ser uma célula em que um vetor de expressão recombi- nante tenha sido introduzido.
Deve ser entendido que tais termos se re- ferem não apenas à célula em questão em particular, mas à progênie de tal célula.
Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula de origem, mas ainda está inclu- ída no escopo do termo “célula hospedeira” como usado neste docu- mento.
Uma “resposta imune” é como entendida na técnica, e geral- mente se refere a uma resposta biológica em um vertebrado contra agentes estranhos ou anormais, por exemplo, células cancerosas, em que a resposta protege o vertebrado contra esses agentes e doenças causadas por eles.
Uma resposta imune é mediada pela ação de uma ou mais células do sistema imune (por exemplo, um linfócito T, linfócito
B, célula exterminadora natural (NK), macrófago, eosinófilo, mastócito, célula dendrítica ou neutrófilo) e macromoléculas solúveis produzidas por qualquer uma dessas células ou o fígado (incluindo anticorpos, cito- cinas e complemento) que resulta em direcionamento seletivo, ligação a, dano a, destruição de e/ou eliminação do corpo do vertebrado de pa- tógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, célu- las cancerosas ou outras células anormais, ou, em casos de autoimuni- dade ou inflamação patológica, células ou tecidos normais, incluindo, por exemplo, células ou tecidos humanos.
Uma reação imune inclui, por exemplo, ativação ou inibição de uma célula T, por exemplo, uma célula T efetora ou uma célula T auxiliar (Th), tal como uma célula T CD4+ ou CD8+, ou a inibição ou depleção de uma célula Treg.
Células “T Efetoras” (“Teff”) são células T (por exemplo, cé- lulas T CD4+ e CD8+) com atividades citolíticas e células T auxiliares (Th). As células Th secretam citocinas e ativam e direcionam outras cé- lulas imunes, mas não incluem células T reguladoras (células Treg). As células T reguladoras (“Treg”) são uma subpopulação de células T que modulam o sistema imune, mantêm a tolerância a auto- antígenos e previnem doenças autoimunes.
As células B de memória são um subtipo de células B que são formadas nos centros germinativos após a infecção primária e são importantes na geração de uma resposta imune mediada por anticorpos acelerada e mais robusta no caso de reinfecção (também conhecida como uma resposta imune secundária). Células “exterminadoras naturais” (NK) são importantes me- diadores da resposta imune contra patógenos e tumores, e fazem parte do sistema imune inato.
As células NK também têm um papel na regu- lação da resposta imune adaptativa, e demonstraram em diferentes con- textos estimular ou inibir as respostas de células T.
As células NK for- necem respostas rápidas a células infectadas por vírus e respondem à formação de tumores.
Como usado neste documento, o termo “resposta mediada por células T” se refere a uma resposta mediada por células T, por exemplo, células T efetoras (por exemplo, células CD8+) e células T auxiliares (por exemplo, células CD4+). As respostas mediadas por cé- lulas T incluem, por exemplo, citotoxicidade e proliferação de células T.
Como usado neste documento, o termo “resposta de linfóci- tos T citotóxicos (CTL)” se refere a uma resposta imune induzida por células T citotóxicas.
As respostas de CTL são mediadas, por exemplo, por células T CD8+. Um “imunomodulador” ou “imunorregulador” se refere a um agente, por exemplo, um componente de uma via de sinalização que pode estar envolvido na modulação, regulação ou modificação de uma resposta imune. “Modular”, “regular” ou “modificar” uma resposta imune se refere a qualquer alteração em uma célula do sistema imune ou na atividade dessa célula (por exemplo, uma célula T efetora, tal como uma célula Th1). Tal modulação inclui a estimulação ou supressão do sis- tema imune, que pode se manifestar pelo aumento ou diminuição do número de vários tipos de células, aumento ou diminuição da atividade dessas células, e/ou quaisquer outras alterações que possam ocorrer dentro do sistema imune.
Tanto os imunomoduladores inibidores quanto os estimuladores foram identificados, alguns dos quais podem aumentar sua função em um microambiente tumoral.
Em algumas modalidades, o imunomodulador está localizado na superfície de uma célula T.
Um “alvo imunomodulador” ou “alvo imunorregulador” é um imunomodulador que é direcionado para ligação por, e cuja atividade é alterada pela ligação de, uma substância, agente, porção, composto ou molécula.
Os alvos imunomoduladores incluem, por exemplo, receptores na superfície de uma célula (“receptores imunomoduladores”) e ligandos de receptores (“ligandos imunomoduladores”). “Imunoterapia” se refere ao tratamento de um indivíduo, tal como um indivíduo humano, afligido por ou em risco de contrair ou sofrer uma recorrência de uma doença por um método compreendendo indu- zir, melhorar, suprimir ou de outra forma modificar uma resposta imune. “Terapia imunoestimulante” ou “terapia imunoestimuladora” se refere a uma terapia que resulta no aumento (indução ou melhoria) de uma resposta imune em um indivíduo para, por exemplo, tratar o câncer. “Potencializar uma resposta imune endógena” significa au- mentar a eficácia ou potência de uma resposta imune existente em um indivíduo, tal como um indivíduo humano.
Esse aumento de eficácia e potência pode ser alcançado, por exemplo, por mecanismos de supera- ção que suprimem a resposta imune do hospedeiro endógeno ou por mecanismos de estimulação que aumentam a resposta imune do hos- pedeiro endógeno.
Como usado neste documento, o termo “ligado” se refere à associação de duas ou mais moléculas.
A ligação pode ser covalente ou não covalente.
A ligação também pode ser genética (isto é, fusão recombinante). Essas ligações podem ser alcançadas usando uma am- pla variedade de técnicas reconhecidas na técnica, tais como conjuga- ção química e produção de proteína recombinante.
Como usado neste documento, “administrar” se refere à in- trodução física de uma composição compreendendo um agente tera- pêutico, por exemplo, um anticorpo anti-NKG2A, a um indivíduo, usando qualquer um dos vários métodos e sistemas de entrega conhecidos por aqueles versado na técnica. “Administrar” inclui, por exemplo, a admi- nistração a um paciente humano por outro, tal como, por exemplo, um ou mais profissionais de saúde, e a autoadministração pelo paciente hu- mano.
Várias vias de administração para anticorpos descritas este do- cumento incluem intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutâ- nea, espinhal ou outras vias de administração parenteral, por exemplo,
por injeção ou infusão.
A frase “administração parenteral”, como usada neste documento, significa modos de administração outros do que não administração enteral e tópica, tais como por injeção, e inclui, sem limi- tação, injeção e infusão intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, in- tra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intra-or- bital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticu- lar, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal, bem como eletroporação in vivo.
Alternativamente, um an- ticorpo descrito neste documento pode ser administrado por via não pa- renteral, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mu- cosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
A administração também pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes e/ou durante um ou mais períodos prolonga- dos.
Como usado neste documento, administração “adjuvante” ou “combinada” (coadministração) inclui a administração simultânea dos compostos na mesma ou em diferente forma de dosagem, ou adminis- tração separada dos compostos (por exemplo, administração sequen- cial). Dessa forma, um primeiro anticorpo, por exemplo, o anticorpo anti- NKG2A, e um segundo, terceiro ou mais anticorpos podem ser adminis- trados simultaneamente em uma única formulação.
Alternativamente, o primeiro e o segundo (ou mais) anticorpos podem ser formulados para administração separada e são administrados concomitantemente ou se- quencialmente.
Terapia de “combinação”, como usado neste docu- mento, significa a administração de dois ou mais agentes terapêuticos de forma coordenada, e inclui, mas sem limitação, dosagem simultânea.
Especificamente, a terapia de combinação abrange tanto a coadminis- tração (por exemplo, administração de uma coformulação ou adminis- tração simultânea de composições terapêuticas separadas) quanto a administração serial ou sequencial, desde que a administração de um agente terapêutico seja condicionada de alguma forma à administração de outro agente terapêutico.
Por exemplo, um agente terapêutico pode ser administrado apenas após um agente terapêutico diferente ter sido administrado e deixado agir por um período de tempo prescrito. (Vide, por exemplo, Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423). Por exemplo, o anticorpo anti-NKG2A pode ser administrado primeiramente após (por exemplo, imediatamente seguido por) a admi- nistração de um segundo anticorpo, ou vice-versa.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-NKG2A é administrado antes da administração do se- gundo anticorpo.
Em outra modalidade, o anticorpo anti-NKG2A é admi- nistrado, por exemplo, dentro de cerca de 30 minutos do segundo anti- corpo.
Tal administração concomitante ou sequencial resulta preferen- cialmente em ambos os anticorpos estarem simultaneamente presentes nos pacientes tratados.
Como usado neste documento, os termos “inibe” ou “blo- queia” são usados indistintivamente e abrangem inibição/bloqueio par- cial e completo.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NKG2A des- crito neste documento inibe a ligação de NKG2A a HLA-E em pelo me- nos cerca de 50%, por exemplo, cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%, determinado, por exemplo, como adicionalmente des- crito neste documento.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti- NKG2A inibe a ligação de NKG2A a HLA-E em não mais do que 50%, por exemplo, em cerca de 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1%, determi- nado, por exemplo, como adicionalmente descrito neste documento.
Como usado neste documento, “câncer” refere-se a um am- plo grupo de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais no corpo.
O crescimento ou divisão celular desre- gulado pode resultar na formação de tumores malignos ou células que invadem tecidos vizinhos e podem metastatizar para partes distantes do corpo através do sistema linfático ou corrente sanguínea.
Os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento”, como usado neste documento, se referem a qualquer tipo de intervenção ou pro- cesso realizado em, ou administrando um agente ativo a, o indivíduo com o objetivo de reverter, aliviar, melhorar, inibir ou desacelerar ou pre- venir a progressão, desenvolvimento, gravidade ou recorrência de um sintoma, complicação, condição ou indícios bioquímicos associados a uma doença.
Em contrapartida, “profilaxia” ou “prevenção” se refere à administração a um indivíduo que não tem uma doença para prevenir a ocorrência da doença.
Como usado neste documento, “tratar”, “tra- tando” e “tratamento” não incluem profilaxia ou prevenção.
O termo “dose eficaz” ou “dosagem eficaz” é definido como uma quantidade suficiente para atingir ou pelo menos atingir parcial- mente um efeito desejado.
Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “dosagem terapeuticamente eficaz” de umo fármaco ou agente tera- pêutico é qualquer quantidade do fármaco que, quando usada sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, promove a regressão da doença evidenciada por uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou uma prevenção da deficiência ou incapacidade devido ao acometimento da doença.
Uma “quantidade profilaticamente eficaz” ou uma “dosagem profilaticamente eficaz” de um fármaco é uma quantidade do fármaco que, quando administrada sozinha ou em com- binação com outro agente terapêutico a um indivíduo em risco de de- senvolver uma doença ou de sofrer uma recorrência da doença, previne o desenvolvimento ou recorrência da doença.
A capacidade de um agente terapêutico promover a regressão da doença ou de um agente profilático prevenir o desenvolvimento ou recorrência da doença pode ser avaliada usando uma variedade de métodos conhecidos pelo profis- sional habilitado, tal como em seres humanos durante ensaios clínicos,
em sistemas de modelo animal preditivos da eficácia em seres huma- nos, ou pela avaliação da atividade do agente em ensaios in vitro.
A administração de quantidades eficazes do anticorpo anti- NKG2A sozinho, ou anticorpo anti-NKG2A combinado com, por exem- plo, um anticorpo anti-PD-1, combinado com um anticorpo anti-PD-L1, ou combinado com um anticorpo anti-CTLA-4, de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, pode resultar em pelo menos um efeito terapêutico, incluindo, por exemplo, redução do cres- cimento ou tamanho do tumor, redução do número de lesões metastáti- cas que aparecem ao longo do tempo, remissão completa, remissão parcial ou doença estável.
Por exemplo, os métodos de tratamento pro- duzem uma taxa de benefício clínico comparável (CBR = remissão com- pleta (CR) + remissão parcial (PR) + doença estável (SD) com duração ≥ 6 meses) melhor do que o obtido sem administração do anticorpo anti- NKG2A, ou do que com a administração de qualquer um dos anticorpos combinados isoladamente, por exemplo, a melhora da taxa de benefício clínico é cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais.
A título de exemplo, um agente anticâncer é um fármaco que retarda a progressão do câncer ou promove a regressão do câncer em um indivíduo, incluindo um indivíduo humano.
Em algumas modalida- des, uma quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco promove a re- gressão do câncer a ponto de eliminá-lo. “Promover a regressão do cân- cer” significa que administrar uma quantidade eficaz do fármaco, sozi- nha ou em combinação com um agente antineoplásico, resulta em uma redução no crescimento ou tamanho do tumor, necrose do tumor, uma diminuição na gravidade de pelo menos uma sintoma da doença, um aumento da frequência e duração de períodos sem sintomas da doença, uma prevenção da deficiência ou incapacidade decorrente do acometi- mento da doença ou, de outra forma, melhora dos sintomas da doença no paciente. “Efetividade farmacológica”, “efetividade” ou “eficácia” re- ferem-se à capacidade do fármaco promover a regressão do câncer no paciente. “Segurança fisiológica” se refere a um nível aceitavelmente baixo de toxicidade ou outros efeitos fisiológicos adversos ao nível ce- lular, de órgão e/ou organismo (efeitos adversos) resultantes da admi- nistração do fármaco.
A título de exemplo, para o tratamento de tumores, uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz do fármaco inibe o crescimento de células tumorais em pelo menos cerca de 20%, em pelo menos cerca de 30%, em pelo menos cerca de 40%, em pelo menos cerca de 50%, em pelo menos cerca de 60%, em pelo menos cerca de 70%, em pelo menos cerca de 80% em relação a indivíduos não trata- dos, ou em pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz do fármaco inibe com- pletamente o crescimento celular ou crescimento tumoral, ou seja, inibe o crescimento celular ou crescimento tumoral em 100%. A capacidade de um composto, incluindo um anticorpo, de inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada usando os ensaios descritos neste documento.
Alter- nativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto para inibir o crescimento celu- lar; tal inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos pelos versados na técnica.
Em algumas modalidades, a inibição do cresci- mento do tumor pode não ser imediata após o tratamento, podendo ocorrer apenas após um período de tempo ou após administração repe- tida.
Em outras modalidades descritas neste documento, a regressão do tumor é observada e continua por pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 40 dias, pelo menos cerca de 50 dias ou pelo menos cerca de 60 dias, ou mais.
Como usado neste documento, os termos “dose fixa”, “dose plana” e “dose plana-fixa” são usados indistintivamente e se referem a uma dose que é administrada a um paciente sem levar em consideração o peso ou a superfície corporal do paciente.
A dose fixa ou plana não é, portanto, fornecida como uma dose em mg/kg, mas sim como uma quantidade absoluta do agente terapêutico.
Como usado neste documento, o termo dose ou dosagem “baseada em peso” significa que uma dose administrada a um paciente é calculada com base no peso do paciente.
Por exemplo, quando um paciente de 60 kg necessita de 3 mg/kg de um anticorpo anti-NKG2A, pode-se calcular e usar a quantidade adequada do anticorpo anti- NKG2A (isto é, 180 mg) para administração.
O termo “paciente” inclui seres humanos e outros mamíferos que recebem tratamento terapêutico ou profilático.
O termo “indivíduo” inclui qualquer animal humano ou não humano.
Por exemplo, os métodos e composições descritos neste do- cumento podem ser usados para tratar um indivíduo com câncer.
Um animal não humano inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamífe- ros e não mamíferos, incluindo primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis etc.
Em uma modalidade, o indivíduo é um indivíduo humano.
Como usado neste documento, o termo “um/uma” entidade se refere a uma ou mais daquela entidade, salvo indicação em contrário; por exemplo, entende-se que “uma sequência de nucleotídeo” repre- senta uma ou mais sequências de nucleotídeo.
Dessa forma, os termos uma”, “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados indistintiva- mente neste documento.
Como usado neste documento, “e/ou” deve ser tomado como invenção específica de cada um dos dois recursos ou componentes es- pecificados com ou sem o outro.
Dessa forma, o termo “e/ou”, como usado em uma frase, tal como “A e/ou B” inclui “A e B”, “A ou B”, “A” sozinho, e “B” sozinho.
Da mesma forma, o termo “e/ou”, como usado em uma frase, tal como “A, B e/ou C” abrange cada um dos seguintes: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A sozinho; B sozinho; e C sozinho.
Entende-se que, sempre que aspectos forem introduzidos neste documento com a linguagem “compreendendo”, de outra forma aspectos análogos descritos em termos de “consistindo em” e/ou “con- sistindo essencialmente em” são também fornecidos.
Unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita do Système International de Unites (SI), salvo indicação em con- trário.
Os intervalos numéricos incluem os números que definem o inter- valo.
Salvo indicação em contrário, as sequências de nucleotídeo são escritas da esquerda para a direita na orientação 5’ para 3’. Sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi.
Como usado neste documento, o termo “cerca de” ou “apro- ximadamente” significa perto, em torno de ou na região de.
Quando o termo “cerca de” é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valo- res numéricos estabelecidos.
Em geral, o termo “cerca de” pode modifi- car um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma vari- ância de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor). Os títulos fornecidos neste documento não são limitações dos vários aspectos da invenção, e devem ser lidos por referência à especificação como um todo.
Por conseguinte, os termos definidos ime- diatamente abaixo são definidos de forma mais completa por referência à especificação em sua totalidade.
Vários aspectos descritos neste do- cumento são descritos em detalhes ainda nas subseções a seguir.
I.
Anticorpos anti-NKG2A A presente invenção descreve, em algumas modalidades,
anticorpos anti-NKG2A, tais como anticorpos totalmente humanos, hu- manizados e quiméricos, com funções ou propriedades desejáveis.
Por exemplo,os anticorpos especificamente ligam proteína NKG2A humana com alta afinidade.
Em certas modalidades, os anticorpos são anticor- pos antagonísticos que bloqueiam ou revertem a inibição mediada por NKG2A em células imunes, tais como células T e NK.
Em algumas mo- dalidades, os anticorpos NKG2A anti-humanos (anti-huNKG2A) têm propriedades desejáveis para uso como agentes terapêuticos no trata- mento de doenças, tais como cânceres ou infecções.
Anticorpos anti-NKG2A específico descritos neste docu- mento são anticorpos tendo a CDR e/ou sequências de região variável dos anticorpos 13F3.A4, NKG2A.6, NKG2A.7, NKG2A.8, NKG2A.9, NKG2A.11, isolados e estruturalmente caracterizados como descrito neste documento, bem como anticorpos tendo pelo menos 80% de iden- tidade (por exemplo, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 95% de identidade ou pelo menos 99% de identidade) para as sequências de aminoácido dos anticorpos anti- NKG2A descritos neste documento.
Em algumas modalidades, os anti- corpos anti-NKG2A descritos neste documento têm pelo menos 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 95% de identidade ou pelo menos 99% de identidade) para a região variável ou sequências de CDR dos anti- corpos anti-NKG2A descritos neste documento.
Em alguns aspectos, os anticorpos da invenção são caracte- rizados por características ou propriedades funcionais particulares.
Por exemplo, os anticorpos especificamente se ligam a NKG2A humana com alta afinidade.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti- NKG2A inibem a ligação de NKG2A a seu ligando HLA-E, que restaura as respostas de células NK e T contra tumores que expressam HLA-E.
Em outras palavras, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste docu- mento estimulam as respostas antitumorais de células T e NK inibindo ou bloqueando a interação entre proteína NKG2A e seu ligando HLA-E.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento apresentam uma ou mais das seguintes proprie- dades: (1) Especificamente se ligam à proteína NKG2A humana; (2) Bloqueiam ou reduzem a ligação e/ou interação de um ligando de NKG2A (por exemplo, HLA-E em seres humanos) à proteína NKG2A humana; (Em outras modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento bloqueiam ou reduzem a ligação e/ou inte- ração de um ligando de NKG2A à proteína NKG2A não humana); (3) Revertem sinalização inibidora mediada por NKG2A; (4) Não se ligam, ou se ligam com baixa afinidade para, pro- teína NKG2C humana; (5) Ligam-se com alta afinidade a NKG2A de macaco cino- molgo e humana; (6) Não se ligam, ou demonstram baixa afinidade para, NKG2A de rato ou camundongo; (7) Não interferem com sinal de ativação de ligação de HLA- E à proteína NKG2C; (8) Têm ligação reduzida a receptor Fc gama humano (FcγR); (9) Induzem e/ou aumentam uma resposta imune antitumor; (10) Aumentam a atividade funcional de células T; (Em algu- mas modalidades, aumentam a função de células T citotóxicas como medida, por exemplo, por lise de células tumorais expressando HLA-E); (11) Aumentam a atividade funcional de células extermina- doras naturais (NK), por exemplo, por indução de ativação de células NK;
(12) Aumentam produção de citocina, por exemplo, IFNγ; e/ou (13) Especificamente ligam-se a um epítopo localizado den- tro de regiões descontínuas compreendendo os seguintes resíduos de aminoácido como determinado por HDX-MS e/ou mapeamento de epí- topo por FPOP: Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2; Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2; 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2; Região 4: L (resíduo de aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). (14) Especificamente se ligam a um epítopo localizado den- tro de regiões descontínuas compreendendo os seguintes resíduos de aminoácido como determinado por HDX-MS: Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2) Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento se ligam com alta afinidade a NKG2A humana e de macaco cinomolgo, e não se ligam a, ou se ligam com baixa afinidade para NKG2A não primata, tais como NKG2A de rato ou camundongo.
Especificamente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: (a) têm um valor de EC50 de cerca de 0,6 nM ou menos para ligação à proteína NKG2A humana como medido por ensaio de ligação celular; (b) têm um valor de EC50 de cerca de 9,0 nM ou mais para ligação à proteína NKG2C humana como medido por ensaio de ligação celular; (c) têm um valor de IC50 de cerca de 1,0 nM ou menos para reduzir a ligação e/ou interação de HLA-E à proteína NKG2A humana como medido por ensaio de bloqueio celular; (d) ligam-se à proteína NKG2A humana com uma KD de cerca de 0,4 nM ou menos como medido por análise de Scatchard; (e) ligam-se à proteína NKG2A humana com uma KD de cerca de 61 nM ou menos como medido por ressonância de plasmons de superfície; (f) ligam-se à proteína NKG2A de cinomolgo com uma KD de cerca de 1,0 nM ou menos como medido por análise de Scatchard; (g) é internalizado mediante ligação a células que expressam NKG2A; (h) aumentam a produção de interferon-gama (IFNγ); e/ou (i) em que a meia-vida do complexo de anticorpo anti- NKG2A:proteína NKG2A é cerca de 40 segundos ou mais.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento bloqueiam a ligação e/ou interação de um ligando de NKG2A (HLA-E em seres humanos) à proteína NKG2A humana.
Es- pecificamente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: a) Anticorpo anti-NKG2A bloqueia pentâmero de HLA-E de ligação a células expressando NKG2A humana com um IC50 de cerca de 0,30 nM para NKL e um IC50 de cerca de 1,0 nM para células CHO- hNKG2A; b) Anticorpo anti-NKG2A complexado com proteína HNKG2A-CD94-mFC ou NKG2A-CD94-mFc de cinomolgo bloqueia li- gação de HLA-E humano.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento são específicos para NKG2A humana.
Especifica- mente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A apresen- tam uma ou mais das seguintes propriedades: a) Têm um valor de EC50 para a ligação de anticorpo anti- NKG2A à NKG2A humana que é cerca de 15 vezes menor do que um segundo valor de EC50 para a ligação de anticorpo anti-NKG2A à prote- ína NKG2C humana.
Em algumas modalidades, o valor de EC50 para a ligação de anticorpo anti-NKG2A à NKG2A humana foi cerca de 0,6 nM, enquanto o valor de EC50 para a ligação de anticorpo anti-NKG2A à NKG2C humana foi cerca de 9,0 nM. b) Nenhuma ligação específica do anticorpo anti-NKG2A à NKG2C humana com base em análise SPR; e/ou c) Não bloqueiam interação de HLA-E e NKG2C humana como medido por citometria de fluxo.
Em algumas modalidades, o anti-NKG2A tem um Fc inerte (por exemplo, o anticorpo é isótipo de IgG1) para reduzir ou evitar liga- ção de FcγR.
Embora não limitado por nenhuma teoria, uma vez que NKG2A é um receptor inibidor expresso em células NK e T CD8+, redu- zir o agonismo ou depleção de células NK e T CD8+ de NKG2A+ é be- néfico para a função antitumoral.
Dessa forma, o bloqueio da interação de NKG2A e HLA-E pode ser feito com um anticorpo anti-NKG2A que não interage com FcγRs humanos.
Em algumas modalidades, o anti-NKG2A descrito neste do- cumento aumenta a atividade funcional antitumoral de células T.
Espe- cificamente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A apre- sentam uma ou mais das seguintes propriedades: a) Revertem a inibição de sinalização de NK-κB em uma li- nhagem de células T Jukart expressando NKG2A estimulada por CHO/scOKT3/HLA-E, com um valor de EC50 de cerca de 0,2 nM ou me- nor. b) Induzem interferon-gama (IFN-γ) em T CD8 NKG2A+ iso- ladas de PBMC de doadores saudáveis cocultivadas com CHO/scOKT3/HLA-E/PD-L1. c) Induzem IFN-γ em células T CD8 NKG2A+ isoladas de tu- mores humanos cocultivadas com CHO/scOKT3/HLA-E/PD-L1. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento aumentam a atividade funcional antitumoral de cé- lulas NK.
Especificamente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: a) Aumentam a produção de IFN-γ em células NKL coculti- vadas com CHO/MICA/HLA-E. b) Induzem um aumento dose-dependente na desgranulação de células NK e lise de células tumorais expressando HLA-E.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento são internalizados após ligação a células que ex- pressam NKG2A.
Especificamente, em algumas modalidades, os anti- corpos anti-NKG2A apresentam internacionalização com um EC50 de cerca de 0,5 nM inferior ou menos.
Em algumas modalidades, os anti- corpos anti-NKG2A apresentam internacionalização dose-dependente com um EC50 de cerca de 0,5 nM inferior ou menos.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A da in- venção não contêm riscos de sequência que reduzem a estabilidade química dos anticorpos.
Os anticorpos anti-NKG2A da invenção têm vá- rios usos importantes, por exemplo, para o tratamento e/ou diagnóstico de câncer e outros distúrbios associados com expressão e/ou atividade de NKG2A.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento por sequência de aminoácido se ligam a epítopos específicos em NKG2A humana, como descrito no Exemplo 4. A ligação à NKG2A humana pode ser avaliada usando uma ou mais técnicas bem estabelecidas na técnica.
Por exemplo, em algu- mas modalidades, o anticorpo é testado por um ensaio de citometria de fluxo em que o anticorpo é reagido com uma linhagem celular que ex- pressa NKG2A humana, tais como células CHO que foram transfecta- das para expressar NKG2A humana em sua superfície celular.
Adicio- nalmente ou alternativamente, a ligação do anticorpo, incluindo a ciné- tica de ligação (por exemplo, valor de KD) pode ser testada em ensaios de ligação Biacore.
Ainda outros ensaios de ligação adequados incluem ensaios ELISA usando, por exemplo, uma proteína NKG2A humana re- combinante.
Em algumas modalidades, anticorpos anti-NKG2A ou frag- mentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos neste documento se ligam à proteína NKG2A humana com alta afinidade, por exemplo, com afinidade nanomolar, incluindo com uma KD de 1 x 10-6 M ou menor, 1 x 10-7 M ou menor, 1 x 10-8 M ou menor, 1 x 10-9 M ou menor, ou 10- 10 M ou menor.
Algumas modalidades da presente invenção referem-se a um anticorpo monoclonal anti-NKG2A ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a um epítopo localizado dentro de regiões descontínuas compreendendo os seguintes resíduos de ami- noácido como determinado por HDX-MS e/ou mapeamento de epítopo por FPOP:
Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2 (sequência de aminoácido de hNKG2A nativa); Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); Região 4: L (resíduo de aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um anti- corpo monoclonal anti-NKG2A ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a um epítopo localizado dentro de regiões descontínuas compreendendo os seguintes resíduos de amino- ácido como determinado por HDX-MS: Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2); Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A descri- tos neste documento aumentam a função de células NK bloqueando a inibição mediada por NKG2A/HLA-E.
Em outra modalidade, o anticorpo anti-NKG2A se liga à proteína NKG2A humana e estimula uma resposta imune antitumor, por exemplo, uma resposta de célula NK e/ou célula T específica de antígeno.
A capacidade do anticorpo anti-NKG2A estimu-
lar uma resposta imune pode ser testada mediando crescimento tumo- ral, tal como em um modelo de enxerto tumoral in vivo, como descrito nos Exemplos neste documento.
Em outras modalidades, os anticorpos anti-NKG2A ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos aumentam a produção de citocina (por exemplo, interferon-gama (IFN-γ) em célu- las T que expressam NKG2A e/ou aumentam a proliferação de células T, incluindo células T efetoras e células T citotóxicas (também conheci- das como células T CD8+). Em outra modalidade, o anticorpo anti-NKG2A, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga à NKG2A humana e apre- senta pelo menos uma das seguintes propriedades: a) liga-se a um ou mais dos seguintes resíduos como deter- minado por HDX-MS e/ou mapeamento de epítopo por FPOP: Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2 (sequência de aminoácido de hNKG2A nativa); Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); Região 4: L (resíduo de aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2); b) Liga-se ao mesmo epítopo em NKG2A humana como an- ticorpos NKG2A.11 e 13F3.A4; b) compete para ligação à NKG2A humana com anticorpos NKG2A.11 e 13F3.A4; c) liga-se à célula NK humana com um EC50 de cerca de 0,4 nM como medido por Biacore; d) bloqueia a ligação de células NK humanas a HLA-E com um IC50 de cerca de 0,3 nM como medido por Biacore; e) liga-se a células CHO que expressam NKG2A de macaco cinomolgo com um EC50 de cerca de 1 nM ou menor; f) tem baixa ligação a NKG2C humana com um EC50 de cerca de 9,0 nM ou mais (em outras palavras, o anticorpo anti-NKG2A não bloqueia a interação de NKG2C humana com HLA-E); e/ou h) aumenta respostas antitumor de células NK e células T CD8+. Por exemplo: i. aumenta a produção de IFN-γ em um ensaio T:CHO-OKT3- HLA-E-PDL1 primário; ii. aumenta a produção de IFN-γ em ensaio de linfócitos de infiltração tumoral de células T (TILs):CHO-OKT3-HLA-E-PDL1; e/ou iii. aumenta a citotoxicidade e a produção de IFN-γ em en- saios de células NK primários.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A da in- venção incluem anticorpos monoclonais humanizados e totalmente hu- manos.
Em outras modalidades, os anticorpos são, por exemplo, anti- corpos monoclonais quiméricos. a.
Anticorpos monoclonais anti-NKG2A Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais 13F3.A4, NKG2A.9, e NKG2A.11, que são iso- lados e estruturalmente caracterizados como descrito nos seguintes Exemplos.
As sequências de aminoácido VH e VL são estabelecidas na Tabela de Sequências e Listagem de Sequências.
Dado que cada um desses anticorpos pode se ligar à NKG2A humana, as sequências de VH e VL podem ser “misturadas e combina- das” para criar outras moléculas de ligação anti-hNKG2A da invenção.
Em algumas modalidades, quando as cadeias VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um par VH/VL particular é substituída por uma sequência de VH estruturalmente similar.
Da mesma forma, em algumas modalidades, uma sequência de VL de um par VH/VL particular é substituída por uma sequência de VL estrutural- mente similar.
Por conseguinte, em um aspecto, esta invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à proteína NKG2A humana, em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada compreendem: (a) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 9 e 8, res- pectivamente; (b) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 164 e 8, respectivamente; ou (c) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 169 e 167, respectivamente.
Em outro aspecto, esta invenção fornece anticorpos que compreendem as CDR1s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e de ca- deia leve de anticorpos NKG2A.9, NKG2A.11 e 13F3A.4. Por conse- guinte, em um aspecto, esta invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à proteína NKG2A humana, em que o anticorpo compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de ami- noácido de SEQ ID NOs: 10, 11, 12, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 13, 14, e 15, respectivamente; (b) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de ami- noácido de SEQ ID NOs: 10, 11, e 12, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 154, 14, e 15, respectivamente; ou
(c) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo região CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de amino- ácido de SEQ ID NOs: 10, 11, e 12, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 155, 14, e 15, respectivamente.
É bem conhecido na técnica que o domínio CDR3, indepen- dentemente do domínio(s) CDR1 e/ou CDR2, sozinho pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que múltiplos anticorpos podem previsivelmente ser gerados tendo a mesma especificidade de ligação com base em uma sequência de CDR3 comum. (Vide, por exemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000). Por conseguinte, a presente invenção fornece an- ticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo derivado de um animal hu- mano ou não humano, em que o anticorpo monoclonal é capaz de es- pecificamente se ligar à NKG2A humana.
Em certos aspectos, a pre- sente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano, em que o anticorpo monoclonal é capaz de especificamente se ligar à NKG2A humana.
Dentro de algumas modalidades, tais anti- corpos da invenção compreendendo um ou mais domínios CDR3 de ca- deia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano (a) são capazes de competir para ligação com; (b) mantêm as características funcionais; (c) ligam-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) têm uma afinidade de ligação si- milar ao anticorpo não humano parental correspondente.
Em outros aspectos, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humano, tais como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não humano, em que o anticorpo humano é capaz de especificamente se ligar à NKG2A humana.
Em ou- tros aspectos, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anti- corpo humano obtido de um animal não humano, em que o primeiro an- ticorpo humano é capaz de especificamente se ligar à NKG2A humana, e em que o domínio CDR3 do primeiro anticorpo humano substitui um domínio CDR3 em um anticorpo humano que não contém especificidade de ligação para NKG2A para gerar um segundo anticorpo humano que é capaz de especificamente se ligar à NKG2A humana.
Em algumas modalidades, tais anticorpos da invenção compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve do primeiro anticorpo hu- mano (a) são capazes de competir para ligação com; (b) mantêm as características funcionais; (c) ligam-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) têm uma afinidade de ligação similar ao anticorpo não humano parental cor- respondente.
Em algumas modalidades, a presente invenção fornece an- ticorpos anti-hNKG2A com IgG1.3 humana com Fc inerte como o isó- tipo.
Em algumas modalidades, tais anticorpos anti-hNKG2A com um Fc inerte mostram eficácia superior no tratamento de câncer em compara- ção com outros isótipos.
Anticorpos com Modificações Conservadoras Em certas modalidades, um anticorpo anti-NKG2A da inven- ção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais dessas sequências de CDR compreendem sequências de ami- noácido específicas com base nos anticorpos descritos neste docu- mento (por exemplo, os anticorpos 13F3.A4, NKG2A.9 e NKG2A.11), ou modificações conservadoras dos mesmos, e em que os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti- hNKG2A da invenção.
É compreendido na técnica que certas modifica- ções de sequência conservadoras podem ser feitas, as quais não remo- vem a ligação ao antígeno. (Vide, por exemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8). Por conseguinte, esta invenção fornece um anti- corpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada com- preendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido es- tabelecida na SEQ ID NO: 12, ou modificações conservadoras dos mes- mos; e (b) o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, especificamente liga NKG2A humana.
Em modalidades adicionais, o anticorpo tem uma ou mais das propriedades funcionais descritas neste documento, tais como liga- ção de alta afinidade à NKG2A humana, e/ou a capacidade para blo- quear a interação de NKG2A/HLA-E.
Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pe- sada compreendendo uma sequência de CDR2 compreende uma se- quência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 11, ou modifica- ções conservadoras dos mesmos; e a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR2 compreendendo uma se- quência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 14, ou modifica- ções conservadoras dos mesmos.
Em outra modalidade, a região vari- ável de cadeia pesada compreende uma sequência de CDR1 compre- endendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 10, ou modificações conservadoras dos mesmos; e a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida nas SEQ ID NOs: 13, 154, ou 155, ou modificações conservadoras dos mesmos.
Em várias modalidades, o anticorpo anti-NKG2A são, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que anticorpos anti-hNKG2A Em outra modalidade, esta invenção fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em proteína NKG2A humana como quais- quer dos anticorpos monoclonais anti-hNKG2A da invenção (isto é, an- ticorpos que têm a capacidade de competir de forma cruzada para liga- ção à proteína NKG2A humana com qualquer um dos anticorpos mono- clonais da invenção). Em algumas modalidades, o anticorpo de referên- cia para estudos de competição cruzada são os anticorpos monoclonais NKG2A.9, NKG2A.11 e 13F3.A4 em ensaios de ligação de NKG2A hu- mana padrão.
Por exemplo, ensaios ELISA padrão podem ser usados, em que uma proteína NKG2A humana recombinante é imobilizada na placa, um dos anticorpos é fluorescentemente rotulado, e a capacidade de anticorpos não rotulados de competirem por ligação do anticorpo ro- tulado é avaliada.
Adicionalmente ou alternativamente, análise Biacore pode ser usada para avaliar a capacidade dos anticorpos de competi- remde forma cruzada.
A capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação de, por exemplo, NKG2A.9, NKG2A.11, e/ou 13F3.A4, à NKG2A humana demonstra que o anticorpo de teste pode competir com NKG2A.9, NKG2A.11 e/ou 13F3.A4 para ligação à NKG2A humana e, assim, se ligar ao mesmo epítopo em NKG2A.9 humana como NKG2A.9, NKG2A.11 e/ou 13F3.A4. Em algumas modalidades, o anti- corpo que se liga ao mesmo epítopo em NKG2A humana como NKG2A.9, NKG2A.11 e/ou 13F3.A4 é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado
Como discutido ainda no Exemplo 4, a ligação de NKG2A.9 e 13F3.A4 foi mapeada para resíduos específicos.
Por conseguinte, em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que, quando ligado à proteína NKG2A humana, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, especificamente se liga aos seguintes resíduos de ami- noácido como determinado por espectrometria de massa com troca hi- drogênio-deutério (HDX-MS): (e) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156); (f) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157); (g) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158); e (h) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159), em que o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação de um li- gando de NKG2A (por exemplo, HLA-E em seres humanos) à proteína NKG2A humana.
Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo mo- noclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que, quando ligado à NKG2A humana, o anticorpo monoclonal especifica- mente se liga aos seguintes resíduos de aminoácido como determinado por HDX-MS e/ou mapeamento de epítopo por oxidação fotoquímica rá- pida de proteínas (FPOP): (f) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156); (g) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157); (h) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158); (i) L; e (j) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159), em que o anticorpo monoclonal bloqueia a ligação de um li- gando de NKG2A (por exemplo, HLA-E em seres humanos) à proteína NKG2A humana.
Tais anticorpos monoclonais humanos ou humanizados po- dem ser preparados e isolados como descrito neste documento.
Por exemplo, anticorpos anti-hNKG2A que se ligam aos mesmos epítopos ou a epítopos similares aos anticorpos descritos neste documento po- dem ser elevados usando protocolos de imunização, por exemplo, aque- les descritos neste documento.
Os anticorpos resultantes podem ser avaliados quanto à ligação de alta afinidade à NKG2A humana.
Os an- ticorpos selecionados podem, então, ser estudados, por exemplo, em ensaio de exibição de levedura em que as variantes de sequência de hNKG2A são apresentadas na superfície das células de levedura, ou por experimentos de troca de hidrogênio-deutério e/ou FPOP, para de- terminar o epítopo preciso ligado pelo anticorpo.
As determinações de epítopos podem ser feitas por qualquer método conhecido na técnica.
Em algumas modalidades, considera-se que os anticorpos anti-hNKG2A se ligam ao mesmo epítopo que um mAb anti- anti-hNKG2A descrito neste documento se eles entrarem em contato com um ou mais dos mesmos resíduos dentro de pelo menos uma região de hNKG2A; se entrarem em contato com a maioria dos resíduos dentro de pelo menos uma região de hNKG2A; se entrarem em contato com a maioria dos resíduos dentro de cada região de hNKG2A; se entrarem em contato com a maioria dos contatos ao longo de todo o comprimento de hNKG2A; se entrarem em contato dentro de todas as mesmas regiões distintas de hNKG2A; se entrarem em contato com todos os resíduos em qualquer região em hNKG2A; ou se entrarem em contato com todos os mesmos resíduos em todas as mesmas regi- ões. “Regiões” de epítopo são agrupamentos de resíduos ao longo, mas não necessariamente diretamente adjacentes dentro de, a seqüência primária.
Técnicas para determinar anticorpos que se ligam ao
“mesmo epítopo em hNKG2A” com os anticorpos descritos neste docu- mento incluem análises de raio-x de cristais de complexos de antí- geno:anticorpo, que oferecem resolução atômica do epítopo.
Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno, em que a perda de ligação devido a uma modificação de aminoácido na sequência de antígeno indica o componente de epítopo.
Os métodos também podem contar com a ca- pacidade de um anticorpo de interesse para isolar por afinidade peptí- deos curtos específicos (tanto na forma tridimensional nativa quanto na forma desnaturada) a partir de bibliotecas combinatórias de peptídeo de exibição de fago ou a partir de uma digestão por protease da proteína alvo.
Os peptídeos são então considerados condutores para a definição do epítopo correspondente ao anticorpo usado para triagem da biblio- teca de peptídeos.
Para mapeamento de epítopos, algoritmos computa- cionais têm também sido desenvolvidos, os quais têm demonstrado ma- pear epítopos descontínuos conformacionais.
O epítopo ou região compreendendo o epítopo também pode ser identificado pela triagem para ligação a uma série de peptídeos so- brepostos abrangendo NKG2A.
Alternativamente, o método de Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899 pode ser usado para orientar a sele- ção de anticorpos tendo o mesmo epítopo e, portanto, propriedades si- milares aos anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento.
Usando a exibição de fago, primeiramente, a cadeia pesada do anticorpo anti- NKG2A é emparelhada com um repertório de cadeias leves (por exem- plo, humanas) para selecionar um anticorpo de ligação à NKG2A, e en- tão a nova cadeia leve é emparelhada com um repertório de cadeias pesadas (por exemplo, humanas) para selecionar um anticorpo de liga- ção a NKG2A (por exemplo, humano) tendo o mesmo epítopo ou região de epítopo que um anticorpo anti-NKG2A descrito neste documento.
Al- ternativamente, as variantes de um anticorpo descrito neste documento podem ser obtidas por mutagênese de sequências de cDNA codificando as cadeias de leves e pesadas do anticorpo.
Mutagênese de varredura de alanina, como descrito por Cu- nningham & Wells, Science 244: 1081 (1989), ou alguma outra forma de mutagênese de ponto de resíduos de aminoácido em NKG2A, também pode ser usada para determinar o epítopo funcional para um anticorpo anti-NKG2A.
O epítopo ou região de epítopo (uma “região de epítopo” é uma região compreendendo o epítopo ou sobreposta ao epítopo) ligado por um anticorpo específico também pode ser determinado avaliando a ligação do anticorpo a peptídeos compreendendo fragmentos de NKG2A.
Uma série de peptídeos sobrepostos englobando a sequência de NKG2A (por exemplo, NKG2A humana) pode ser sintetizada e triada para ligação, por exemplo, em um ELISA direto, um ELISA competitivo (em que o peptídeo é avaliado quanto à sua capacidade de prevenir a ligação de um à NKG2A ligada a uma cavidade de uma placa de micro- titulação), ou em um chip.
Tais métodos de triagem de peptídeos podem não ser capazes de detectar alguns epítopos funcionais descontínuos, isto é, epítopos funcionais que envolvem resíduos de aminoácido que não são contíguos ao longo da sequência primária da cadeia polipeptí- dica de NKG2A.
Um epítopo também pode ser identificado por pegada (foo- tprint) de proteína baseada em MS, tal como HDX-MS e Oxidação Fo- toquímica Rápida de Proteínas (FPOP). HDX-MS pode ser realizado, por exemplo, como ainda descrito em Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95, os métodos do qual são especificamente incorporados por referência neste documento.
FPOP pode ser conduzida como descrito, por exemplo, em Hambley & Gross (2005) J.
American Soc.
Mass Spec- trometry 16:2057, os métodos do qual são especificamente incorpora- dos por referência neste documento.
O epítopo ligado por anticorpos anti-NKG2A também pode ser determinado por métodos estruturais, tais como determinação de estrutura cristalina de raios-X (por exemplo, WO2005/044853), modela- gem molecular e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), incluindo determinação de NMR das taxas de troca de H-D de amida hidrogênios lábeis em NKG2A quando livre e quando ligado em um complexo com um anticorpo de interesse (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884). Salvo indicação em contrário, e com referência às reivindica- ções, o epítopo ligado por um anticorpo é o epítopo como determinado por métodos HDX-MS.
Anticorpos anti-NKG2A que se ligam com alta afinidade Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hNKG2A da presente invenção se ligam a hNKG2A com alta afinidade, tornando-os agentes terapêuticos eficazes.
Em várias modalidades, anticorpos anti- hNKG2A da presente invenção se ligam a hNKG2A com uma KD de me- nos do que 10nM, 5nM, 2nM, 1nM, 300pM ou 100pM.
Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para hNKG2A in- cluem ELISAs, RIAs, Western blots, interferometria de biocamada (BLI) e análise de SPR BiacoreTM (vide Exemplo 10). d.
Variantes de sequência de anticorpo anti-NKG2A Variantes de sequência de anticorpo anti-NKG2A descritos neste documento mantêm as propriedades funcionais desejáveis des- critas neste documento.
As regiões CDR são delineadas usando o sis- tema Kabat (Kabat, et al., 1991) salvo indicação em contrário.
Em algu- mas modalidades, a presente invenção ainda fornece anticorpos anti- hNKG2A humanos ou humanizados compreendendo sequências de CDR que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idênticas às sequências de CDR dos anticor- pos descritos neste documento.
A presente invenção também fornece anticorpos anti- anti-hNKG2A compreendendo sequências de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idênticas às se- quências de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos descritos neste documento, bem como anticorpos anti-hNKG2A com- preendendo sequências de cadeia pesada e/ou leve de comprimento total que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% idênticas às sequências de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos descritos neste documento.
II.
Anticorpos Modificados e Geneticamente manipulados a.
Regiões VH e VL Também fornecidos são anticorpos modificados e genetica- mente manipulados que podem ser preparados usando um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de VH e/ou VL descritas neste docu- mento como material de partida para a geneticamente modificar um an- ticorpo modificado, que o anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas a partir do anticorpo de partida.
Em algumas modalidades, um anticorpo como descrito neste documento foi geneticamente manipu- lado pela modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de quadro.
Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo como descrito neste documento foi geneticamente manipulado por meio da modificação de resíduos na(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.
Em uma modalidade, a engenharia de região variável inclui enxerto de CDR.
Tal enxerto é de uso particular na humanização de anticorpos anti-NKG2A não humanos, por exemplo, anticorpos anti- hNKG2A que competem para ligação com os anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento e/ou se ligam ao mesmo epítopo que os an- ticorpos anti- hNKG2A de seleção descritos neste documento. Os anti- corpos interagem com os antígenos alvo predominantemente por meio de resíduos de aminoácido que são localizados nas CDRs de cadeia pesada e leve. As CDRs são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). Vetores de ex- pressão podem ser construídos de forma que incluam sequências de CDR de um anticorpo de referência específico (também chamado de “parental”) enxertado em sequências de quadro de um anticorpo dife- rente (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323- 327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente dos EUA Nº.
5.225.539 de Winter, e Patentes dos EUA Nºs. 5.530.101; 5.585.089;
5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.). Em alguns casos, o anticorpo recombinante resultante tem propriedades que são similares às do an- ticorpo de origem. O anticorpo geneticamente manipulado pode então ser ainda modificado para adquirir propriedades que são distintas do anticorpo de origem. Em outros casos, enxertar as sequências de CDR parentais em uma estrutura anula certas características do anticorpo de origem, tal que o anticorpo recombinante não tenha mais essas carac- terísticas. Uma característica exemplificativa é a afinidade de ligação em relação a um antígeno. Em tais casos, pode ser vantajoso modificar o anticorpo geneticamente manipulado para recuperar as característi- cas desejadas do anticorpo de origem. Essas sequências de quadro podem ser encontradas em bancos de dados públicos de DNA ou referências publicadas que in- cluem sequências de genes de linha germinativa. Por exemplo, as se- quências de DNA de linha germinativa para genes humanos de região variável de cadeia leve e pesada podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linha germinativa humana “VBase”, bem como em Kabat, E. A., et al., 1991); Tomlinson, I.M., et al. (1992) “The Reper- toire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776- 798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”, Eur. J. Immunol. 24:827-836; o conteúdo de cada um dos quais é expressamente incor- porado neste documento por referência. Em algumas modalidades, as sequências de quadro para uso nos anticorpos descritos neste documento são aquelas que são es- truturalmente similares às sequências de quadro usadas por anticorpos descritos neste documento. As sequências de VH CDR1, 2 e 3 e as se- quências de VL CDR1, 2 e 3 podem ser enxertadas em regiões de qua- dro que têm a sequência idêntica à encontrada no gene de imunoglobu- lina de linha germinativa a partir da qual a sequência de quadro deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões de quadro que contêm até 20 substituições de aminoácido, incluindo substituições de aminoácido conservadoras, em comparação com as sequências de linha germinativa. Por exemplo, verificou-se que, em certos casos, é be- néfico mutar resíduos dentro das regiões de quadro para manter ou au- mentar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo (vide, por exemplo, Patentes dos EUA 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e
6.180.370 de Queen et al). Anticorpos geneticamente manipulados descritos neste do- cumento incluem aqueles em que as modificações tenham sido feitas nos resíduos de quadro dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melho- rar as propriedades do anticorpo, tal como diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é “retromutar” um ou mais resíduos de quadro para a sequência de linha germinativa correspon- dente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somá- tica pode conter resíduos de quadro que diferem da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado.
Esses resíduos podem ser identificados por comparação das sequências de quadro de anticorpo com as sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é deri- vado.
Para retornar as sequências de região de quadro à sua configu- ração de linha germinativa, as mutações somáticas podem ser “retro- mutadas” para a sequência de linha germinativa, por exemplo, por mu- tagênese dirigida a sítio ou mutagênese mediada por PCR.
Tais anticor- pos “retromutados” são também abrangidos nesta invenção.
Outro tipo de modificação de quadro envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região de quadro, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epítopos de células T para, assim, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo.
Essa aborda- gem é também referida como “desimunização” e é descrita ainda em detalhes na Publicação de Patente dos EUA Nº. 20030153043 de Carr et al.
Outro tipo de modificação de região variável é a mutação de resíduos de aminoácido dentro das regiões de CDR para melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse.
A mutagênese dirigida a sítio ou a mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse.
De preferência, modificações conservadoras são introduzidas.
As muta- ções podem ser adições, deleções ou substituições de aminoácidos.
Em algumas modalidades, não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região de CDR são alterados.
Os resíduos de metionina nas CDRs de anticorpos podem ser oxidados, resultando em potencial degradação química e conse- quente redução na potência de anticorpo.
Por conseguinte, também for- necido neste documento são anticorpos anti-NKG2A que têm um ou mais resíduos de metionina nas CDRs de cadeia pesada e/ou leve subs- tituídos por resíduos de aminoácido que não sofrem degradação oxida- tiva.
Da mesma forma, os sítios de desamidação podem ser removidos de anticorpos anti-NKG2A, particularmente nas CDRs.
Também forne- cidos neste documento são anticorpos em que os sítios de glicosilação potenciais dentro do domínio de ligação ao antígeno foram eliminados para evitar a glicosilação que pode interferir na ligação ao antígeno.
Vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº. 5.714.350. b.
Mascaramento (Masking) de Anticorpo Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste do- cumento são modificados para limitar sua ligação a células e/ou tecidos específicos.
Em uma modalidade, tais anticorpos compreendem uma “máscara” de peptídeo bloqueante que especificamente se liga à super- fície de ligação ao antígeno do anticorpo e interfere na ligação ao antí- geno.
Em algumas modalidades, a máscara é ligada a cada um dos braços de ligação do anticorpo por um ligante clivável por protease.
Vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº. 8.518.404 de CytomX.
Anticor- pos com ligantes cliváveis por protease são úteis para tratamento de cânceres em que os níveis de protease são muito aumentados no mi- croambiente tumoral em comparação com tecidos não tumorais.
A cli- vagem seletiva do ligante clivável no microambiente tumoral permite a dissociação do peptídeo de mascaramento/bloqueio, permitindo a liga- ção ao antígeno seletivamente no tumor, em vez do que em tecidos pe- riféricos em que a ligação ao antígeno pode causar efeitos colaterais indesejados.
Em outra modalidade, um composto de ligação bivalente (“li- gando de mascaramento”) compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno é desenvolvido, que se liga a ambas as superfícies de ligação ao antígeno do anticorpo (bivalente) e interfere na ligação ao antígeno.
Em uma modalidade, as duas máscaras de domínio de ligação são liga- das entre si (mas não o anticorpo) por um ligante clivável, por exemplo, clivável por uma peptidase. (Vide, por exemplo, WO 2010/077643 de Tegopharm Corp). Os ligandos de mascaramento podem compreender, ou ser derivados de, o antígeno ao qual o anticorpo é destinado a se ligar, ou podem ser gerados independentemente (por exemplo, frag- mentos de ligação anti-idiotipo). Esses ligandos de mascaramento são úteis para o tratamento de cânceres em que os níveis de protease são muito aumentados no microambiente tumoral em comparação com os tecidos não tumorais.
A clivagem seletiva do ligante clivável no micro- ambiente tumoral permite a dissociação dos dois domínios de ligação um do outro, reduzindo a avidez pelas superfícies de ligação ao antí- geno do anticorpo.
A dissociação resultante do ligando de mascara- mento do anticorpo permite a ligação ao antígeno seletivamente no tu- mor, em vez de nos tecidos periféricos em que a ligação ao antígeno pode causar efeitos colaterais indesejados. c.
Fcs e Regiões Fc Modificadas Em uma modalidade, os anticorpos descritos neste docu- mento podem compreender regiões Fc selecionadas com base nas ati- vidades biológicas do anticorpo.
Salfeld, Nat.
Biotechnol. 25:1369 (2007). As IgGs humanas, por exemplo, podem ser classificadas em quatro subclasses, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada uma dessas subclas- ses compreendem uma região Fc tendo um perfil único para ligação a um ou mais de receptores Fcγ (receptores de ativação FcγRI (CD64), FcγRIIA, FcγRIIC (CD32a,c); FcγRIIIA e FcγRIIIB (CD16a,b) e receptor de inibição FcγRIIB (CD32b), e para o primeiro componente de comple- mento (C1q). IgG1 e IgG3 humanas se ligam a todos os receptores Fcγ; IgG2 liga-se a FcγRIIAH131, e com menor afinidade para FcγRIIAR131 FcγRIIIAV158; IgG4 liga-se a FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, e FcγRIIIAV158; e o receptor inibidor FcγRIIB tem uma menor afinidade para IgG1, IgG2 e IgG3 do que todos os outros receptores Fcγ. (Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716). Os estudos demonstraram que FcγRI não se liga a IgG2, e FcγRIIIB não se liga a IgG2 ou IgG4. Id.
Em geral, com relação à atividade de ADCC, IgG1 ≧ IgG3 ≫ IgG4 ≧ IgG2 humana.
Em algumas modalidades, um domínio constante de IgG1, em vez do que uma IgG2 ou IgG4, é escolhido, por exemplo, para uso em uma compo- sição terapêutica porque ADCC é desejado.
Regiões variáveis de anticorpo anti-hNKG2A descritas neste documento podem ser ligadas (por exemplo, covalentemente ligadas ou fundidas) a um Fc, por exemplo, um Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, que pode ser de qualquer alótipo ou isoalótipo, por exemplo, para IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v). (Vide, por exemplo, Jef- feris et al. (2009) mAbs 1:1). A seleção de alótipo pode ser influenciada pelas preocupações com a imunogenicidade potencial, por exemplo, para minimizar a formação de anticorpos antifármaco.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-NKG2A da pre- sente invenção são incapazes de interagir com FcγRs humanos.
Uma vez que NKG2A é um receptor inibidor expresso em células NK e T CD8+, evitar ou reduzir o agonismo ou depleção de células NK ou T CD8+ de NKG2A+ aumenta a imunidade antitumoral.
Dessa forma, o bloqueio da interação de NKG2A/HLA-E foi desejado com um anticorpo anti-NKG2A incapaz de interagir com FcγRs humanos. d.
Extensão de Meia-vida Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NKG2A é modifi- cado para aumentar sua meia-vida biológica, por exemplo, a meia-vida do anticorpo em soro.
Várias abordagens são conhecidas na técnica.
Em uma modalidade, o anticorpo é alterado dentro da região CH1 ou
CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento reti- rado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes dos EUA Nºs. 5.869.046 e 6.121.022 de Presta et al.
Por exemplo, um Fc variante de combinação compreen- dendo M252Y, S254T e T256E, aumenta a meia-vida em quase quatro vezes. (Dall’Acqua et al. (2006) J.
Biol.
Chem. 281:23514). Outras mo- dificações para aumentar a ligação de FcRn são descritas em Yeung et al. (2010) J.
Immunol. 182:7663-7671; 6.277.375; 6.821.505; WO 97/34631; WO 2002/060919. A meia-vida sérica dos anticorpos descritos neste docu- mento também pode ser aumentada por peguilação.
Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo.
Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, normalmente é reagido com um reagente de polietilenoglicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG se ligam ao anticorpo ou fragmento de anticorpo.
De preferência, a peguilação é re- alizada por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquila- ção com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como usado neste documento, o termo “polieti- lenoglicol” destina-se a abranger qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1- C10)alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida.
Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo agli- cosilado.
Os métodos de peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos descritos neste docu- mento. (Vide, por exemplo, EP 0154316 de Nishimura et al. e EP 0401384 de Ishikawa et al.) Em alguns casos, pode ser desejável diminuir a meia-vida de um anticorpo, em vez de aumentá-lo.
Em algumas modalidades, os an- ticorpos descritos deste documento incluem modificações para diminuir sua meia-vida.
Modificações como I253A (Hornick et al. (2000) J.
Nucl.
Med. 41:355) e H435A/R, I253A ou H310A (Kim et al. (2000) Eur.
J.
Immunol. 29:2819) em Fc de IgG1 humana pode diminuir a ligação de FcRn, diminuindo assim a meia-vida (aumentando a depuração) para uso em situações em que depuração rápida é preferida, tal como para imagens médicas. (Vide também Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622). Outros meios para aumentar a depuração incluem a formata- ção dos domínios de ligação ao antígeno da presente invenção como fragmentos de anticorpo sem a capacidade de ligar FcRn, tais como fra- gmentos Fab.
Tal modificação pode, por exemplo, reduzir a meia-vida circulante de um anticorpo de algumas semanas a horas.
A PEGuilação seletiva de fragmentos de anticorpo pode então ser usada para aumen- tar a meia-vida dos fragmentos de anticorpo quando desejado. (Cha- pman et al. (1999) Nat.
Biotechnol. 17:780). Fragmentos de anticorpo também podem ser fundidos à albumina de soro humano, por exemplo, em um constructo de proteína de fusão, para aumentar a meia-vida. (Yeh et al. (1992) Proc.
Nat’l Acad.
Sci. 89:1904). Alternativamente, um anticorpo biespecífico pode ser construído com um primeiro domínio de ligação ao antígeno da presente invenção e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga à albumina de soro humano (HSA). (Vide WO 2009/127691 e referências de patente ali citadas). Alternativa- mente, sequências polipeptídicas especializadas podem ser adiciona- das a fragmentos de anticorpo para aumentar a meia-vida, por exemplo, sequências polipeptídicas “XTEN”. (Schellenberger et al. (2009) Nat.
Bi- otechnol. 27:1186; Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2010/091122). e.
Variantes Fc Adicionais Em algumas modalidades, ao usar um domínio constante de
IgG1, um sítio de clivagem de protease potencial na dobradiça de cons- trutos de IgG1 pode ser eliminado por modificações D221G e K222S, aumentando a estabilidade do anticorpo. (WO 2014/043344). As afinidades e propriedades de ligação de uma variante Fc para seus ligandos (receptores Fc) podem ser determinadas por uma variedade de métodos de ensaio in vitro (por exemplo, ensaios de base bioquímica ou imunológica) conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio de imunoabsor- ção enzimática (ELISA), ou radioimunoensaio (RIA)), ou cinética (por exemplo, análise SPR BIACORE®), e outros métodos, tais como en- saios de ligação indireta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Esses e outros métodos podem usar um rótulo em um ou mais dos componentes sendo exami- nados e/ou empregar vários métodos de detecção, incluindo, mas sem limitação, rótulos cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotó- picos.
Uma descrição detalhada de cinética e afinidades de ligação pode ser encontrada em Paul, W.
E., ed., Fundamental Immunology, 4ª Ed., Lippincott-Raven, Filadélfia (1999), que se concentra nas interações an- ticorpo-imunógeno.
Em ainda outras modalidades, a glicosilação de um anticorpo é modificada para aumentar ou diminuir a função efetora.
Por exemplo, um anticorpo aglicoslado pode ser produzido, o qual não contém toda a função efetora por mutação do resíduo de asparagina conservado na posição 297 (por exemplo, N297A), abolindo assim a ligação de FcγRI e complemento. (Bolt et al. (1993) Eur.
J.
Immunol. 23:403; vide também Tao & Morrison (1989) J.
Immunol. 143:2595 (usando N297Q em IgG1 para eliminar a glicosilação na posição 297)). Embora anticorpos aglicosilados geralmente não tenham função efetora, as mutações podem ser introduzidas para restaurar essa função.
Anticorpos aglicosilados, por exemplo, aqueles resultantes de mutações N297A/C/D/ou H ou produzidos em sistemas (por exemplo, E. coli) que não glicosilam proteínas, podem ser ainda mutados para restaurar a ligação de FcγR, por exemplo, S298G e/ou T299A/G/ou H (WO 2009/079242), ou E382V e M428I (Jung et al. (2010) Proc.
Nat’l Acad.
Sci. (USA) 107:604). A glicoengenharia também pode ser usada para modificar as propriedades anti-inflamatórias de um constructo de IgG alterando o conteúdo de sialil α2,6 das cadeias de carboidrato anexadas a Asn297 das regiões Fc, em que uma proporção aumentada de forma sialiladas α2,6 resulta em efeitos anti-inflamatórios aumentados. (Vide Nimmer- jahn et al. (2008) Ann.
Rev.
Immunol. 26:513). Por outro lado, a redução da proporção de anticorpo tendo carboidratos sialilados α2,6 pode ser útil nos casos em que as propriedades anti-inflamatórias não são dese- jadas.
Métodos de modificação do conteúdo de sialilação α2,6 de anti- corpos, por exemplo, por purificação seletiva de formas sialiladas α2,6 ou por modificação enzimática, são fornecidos na Publicação de Pedido de Patente dos EUA Nº. 2008/0206246. Em outras modalidades, a se- quência de aminoácido da região Fc pode ser modificada para mimetizar o efeito de sialilação α2,6, por exemplo, pela inclusão de uma modifica- ção F241A. (WO 2013/095966). III.
Propriedades Físicas de Anticorpo Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste docu- mento contêm um ou mais sítios de glicosilação na região variável de cadeia pesada ou leve.
Tais sítios de glicosilação podem resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma farmacocinética alte- rada do anticorpo devido à ligação ao antígeno alterada (Marshall et al (1972) Ann.
Rev.
Biochem. 41:673-702; Gala e Morrison (2004) J.
Im- munol. 172:5489-94; Wallick et al (1988) J.
Exp.
Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature
316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). A glicosila- ção foi conhecida por ocorrer em motivos contendo uma sequência N- X-S/T.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hNKG2A não contém glicosilação de região variável.
Tais anticorpos podem ser obtidos sele- cionando anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou por mutação de resíduos dentro da região de glicosilação.
Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste docu- mento não contêm sites de isomeria de asparagina.
A desamidação de asparagina pode ocorrer nas sequências N-G ou D-G e resultar na cria- ção de um resíduo de ácido isoaspártico que introduz uma dobra na cadeia polipeptídica e diminui sua estabilidade (conhecido como efeito do ácido isoaspártico). Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste do- cumento têm um ponto isoelétrico (pI) na faixa de pH entre 6 e 9,5. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento têm um pI na faixa de pH de 7-9,5 ou 6-8. Anticorpos tendo um pI dentro de uma faixa de pI desejada podem ser obtidos selecionando anticorpos com um pI na faixa de pH de um grupo de candidatos ou mutando resíduos de superfície carregados de um anticorpo particular.
Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste do- cumento são selecionados e/ou genetifcamente projetados para ter uma temperatura de desdobramento inicial (TM1) maior do que 60° C, maior do que 65° C, ou maior do que 70° C.
O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando calorimetria de varredura diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett. 68:47-52) ou dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J.
Chromatogr.
Sci. 40:343-9). Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste do- cumento são selecionados e/ou geneticamente manipulados para ter propriedades de degradação vantajosas, por exemplo, degradação lenta in vitro e/ou in vivo.
A degradação de anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander A J e Hughes D E (1995) Anal Chem. 67:3626-32). Em algumas modalidades, os an- ticorpos descritos neste documento são selecionados e/ou genetica- mente manipulados para ter propriedades de agregação favoráveis, por exemplo, que mostram agregação mínima in vitro e/ou in vivo, que pode desencadear uma resposta imune indesejada e/ou propriedades farma- cocinéticas alteradas ou desfavoráveis.
Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento apresentam agregação de 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, ou 5% ou menos em comparação com a agregação do anticorpo de origem.
A agregação pode ser medida por várias técnicas, incluindo coluna de ex- clusão de tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), e espalhamento de luz.
IV.
Moléculas de ácido nucleico e métodos recombinantes Outro aspecto positivo descrito neste documento refere-se às moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti- hNKG2A descritos neste documento.
Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, por exemplo, uma célula hospedeira, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substan- cialmente pura.
Um ácido nucleico é “isolado” ou “tornado substancial- mente puro” quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celula- res (por exemplo, outro DNA cromossômico, por exemplo, o DNA cro- mossômico que é ligado ao DNA isolado na natureza) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandagem CsCl, cromatografia de coluna, enzimas de restrição, eletroforese em gel de agarose, e outras bem conhecidas na técnica. (Vide, F.
Ausubel, et al., Ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e
Wiley Interscience, Nova York). Um ácido nucleico descrito neste docu- mento pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter ín- trons.
Em certas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.
Ácidos nucleicos descritos neste documento podem ser ob- tidos usando técnicas de biologia molecular padrão.
Para os anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de imunoglobulina humana como descrito ainda abaixo), cDNAs codificando as cadeias le- ves e/ou pesadas do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA.
Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), o ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser recuperado da biblioteca.
Uma vez que fragmentos de DNA codificando segmentos de VH e VL são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser ainda mani- pulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou em um gene scFv.
Nessas manipulações, um fragmento de DNA codificando VL- ou VH- é operativamente ligado a outro fragmento de DNA codificando outra pro- teína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível.
O termo “operativamente ligado”, como usado neste contexto, significa que os dois fragmentos de DNA são unidos de forma que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam em quadro.
DNA isolado codificando a região de VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total operativamente ligando um DNA codificando VH- a outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (dobradiça, CH1, CH2 e/ou CH3).
As sequências de genes da região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, et al., 1991), e fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão.
A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA, IgE, IgM ou IgD, por exemplo, uma região IgG1. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, um DNA codificando VH- pode ser operativa- mente ligado a outra molécula de DNA codificando apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.
O DNA isolado codificando a região de VL pode ser conver- tido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve Fab) operativamente ligando um DNA codificando VL- a outra molécula de DNA codificando uma região constante de ca- deia leve, CL.
As sequências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, et al., 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edi- ção, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publica- ção NIH Nº. 91-3242), e fragmentos de DNA englobando essas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão.
A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kapa ou lambda.
Para criar um gene scFv, fragmentos de DNA codificando VH- e VL- são operativamente ligados a outro fragmento codificando um li- gante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácido (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 160), tal que as sequências de VH e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões de VL e VH unidas pelo ligante flexível (vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554). V.
Geração de Anticorpo
Vários anticorpos da presente invenção, por exemplo, aque- les que se ligam ao mesmo epítopo que anticorpos anti-hNKG2A sele- cionados descritos neste documento, podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas, tais como a técnica de hibridi- zação de células somáticas padrão descrita por Kohler e Milstein, Na- ture 256:495 (1975). Outras técnicas para produção de anticorpos mo- noclonais também podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B, técnica de exibição de fago usando bibliotecas de genes de anticorpos humanos. Um sistema animal exemplificativo para a preparação de hi- bridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma em camundon- gos é um procedimento bem estabelecido. Os protocolos de imunização e as técnicas de isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mi- eloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos. Os anticorpos quiméricos ou humanizados descritos neste documento podem ser preparados com base na sequência de um anti- corpo monoclonal murino preparado como descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia leve e pesada pode ser obtido do hibridoma de interesse murino e geneticamente manipulado para conter sequências de imunoglobulina não murina (por exemplo, humana) usando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº 4.816.567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura de quadro humana usando métodos co- nhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº 5.225.539 de Winter, e Patente dos EUA Nº 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e
6.180.370 de Queen et al.).
Em uma modalidade, os anticorpos descritos neste docu- mento são anticorpos monoclonais humanos.
Esses anticorpos mono- clonais humanos direcionados contra NKG2A humana podem ser gera- dos usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos por- tando partes do sistema imune humano, em vez do sistema de camun- dongos.
Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos in- cluem camundongos referidos neste documento como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente re- feridos neste documento como “camundongos de Ig humana”. O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglo- bulina de cadeia leve κ e pesada (µ e γ) humana não rearranjada e, juntamente com mutações direcionadas que inativam os loci endógenos de cadeia µ e κ (vide, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474):856-859). Portanto, os camundongos apresentam expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais de IgGκ humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern.
Rev.
Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann.
N.Y.
Acad.
Sci. 764:536- 546). A preparação e uso de camundongos HuMab, e as modificações genômicas feitas por tais camundongos, são ainda descritos em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J.
Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International
Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechno- logy 14: 845-851, todo o conteúdo dos quais é no presente documento especificamente incorporado por referência em sua totalidade. (Vide, também, Patentes dos EUA Nºs. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;
5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e
5.770.429; todos de Lonberg e Kay; Patente dos EUA Nº. 5.545.807 de Surani et al.; Publicação PCT Nº. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todos de Lon- berg e Kay; e Publicação PCT Nº. WO 01/14424 de Korman et al.). Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste docu- mento são criados usando um camundongo que porta sequências de imunoglobulinas humanas em transgenes e transcromossomos, tais como um camundongo que porta um transgene de cadeia pesada hu- mana e um transcromossomo de cadeia leve humana. Tais camundon- gos, referidos neste documento como “camundongos KM”, são descri- tos em detalhes na Publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al. Além disso, sistemas de animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulinas humanas estão disponíveis na técnica e podem ser usados para gerar anticorpos anti-hNKG2A neste documento. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser utilizado; tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nºs. 5.939.598;
6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 de Kucherlapati et al. Além disso, os sistemas de animais transcromossômicos al- ternativos que expressam genes da imunoglobulina humana estão dis- poníveis na técnica e podem ser usados para gerar anticorpos anti- NKG2A descritos neste documento. Por exemplo, camundongos porta- dores de um transcromossomo de cadeia pesada humana e um trans- cromossomo de cadeia leve humana, referidos como “camundongos TC”, podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 97:722-727. Além disso, vacas portadoras de transcromossomos de cadeia leve e pesada humana fo- ram descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para gerar anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento.
Sistemas de camundongo adicionais descritos na técnica de geração de anticorpos humanos, por exemplo, anticorpos anti-hNKG2A humanos, incluem (i) o camundongo VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), em que regiões variáveis de cadeia pesada e leve de camundongos endógenos foram substituídas, via recombinação homóloga, por regiões de variáveis de cadeia pesada e leve humanas, operativamente ligadas às regiões constantes endógenas de camun- dongo, tal que anticorpos quiméricos (V humano/C camundongo) sejam gerados nos camundongos, e posteriormente convertidos em anticorpos totalmente humanos usando técnicas de DNA recombinante padrão; e (ii) o camundongo MeMo® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), em que o camundongo contém regiões variáveis de cadeia pesada humana não reorganizada, mas uma única região variável de cadeia leve comum hu- mana reorganizada.
Tais camundongos, e usos dos mesmos para gerar anticorpos, são descritos, por exemplo, em WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 e US 2012/0073004. Anticorpos monoclonais humanos descritos neste docu- mento também podem ser preparados usando métodos de exibição de fago para triagem de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana.
Esses métodos de exibição de fago para o isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. (Vide, por exemplo, Patentes dos EUA Nº.s 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Ladner et al.; Pa- tentes dos EUA Nº.s 5.427.908 e 5.580.717 para Dower et al.; Patentes dos EUA Nºs 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; e Patentes dos EUA Nºs 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e
6.593.081 para Griffiths et al.). Anticorpos monoclonais humanos descritos neste docu- mento também podem ser preparados usando camundongos com imu- nodeficiência combinada severa (SCID) em que as células imunes hu- manas tenham sido reconstituídas de forma que uma resposta a anti- corpo humano possa ser gerada após a imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nºs. 5.476.996 e
5.698.767 de Wilson et al. Imunizações Para gerar anticorpos totalmente humanos e NKG2A hu- mana, camundongos ou camundongos transgênicos ou transcromossô- micos contendo genes de imunoglobulina humana (por exemplo, ca- mundongos HCo12, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma pre- paração purificada ou enriquecida do antígeno NKG2A e/ou células ex- pressando NKG2A, como descrito para outros antígenos, por exemplo, por Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474):856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 e WO 98/24884. Alternativa- mente, os camundongos podem ser imunizados com DNA codificando NKG2A humana. De preferência, os camundongos terão 6-16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purifi- cada ou enriquecida (por exemplo, 5 µg-50 µg) do antígeno NKG2A hu- mano recombinante pode ser usada para imunizar os camundongos por via intraperitoneal. Se as imunizações utilizando uma preparação purifi- cada ou enriquecida do antígeno NKG2A não resultarem em anticorpos, os camundongos também podem ser imunizados com células expres- sando NKG2A, por exemplo, uma linhagem celular, para promover res- postas imunes.
Os camundongos transgênicos HuMAb podem ser inicial- mente imunizados intraperitonealmente ou subcutaneamente (SC) com antígeno em adjuvante de Ribi, seguido por imunizações IP/SC a cada duas semanas (até um total de 10) com antígeno em adjuvante de Ribi.
A resposta imune pode ser monitorada ao longo do protocolo de imuni- zação com amostras de plasma sendo obtidas por sangramento retro- orbital.
O plasma pode ser rastreado por ELISA e FACS (como descrito abaixo), e camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina hu- mana anti-NKG2A podem ser usados para fusões.
Os camundongos podem ser reforçados por via intravenosa com antígeno três dias antes do sacrifício e remoção do baço e gânglios linfáticos.
Podem ser reali- zadas duas a três fusões para cada imunização.
Entre 6 e 24 camun- dongos podem ser imunizados para cada antígeno.
Em algumas moda- lidades, as cepas HCo7, HCo12 e KM são usadas.
Além disso, os trans- genes HCo7 e HCo12 podem ser cruzados em um único camundongo tendo dois diferentes transgenes de cadeia pesada humana (HCo7/HCo12). Geração de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais para prote- ína NKG2A Para gerar hibridomas produzindo anticorpos monoclonais descritos neste documento, células de esplenócitos e/ou gânglios linfá- ticos de camundongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo.
Os hibridomas resultantes podem ser ava- liados quanto à produção de anticorpos específico de antígeno.
Por exemplo, suspensões de células únicas de linfócitos esplênicos de ca- mundongos imunizados podem ser fundidas a células de mieloma de camundongo não secretoras Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) com PEG 50%. As células são plaqueadas a aproximadamente 2 x 105 em placa de mi-
crotitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas sema- nas em meio seletivo contendo 10% de soro de clone fetal, 18% de meio condicionado “653”, 5% de Origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio em que o HAT é substituído por HT.
As cavidades individuais podem então ser avaliadas por ELISA para anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos.
Uma vez que ocorre a cultura extensa de hibridoma, o meio pode ser observado geralmente após 10-14 dias.
Os hibridomas secretores de anticorpo podem ser pla- queados novamente, avaliados novamente, e, se ainda forem positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante.
Os subclones estáveis podem, então, ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.
Para purificar anticorpos monoclonais, hibridomas seleciona- dos podem ser cultivados em frascos giratórios de dois litros para puri- ficação de anticorpo monoclonal.
Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A- sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verifi- cada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempe- nho para garantir a pureza.
A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80˚C.
VI.
Fabricação de Anticorpo Generação de transfectomas produzindo anticorpos monoclonais para NKG2A
Anticorpos da presente invenção, incluindo tanto os anticor- pos específicos para os quais sequências são fornecidas e outros, anti- corpos anti-NKG2A relacionados, podem ser produzidos em um trans- fectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Por exemplo, para expressar anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, DNAs codificando cadeias pesadas e leves par- ciais ou de comprimento total podem ser obtidos por técnicas padrão de biologia molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse), e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão, de modo que os genes sejam operativamente ligados a sequências de controle trans- cricionais e translacionais.
Nesse contexto, o termo “operativamente li- gado” significa que um gene de anticorpo é ligado a um vetor, tal que sequências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetor tenham a função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo.
O vetor de expressão e sequências de controle de expres- são são escolhidos para serem compatíveis com célula hospedeira de expressão utilizada.
O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou ambos os genes podem ser inseridos no mesmo vetor de expressão.
Os genes de anticorpo são inseridos no(s) vetor(es) de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição comple- mentar no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extre- midade cega se não houver sítios de restrição presentes). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos descritos neste docu- mento podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isótipo de anticorpo, inserindo-os em vetores de ex-
pressão já codificando regiões constantes de cadeia pesada e constan- tes de cadeia leve do isótipo desejado, tal que o segmento de VH seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor, e o seg- mento de VL seja operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor.
Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recom- binante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da ca- deia de anticorpo de uma célula hospedeira.
O gene da cadeia de anti- corpo pode ser clonado no vetor, de modo que o peptídeo sinal seja ligado em quadro ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpo.
O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um pep- tídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não imunoglobulina). Além dos genes da cadeia de anticorpo, vetores de expres- são recombinantes podem conter sequências reguladoras que contro- lam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hos- pedeira.
O termo “sequência reguladora” inclui promotores, potenciado- res, e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpo.
Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology.
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreci- ado por aqueles versados na técnica que o design do vetor de expres- são, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, entre outros fatores.
As sequências reguladoras preferidas para a expressão de células hospedeiras de ma- míferos incluem elementos virais que direcionam níveis elevados de ex- pressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou potenciadores derivados de citomegalovírus (CMV), vírus símio 40
(SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adeno- vírus (AdMLP), e poliomavírus.
Alternativamente, podem ser utilizadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina.
Além disso, elementos reguladores compos- tos de sequências de diferentes fontes, tais como o sistema promotor SRα que contém sequências do promotor inicial SV40 e da repetição terminal longa do vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 (Ta- kebe, Y. et al. (1988) Mol.
Cell.
Biol. 8: 466-472). Além dos genes de cadeia de anticorpo e sequências regu- ladoras, vetores de expressão recombinantes podem portar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes mar- cadores selecionáveis.
O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (vide, por exem- plo, Patentes dos EUA Nº.s 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel et al.). Por exemplo, normalmente o gene marcador selecionável confere resistência o fármacos, tais como G418, higromicina ou meto- trexato, em uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido.
Genes marcadores selecionáveis exemplificativos incluem o gene dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr- com sele- ção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418). Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) ve- tor(es) de expressão codificando as cadeias leves e pesadas é trans- fectado em uma célula hospedeira por técnicas padrão.
As várias for- mas de termo “transfecção” abrangem uma ampla variedade de técni- cas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletropora- ção, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e similares.
Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos descritos neste documento em células hospedeiras procarióticas ou eu- carióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferencialmente células hospedeiras de mamíferos, é a mais preferida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamíferos, são mais prováveis do que as células procarióticas de se reunirem e secretarem um anticorpo devidamente dobrado e imunologicamente ativo.
A expressão procariótica de genes de anticorpo foi relatada como ineficaz para a produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos em cepas de le- vedura geneticamente manipuladas com glicol. (Pichia pastoris.
Li et al. (2006) Nat.
Biotechnol. 24:210). Células hospedeiras de mamífero exemplificativas para ex- pressar os anticorpos recombinantes descritos neste documento in- cluem células CHO (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de dihidrofolato redutase (DHFR), por exem- plo, como descrito em R.J.
Kaufman e P.A.
Sharp (1982) Mol.
Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de ex- pressão exemplificativo é o sistema de expressão de gene GS descrito no WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de ex- pressão recombinantes codificando genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas.
Anticorpos podem ser recupera- dos do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína pa- drão.
Os terminais N- e C- de cadeias polipeptídicas de anticorpo da presente invenção podem diferir da sequência esperada devido a modificações pós-tradução comumente observadas.
Por exemplo, resí- duos de lisina C-terminal estão geralmente ausentes das cadeias pesa- das de anticorpo. (Dick et al. (2008) Biotechnol.
Bioeng. 100:1132). Re- síduos de glutamina N–terminal e, em menor grau, resíduos de gluta- mato, são frequentemente convertidos em resíduos de piroglutamato em cadeias leves e pesadas de anticorpos terapêuticos. (Dick et al. (2007) Biotechnol.
Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J.
Biol.
Chem. 286:11211). Sequências de aminoácido para vários anticorpos anti- hNKG2A da presente invenção são fornecidas na Listagem de Sequên- cias.
Pelas razões discutidas acima, a lisina C-terminal não é incluída em muitas das sequências na Listagem de Sequências para cadeias pesadas ou domínios constantes de cadeia pesada.
No entanto, em uma modalidade alternativa, cada cadeia pesada para os anticorpos anti-hNKG2A da presente invenção, e/ou constructo genético codifi- cando tais anticorpos ou as cadeias pesadas ou leves dos mesmos, in- clui esse resíduo de lisina adicional no C-terminal da(s) cadeia(s) pe- sada(s). VII.
Ensaios Anticorpos descritos neste documento podem ser testados para ligação à NKG2A, por exemplo, por ELISA padrão.
Por exemplo, as placas de microtitulação são revestidas com NKG2A purificado a 1-2 µg/ml em PBS, e então bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino em PBS.
Diluições de anticorpo (por exemplo, diluições de plasma de camundongos imunizados com NKG2A) são adicionadas a cada cavi- dade e incubadas por 1-2 horas a 37ºC.
As placas são lavadas com PBS/Tween e, em seguida, incubadas com reagente secundário (por exemplo, para anticorpos humanos, ou anticorpos de outra forma tendo uma região constante de cadeia pesada humana, um reagente policlo- nal específico para Fc de IgG anti-humano de cabra) conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (HRP) por 1 hora a 37ºC.
Após a lava- gem, as placas são desenvolvidas com substrato ABTS (Moss Inc, pro- duto: ABTS-1000) e analisadas em espectrofotômetro a OD 415-495. Os soros de camundongos imunizados ainda são avaliados por citome- tria de fluxo para ligação a uma linhagem celular que expressa NKG2A humana, mas não para uma linhagem celular de controle que não ex- pressa NKG2A.
Resumidamente, a ligação de anticorpos anti-NKG2A é avaliada pela incubação de NKG2A expressando células CHO com o anticorpo anti-NKG2A na diluição 1:20. As células são lavadas e a liga- ção é detectada com um Ab de IgG anti-humano rotulado com PE.
As análises de citometria de fluxo são realizadas usando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). De preferência, os camundongos que desenvolverem os títulos mais altos serão usados para fusões.
Experimentos análogos podem ser realizados usando an- ticorpos de detecção anticamundongo se anticorpos anti-HNKG2A fo- rem detectados.
Um ELISA, por exemplo, como descrito acima, pode ser usado para analisar anticorpos e, dessa forma, hibridomas que produ- zem que apresentam reatividade positiva com o imunógeno NKG2A.
Os hibridomas que produzem um que se ligam, de preferência com alta afi- nidade, a NKG2A podem então ser subclonados e ainda caracterizados.
Um clone de cada hibridoma, que mantém a reatividade das células pa- rentais (por ELISA), pode então ser escolhido para a produção de um banco de células, e para a purificação de anticorpo.
Para purificar anticorpos anti-NKG2A, hibridomas seleciona- dos podem ser cultivados em frascos giratórios de dois litros para puri- ficação do anticorpo monoclonal.
Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-
sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta eficiência para garantir a pureza.
A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a con- centração pode ser determinada por OD280 usando coeficiente de extin- ção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquo- tas e armazenados a -80 ºC.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-NKG2As selecionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser bioti- nilado usando reagentes disponíveis comercialmente (Pierce, Rockford, IL). A ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda rotulada com estreptavidina.
Estudos de competição usando anticorpos monoclonais não rotulados e anticorpos monoclonais biotinilados po- dem ser realizados usando placas de ELISA revestidas com NKG2A, como descrito acima.
Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, ELISAs de isótipo podem ser realizados usando reagentes específicos para an- ticorpos de um isótipo particular.
Por exemplo, para determinar o isótipo de um anticorpo monoclonal humano, as cavidades das placas de mi- crotitulação podem ser revestidas com 1 µg/ml de imunoglobulina anti- humana durante a noite a 4ºC.
Após bloqueio com BSA a 1%, as placas são reagidas com 1 µg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou isótipos controle purificados, à temperatura ambiente por uma a duas horas.
As cavidades podem, então, ser reagidos com sondas conjuga- das com fosfatase alcalina específica de IgG1 humana ou IgM humana.
As placas são desenvolvidas e analisadas como descrito acima.
Para testar a ligação de anticorpos monoclonais a células vi- vas expressando NKG2A, citometria de fluxo pode ser usada.
Resumi- damente, as linhagens celulares que expressam NKG2A ligada por membrana (cultivadas em condições de cultura padrão) são misturadas com concentrações A de anticorpos monoclonais em PBS contendo
0,1% de BSA a 4ºC por uma hora.
Após a lavagem, as células são rea- gidas com anticorpo anti-IgG rotulado com Ficoeritrina (PE) nas mes- mas condições de coloração do anticorpo primário.
As amostras podem ser analisadas por instrumento FACScan usando propriedades disper- são de luz e lateral para comportar em células individuais, e a ligação dos anticorpos rotulados é determinada.
Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado (além de ou em vez de) o ensaio de citometria de fluxo.
As células podem ser coloridas exata- mente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluores- cência.
Este método permite a visualização de células individuais, mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antí- geno.
Anticorpos anti-hNKG2A podem ser ainda testados quanto à reatividade com o antígeno NKG2A por Western blotting.
Resumida- mente, extratos celulares de células expressando NKG2A podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida.
Após a eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueadas com soro de camundongo 20% e colocados em sonda com os anticorpos monoclo- nais a serem testados.
A ligação de IgG pode ser detectada usando fosfatase alcalina anti-IgG e desenvolvida com comprimidos de subs- trato BCIP/NBT (Sigma Chem.
Co., St.
Louis, MO). Métodos para analisar a afinidade de ligação, reatividade cruzada e cinética de ligação de vários anticopos anti-NKG2A incluem ensaios padrão conhecidos na técnica, por exemplo, análise de Interfe- rometria de Biocamada (BLI) e análise de SPR Biacore usando um ins- trumento Biacore SPR.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A especifica- mente se liga à região extracelular de NKG2A humana.
Em uma moda-
lidade, o anticorpo se liga a um domínio particular (por exemplo, um do- mínio funcional) dentro do domínio extracelular de NKG2A.
Em uma mo- dalidade, o anticorpo anti-hNKG2A especificamente se liga à região ex- tracelular de NKG2A humana e à região extracelular de NKG2A de ci- nomolgo.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A se liga à NKG2A humana com alta afinidade.
VIII.
Moléculas Multiespecíficas Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste docu- mento podem ser moléculas multiespecíficas, por exemplo, biespecífi- cas ou triespecíficas.
Moléculas de ligação ao antígeno multiespecífi- cas, tais como anticorpos multiespecíficos, compreendem dois ou mais sítios de ligação ao antígeno, cada um específico para um epítopo dife- rente.
Os diferentes epítopos podem ser parte do mesmo ou de diferen- tes antígenos.
Em uma modalidade, um sítio de ligação ao antígeno é específico para NKG2A humana e o outro, para um antígeno diferente.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A, ou fragmentos de li- gação ao antígeno do mesmo, como descrito neste documento, é ligado a outra molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou um ligando para um receptor) tendo uma especificidade de ligação dife- rente para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas alvo diferentes.
Em uma modalidade, o anticorpo descrito neste documento é derivatizado ou ligado a mais de uma outra molécula de ligação ao antígeno para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois diferentes sítios de ligação e/ou moléculas alvo.
Por conseguinte, são fornecidas neste documento moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira es- pecificidade de ligação para NKG2A e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo.
Em uma modalidade descrita neste documento, em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação.
Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas descritas neste documento compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab’, F(ab’)2, ou um Fv de cadeia única.
O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um constructo de cadeia única como descrito em Ladner et al.
Patente dos EUA Nº. 4.946.778, o conteúdo da qual é expressamente incorpo- rado por referência.
Embora anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecí- ficas neste documento são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.
As moléculas biespecíficas descritas neste documento po- dem ser preparadas pela conjugação das especificidades de ligação constituintes usando métodos conhecidos na técnica.
Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser ge- rada separadamente e, então, conjugadas entre si.
Quando as especi- ficidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de engajamento ou reticulação pode ser usada para a conjuga- ção covalente.
Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5’-ditio- bis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil 4- (N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J.
Exp.
Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins.
Mitt.
No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J.
Immunol. 139:2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis em Pierce Chemical Co. (Rock- ford, IL). Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados via ligação sulfidril das regiões de dobradiça C- terminal das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular- mente preferida, a região de dobradiça é modificada para conter um nú- mero ímpar de resíduos sulfidrila, preferencialmente um, antes da con- jugação. Alternativamente, ambas as especificidades de ligação po- dem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando uma molécula biespecífica tem uma combinação de especificidades de ligação, tais como uma porteína de fusão (mAb x mAb), (mAb x Fab), (Fab x F(ab’)2) ou (ligando x Fab). Uma molécula biespecífica descrita neste documento pode ser uma molécula de cadeia simples compreen- dendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para a prepa- ração de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Pa- tente dos EUA Número 5.260.203; Patente dos EUA Número 5.455.030; Patente dos EUA Número 4.881.175; Patente dos EUA Número
5.132.405; Patente dos EUA Número 5.091.513; Patente dos EUA Nú- mero 5.476.786; Patente dos EUA Número 5.013.653; Patente dos EUA Número 5.258.498; e Patente dos EUA Número 5.482.858. A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específi- cos pode ser confirmada usando métodos reconhecidos na técnica, tais como usando ELISA, radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular, empregando um reagente ro- tulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de inte- resse.
IX.
Composições São ainda fornecidas composições, por exemplo, composi- ções farmacêuticas, contendo um ou mais anticorpos anti-NKG2A, ou fragmento(s) de ligação ao antígeno dos mesmos, como descrito neste documento, formuladas juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Por conseguinte, as composições da presente invenção in- cluem os anticorpos anti-hNKG2A humanizados ou humanos (ou frag- mentos de ligação ao antígeno dos mesmos) tendo as sequências de CDR, as sequências de região variável de cadeia leve e/ou pesada, ou as sequências de cadeia pesada e/ou leve de comprimento total apre- sentadas neste documento.
Composições da presente invenção tam- bém incluem anticorpos anti-hNKG2A tendo sequências que são vari- antes das sequências apresentadas na Listagem de Sequências.
Por exemplo, tais anticorpos podem compreender sequências que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de CDR, as sequências de região variável de cadeia leve e/ou pesada, ou sequências de cadeia pesada e/ou leve de comprimento total apresentadas na Listagem de Sequências.
Essas composições também podem incluir uma ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas neste documento.
Por exemplo, uma composição farmacêutica descrita neste documento pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjuga- dos ou anticorpos biespecíficos) que se ligam a diferentes epítopos no antígeno alvo ou que têm atividades complementares.
Composições farmacêuticas descritas neste documento também podem ser administradas como terapia de combinação, isto é, anticorpos anti-NKG2A combinados com outros agentes.
Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-NKG2A descrito neste documento combinado com pelo menos um outro agente anticân- cer e/ou de estimulação de células T (por exemplo, ativador). Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combina- ção são descritos em maiores detalhes a seguir, na seção sobre usos dos anticorpos descritos neste documento.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas neste documento podem incluir outros compostos, fármacos e/ou agentes usados para o tratamento de câncer.
Tais compostos, fár- macos e/ou agentes podem incluir, por exemplo, fármacos de quimiote- rapia, fármacos de pequenas moléculas ou anticorpos que estimulem a resposta imune a um determinado câncer.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um primeiro anticorpo es- pecífico para anti-hNKG2A e um segundo anticorpo.
Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo estão presentes na composição em uma dose fixa (isto é, uma proporção fixa). Em outras modalidades, essa dose fixa é entre pelo menos cerca de 1:200 a pelo menos cerca de 200:1, pelo menos cerca de 1:150 a pelo menos cerca de 150:1, pelo menos cerca de 1:100 a pelo menos cerca de 100:1, pelo menos cerca de 1:75 a pelo menos cerca de 75:1, pelo menos cerca de 1:50 a pelo menos cerca de 50:1, pelo menos cerca de 1:25 a pelo menos cerca de 25:1, pelo menos cerca de 1:10 a pelo menos cerca de 10:1, pelo menos cerca de 1:5 a pelo menos cerca de 5:1, pelo menos cerca de 1:4 a pelo menos cerca de 4:1, pelo menos cerca de 1:3 a pelo menos cerca de 3:1, ou pelo menos cerca de 1:2 a pelo menos cerca de 2:1 mg de anticorpo anti- hNKG2A para mg do segundo anticorpo.
Em algumas modalidades, a dose fixa é pelo menos cerca de 1:1, cerca de 1:2, cerca de 1:3, cerca de 1:4, cerca de 1:5, cerca de 1:6, cerca de 1:7, cerca de 1:8, cerca de 1:9, cerca de 1:10, cerca de 1:15, cerca de 1:20, cerca de 1:30, cerca de 1:40, cerca de 1:50, cerca de 1:60, cerca de 1:70, cerca de 1:80, cerca de 1:90, cerca de 1:100, cerca de 1:120, cerca de 1:140, cerca de 1:160, cerca de 1:180, ou cerca de 1:200 de anticorpo anti-hNKG2A para o segundo anticorpo.
Em algumas modalidades, a dose fixa é pelo menos cerca de 2:1, cerca de 3:1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6:1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1, cerca de 10:1, cerca de 15:1, cerca de 20:1, cerca de 30:1, cerca de 40:1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1, cerca de 100:1, cerca de 120:1, cerca de 140:1, cerca de 160:1, cerca de 180:1, ou cerca de 200:1 mg do primeiro anticorpo para mg do segundo anticorpo.
Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A e o segundo anticorpo são administrados como descrito nos Exemplos.
Os anticorpos adicionais incluem, por exemplo, um ou mais de um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti- PD-L1, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-OX40 (também co- nhecido como CD134, TNFRSF4, ACT35 e/ou TXGP1L), um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-CD137, um an- ticorpo anti-CD27, ou um anticorpo anti-CSF-1R.
Como usado neste documento, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotôni- cos e retardadores de absorção, e similares, que sejam fisiologicamente compatíveis.
Em algumas modalidades, o veículo é adequado para ad- ministração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espi- nhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Em algumas modalidades, o veículo é adequado para administração intravenosa.
Em outras modalidades, o veículo é adequado para administração subcutâ-
nea.
Em algumas modalidades, a composição compreendendo anti- corpo anti-NKG2A é entregue por via subcutânea usando a tecnologia de entrega de fármaco ENHANZE® da Halozyme, que inclui uma en- zima hialuronidase humana recombinante (rHuPH20) que degrada tem- porariamente o hialuronano.
Em algumas modalidades, a tecnologia de entrega de fármaco ENHANZE® permite administrações subcutâneas de composições que são mais rápidas em comparação com a adminis- tração intravenosa.
Em outras modalidades, dependendo da via de ad- ministração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou mo- lécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
Os compostos farmacêuticos descritos neste documento po- dem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis.
Um “sal far- maceuticamente aceitável” se refere aa sal que mantém a atividade bi- ológica desejada do composto original e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (vide, por exemplo, Berge, SM, et al. (1977) J.
Pharm.
Sci. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base.
Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorí- drico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e simi- lares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos por fe- nila, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos ali- fáticos e aromáticos, e similares.
Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potás- sio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N’-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloro- procaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.
Uma composição farmacêutica descrita neste documento também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de as- corbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), leci- tina, galato de propila, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.
Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas descritas neste documento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, pro- pilenoglicol, polietilenoglicol e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectá- veis, tais como oleato de etil.
A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
Essas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes.
A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares.
Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúca- res, cloreto de sódio e similares nas composições.
Além disso, a absor- ção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoes- tearato de alumínio e gelatina.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extem- porânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis.
Veículos farma- ceuticamente aceitáveis exemplificativos neste documento ainda in- cluem agentes de dispersão intersticial de fármacos, tais como glicopro- teínas de hialuronidase neutra-ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúvel humana, tais como rHuPH20 (HYLENEX™, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs e métodos de uso exemplificativos, incluindo rHuPH20, são descritos na Publicação de Patente dos EUA Nº.s 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glico- saminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuti- camente ativas é conhecido na técnica.
Exceto na medida em que qual- quer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, o uso dos mesmos nas composições farmacêuticas descritas neste documento é contemplado.
Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento.
A composi- ção pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fár- maco.
O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas adequadas dos mes- mos.
A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensoati- vos.
Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.
A absorção prolongada das composições injetá- veis pode ser obtida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um sol- vente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enume- rados acima, como necessário, seguido por esterilização por microfiltra- ção.
Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles descritos acima.
No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis esté- reis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e cri- odessecação (liofilização) que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.
A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo de adminis- tração específico.
A quantidade de ingrediente ativo que pode ser com- binado com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.
Fora de cem por cento, essa quantidade pode variar de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento do ingrediente ativo, por exemplo, de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, por exemplo, de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento do ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em algumas modalidades, a composição inclui um anticorpo anti-NKG2A, tal como NKG2A.9. A composição é uma solução aquosa isotônica estérila, apirogênica, de uso único, sem conservantes para ad- ministração intravenosa.
A composição pode ser administrada não dilu- ída ou ainda diluída com injeção de cloreto de sódio a 0,9% nas con- centrações de proteína necessárias antes da infusão.
Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-NKG2A inclui os seguintes excipientes: L- histina, cloridrato de L-histidina monohidratado, sacarose, ácido penté- tico (também conhecido como ácido dietilenotriaminapentaaceítico, po- lissorbato 80 e água para injeção.
Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a res- posta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser pro- porcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica.
É especialmente vantajoso formular composi- ções parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de ad- ministração e uniformidade de dosagem.
Forma de dosagem unitária, como usado neste documento, se refere a unidades fisicamente discre- tas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tra- tados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de com- posto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as- sociação com o veículo farmacêutico necessário.
A especificação para as formas de dosagem unitária descritas neste documento é ditada por e diretamente dependente de (a) as características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limita- ções inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
Para administração do anticorpo, a dosagem pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente de 0,01 a 5 mg/kg, de acordo com o peso corporal do hospedeiro.
Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1-10 mg/kg.
Alternativamente, a ad- ministração do anticorpo é uma dose plana que pode variar de 2 mg a 800 mg, por exemplo, uma dose de 25 mg, 80 mg, 200 mg ou 400 mg.
Um regime de tratamento exemplificativo envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses ou uma vez a cada seis meses.
Em algumas modalidades, o regime de tratamento inclui uma dose ini- cial e, em seguida, uma dose de manutenção de uma quantidade de dose diferente em um intervalo de dose intermitente.
Em algumas modalidades, dois ou mais anticorpos monoclo- nais com diferentes especificidades de ligação são administrados simul- taneamente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado fica dentro dos intervalos indicados.
Em algumas modalidades, o anti- corpo terapêutico é administrado em várias ocasiões.
Os intervalos en- tre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanais, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, mensalmente, a cada três meses ou anualmente.
Os intervalos também podem ser irre- gulares, como indicado pela medição dos níveis sanguíneos de anti- corpo para o antígeno alvo no paciente.
Em algumas modalidades, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração plasmática de anti- corpo de cerca de 1-1000 µg/ml e, em alguns métodos, cerca de 25-300 µg/ml.
Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada.
A administração por meio de formulações de liberação sustentada pode exigir uma adminis- tração menos frequente.
A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente.
A dosagem e frequência de ad- ministração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico.
Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo.
Alguns pacientes continuam a receber tra- tamento pelo resto de suas vidas.
Em algumas modalidades, uma do- sagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é adminis- trada para o tratamento terapêutico.
Em algumas modalidades, uma do- sagem relativamente alta é administrada até a progressão da doença ser reduzida ou encerrada, por exemplo, até que o paciente apresente uma melhora parcial ou completa dos sintomas da doença.
Em algumas modalidades, um tratamento profilático é administrado ao paciente após um tratamento terapêutico.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas com- posições farmacêuticas descritas neste documento podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um determinado paci- ente, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o pa- ciente.
O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade empregada das com- posições específicas descritas neste documento, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser utilizado, a duração do tratamento, outras fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paci- ente a ser tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas mé- dicas.
Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de um anticorpo anti-NKG2A descrito neste documento resulta preferencialmente na di- minuição da gravidade dos sintomas da doença, no aumento da fre- quência e na duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou na prevenção da deficiência ou incapacidade devido ao acometimento da doença.
No contexto do câncer, uma dose terapeuticamente eficaz pre- ferencialmente ainda previne a deterioração dos sintomas físicos asso- ciados ao câncer.
Os sintomas de câncer são bem conhecidos na téc- nica e incluem, por exemplo, características incomuns de uma pinta, uma alteração na aparência de uma pinta, incluindo assimetria, borda, cor e/ou diâmetro, uma área de pele recém-pigmentada, uma pinta anor- mal, área escurecida sob as unhas, protuberâncias mamárias, altera- ções nos mamilos, cistos mamários, dor mamária, morte, perda de peso, fraqueza, fadiga excessiva, dificuldade em comer, perda de apetite, tosse crônica, agravamento da falta de ar, tosse com sangue, sangue na urina, sangue nas fezes, náuseas, vômitos, metástases hepáticas, metástases pulmonares, metástases ósseas, plenitude abdominal, in- chaço, fluido na cavidade peritoneal, sangramento vaginal, constipação, distensão abdominal, perfuração do cólon, peritonite aguda (infecção, febre, dor), dor, vômito com sangue, sudorese forte, febre, pressão alta, anemia, diarreia, icterícia, tontura, calafrios, espasmos musculares, me- tástases do cólon, metástases pulmonares, metástases da bexiga, me- tástases hepáticas, metástases ósseas, metástases renais, metástases pancreáticas, dificuldade de engolir, e assim por diante.
A eficácia tera- pêutica pode ser observada imediatamente após a primeira administra- ção de um anticorpo monoclonal anti-hNKG2A da presente invenção, ou pode ser apenas observada após um período de tempo e/ou uma série de doses.
Essa eficácia retardada somente pode ser observada após vários meses de tratamento, por exemplo, até 6, 9 ou 12 meses.
Uma dose terapeuticamente eficaz pode prevenir ou retardar o aparecimento do câncer, tal como pode ser desejada quando presen- tes sinais precoces ou preliminares da doença.
Portanto, qualquer en- saio clínico ou bioquímico que monitore qualquer um dos anteriores pode ser usado para determinar se um tratamento em particular é uma dose terapeuticamente eficaz para tratar o câncer.
Um versado na téc- nica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo e a composição particular ou via de administração selecionada.
Uma composição descrita neste documento pode ser admi- nistrada através de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
Como será apreciado pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.
As vias de administra- ção exemplificativas para anticorpos descritos neste documento incluem as vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intra- peritoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração paren- teral, por exemplo, por injeção ou infusão.
Alternativamente, um anticorpo descrito neste documento pode ser administrado por via não parenteral, tal como via de adminis- tração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasal, oral, va- ginal, retal, sublingual ou tópica.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, tais como formula- ção de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmi- cos e sistemas de entrega microencapsulados.
Polímeros biodegradá- veis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poli- lático.
Muitos métodos para a preparação de tais formulações são pa- tenteados ou geralmente conhecidos pelos versados na técnica.
Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,
J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978. As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma mo- dalidade preferida, uma composição terapêutica descrita neste docu- mento pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodér- mica sem agulha, tal como os dispositivos descritos nas Patentes dos EUA Nºs. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880;
4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem co- nhecidos para uso com anticorpos anti-hNKG2A descritos neste docu- mento incluem: Patente dos EUA Nº. 4.487.603, que descreve uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicamentos a uma taxa controlada; Patente dos EUA Nº. 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente dos EUA Nº. 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicamento para entregar medicamento a uma taxa de infusão pre- cisa; Patente dos EUA Nº. 4.447.224, que descreve um aparelho de in- fusão implantável de fluxo variável para entrega contínua de fármaco; Patente dos EUA Nº. 4.439.196, que descreve um sistema de entrega de fármaco osmótico com compartimentos de múltiplas câmaras; e Pa- tente dos EUA Nº. 4.475.196, que descreve um sistema de entrega de fármaco osmótico. Essas patentes são incorporadas neste documento por referência. Muitos outros implantes, sistemas de entrega e módulos são conhecidos dos versados na técnica. Em certas modalidades, os anticorpos anti-hNKG2A descri- tos neste documento podem ser formulados para garantir a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) ex- clui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os com- postos terapêuticos descritos neste documento cruzem a BBB (se de- sejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, vide, por exemplo, Patentes dos
EUA 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compre- ender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, aumentando assim a entrega direcionada de fármaco (Vide, por exemplo, V.V.
Ranade (1989) J.
Clin.
Pharmacol. 29:685). Porções de direcionamento exemplificativas incluem folato ou biotina (Vide, por exemplo, Patente dos EUA 5.416.016 de Low et al.); manosídeos (Umezawa et al., (1988) Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 153:1038); anticorpos (P.G.
Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M.
Owais et al. (1995) Antimicrob.
Agentes Chemother. 39:180); recep- tor de tensoativo proteína A (Briscoe et al. (1995) Am.
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Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J.
Biol.
Chem. 269:9090); vide também K.
Keinanen; M.L.
Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J.
Killion; I.J.
Fidler (1994) Immunométodos 4:273. Também no escopo descrito neste documento estão kits compreendendo as composições de anticorpo descritas neste docu- mento (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções de uso.
O kit ainda pode conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticor- pos humanos adicionais descritos neste documento.
Os kits podem in- cluir um rótulo indicando o uso pretendido do conteúdo do kit.
O rótulo inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido com o kit, ou que de outra forma acompanhe o kit.
X.
Métodos de Uso Os, anticorpos, composições de anticorpos e métodos des- critos neste documento têm numerosos usos in vitro e in vivo envol- vendo, por exemplo, aumento da resposta imune por bloqueio da inte- ração de NKG2A/HLA-E.
Em uma modalidade, os anticorpos anti- NKG2A descritos neste documento são anticorpos humanos ou huma- nizados monoclonais.
Em uma modalidade, os anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento (por exemplo, 13F3.A4, NKG2A.9 e
NKG2A.11) podem ser administrados a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos para aumentar a imunidade em uma va- riedade de doenças.
Em uma modalidade particular, os anticorpos anti- hNKG2A são anticorpos antagonísticos.
São fornecidos neste docu- mento métodos de modificar uma resposta imune em um indivíduo com- preendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-NKG2A, ou fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, tal que a resposta imune no indivíduo seja aumentada, estimulada ou sobrerregulada.
Em uma modalidade, administrar o anticorpo anti- hNKG2A de acordo com os métodos descritos neste documento au- menta as respostas de células T e/ou células NK.
Em uma modalidade, administrar o anticorpo anti-hNKG2A de acordo com os métodos descri- tos neste documento estimula, aumenta ou sobrerregula as respostas de células T específicas de antígeno a um tumor.
As células T podem ser células Teff, por exemplo, células Teff CD4+, células Teff CD8+, cé- lulas T auxiliares (Th) e células T citotóxicas (Tc). Um tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor líquido, por exemplo, uma malignidade hema- tológica.
Em certas modalidades, um tumor é um tumor imunogênico.
Em certas modalidades, um tumor é não imunogênico.
Em certas mo- dalidades, um tumor é PD-L1 positivo.
Em certas modalidades um tumor é PD-L1 negativo.
Um indivíduo também pode ser um indivíduo portador de vírus e uma resposta imune contra o vírus é aumentada.
Em uma modalidade, administrar o anticorpo anti-hNKG2A de acordo com os métodos descritos neste documento estimula, aumenta ou sobrerregula as respostas de células NK.
Em uma modalidade, os métodos resultam em um aumento de uma resposta imune em um indivíduo humano, em que tal aumento tem um efeito desejável.
Em uma modalidade, o indivíduo humano são pacientes humanos tendo um distúrbio que pode ser tratado pelo au- mento de uma resposta imune, por exemplo, a resposta imune mediada por células T.
Em uma modalidade particular, o paciente humano tem um câncer.
Em uma modalidade, os anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento podem ser administrados juntamente com um antí- geno de interesse ou o antígeno pode já estar presente no indivíduo a ser tratado, por exemplo, um indivíduo portador de tumor ou portador de vírus.
Quando os anticorpos anti-NKG2A são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser administrados separadamente ou simultaneamente.
Além disso, são fornecidos métodos para inibir o crescimento de uma célula tumoral em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-hNKG2A descrito neste documento, tal que o crescimento da célula tumoral seja inibido no indivíduo, tal como um indivíduo humano.
Também são fornecidos métodos de tratamento de infecção viral crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-NKG2A descrito neste documento, tal como a infecção viral crônica seja tratada no indivíduo, tal como um indivíduo humano.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-NKG2A é ad- ministrado a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, como uma terapia adjunta, terapia adjuvante ou terapia neo-adjuvante.
Em al- gumas modalidades, os tratamentos de indivíduos tendo câncer com um anticorpo anti-NKG2A podem levar a uma resposta durável de longo prazo em relação ao padrão de tratamento atual; sobrevida de longo prazo de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos, sobrevida livre de recorrência de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais anos.
Em certas modalidades, o tratamento de um indivíduo tendo cân- cer com um anticorpo anti-hNKG2A previne a recorrência do câncer ou retarda a recorrência do câncer, por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais anos.
Um tratamento com anti-NKG2A pode ser usado como primeira, segunda ou linha de tratamento subsequente.
Esses e outros métodos descritos neste documento são dis- cutidos em detalhes ainda a seguir.
Câncer São fornecidos neste documento métodos para tratar um in- divíduo tendo câncer, compreendendo administrar ao indivíduo um an- ticorpo anti-hNKG2A descrito neste documento, tal que o indivíduo seja tratado, por exemplo, tal que o crescimento de tumores cancerosos seja inibido ou reduzido e/ou que os tumores regridam.
Um anticorpo anti- NKG2A pode ser usado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerosos.
Alternativamente, um anticorpo anti-NKG2A pode ser usado em conjunto com outro agente, por exemplo, outros agentes imu- nogênicos, tratamentos de câncer padrão, ou outros anticorpos, como descrito abaixo.
A combinação com um inibidor de PD-1, tal como um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1, é também fornecido.
A combinação com um inibidor de CTLA-4, tal como um anticorpo anti-CTLA-4, é tam- bém fornecida.
A combinação com um inibidor de PD-1 e um inibidor de CTLA-4 é também fornecida.
A combinação com um anticorpo agonista de ICOS é também fornecida.
Em um aspecto, são fornecidos neste documento métodos de tratar câncer em um indivíduo, compreendendo administrar ao indi- víduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti- NKG2A descrito neste documento.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-NKG2A pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo anti-NKG2A humanizado.
Em uma modalidade, os méto- dos de tratar um câncer descritos neste documento compreendem ad- ministrar um anticorpo anti-NKG2A que contacta NKG2A humana em um ou mais resíduos de aminoácido de: (a) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156); (b) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157); (c) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158); e
(d) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159). Em outra modalidade, os métodos de tratar um câncer des- critos neste documento compreendem administrar um anticorpo anti- NKG2A que contacta NKG2A humana em um ou mais resíduos de ami- noácido de: (a) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156); (b) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157); (c) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158); (d) L; e (e) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159). Em outra modalidade, o método compreende administrar o anticorpo NKG2A.9 para tratar câncer.
Em outra modalidade, o método compreende administrar uma composição compreendendo o anticorpo 13F3.A4 para tratar câncer.
Em outra modalidade, o método compre- ende administrar o anticorpo NKG2A.11 para tratar câncer.
Em outra modalidade, o método compreende administrar uma composição com- preendendo o anticorpo NKG2A.9 para tratar câncer.
Em outra modali- dade, o método compreende administrar uma composição compreen- dendo o anticorpo NKG2A.11 para tratar câncer.
Em outra modalidade, o método compreende administrar o anticorpo 13F3.A4 ou uma variante do mesmo para tratar câncer.
Em outra modalidade, o método compre- ende administrar uma composição compreendendo o anticorpo 13F3.A4 ou uma variante do mesmo para tratar câncer.
Exemplos de câncer incluem, mas sem limitação, carcinoma de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas (SCLC), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), NSCLC esca- moso, glioma, câncer gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carci- noma de células claras), câncer ovariano, câncer de fígado, câncer co- lorretal, câncer endometrial, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarci- noma de próstata refratário hormonal), câncer de tireoide, neuroblas- toma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cân- cer cervical, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon, e câncer (ou carcinoma) de cabeça e pescoço, câncer gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pedi- átrico, exterminador natural sinonasal, melanoma (por exemplo, mela- noma maligno metastático, tal como melanoma maligno cutâneo ou in- traocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer uterino, câncer da re- gião anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de falópio, carci- noma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, câncer da uretra, cân- cer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (CNS), linfoma pri- mário do CNS, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, câncer ce- rebral incluindo glioma de tronco encefálico, adenoma pituitário, sar- coma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, lin- foma de células T, cânceres induzidos pelo meio ambiente incluindo aqueles induzidos por amianto, câncer relacionado a vírus (por exem- plo, tumor relacionado ao vírus do papiloma humano (HPV)) e maligni- dades hematológicas derivadas de qualquer uma das duas principais linhagens de células sanguíneas, isto é, a linhagem celular mieloide (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, macrófagos e mastó- citos) ou linhagem celular linfoide (que produz células B, T, NK e plas- máticas), tais como todos os tipos de leucemias, linfomas e mielomas, por exemplo, leucemias agudas, crônicas, linfocíticas e/ou mielógenas, tais como leucemia aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leu- cemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mielógena crônica (CML),
AML não diferenciada (M0), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mi- eloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou M3 variante [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 ou M4 variante com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leu- cemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico isolado, e clo- roma; linfomas, tais como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmo- citoide, linfoma monocitoide de células B, linfoma de tecido linfoide as- sociado à mucosa (MALT), linfoma de células grandes anaplásico (por exemplo, Ki 1+), linfoma/leucemia de células T adultas, linfoma de célu- las do manto, linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma angio- cêntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma linfoblástico T precursor, linfoblástico T; e linfoma/leu- cemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periférico, linfoma linfoblás- tico, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, linfoma histiocítico ver- dadeiro, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma de der- rame primário, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de gran- des células B, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imunoblástico de grandes células, linfoma linfo- blástico B precursor, linfoma cutâneo de células T (CTLC) (também de- nominado micose fungoide ou síndrome de Sézary), e linfoma linfoplas- mocitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tais como mieloma IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também denominado mieloma indolente), plasmoci- toma solitário, e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crônica (LLC), linfoma de células pilosas; tumores hematopoiéticos de linhagem mie- loide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rab- domiossarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores do sistema ner- voso central e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pig- mentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular de tireoide e te- ratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, por exemplo, tumores de células T e células B, incluindo, mas sem limita- ção, distúrbios de células T, tais como leucemia T-prolinfocítica (T-PLL), incluindo do tipo células pequenas e células cerebriformes; leucemia de linfócitos granulares grandes (LGL), de preferência do tipo células T; linfoma hepatoesplênico a/d T-NHL; linfoma de células T periférico/pós- tímico (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma de células T an- giocêntrico (nasal); câncer de cabeça ou pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como quaisquer combinações dos referidos cânceres.
Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento também podem ser usados para tratamento de cânceres metastáticos, cânceres refratários (por exem- plo, cânceres refratários à imunoterapia anterior, por exemplo, com um anticorpo CTLA-4 e/ou PD-1 de bloqueio), e cânceres recorrentes.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A é adminis- trado em monoterapia.
Em uma modalidade, o anticorpo agonista anti- hNKG2A é administrado como o único agente imunoestimulador.
Em uma modalidade, o anti-hNKG2A é administrado a um paciente com ou- tro agente.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A é adminis- trado com um agente imunogênico.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A é administrado em conjunto com uma vacina contra o cân- cer.
Em algumas modalidades, a vacina do câncer compreende células cancerosas, antígenos tumorais purificados (incluindo proteínas recom- binantes, peptídeos e moléculas de carboidrato), células e células trans- fectadas com genes que codificam citocinas de estímulo imune (He et al. (2004) J.
Immunol. 173:4919-28). Em algumas modalidades, a vacina contra o câncer é uma vacina peptídica contra o câncer, que, em algu- mas modalidades, é uma vacina peptídica personalizada.
Em algumas modalidades, a vacina peptídica contra o câncer é um peptídeo longo multivalente, um multipeptídeo, um coquetel de peptídeo, um peptídeo híbrido ou uma vacina de células dendríticas pulsadas por peptídeo (vide, por exemplo, Yamada et al., Cancer Sci, 104:14-21, 2013). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado em conjunto com um adjuvante.
Exemplos não limitantes de vacinas tumo- rais que são usadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosi- nase, ou células tumorais transfectadas para expressar a citocina GM- CSF.
Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores têm sido concebidas (vide Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Edu- cational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; vide também Restifo, N. e Sznol, M., Cancer Vaccines, Cap. 61, pp. 3023-3043 em DeVita et al. (Eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Quinta Edição). Em uma dessas estratégias, uma vacina é preparada usando células tumorais autólogas ou alogêni- cas.
Essas vacinas celulares demonstraram ser mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF.
O GM- CSF demonstrou ser um potente ativador da apresentação de antígenos para a vacinação tumoral.
Dranoff et al. (1993) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 90:3539-43. Outras vacinas contra o câncer são as proteínas de vírus im- plicados em cânceres humanos, tais como os Vírus do Papiloma Hu- mano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus do Herpes Sar- coma de Kaposi (KHSV). Em algumas modalidades, outra forma de an- tígeno específico do tumor que é usado com a inibição de NKG2A são proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio te- cido tumoral.
Essas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e essas HSPs são altamente eficientes na entrega a células apresentadoras de antígeno para induzir imunidade tumoral (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278: 117-120). Em algumas modalidades, as células dendríticas são poten- tes células apresentadoras de antígeno que são usadas para iniciar res- postas específicas de antígeno.
As células dendríticas podem ser pro- duzidas ex vivo e carregadas com várias proteínas e antígenos de pep- tídeo, bem como extratos de células tumorais (Nestle et al. (1998) Na- ture Medicine 4:328-332). As células dendríticas também podem ser transduzidas por meios genéticos para expressar também esses antí- genos tumorais.
As DCs também foram fundidas diretamente a células tumorais para fins de imunização (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como um método de vacinação, a imunização com células dendríticas pode ser efetivamente combinada com anticorpos anti- NKG2A para ativar (desencadear) respostas antitumorais mais poten- tes.
Em algumas modalidades, um anti-hNKG2A é administrado com tratamento padrão, por exemplo, cirurgia, radiação, e/ou quimiote- rapia.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é adminis- trado com um agente quimioterápico.
Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-hNKG2A é administrado com um ou mais de carboplatina, cisplatina, paclitaxel, nab-paclitaxel, gencitabina ou FOLFOX.
Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado com car- boplatina ou nab-paclitaxel.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado em conjunto com carboplatina e paclitaxel.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado com cisplatina e pemetrexedo.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado com cisplatina e gencitabina.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado com FOLFOX.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado com FOLFIRI.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A é admi- nistrado com dacarbazina para o tratamento de melanoma.
Em algumas modalidades, a cisplatina é administrada por via intravenosa como uma dose de 100 mg/ml uma vez a cada quatro semanas.
Em algumas mo- dalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado com doxorrubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina e cisplatina, carmustina, clorambu- cila, dacarbazina e/ou ciclofosfamida hidroxiureia.
Em algumas modali- dades, a adriamicina é administrada por via intravenosa como uma dose de 60 mg/ml a 75 mg/ml uma vez a cada 21 dias.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A é administrado a um paciente humano que é resistente ao tratamento com pelo menos um fármaco, em que a admi- nistração do anticorpo anti-hNKG2A reduz, alivia ou anula a resistência à pelo menos um fármaco.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti- hNKG2A é administrado com um anticorpo agonista, tal como um anti- corpo anti-ICOS.
As terapias de combinação descritas acima podem ser ad- ministradas em várias combinações entre si, e abrangem a administra- ção combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão inclu- ídos nas mesmas ou em formulações separadas), e administração se- parada, nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante.
Os anticorpos da invenção tam- bém podem ser usados em combinação com radioterapia.
Em algumas modalidades, outro exemplo de tal combinação é um anticorpo anti-hNKG2A administrado em combinação com inter- leucina-2 (IL-2). Em algumas modalidades, a combinação de anticorpo anti-hNKG2A e IL-2 é para tratar vários cânceres, incluindo o tratamento de carcinoma de células renais e melanoma.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hNKG2A discutidos neste documento são combina- dos com um agonista da via de IL-2 para tratar vários cânceres.
A com- binação inclui vários agonistas da via de IL-2, tais como aqueles descri- tos no WO 2012/065086 (Nektar Therapeutics) e WO 2015/125159 (Nektar Therapeutics), o conteúdo dos quais é incorporado por referên- cia em sua totalidade.
O WO 2006/138572 (Nektar Therapeutics) ofe- rece conjugados tendo uma ligação degradável e reagentes poliméricos úteis na preparação de tais conjugados, bem como métodos de prepa- ração de reagentes e conjugados poliméricos, e é incorporado por refe- rência na sua totalidade.
Em algumas modalidades, a combinação de um anticorpo anti-hNKG2A como descrito neste documento, tal como anticorpos NKG2A.9, NKG2A.11 ou 13F3.A4, e um agonista da via de IL-2, tal como NKTR-214, é administrada a pacientes para tratar câncer.
Como descrito em mais detalhes abaixo, NKTR-214 é produzido conjugando em média cerca de seis reagentes de polietileno glicol(PEG) à base de FMOC (cloreto de fluorenilmetiloxicarbonil) tendo a seguinte estrutura (derivado de mPEG2-C2-fomc-20K-N-Hidroxissuccinimidato, 20 kDa, (“mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS”):
a uma proteína tendo a seguinte sequência de 132 aminoácidos: PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEE 60
ELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW 120
ITFSQSIISTLT 132 (SEQ ID NO: 161)
O WO 2012/065086 fornece conjugados de uma porção IL-2 e um ou mais polímeros não peptídicos, solúveis em água, incluindo polietilenoglicol ou um derivado dos mesmos. Especificamente, o Exem- plo 2 (parágrafos 202-204) do WO 2012/065086 descreve a PEGuilação de rIL-2 com mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS para resultar na estrutura mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS estabelecida acima. O Exemplo 1 (parágra- fos 63-66) do WO 2015/125159 descreve uma abordagem ampliada para PEGuilar IL-2 com mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS que resulta em RSLAIL-2 (NKTR-214). NKTR-214 é uma citocina que é geneticamente manipulada para atingir CD122, (também conhecido como subunidade beta do receptor de interleucina-2, IL-2Rβ), uma proteína encontrada em certas células do sistema imune (por exemplo, células T CD8+ e células NK), para expandir essas células para promover seus efeitos antitumorais. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A é ad- ministrado em combinação com um agente antiangiogênico. Outras terapias de combinação que podem resultar em si- nergia com os anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento atra- vés da morte celular são radiação, cirurgia e privação de hormônio. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hNKG2A des- critos neste documento são administrados em conjunto com anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos podem ser usados para direcio- nar dois antígenos diferentes. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hNKG2A são usados em combinação com anticorpos biespecíficos que têm como alvo células efetoras expressando receptor Fcα ou Fcγ para tratar células tumorais (vide, por exemplo, Patentes dos EUA Nºs.
5.922.845 e 5.837.243). Por exemplo, anticorpos biespecíficos de re- ceptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por exemplo, Her-2/neu) foram usa- dos para macrófagos alvo em sítios de tumor. Em algumas modalida- des, o braço de células T dessas respostas é aumentado pela atividade funcional do anticorpo anti-hNKG2A.
Em algumas modalidades, o antí- geno é entregue diretamente às DCs pelo uso de anticorpos biespecífi- cos que se ligam a um antígeno tumoral e um marcador de superfície celular específico de células dendríticas.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-hNKG2A são usados em combinação com anticorpos que reduzem ou inativam as proteínas imunossupressoras expressas por um tumor, por exemplo, anticorpos anti-TGF-β, anticorpos anti-IL- 10, e anticorpos de ligando anti-Fas.
Doenças Infecciosas Em outro aspecto, a invenção descrita neste documento for- nece um método de tratamento de uma doença infecciosa em um indi- víduo, incluindo um indivíduo humano, compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-hNKG2A, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, tal que o indivíduo seja tratado para as doenças infec- ciosas.
Em outras modalidades, o anticorpo anti-NKG2A é um anticorpo quimérico ou humanizado.
Similar ao seu tratamento de tumores, como discutido neste documento, anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento podem ser administrados sozinhos, ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para aumentar a resposta imune a patógenos, toxinas e autoantígenos, incluindo tratar infecções virais crônicas.
Exemplos de patógenos para os quais esta abordagem terapêutica pode ser particu- larmente útila, incluem patógenos para os quais atualmente não exista vacina eficaz, ou patógenos para os quais as vacinas convencionais se- jam menos do que completamente eficazes.
Esses patógenos incluem, mas sem limitação, HIV, hepatite (A, B e C), influenza, herpes, giárdia, malária, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerugi- nosa.
Exemplos de vírus patogênicos que causam infecções tratá- veis por métodos descritos neste documento incluem HIV, hepatite (A,
B, ou C), vírus do herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II e CMV, Vírus Epstein-Barr), adenovírus, vírus influenza, flavivírus, echo- vírus, rinovírus, vírus de coxsackie, coronavírus, vírus sincicial respira- tório, vírus da caxumba, rotavírus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus da vacínia, vírus HTLV, vírus da dengue, vírus do pa- piloma, vírus do molusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus da encefalite arboviral.
Exemplos de bactérias patogênicas que causam infecções tratáveis por métodos descritos neste documento incluem clamídia, bac- térias rickettsiais, micobactérias, estafilococos, estreptococos, pneumo- nococos, meningococos e gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionela, difteria, cólera, tétano, botulismo, antraz, praga, leptospirose, e bactérias da doença de Lyme.
Exemplos de fungos patogênicos que causam infecções tra- táveis pelos métodos descritos neste documento incluem Candida (albi- cans, krusei, glabrata, tropicalis etc.), Cryptococcus neoformans, Asper- gillus (fumigatus, niger etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizo- pus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Exemplos de parasitas patogênicos que causam infecções tratáveis pelos métodos descritos neste documento incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giar- dia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vi- vax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leish- mania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.
Os métodos descritos neste documento de administrar anti- corpos anti-hNKG2A a um indivíduo podem ser combinados com outra forma de imunoterapia, tal como tratamento com citocina (por exemplo, interferons, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ou terapia com anticorpo biespecí- fico, que fornece apresentação aumentada de antígenos tumorais (Vide,
por exemplo, Holliger (1993) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123). Reações Autoimunes Em alguns aspectos, anticorpos anti-NKG2A aumentam as respostas autoimunes.
A indução de respostas antitumorais usando va- cinas de peptídeo e célula tumoral revela que muitas respostas antitu- morais envolvem anti-autorreatividades (van Elsas et al. (2001) J.
Exp.
Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 96:2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J.
Im- munother Emphasis Tumor Immunol 19 (1):81-4). Portanto, anticorpos anti-NKG2A são usados com várias proteínas próprias para desenvolver protocolos de vacinação para eficientemente gerar respostas imunes contra essas proteínas próprias para o tratamento de doenças.
Por exemplo, a doença de Alzheimer envolve a acumulação inadequada de peptídeo Aβ em depósitos amiloides no cérebro; as respostas de anti- corpos contra amiloide são capazes de limpar esses depósitos de ami- loide (Schenk et al., (1999) Nature 400:173-177). Outras proteínas próprias também podem ser utilizadas como alvos, tais como IgE para o tratamento de alergia e asma, e TNF- α para artrite reumatoide.
Finalmente, as respostas de anticorpo a vários hormônios podem ser induzidas pelo uso de anticorpos anti-NKG2A.
As respostas neutralizantes de anticorpo a hormônios reprodutivos podem ser usadas para a contracepção.
A resposta neutralizante de anticorpo a hormônios e outros fatores solúveis necessários ao crescimento de determinados tumores são alvos adicionais da vacinação.
Métodos análogos aos descritos acima para o uso de anti- corpos anti-NKG2A podem ser usados para indução de respostas autoi- munes terapêuticas para tratar pacientes tendo um acúmulo inade- quado de outros autoantígenos, tais como depósitos amiloides, inclu- indo Αβ na doença de Alzheimer, citocinas, tais como TNF-α, e IgE.
Vacinas Em alguns aspectos, anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento são usados para estimular respostas imunes específicas de antígeno administrando um anticorpo anti-NKG2A juntamente com um antígeno de interesse (por exemplo, uma vacina). Por conseguinte, são fornecidos neste documento métodos de potencializar uma resposta imune a um antígeno em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo: (i) o antígeno; e (ii) um anticorpo anti-NKG2A, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal que uma resposta imune ao antí- geno no indivíduo é aumentada.
O anticorpo pode ser um anticorpo hu- mano anti-NKG2A humana (tal como qualquer um dos anticorpos hu- manos anti-NKG2A descritos neste documento). Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-NKG2A é um anticorpo quimérico ou humanizado.
O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno de um patógeno.
Exem- plos não limitantes de tais antígenos incluem aqueles discutidos nas se- ções neste documento, tais como os antígenos tumorais (ou vacinas tumorais) discutidos neste documento, ou antígenos dos vírus, bactérias ou outros patógenos descritos neste documento.
Em certas modalidades, um peptídeo ou proteína de fusão compreendendo o epítopo a que um anticorpo anti-NKG2A liga é usado como uma vacina em vez de, ou em adição a, um anticorpo anti-NKG2A.
Vias adequadas de administrar as composições de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespe- cíficas e biespecíficas e imunoconjugados) descritas neste documento in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser seleciona- das por aqueles versados na técnica.
Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por via intravenosa ou subcutânea.
As dosagens adequadas da composição utilizada dependerão da idade e do peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composi- ção de anticorpo.
Como descrito anteriormente, os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento podem ser coadministrados com um ou ou- tros mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor.
O anticorpo anti- NKG2A pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separadamente do agente.
Neste último caso (admi- nistração separada), o anticorpo anti-NKG2A pode ser administrado an- tes, depois ou simultaneamente ao agente ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, quimioterapia e/ou radiação.
Tais agentes terapêuticos in- cluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina e cisplatina, carmustina, clorambu- cila, dacarbazina e ciclofosfamida hidroxiureia que, por si só, são efica- zes apenas em níveis que são tóxicos ou subtóxicos para um paciente.
A cisplatina é administrada por via intravenosa na dose de 100 mg/ml uma vez a cada quatro semanas, e a adriamicina é administrada por via intravenosa na dose de 60-75 mg/ml uma vez a cada 21 dias.
A coad- ministração de anticorpos anti-NKG2A, ou fragmentos de ligação ao an- tígeno dos mesmos, descritos neste documento com agentes quimiote- rápicos fornece dois agentes anticâncer que atuam por meio de diferen- tes mecanismos para produzir um efeito citotóxico a células tumorais humanas.
Essa coadministração pode resolver problemas devido ao de- senvolvimento de resistência o fármacos ou uma alteração na antigeni- cidade das células tumorais, que as tornaria não reativas com o anti- corpo.
Também no escopo descrito neste documento estão kits compreendendo as composições de anticorpo descritas neste docu- mento (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções de uso.
O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticor- pos anti-NKG2A humanos adicionais descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno NKG2A distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits normalmente incluem um rótulo indicando o uso pre- tendido do conteúdo do kit.
O termo rótulo inclui qualquer material es- crito ou gravado fornecido com o kit, ou que de outra forma acompanha o kit.
Terapias de Combinação Em um aspecto, são fornecidos neste documento métodos de terapia de combinação, por exemplo, para o tratamento de câncer, em que um anticorpo anti-hNKG2A é administrado em conexão com um ou mais agentes adicionais, por exemplo, anticorpos, que são eficazes para estimular respostas imunes para, dessa forma, ainda aumentar, estimular ou sobrerregular respostas imunes em um indivíduo, incluindo um indivíduo humano.
São fornecidos neste documento métodos para tratar ou retardar a progressão de câncer em um indivíduo compreen- dendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-hNKG2A (por exem- plo, NKG2A.9, NKG2A.11 e 13F3.A4) em conjunto com outro agente anticâncer ou terapia de câncer.
Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-hNKG2A pode ser administrado em conjunto com uma quimi- oterapia ou agente quimioterápico ou com uma radioterapia ou agente radioterápico, como descrito acima.
Em algumas modalidades, um anti- corpo anti-hNKG2A pode ser administrado em conjunto com um anti- corpo agonista, tal como anticorpo anti-hICOS.
Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-hNKG2A pode ser administrado em conjunto com uma terapia direcionada ou agente terapêutico direcionado.
Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A pode ser administrado em conjunto com uma imunoterapia ou agente imunoterápico, por exem- plo, um anticorpo monoclonal.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hNKG2A des- crito neste documento pode ser combinado com (i) um agonista de outro receptor coestimulador e/ou (ii) um antagonista de um sinal inibidor em células T.
Em algumas modalidades, uma terapia de combinação com- preendendo um anticorpo anti-hNKG2A e o agonista e/ou antagonista resulta em uma resposta de células T específica de antígeno aumentada em um indivíduo.
Em algumas modalidades, anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento podem ser administrados em conjunto com um agente que tem como alvo moléculas coestimuladoras e coinibido- ras que são um membro da superfamília das imunoglobulinas (IgSF) para aumentar uma resposta imune.
Em algumas modalidades, anticor- pos anti-hNKG2A descritos neste documento podem ser administrados em conjunto com um agente que tem como alvo um ligando de uma molécula coestimuladora ou coinibidora.
Uma família de ligando ligados à membrana que se ligam a receptores coestimuladores ou coinibidores é a família B7, que inclui B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), e B7-H6. Outra família de ligandos ligados à membrana que se ligam a receptores coestimula- dores ou coinibidores é a família TNF de moléculas que se ligam a mem- bros cognatos da família de receptores de TNF, que incluem CD40, CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137/4-1BB, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRILA, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Lym- photoxin α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, Linfotoxina α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR.
Em outro aspecto, anticorpos anti-hNKG2A podem ser usa- dos em combinação com antagonistas de citocinas que inibem ativação de células T (por exemplo, IL-6, IL-10, TGF-ß, VEGF; ou outras “citoci- nas imunossupressoras,” ou citocinas que estimulam a ativação de cé- lulas T, para estimular uma resposta imune, por exemplo, para tratar doenças proliferativas, tais como câncer.
Em um aspecto, respostas de células T são estimuladas por uma combinação de um anticorpo anti-hNKG2A descrito neste docu- mento e um ou mais de (i) um antagonista de uma proteína que inibe a ativação de células T (por exemplo, inibidores de pontos de verificação imunes), tais como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galec- tina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, e TIM-4, e (ii) um ago- nista de uma proteína que estimula ativação de células T, tal como B7- 1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD40, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, DR3 e CD28H.
Agentes exemplificativos que modulam uma das proteínas acima e podem ser combinados com anti-hNKG2A, por exemplo, aque- les descritos neste documento, para tratar câncer, incluem: YER- VOY®/ipilimumab ou tremelimumab (para CTLA-4), galiximab (para B7,1), BMS-936558 (para PD-1), pidilizumab/CT-011 (para PD-1), KEYTRUDA®/pembrolizumab/MK-3475 (para PD-1), AMP224 (para B7-DC/PD-L2), BMS-936559 (para B7-H1), MPDL3280A (para B7-H1), CP-870893 ou dacetuzumab/SGN-40 (CD40 – Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J.
Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin.
Cancer Res. 19:1035), AMG557 (para B7H2), MGA271 (para B7H3 – WO 11/109400), IMP321 (para LAG-3), urelumab/BMS-663513 e PF- 05082566 (para CD137/4-1BB), varlilumab/CDX-1127 (para CD27), MEDI-6383 e MEDI-6469 (para OX40), RG-7888 (para OX40L – WO
06/029879), Atacicept (para TACI), muromonab-CD3 (para CD3), ipi- lumumab (para CTLA-4). Por conseguinte, em uma modalidade, um an- ticorpo anti-hNKG2A (tal como NKG2A.9) é combinado com um anti- corpo anti-PD-1 (tal como nivolumab) e/ou um anticorpo anti-CTLA-4 (tal como ipilimumab). Outras moléculas que podem ser combinadas com anticor- pos anti-hNKG2A para o tratamento de câncer incluem antagonistas de receptores inibidores em células NK ou agonistas de receptores de ati- vação em células NK.
Por exemplo, anticorpos anti-hNKG2A podem ser combinados com antagonistas de KIR (por exemplo, lirilumab). Ainda outros agentes para terapias de combinação incluem agentes que inibem ou depletam macrófagos ou monócitos, incluindo, mas sem limitação, antagonistas CSF-1R, tais como anticorpos antago- nistas CSF-1R incluindo RG7155 (WO 11/70024, WO 11/107553, WO 11/131407, WO 13/87699, WO 13/119716, WO 13/132044) ou FPA-008 (WO 11/140249; WO 13/169264; WO 14/036357). Em algumas modalidades, anticorpos anti-hNKG2A descri- tos neste documento são usados em conjunto com um ou mais de agen- tes agonísticos que ligam coestimuladores receptores positivos, bloque- ando agentes que atenuam a sinalização através de receptores inibido- res, e um ou mais agentes que aumentam sistemicamente a frequência de células T antitumorais, agentes que ultrapassam vias imunossupres- soras imunes distintas dentro do microambiente tumoral (por exemplo, bloqueiam engajamento de receptor inibidor (por exemplo, interações PD-L1/PD-1), depletam ou inibem Tregs (por exemplo, usando um anti- corpo monoclonal anti-CD25 (por exemplo, daclizumab) ou por deple- ção de esferas anti-CD25 ex vivo), inibem enzimas metabólicas, tais como IDO, ou revertem/previnem anergia e/ou exaustão de células T) e agentes que desencadeiam ativação imune inata e/ou inflamação em sítios tumorais.
São fornecidos neste documento métodos para estimular uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo anti-hNKG2A e um ou mais anticorpos adicionais imunoestimuladores, tais como um antagonista PD-1, por exemplo, an- ticorpo antagonista, um antagonista PD-L1, por exemplo, anticorpo an- tagonista, um antagonista CTLA-4, por exemplo, anticorpo antagonista e/ou um antagonista LAG3, por exemplo, um anticorpo antagonista, tal que uma resposta imune seja estimulada no indivíduo, por exemplo para inibir crescimento tumoral ou para estimular uma resposta antiviral. Em uma modalidade, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti- hNKG2A e um anticorpo antagonista anti-PD-1. Em uma modalidade, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-hNKG2A e um anticorpo antagonista anti-PD-L1. Em uma modalidade, ao indivíduo é adminis- trado um anticorpo anti-hNKG2A e um anticorpo antagonista anti-CTLA-
4. Em uma modalidade, o pelo menos um anticorpo imunoestimulador adicional (por exemplo, um antagonista anti-PD-1, um antagonista anti- PD-L1, um antagonista anti-CTLA-4 e/ou um anticorpoantagonista anti- LAG3) é um anticorpo humano. Alternativamente, o pelo menos um an- ticorpo imunoestimulador adicional pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado a partir de um anti- corpo anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 e/ou anti-LAG3 de camun- dongo ou hamster). São fornecidos neste documento métodos para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo admi- nistrar um anticorpo anti-hNKG2A e um antagonista PD-1 anticorpo a um indivíduo. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) ou câncer colorretal (CRC). Em al- gumas modalidades, o câncer é caracterizado por tumores com (i) níveis elevados de HLA-E; e/ou (ii) carga de mutação tumoral mais alta. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hNKG2A é administrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-1 é administrado em uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados em uma dose subterapêu- tica.
São também fornecidos neste documento métodos para alterar um evento adverso associado com tratamento de uma doença hiperprolife- rativa com um agente imunoestimulador.
Em uma modalidade, o método compreende administrar um anticorpo anti-hNKG2A e uma dose subte- rapêutica de anticorpo anti-PD-1 a um indivíduo.
Em algumas modalida- des, o indivíduo é um ser humano.
Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-PD-1 é um anticorpo monoclonal humano.
Em algumas modalidades, anticorpos anti-PD-1 que são co- nhecidos na técnica são usados nos métodos presentemente descritos em combinação com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste docu- mento.
Vários anticorpos humanos monoclonais que se ligam especifi- camente a PD-1 com alta afinidade foram descritos na Patente dos EUA Nº. 8.008.449. Anticorpos anti-PD-1 humanos descritos na Patente dos EUA Nº. 8.008.449 demonstraram apresentar uma ou mais das seguin- tes características: (a) ligam-se a PD-1 humano com uma KD de 1 x 10- 7 M ou menos, como determinado por ressonância de plasmons de su- perfície usando um sistema de biossensor Biacore; (b) não se ligam substancialmente a CD28, CTLA-4 ou ICOS humano; (c) aumentam pro- liferação de células T em um ensaio de Reação Mista Linfocitária (MLR); (d) aumentam a produção de interferon-γ em um ensaio MLR; (e) au- mentam a secreção de IL-2 em um ensaio MLR; (f) ligam-se a PD-1 humano e PD-1 de macaco cinomolgo; (g) inibem a ligação de PD-L1 e/ou PD-L2 a PD-1; (h) estimulam respostas de memória específicas de antígeno; (i) estimulam respostas de anticorpo; e (j) inibem crescimento de células tumorais in vivo.
Anticorpos anti-PD-1 utilizáveis na presente invenção incluem anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a PD-1 humano e apresentam pelo menos uma, em algumas modalida- des, pelo menos cinco, das características acima.
Outros anticorpos anti-PD-1 monoclonais foram descritos, por exemplo, em Patentes dos EUA Nºs. 6.808.710, 7.488.802,
8.168.757 e 8.354.509, Publicação US Nº. 2016/0272708, e Publicação PCT Nº. WO 2012/145493, WO 2008/156712, WO 2015/112900, WO 2012/145493, WO 2015/112800, WO 2014/206107, WO 2015/35606, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2017/020291, WO 2017/020858, WO 2016/197367, WO 2017/024515, WO 2017/025051, WO 2017/123557, WO 2016/106159, WO 2014/194302, WO 2017/040790, WO 2017/133540, WO 2017/132827, WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/106061, WO 2017/19846, WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, e WO 2017/133540 cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab (também conhecido como OPDIVO®, 5C4, BMS-936558, MDX-1106, e ONO-4538), pembrolizumab (Merck; também conhecido como KEYTRUDA®, lambrolizumab, e MK-3475; vide WO2008/156712), PDR001 (Novartis; vide WO 2015/112900), MEDI-0680 (AstraZeneca; também conhecido como AMP-514; vide WO 2012/145493), cemiplimab (Regeneron; também conhecido como REGN-2810; vide WO 2015/112800), JS001 (TAIZHOU JUNSHI PHARMA; vide Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)), BGB-A317 (Beigene; vide WO 2015/35606 e US 2015/0079109), INCSHR1210 (Jiangsu Hengrui Me- dicine; também conhecido como SHR-1210; vide WO 2015/085847; Si- Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)), TSR-042 (Tesaro Biopharmaceutical; também conhecido como ANB011; vide WO2014/179664), GLS-010 (Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals; tam- bém conhecido como WBP3055; vide Si-Yang Liu et al., J. Hematol. On- col. 10:136 (2017)), AM-0001 (Armo), STI-1110 (Sorrento Therapeutics; vide WO 2014/194302), AGEN2034 (Agenus; vide WO 2017/040790), MGA012 (Macrogenics, vide WO 2017/19846), ou IBI308 (Innovent;
vide WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, e WO 2017/133540). Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab. Ni- volumab é um anticorpo inibidor de ponto de verificação imune PD-1 de IgG4 (S228P) totalmente humano que seletivamente previne a interação com ligandos de PD-1 (PD-L1 e PD-L2), bloqueando assim a sub-regu- lação de funções de células T antitumor (Patente dos EUA Nº.
8.008.449; Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56). Em outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizu- mab. Pembrolizumab é um anticorpo IgG4 (S228P) monoclonal huma- nizado direcionado contra PD-1 de receptor de superfície celular hu- mana (morte programada-1 ou morte celular programada-1). Pembroli- zumab é descrito, por exemplo, na Patente dos EUA Nºs. 8.354.509 e
8.900.587. Anticorpos anti-PD-1 utilizáveis nos métodos descritos tam- bém incluem anticorpos isolados que se ligam especificamente a PD-1 humano e competem de forma cruzada para ligação a PD-1 humano com qualquer anticorpo anti-PD-1 descrito neste documento, por exem- plo, nivolumab (vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº. 8.008.449 e
8.779.105; WO 2013/173223). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 liga o mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti- PD-1 descritos neste documento, por exemplo, nivolumab. A capaci- dade de anticorpos competirem de forma cruzada para ligação a um antígeno indica que esses anticorpos monoclonais se ligam à mesma região de epítopo do antígeno e estericamente impedem a ligação de outros anticorpos de competição cruzada àquela região de epítopo em particular. Espera-se que esses anticorpos de competição cruzada te- nham propriedades funcionais muito similares às do anticorpo de refe- rência, por exemplo, nivolumab, em virtude de sua ligação à mesma re- gião de epítopo de PD-1. Anticorpos de competição cruzada podem ser prontamente identificados com base em sua capacidade de competir de forma cruzada com nivolumab em ensaios de ligação de PD-1 padrão, tais como análise Biacore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo (vide, por exemplo, WO 2013/173223). Em certas modalidades, os anticorpos que competem de forma cruzada para ligação a PD-1 humano com, ou se ligam à mesma região de epítopo do anticorpo PD-1 humano, nivolumab, são anticorpos monoclonais.
Para administração a indivíduos humanos, esses anticor- pos de competição cruzada são anticorpos quiméricos, anticorpos ge- neticamente manipulados, ou anticorpos humanizados ou humanos.
Tais anticorpos monoclonais quiméricos, geneticamente manipulados, humanos ou humanizados podem ser preparados e isolados por méto- dos bem conhecidos na técnica.
Anticorpos anti-PD-1 utilizáveis nos métodos da invenção descrita também incluem porções de ligação ao antígeno dos anticorpos acima.
Demonstrou-se amplamente que a função de ligação ao antí- geno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anti- corpo de comprimento total.
Anticorpos anti-PD-1 adequados para uso nos métodos ou composições descritos são anticorpos que se ligam a PD-1 com alta especificidade e afinidade, bloqueiam a ligação de PD-L1 e ou PD-L2, e inibem o efeito imunossupressor da via de sinalização de PD-1. Em qualquer um das composições ou métodos descritos neste documento, um “anticorpo” anti-PD-1 inclui uma porção de ligação ao antígeno ou fragmento que se liga ao receptor PD-1 e apresenta as propriedades funcionais similares àqueles de anticorpos inteiros na inibição da ligação de ligandos e sobrerregulação do sistema imune.
Em certas modalida- des, o anticorpo anti-PD-1 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compete de forma cruzada com nivolumab para ligação a PD-1 humano.
São fornecidos neste documento métodos para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo admi- nistrar um anticorpo anti-hNKG2A e um anticorpo PD-L1 antagonista a um indivíduo.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-hNKG2A é admi- nistrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-L1 é admi- nistrado em uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica.
São fornecidos neste documento métodos para alterar um evento adverso associado com tratamento de uma do- ença hiperproliferativa com um agente imunoestimulador, compreen- dendo administrar um anticorpo anti-NKG2A e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-PD-L1 a um indivíduo.
Em certas modalidades, o indi- víduo é um ser humano.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 é um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anticorpo anti- hNKG2A é um anticorpo monoclonal humanizado, tal como um anti- corpo compreendendo as CDRs ou regiões variáveis dos anticorpos descritos neste documento.
Anticorpos anti-PD-L1 que são conhecidos na técnica podem ser usados nos métodos da presente invenção.
Exemplos de anticorpos anti-PD-L1 úteis nos métodos da presente invenção incluem os anticor- pos descritos na Patente dos EUA Nº. 9.580.507. Anticorpos anti-PD-L1 humanos monoclonais descritos na Patente dos EUA Nº. 9.580.507 de- monstraram apresentar uma ou mais das seguintes características: (a) ligam-se a PD-L1 humano com uma KD de 1 x 10-7 M ou menos, como determinado por SPR usando um sistema de biossensor Biacore; (b) aumentam a proliferação de células T em um ensaio de Reação Mista Linfocitária (MLR); (c) aumentam a produção de interferon-γ em um en- saio MLR; (d) aumentam a secreção de IL-2 em um ensaio MLR; (e) estimulam respostas de anticorpo; e (f) revertem o efeito de células T reguladoras em células T efetoras e/ou células dendríticas.
Anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis na presente invenção incluem anticorpos mono- clonais que se ligam especificamente a PD-L1 humano e apresentam pelo menos uma, em algumas modalidades, pelo menos cinco, das ca- racterísticas acima.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é BMS- 936559 (também conhecido como 12A4, MDX-1105; vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº. 7.943.743 e WO 2013/173223), atezolizumab (Ro- che; também conhecido como TECENTRIQ®; MPDL3280A, RG7446; vide US 8.217.149; vide, também, Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000), durvalumab (AstraZeneca; também conhecido como IMFINZI™, MEDI-4736; vide WO 2011/066389), avelumab (Pfizer; tam- bém conhecido como BAVENCIO®, MSB-0010718C; vide WO 2013/079174), STI-1014 (Sorrento; vide WO2013/181634), CX-072 (Cytomx; vide WO2016/149201), KN035 (3D Med/Alphamab; vide Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017), LY3300054 (Eli Lilly Co.; vide, por exemplo, WO 2017/034916), ou CK-301 (Ponto de verificação Therapeutics; vide Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)). Em certas modalidades, o anticorpo PD-L1 é atezolizumab (TECENTRIQ®). Atezolizumab é um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal IgG1 totalmente humanizado.
Em certas modalidades, o anticorpo PD-L1 é durvalumab (IMFINZI™). Durvalumab é um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal kapa IgG1 humano.
Em certas modalidades, o anticorpo PD-L1 é avelumab (BA- VENCIO®). Avelumab é um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal lambda IgG1 humano.
Em outras modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 monoclonal é 28-8, 28-1, 28-12, 29-8, 5H1, ou qualquer combinação dos mesmos.
Anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis nos métodos descritos tam- bém incluem anticorpos isolados que se ligam especificamente a PD-L1 humano e competem de forma cruzada para ligação a PD-L1 humano com qualquer anticorpo anti-PD-L1 descrito neste documento, por exemplo, atezolizumab, durvalumab e/ou avelumab.
Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-PD-L1 liga o mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 descritos neste documento, por exemplo, atezolizumab, durvalumab, e/ou avelumab.
A capacidade de anticorpos competirem de forma cruzada para ligação a um antígeno indica que esses anticorpos se ligam à mesma região de epítopo do antígeno e estericamente impedem a ligação de outros anticorpos de competição cruzada àquela região de epítopo em particular.
Espera-se que esses anticorpos de competição cruzada tenham propriedades funcionais muito similares àquelas do anticorpo de referência, por exemplo, atezo- lizumab e/ou avelumab, em virtude de sua ligação à mesma região de epítopo de PD-L1. Anticorpos de competição cruzada podem ser pron- tamente identificados com base em sua capacidade de competir de forma cruzada com atezolizumab e/ou avelumab em ensaios de ligação de PD-L1 padrão, tais como análise Biacore, ensaios ELISA ou citome- tria de fluxo (vide, por exemplo, WO 2013/173223). Em certas modalidades, os anticorpos que competem de forma cruzada para ligação a PD-L1 humano com, ou se ligam à mesma região de epítopo que PD-L1 humano anticorpo que, atezolizumab, dur- valumab e/ou avelumab, são anticorpos monoclonais.
Para administra- ção a indivíduos humanos, esses anticorpos de competição cruzada são anticorpos quiméricos, anticorpos geneticamente manipulados ou anti- corpos humanizados ou humanos.
Tais anticorpos monoclonais quimé- ricos, geneticamente manipulados, humanos ou humanizados podem ser preparados e isolados por métodos bem conhecidos na técnica.
Anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis nos métodos da invenção descrita também incluem porções de ligação ao antígeno dos anticorpos acima.
Demonstrou-se amplamente que a função de ligação ao antí- geno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anti- corpo de comprimento total.
Anticorpos anti-PD-L1 adequados para uso nos métodos ou composições descritos são anticorpos que se ligam a PD-L1 com alta especificidade e afinidade, bloqueiam a ligação de PD-1, e inibem o efeito imunossupressor da via de sinalização de PD-1. Em qualquer um das composições ou métodos descritos neste documento, um “anti- corpo” anti-PD-L1 inclui uma porção de ligação ao antígeno ou frag- mento que se liga a PD-L1 e apresenta as propriedades funcionais si- milar àquelas de anticorpos inteiros na inibição de ligação de receptor e sobrerregulação do sistema imune.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compete de forma cruzada com atezolizumab, durvalumab e/ou avelumab para liga- ção a PD-L1 humano.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A da presente invenção é combinado com um antagonista de sinalização de PD-1/PD- L1, tal como um antagonista PD-1a (por exemplo, nivolumab, também conhecido como MDX1106, como descrito no WO 06/121168) ou um antagonista PD-L1, em combinação com um terceiro agente imunoterá- pico (por exemplo, um anticorpo anti-ICOS, tal como ICOS.33 IgG1f S267E (como descrito na Patente dos EUA Nº. 10.251.945), em combi- nação com nivolumab e ipilimumab). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um anticorpo antagonista CTLA-4. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é YERVOY® (ipilimumab ou an- ticorpo 10D1, descrito na Publicação PCT WO 01/14424) ou tremelimu- mab (previamente ticilimumab, CP-675.206). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista GITR ou um antago- nista OX-40, tal como os anticorpos anti-GITR ou anti-OX40 descritos neste documento.
Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um agonista GITR, tal como um anticorpo GITR agonístico.
Anticorpos GITR adequados incluem, por exemplo, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO06/105021, WO09/009116) e MK-4166 (WO11/028683).
Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista IDO.
Antagonistas IDO adequados incluem, por exemplo, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoxi- mod, ou NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237). São fornecidos neste documento métodos para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo admi- nistrar um anticorpo anti-hNKG2A descrito neste documento e um anti- corpo antagonista CTLA-4 a um indivíduo.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-hNKG2A é administrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado em uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica.
São fornecidos neste documento métodos para alterar um evento adverso associado com tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imu- noestimulador, compreendendo administrar um anticorpo anti-hNKG2A e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-CTLA-4 a um indivíduo.
Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
Anticorpos anti-CTLA-4 que são conhecidos na técnica po- dem ser usados nos métodos da presente invenção.
Anticorpos anti- CTLA-4 da presente invenção se ligam a CTLA-4 humano de modo a interromper a interação de CTLA-4 com um receptor B7 humano.
Uma vez que a interação de CTLA-4 com B7 transduz um sinal levando à inativação de células T portando o receptor de CTLA-4, a interrupção da interação efetivamente induz, aumenta ou prolonga a ativação de tais células T, desse modo induzindo, potencializando ou prolongando uma resposta imune.
Anticorpos monoclonais humanos que se ligam especifica- mente a CTLA-4 com alta afinidade foram descritos na Patente dos EUA Nºs. 6.984.720. Outros anticorpos anti-CTLA-4 monoclonais foram des- critos, por exemplo, em Patentes dos EUA Nºs. 5.977.318, 6.051.227,
6.682.736, e 7.034.121 e Publicação Internacional Nº.s WO 2012/122444, WO 2007/113648, WO 2016/196237, e WO 2000/037504, cada uma das quais é no presente documento incorpo- rada por referência em sua totalidade. Anticorpos anti-CTLA-4 úteis para a presente invenção incluem anticorpos monoclonais que se ligam es- pecificamente a CTLA-4 humano e apresentam pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três das características acima. Em certas modalidades, o anticorpo CTLA-4 é ipilimumab (também conhecido como YERVOY®, MDX-010, 10D1; vide Patente dos EUA Nº. 6,984,720), MK-1308 (Merck), AGEN-1884 (Agenus Inc.; vide WO 2016/196237), ou tremelimumab (AstraZeneca; também co- nhecido como ticilimumab, CP-675,206; vide WO 2000/037504 e Ribas, Update Cancer Ther. 2(3): 133-39 (2007)). Em modalidades particula- res, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumab. Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é ipilimu- mab para uso nos métodos descritos neste documento. Ipilimumab é um anticorpo monoclonal IgG1 totalmente humano que bloqueia a liga- ção de CTLA-4 a seus ligandos B7, desse modo estimulando a ativação de células T e melhorando a sobrevivência geral (OS) em pacientes com melanoma avançado. Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é tre- melimumab. Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é MK-
1308. Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é AGEN-
1884. Anticorpos anti-CTLA-4 utilizáveis nos métodos descritos também incluem anticorpos isolados que se ligam especificamente a CTLA-4 humano e competem de forma cruzada para ligação a CTLA-4 humano com qualquer anticorpo anti-CTLA-4 descrito neste documento,
por exemplo, ipilimumab e/ou tremelimumab.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 liga o mesmo epítopo que qualquer um dos an- ticorpos anti-CTLA-4 descritos neste documento, por exemplo, ipilimu- mab e/ou tremelimumab.
A capacidade de anticorpos competirem de forma cruzada para ligação a um antígeno indica que esses anticorpos se ligam à mesma região de epítopo que o antígeno e estericamente impedem a ligação de outros anticorpos de competição cruzada àquela região de epítopo em particular.
Espera-se que esses anticorpos de competição cruzada tenham propriedades funcionais muito similares àquelas do anticorpo de referência, por exemplo, ipilimumab e/ou tre- melimumab, em virtude de sua ligação à mesma região de epítopo de CTLA-4. Anticorpos de competição cruzada podem ser prontamente identificados com base em sua capacidade de competirem de forma cru- zada com ipilimumab e/ou tremelimumab em ensaios de ligação de CTLA-4 padrão, tais como análise Biacore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo (vide, por exemplo, WO 2013/173223). Em certas modalidades, os anticorpos que competem de forma cruzada para ligação a CTLA-4 humano com, ou se ligam à mesma região de epítopo que CTLA-4 humano anticorpo que, ipilimu- mab e/ou tremelimumab, são anticorpos monoclonais.
Para administra- ção a indivíduos humanos, esses anticorpos de competição cruzada são anticorpos quiméricos, anticorpos geneticamente manipulados ou anti- corpos humanizados ou humanos.
Tais anticorpos monoclonais quimé- ricos, geneticamente manipulados, humanos ou humanizados podem ser preparados e isolados por métodos bem conhecidos na técnica.
Anticorpos anti-CTLA-4 utilizáveis nos métodos da invenção descrita também incluem porções de ligação ao antígeno dos anticorpos acima.
Demonstrou-se amplamente que a função de ligação ao antí- geno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anti- corpo de comprimento total.
Anticorpos anti-CTLA-4 adequados para uso nos métodos ou composições descritos são anticorpos que se ligam a CTLA-4 com alta especificidade e afinidade, bloqueiam a atividade de CTLA-4, e inter- rompem a interação de CTLA-4 com um receptor B7 humano.
Em qual- quer um das composições ou métodos descritos neste documento, um “anticorpo” anti-CTLA-4 inclui uma porção de ligação ao antígeno ou fra- gmento que se liga a CTLA-4 e apresenta as propriedades funcionais similares àquelas de anticorpos inteiros na inibição da interação de CTLA-4 com um receptor B7 humano e sobrerregulação do sistema imune.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compete de forma cruzada com ipilimu- mab e/ou tremelimumab para ligação a CTLA-4 humano.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-hNKG2A da presente invenção é combinado com um anticorpo anti-CTLA-4, em combinação com um terceiro agente imunoterápico.
Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista GITR ou um antagonista OX- 40, tal como os anticorpos anti-GITR ou anti-OX40 descritos neste do- cumento.
Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um agonista GITR, tal como um anticorpo GITR agonístico.
Anticorpos GITR adequados incluem, por exemplo, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO06/105021, WO09/009116) e MK-4166 (WO11/028683). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista IDO.
Antagonistas IDO adequados incluem, por exemplo, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoxi- mod, ou NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237). São fornecidos neste documento métodos para tratar uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo admi- nistrar um anticorpo anti-hNKG2A e um anticorpo anti-LAG-3 a um indi-
víduo.
Em outras modalidades, o agonista anticorpo anti-hNKG2A é ad- ministrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-LAG-3 é ad- ministrado em uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica.
São fornecidos neste documento méto- dos para alterar um evento adverso associado com tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulador, compreen- dendo administrar um anticorpo anti-hNKG2A e uma dose subterapêu- tica de anticorpo anti-LAG-3 a um indivíduo.
Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
Em certas modalidades, o anticorpo anti- hNKG2A é um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anti- corpo anti-hNKG2A é um anticorpo monoclonal humanizado, tal como um anticorpo compreendendo as CDRs ou regiões variáveis dos anti- corpos descritos neste documento.
Exemplos de anticorpos anti-LAG3 incluem anticorpos compreendendo as CDRs ou regiões variáveis de anticorpos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 ou 17E5, que são descritos na Publicação de Patente dos EUA Nº.
US2011/0150892 e WO2014/008218. Em uma modalidade, um anticorpo anti-LAG-3 é BMS-986016. Outros anticorpos anti-LAG-3 que podem ser usados in- cluem IMP731 descritos na US 2011/007023 ou IMP-321. Anticorpos anti-LAG-3 que competem com e/ou se ligam ao mesmo epítopo que o de qualquer um desses anticorpos também podem ser usados em tra- tamentos de combinação.
Em certas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 se liga a LAG-3 humano com uma KD de 5×10−8 M ou menos, se liga a LAG-3 humano com uma KD de 1×10−8 M ou menos, se liga a LAG-3 humano com uma KD de 5×10−9 M ou menos, ou se liga a LAG-3 humano com uma KD de entre 1×10−8 M e 1×10−10 M ou menos.
A administração de anticorpos anti-hNKG2A descritos neste documento e outros antagonistas, por exemplo, anticorpo antagonistas, a um ou mais segundos antígenos alvo, tais como LAG-3 e/ou CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1, aumenta a resposta imune a células cancerosas no paciente.
Cânceres cujo crescimento pode ser inibido usando os an- ticorpos da presente invenção incluem cânceres normalmente respon- sivos à imunoterapia.
Exemplos de cânceres para tratamento com a te- rapia de combinação descrita neste documento incluem, mas sem limi- tação, os descritos acima na discussão de monoterapia com anticorpos anti-hNKG2A.
Em certas modalidades, a combinação de anticorpos tera- pêuticos discutidos neste documento pode ser administrada simultane- amente como uma única composição em um veículo farmaceuticamente aceitável, ou simultaneamente como composições separadas com cada anticorpo em um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em outra moda- lidade, a combinação de anticorpos terapêuticos pode ser administrada sequencialmente.
Por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4 e um anti- corpo anti-hNKG2A pode ser administrado sequencialmente, tal como o anticorpo anti-CTLA-4 sendo administrado primeiramente e o anticorpo anti-hNKG2A depois, ou o anticorpo anti-hNKG2A sendo administrado primeiramente e o anticorpo anti-CTLA-4 depois.
Adicionalmente ou al- ternativamente, um anticorpo anti-PD-1 e um anticorpo anti-hNKG2A podem ser administrados sequencialmente, tal como o anticorpo anti- PD-1 sendo administrado primeiramente e o anticorpo anti-hNKG2A de- pois, ou o anticorpo anti-hNKG2A sendo administrado primeiramente e o anticorpo anti-PD-1 depois.
Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-PD-L1 e anticorpo anti-hNKG2A podem ser administrados sequencialmente, tal como anticorpo anti-PD-L1 sendo administrado pri- meiramente e o anticorpo anti-hNKG2A depois, ou o anticorpo anti- hNKG2A sendo administrado primeiramente e o anticorpo anti-PD-L1 depois.
Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-LAG-3 e anticorpo anti-hNKG2A podem ser administrados sequencialmente, tal como o anticorpo anti-LAG-3 sendo administrado primeiramente e o an- ticorpo anti-hNKG2A depois, ou o anticorpo anti-hNKG2A sendo admi- nistrado primeiramente e o anticorpo anti-LAG-3 depois.
Além disso, se mais de uma dose da terapia de combinação for administrada sequencialmente, a ordem da administração sequen- cial pode ser invertida ou mantida na mesma ordem em cada ponto de tempo de administração, administrações sequenciais podem ser combi- nadas com administrações simultâneas, ou qualquer combinação dos mesmos.
Por exemplo, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e anticorpo anti-hNKG2A pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-CTLA- 4 primeiramente e anticorpo anti-hNKG2A depois, e a terceira adminis- tração pode ser sequencial com anticorpo anti-hNKG2A primeiramente e anticorpo anti-CTLA-4 depois etc.
Adicionalmente ou alternativa- mente, a primeira administração de uma combinação anticorpo anti-PD- 1 e anticorpo anti-hNKG2A pode ser simultânea, a segunda administra- ção pode ser sequencial com anticorpo anti-PD-1 primeiramente e anti- corpo anti-hNKG2A depois, e a terceira administração pode ser sequen- cial com anticorpo anti-hNKG2A primeiramente e anticorpo anti-PD-1 depois etc.
Adicionalmente ou alternativamente, a primeira administra- ção de uma combinação anticorpo anti-PD-L1 e anticorpo anti-hNKG2A pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-PD-L1 primeiramente e anticorpo anti-hNKG2A depois, e a terceira administração pode ser sequencial com anticorpo anti- hNKG2A primeiramente e anticorpo anti-PD-L1 depois etc.
Adicional- mente ou alternativamente, a primeira administração de uma combina- ção anticorpo anti-LAG-3 e anticorpo anti-hNKG2A pode ser simultânea, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-LAG- 3 primeiramente e anticorpo anti-hNKG2A depois, e a terceira adminis- tração pode ser sequencial com anticorpo anti-hNKG2A primeiramente e anticorpo anti-LAG-3 depois etc.
Outro esquema de dosagem repre- sentativo pode envolver uma primeira administração que é sequencial com anti-hNKG2A primeiramente e anticorpo anti-CTLA-4 (e/ou anti- corpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti-LAG-3) depois, e administrações subsequentes podem ser simultâneas.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A, como único agente imunoterápico, ou a combinação de um anticorpo anti- hNKG2A e um ou mais anticorpos imunoterápicos adicionais (por exem- plo, anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anti- LAG-3) podem ser ainda combinados com um agente imunogênico, tal como células cancerosas, antígenos tumorais purificados (incluindo pro- teínas recombinantes, peptídeos e moléculas de carboidrato), células, e células transfectadas com genes que codificam citocinas de estimula- ção imunes (He et al. (2004) J.
Immunol. 173:4919-28). Exemplos não limitantes de vacinas tumorais que podem ser usadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, ou células tumorais transfectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutido ainda abaixo). Um ago- nista ICOS e um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, bloqueio de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3) também pode ser ainda combinado com tratamentos de câncer padrão.
Por exemplo, um ago- nista ICOS e um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, bloqueio de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3) podem ser combinados com regimes quimioterápicos.
Em uma modalidade, um anticorpo anti- hNKG2A é administrado a um paciente com um anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti- LAG-3 em combinação com dacarbazina para o tratamento de mela- noma.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A é administrado a um paciente com um anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti-LAG-3 em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de câncer, incluindo mela- noma.
Outras terapias de combinação que podem resultar em sinergia com um anticorpo anti-hNKG2A combinado com ou sem antagonismo de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 por meio de citotoxicidade incluem radiação, cirurgia ou privação de hormônio.
Em outra modali- dade, inibidores de angiogênese podem ser combinados com um anti- corpo anti-hNKG2A e antagonismo de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3. Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A como único agente imunoterápico, ou uma combinação de um anticorpo anti- hNKG2A e anticorpos de bloqueio CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 durante também pode ser usada em combinação com anticorpos biespecíficos que têm como alvo células efetoras que expressam o re- ceptor Fcα ou Fcγ para células tumorais.
Vide, por exemplo, Pat. dos EUA Nºs. 5.922.845 e 5.837.243. Anticorpos biespecíficos podem ser usados para direcionar dois antígenos separados.
Em uma modalidade, um anticorpo anti-hNKG2A como único agente imunoterápico ou uma combinação de um anticorpo anti- hNKG2A e agente imunoestimulador adicional, por exemplo, anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou an- ticorpo anti-LAG-3, podem ser usados em conjunto com um agente an- tineoplásico, tal como RITUXAN® (rituximab), HERCEPTIN® (trastuzu- mab), BEXXAR® (tositumomab), ZEVALIN® (ibritumomab), CAM- PATH® (alemtuzumab), LYMPHOCIDE® (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab) e TARCEVA® (erlotinib). A título de exemplo e não de- sejando estar vinculado à teoria, o tratamento com um anticorpo anti- câncer ou um anticorpo anticâncer conjugado a uma toxina pode levar à morte de células cancerosas (por exemplo, células tumorais), o que pode potencializar uma resposta imune mediada pelo agente imunoes-
timulador, por exemplo, anticorpo anti-NKG2A, anticorpo anti-TIGIT, an- ticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1, anti- corpo anti-ICOS e/ou anticorpo anti-LAG-3. Em uma modalidade, um tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, um tumor canceroso) pode incluir um agente anticâncer, por exemplo, anticorpo, em combinação com um anticorpo anti-NKG2A e, opcionalmente, um agente imunoestimulador adicional, por exemplo, anticorpo anti-CTLA- 4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti- LAG-3, simultaneamente ou sequencialmente ou qualquer combinação dos mesmos, o que pode potencializar uma resposta imune antitumoral pelo hospedeiro.
São fornecidos neste documento métodos para reduzir, me- lhorar ou anular um evento adverso associado com tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer) com um agente imu- noestimulador, compreendendo administrar um anticorpo anti-NKG2A com ou sem um anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3, a um indivíduo.
Em uma modalidade, o método reduz a incidência de colite ou diarreia induzida por anticorpos terapêuticos imunoestimuladores pela administração de um esteroide não absorvível ao paciente.
Como usado neste documento, um “esteroide não absorví- vel” é um glicocorticoide que apresenta um extenso metabolismo de pri- meira passagem, tal que, após o metabolismo no fígado, a biodisponi- bilidade do esteroide é baixa, isto é, menos do que cerca de 20%. Em uma modalidade descrita neste documento, o esteroide não absorvível é budesonida.
A budesonida é um glicocorticosteroide de ação local, que é amplamente metabolizado, principalmente pelo fígado, após ad- ministração oral.
ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) é uma formulação oral de budesonida dependente de pH e de tempo desenvolvida para otimizar a entrega de fármaco ao íleo e ao cólon.
ENTOCORT EC® é aprovado nos EUA para o tratamento de doença de Crohn leve a mode- rada envolvendo o íleo e/ou cólon ascendente.
A dosagem oral usual de ENTOCORT EC® para o tratamento de doença de Crohn é de 6 a 9 mg/dia.
ENTOCORT EC® é liberado no intestino antes de ser absorvido e retido na mucosa intestinal.
Depois de passar pelo tecidoalvo da mu- cosa intestinal, o ENTOCORT EC® é amplamente metabolizado pelo sistema do citocromo P450 no fígado em metabólitos com atividade gli- cocorticoide desprezível.
Portanto, a biodisponibilidade é baixa (cerca de 10%). A baixa biodisponibilidade de budesonida resulta em uma ra- zão terapêutica melhorada em comparação com outros glicocorticóides com metabolismo de primeira passagem menos extenso.
A budesonida resulta em menos efeitos adversos, incluindo menos supressão hipotá- lamo-pituitária, do que corticosteroides de ação sistêmica.
No entanto, a administração crônica de ENTOCORT EC® pode resultar em efeitos de glicocorticoide sistêmicos, tais como hipercorticismo e supressão adrenal.
Vide PDR 58ª ed. 2004; 608-610. Em uma modalidade, um anticorpo anti-NKG2A com ou sem antagonista CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 em conjunto com um esteroide não absorvível pode ser ainda combinado com um salici- lato.
Os salicilatos incluem agentes 5-ASA, tais como, por exemplo: sul- fassalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalazina (DIPEN- TUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharma- ceuticals, Inc.); e mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharma- ceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay). De acordo com os métodos descritos neste documento, um salicilato administrado em combinação com um anticorpo anti-NKG2A com ou sem anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou LAG-3 e um esteroide não absorvível inclui qualquer administração so- breposta ou sequencial do salicilato e do esteroide não absorvível com a finalidade de diminuir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimuladores.
Dessa forma, por exemplo, métodos para reduzir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimuladores descritos neste documento englobam administrar um salicilato e um es- teroide não absorvível simultaneamente ou sequencialmente (por exem- plo, um salicilato é administrado 6 horas após um esteroide não absor- vível), ou qualquer combinação dos mesmos.
Além disso, um salicilato e um esteroide não absorvível podem ser administrados pela mesma via (por exemplo, ambos são administrados por via oral) ou por diferen- tes vias (por exemplo, um salicilato é administrado por via oral e um esteroide não absorvível é administrado por via retal), que podem diferir da(s) via(s) usada(s) para administrar o anticorpo anti-NKG2A e anticor- pos anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3s.
Os anticorpos de anticorpo anti-NKG2A e terapias de combi- nação de anticorpo descritos neste documento também podem ser usa- dos em conjunto com outras terapias bem conhecidas que são selecio- nadas por sua particular utilidade contra a indicação sendo tratada (por exemplo, câncer). As combinações dos anticorpos de anticorpo anti- NKG2A descritas neste documento podem ser usadas sequencialmente com agente(s) farmaceuticamente aceitável(is) conhecido(s). Em uma modalidade, os anticorpos de anticorpo anti-NKG2A e as terapias de combinação de anticorpo descritos neste documento podem ser usados em combinação (por exemplo, simultaneamente ou separadamente) com um tratamento adicional, tal como irradiação, qui- mioterapia (por exemplo, usando camptotecina (CPT-11), 5-fluorouracil (5-FU), cisplatina, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel, gencitabina, cisplatina, paclitaxel, carboplatina-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu, ou camptotecina + apo2l/TRAIL (um combo 6X), um ou mais inibidores de proteassoma (por exemplo, bortezomib ou MG132), um ou mais ini- bidores de Bcl-2 (por exemplo, inibidor de BH3I-2’ (inibidor de bcl-xl),
inibidor de indoleamina dioxigenase-1 (IDO1) (por exemplo, INCB24360), AT-101 (derivado de R-(-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequena), GX-15-070 (obatoclax), ou antagonistas de MCL-1 (proteína- 1 de diferenciação de células de leucemia mieloide)), antagonistas de iAP (inibidor de proteína de apoptose) (por exemplo, smac7, smac4, mi- mético smac de molécula pequena, peptídeos smac sintéticos (vide Fulda et al., Nat Med 2002; 8:808-15), ISIS23722 (LY2181308), ou AEG- 35156 (GEM-640)), inibidores de HDAC (histona desacetilase), anticor- pos anti-CD20 (por exemplo, rituximab), inibidores de angiogênese (por exemplo, bevacizumab), agentes antiangiogênicos direcionados a VEGF e VEGFR (por exemplo, AVASTIN®), triterpenoides sintéticos (vide Hyer et al., Cancer Research 2005; 65:4799-808), moduladores c- FLIP (proteína inibidora de FLICE celular) (por exemplo, ligandos natu- rais e sintéticos de PPARγ (receptor γ ativado por proliferador de pero- xissoma), 5809354 ou 5569100), inibidores de quinase (por exemplo, Sorafenib), trastuzumab, cetuximab, Temsirolimus, inibidores de mTOR, tais como rapamicina e temsirolimus, Bortezomib, inibidores de JAK2, inibidores de HSP90, inibidores de PIK3-AKT, Lenalildomida, inibidores de GSK3β, inibidores de IAP e/ou fármacos genotóxicos.
Os anticorpos de anticorpo anti-NKG2A e terapias de combi- nação de anticorpo descritas neste documento podem ainda ser usados em combinação com um ou mais agentes citotóxicos antiproliferativos.
As classes de compostos que podem ser usados como agentes citotó- xicos antiproliferativos incluem, mas sem limitação, o seguinte: Agentes alquilantes (incluindo, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos): Mostarda de uracila, Clormetina, Ciclofosfamida (CITO- XANTM) fosfamida, Melfalano, Clorambucila, Pipobroman, Trietilenome- lamina, Trietilenotiofosforamina, Bussulfano, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina e Temozolomida.
Antimetabólitos (incluindo, sem limitação, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase): Metotrexato, 5-Fluorouracila, Floxuridina, Cita- rabina, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Fosfato de fludarabina, Pen- tostatina e Gencitabina. Agentes antiproliferativos adequados para combinar com an- ticorpo anti-NKG2A incluem, sem limitação, taxanos, paclitaxel (paclita- xel é comercialmente disponível como TAXOLTM), docetaxel, discoder- molida (DDM), dictiostatina (DCT), Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, fura- noepotilona D, desoxiepotilona B1, [17]-desidrodesoxiepotilona B,
[18]desidrodesoxiepotilonas B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A em ponte C6-C8, trans-9,10-desidroepotilona D, cis-9,10-desidroepo- tilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomolida, patu- pilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ -789, XAA296A (Discodermolida), TZT-1027 (soblidotina), ILX-651 (cloridrato de tasido- tina), Halicondrina B, Mesilato de eribulina (E-7389), Hemiasterlina (HTI- 286), E-7974, Cirptohicinas, LY-355703, Imunoconjugados maitansinoi- des (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispine- sib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17beta-acetóxi-2- etóxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, cicloestreptina, isolauli- malida, laulimalida, 4-epi-7-desidroxi-14,16-didemetil-(+)-discodermoli- das, e criptotilona 1, em adição a outros agentes estabilizadores de mi- crotubulina conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, pode ser desejável tornar as cé- lulas aberrantemente proliferativas quiescentes em conjunto com ou an- tes de tratamento com anticorpos de anticorpo anti-NKG2A descritos neste documento, por exemplo, administrando ao paciente hormônios e esteroides (incluindo análogos sintéticos), tais como 17a-Etinilestradiol,
Dietilestilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximesterona, Propio- nato de Dromostanolona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilpred- nisolona, Metil-testosterona, Prednisolona, Triancinolona, Clorotriani- seno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Medroxi- progesterona-acetato, Leuprolida, Flutamida, Toremifeno, ZOLADEXTM.
Ao empregar os métodos ou composições descritos neste documento, outros agentes usados na modulação de crescimento tumoral ou me- tástase em um ambiente clínico, tais como antimiméticos, também po- dem ser administrados como desejado.
Métodos para a administração segura e eficaz de agentes quimioterápicos são conhecidos por aqueles versados na técnica.
Além disso, sua administração é descrita na literatura padrão.
Por exemplo, a administração de muitos dos agentes quimioterápicos é descrita em Physicians’ Desk Reference (PDR), por exemplo, edição de 1996 (Me- dical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA); a inven- ção do qual é incorporada neste documento por referência.
O(s) agente(s) quimioterápico(s) e/ou radioterapia pode ser administrado segundo protocolos terapêuticos conhecidos na técnica.
Será evidente para aqueles versados na técnica que a administração do(s) agente(s) quimioterápico(s) e/ou radioterapia pode ser variada de- pendendo da doença a ser tratada e dos efeitos conhecidos do(s) agente(s) quimioterápico(s) e/ou radioterapia naquela doença.
Tam- bém, de acordo com o conhecimento do médico habilitado, os protoco- los terapêuticos (por exemplo, quantidades de dosagem e tempos de administração) podem ser variados em função dos efeitos observados dos agentes terapêuticos administrados no paciente, e em função das respostas observadas da doença aos agentes terapêuticos administra- dos.
Resultados A resposta tumoral é determinada, por exemplo, por Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST) modificados estabelecidos pelo NCI. Com relação às lesões alvo, as respostas à terapia podem incluir: Resposta Completa (CR) Desaparecimento de todas as lesões alvo. Qualquer gânglio linfático patológico (alvo ou não alvo) (RECIST V1.1) deve apresentar redução no eixo curto para <10 mm.
Resposta Parcial (PR) Pelo menos uma redução de 30% na soma dos diâmetros das lesões alvo, tomando como referên- (RECIST V1.1) cia a soma dos diâmetros da linha de base.
Doença Progressiva (PD) Pelo menos um aumento de 20% na soma dos diâmetros de lesões alvo, tomando como referência (RECIST V1.1) a menor soma em estudo (inclui a soma de linha de base se for o menor em estudo). Em adição ao aumento relativo de 20%, a soma deve também demonstrar um aumento absoluto de pelo menos 5 mm. (Nota: o aparecimento de uma ou mais novas lesões é também considerado progressão). Doença Estável (SD) Nem retração suficiente para qualificar para PR nem aumento suficiente para qualificar para PD, (RECIST V1.1) tomando como referência as menores somas de diâmetro durante o estudo.
Resposta Completa Imuno-Relacionada (irCR) Desaparecimento de todas as lesões alvo. Qualquer gânglio linfático patológico (alvo ou não alvo) (irRECIST) deve apresentar redução no eixo curto para <10 mm. Resposta Parcial Imuno-Relacionada (irPR) Pelo menos uma diminuição de 30% na soma de diâmetros de lesões alvo e todas as novas lesões (irRECIST) mensuráveis (por exemplo, alteração percentual na carga tumoral), tomando como referência a soma dos diâmetros de linha de base. Nota: o aparecimento de novas lesões mensuráveis é consi- derado na carga global do tumor, mas não se qualifica automaticamente como doença progressiva até que a soma dos diâmetros aumente em ≥ 20% quando em comparação com nadir. Doença Progressiva Imuno-Relacionada (irPD) Pelo menos 20% de aumento na carga tumoral (por exemplo, a soma de diâmetros de lesões alvo, (irRECIST) e quaisquer novas lesões mensuráveis) tomando como referência a menor soma em estudo (inclui a soma de linha de base se for a menor em estudo). Em adição ao aumento relativo de 20%, a soma deve também demonstrar um aumentam absoluto de pelo menos 5 mm. Avaliações de tumor usando critérios relacionados ao sistema imune para doença progressiva incorporam a contribuição de novas lesões mensuráveis. Cada variação percentual líquida na carga tumoral por avaliação é responsável pelo tamanho e pela cinética de crescimento de tanto de lesões antigas quanto de no- vas à medida que aparecem. Doença Estável Imuno-Relacionada (irSD) Nem redução suficiente para qualificar para irPR nem aumentam suficiente para qualificar para (irRECIST) irPD, tomando como referência os menores diâmetros de soma durante o estudo.
Com relação a lesões não alvo, as respostas à terapia po- dem incluir: Resposta Completa (CR) Desaparecimento de todas as lesões não alvo. Todos os gânglios linfáticos devem ter tamanho (RECIST V1.1) não patológico (eixo curto <10 mm). Não-CR/Não-PD Persistência de uma ou mais lesões não alvo. (RECIST V1.1) Doença Progressiva (PD) Progressão inequívoca de lesões não alvo existentes. O aparecimento de uma ou mais novas (RECIST V1.1) lesões é também considerado progressão.
Resposta Completa Imuno-Relacionada (irCR) Desaparecimento de todas as lesões não alvo. Todos os gânglios linfáticos devem ter tamanho (irRECIST) não patológico (eixo curto <10 mm). Doença Progressiva Imuno-Relacionada (irPD) Aumentos no número ou tamanho de lesões não alvo não constituem doença progressiva a me- (irRECIST) nos que/até a carga tumoral aumentar em 20% (por exemplo, a soma dos diâmetros em nadir de lesões alvo e quaisquer novos aumentos de lesão mensuráveis pela quantidade necessária). Le- sões não alvo não são consideradas na definição de Doença Estável e Resposta Parcial.
Pacientes tratados de acordo com os métodos descritos neste documento, de preferência, apresentam melhora em pelo menos um sinal de câncer. Em uma modalidade, a melhora é medida pela re- dução na quantidade e/ou tamanho de lesões tumorais mensuráveis.
Em outra modalidade, as lesões podem ser medidas em radiografias de tórax ou tomografia computadorizada (CT) ou ressonância magnética.
Em outra modalidade, citologia ou histologia podem ser usadas para avaliar a responsividade a uma terapia.
Em uma modalidade, o paciente tratado apresenta uma res- posta completa (CR), uma resposta parcial (PR), doença estável (SD), doença completa imuno-relacionada (irCR), resposta parcial imuno-re- lacionada (irPR), ou doença estável imuno-relacionada (irSD). Em outra modalidade, o paciente tratado experimenta encolhimento tumoral e/ou diminuição na taxa de crescimento, isto é, supressão de crescimento tumoral.
Em outra modalidade, a proliferação celular indesejada é redu- zida ou inibida.
Em ainda outra modalidade, um ou mais dos seguintes podem ocorrer: o número de células cancerosas pode ser reduzido; o tamanho tumoral pode ser reduzido; a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos pode ser inibida, retardada, retardada ou inter- rompida; a metástase tumoral pode ser retardada ou inibida; o cresci- mento tumoral pode ser inibido; a recorrência do tumor pode ser preve- nida ou retardada; um ou mais dos sintomas associados ao câncer po- dem ser aliviados até certo ponto.
Em outras modalidades, a administração de quantidades efi- cazes do anticorpo anti-NKG2A (ou combinações de anticorpo anti- NKG2A e pelo menos um anticorpo adicional, por exemplo, um anti- corpo anti-PD-1 ou anticorpo anti-CTLA-4) de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos neste documento produz uma redução do ta- manho de um tumor, redução do número de lesões metastáticas que aparecem ao longo do tempo, remissão completa, remissão parcial ou doença estável.
Ainda em outras modalidades, os métodos de trata- mento produzem uma taxa de benefício clínico comparável (CBR = CR + PR + SD ≥ 6 meses) melhor do que o obtido por um anticorpo anti- NKG2A sozinho (ou qualquer um dos anticorpos combinados sozinho).
Em outras modalidades, a melhoria da taxa de benefício clínico é cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou mais, em comparação com o anticorpo anti-NKG2A sozinho (ou qualquer um dos anticorpos combinados sozinho). Adjuvantes de Vacina Anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento podem ser usados para aumentar respostas imunes específicas de antígeno pela coadministração de um anticorpo anti-NKG2A com um antígeno de interesse, por exemplo, uma vacina.
Por conseguinte, são fornecidos neste documento métodos de potencializar uma resposta imune a um antígeno em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo: (i) o antígeno; e (ii) um anticorpo anti-NKG2A, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal que uma resposta imune ao antígeno no indiví- duo seja aumentada.
O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno de um patógeno.
Exemplos não limitantes de tais antígenos incluem aque- les discutidos nas seções acima, tais como os antígenos tumorais (ou vacinas tumorais) discutidos acima, ou antígenos dos vírus, bactérias ou outros patógenos descritos acima.
Detecção e Diagnósticos Em outro aspecto, são fornecidos neste documento métodos para detectar a presença de antígeno de NKG2A humana em uma amostra, ou medir a quantidade de antígeno de NKG2A humana, com- preendendo contactar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo anti-NKG2A, por exemplo, um anticorpo NKG2A anti-humano monoclonal, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à NKG2A humana, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou fragmento dos mes-
mos e NKG2A humana. A formação de um complexo é, então, detec- tada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença de an- tígeno de NKG2A humana na amostra. Além disso, os anticorpos anti- NKG2A descritos neste documento podem ser usados para purificar NKG2A humana por meio de purificação por imunoafinidade. A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a se- guir, que não devem ser considerados limitantes. O conteúdo de todas as figuras e todas as referências, sequências GenBank, patentes e pe- didos de patente publicados citados ao longo deste pedido são expres- samente incorporados neste documento por referência.
EXEMPLOS A seguir são exemplos não limitantes de anticorpos anti- NKG2A, composições e métodos da invenção. É entendido que várias outras modalidades podem ser praticadas de acordo com a descrição geral fornecida neste documento. EXEMPLO 1 Geração de Anticorpos Anti-huNKG2A Anticorpos monoclonais anti-NKG2A quiméricos e total- mente humanos, e anticorpos quiméricos e totalmente humanos que se ligam ao mesmo epítopo e/ou bloqueiam de forma cruzada a ligação dos anticorpos anti-NKG2A são descritos nesta invenção. Desejaram- se os anticorpos que se ligaram especificamente a células que expres- sam NKG2A humanas e de macaco cinomolgo, mas não a células que expressam NKG2C humanas e de macaco cinomolgo. Os anticorpos ANTI-NKG2A descritos neste documento podem ser gerados usando vários métodos como descrito neste exemplo. Métodos de Geração, Triagem e Seleção de Anticorpos anti-NKG2A
1. Método e Desenvolvimento de Hibridoma
Usando um método de hibridoma, anticorpos anti-NKG2A fo- ram gerados usando camundongos transgênicos que expressam genes de anticorpo humano.
Camundongos Kunming (KM) transgênicos de IgG humana foram imunizados através de injeção na planta da pata com a membrana plasmática de BAF3 (uma linha de células pró-B de mu- rino)-NKG2A humana (BAF3-hNKG2A) e células hCD94 ou proteína hNKG2A-hCD94-mFc.
Os gânglios linfáticos desses camundongos fo- ram colhidos, e os hibridomas foram gerados utilizando um instrumento de eletroporação CytoPulse, que utiliza um pulso de eletricidade para aumentar a permeabilidade da membrana celular, permitindo, por exem- plo, que o DNA seja introduzido na célula.
Anticorpos específicos para NKG2A humana foram selecionados em uma triagem primária por Tec- nologia de Ensaio de Microvolume Fluorescente (FMAT) por sua capa- cidade de se ligar a CHO-S-NKG2A humana.
Uma triagem de confirma- ção secundária por análise de Classificação Celular Ativada por Fluo- rescência (FACS) foi realizada para identificar monoclonais que se ligam especificamente a NKG2A humana expressa na superfície celular das células transfectantes CHO-S.
Como mostrado na Figura 1A, na etapa 101, 40 fusões das células de gânglios linfáticos fundidas a uma linhagem celular de mi- eloma produziram 153 clones de anticorpos.
Subsequentemente, na etapa 102, os sobrenadantes de hi- bridoma foram testados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação do pentâmero de HLA-E (um complexo MHC-peptídeo rotulado fluores- cente, ProImmune) a células que expressam NKG2A humana.
Este en- saio identificou que os anticorpos foram capazes de bloquear a ligação do pentâmero de HLA-E às células que expressam NKG2A humana, e estreitou o número de clones de anticorpo para desenvolvimento poste- rior de 153 para 28 clones de anticorpo.
Em seguida, a especificidade de antígeno foi determinada pela ligação de anticorpos purificados a células que expressam NKG2C ou que expressam NKG2A humana ou de macaco cinomolgo. Especifi- camente, na Etapa 103, os 28 clones de anticorpo que bloquearam a interação de HLA-E/NKG2A ainda foram selecionados pela ligação de anticorpos purificados em uma expressão de NKG2A humana e seleci- onados contra a ligação a células que expressam hNKG2C ou hCD94. Nesta etapa, três clones de anticorpo (13F3.A4, 11H9.A4 e 4G5.D1) fo- ram descobertos e selecionados para investigação adicional. Na Etapa 104, os três clones de anticorpo (13F3.A4, 11H9.A4 e 4G5.D1) foram selecionados para reatividade cruzada com células de ovário de hamster chinês (CHO) que expressam NKG2A de macaco cinomolgo. Na Etapa 105, vários ensaios funcionais e experimentos de binning de epítopo descritos nos Exemplos neste documento foram usa- dos para caracterizar os anticorpos anti-NKG2A. Na Etapa 106, otimização de anticorpo e análise de varre- dura mutacional adicionais permitiram a descoberta de anticorpos anti- NKG2A adicionais com propriedades funcionais desejadas como des- crito neste documento.
2. Método de Geração de Biblioteca de Anticorpos Além do método de hibridoma para gerar anticorpos, o mé- todo de biblioteca de anticorpos foi também usado para gerar anticorpos anti-NKG2A adicionais. Este método gerou anticorpos anti-NKG2A in- cluindo o anticorpo P1-069366, que mostrou ligação específica desejá- vel a ambas as linhagens celulares que expressam NKG2A humana e de macaco cinomolgo, enquanto a ligação a células que expressam NKG2C humana foi vantajosamente não observada. Nesse método de geração de biblioteca de anticorpo, como mostrado na Figura 1B, na etapa 107, nove camundongos transgênicos expressando anticorpos humanos foram imunizados com proteína de fusão hNKG2A-hCD94-mFc recombinante e membranas plasmáticas de uma linhagem celular expressando NKG2A de macaco cinomolgo. Na etapa 108, os gânglios linfáticos dos animais imunizados foram co- letados e usados para gerar uma biblioteca de anticorpos imunes. Esta biblioteca foi expressa por exibição de superfície de levedura e classifi- cada usando classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para anticorpos que se ligaram à proteína recombinante hNKG2A- hCD94-mFc, mas não à proteína recombinante hNKG2C-hCD94-mFc. Na etapa 109, a população resultante foi sequenciada utilizando se- quenciamento de próxima geração (NGS), e os anticorpos de interesse foram sintetizados e testados em ensaios. Na etapa 110, caracterização funcional foi realizada. Por exemplo, para caracterizar o anticorpo P1- 069366, mediu-se a ligação do anticorpo a linhagens celulares CHO ge- neticamente manipuladas para expressar NKG2A humana-CD94, NKG2A de macaco cinomolgo, ou NKG2C humana-CD94 por FACS. Além disso, o binning de epítopo foi realizado contra, por exemplo, o anticorpo 13F3.A4 e variantes, incluindo o anticorpo NKG2A.9, como descrito nos Exemplos neste documento.
3. Método de clonagem de célula B única (SBCC) Junto com os métodos de hibridoma e biblioteca de anticor- pos para gerar anticorpos anti-NKG2A, um terceiro método foi usado para gerar mais de 200 anticorpos anti-NKG2A adicionais. Os anticorpos anti-huNKG2A foram gerados usando camun- dongos transgênicos que expressam genes de anticorpo humano. Este método de SBCC foi usado para gerar mais de 200 anticorpos monoclo- nais anti-NKG2A humanos. Como mostrado na Figura 1C, na etapa 111, camundongos transgênicos (KM) de IgG humana foram imunizados por meio de injeção na planta da pata com as membranas plasmáticas de linhagens celulares BAF3 que expressam-NKG2A humana e NKG2A de macaco cinomolgo, respectivamente, e proteína hNKG2A-hCD94-mFc.
Na etapa 112, os gânglios linfáticos desses camundongos foram colhi- dos, e células derivadas foram usadas para o método SBCC.
Na etapa 113, 10x106 células de gânglios linfáticos foram isoladas dos gânglios linfáticos.
Na etapa 114, a seleção/classificação de células B específi- cas de antígeno baseou-se na expressão de IgG humana de superfície celular, e utilizou-se principalmente citometria de fluxo para classificar células B positivas para antígeno (Ag+). Os gânglios linfáticos dos ani- mais imunizados foram colhidos e usados para isolar células B especí- ficas de antígeno, ou seja, células B específicas para NKG2A.
A estratégia de coloração FACS exigiu o uso de antígeno alvo solúvel que é fluorescentemente rotulado/biotinilado, e incluiu um painel de marcadores expressos em superfície celular específica de cé- lula B, por exemplo, CD19 de camundongo, B220 de camundongo e IgG humana.
Esse FACS multiparamétrico resultou com sucesso na identi- ficação e classificação de células B específicas de NKG2A.
A coloração seletiva de FACS resultou no isolamento da proteína recombinante hNKG2A-hCD94-mFc positiva, mas não das células de proteína B re- combinante hNKG2C-CD94-Fc.
Os genes VH e VK de IgG humana des- sas células B classificadas foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) e expressos molecularmente como IgG1 humana re- combinante.
Os anticorpos assim gerados foram testados em ensaios de ligação, tais como ELISA, HTRF e FACS.
O objetivo foi gerar anticorpos que especificamente se liga- ram à NKG2A, mas não à proteína NKG2C.
Foram identificados alguns anticorpos que especificamente se ligaram à NKG2A, e alguns que eram negativos para NKG2C.
Um número muito pequeno (raro) de clones de células B foi identificado como NKG2A humana e de cinomolgo reativa cruzada e NKG2C negativa.
A NGS foi realizada em clones de células B derivadas de SBCC para gerar dados de sequenciamento de VH e VK de IgG humana.
O painel selecionado de anticorpos específicos para
NKG2A foi testado para ensaios adicionais.
No entanto, nenhum dos clones bloqueou suficientemente a interação de NKG2A humana/HLA- E, de modo que esses anticorpos não foram tratados para desenvolvi- mento, como discutido em detalhes ainda no Exemplo 3(2) abaixo.
EXEMPLO 2 Varredura Mutacional e Outras Otimizações de Anticorpo Uma varredura mutacional foi conduzida, em que uma bibli- oteca de mutações de sítio único gerou variantes adicionais de anticor- pos anti-NKG2A, incluindo o anticorpo NKG2A.11 (também conhecido como 13F3.A4 VH I107T, VK N30P). A Figura 2 ilustra a análise de varredura mutacional.
O se- quenciamento de alto rendimento foi combinado com a exibição de pro- teína para permitir medição simultânea da aptidão relativa de cada mu- tante CDR de sítio único possível em uma escala que seria onerosa para uma abordagem mais tradicional.
Abordagens de varredura mutacional profundas foram descritas em Araya et al., Trends in Biotechnology 29: 435-442 (2001); Forsynth et al., MAbs 5:523-53 (2013); e Wrenbeck et al. (2017) Curr.
Opin.
Struct.
Biol. 45:36. Primeiramente, na etapa 201, um anticorpo de interesse foi selecionado para gerar mutações do anticorpo.
Especificamente, foi se- lecionado o anticorpo anti-NKG2A 13F3.A4 I107T.
O parátopo de liga- ção do anticorpo de hibridoma 13F3.A4 I107T para NGK2A foi investi- gado usando uma varredura mutacional profunda.
Depois, na etapa 202, uma biblioteca scFv (cadeia única) foi criada, onde cada substituição de aminoácido individual na região CDR1 de cadeia leve (LCDR1), região CDR3 de cadeia leve (LCDR3), e regiões CDR1-3 de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, e HCDR3) foi gerada usando oligonucleotídeos NNK.
Esta biblioteca de mutantes únicos foi sequenciada usando técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS). Na geração dessa biblio-
teca de mutantes únicos, para cada sequência de CDR, vários oligonu- cleotídeos foram projetados, os quais incorporaram individualmente um códon NNK em cada posição, em que N = A, C, G, T, e K = G, T.
O uso desses códons degenerados permitiu codificar todos os 20 aminoácidos de ocorrência natural (mais um códon de parada) na posição onde o códon NNK foi incorporado.
A definição de Kabat foi usada para todas as CDRs, exceto HCDR1, em que a definição de AbM foi usada (Abhi- nandan e Martin (2008) Mol.
Immunol. 45:3832; Swindells et al. (2017) J.
Mol.
Biol. 429:356), e posição 102 de HCDR3 não foi incluída na aná- lise.
Em terceiro lugar, na etapa 203, usando exibição de mRNA (Xu L et al. (2002) Chemistry & Biology 9:933; Roberts RW e JW Szostak (1997) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 94:12297; Kurz et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(18):E83), a biblioteca de DNA foi obtida por meio de uma única rodada de transcrição e tradução in vitro, durante a qual o mRNA codificado foi fundido à sua própria molécula de proteína scFv por meio de uma ligação de puromicina.
Durante a seleção, quaisquer scFvs que ligaram a proteína de fusão hNKG2A-hCD94-mFc rotulada com biotina foram capturados por esferas magnéticas de estreptavidina, eluídos e amplificados por PCR (etapa 205). Como mostrado na etapa 204, os anticorpos que não se ligaram à NKG2A humana não foram seleciona- dos para teste e desenvolvimento posterior.
Finalmente, na etapa 206, a biblioteca inicial gerada na etapa 202 e o DNA eluído da etapa 205 foram sequenciados usando sequenciamento de próxima geração (NGS). Análise de Dados por Sequenciamento de Próxima Geração: Durante a análise de dados de NGS, sequências de leitura reversa e direta pareadas do NGS foram montadas usando FLASH (Magoc e Sal- zberg (2011) Bioinformatics 27:2957) e categorizadas (binning) de acordo com a população, posição de mutação e identidade do aminoá-
cido mutado.
Todas as sequências de baixa qualidade e aquelas con- tendo vários sítios de mutação foram eliminadas da análise.
Em se- guida, a frequência de cada sequência na população pós-seleção foi dividida pela frequência na população inicial para derivar uma razão de enriquecimento (ER). Em outras palavras, a taxa de enriquecimento é a contagem de uma determinada variante de sequência na amostra ligada à NKG2A (etapa 205) dividida pelas contagens na biblioteca inicial (etapa 202). Isso foi, então, normalizado para a razão de enriquecimento do anticorpo 13F3.A4 I107T de origem: Razão de Enriquecimento Frequência após seleção (etapa 205) = Frequência na biblioteca de partida (etapa 202)  Normalizar para valor parental em cada posição Dessa forma, o efeito sobre a ligação de NKG2A de cada substituição de aminoácido individual nas regiões CDR, como discutido neste documento, foi avaliado.
A Figura 3 é um mapa de calor exempli- ficativo que foi gerado usando a análise de dados de varredura mutaci- onal, e permite a interpretação da relação sequência-atividade de subs- tituições de aminoácidos individuais.
A sequência HCDR1 (definição de AbM) do clone parental 501 é mostrada, e a posição na sequência 502 também é mostrada.
Geralmente, o erro neste método é de aproxima- damente duas vezes.
Dessa forma, valores de razão de enriquecimento (ER) de 0,5 a 2 são considerados substituições neutras, isto é, substi- tuições que mantêm propriedades de ligação à proteína NKG2A.
Valo- res de ER maiores do que 2 são considerados favoráveis ou preferidos para ligação, e valores de ER menores do que 0,5 são considerados desfavoráveis para ligação.
A título de exemplo, uma substituição do clone parental N na posição 35 para S resulta em um valor de ER de 5,16, que é maior do que 2 e é, dessa forma, um exemplo de uma subs- tituição favorável ou preferida.
As posições de CDR analisadas usando o método de varre- dura mutacional são mostradas na Figura 4. Como discutido neste do- cumento, a definição de Kabat foi usada para todas as CDRs, exceto HCDR1, em que a definição de AbM foi usada.
Para desenvolver um anticorpo anti-NKG2A com propriedades biofísicas desejáveis, os dados de varredura mutacional foram usados para remover o risco químico de desamidação “NS” em LCDR1, identificando substituições de aminoá- cido que manteriam ligação similar à proteína NKG2A como o anticorpo 13F3.A4 I107T.
Com base nessa análise, como mostrado na Figura 5A, N30P em LCDR1 foi escolhido como uma substituição preferencial (fa- vorável), e o anticorpo NKG2A.11 (também conhecido como 13F3 VH I107T VK N30P) foi gerado.
Essa molécula foi sintetizada e clonada em um vetor de expressão de IgG com a região Fc de IgG1.3f humana e kapa constante humana (cadeia leve). A proteína de IgG foi expressa para caracterização a jusante adicional.
A análise de varredura de mutação forneceu um conjunto rico de informações sobre o efeito de substituições de aminoácido indi- viduais no anticorpo anti-NKG2A 13F3.A4 I107T na ligação à proteína NKG2A, como mostrado nas Figuras 5A-E e resumido na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1 – Mutações de sítio único nas sequências de CDR de anticorpo anti-NKG2A 13F3.A4 I107T que mantêm ou aumentam a capacidade do anticorpo de se ligar a NKG2A.
Região de CDR Posição Substituições preferidas que Aminoácidos que mantêm a ligação à NKG2A, mantêm ou aumentam a ligação incluindo sequência de aminoácido de origem (Na definição de Kabat, ex- à NKG2A ceto que HCDR1 está na (mapas de calor são mostrados (mapas de calor são mostrados nas Figuras 5A-E) definição de AbM) nas Figuras 5A-E) LCDR1 24, X1 G, A, C, S, T, V, L, I, M, K, R (parental), H, F, Y, W, N, D, E, Q
25, X2 C, T, V, M P, G, A (parental), S, L, I, F, Y, N, E, Q
26, X3 P, G, A, C, S (parental), T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D, E, Q
27, X4 G P, A, C, S, T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D, E, Q (parental)
Região de CDR Posição Substituições preferidas que Aminoácidos que mantêm a ligação à NKG2A, mantêm ou aumentam a ligação incluindo sequência de aminoácido de origem (Na definição de Kabat, ex- à NKG2A ceto que HCDR1 está na (mapas de calor são mostrados (mapas de calor são mostrados nas Figuras 5A-E) definição de AbM) nas Figuras 5A-E) 28, X5 L P, A, C, S, T, V, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D, E, Q, G (parental) 29, X6 C, H, F, N, D, E P, G, A, S, T, V, L, I (parental) M, K, R, Y, W, Q 30, X7 P G, A, C, S, T, V, L, I, M, K, H, F, Y, W, N (parental), D, E, Q 31, X8 P, G, C, D, E A, S (parental), T, L, I, M, H, F, Y, W, N, Q 32, X9 V, I, F, Y, D, E G, A (parental), C, S, T, L, M, H, W, N 33, X10 A, C, T, V, L (parental), I 34, X11 E A (parental), T, V LCDR3 89, X12 Q (parental) 90, X13 D A, S, T, K, N, E, Q (parental) 91, X14 C, M, H, W, N A, T, L, F (parental) 92, X15 P, A, C, S, I, H, F, Y, W, N (parental), D, E, Q 93, X16 V, D, E G, A, C, S (parental), T, L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N,
Q 94, X17 M, H, F, Y (parental), W 95, X18 P (parental), G, A, S, M, D, E, Q 96, X19 C, L (parental), F, W 97, X20 G, A, C, S, T (parental), V, I, M, K, H, F, Y, W, N, D, E, Q HCDR1 26, X21 G (parental) 27, X22 F (parental) 28, X23 V G, A, C, S, T (parental), L, I, M, K, R, H, F, Y, N, D, E, Q 29, X24 F (parental) 30, X25 G, N P, A, C, S (parental), M, K, R, H, D, E, Q 31, X26 G, A, V S (parental), T, E, Q 32, X27 H (parental) 33, X28 C A, S (parental), M, K, R 34, X29 M (parental) 35, X30 G, A, S T, V, N (parental), D HCDR2 50, X31 S, Q G, A (parental), C, L, M, K, F, D
Região de CDR Posição Substituições preferidas que Aminoácidos que mantêm a ligação à NKG2A, mantêm ou aumentam a ligação incluindo sequência de aminoácido de origem (Na definição de Kabat, ex- à NKG2A ceto que HCDR1 está na (mapas de calor são mostrados (mapas de calor são mostrados nas Figuras 5A-E) definição de AbM) nas Figuras 5A-E)
51, X32 A S, V, L, I (parental), M, N, E, Q
52, X33 S (parental) 52a, X34 C S (parental)
53, X35 Q S (parental)
54, X36 S (parental)
55, X37 F, Y, W A, C, S (parental), T, M, R, H
56, X38 Y (parental) 57, X39 I (parental) 58, X40 G, A, S, M, K, R, H, F, Y (parental), N, E, Q
59, X41 G, S, T, V, M, R, H, F, Y (parental), W, N, Q
60, X42 H, Q P, G, A (parental), C, S, T, V, L, I, M, K, R, F, Y, W, N, D, E
61, X43 P, G, A, C, S, T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D (parental), E, Q 62, X44 P, G, A, C, S (parental), T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D, E, Q 63, X45 P, G, A, C, S, T, V (parental), L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D, E, Q 64, X46 P, G, A, C, S, T, V, L, I, M, K (parental), R, H, F, Y, W, N, D, E, Q 65, X47 P, G (parental), A, C, S, T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, W, N, D, E, Q HCDR3 95, X48 E (parental) 96, X49 M, E (parental) 97, X50 W (parental) 98, X51 G (parental) 99, X52 S, L (parental), H 100, X53 P (parental) 100a, X54 F (parental) 101, X55 D (parental)
Usando os dados de varredura mutacional profunda com- pleta, um versado na técnica entenderia que muitas posições de amino- ácido, como mostrado nos dados nas Figuras 5A-E, são tolerantes à mutação, o que significa que substituições de aminoácido podem ser feitas nessas posições e ainda manter a capacidade funcional desejada para se ligar especificamente à proteína NKG2A.
Um versado na técnica entenderia que certas posições, por exemplo, posição de LCDR 89 (como mostrado na Figura 5B), bem como posições de HCDR 26, 27, 29, 32 e 34 (como mostrado na Figura 5C); posições de HCDR 52, 52a, 53, 54, 56, 57 (como mostrado na Figura 5D); e posições de HDCR 95,
96, 97, 98, 99, 100, 100a, e 101 (como mostrado na Figura 5E) foram as mais conservadas, onde apenas um ou alguns tipos de aminoácidos nessas posições mantiveram ligação à proteína NKG2A.
Um versado na técnica seria capaz de conceber substituições de aminoácido usando esses dados para manter a ligação à proteína NKG2A.
EXEMPLO 3 Descoberta de anticorpos anti-NKG2A com caraterísticas funcionais inesperadas desejadas após analisar centenas de anticorpos que não apresentaram tais caraterísticas. (1) Descoberta, Projeto e Teste Experimental de Anticorpos Anti- NKG2A O desenvolvimento de centenas de anticorpos anti-NKG2A não foi realizado porque os anticorpos não apresentaram certas propri- edades funcionais desejadas, como descrito neste documento.
Essa di- ficuldade em descobrir anticorpos anti-NKG2A com propriedades funci- onais desejadas foi parcialmente devido à alta homologia de sequência entre as proteínas NKG2A humana e NKG2C humana, como exemplifi- cado na Figura 6. O alinhamento de sequência foi realizado usando o software Vector NTI e o programa Align X.
A Figura 6 mostra que 76% dos resíduos de aminoácido (177 de 233 resíduos de aminoácido) são conservados, e 6% dos resíduos de aminoácido (13 de 233 resíduos de aminoácido) são similares entre a sequência canônica de proteína NKG2A humana (humana SEQ ID NO: 182) e proteína NKG2C humana (hNKG2C, SEQ ID NO: 3). É conhecido na técnica que 20 diferentes aminoácidos ocor- rem na natureza, e que aminoácidos podem ser agrupados como em classes diferentes e, dessa forma, são “similares” com base em suas propriedades físico-químicas.
Aminoácidos que são físico-quimica- mente similares são muitas vezes mais intercambiáveis, ou seja, subs- tituíveis, do que aqueles que não são.
A tabela a seguir oferece um agrupamento de aminoácidos que têm características similares como definido, por exemplo, por suas cadeias laterais: Característica de Aminoácido Exemplos Polar Polar, positivamente carregado Arginina Arg R Histidina His H Lisina Lys K Polar, negativamente carregado Ácido aspártico Asp D Ácido glumático Glu E Polar, neutral Serina Ser S Treonina Thr T Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Não polar Não polar alifático Alanina Ala A Valina Val V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Metionina Met M Não polar aromático Fenilalanina Phe F Tirosina Tyr Y Triptofano Trp W Prolina Pro P Glicina Cys C Características Especiais Asparagina/ Aspartato Asx Glutamina/ Glutamato Glx *Glicina não tem uma cadeia lateral, e a classificação não é direta. Glicina é geralmente encontrada na superfície da proteína dentro de regiões espirais ou de alça, o que fornece alta flexibilidade à cadeia de polipeptídeo nesses locais.
Em resumo, NKG2A humana e NKG2C humana comparti- lham aproximadamente 82% das mesmas ou de sequências de amino- ácido similares. Essa alta homologia de sequência entre NKG2A hu- mana e NKG2C humana tornou um processo muito difícil de descobrir anticorpos anti-NKG2A que não apenas se ligaram com alta afinidade e especificidade à proteína NKG2A, mas também se ligaram com baixa ou nenhuma afinidade e especificidade à proteína NKG2C. Surpreendentemente, os inventores descobriram que o anti- corpo 13F3.A4 exibia certas características funcionais desejadas como descrito em detalhes neste documento. A Figura 7A-B mostra as se- quências de aminoácido da região variável de cadeia pesada (Figura 7A) e da região variável de cadeia leve (Figura 7B) dos anticorpos anti- NKG2A 13F3.A4. Evidenciando a dificuldade de descobrir anticorpos anti-NKG2A que apresentavam as características funcionais desejadas para, por exemplo, tratar câncer, mesmo diversas variantes do anticorpo
13F3.A4 que foram inicialmente consideradas potenciais anticorpos lí- deres, finalmente não apresentaram as propriedades funcionais deseja- das. A Tabela 2 resume certos anticorpos anti-NKG2A, incluindo varian- tes do anticorpo 13F3.A4, que foram gerados e funcionalmente carac- terizados. Determinadas variantes do anticorpo 13F3.A4, incluindo o an- ticorpo NKG2A.9, apresentaram inesperadamente as características funcionais desejadas descritas neste documento. Tabela 2 – Anticorpo anti-NKG2A e Caracterização Funcional Clone de Hibridoma Nome de Anticorpo Re- Isótipo de Anti- Descrição e Caracterização Funcional Parental combinante corpo 11H9.A4 NKG2A.5 IgG1f  Testado em ensaio de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E  Testado em ensaio de ligação de CHO-NKG2A de cinomolgo.  NKG2A.5 apresentou baixa ligação a células CHO expressando NKG2A de cinomolgo e ainda não foi desenvolvido.  As Figuras 9A-9B mostram as sequências de região variável de cadeia pesada e leve do anticorpo 11H9. 11H9.A4 NKG2A.5 IgG1.3f  Testado em ensaio de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E  Testado em ensaio de ligação de CHO-NKG2A de cinomolgo. Apresen- tou baixa ligação a células CHO expressando NKG2A de cinomolgo e ainda não foi desenvolvido. 13F3.A4 NKG2A.6 IgG1.3f  Testado em ensaio de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E. NKG2A.6 (o anticorpo de origem de, por exemplo, NKG2A.9 e NKG2A.11) bloqueiou e a interação de hNKG2A/HLA-E.  Testado em ensaio de ligação de CHO-NKG2A de cinomolgo. NKG2A.6 IgG1f (o anticorpo de origem de, por exemplo, NKG2A.9 e NKG2A.11) ligado à NKG2A de cinomolgo  Com base nos resultados do ensaio, o anticorpo NKG2A.6-IgG1.3f foi ainda desenvolvido e levou à descoberta e desenvolvimento de, por exemplo, os anticorpos NKG2A.9 e NKG2A.11-IgG1.3f.
13F3.A4 NKG2A.6 IgG2,5  Anti-NKG2A 13F3.A4 com IgG2-C131S humano (otimizado por códon)  Não testado em nenhum ensaio 13F3.A4 VH-I107T, NKG2A.9 IgG1.3f  13F3.A4 com reversão de VH-I107T FW e VK-N30S para remover sítio de VK-N30S desamidação (otimizado por códon)  Descoberto e caracterizado em vários ensaios funcionais como descrito nos Exemplos neste documento, e surpreendentemente apresentou ca- racterísticas funcionais desejadas.  A Figura 15 mostra as sequências de aminoácido de cadeia leve e pesada do anticorpo NKG2A.9. 13F3.A4 VH-I107T, NKG2A.10 IgG1.3f  13F3.A4 com reversão de VH-I107T FW e VK-N30Q para remover sítio de VK-N30Q desamidação  Testado em ensaios de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E e ligação de CHO-hNKG2A.
13F3.A4 VH-I107T, NKG2A.11 IgG1.3f  13F3.A4 com reversão de VH-I107T FW e VK-N30P para remover sítio de VK-N30P desamidação  Testado em ensaios de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E e ligação de CHO-hNKG2A. 13F3.A4 VH-I107T NKG2A.12 IgG1.3f  13F3.A4 com Reversão de VH-I107T FW  Testado em ensaios de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E e ligação de CHO-hNKG2A
13F3.A4 VK-N30S NKG2A.13 IgG1.3f  13F3.A4 com N30S para remover sítio de desamidação  Não testado em nenhum ensaio porque o anticorpo NKG2A.13 não teve rendimento suficiente.
13F3.A4 VK-N30Q NKG2A.14 IgG1.3f  13F3.A4 com N30Q para remover sítio de desamidação  Testado em ensaios de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E e ligação de CHO-hNKG2A 13F3.A4 VK-N30P NKG2A.15 IgG1.3f  13F3.A4 com N30P para remover sítio de desamidação  Testado em Ensaios de bloqueio de CHO-hNKG2A/HLA-E e ligação de CHO-hNKG2A 2G6.C2 NKG2A.16 IgG1.3f  Testado em ensaio de ligação de CHO-NKG2A de cinomolgo.  O anticorpo apresentou baixa ligação a células CHO expressando NKG2A e de cinomolgo e ainda não foi desenvolvido.  O anticorpo também apresentou funcionalidade elevada de células expres- IgG1f-Fab6H sando NKG2A-negativa, que sugeriu que o anticorpo não afeta direta- mente a via de NKG2A/HLA-E.  A Figura 8A-B mostra as sequências de aminoácido de cadeia pesada (Fi- gura 8A) e cadeia leve (Figura 8B) do anticorpo 2G6.C2. 13F3 VH-I107T, VK- NKG2A.18 IgG1.3f  Mutantes de patches hidrofóbicos foram gerados para testar e reduzir ní- N30S-Y49S veis indesejados de agregação.  Nenhum dos mutantes de patches hidrofóbicos foi testado em nenhum ensaio. 13F3 VH-I107T, VK- NKG2A.19 N30S-Y94T 13F3 VH-I107T, VK- NKG2A.20 N30S-Y94A 13F3 VH-I107T, VK- NKG2A.21 N30S-Y94N 13F3 VH-Y56T-I107T, NKG2A.22 VK-N30S 13F3 VH-I57T-I107T, NKG2A.23 VK-N30S 13F3 VH-Y58N-I107T, NKG2A.24 VK-N30S 13F3 VH-Y58S-I107T, NKG2A.25 VK-N30S 27H4.D4 NKG2A.17 mIgG1-D265A  27H4.D4 foi re-expresso como NKG2A.17, um anticorpo quimérico com regiões constantes kapa de camundongo e IgG1-D265A de camundongo.
 O anticorpo 27H4.D4 é um anticorpo de não competição que foi gerado para ligar o receptor de NKG2A na presença do anticorpo anti-NKG2A de interesse, isto é, gerado para se ligar ao mesmo antígeno que o anticorpo alvo (no presente documento, NKG2A), mas não ao mesmo epítopo. Isso permitiu medição da expressão do receptor de NKG2A na presença do anticorpo anti-NKG2A de interesse.
Pelos motivos descritos neste documento e como demons- trado pelos vários anticorpos anti-NKG2A que ainda não foram selecio- nados para desenvolvimento devido a características funcionais indese- jadas, gerar e descobrir anticorpos anti-NKG2A com as propriedades funcionais desejadas foi um processo extremamente difícil. Por exem- plo, mesmo durante estágios avançados de desenvolvimento do anti- corpo anti-NKG2A, os anticorpos 2G6.C2, 4G5.D1, 11H9.A4 e 1G5.B2, que foram inicialmente considerados potenciais líderes de, acabaram não sendo selecionados para desenvolvimento porque não apresenta- vam todas as propriedades funcionais desejadas.
As Figuras 8A-B mos- tram as sequências da região variável de cadeia leve e pesada do anti- corpo 2G6.C2. As Figuras 9A-B mostram as sequências da região vari- ável de cadeia leve e pesada do anticorpo 11H9.A4. As Figuras 10A-B mostram as sequências da região variável de cadeia leve e pesada do anticorpo 4G5.D1. As Figuras 11A-B mostram as sequências da região variável de cadeia leve e pesada do anticorpo 1G5.B2. Esses exemplos, entre outros exemplos descritos neste documento, demonstram a difi- culdade de gerar anticorpos anti-NKG2A com as características funcio- nais desejadas, incluindo ligação específica à proteína NKG2A e não à proteína NKG2C.
Como explicado neste documento, parte da dificul- dade em descobrir os anticorpos anti-NKG2A com as propriedades fun- cionais desejadas foi devido à alta homologia de seqüência entre as proteínas NKG2A humana e NKG2C humana.
Variantes do anticorpo 13F3.A4 foram descobertas e adicio- nalmente caracterizadas.
Como mostrado nas Figuras 12-13, riscos de sequência foram avaliados no anticorpo 13F3.A4. A sequência variável do anticorpo monoclonal anti-NKG2A totalmente humano NKG2A.9 foi derivada do hibridoma 13F3.A4 com uma mutação de reversão de linha germinativa VH-I107T e uma mutação VK-N30S para mitigar o risco de desamidação do resíduo VK-N30. A região constante foi derivada de uma estrutura IgG1f (IgG1.3) e inclui três mutações na cadeia pesada: L234A, L235E e G237A para minimizar ou eliminar a ligação de anti- corpo a receptores Fcγ e C1q.
A oxidação de M34 foi identificada como um risco potencial de oxidação, mas foi eliminada com base em estudos de estabilidade acelerada subsequentes.
A sequência de aminoácido de comprimento total do anticorpo NKG2A.9 é mostrada na Figura 14. O anticorpo NKG2A.9 foi selecionado e testado em vários ensaios fun-
cionais, como descrito neste documento, para mostrar segurança e efi- cácia sozinho e em combinação com outros agentes para tratar, por exemplo, câncer.
A sequência de aminoácido de comprimento total do anti- corpo NKG2A.11 é mostrada na Figura 15. NKG2A.11 é derivado de 13F3.A4 com uma reversão de estrutura de quadro VH-I107T e VK- N30P para remover o sítio de desamidação.
Há uma diferença de ami- noácido entre NKG2A.9 (N30S) e NKG2A.11 (N30P) na cadeia leve, e não há diferenças de aminoácido na cadeia pesada.
NKG2A.9 e NKG2A.11 têm propriedades similares de estabilidade térmica e solubi- lidade.
NKG2A.9 tem melhor reversibilidade térmica e melhor imunoge- nicidade (in silico) do que NKG2A.11. A imunogenicidade de NKG2A.9 é descrita em mais detalhes nos Exemplos 16 e 26. (2) Centenas de anticorpos gerados usando o método de clonagem de célula B única sem características funcionais desejadas A Figura 16 mostra um gráfico circular de resultados de bin- ning de epítopo de anticorpos exemplificativos gerados pelo método de clonagem de células B.
O binning de epítopo foi realizado em um instru- mento Octeto HTX usando o “formato in-tandem”. Primeiramente, a pro- teína de fusão hNKG2A-hCD94-mFc foi capturada em pontas de senso- res Octeto.
Em seguida, os sítios de captura restantes foram bloquea- dos, se necessário.
Em terceiro lugar, o antígeno foi saturado com anti- corpos derivados de clonagem de célula B única derivada de sobrena- dante.
Por fim, a ligação de anticorpos de referência foi testada.
O ex- perimento de binning de epítopo foi repetido com ordem reversa de adi- ção, saturando primeiramente com anticorpos de referência, e depois sondando para ligação de sobrenadante contendo uns anticorpos deri- vados de clonagem de célula B única.
Esse binning de epítopos apre- sentou alta diversidade no comportamento de ligação e bloqueio, cor- respondendo a alta diversidade nos epítopos.
A Figura 16 mostra os resultados de binning de epítopo exibindo que anticorpos se bloqueiam de forma cruzada conectados por uma linha.
Anticorpos de amostra que têm um perfil de bloqueio similar em comparação com os anticorpos de referência (13F3.A4, Z270, RD-ahNKG2a (clone 131411, Catálogo Nº.
MAB1059), e RD-ahCD94 (clone 131412, Catálogo Nº.
MAB1058)) são agrupados em grupos 1-4, 6-7, e 9. Anticorpos de referência com perfis de bloqueio similares como os conjunto de anticorpos de amostra são também agrupados em grupos 5, 8 e 10. Os anticorpos no mesmo grupo podem potencialmente se bloquear de forma cruzada também, mas isso não foi testado nesses experimentos.
Os anticorpos de amostra não fo- ram testados um contra o outro, e os anticorpos de referência não foram testados um contra o outro para bloqueio cruzado.
A capacidade de anticorpos NKG2A anti-humanos gerados usando o método de clonagem de célula B única de bloquearem a inte- ração de NKG2A/HLA-E foi avaliada.
Como ilustrado na Figura 17A, 1x106 células CHO expressando NKG2A humana foram incubadas com 100 µL de sobrenadante ou 10 µg/mL de anticorpo purificado por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lavadas e coradas com pentâmero de HLA-E fluorescentemente rotulado (Proimmune) para detectar o HLA-E ligado na superfície celular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
A Figura 17B mostra a capacidade de anticorpos NKG2A anti-humanos gerados por clonagem de células B de bloquearem a liga- ção de HLA-E a células CHO expressando NKG2A humana.
O anticorpo NKG2A.9 serviu como controle positivo, e o isótipo serviu como controle negativo.
As centenas de anticorpos gerados usando o método SBCC bloquearam apenas parcialmente ou não bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E.
Nenhuma dessas centenas de anticorpos foi selecio- nada para desenvolvimento posterior, o que evidencia a dificuldade de descoberta de anticorpos anti-NKG2A com as características funcionais desejadas.
(3) Anticorpos NKG2A anti-humanos que desejavelmente bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E e não, a Interação de NKG2C/HLAE A capacidade de anticorpos NKG2A anti-humanos para blo- quear as interações de NKG2A/HLA-E e NKG2C/HLA-E foi avaliada.
Como mostrado na Figura 18D, 1x106 células CHO expressando NKG2A humana foram incubadas com montantes de titulação de anti- corpo anti-NKG2A por 30 minutos a 4ºC.
As células foram lavadas e coradas com pentâmero de HLA-E fluorescentemente rotulado (Proimmune) para detectar HLA-E ligado na superfície celular.
As célu- las foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
As Figuras 18E-F mostram a curva de bloqueio de HLA-E e IC50 de anticorpos anti-NKG2A no blo- queio da ligação de HLA-E a células CHO expressando NKG2C ou ex- pressando NKG2A humana.
Os anticorpos 13F3.A4 e 11H9.A1 deseja- velmente apresentaram ligação específica a células CHO expressando NKG2A humana (Figura 18E), e desejavelmente não bloquearam a in- teração de NKG2C/HLA-E (Figura 18F). No entanto, o anticorpo 2EB.B1 indesejavelmente ligou-se a células CHO expressando NKG2C humana e bloqueou a interação de NKG2C/HLA-E.
Dessa forma, o anti- corpo2EB.B1 não foi selecionado para desenvolvimento posterior.
A capacidade de anticorpos anti-NKG2A para bloquear a in- teração de NKG2A/HLA-E em células exterminadoras naturais (NKLs) foi também avaliada.
Como mostrado na Figura 19C, 1x106 células NKL humanas de expressão endógena foram incubadas com montantes de titulação de anticorpo anti-NKG2A por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lavadas e coradas com pentâmero de HLA-E fluorescentemente rotulado (Proimmune) para detectar HLA-E ligado na superfície celular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
A Figura 19D mostra a curva de bloqueio de HLA-E e os valores de IC50 de anticorpos anti- NKG2A no bloqueio da ligação de HLA-E a células NKL expressando NKG2A humana.
Os anticorpos 13F3.A4, 11H9.A1, 4G5.D1 e IG5.B2 mostraram bloqueio da interação de NKG2A/HLA-E em células NKL com valores de IC50 de 0,2 nM, 0,1 nM, 0,3 nM, e 0,4 nM, respectiva- mente.
A capacidade de anticorpos NKG2A anti-humanos adicionais para bloquear a interação de NKG2A/HLA-E foi avaliada.
Como ilus- trado na Figura 20A, 1x106 células CHO expressando NKG2A humana foram incubadas com montantes de titulação de anticorpo anti-NKG2A (10 µg/ml) por 30 minutos a 4ºC.
As células foram lavadas e coradas com pentâmero de HLA-E fluorescentemente rotulado (Proimmune) para detectar HLA-E ligado na superfície celular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
As Figuras 20B-C mostram a curva de blo- queio de HLA-E, e valores de IC50 de anticorpos NKG2A anti-humanos em sua capacidade para bloquear ligação de HLA-E a células CHO ex- pressando NKG2A humana.
Como mostrado na Figura 20B, todos os anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14 e NKG2A.15 demonstraram valores de IC50 relativamente baixos (0,1, nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, e 0,1 nM, respectivamente), o que indicou que os anticorpos bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E.
Da mesma forma, como mostrado na Figura 20C, os anticorpos NKG2A.5, 4G5.D1 e 1G5.B2 demonstraram valores de IC50 relativa- mente baixos de 0,3 nM, 0,9 nM, e 0,7 nM, respectivamente.
Dessa forma, esses anticorpos foram selecionados para desenvolvimento pos- terior.
No entanto, como descrito neste documento, os anticorpos NKG2A.5 e 4G5.D1 foram posteriormente eliminados para desenvolvi- mento posterior devido à sua fraca ligação à proteína NKG2A de cino- molgo.
Como mostrado na Figura 20C, no entanto, o anticorpo 25E7.G8 (representado com um círculo fechado) não bloqueou a inte- ração de NKG2A/HLA-E, como mostrado pelo valor relativamente alto de IC50 de cerca de 4 nM.
Dessa forma, o anticorpo 25E7.G8 não foi selecionado para desenvolvimento posterior. (4) Anticorpos anti-NKG2A que apresentaram ligação específica dese- jável a células CHO expressando NKG2A humana.
Como representado na Figura 18A, 1x106 células CHO ex- pressando NKG2C ou expressando NKG2A humana foram incubadas com montantes de titulação de anticorpo anti-NKG2A por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lavadas e coradas com anticorpo secundário anti- IgG-PE humano de cabra fluorescentemente rotulado por 30 minutos a 4 ºC para detectar o anticorpo ligado na superfície celular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
As Figuras 18B-C mostram a curva de ligação e EC50 (nM) de anticorpos anti-NKG2A para células CHO expressando NKG2C ou expressando NKG2A humana.
Os anti- corpos 13F3.A4, 11H9.A1 e 2EB.B1 apresentaram ligação específica às células CHO expressando NKG2A humana, a mostrada pelos valores de EC50 de 0,7 nM, 0,7 nM e 0,3 nM, respectivamente.
Como mostrado na Figura 21A, 1x106 células CHO expres- sando NKG2A humana e de cinomolgo foram incubadas com montantes de titulação de anticorpo (10 µg/ml) por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lavadas e coradas com anticorpo secundário IgG-PE anti-humano de cabra fluorescentemente rotulado por 30 minutos a 4 ºC para detec- tar o anticorpo ligado na superfície celular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
As Figuras 21B-C mostram as curvas de ligação, e valores de EC50 de anticorpos NKG2A anti-humanos para células CHO expressando NKG2A humana.
Como mostrado na Figura 21B, todos os anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14 e NKG2A.15 demonstraram valores de EC50 relativamente baixos (0,1 nM, 0, 1 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,1 nM e 0,1 nM, respectivamente), o que indicou que os anticorpos anti-NKG2A desejavelmente se ligaram com especifici-
dade ao receptor de NKG2A em células CHO expressando NKG2A hu- mana.
Da mesma forma, como mostrado na Figura 21C, os anticorpos NKG2A.5, 4G5.D1 e 1G5.B2 demonstraram valores de EC50 relativa- mente baixos (0,3 nM, 0,6 nM, e 0,6 nM, respectivamente), o que indicou os anticorpos ligados ao receptor de NKG2A.
Dessa forma, NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14, NKG2A.15, NKG2A.5, 4G5.D1 e 1G5.B2 foram selecionados para desenvolvimento posterior nesta fase. (5) Anticorpos anti-NKG2A que se ligaram a células CHO expressando NKG2A de cinomolgo Foi avaliada a capacidade de anticorpos anti-NKG2A que se ligaram a células CHO que expressam NKG2A de cinomolgo.
Como re- presentado na Figura 22A, 1x106 células CHO expressando NKG2A de cinomolgo foram incubadas com montantes de titulação de anticorpo anti-NKG2A (10 µg/ml) 10 por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lava- das e coradas com pentâmero de HLA-E fluorescentemente rotulado (Proimmune) para detectar HLA-E ligado na superfície celular.
As célu- las foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
As Figuras 22B-C mostram as curvas de ligação, e valores de EC50 de anticorpos NKG2A anti-hu- manos para células CHO expressando NKG2A de cinomolgo.
Como mostrado na Figura 22B, todos os anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14 e NKG2A.15 demonstraram valores de EC50 relativamente baixos (1,2 nM, 1, 3 nM, 1,4 nM, 1,2 nM, 1,2 nM, e 1,5 nM, respectivamente), o que indicou que os anticorpos anti-NKG2A se ligaram ao receptor de NKG2A nas células CHO que expressam NKG2A de macaco cinomolgo.
Como mostrado na Figura 22C, os anticorpos NKG2A.5, 4G5.D1, e 1G5.B2 mostraram ligação fraca a células CHO que expres- sam NKG2A de macaco cinomolgo, como demonstrado pelos valores relativamente altos de EC50 de 172 nM, cerca de 314 nM e 21 nM, res- pectivamente.
Dessa forma, esses três anticorpos não foram seleciona- dos para desenvolvimento posterior.
O anticorpo 2G6.C2 teve um valor de EC50 de 0,6 nM, que desejavelmente apresentou ligação específica a células CHO expressando NKG2A de macaco cinomolgo; dessa forma, o anticorpo 2G6.C2 foi selecionado para desenvolvimento poste- rior.
A capacidade de o anticorpo 2G6.C2 para se ligar especifi- camente ao receptor de NKG2A e para bloquear a interação de NKG2A/HLA-E foi avaliada usando os mesmos métodos que os descri- tos acima neste Exemplo 3(3) e 3(4 ), e como representado nas Figuras 23A e 23C.
O anticorpo 2G6.C2 foi comparável a, por exemplo, o anti- corpo NKG2A.9 em sua capacidade de bloquear a interação de NKG2A/HLA-E, como mostrado pelos valores similares de IC50 de 1,1 nM para o anticorpo NKG2A.9 e 1,3 nM para o anticorpo 2G6.C2, como mostrado na Figura 23B.
Da mesma forma, o anticorpo 2G6.C2 foi com- parável a, por exemplo, o anticorpo NKG2A.9 em sua capacidade de se ligar ao receptor de NKG2A em células CHO expressando NKG2A hu- mana, como mostrado pelos valores similares de EC50 de 0,8 nM para o anticorpo NKG2A.9 e 1 nM para o anticorpo 2G6.C2, como mostrado na Figura 23D.
Apesar de ser capaz de bloquear desejavelmente a interação de NKG2A/HLA-E e de ser ligar ao receptor de NKG2A, o anticorpo 2G6.C2 não foi selecionado para desenvolvimento posterior porque 2G6.C2 aumentou não especificamente a funcionalidade entre células NK NKG2A negativa (-). Isso demonstra a dificuldade de descobrir anti- corpos anti-NKG2A com as características funcionais desejadas descri- tas neste documento para tratar câncer. (6) Anticorpos anti-NKG2A que se ligaram à linhagem de células exter- minadoras naturais (NKL) de NKG2A+ humanas
Como mostrado na Figura 19A, 1x106 células NKL humanas expressando endogenamente NKG2A foram incubadas com montantes de titulação de anticorpo anti-NKG2A por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lavadas e coradas com anticorpo secundário de IgG-PE anti-hu- mano de cabra fluorescentemente rotulado por 30 minutos a 4 ºC para detectar o anticorpo ligado na superfície celular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
A Figura 19B mostra a curva de ligação e valores de EC50 (nM) de anticorpos anti-NKG2A a células NKL expres- sando NKG2A humana.
Os valores de EC50 para os anticorpos 13F3.A4, 11H9.A1, 4G5.D1 e IG5.B2 foram 0,2 nM, 0,1 nM, 0,2 nM e 0,3 nM, respectivamente, e esses valores indicaram que esses anticorpos anti- NKG2A desejavelmente se ligaram especificamente a células extermi- nadoras naturais de NKG2A+. (7) Anticorpos anti-NKG2A que se ligaram a NKL de NKG2A+ de cino- molgo Como representado na Figura 24A, 1x106 células mononu- cleares de sangue periférico (PBMC) de macacos cinomolgos foram in- cubadas com montantes de titulação de anticorpo anti-NKG2A por 30 minutos a 4 ºC.
As células foram lavadas e coradas com anticorpo se- cundário de IgG-PE anti-humano de cabra fluorescentemente rotulado por 30 minutos a 4ºC para detectar o anticorpo ligado na superfície ce- lular.
As células foram lidas frescas no BD LSRFortessa.
A Figura 24B mostra a curva de ligação e valores de EC50 (nM) de anticorpos anti- NKG2A a células NK expressando NKG2A de cinomolgo.
Como mos- trado na Figura 24B, os anticorpos 11H9.A1 e 4G5.D1 não se ligaram a células NK NKG2A+ de cinomolgo, como indicado por valores de EC50 de 28 nM e 38 nM, respectivamente.
Dessa forma, devido à sua não ligação a células NK NKG2A+ de macaco cinomolgo, os anticorpos 11H9.A1 e 4G5.D1 foram eliminados do desenvolvimento posterior para tratar, por exemplo, câncer.
O anticorpo 13F3.A4 desejavelmente se li- gou a células NK NKG2A+ de macaco cinomolgo, como indicado pelo valor de EC50 de 0,2 nM.
Dessa forma, o anticorpo 13F3.A4 demonstrou a funcionalidade de ligação desejável e foi selecionado para modifica- ção e desenvolvimento posterior. (8) Anticorpos anti-NKG2A que potencializaram a resposta de células exterminadoras naturais (NK) de desgranulação Em experimentos in vitro usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores humanos saudáveis, o bloqueio de anticorpo anti-NKG2A da interação de NKG2A/HLA-E entre células NK ativadas aumentou a desgranulação de células NK.
Um dos meca- nismos pelos quais as células NK eliminam seus alvos, tais como célu- las tumorais, é através de um complicado processo multiestágio que se conclui na secreção dirigida de grânulos contendo as enzimas líticas perforina e granzimas.
Esse processo celular de secreção direcionada de moléculas de grânulos é conhecido como degranulação.
Após as cé- lulas NK liberarem grânulos líticos secretores para, por exemplo, as cé- lulas tumorais alvo, a perforina gera poros nas membranas das células tumorais alvo, e granzimas acessam o citoplasma das células tumorais alvo e induzem a morte das células tumorais (também conhecido como apoptose). Durante esse processo, a proteína-1 de membrana associ- ada a lisossoma (LAMP-1, também conhecido como CD107A) é trans- portada para a superfície da célula NK, que a torna acessível para liga- ção ao anticorpo, possibilitando a identificação de células NK que esta- vam ativas na desgranulação.
Em seguida, mediu-se o efeito dos anti- corpos anti-NKG2A descritos neste documento na ativação das células NK e o aumento da funcionalidade de células NK no processo de degra- nulação, que resulta em aumento da morte celular tumoral.
Esse pro- cesso é parcialmente ilustrado na Figura 25A.
O X na célula NK ilustra o sinal inibidor quando NKG2A interage com HLA-E.
Os círculos escuros na célula NK representam grânulos.
As células NK isoladas de doadores de PBMC normais foram ativadas durante a noite com interleucina-2 (IL-2) humana recombinante (rh). Especificamente, as células NK foram isoladas de sangue total hu- mano usando gradiente Ficoll e o kit de isolamento de células NK hu- manas (Miltenyi Biotech). As células NK foram cultivadas durante a noite com rh IL-2 (400UI/ml). Após a ativação, a viabilidade celular foi superior a 90%, como determinado pelo contador celular.
As células NK foram, então, cocultivadas por quatro horas com 5x104 da linhagem celular alvo B-linfoblastoide humana 721.221 expressando HLA-E na presença de anticorpos NKG2A anti-humanos (NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.14, NKG2A.15, NKG2A.5, 2G6.C2, 4G5.D1, 25E7.G8) e um an- ticorpo de isótipo (IgG1.3 humana). As células foram então coletadas e coradas para os seguintes marcadores: CD3 anti-humano, CD56 anti- humano, e CD107a anti-humano, vivo/morto e anticorpo NKG2A anti- humano não competitivo (o clone 27H4.D4). As células foram adquiridas frescas no BD LSRFortessaTM.
A porcentagem de degranulação (% de CD107) entre células NK NKG2A+ ou NKG2A- foi posteriormente anali- sada no FlowJo Versão 10 (software de citometria de fluxo). O aumento de dobra foi calculado pelo aumentam em % de CD107a sobre o isótipo de controle.
Na presença de anticorpos monoclonais NKG2A anti-huma- nos, houve um aumento na desgranulação de células NK como medido pela expressão de CD107a por citometria de fluxo.
O aumento da res- posta das células NK não foi observado em células NK NKG2A negati- vas(-), que mostrou que o efeito do anticorpo foi específico para células NK expressando NKG2A.
As Figuras 25B-C são representações gráficas das análises de citometria de fluxo, e mostram que todos os anticorpos anti-NKG2A testados (anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12,
NKG2A.14, NKG2A.15, NKG2A.5, 2G6.C2 e 4G5.D1) aumentaram a degranulação de células NK (como medido por alteração de dobra em % de CD107a em comparação com o controle de isótipo) entre células NK NKG2A+, exceto o clone 25E7.G8 (um anticorpo não bloqueador) (como mostrado na Figura 25B), que foi incluído como um controle ne- gativo. (Em outras palavras, era esperado que o anticorpo 25E7.G8 não aumentasse a degranulação de células NK porque o anticorpo não blo- queia a via NKG2A/HLA-E). Especificamente, ao avaliar células NK de vários doadores com uma concentração fixa de 10 µg/ml do anticorpo NKG2A.9, houve um aumento de aproximadamente duas vezes na desgranulação per- centual entre células NK que expressam NKG2A+ em comparação com o controle de isótipo de IgG1.3 humano.
Como mostrado na Figura 25C, para os anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14, NKG2A.15, NKG2A.5 e 4G5.D1, o aumento na resposta de células NK não foi observado em células NK NKG2A negativas (-) (tam- bém referidas neste documento como NKG2A-), o que mostrou que a % de aumento de CD107 foi específica para células NK que expressam NKG2A.
Em outras palavras, para vários dos anticorpos anti-NKG2A (anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14, NKG2A.15, NKG2A.5, 4G5.D1), o aumento de degranulação entre cé- lulas NK NKG2A positivas (+) (também referidas neste documento como NKG2A+) e a falta de aumento de degranulação entre células NK NKG2A negativas(-) mostraram que a expressão do receptor de NKG2A foi necessária para aumentar a funcionalidade.
Uma exceção a esse resultado, como mostrado na Figura 25C, foi o anticorpo 2G6.C2, que mostrou aumento de desgranulação de células NK mesmo entre células NK NKG2A negativas(-). Em outras palavras, o aumento da degranula- ção com o anticorpo 2G6.C2 não foi específico para a interação de NKG2A/HLA-E.
Dessa forma, o anticorpo 2G6.C2 não foi selecionado para investigação posterior.
Em resumo, os anticorpos NKG2A.9, NKG2A.10, NKG2A.11, NKG2A.12, NKG2A.14, NKG2A.15, NKG2A.5 e 4G5.D1 surpreendente- mente e desejavelmente aumentaram de forma específica a degranula- ção entre células NK que expressam NKG2A em comparação com o controle de isótipo.
Como mostrado na Figura 25B, para o anticorpo NKG2A.9, este aumento de degranulação foi de aproximadamente duas vezes em comparação com o controle de isótipo.
No entanto, outros an- ticorpos anti-NKG2A não foram selecionados para desenvolvimento posterior por não apresentarem as características funcionais desejadas.
Por exemplo, o anticorpo 2G6.C2 resultou no aumento da funcionali- dade de células expressando NKG2A negativa(-), o que sugeriu que o anticorpo 2G6.C2 não afetou diretamente a interação de NKG2A/HLA- E.
O anticorpo P1-069366 também não apresentou funcionalidade no ensaio de degranulação NK.
Como mostrado na Figura 53, o anticorpo P10069366 teve um % de CD107+ similar dentro de células NK NKG2A+, são o isótipo.
Dessa forma, os anticorpos 2G6.C2 e P1- 069366 não foram selecionados para desenvolvimento posterior, por- que não aumentaram a degranulação nas células NK. (9) Anticorpos anti-NKG2A que aumentaram a resposta de células NK de produção de interferon-gama (IFNγ) elevada.
Anticorpos NKG2A anti-humanos aumentaram a produção de IFN-γ em células NKL cocultivadas com CHO/MICA/HLA-E (células CHO geneticamente manipuladas para expressar HLA-E e MICA, o li- gando para o receptor ativador de células NK NKG2D). Como ilustrado na Figura 26A, em experimentos in vitro usando células NKL e CHO/MICA/HLA-E, o bloqueio de anticorpo anti-NKG2A da interação de NKG2A/HLA-E entre células NK ativadas (por meio da via MICA- NKG2D) desejavelmente aumentou a produção de IFN-γ.
Primeira-
mente, ativaram-se as células NKL usando MICA transfectado em célu- las CHO para que as células NKL ativadas pudessem exterminar as cé- lulas alvo, células CHO/MICA/HLA-E.
MICA funciona como um ligando reconhecido pelo receptor ativador NKG2D que é expresso na superfí- cie de células NK.
Os anticorpos foram avaliados em um ensaio usando uma cocultura de células NKL e CHO/MICA/HLA-E.
Neste ensaio, MICA em células CHO serviu para ativar células NKL por meio de NKG2A (si- nal positivo), e a expressão de HLA-E em células CHO inibe células NKG2A que expressam células NKL (sinal negativo). O ensaio testou se o anticorpo anti-NKG2A bloquearia a interação de NKG2A/HLA-E e au- mentaria desejavelmente a produção de IFN-γ.
Especificamente, as células NKL foram cocultivadas com CHO/MICA/HLA-E em uma razão célula efetora para célula alvo (E:T) de 4:1 na presença de 10 µg/mL de anticorpo NKG2A anti-humano ou anticorpo de isótipo de controle.
Após estimulação durante a noite em uma incubadora a 37 ºC, a produção de IFN-γ foi medida no sobrena- dante por ELISA.
Como mostrado na Figura 26B, os anticorpos 13F3.A4, 11H9.A1 e 4G5.D1 aumentaram desejavelmente a produção de IFN-γ em comparação com o controle de isótipo (IgG1.3 humana). O anticorpo 25E7.G8, um anticorpo NKG2A anti-humano que não bloqueia a interação de NKG2A/HLA-E, foi usado como um controle negativo, e, como esperado, não aumentou a produção de IFN-γ em comparação com o controle de isótipo. (10) Anticorpos anti-NKG2A que aumentaram a resposta de células T CD8+ de produção de IFNγ elevada.
Anticorpos NKG2A anti-humanos aumentaram a produção de IFN-γ entre células T CD8+ cocultivadas com a linhagem de células de carcinoma pancreático, Hs766T.
Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de do- adores normais foram ativadas por três dias com CD3 ligado em placa
(OKT3) e rhIL-15 para aumentar a expressão de NKG2A entre células T CD8+. Como descrito na Figura 27A, células T CD8+ foram cocultiva- das com células alvo Hs766T (tratadas com mitomicina C) em uma ra- zão de célula efetora para célula alvo (E:T) de 1:1 na presença de 10 µg/mL de anticorpos NKG2A anti-humanos ou controle de isótipo (IgG1.3 humano). Após cinco dias de estimulação a 37 ºC, a produção de IFN-γ foi medida no sobrenadante por ELISA.
Como mostrado na Figura 27B, os anticorpos 13F3.A4 e 11H9.A1 aumentaram a produção de IFN-γ em comparação com o con- trole de isótipo.
O anticorpo 25E7.G8, um anticorpo NKG2A anti-hu- mano que não bloqueia interação de NKG2A/HLA-E, foi usado como um controle negativo e, como esperado, não aumentou uma produção de IFN-γ sobre o controle de isótipo.
Especificamente, HS766T é uma li- nhagem celular de carcinoma pancreático que expressa endogena- mente HLA-E.
Células T CD8+ de PBMC de doadores saudáveis geral- mente expressam baixos níveis de NKG2A.
Porém, com a estimulação de anti-CD3 e IL-15, foi possível aumentar a expressão de NKG2A nes- sas células.
Nesse sistema, as células T CD8+ expressam NKG2A, e as células HS766T alvo expressam HLA-E.
Os anticorpos 13F3.A4 e 11H9.A1 bloquearam a interação de NKG2A/HLA-E e aumentaram a funcionalidade citotóxica de células T CD8+, que foi demonstrada por um aumento na produção de IFN-γ. (11) Anticorpo 13F3.A4 e variantes, incluindo o anticorpo NKG2A.9, de- monstraram níveis seguros de agregação de anticorpo indesejável Os agregados de Anticorpo são agrupamentos de moléculas de anticorpo desnaturadas que são formados de forma irreversível du- rante a expressão de anticorpo na cultura celular, purificação de produto ou armazenamento como produto de fármaco de anticorpo.
O processo de agregação é complicado e influenciado pelas propriedades bioquími- cas e biofísicas do anticorpo, bem como pelo ambiente físico-químico em que o anticorpo é exposto durante o processamento e armazena- mento.
A agregação de anticorpo pode expor epítopos normalmente não expostos, levando a aumentar a imunogenicidade.
Os processos de pu- rificação de produtos de anticorpo visam atingir baixos níveis de agre- gado, por exemplo, menos do que 2% de agregados solúveis.
Estudos de estabilidade acelerada (também conhecidos como estudos de degra- dação forçada) foram realizados em oito variantes do anticorpo 13F3.A4 (NKG2A.9, NKG2A.13, NKG2A.18, NKG2A.19, NKG2A.21, NKG2A.22, NKG2A.23 e NKG2A.24) para determinar a propensão de agregação desses anticorpos a 4 ºC e 25 ºC de armazenamento por um mês.
A estabilidade de NKG2A.20 foi testada apenas a 4 ºC devido à disponi- bilidade limitada de material.
Uma formulação com 20 mM de histidina (pH 6,0), 260 mM de sacarose, 50 µM de DTPA e 0,05% de polissorbato 80 foi usada como a formulação de teste para todos os anticorpos.
Os agregados solúveis foram monitorados por análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As concentrações testadas foram basea- das na disponibilidade de material.
SEC revelou propensões de agrega- ção comparáveis para todos os anticorpos, exceto NKG2A.19, em que múltiplos picos são observados.
Embora não seja ligado por nenhum outro mecanismo, NKG2A.19 pode ter sofrido degradação devido à pre- sença de níveis significativos de protease no lote de material testado.
No geral, os níveis de agregação (menos que 2% de agrega- dos solúveis a 25 ºC após um mês de armazenamento) indicaram ade- quação para formular em pH 6,0 para os outros que foram testados.
Os dados de estabilidade física demonstraram menos do que 2% de agre- gados solúveis após um mês de armazenamento a 25ºC, que indicou que a formulação testada com os anticorpos anti-NKG2A era adequada como uma formulação preliminar conferindo estabilidade de armazena- mento aceitável para a substância do fármaco na concentração testada.
Agregado solúvel (%)
Sequência de NKG2A Concentração Testada (mg/mL) 4°C por um mês 25°C por um mês
NKG2A.9 150 0,7 0,8
NKG2A.18 90 Não detectado 1,2
NKG2A.19 54 Amostrada degradada
NKG2A.20 6 1,2 Não testado
NKG2A.21 43 1,3 1,9
NKG2A.22 120 0,8 1,2
NKG2A.23 130 0,8 1,1
NKG2A.24 120 0,8 1,1
(12) Anticorpo NKG2A.9 ligado com alta afinidade a NKG2A versus pro- teína NKG2C A especificidade do anticorpo NKG2A.9 para proteína NKG2A sobre a proteína NKG2C foi avaliada pela determinação da ci- nética e afinidades usando um instrumento Biacore T200 SPR.
Os do- mínios extracelulares de proteína NKG2A e proteína NKG2C foram, cada um, preparados como um heterodímero com o domínio extracelu- lar de CD94. A temperatura de ensaio foi de 37ºC, e o tampão de exe- cução foi solução salina tamponada com HEPES (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl) em pH 7,4 suplementado com 0,05% de Tween-20 e 1 g/L de albumina de soro bovino (BSA). O anticorpo NKG2A.9 foi cap- turado em um chip de sensor CM4 com reagente de captura de Fc anti- humano pré-imobilizado (Southern Biotech Catálogo Número 2081-01). Os heterodímeros NKG2A-CD94 e NKG2C-CD94 foram escoados como analitos sobre o anticorpo capturado em duas séries de diluição de cinco membros e três vezes cada.
Uma série de concentração foi usada para cinética de ciclo único e a outra para cinética de ciclo múlti- plo.
Para a análise de cinética multiciclo, a segunda concentração mais alta foi injetada em duplicata.
A concentração superior para NKG2A- CD94 foi de 250 nM, e a concentração superior para NKG2C-CD94 foi de 1,5uM.
Todos os dados foram duplamente referenciados e ajustados a um modelo de ligação 1:1 com transporte de massa usando o Sof- tware de Avaliação Biacore T200 versão 3.1. Geralmente, como discutido neste documento, dois parâme- tros cinéticos determinam a afinidade de ligação.
O primeiro parâmetro é a rapidez com que o complexo é formado (a taxa de associação, ka), e o segundo parâmetro é a rapidez com que o complexo se dissocia ou se desfaz (a taxa de dissociação, kd). Ambos os parâmetros cinéticos podem ser resumidos na constante de dissociação de equilíbrio (KD), que é definida como kd/ka.
Este experimento Biacore comparativo abor- dou ambos os parâmetros de interação: quão rápido o complexo de an- ticorpo NKG2A.9/proteína NKG2 foi formado (ka) e quão rápido ele se desfez (kd). Neste experimento Biacore comparativo, o anticorpo NKG2A.9 mostrou ligação 15 vezes mais forte à proteína NKG2A do que à proteína NKG2C (KD de 3,9 x 10-8 M para ligação à NKG2A versus KD de 5,7 x 10-7 M para ligação à NKG2C). Em outras palavras, o anticorpo NKG2A.9 mostrou ligação 15 vezes mais fraca à proteína NKG2C do que à proteína NKG2A.
Estes resultados indicaram que o anticorpo NKG2A.9 tinha alta seletividade para a proteína NKG2A em compara- ção com a proteína NKG2C, como resumido na Tabela abaixo.
A ligação mais forte do anticorpo NKG2A.9 à proteína NKG2A foi impulsionada por uma taxa de associação mais rápida (ka), ou seja, quão rápido o complexo de anticorpo NKG2A.9/proteína NKG2A se formou em com- paração com o complexo de anticorpo NKG2A.9/proteína NKG2C.
Em outras palavras, o anticorpo NKG2A.9 formou um complexo 15 vezes mais rapidamente com a proteína NKG2A do que com a proteína NKG2C.
Tabela: Afinidades comparativas de anticorpo NKG2A.9 para as proteínas NKG2A e NKG2C Ligando Amostra ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Razão KD (NKG2C/NKG2A)
5 -2 -8 NKG2A.9 hNKG2A- heterodímero 3,9 x 10 1,5 x 10 3,9 x 10
4 -2 NKG2A.9 hNKG2C-heterodímero 2,4 x 10 1,4 x 10 5,7 x 10-7 15
As Figuras 56A-D mostram a afinidade de ligação do anti- corpo NKG2A.9 a heterodímeros CD94-NKG2A humana (Figuras 56A-
B) e heterodímeros CD94-NKG2C (Figuras 56C-D) a 37 ºC como deter- minado por Biacore usando ambas a cinética de ciclo único (Figuras 56A e 56C) e cinética multiciclo (Figuras 56B e 56D). A resposta SPR é mos- trada para associação e dissociação de analito.
Em outras modalidades, o anticorpo NKG2A.9 forma um complexo com proteína NKG2A 14 vezes mais rapidamente, 13 vezes mais rapidamente, 12 vezes mais rapidamente, 11 vezes mais rapida- mente, 10 vezes mais rapidamente, 9 vezes mais rapidamente, 8 vezes mais rapidamente, 7 vezes mais rapidamente, 6 vezes mais rapida- mente, 5 vezes mais rapidamente, 4 vezes mais rapidamente, três ve- zes mais rapidamente ou duas vezes mais rapidamente do que com proteína NKG2C. (13) Sumário de propriedades funcionais desejáveis e surpreendentes de anticorpos anti-NKG2A Em resumo, os inventores descobriram inesperadamente certos anti-NKG2A que exibiam várias propriedades desejadas para tra- tamento de, por exemplo, câncer.
Em certas modalidades, esses anti- corpos anti-NKG2A incluem o anticorpo 13F3.A4, clone e variantes, in- cluindo os anticorpos NKG2A.9 e NKG2A.11, que foram identificados e selecionados entre centenas de anticorpos que não foram apresenta- ram as propriedades funcionais desejadas.
Especificamente, o anti- corpo NKG2A.9 é um anticorpo anti-hNKG2A que é também conhecido como 13F3.A4-VH-I107T-N30S IgG1.3, e será referido neste docu- mento como o anticorpo “NKG2A.9”. Mutações no resíduo VH-107T (mutação de quadro revertida para linha germinativa) e resíduo VK- N30S para diminuir o potencial de desamidação e reduzir o risco de imunogenicidade resultaram na descoberta do anticorpo NKG2A.9. Como descrito neste documento e mostrado na Figura 13, vários riscos de sequência foram avaliados no anticorpo 13F3.A4, o que levou à oti- mização e desenvolvimento, por exemplo, do anticorpo NKG2A.9.
Como descrito em mais detalhes nos Exemplos neste docu- mento, anticorpos anti-NKG2A, incluindo o anticorpo NKG2A.9, de- monstraram, por exemplo, as seguintes características funcionais sur- preendentes e desejáveis: a) Bloqueiaram a interação de NKG2A/HLA-E; b) Reverteram a sinalização inibidora mediada por NKG2A; c) Não se ligaram, ou se ligaram com baixa afinidade para, células expressando proteína NKG2C humana; d) Ligaram-se com alta afinidade a células expressando NKG2A humana e de cinomolgo; e/ou e) Ligaram-se a células exterminadoras naturais de NKG2A+ humana e de cinomolgo; f) Aumentaram a responsta à célula exterminadora natural, por exemplo, de interferon-gama (IFNγ) elevado; e/ou g) Aumentaram a resposta de célula T CD8+, por exemplo, de produção de IFNγ elevada; e/ou h) Formaram um complexo mais rapidamente com proteína NKG2A do que com proteína NKG2C; em algumas modalidades, forma- ram um complexo 15 vezes mais rapidamente com proteína NKG2A do que com proteína NKG2C.
O anticorpo NKG2A.9 foi caracterizado e testado sozinho e em combinação com anticorpos adicionais como descrito nos Exemplos neste documento.
O anticorpo NKG2A.9 ligado com alta afinidade e es- pecificidade à proteína NKG2A humana.
Os valores de EC50 para liga- ção de NKG2A.9 à proteína NKG2A foram como seguem e demonstra- ram ligação de NKG2A.9 à proteína NKG2A: Linhagens Celulares EC50
NKL (NKG2A humana endogenamente expressa em uma linhagem celular NK ) 0,4 nM
CHO-NKG2A humana (NKG2A humana ectopicamente expressa em células CHO) 0,6 nM
CHO-cyno NKG2A (NKG2A de macaco cinomolgo ectopicamente expressa em células CHO) 1,2 nM
Os valores de EC50 para ligação de NKG2A.9 à proteína NKG2C foram como seguem e desejavelmente demonstraram não con- ter ligação de NKG2A.9 à proteína NKG2C humana: Linhagens Celulares EC50
CHO-NKG2C humana (NKG2C humana ectopicamente expressa em células CHO) 9,0 nM
CHO-cyno NKG2C (NKG2C de macaco cinomolgo ectopicamente expressa em células CHO) 0,8 nM
Os valores de IC50 de NKG2A.9, que mostraram o bloqueio da interação de NKG2A/HLA-E em ensaios de bloqueio celular, foram os seguintes: Linhagens Celulares IC50
NKL 0,3 nM
CHO-NKG2A humana 1,0 nM
Os valores de EC50 mostraram que o anticorpo NKG2A.9 blo- queou a interação de NKG2A/HLA-E.
O valor de EC50 do anticorpo NKG2A.9 mostrou que a ligação à proteína NKG2A humana foi cerca de 15 vezes menor do que à proteína NKG2C humana (0,6 nM para NKG2A vs. 9,0 nM para NKG2C). Além disso, nenhuma ligação especí- fica do anticorpo NKG2A.9 à NKG2C humana foi observada em experi- mentos de SPR.
Em contraste, os valores de EC50 de ligação de anti- corpo NKG2A.9 às proteínas NKG2A de cinomolgo e NKG2C de cino- molgo foram similares (1,2 nM para NKG2A vs. 0,8 nM para NKG2C). O anticorpo NKG2A.9 não bloqueou a interação de NKG2C humana/HLA- E como avaliado por citometria de fluxo sob as condições discutidas neste documento.
Nenhuma ligação a NKG2A de rato ou camundongo foi observada por citometria de fluxo em células NK primárias.
Foi usada análise de Scatchard para medir as afinidades de ligação de NKG2A.9. Para NKG2A.9, ligação celular saturada e análise de Scatchard de CHO-hNKG2A e CHO-NKG2A de cinomolgo estabele- ceram afinidades específicas (valores KD) de cerca de 0,4 nM e 1,0 nM, respectivamente, como mostrado nas Figuras 52A-B.
Especificamente, 125 NKG2A.9 foi radioiodado com I-Na (1 mCi; Catálogo PerkinElmer
NEZ033H001 MC) usando o reagente de iodação de fase sólida IODO- GEN® (1,3,4,6-tetracloro-3a-6a-difenilglicouril; Pierce, Catálogo 28601). O excesso de iodeto foi removido usando uma coluna de des- salinização (Pierce, Catálogo 43243). As frações de anticorpo rotulado foram coletadas e analisadas quanto à radioatividade em um contador gama Wizard 1470. A concentração de 125I-NKG2A.9 em cada fração foi calculada com o fluorômetro Qubit da Invitrogen.
A radiopureza foi es- tabelecida por cromatografia de camada fina de proteína de pico e fra- ções radioativas.
A ligação de NKG2A.9 radioiodada a células CHO de NKG2A humana ou de cinomolgo sobre-expressas foi demonstrada pela incubação de células CHO de NKG2A humana ou de cinomolgo com titulação de 125I-NKG2A.9. Ligação não específica foi determinada por ligação na presença de uma titulação de um excesso molar de 100 vezes de um anticorpo não rotulado e foi subtraída do CPM total para calcular a ligação específica.
Uma curva padrão linear de concentração de 125I-NKG2A.9 versus CPM foi usada para extrapolar a atividade es- pecífica, nM máximo de 125I-NKG2A.9 ligado e, desse modo, calcular o número de receptores por célula.
Os resultados da análise de Scatchard mostraram que NKG2A.9 especificamente se ligou a CHO- hNKG2A com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 0,4 nM e a transfectantes de CHO-cynoNKG2A com uma KD de 0,1 nM.
A afinidade de ligação relativa de NKG2A.9 para NKG2A de cinomolgo foi determinada via SPR pelo fluxo de Fab NKG2A.9 sobre um chip CM4 com NKG2A-CD94-mFc de macaco imobilizado (constructo truncado para alcançar a expressão). NKG2A humana-CD94-mFc acoplado a uma segunda célula de fluxo serviu como controle.
Outra célula de fluxo foi deixada em branco para a subtração de referência.
A medição foi conduzida em um instrumento Biacore T200 a 37 ºC usando solução salina tamponada com Hepes (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl) em pH 7,4 suplementado com 0,05% de Tween-20 e 1 g/L de BSA como tampão de execução.
Uma série de concentrações de Fab NKG2A.9 foi injetada sobre as diferentes células de fluxo.
Todos os dados foram du- plamente referenciados e ajustados a um modelo Langmuir 1: usando o software de avaliação Biacore T200 versão 3.1. Nesse ensaio, a ligação monovalente de Fab NKG2A.9 à NKG2A humana foi aproximadamente 26 vezes mais forte do que a ligação à NKG2A de cinomolgo.
O valor de KD como medido por SPR para NKG2A humana foi de 61 nM, e o valor de KD como medido por SPR para NKG2A de cinomolgo foi de 1600 nM, como mostrado na tabela abaixo.
Esses valores de KD indica- ram que Fab NKG2A.9 se liga a à NKG2A de cinomolgo recombinante, mas concentrações de Fab mais altas devem ser usadas para atingir um nível de ligação (nível de saturação) similar ao de NKG2A humana. hNKG2A-CD94 cyNKG2A-CD94 KD ratio (cy/h)
Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) KD (nM)
-2 NKG2A.9 Fab 3,4x105 2,0x10 61 nM 1600 nM Cerca de 26
EXEMPLO 4 Mapeamento de Epítopo de Anticorpos anti-NKG2A Métodos conhecidos na técnica foram usados para sondar regiões de NKG2A às quais anticorpos anti-NKG2A, especificamente, 13F3.A4 e NKG2A.9, se ligam.
Espectrometria de massa com troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS) e oxidação fotoquímica rápida de proteí- nas (FPOP) foram usados para sondar epítopos de ligação de hNKG2A com os anticorpos 13F3.A4 e NKG2A.9. Experimentos de HDX-MS em mFc-hNKG2A- hCD94/NKG2A.9 forneceram 95% de sequência de cobertura para mFc-NKG2A-CD94. As medições de FPOP renderam 99% de cobertura de sequência em NKG2A.
A cobertura de sequência total para NKG2A foi 100% com o conjunto de dados de HDX-MS e FPOP combinados.
Da mesma forma, os experimentos de HDX-MS em mFc-hNKG2A- hCD94/13F3 fornecem 95% de cobertura de sequência para mFc- NKG2A-CD94. As medições de FPOP renderam 99% de cobertura de sequência em NKG2A.
A cobertura de sequência total para NKG2A foi de 100% com o conjunto de dados de HDX-MS e FPOP combinados.
Como discutido em mais detalhes neste Exemplo, certas mo- dalidades da presente invenção referem-se a um anticorpo monoclonal anti-NKG2A ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que especifi- camente se liga a um epítopo localizado dentro de regiões descontínuas que abrangem aproximadamente os seguintes resíduos de aminoácido, como determinado por mapeamento de epítopo por HDX-MS e/ou FPOP: Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2 (sequência de aminoácido de hNKG2A nativa); Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); Região 4: L (resíduo de aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um anti- corpo monoclonal anti-NKG2A ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente se liga a um epítopo localizado dentro de regiões descontínuas consistindo nos seguintes resíduos de aminoá- cido, como determinado por HDX-MS: Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2); Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); e
Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). Preparação para experimentos de mapeamento de epítopo.
Antes dos experimentos de mapeamento de epítopo, experi- mentos não deuterados foram realizados para gerar uma lista de peptí- deos comuns para mFc-hNKG2A-hCD94 recombinante e complexos de proteína de mFc-NKG2A-CD94 e Fab 13F3 ou Fab NKG2A.9 parental (15 µM, razão molar de 1:1). Nos experimentos de HDX-MS, 5 µL de cada amostra (mFc-hNKG2A-hCD94 ou mFc-hNKG2A-hCD94 com Fab) foram diluídos em 55 µL de tampão de óxido de deutério (D2O) (10 mM de tampão de fosfato, D2O, pD 7,0) para iniciar as reações de rotu- lagem.
As reações foram realizadas por diferentes períodos de tempo: 20 segundos, 1 minuto, 10 minutos e 4 horas.
Ao final de cada período de reação de rotulagem, a reação foi resfriada bruscamente pela adição de tampão de resfriamento brusco (100 mM de tampão de fosfato com 4 M de cloridrato de guanidina (GdnCl) e 0,4 M de tris(2-carboxiletil)fos- fina (TCEP), pH 2,5, 1:1, volume/volume), e 50 µL de amostra resfriada bruscamente foram injetados no sistema Waters HDX-MS para análise.
Os níveis de captação de deutério pelos peptídeos pépticos comuns fo- ram monitorados na ausência ou presença de Fabs.
Mapeamento de epítopo de 13F3 e NKG2A.9 por HDX-MS.
HDX-MS.
HDX-MS realizad sondagem de conformação de proteína e dinâmica conformacional em solução monitorando a taxa e extensão de troca de deutério de átomos de hidrogênio de amida da estrutura (R.
Huang e G.
Chen, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406: 6541-58 (2014); Wei et al., Drug Discovery Today, 19:95-102 (2014). O nível de HDX depende da acessibilidade de solvente dos áto- mos de hidrogênio de amida da estrutura e das ligações de hidrogênio da proteína.
O aumento de massa da proteína mediante HDX pode ser precisamente medido por MS.
Quando esta técnica é emparelhada com digestão enzimática, as características de estrutura no nível do peptídeo podem ser resolvidas, permitindo a diferenciação de peptídeos expostos à superfície daqueles dobrados dentro.
Normalmente, a rotulagem de deutério e subsequentes experimentos de resfriamento brusco são rea- lizados após digestão enzimática, separação de peptídeo e análise MS.
A Figura 28A mostra HDX diferencial de mFc-hNKG2A- hCD94 após interação com anticorpo NKG2A.9. A Figura 28B mostra HDX diferencial de mFc-NKG2A-CD94 após interação com 13F3.A4. Os dados nas Figuras 28A-B mostram que os epítopos são os mesmos para anticorpos NGK2A.9 e 13F.3.A4. Especificamente, análise de da- dos HDX-MS no anticorpo NKG2A9 em mFc-NKG2A-CD94 indicou que NKG2A9 e o anticorpo monoclonal parental 13F3.A4 compartilham o mesmo epítopo, que são as seguintes quatro regiões descontínuas de hNKG2A (números de resíduos correspondem à sequência de hNKG2A nativa): Região 1: 155LSIDNEEEMKF165 (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2); Região 2: 171PSSWIGVFRNSSHHPW 186 (resíduos de amino- ácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); 192 Região 3: LAFKHEIKDSDN203 (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); e 212 Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC229 (resíduos de ami- noácido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). Epítopo mapeado para sequência mFc-hNKG2A-hCD94 e estrutura de cristal.
FPOP.
A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica de pegada (footprinting) de proteína para determinar in- formações estruturais por meio do mapeamento de oxidação induzida por radicais hidroxil (OH). (Li et al., Analytical Chemistry, 2017, 89, 2250-
2258). A extensão da oxidação induzida por radical hidroxil depende di- retamente da acessibilidade ao solvente de cadeias laterais de aminoá- cidos e das propriedades químicas dos aminoácidos expostos.
Os radi- cais hidroxila, produzidos a partir do peróxido de hidrogênio (H2O2) via ativação de laser, são altamente reativos e produzem modificações co- valentes irreversíveis nas cadeias laterais sem que causar clivagens na estrutura.
FPOP acoplado com digestão enzimática e análise de MS permite a avaliação do nível de peptídeo das alterações nas acessibili- dades ao solvente das cadeias laterais devido às interações proteína- proteína.
As informações de nível de resíduo podem ser alcançadas por fragmentação de fase gasosa das regiões de peptídeo selecionadas por MS/MS.
Esta técnica oferece informações complementares a HDX.
Mapeamento de epítopos por FPOP foi realizado em mFc- NKG2A-CD94 e mFc-NKG2A-CD94 complexado com Fab 13F3 paren- tal (15 µM, proporção molar de 1:1). Da mesma forma, o mapeamento de epítopo por FPOP foi realizado em mFc-NKG2A-CD94 e mFc- NKG2A-CD94 complexado com Fab NKG2A.9 (15 µM, proporção molar de 1:1). Para mapeamento de epítopo de ambos os anticorpos 13F3.A4 e NKG2A.9, um laser excímero de fluoreto de criptônio (KrF) foi usado para gerar radicais hidroxil pela fotólise de H2O2, e o compri- mento de onda de excitação foi ajustado em 248 nm para evitar qualquer mudança de conformação induzida por laser da proteína.
Imediata- mente antes da rotulagem, 5 μL de histidina e 5 μL de H2O2 foram adi- cionados a uma alíquota de proteína.
O volume final da solução de pro- teína foi de 50 μL, e as concentrações finais de histidina foram de 500 μM, e de H2O2 foram de 15 mM.
A amostra foi então injetada em um tubo de sílica fundida com uma janela transparente ultravioleta (UV). A energia do laser foi ajustada para 70 mJ/pulso na frequência de 7,4 Hz.
Tanto FPOP quando os experimentos de controle sem laser foram rea- lizados em triplicata.
Cada réplica foi coletada em um tubo de microcen- trífuga contendo 11 μL de solução de resfriamento brusco (50 nM de catalase e 20 mM de metionina). As amostras foram desnaturadas, re- duzidas, alquiladas, desglicosiladas e digeridas com tripsina seguida por análise de Cromatografia Líquida (LC)/MS.
Os níveis de oxidação dos peptídeos trípticos foram monitorados na ausência ou presença do Fab NKG2A.9. Em experimentos FPOP, quatro resíduos, M163, F179, H184 e L206, em hNKG2A exibiram redução significativa (valor P <0,025) nos níveis de oxidação após a ligação com Fab 13F3 parental.
Da mesma forma, em experimentos FPOP, quatro resíduos, M163, F179, H184 e L206, em hNKG2A exibiram redução significativa (valor P <0,025) nos níveis de oxidação após a ligação com NKG2A9. Para ambos os anticorpos 13F3.A4 e NKG2A.9, a porcenta- gem de proteção de FPOP após a ligação de Fab foi calculada como: (% Relativa de diferença de FPOP em hNKG2A) − (% Relativa de diferença de FPOP em complexo hNKG2A/Fab) 𝑋 100 % Relativa de diferença de FPOP em hNKG2A
A Figura 29A exibe os percentuais de proteção para quatro resíduos (M163, F179, H184, L206) em hNKG2A mediante interação com NKG2A.9. A Figura 29B exibe as porcentagens de proteção de FPOP para quatro resíduos (M163, F179, H184, L206) em hNKG2A me- diante interação com 13F3.A4. Epítopo mapeado para sequência mFc-NKG2A-CD94 e estrutura cris- talina.
Como mostrado na Figura 30, os epítopos de anticorpos NKG2A.9 e 13F3.A4 determinados por HDX-MS e por FPOP foram ma- peados para a sequência mFc-hNKG2A-hCD94. Na sequência mFc- hNKG2A-hCD94, mFc é a região Fc de camundongo, que é ligada por meio de uma sequência de ligante ASIEGR (SEQ ID NO: 123) (mos- trada por uma caixa com linhas tracejadas) ao domínio extracelular de hNKG2A, que é ligada através de uma sequência de ligante GGSGGS (SEQ ID NO: 124) (mostrada por uma caixa com linhas tracejadas) a hCD94, que é a proteína CD94 humana.
Como mostrado na Figura 31, o epítopo de anticorpo anti- NKG2A (por exemplo, epítopos de anticorpos NKG2A.9 e 13F3.A4) pode ser visualizado na estrutura de cristal NKG2A/CD94/HLA-E.
Espe- cificamente, a Figura 31 representa o epítopo de anticorpo anti-NKG2A (mostrado em preto) na estrutura de cristal NKG2A/CD94/HLA-E (CD94/NKG2A humana em complexo com a estrutura de cristal de HLA- E foi publicado por Petrie et al., J.
Exp.
Med. 205: 725-35 (2008), que é incorporado por referência na sua totalidade). A estrutura de cristal de HLA-E é indicada com uma oval sólida, e a estrutura de cristal de CD94 é indicada com uma oval pontilhada.
Em resumo, com base nos experimentos de HDX-MS e FPOP discutidos neste documento, o epítopo de NKG2A ao qual os an- ticorpos NKG2A.9 e 13F3.A4 se ligam inclui as seguintes regiões de ligação descontínua: Região 1: LSIDNEEEMKF (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2); Região 2: PSSWIGVFRNSSHHPW (resíduos de aminoácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); Região 3: LAFKHEIKDSDN (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); Região 4: L (resíduo de aminoácido 206 de SEQ ID NO: 2); e Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC (resíduos de aminoá- cido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). Em outras modalidades, com base nos experimentos de HDX-MS discutidos neste documento, o epítopo de NKG2A ao qual os anticorpos NKG2A.9 e 13F3.A4 se ligam inclui as seguintes regiões de ligação descontínua: Região 1: LSIDNEEEMKF (resíduos de aminoácido 155 a 165 de SEQ ID NO: 2); Região 2: PSSWIGVFRNSSHHPW (resíduos de aminoácido 171 a 186 de SEQ ID NO: 2); Região 3: LAFKHEIKDSDN (resíduos de aminoácido 192 a 203 de SEQ ID NO: 2); e Região 5: QVNRLKSAQCGSSIIYHC (resíduos de aminoá- cido 212 a 229 de SEQ ID NO: 2). EXEMPLO 5 Experimentos de Binning de Epítopo (1) Anticorpo P1-069366 bloqueou de forma cruzada 13F3.A4 Um experimento de binning de epítopo para P1-069366 e 13F3.A4 foi realizado por SPR usando um “formato sanduíche”, em que o anticorpo 1 é imobilizado em um chip Biacore T100 CM5, a proteína CD94-NKG2A humana recombinante é escoada sobre o chip Biacore T100 CM5 e deixada ligar, e então o anticorpo 2 é escoado sobre o chip.
Especificamente, os anticorpos 13F3.A4 ou P1- foram imobilizados em um chip de sensor CM5 por acoplamento de amina.
Uma solução de proteína NKG2A recombinante foi escoada sobre o chip de sensor onde observou-se ligar ambos os anticorpos P1-069366 e 13F3.A4. Uma so- lução de anticorpo de competição foi então escoada sobre o chip, e li- gação adicional foi medida (indicativa de coligação a NKG2A). Por fim, o chip de sensor foi regenerado utilizando uma solução de MgCl2, que removeu NKG2A ligado e anticorpo de competição.
O experimento foi conduzido a 25 ºC.
Para análise, ligação não específica à célula de fluxo de referência foi subtraída da ligação às células de fluxo analítico.
O anticorpo P1-069366 foi diretamente imobilizado na célula de fluxo 2. Em seguida, 200 nM de NKG2A foram escoados na célula de fluxo 2, e observou-se que aproximadamente 600 RU ligaram-se.
A injeção sub- sequente de anticorpo 13F3.A4, anticorpo P1-069366 ou tampão (HBS- P) não resultou em aumento do sinal de ligação.
Anticorpo 13F3.A4 foi imobilizado na célula de fluxo 3. Em seguida, 200 nM de NKG2A foram escoados pela célula de fluxo 3, e observou-se que aproximadamente 900 RU ligaram-se.
A injeção subsequente de anticorpo P1-069366, an- ticorpo 13F3.A4, ou tampão (HBS-P) não resultou em aumento do sinal de ligação.
Em conclusão, o anticorpo P1-069366 pareceu bloquear de forma cruzada 13F3.A4 com base nos resultados do experimento de binning de epítopo. (2) 13F3.A4, 2G6.C2 bloquearam um ao outro, bem como HLA-E de se ligar a CD94-NKG2A humana.
Em outro experimento de bloqueio e binning de epítopo que foi realizado em um instrumento Octeto HTX usando o “formato sandu- íche”, anticorpo 13F3.A4, anticorpo 2G6.C2, bem como HLA-E foram testados para ligação simultânea a NKG2A humana.
Os anticorpos e HLA-E biotinilado foram capturados em pontas de sensor Octeto sepa- radas.
Em seguida, os sítios de captura restantes foram bloqueados, se necessário, e CD94-NKG2A humana foi ligada.
A ligação subsequente de anticorpo 13F3.A4, anticorpo 2G6.C2, e HLA-E a NKG2A-CD94 pré- ligado foi testada, sondando todas as combinações de pares dessas três amostras.
Esses experimentos de binning de epítopo mostraram que os anticorpos 13F3.A4 e 2G6.C2 bloqueiam um ao outro, bem como HLA- E de se ligar a CD94-NKG2A humana. (3) Atividade de ligação de anticorpo 2G6.C2 Os experimentos de Octeto também mostraram a ligação do anticorpo 2G6.C2 não apenas a CD94-NKG2A humana, mas também a um constructo de NKG2A-CD94-mFc de cinomolgo.
A cinética do anti- corpo 2G6.C2 ligando-se a heterodímeros CD94-NKG2A humana e
CD94-NKG2C foi medida em um instrumento Biacore T200 a 37 ºC cap- turando o anticorpo em um chip CM4 com anticorpo anti-hFc pré-imobi- lizado e fluindo os antígenos como analitos com uma faixa de concen- tração apropriada.
Todos os dados foram duplamente referenciados e ajustados a um modelo de ligação 1:1 usando o software de avaliação Biacore T200 versão 3.1. Os experimentos Biacore mostraram que o anticorpo 2G6.C2 tinha uma afinidade de ligação mais fraca do que o anticorpo 13F3.A4, e que tem alguma reatividade cruzada com NKG2C, como resumido abaixo.
Capturado Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Meia-vida de Complexo de Anticorpo/Analito (segundos)
2G6.C2 hNKG2A-CD94 4,0x105 3,6x10-2 9,1x10-8 19
2G6.C2 hNKG2C-CD94 2,8x104 3,0x10-2 1,1x10-6 23
EXEMPLO 6 Descoberta de Anticorpos Anti-NKG2A Adicionais Como mostrado nas Figuras 32A-B, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de certos anticorpos anti-NKG2A (13F3.A4, NKG2A.9 e NKG2A.11) foram alinhadas usando o software Clutsal 2.1. Esse alinhamento resultou na descoberta de anticorpos anti-NKG2A com as seguintes sequências de CDR consenso: HCDR1: SHSMN (SEQ ID NO: 10) HCDR2: AISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 11) HCDR3: EEWGLPFDY (SEQ ID NO: 12) LCDR1: RASQGISSALA (SEQ ID NO: 13, para anticorpo NKG2A.9); RASQGIPSALA (SEQ ID NO: 154, para anticorpo NKG2A.11) ou RASQGINSALA (SEQ ID NO: 155, for 13F3.A4 anti- corpo). LCDR2: DASSLKS (SEQ ID NO: 14)
LCDR3: QQFNSYPLT (SEQ ID NO: 15) EXEMPLO 7 Desenvolvimento de anticorpo NKG2A.9 com um Fc inerte (IgG1.3) para reduzir ou evitar ligação de receptor Fc gama (FcγR) Uma vez que NKG2A é um receptor inibidor expresso em células NK e T CD8+, acredita-se que evitar ou reduzir o agonismo ou depleção de células NK ou T CD8+ de NKG2A+ aumenta a imunidade antitumoral.
Dessa forma, o bloqueio da interação de NKG2A/HLA-E foi desejado com um anticorpo anti-NKG2A incapaz de interagir com FcγRs humanos.
Como resumido no Estudo 1 abaixo, avaliou-se o papel do isótipo na mediação da inibição de crescimento tumoral no modelo de sarcoma 1956. O anticorpo NKG2A.2 é um anticorpo substituto de ca- mundongo gerado como um isótipo de mIgG2a ou mIgG1-D265A para avaliar o papel de Fc na atividade antitumoral.
Estudo 1 de Modelo Tumoral de Camundongo Finalidade Modelo de tu- Camundongo mAb(s) Regime de Tratamento % de inibição de cresci- mor mento tumoral Receptor (em comparação com con- trole de isótipo)
Eficácia de isóti- Sarcoma 1956 C57Bl/6 NKG2A.2 (mIg2a) Dia 0: 1x106 células por ca- No Dia 21 pos anti- n = 10/grp NKG2A.2 (mIgG1-D265A) mundongo subcutânea (SC) NKG2A.2-g1 D265A: 41% mNKG2A.2 IgG2a NKG2A.2 Dias 6, 9, 12: NKG2A.2-g2a: 0% IgG1-D265A Cada isótipo 10 mg/kg intrape- ritoneal (IP)
No Dia 21 pós-implante, NKG2A.2-mIGg1 D265A inibiu o crescimento tumoral em 41% em comparação com o controle de isótipo.
Em outras palavras, o tratamento de camundongos portando tumor com um mAb anti-mNKG2A contendo um Fc inerte (mNKG2A.2 mIgG1- D265A) levou a uma potente atividade antitumoral.
Porém, quando NKG2A.2 mIgG2a foi administrado, o anticorpo não inibiu o crescimento tumoral.
Em outras palavras, quando o anticorpo NKG2A.2 foi testado com um Fc capaz de interagir com FcγRs de camundongo (mNKG2A.2 mIgG2a), os tumores cresceram mais rápido in vivo.
Quando o mAb anti-hNKG2A com Fc IgG4 foi testado, ele inibiu as respostas de células NK, particularmente na presença de forte estimulação.
Coletivamente, esses dados mostraram que as funções van- tajosas de IgG1.3 humana com Fc inerte foram o isótipo preferido para o anticorpo NKG2A.9. EXEMPLO 8 Anticorpo NKG2A.9 aumentou a atividade funcional de células T Neste ensaio, o anticorpo NKG2A.9 foi testado quanto à sua atividade funcional de reverter a inibição de sinalização de NK-κB em uma linhagem de células T Jukart expressando NKG2A estimulada por CHO/scOKT3/HLA-E (células de Ovário de Hamster Chinês que foram geneticamente manipuladas para expressar OKT3 de cadeia simples e o ligando, HLA-E). Células efetoras Jurkat que expressam NKG2A fo- ram cocultivadas com células alvo CHO/scOKT3/HLA-E em uma razão de célula efetora para célula alvo (E:T) de 1:1. O anticorpo NKG2A.9 ou anticorpo de isótipo (IgG1.3 humana) foi adicionado à cocultura em con- centrações de titulação.
Após quatro horas de estimulação a 37 ºC, a atividade de luciferase foi quantificada utilizando Reagente Bio-Glo (100 µl/cavidade) e leitor de placas EnVision.
Os dados de Unidades Relati- vas de Luciferase (RLU) foram plotados usando o software Prism v5.01 da GraphPad Inc.
O anticorpo NKG2A.9 reverteu a inibição de respostas de cé- lulas T mediada por NKG2A/HLA-E.
Especificamente, como mostrado na Figura 33, o anticorpo NKG2A.9 reverteu a inibição de sinalização de NK-κB em uma linhagem de células T Jukart expressando NKG2A esti- mulada por CHO/scOKT3/HLA-E, com um valor de EC50 de 0,2 nM.
EXEMPLO 9 Produção de IFN-γ de anticorpo NKG2A.9 sozinho e em combinação com anticorpo monoclonal anti-PD-L1 O anticorpo NKG2A.9 induziu IFN-γ em T CD8 NKG2A+ iso- aldas de PBMC de doadores saudáveis cocultivadas com CHO/scOKT3/HLA-E/PD-L1 (células de ovário de hamster chinês que foram geneticamente manipuladas para expressar a OKT3 de cadeia única e os ligandos HLA-E e PD-L1). Produção de IFN-γ aumentada é uma medida de funcionalidade células T aumentada.
O efeito foi signifi- cativamente amplificado quando NKG2A.9 foi combinada com o anti- corpo monoclonal anti-PD-L1. Resumidamente, como descrito na Figura 34A, células T iso- ladas de PBMCs saudáveis foram incubadas com CHO/scOKT3/HLA- E/PD-L1 irradiadas na presença de anticorpo NKG2A.9 e um anticorpo anti-PD-L1 (BMS-936659), ou uma combinação dos mesmos por quatro dias.
As células T foram isoladas de sangue total humano utilizando gra- diente Ficoll e o kit de isolamento de células T humanas (Kit de Isola- mento de Células T Humanas EasySepTM, Stemcell Technologies). A viabilidade celular foi superior a 90%, como determinado pelo contador de células (Nexcelcom Cellometer Auto 2000). 1,5x105 células foram cocultivadas por quatro dias com 2,5x104 células CHO/OKT3/HLA- E/PD-L1 irradiadas (67.000 RAD por 80 minutos; Rad Source Irradiator, RS-2000 Biological System) em rhIL-15 (5 ng/ml) contendo meio na pre- sença de um anticorpo de controle de isótipo (IgG1.3 humano) ou NKG2A.9 e/ou anticorpo anti-PD-L1 humano (BMS-936659). (Células CHO/scOKT3/HLAE/PD-L1 são células de ovário de Hamster Chinês que foram geneticamente manipuladas para expressar OKT3 de cadeia simples e os ligandos HLA-E e PD-L1). No dia quatro da cultura, as cé- lulas foram coletadas e coradas com CD4 anti-humano, CD8 anti-hu- mano, NKG2A anti-humana viva/morta (clone 27H4). A produção de IFN-γ foi avaliada por coloração de citocina intracelular usando o kit BD Cytofix/CytopermTM.
As células fixas foram lidas no BD LSRFortessaTM.
A percentagem de IFN-γ entre células T CD8 NKG2A+ ou NKG2A- foi calculada por FlowJo.
Como mostrado na Figura 34B, um aumento dependente de dose da produção de IFN-γ por células T CD8 NKG2A+ foi observado quando o anticorpo NKG2A.9 foi combinado com o anticorpo anti-PD- L1. Notavelmente, o aumento na produção de IFN-γ não foi observado nas células T CD8 NKG2A-, o que indicou que o efeito do anticorpo NKG2A.9 foi específico e intrínseco às células T CD8 NKG2A+. O anticorpo NKG2A.9 também induziu IFN-γ em células T CD8+ NKG2A+ de tumores humanos cocultivadas com CHO/scOKT3/HLA-E/PD-L1. O efeito foi significativamente amplificado quando o anticorpo NKG2A.9 foi combinado com um anticorpo mono- clonal anti-PD-L1 (BMS-936659). Resumidamente, como mostrado nas Figura 35A-B, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) de amostras de carci- noma de células renais, melanoma ou tumor endometrial foram coculti- vadas com CHO/scOKT3/HLA-E/PD-L1 irradiada na presença do anti- corpo NKG2A.9, anti-PD-L1, ou sua combinação por quatro dias.
O an- ticorpo NKG2A.9 não aumentou os níveis de IFN-γ por TIL CD8 NKG2A+ sobre o anticorpo monoclonal de controle, enquanto o anti- corpo anti-PD-L1 estimulou os níveis de IFN-γ por TIL CD8 NKG2A+ sobre o anticorpo de isótipo (P = 0,01). A maior resposta de IFN-γ foi observada com a combinação do anticorpo NKG2A.9 e mAb anti-PD-L1 em comparação com anticorpo de controle de isótipo (P = 0,003), bem como em comparação com anti-PD-L1 sozinho (P = 0,04), como mos- trado na Figura 35B.
EXEMPLO 10 Anticorpo NKG2A.9 foi desejavelmente interbalizado após ligação à cé- lula que expressa NKG2A Como descrito nos exemplos acima, observou-se a sub-re- gulação da expressão de superfície de NKG2A após a incubação de células NK ou T CD8+ humanas com o anticorpo NKG2A.9. Para deter- minar se o anticorpo NKG2A.9 foi internalizado na célula, anticorpo NKG2A.9 rotulado com Alexa Fluor 488 ou anticorpo monoclonal de controle de isótipo (anticorpo IgG1 humano de KLH) foi adicionado às células NKL, e os níveis de anticorpos monoclonais ligados à superfície e intracelulares foram medidos.
Internacionalização do anticorpo mostra o engajamento alvo do anticorpo ao receptor.
Como mostrado na Figura 36A, o anticorpo NKG2A.9 demonstrou internalização em uma hora e aumentou em 20 horas.
O anticorpo NKG2A.9 foi gradualmente interna- lizado pelas células NKL e atingiu um nível de platô de cerca de 40% de internalização em 20 horas.
Para quantificar a internalização do anti- corpo NKG2A.9 em formato dose-resposta, o ensaio de corante sensí- vel ao pH foi realizado em células NKL.
Como mostrado na Figura 36B, em duas horas, o anticorpo NKG2A.9 demonstrou uma internalização dependente da dose com um EC50 de 0,5 nM.
EXEMPLO 11 Anticorpo NKG2A.9 aumentou a desgranulação de células extermina- doras naturais e lise de células tumorais expressando HLA-E Em experimentos in vitro usando PBMCs de doadores nor- mais, o bloqueio de anticorpo anti-NKG2A da interação de NKG2A/HLA- E entre células NK ativadas resultou em aumento da desgranulação de células NK.
Como descrito na Figura 37A, as células NK isoaldas de dadores de PBMC normais foram ativadas durante a noite com IL-2 hu- mana recombinante (rh). As células NK foram, então, cocultivadas com a linhagem celular alvo B-linfoblastoide humana 721.221 expressando HLA-E.
Como mostrado na Figura 37B, o anticorpo NKG2A.9, em com- paração com o isótipo, aumentou a desgranulação de células NK de uma maneira dependente de dose, como medido por % da expressão de CD107a por citometria de fluxo.
A reversão da inibição da citotoxici- dade de células NK mediada por NKG2A/HLA-E foi avaliada in vitro.
Como apresentado na Figura 37C, HSC-3, uma linhagem celular de câncer oral humano, foi selecionada com base em sua expressão endó- gena de HLA-E.
As células NKL foram cocultivadas com as células alvo HSC-3 rotuladas com Calceína AM (um corante celular permanente) em uma razão de efetora para alvo de 20:1 na presença de NKG2A.9 ou anticorpo de controle de isótipo (IgG1.3 humana). A quantidade de cal- ceína liberada após duas horas foi medida e usada para indicar o nível de lise das células alvo.
Como mostrado na Figura 37D, o anticorpo NKG2A.9, em comparação com o isótipo, aumentou a lise de células tumorais que expressam HLA-E de maneira dependente de dose.
EXEMPLO 12 Anticorpo 13F3.A4 apresentou funcionalidade de células NK aumentada A Figura 38A ilustra o método usado para medir o efeito do anticorpo 13F3.A4 sobre a produção de IFN-γ em células NKL coculti- vadas com CHO/MICA/HLA-E.
Similar ao anticorpo NKG2A.9, a Figura 38B mostra que o anticorpo 13F3.A4 aumentou a produção de IFN-γ em linfócitos exterminadores naturais (NKL) cocultivados com CHO/MICA/HLA-E (células de ovário de hamster chinês que foram ge- neticamente manipuladas para expressar MICA e HLA-E) em compara- ção com o isótipo.
EXEMPLO 13 Afinidades de ligação comparativas de NKG2A.9 Uma comparação das cinéticas e afinidades de ligação de NKG2A.9, Z270, e monalizumab para ligação a hNKG2A-hCD94 foi feita usando um instrumento biossensor Biacore T200 e um heterodímero dos domínios extracelulares de CD94 e NKG2A humana.
A temperatura foi de 37ºC e o tampão de execução foi solução salina tamponada com Hepes (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl) em pH 7,4 suplementado com 0,05% de Tween-20 e 1 g/L de BSA.
Os anticorpos foram captura-
dos em um chip de sensor C1 com reagente de captura de Fc anti-hu- mano pré-imobilizado (Southern Biotech catálogo número 2081-01). O domínio extracelular de NKG2A humana foi escoado como analito sobre os anticorpos capturados em duas séries de concentração de cinco membros e três vezes com concentração superior de 250 nM: uma série de concentração foi usada para cinética de ciclo único e a outra, para cinética de ciclo múltiplo com uma injeção duplicada a 83 nM.
Todos os dados foram duplamente referenciados e ajustados para um modelo de ligação 1:1 usando o Software de Avaliação Biacore T200 versão 3.1. Duas execuções independentes foram realizadas, usando uma célula de fluxo diferente para cada ensaio monoclonal na segunda execução.
Dessa forma, quatro medições de KD foram obtidas.
Quando aplicável, o ajuste cinético e o ajuste de estado estacionário foram usados para analisar os dados.
A Figura 51A-D mostra a ligação de afinidade do anticorpo NKG2A.9 a heterodímero CD94-NKG2A humana a 37 ºC como deter- minado por Biacore em medições em quadruplicata usando ambas as cinéticas de ciclo único e multiciclo.
A Figura 51A-D mostra unidades de resposta (RU) de ligação NKG2A-CD94 versus tempo em segundos.
O anticorpo NKG2A.9 mostrou maior afinidade (KD = 16 nM ± 0,4 nM; média ± desvio padrão) do que Z270 (KD = 25 nM ± 3nM) e monalizumab (KD = 26 nM ± 3nM) neste ensaio, como resumido na Ta- bela abaixo.
A afinidade geral para NKG2A.9 é maior neste ensaio do que no experimento usando Fab NKG2A.9 no Exemplo 3; a diferença pode ser devido a uma taxa de associação mais rápida (ka), enquanto a taxa de dissociação (kd) é muito similar.
A taxa de associação mais rá- pida (ka) neste ensaio pode ser refletida pelas condições mais otimiza- das, em particular, pelo uso de um chip de sensor plano, que foram usa- das devido a menos restrições de reagentes para NKG2A humana ver- sus de cinomolgo.
Tabela - Afinidade comparativa de anticorpos anti-NKG2A e meia- vida de complexo de anticorpo/analito Anticorpo capturado Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) Meia-vida de Complexo de an- ticorpo/analito (segundos, s) NKG2A.9 hNKG2A-hCD94 1,1x106 ± 0,1x106 1,7x10-2 ± 16,0 nM ± 0,4 nM 37 a 45 s 0,2x10-2
Z270 8x106 2x10-1 25 nM ± 3 nM 3s a 4s Monalizumab 7x106 2x10-1 26 nM ± 3 nM 3s a 4s
KD foi a média de quatro medições.
Desvio padrão é mostrado onde aplicado.
A meia-vida de um complexo 1:1, tal como um sítio de liga- ção de anticorpo ligado a um heterodímero CD94-NKG2A, é o tempo que leva para metade da quantidade do complexo de anticorpo/analito (no presente documento, o complexo anticorpo:NKG2A-CD94) se dis- sociar.
A meia-vida pode ser matematicamente descrita como ln(2)/k d.
A meia-vida do complexo de anticorpo:NKG2A-CD94 foi aproximada- mente 12 vezes mais longa para NKG2A.9 (41 segundos) do que para ambos Z270 e monalizumab (3 a 4 segundos). Sob condições de ligação monovalente em uma superfície celular (por exemplo, devido à baixa expressão de antígeno), NKG2A.9 pode, assim, envolver o complexo NKG2A-CD94 por um período de tempo mais longo do que Z270 e monalizumab.
Acredita-se que essa meia-vida mais longa do complexo de anticorpo/NKG2A-CD94 permite maior eficiência no no bloqueio de ligando.
Em outras palavras, a meia- vida mais longa do complexo de NKG2A.9/NKG2A-CD94 em compara- ção com monalizumab/NKG2A-CD94 ou Z270/NKG2A-CD94 forneceu evidência da capacidade do anticorpo NKG2A.9 para melhor bloquear a interação de NKG2A/HLA-E em comparação com monalizumab ou Z270. EXEMPLO 14 Propriedades de anticorpos anti-mNKG2A in vitro Anticorpos de substituição anti-mNKG2A, NKG2A.2 (clone 20D5, eBioscience, mIgG1-D265A) e NKG2A.3 (clone 7E6, mIgG1-
D265A), tiveram propriedades funcionais similares ao anticorpo NKG2A.9 quando avaliado in vitro permitindo que esses anticorpos sir- vam como anticorpos substitutos para a prova de conceito, mecanismo de ação (MOA) e estudos de projeção de dose humana.
Ao anticorpos de camundongo anti-NKG2A NKG2A.2 e NKG2A.3 tiveram as seguintes propriedades ativas: 1) Os valores de EC50 para ligação a células CHO que ex- pressam mNKG2A foram 0,2 nM (NKG2A.2) e 0,3 nM (NKG2A.3). 2) Os valores de IC50 para o bloqueio da ligação de tetrâmero Qa-1b a células CHO que expressam mNKG2A foram 0,3 nM (NKG2A.2) e 0,4 nM (NKG2A.3). (Qa-1b é o homólogo local para HLA- E em seres humanos.
Dessa forma, este é comparável ao ensaio de bloqueio de hNKG2A/HLA-E de CHO). 3) NKG2A.2 e NKG2A.3 se ligaram especificamente a mNKG2A, pois não se ligaram a células T CD8 ou NK NKG2A-/-. 4) Anticorpos NKG2A.2 e NKG2A.3 induziram um aumento dependente de dose na desgranulação de células NK de camundongo.
EXEMPLO 15 Atividade antitumoral in vivo induzida por anticorpos anti-mNKG2A, so- zinhos e em combinação com outros agentes (1) Atividade antitumoral induzida por anticorpos anti-mNKG2A como uma monoterapia em modelos de camundongos Anticorpos monoclonais anti-mNKG2A (incluindo os anticor- pos NKG2A.2 e NKG2A.3) quando administrados como um único agente inibiram o crescimento tumoral em carcinoma de cólon CT26, sarcoma1956, e modelos de linfoma subcutâneo (SC) de células B A20, como resumido no Estudo 2 abaixo.
Resumo dos Estudos 2-4 de Modelo Tumoral de Camundongo
Studo Nº.
Finalidade Modelo de Tumor Camundongo Receptor mAb(s) Regime de Tratamento % de Inibição de Crescimento Tumoral (em comparação com controle de isótipo)
2 Título de dose de Carcinoma de cólon CT26 BALB/c NKG2A.3 (mIgG1- Dia 0: 1x106 células por ca- No Dia 20 anti-mNKG2A.3 n =10/grupo D265A) mundongo SC NKG2A.3 (10 mg/kg) + Anti-PD-1 Ab: 96% Dias 6, 10, 13, 17, 20: NKG2A.3 (1 mg/kg) + Anti-PD-1 Ab: 96% Anti-PD-1 Ab NKG2A 10, 3, 1, 0,3 mg/kg Anti-PD-1 Ab: 88% (mIGg1 D265A) intraperitoneal ( IP) NKG2A.3(3 mg/kg) + Anti-PD-1 Ab: 76% PD-1 (mPD1-4h2-mg1- NKG2A.3(0,3 mg/kg) + Anti-PD-1 Ab: 71% D265A, camundongo substi- NKG2A.3 (3 mg/kg): 56% tuto para nivolumab) 10 NKG2A.3(10 mg/kg): 49% mg/kg IP NKG2A.3(1 mg/kg): 31% NKG2A.3(0,3 mg/kg): 0%
Cada anticorpo administrado a 10 mg/kg IP
3 Eficácia de anti- Carcinoma de cólon CT26 BALB/c NKG2A.3 (mIgG1- Dia 0: 1x106 células por ca- No Dia 24 mNKG2A.3 em n =10/grupo D265A) mundongo SC NKG2A.3 +anti-PD-1 Ab (Clone 4H2, mIgGg1- combinação com Dias 6, 10, 13, 17, 20: D265aA: 91% outros inibidores de Anti-PD-1 Ab Cada anticorpo administrado NKG2A.3 + anti-TIGIT Ab (Clone 4H2, mIgG1- ponto de verifica- (mIgG1 D265A) a 10 mg/kg IP D265A: 88% ção NKG2A.3: 42% Anti-TIGIT Ab Anti-PD-1 Ab: 61% (mIg2a) Anti-TIGIT Ab: 78%
4 Eficácia de anti- Linfoma de células B A20 BALB/c NKG2A.2 (mIgG1- Dia 0: 5x106 células por ca- No Dia 23 mNKG2A.2 em n = 10/grupo D265A) mundongo SC NKG2A.3+Anti-PD-1 Ab: 94% combinação com Dias 6, 9, 12, 15, 18: Anti-PD-1 Ab: 75% inibidores de ponto Anti-PD-1 Ab Cada anticorpo dosado a 10 NKG2A.3: 58% de verificação em (mIgG1-D265A) mg/kg IP NKG2A.3+Anti-TIGIT Ab: 51% modelo de linfoma Anti-TIGIT Ab: 32% subcutâneo Anti-TIGIT Ab (mIg2a)
Camundongos livres de tumor no final do estudo Anti-NKG2A A + Anti-PD-1 Ab: 8/9 camundon- gos livres de tumor no final do estudo (TF) Anti-NKG2A Ab +Anti-TIGIT Ab: 4/9 TF Anti-PD-1 Ab: 3/9 TF Anti-NKG2A Ab: 1/9 TF Anti-TIGIT Ab: 0/9 TF Isótipo: 0/9 TF
Como mostrado na Figura 39, em um estudo de titulação de dose (Estudo Nº. 2 descrito acima) com o modelo de tumor CT26, o anticorpo NKG2A.3 reduziu o tamanho do tumor quando administrado em doses de 10 mg/kg, 3 mg/kg, e 1 mg/kg (48%, 56% e 30% de redu- ção no volume médio do tumor, respectivamente). (2) Atividade antitumoral potencializada por combinação de anticorpos anti-mPD-1 e anti-mNKG2A em comparação com qualquer agente único sozinho em modelos de tumor múltiplo de camundongo.
Cobloqueio com os anticorpos anti-NKG2A (mNKG2A.3- mG1-D265A (clone 7E6) e anti-PD-1 (PD1-4H2-mG1-D265A, clone 6A1) reduziu o crescimento tumoral em modelos em que o anticorpo monoclonal anti-NKG2A sozinho apresentou atividade de agente único.
A combinação de anticorpos anti-mPD-1 e anti-mNKG2A demonstrou maior atividade antitumoral do que qualquer agente único sozinho no modelo de tumor CT26. No modelo CT26, o tratamento de agente único com anticor- pos anti-mNKG2A ou anti-mPD-1 reduziu o volume médio do tumor em 43% e 61%, respectivamente.
O cobloqueio de NKG2A e PD-1 levou a uma inibição do crescimento tumoral relativamente mais forte, com 7/10 camundongos livres de tumor (TF) ao final do estudo (Figura 40D) e diminuição de 91% no volume médio do tumor (Figura 40E). As Figuras 40A-D mostram o volume do tumor em vários pontos de tempo após a implantação do tumor em camundongos (n = 10/grupo) tratados com isótipo (Figura 40A), anticorpo anti-mNKG2A sozinho (Figura 40B), anti- mPD-1 sozinho (Figura 40C), ou uma combinação de anticorpos anti- mNKG2A e anti-mPD1 (Figura 40D). A Figura 40E mostra o volume de tumor médio em função do tempo (dias pós-implante do tumor) em ca- mundongos tratados com isótipo, anticorpo anti-mNKG2A sozinho, an- ticorpo anti-mPD-1 sozinho, ou uma combinação de anticorpos anti- mNKG2A e anti-mPD-1. Efeitos similares foram observados em camundongos inocu- lados com tumores de sarcoma 956 ou linfoma SC A20, como resumido nos Estudos 3 e 4 abaixo.
Resumo dos Estudos 3 e 4 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo nº.
Finalidade Modelo de tu- Camundongo Receptor mAb(s) Regime de Trata- % de inibição de crescimento tu- mor mento moral (em comparação com controle de isótipo)
3 Eficácia de anti- CT26 carcinoma BALB/c NKG2A.3 (mIgG1-D265A) Dia 0: 1x106 células No Dia 24 mNKG2A.3 em com- de cólon n =10/grupo por camundongo SC NKG2A.3 +anti-PD-1 Ab: 91% binação com outros Anti-PD-1 Ab Dias 6, 10, 13, 17, 20: NKG2A.3 + anti-TIGIT Ab (10A7 inibidores de ponto (mIGg1 D265A) Cada anticorpo admi- clone, mIgG1-D265A): 88% de verificação nistrado a 10 mg/kg IP NKG2A.3: 42% Anti-TIGIT Ab (mIg2a) Anti-PD-1 Ab: 61% Anti-TIGIT Ab: 78%
4 Eficácia de anti- Linfoma de cé- BALB/c NKG2A.2 (mIgG1-D265A) Dia 0: 5x106 células No Dia 23 mNKG2A.2 em com- lulas B A20 n = 10/grupo por camundongo SC NKG2A.3+ anti-PD-1 Ab: 94% binação com inibido- Anti-PD-1 (mIgG1-D265A) Dias 6, 9, 12, 15, 18: Anti-PD-1 Ab: 75% res de ponto de veri- Ab Cada anticorpo do- NKG2A.3: 58% ficação em modelo sado a 10 mg/kg IP NKG2A.3+ anti-TIGIT Ab: 51% de linfoma subcutâ- Anti-TIGIT (mIg2a) Ab Anti-TIGIT Ab: 32% neo
Camundongos livres de tumor no final do estudo NKG2A+anti-PD-1 Ab: 8/9 ca- mundongos livres de tumor no final do estudo (TF) NKG2A+Anti-TIGIT Ab: 4/9 TF Anti-PD-1 Ab: 3/9 TF NKG2A: 1/9 TF Anti-TIGIT Ab: 0/9 TF Isótipo: 0/9 TF
O cobloqueio de NKG2A/PD-1 aumentou a inibição de cresi- mento tumoral mesmo em modelos em que anticorpos monoclonais anti-NKG2As sozinhos (NKG2A.3-mG1-D265A (clone 7E6) ou NKG2A.2-mg1-D265A (clone 4F12)) não apresentaram atividade de agente único.
No modelo de tumor de pulmão M109, o cobloqueio de anticorpos anti-NKG2A e anti-PD-1 levou a uma diminuição de 72% no volume médio de tumor em comparação com o controle de isótipo, como resumido no Estudo 5 abaixo.
Resumo do Estudo 5 de Modelo Tumoral de Camundongo % de inibição de cresci- Estudo Finalidade Modelo de Camundongo mAb(s) Regime de Tratamento mento tumoral nº. tumor Receptor (em comparação com con- trole de isótipo)
5 Eficácia de anti- M109 lung BALB/c NKG2A.2 (mIgG1-D265A) Dia 0: 2x105 células por ca- No Dia 25 mNKG2A.2 em carcinoma n = 10/grupo mundongo SC NKG2A+Anti-PD-1 Ab: 72% combinação com Anti-PD-1 Ab (mIgG1- Dia 7, 10, 13: Anti-PD-1 Ab: 17% anti-mPD-1 D265A) Cada anticorpo administrado Anti-NKG2A Ab: 11% a 10 mg/kg IP
No modelo de tumor de ovário BR5,1, o cobloqueio de NKG2A e PD-1 levou a uma diminuição de 36% no volume médio do tumor em comparação com controle de isótipo, como resumido no Es- tudo 6 abaixo.
Resumo do Estudo 5 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo nº.
Finalidade Modelo de tu- Camundongo Receptor mAb(s) Regime de Tratamento % de inibição de cres- mor cimento tumoral (em comparação com controle de isótipo)
6 Eficácia de BR5,1 ovário FVB/NJ NKG2A.2 Dia 0: Tumores fragmenta- No Dia 26 anti- n = 15/grupo (mIgG1-D265A) dos SC NKG2A+PD-1: 36% mNKG2A.2 NKG2A: 5% em combina- PD-1 (mIgG1- Dias 5, 8, 11, 14, 17: PD-1: 0% ção com anti- D265A) NKG2A.2 10 mg/kg IP mPD-1 PD-1 5 mg/kg IP
Não foi observada atividade de anti-mNKG2A sozinho ou em combinação com anti-mPD-1 no modelo de carcinoma de cólon MC38, como mostrado no Estudo 7 abaixo.
Sumário do Estudo 7 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo Finalidade Modelo de tumor Camundongo Recep- mAb(s) Regime de Trata- % de inibição de cresci- nº. tor mento mento tumoral (em comparação com con- trole de isótipo)
7 Eficácia de MC38 adenocarci- C57Bl/6 NKG2A.3 (mIgG1- Dia 0: 1e6 células por No eficácia observado anti- noma de cólon n = 10/grupo D265A) camundongo SC mNKG2A.3 Dias 6, 8: com anti- PD-1 (mIgG1- Cada anticorpo admi- mPD-1 D265A) nistrado a 10 mg/kg IP
(3) Anticorpos anti-NKG2A e anti-PD-1 aumentaram a atividade antitu- moral e funcionalidade de células exterminadoras naturais (nk) de ca- mundongo e linfócitos infiltrantes tumorais CD8 (TILs). A eficácia do cobloqueio de NKG2A/PD-1 foi dependente de ambas as células NK e T CD8+. Camundongos portando CT26- foram depletados de células NK ou T CD8+ antes do tratamento com anticor- pos monoclonais anti-mNKG2A e anti-mPD-1. Os camundongos trata- dos com anticorpos anti-mNKG2A (NKG2A.3, clone 7E6, mIgG1- D265A)/anti-mPD-1 (clone 4H2, mIgG1-D265A) tiveram um aumento no volume tumoral médio quando depletados de células T CD8+ (aumento de 191%, volume médio tumoral 2271 ± 699 mm3) ou células NK (au- mento de 94%, volume médio tumoral 1509 ± 800 mm3) em comparação com camundongos que não receberam depleção de anticorpos mono- clonais (volume médio tumoral 778 ± 686mm3), como resumido no Es- tudo 8 abaixo.
Resumo do Estudo 8 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo Finalidade Modelo de tu- Camundongo mAb(s) Regime de Tratamento % de inibição de cresci- nº. mor Receptor mento tumoral (em comparação com con- trole de isótipo)
8 Depleção de célu- CT26 carcinoma BALB/c NKG2A.3 (mIgG1-D265A) Dia 0: 1e6 células por camun- No Dia 21 las NK e T CD8 de cólon n = 10/grupo dongo SC NKG2A.3+PD-1: 60% PD-1 (mIgG1-D265A) NKG2A.3+PD-1+anti-asi- Dias 5, 12, 19: alo GM1: 22% Anti-asialo GM1 (e-Biosci- anti-asialo GM1 (50 µg/mouse) NKG2A.3+PD-1+anti-CD8: ence) ou anti-CD8a (200 µg/mouse) IP 0% Anti-CD8a (53,6,7, BioXCell) Dias 6, 10, 13, 17, 20: Cada anticorpo administrado a 10 mg/kg IP
O cobloqueio de NKG2A/PD-1 aumentou a funcionalidade de TIL T CD8+ e NK.
Após quatro doses de anticorpos monoclonais (Dia 12 após o início do tratamento), os TILs T CD8+ e NK foram analisados por citometria de fluxo.
O tratamento com anti-mNKG2A/anti-mPD-1 le- vou a um aumento da frequência de células NK CD107a+ em relação aos grupos de tratamento de controle de isótipo, como mostrado na Fi- gura 41A.
Estudos de imunofenotipagem no modelo CT26 mostraram que o cobloqueio com os anticorpos anti-NKG2A e anti-PD-1 mostrou um aumento estatisticamente significativo na citotoxicidade de células NK e T CD8+ específicas de tumores e IFN-γ.
O tratamento com anti- mNKG2A/anti-mPD-1 levou a um aumento da frequência de células NK CD107a+ com um aumento de aproximadamente 1,5 vez em relação ao grupo tratado com controle de isótipo.
Um aumento similar na frequência de células T CD8+ citotóxicas foi observado entre células T CD8+ AH- 1+ específicas de tumor, como mostrado na Figura 41B, com um au- mento de aproximadamente 13 vezes em células T CD107a+ Granzyme B+ AH1+ CD8 em relação ao tratado com controle de isótipo.
O coblo-
queio de NKG2A/PD-1 também aumentou a frequência de IFN-γ produ- zindo células T AH-1+ CD8+ com um aumento de aproximadamente 5,5 vezes em células T IFN-γ+ AH-1+ CD8+ em relação ao grupo tratado com controle de isótipo, como mostrado na Figura 41C.
Em resumo, os anticorpos anti-NKG2A e anti-PD-1, isolada- mente ou em combinação, aumentaram a frequência de células T CD8+ citotóxicas entre células T AH-1+ CD8 específicas de tumor.
A adminis- tração de anticorpos anti-NKG2A e anti-PD-1 aumentou a citotoxicidade de células T CD8 específicas de tumor e NK, e IFN-γ no modelo CT. (4) Anticorpos anti-mPD-1 inibiram crescimento tumoral em maior ex- tensão quando combinados com anti-mNKG2A em comparação com a combinação com anticorpos anti-mLAG-3 ou anti-mTIGIT em um mo- delo de camundongo de sarcoma.
Foi mostrado anteriormente que o bloqueio duplo de PD-1 com anticorpos anti-LAG-3 e anti-PD-1 com anticorpos anti-TIGIT siner- gicamente retardou o crescimento tumoral em comparação com trata- mento de agente único em modelos de tumor de camundongo. (Woo et al., “Immune inhibitory molecules LAG-3 and PD-1 synergistically regu- late T-cell function to promote tumoral imune escape.” Cancer Res 72:917-27 (2012); Johnston RJ et al., “The immunoreceptor TIGIT regu- lates antitumor and antiviral CD8 (+) T cell effector function.” Cancer Cell 26:923-937 (2014). Foi examinado o efeito da combinação de anticorpo anti- mPD-1 com anticorpos anti-mNKG2A (NKG2A.3, clone 7E6, mIgG1- D265a), anti-mLAG-3 (clone 1A5, mIgG1-D265A), ou anti- mTIGIT (clone 10A7, mIgG1-D265A) no controle de crescimento tumoral no mo- delo de sarcoma 1956, como resumido no Estudo 9 abaixo.
Sumário do Estudo 9 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo nº.
Finalidade Modelo de tumor Camundongo mAb(s) Regime de Trata- % de inibição de crescimento tu- Receptor mento moral (em comparação com controle de isótipo)
9 Eficácia de anti- 1956 sarcoma C57Bl/6 NKG2A.3 (mIgG1- Dia 0: 1x106 células No Dia 27 mPD-1 em combi- n = 10/grupo D265A) por camundongo SC NKG2A.3 + Anti-PD-1 Ab: 97% nação com anti- Anti-PD-1 Ab + Anti-LAG-3 Ab: mNKG2A.3 e ou- Anti-PD-1 Ab (mIgG1- Dias 6, 9, 12, 15, 18: 91% tros inibidores de D265A) Cada anticorpo admi- Anti-PD-1 Ab: 77% ponto de verifica- TIGIT (mIgG1- D265A) nistrado a 10 mg/kg Anti PD-1 Ab + Anti-TIGIT Ab: 72% ção IP NKG2A.3-D265A: 24% Anti-LAG-3 Ab (mIgG1- Anti-LAG-3-D265A Ab: 0% D265A) Anti-TIGIT-D265A Ab: 0%
Camundongos livres de tumor no final do estudo (TF) NKG2A+PD-1: 6/10 TF LAG-3+PD-1: 4/10 TF PD-1: 2/10 TF PD-1+TIGIT: 1/10 TF NKG2A: 1/10 TF LAG-3: 0/10 TF TIGIT: 0/10 TF Isótipo: 0/10 TF
O bloqueio duplo de PD-1/NKG2A mostrou a eficácia antitu- moral mais forte (6/10 camundongos livres de tumor) em comparação com uma combinação de 1) anticorpos antiPD-1/anti-LAG-3 (4/10 ca- mundongos livres de tumor) e 2) anticorpos anti-PD-1/anti-TIGIT (1/10 camundongos livres de tumor). Anticorpos anti-mNKG2A foram combinados com outros ini- bidores de ponto de verificação incluindo anticorpos anti-mCTLA-4 e anti-LAG-3 para aumentar a eficácia antitumoral em vários modelos de tumor de camundongo.
No modelo 1956, o anticorpo anti-mNKG2A de- monstrou forte atividade quando combinado com anti-mCTLA-4, com redução de 87% no volume de crescimento tumoral médio e 3/10 ca- mundongos livres tumor em comparação com controle de isótipo, como descrito nos estudos resumidos no Estudo 10 e nas Figuras 42A-E.
Sumário do Estudo 10 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo Finalidade Modelo de tu- Camundongo Receptor mAb(s) (com isótipo Regime de Trata- % de inibição de cresci- nº. mor em parênteses) mento mento tumoral (em comparação com con- trole de isótipo)
10 Eficácia de 1956 sarcoma C57Bl/6 NKG2A.3 (mIgG1- Dia 0: 1x106 células No Dia 22 anti- n = 10/grupo D265A) por camundongo SC NKG2A.3+Anti-CTLA-4 mNKG2A.3 Ab: 86% Anti-PD-1 Ab (mIgG1- Dias 6, 9, 12:
em combina- D265A) NKG2A: 10 mg/kg IP NKG2A.3+Anti-PD-1 Ab: ção com me- Anti-PD-1 Ab: 0,3 76% nores doses Anti-CTLA-4 Ab mg/kg IP de outros ini- (mIgG2a) Anti-CTLA-4 Ab: 0,1 Anti-CTLA-4 mIgG2a Ab: bidores de mg/kg IP 51% ponto de veri- NKG2A.3: 26% ficação Anti-PD-1 mIgG1 D265A Ab: 25% As Figuras 42A-E mostram a atividade antitumoral de anti- corpos anti-mNKG2A (10 mg/kg) e anti-mCTLA-4 (0,1 mg/kg), isolada- mente ou em combinação, no modelo de sarcoma de camundongo
1956. As Figuras 42A-D mostram o volume do tumor em vários pontos de tempo após a implantação do tumor em camundongos tratados com isótipo (Figura 42A), anticorpo anti-mCTLA-4 (Figura 42B, CTLA-4 IgG2a, 0,1 mg/kg), anticorpo anti-mNKG2A (Figura 42C, 10 mg/kg), ou combinação de anti-mNKG2A e anti-mCTLA-4 (Figura 42D). A Figura 42E mostra o volume tumoral médio em função do tempo (dias pós-im- plante do tumor) em camundongos tratados com isótipo, anti-mCTLA-4 sozinho, anti-mNKG2A sozinho ou combinação de anti-mNKG2A e anti- mCTLA-4. No modelo de linfoma intravenoso A20, o anticorpo anti- NKG2A sozinho teve um benefício de sobrevivência, com uma taxa de sobrevivência de 10%. Terapia de combinação com anticorpos anti- mPD-1 ou anti-mLAG-3 estenderam o benefício de sobrevivência para 50% e 70%, respectivamente. A combinação tripla de anticorpos anti- mNKG2A, anti-mPD-1 e anti-mLAG-3 proporcionou o maior benefício com uma taxa de sobrevivência de 80%, como resumido no Estudo 11 abaixo e mostrado na Figura 43. Sumário do Estudo 11 de Modelo Tumoral de Camundongo Estudo nº. Finalidade Modelo de tu- Camundongo Recep- mAb(s)(com isótipo Regime de Trata- % de inibição de cresci- mor tor em parênteses) mento mento tumoral (em comparação com con- trole de isótipo)
11 Sobrevivên- Linfoma de cé- BALB/c NKG2A.3 (mIgG1- Dia 0: 2x105 célu- % Sobrevivência no Dia 60: cia após tra- lulas B A20 n = 10/grupo D265A) las por camun- Anti-NKG2A+Anti-PD-1+Anti- tamento com dongo IV LAG-3 Abs: 80%, P=<0,0001 anti- Anti-PD-1 Ab (mIgG1- mNKG2A.3 D265A) Dias 4, 7, 10, 13, Anti-NKG2A+ Anti-LAG-3 em combina- 16: Abs:70%, P=0,0004 ção com inibi- Anto-LAG-3 (mIgG1- Cada anticorpo ad- dores de D265A) ministrado a 10 Anti-NKG2A+Anti-PD-1 Abs: ponto de veri- mg/kg IP 50%, P=0,006 ficação em modelo de Anti-LAG-3 Ab: 40%, P=0,001 linfoma IV Anti-PD-1 Ab: 20%, P=<0,0001
Anti-NKG2A Ab: 10%, P=0,028 (Valor P em comparação com controle de isótipo)
A Figura 43 mostra a atividade antitumoral de anticorpos anti-mNKG2A, anti-PD-1 anti-LAG3, sozinhos e em combinação no mo- delo de linfoma sistêmico A20. Especificamente, a Figura 43 mostra a sobrevida percentual em vários momentos pós-implante tumoral em ca- mundongos (n = 10/grupo) tratados com isótipo, anti-mNKG2A, anti- mPD-1, anti-LAG3 sozinho, ou uma combinação dos mesmos.
Tomados em conjunto, esses dados mostraram que o blo- queio combinatório de anticorpos anti-NKG2A, anti-PD-1, anti-CTLA-4 e anti-LAG-3s tem maior eficácia na redução do crescimento tumoral de camundongos. (5) Anticorpo monoclonal anti-mNKG2A administrado in vivo, NKG2A de superfície sub-regulada em células NK de camundongo Após o tratamento com anticorpo monoclonal anti-mNKG2A (NKG2A.3 (clone 7E6), mIgG1-D265A), o nível de expressão de NKG2A foi reduzido em ambas as células NK esplênicas e TIL em comparação com o isótipo, como mostrado na Figura 44. A Figura 44 mostra a por- centagem de células NK que expressam NKG2A entre células NK NKG2A+, como medido no dia cinco após o primeiro tratamento no baço e tumor em um modelo de carcinoma de cólon CT26 murino.
Observou-
se a sub-regulação da expressão de NKG2A após a administração do anticorpo anti-NKG2A, que indicou que pode ser usado como marcador de engajamento do alvo. A sub-regulação se refere à sub-regulação da expressão de NKG2A de superfície. Engajamento do alvo significa que o anticorpo anti-NKG2A engaja com o receptor de NKG2A. Em conjunto com os dados de internalização discutidos neste documento, esses dados suportam que a sub-regulação de NKG2A servirá como um marcador de engajamento de alvo para o an- ticorpo NKG2A.9. EXEMPLO 16 Propriedades biofísicas, afinidade e mapeamento de epítopo, e imuno- genicidade Como descrito neste documento, a sequência variável de an- ticorpo monoclonal anti-NKG2A totalmente humano NKG2A.9 é deri- vado do hibridoma 13F3.A4 com uma mutação de reversão de linha ger- minativa VH-I107T e uma mutação VK-N30S para mitigar o risco de de- samidação do resíduo de aminoácido VK-N30. A região constante foi derivada de uma estrutura IgG1f (IgG1.3) e inclui três mutações na ca- deia pesada: L234A, L235E e G237A para minimizar ou eliminar a liga- ção de anticorpo a receptores Fcγ e C1q. O anticorpo NKG2A.9 é tam- bém conhecido como 13F3-VH-I107T-VH-N30S IgGf1.3 e NKG2A.9 IgGf1.3. A Tabela abaixo resume as características biofísicas do anti- corpo NKG2A.9 com base na análise do material derivado do sistema de expressão transiente ExpiCHO. Propriedade Método Resultados Identidade SDS-PAGE (eletroforese em gel de Bandas de cadeia pesada e leve confirmadas poliacrilamida-dodecil sulfato de só- Peso molecular desglicosilado (MW) =143.683 Dálton dio) (Da) (como previsto) Mapa de peptídeo LC-MS/MS *Cadeia pesada (HC) : observado 48.893 Da, inferido
48.900 Da, previsto 48.900 Da *Cadeia leve (LC) = observado 23,207 Da, inferido
23.211 Da, previsto 23.210 Da >99% de sequência e estrutura dissulfeto confirmadas
Propriedade Método Resultados por mapeamento de peptídeo e espectrometria de massa. A isoforma e glicosilação de N-297 na cadeia pesada foram confirmadas.
Pureza/Homogeneidade CE-SDS (eletroforese capilar dodecil Não reduzido (NR): 97,0% de monômero, impurezas sulfato de sódio) incluem 2,1% HHL (cadeia pesada-cadeia pesada-ca- deia leve), 0,4% de HL (cadeia pesada-cadeia leve), 0,1% de HH (cadeia pesada-cadeia pesada), 0,3% SEC (Cromatografia por Exclusão de de Reduzido (R): LC 29,5%, HC 69,8%, NGHC 0,7% Tamanho) 98,1% de monômero 95,2%(146 kDa), 2,63% (505 kDa), 1,6% (109 kDa) SE-MALS (combinação de Cromato- 86,4% de pico principal a 35,5 minutes, 13,6% de pico grafia por Exclusão de Tamanho com pré-principal, Análise de Espalhamento de Luz em GOF (78%), G1F (17%), G2F (1%), Man5 (4%), Vários Ângulos) Pico principal pI = 8,9 (59%), Espécies ácidas 35%, Espécies básicas 7%; Faixa pI 8,6-9,1 HIC-HPLC (Cromatografia por Intera- ção Hidrofóbica-Cromatografia Lí- quida de Alto Desemepnho) CE (Eletroforese capilar, Glicanos) cIEF (Focalização isoelétrica capilar) Modificações Químicas Mapa de peptídeo LC-MS/MS (Cro- Muito baixo matografia Líquida-Espectrometria de massa em tandem) Afinidade NKG2A humana** Biacore KD = 36 nM (1:1 modelo de ligação); ka (1/Ms) = 3,0×105, kd (1/s) = 1,1×10-2 at 37°C; reage de forma cruzada com NKG2A de cinomolgo Reversibilidade e Estabilidade DSC (Colorimetria por varredura dife- Tm1 = 68 ºC, Tm2 = 75 ºC, Tm3 = 83ºC Térmica rencial) (diluído em tampão de arma- Reversibilidade a 68 ºC = 92%, a 75 ºC = 49% zenamento) * Método de redução parcial e desglicosilação usado para confirmação de massa de cadeia leve e pesada. ** Heterodímero de CD94-NKG2A humana (hNKG2A-CD94-mFc) usado como antígeno para estudos de ligação. As propriedades biofísicas do anticorpo NKG2A.9 foram fa- voráveis. A identidade do anticorpo NKG2A.9 foi confirmada por SDS- PAGE e análise de espectrometria de massa. A pureza do anticorpo foi maior do que 98% como testado por cromatografia de exclusão por ta- manho (SEC). Um único sítio de N-glicosilação foi confirmado em N297 na cadeia pesada, com um perfil de glicano que foi consistente com o perfil de glicano de anticorpos monoclonais IgG1 expressos em células
CHO.
Apenas glicanos fucosilados (G0f, G1f, G2f e Man5) foram encon- trados.
O anticorpo NKG2A.9 apresentou boa estabilidade térmica e re- versibilidade, o que significa que o anticorpo reteve sua integridade es- trutural sob estresse térmico e apresentou propriedades de redobra- mento modestas quando o estresse foi liberado.
EXEMPLO 17 Estudos de farmacocinética pré-clínica Os dados de farmacocinética suportaram a eficácia do anti- corpo NKG2A.9. Após administração intravenosa (IV) a macacos cino- molgos, o NKG2A.9 apresentou características farmacocinéticas (PK) de anticorpo lineares em doses ≥ 0,5 mg/kg, com uma meia-vida hu- mana prevista (T1/2) de 16 dias.
A dose humana eficaz direcionada à concentração mínima em estado estacionário (Ctrough,ss) para atingir a ocupação de receptor (RO) completa (99%) no sangue foi projetada para ser 2,5 mg/kg IV, a cada quatro semanas.
A dose após a adminis- tração subcutânea (SC) pode variar dependendo da biodisponibilidade SC em seres humanos (tipicamente 50-100%) e se uma taxa de absor- ção SC lenta melhora a Ctrough,ss.
Os esforços de formulação mostraram que uma abordagem de formulação de plataforma pode ser usada para uma formulação pronta para uso (RTU). A avaliação preliminar de viscosidade e estabi- lidade do anticorpo NKG2A.9 em alta concentração (150 mg/mL) e a dose eficaz humana prevista (2,5 mg/kg) indicam que a administração subcutânea pode ser possível em condições de formulação otimizadas.
Os dados toxicológicos mostraram que o anticorpo NKG2A.9 pode ser administrado de forma segura.
Doses de 0 mg/kg, 0,5 mg/kg, 10 mg/kg e 50 mg/kg em macacos cinomolgos foram bem toleradas sem anormalidades identificadas.
A ocupação de receptor no dia 43 (36%, 84% e 97% a 0,1 mg/kg, 10 mg/kg e 50 mg/kg, respectivamente) e o engajamento do alvo (sub-regulação de NKG2A de superfície) foram demonstrados em todas as doses. A sub-regulação se refere à sub-re- gulação da expressão de NKG2A de superfície. Observou-se a sub-re- gulação da expressão de NKG2A após a administração do anticorpo, o que indicou que ele pode ser usado como um marcador de engajamento do alvo (isto é, o anticorpo anti-NKG2A se engaja com o receptor de NKG2A). EXEMPLO 18 Farmacocinética de anti-mNKG2A.3 em camundongos Estudos farmacocinéticos foram conduzidos com um substi- tuto de camundongo anti-mNKG2A (NKG2A.3) que tem propriedades similares ao anticorpo NKG2A.9 após administração intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP) em camundongos C57BL6. A Tabela 3 resume os parâmetros farmacocinéticos obtidos dos estudos. Tabela 3: Parâmetros farmacocinéticos de uma substituição de ca- mundongo anti-mNKG2A (NKG2A.3) após administração IV e IP a ca- mundongos C57BL6 (Média ± Desvio padrão (SD), n = 4 ou 5)* Via de administração Dose Cmax Tmax AUCtot T1/2 CLT Vss (mg/kg) (nM) (horas) (M × dia) (dias) (mL/dia/kg) (mL/kg) IV 0,3 24 ± 6,8 0,25± 0** 0,075 ± 0,010 3,2 ± 26 ± 3,5 121 ± 16 (não portador de tumor) 0,2 1 79 ± 7,8 0,25± 0** 0,38 ± 0,036 3,9 ± 17 ± 1,7 108 ± 15 0,5 10 940 ± 327 0,25± 0** 7,3 ± 2,0 9,4 ± 9,7 ± 2,5 128 ± 19 2,5 IP 0,1 6,9 ± 0,8 2±0 0,014 ± 0,004 n.a. n.a. n.a. (portador de tumor) 10 993 ± 87 2±0 8,0 ± 1,1 n.a. n.a. n.a.
Nota: parâmetros PK foram obtidos usando análise não compartimental de dados de tempo-concentração de fármaco sérica. n.a. significa não aplicável. *Níveis de fármaco séricos foram obtidos de microamostragem serial e corrigidos para um fator de diluição teórica de 17 ou um fator de diluição experimentalmente determinado de 20; **Primeiro ponto de tempo de amostragem.
O anticorpo NKG2A.3 apresentou farmacocinética não linear em camundongos.
Com uma razão de dose intravenosa de 1:3:30, a razão de Área Sob a Curva (AUC) foi de 1:5,1:97. A meia-vida terminal aumentou de 3,2 dias para 9,4 dias quando as doses aumentaram de 0,3 mg/kg para 10 mg/kg.
Da mesma forma, com uma razão de dose IP de 1:100, a razão de AUC foi de 1:571 entre 0,1 e 10 mg/kg.
Além disso, a formação de anticorpos antifármaco (ADAs) não afetou a PK de NKG2A.3 significativamente.
Coletivamente, esses dados mostraram que o anticorpo NKG2A.3 foi submetido à disposição de fármaco medi- ada por alvo (TMDD) em camundongos.
A biodisponibilidade IP estava completa ao comparar os va- lores de AUC a 10 mg/kg entre as vias IV e IP.
Além disso, não houve diferença aparente na exposição sistêmica entre camundongos por- tando tumor e não portando tumor, bem como entre camundongos C57BL6 e BALB/c.
Além disso, um estudo PK/farmacodinâmico (PD) de dose única foi conduzido com o anticorpo NKG2A. 3 no modelo CT26, em que o curso de tempo de níveis de fármaco e ocupação de receptor (RO) foi determinado em ambas a circulação e os tumores.
A razão de concen- tração média de fármaco tumor-soro foi de 0,10 ± 0,07 (N = 33), com a RO no sangue e linfócitos infiltrantes tumorais (TILs) estando completa na dose eficaz de camundongo de 1 mg/kg.
EXEMPLO 19 Farmacocinética do anticorpo NKG2A.9 em macacos cinomolgos Foram caracterizadas as características farmacocinéticas do anticorpo NKG2A.9 em macacos cinomolgos em uma faixa de dosagem de 0,5 mg - 50 mg/kg). Os parâmetros PK do anticorpo NKG2A.9 obtidos de um estudo de toxicocinética (TK)/PD e tolerabilidade em dose única são resumidos na Tabela 4 abaixo.
Tabela 4: Parâmetros farmacocinéticos do anticorpo NKG2A.9 após administração IV a macacos cinomolgos (Média ± SD, N = 3) Dose Cmax Tmax AUC0-42d T1/2 CLT Vss (mg/kg) (nM) (hora) (M × dia) (dia) (mL/dia/kg) (mL/kg) 0,5 0,11 ± 0,01 0,5 ± 0* 1 ± 0,2 14 ± 6 3,1 ± 0,9 53 ± 7
10 2,5 ± 0,29 0,5 ± 0* 22 ± 4 18 ± 3** 2,4 ± 0,5 57 ± 6
50 9,8 ± 2,5 0,5 ± 0* 101 ± 18 23 ± 4 2,5 ± 0,5 77 ± 12
Nota: Parâmetros PK foram obtidos usando análise não compartimental de dados de tempo-concentração de fármaco sérica. *Primeiro ponto no tempo de amostragem; **Duas concentrações de fármaco afetadas por ADAs não foram incluí- das para cálculo de T1/2. A AUC0-42d foi proporcional à dose entre doses de 0,5 mg/kg e 50 mg/kg IV, com meia-vida variando de 14 dias a 23 dias.
Além disso, os resultados de PK foram afetados por ADAs apenas em um macaco.
Além disso, a modelagem de PK/PD dos dados de RO do sangue de macaco revelou que o EC50 de fármaco sérica foi de 20 ± 5,4 nM, que está de acordo com o EC50 in vitro de 31 ± 5,4 nM.
Em conclusão, os estudos demonstraram que o anticorpo anti-NKG2A apresentou boa ocupação de receptor e foi bem tolerado em macacos cinomolgos.
EXEMPLO 20 Farmacocinética humana do anticorpo NKG2A.9 Assume-se que a PK humana do anticorpo NKG2A.9 seja a mesma que a dos macacos.
Como resultado, a dose intravenosa hu- mana prevista do anticorpo NKG2A.9 é de 10 mg/kg, e a meia-vida pre- vista do anticorpo NKG2A.9 em seres humanos é de 16 dias, como re- sumido na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5: Parâmetros farmacocinéticos humanos previstos do anticorpo NKG2A.9
Dose IV AUCtot T1/2 CLT Vss (mg/kg) (M × dia) (dia) (mL/dia/kg) (mL/kg)
10 24 16 2,7 61
EXEMPLO 21 Projeção de dose humana eficaz A dose humana eficaz do anticorpo NKG2A.9 foi projetada usando uma abordagem baseada em RO.
Foram avaliados os dados pré-clínicos in vitro e in vivo disponíveis, incluindo RO em camundongos e macacos, bem como eficácia antitumoral em camundongos.
A eficácia antitumoral máxima em combinação com anti-mPD-1 foi demonstrada em modelos singênicos CT26 e 1956 em um regime de dosagem de 1 mg/kg administrado a cada três a quatro dias por um total de cinco do- ses (Q3/4D x5), sem nenhuma melhora adicional na eficácia em doses de até 10 mg/kg.
Importante ressaltar que, a 1 mg/kg, os receptores de NKG2A tanto no sangue quanto nos tumores (isto é, TIL) estavam total- mente ocupados, indicando RO completa.
Além disso, a modelagem de PK/PD de dados de RO no sangue de macaco revelou concordância entre o EC50 de RO in vitro e in vivo, que sugeriu que o EC50 in vitro pode ser usado para prever a RO in vivo.
Tomados em conjunto, a dose humana eficaz do anticorpo NKG2A.9 é projetada visando 99% de RO no sangue, usando um EC50 de RO humana in vitro de 1 nM.
Como a razão média da concentração de fármaco tumor-soro observada com NKG2A.3 em camundongos foi de cerca de 0,10, juntamente com o fato de que uma razão similar foi observada com um anticorpo anti-OX40 (BMS-986178) em amostras de biópsias tumorais humanas, visando 99% de RO no sangue levaria a cerca de 90% de RO nos tumores ao longo do período de tratamento.
Consequentemente, a dose eficaz hu- mana projetada é de 2,5 mg/kg administrada a cada quatro semanas.
Com essa dose, a AUC e a Ctrough de estado estacionário humano pre- vistas cobrem a exposição alcançada com a dose eficaz máxima de 1 mg/kg Q3/4Dx5 em camundongos.
EXEMPLO 22 Estabilidade e formulação do anticorpo NKG2A.9 Os esforços de formulação demonstraram que uma aborda- gem de formulação de plataforma pode ser usada para o desenvolvi- mento de uma formulação pronta para uso (RTU) para o anticorpo NKG2A.9. A avaliação preliminar de viscosidade e estabilidade a 150 mg/mL indicou que o anticorpo NKG2A.9 pode ser administrado via ad- ministração subcutânea em condições de formulação otimizadas.
Uma avaliação de formulação incluindo um estudo de esta- bilidade ao congelamento-descongelamento e um estudo de estabili- dade acelerado foi realizada para o anticorpo NKG2A.9 a uma concen- tração de 25 mg/mL, como resumido na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6: Estabilidade do anticorpo NKG2A.9 a 25 mg/mL em formu- lação de plataforma Propriedade Método(s) Resultados
Congelamento/Descongelamento (F/T) UV, SEC Nenhum risco de estabilidade F/T revelado (1 hora a -80ºC, 1 hora à temperatura ambiente (RT)  5) Solubilidade/Perfil de Concentração UV, SEC Pelo menos 25 mg/mL em tampão de plataforma (20 mM de histidina, pH 6,0, 260 mM de sacarose, 0,05 mM de DTPA, 0,05% de polissorbato 80) Estabilidade Acelerada UV, SEC, cIEF, Mapeamento de 3 meses a 40C = 5% de aumento em LMW* 25 mg/mL 3 meses a 4ºC, 25ºC, e 40ºC em formulação de peptídeo LC-MS/MS, funcional (ci- 3 meses a 40C = 4% de aumento em HMW* plataforma tometria de fluxo) 3 meses a 40C = 12%/mês aumento em variante ácida 3 meses a 40C = 18% de aumento em desamida- ção de N326 na região VSNK (SEQ ID NO: 162)
*LMW = Baixo Peso Molecular, HMW = Alto peso Molecular Nenhum problema de estabilidade física foi observado du- rante o estresse de congelamento-descongelamento (cinco ciclos) a 25 mg/mL na formulação de plataforma (20 mM de tampão de histidina, pH 6,0, 260 mM de sacarose, 50 µM de ácido pentético, 0,05% de polissor- bato 80). Estudos de estabilidade acelerada em tampão de plataforma a 25 mg/mL foram conduzidos a 4ºC, 25ºC e 40ºC.
Ao longo de três meses sob as condições testadas, pequenas modificações químicas que não afetaram a atividade funcional foram observadas na região de CDR do anticorpo NKG2A.9. Essas pequenas modificações químicas no anticorpo NKG2A.9 incluíram mudanças na oxidação, desamidação e isomerização de resíduos de aminoácido que são esperados devido ao armazenamento da solução em, por exemplo, uma temperatura ele- vada, não afetou adversamente a atividade de ligação do anticorpo.
De- samidação de N326 na região VSNK (SEQ ID NO: 162) do Fc foi obser- vada em condições de estresse (cerca de 18% após três meses a 40ºC), que é típico para anticorpos monoclonais IgG1. Após armazenamento a 25 ºC por três meses, desamidação foi considerada aceitável em cerca de 1,4%. Não foram observados problemas de estabilidade física ou perda de atividade funcional ao longo de três meses nas condições tes- tadas.
Não foram observados problemas com viscosidade (viscosi- dade aparente = 7,3 centipoise (cP)) ou agregação (0,4% de agregados solúveis) após a concentração do anticorpo NKG2A.9 a 150 mg/mL.
Ne- nhum problema de estabilidade física foi observado durante o estresse de congelamento-descongelamento (cinco ciclos) a 150 mg/mL na for- mulação de plataforma.
O anticorpo NKG2A.9 a 150 mg/mL na formula- ção de plataforma foi submetido à estabilidade acelerada por três meses a 4ºC, 25ºC, e 40ºC, como resumido na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7: Estabilidade do anticorpo NKG2A.9 a 150 mg/mL em for- mulação de plataforma Propriedade Método(s) Resultados
Solubilidade/Perfil de concentração UV, SEC, Viscosidade (vis- Pelo menos 150 mg/mL em tampão de plataforma(20 mM de histi- cosímetro) dina, pH 6,0, 260 mM de sacarose, 0,05 mM de DTPA, 0,05% po- lissorbato 80) Viscosidade aparente = 7,3 ±0,1 CP Estabilidade acelerada UV, SEC 3 meses a 4C = 0,1% de aumento em LMW 150 mg/mL 3 meses a 4C, 25C e 40C em formu- 3 meses a 4°C = 0,8% de aumento em HMW lação de plataforma 1 mês a 25°C = 0,4% de aumento em LMW 1 mês a 25°C = 0,8% de aumento em HMW Agregação e recorte significativos observados a 25 ºC e 40 ºC após 1 mês.
Pequenos problemas de estabilidade física foram observa- dos a 4ºC após três meses e a 25ºC após um mês de estabilidade (0,8% de aumento em agregados de alto peso molecular, HMW, em ambas as temperaturas). Recorte e instabilidade física foram observados em tem- peraturas elevadas de 25ºC e 40ºC após armazenamento por mais de um mês.
A instabilidade observada após armazenamento por mais tempo em temperatura elevada poderia ser potencialmente explicada por uma leve contaminação do lote de descoberta usado para a avalia- ção.
EXEMPLO 23 Distribuição de tecido do anticorpo NKG2A.9 Imuno-histoquímica usando o anticorpo NKG2A.9 em um painel de 20 tecidos humanos congelados mostrou expressão ocasional de células mononucleares, mas nenhuma ligação inesperada.
Houve forte coloração em pequenos subconjuntos de células mononucleares, principalmente no baço, e rara coloração de células mononucleares na tonsila, útero, estômago, intestino delgado, timo e fígado.
EXEMPLO 24 Farmacocinética de dose única, toxicocinética, tolerabilidade e estudo de farmacodinâmica de NKG2A.9 em macacos cinomolgos O macaco cinomolgo é a espécie de toxicologia pré-clínica devido à ligação similar de todo o anticorpo a NKG2A.
Além disso, a análise imuno-histoquímica de tecidos de macaco, usando o anticorpo NKG2A.9, é similar à de humanos, mostrando coloração positiva em pe- quenos subconjuntos de células mononucleares.
Como discutidos neste documento, o anticorpo NKG2A.9 liga-se a ambos NKG2A e NKG2C em macacos, enquanto seletivamente se liga a NKG2A e não NKG2C em seres humanos.
Uma vez que NKG2C é um receptor ativador, é possível que, em macacos, possa haver sobrerregulação simultânea de respos-
tas imunes (devido ao bloqueio de NKG2A) e sub-regulação de respos- tas imunes (devido ao bloqueio de NKG2C). O anticorpo NKG2A.9 foi administrado como uma dose intra- venosa única para macacos cinomolgos (n = 3 por grupo, sexo misto) a 0 mg/kg, 0,5 mg/kg, 10 mg/kg e 50 mg/kg, e os animais foram observa- dos por 42 dias.
Os desfechos do estudo incluíram observações clíni- cas, peso corporal, patologia clínica, farmacocinética e toxicocinética, formação de anticorpo antifármaco (ADA), RO, expressão de NKG2A de superfície e imunofenotipagem de PBMC.
Todos os animais foram imunizados com vírus da imunodeficiência símia (SIV) Gag e Nef, ex- presso em dois vetores separados de adenovírus-5, para avaliar o au- mento de respostas imunes como um desfecho potencial de DP (ensaio de células T reativas a SIV [tetrâmero] no Dia 22; resposta de células T ex vivo ao antígeno no Dia 22). Este foi um estudo não terminal, sem necropsia ou histopatologia.
Todas as doses foram bem toleradas em dosagens de até 50 mg/kg (AUC0-42 dias ≤101 µM•dia). Não houve sinais clínicos relacio- nados com o anticorpo NKG2A.9, alterações no peso corporal ou alte- rações relacionadas com o anticorpo NKG2A.9 na hematologia ou quí- mica clínica, como resumido na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8: Resumo dos resultados para o anticorpo NKG2A.9: TK IV dose única, tolerabilidade, e PD em macacos (n=3/grupo) Desfecho de Estudo Resultados Relacionados ao Anticorpo NKG2A.9 Sinais clínicos Nenhum Peso corporal Nenhuma alterações significativa Hematologia, química clínica Nenhuma alterações significativa Ocupação de receptor Dia 1, 4 horas: 81%, 99%, e 100% at 0,5 mg/kg, 10 mg/kg, e 50 mg/kg, respectivamente Dia 43: 36%, 84%, e 97% a 0,5 mg/kg,10 mg/kg, e 50 mg/kg, respectivamente Sub-regulação de NKG2A de superfície Dia 1 (4 horas pós-dosagem): Expressão de superfície foi 50%, 52%, e 58% (em relação à pré-dose) a (marcador de engajamento alvo) 0,5 mg/kg, 10 mg/kg, e 50 mg/kg Dia 43: Expressão de superfície foi 65-80%, 47-107%, e 41-51% a 0,5 mg/kg, 10 mg/kg, e 50 mg/kg, respectivamente Resposta à imunização Nenhuma alteração na resposta de recolha ex vivo a SIV Gag ou Nef.
Uma aparente tendência de dimi- nuição mediada por NKG2A.9 nas porcentagens de células CD8+ específicas de Nef e Gag (tetrâ- mero+). Dentro das populações de células T CD8+ antígeno-específicas, houve uma aparente tendên- cia de diminuição na porcentagem de células T EM.
Toxicocinética A 50 mg/kg, a Cmax foi de 9,8 M no Dia 1, 0,5 h, e a AUC0-42dias foi de 101 Mdia Anticorpo antifármaco (ADA) ADA observado em um animal (10 mg/kg) começando no primeiro ponto de tempo, Dia 8
O ADA foi observado em um animal (10 mg/kg) começando no primeiro ponto no tempo, Dia 8. A farmacocinética/toxicocinética foi linear na faixa de dose avaliada.
Na dosagem alta de 50 mg/kg, a Cmax foi de 9,8 µM (no Dia 1, 0,5 h) e a AUC0-42 dias foi de 101 µM • dia.
Em resumo, o estudo de dose única em macacos mostrou RO, sub-regula- ção da expressão de superfície de NKG2A como um marcador de en- gajamento do alvo e TK aceitável sem quaisquer descobertas adversas para uma dose única administrada em dosagens de até 50 mg/kg (AUC0- 42 dias ≤ 101 µM • dia). EXEMPLO 25 Ensaios de liberação de citocina Um ensaio de liberação de citocina in vitro foi realizado usando anticorpo NKG2A.9 solúvel e sangue total de 15 doadores hu- manos.
Citocinas e quimiocinas foram avaliadas por um painel Luminex de 75 citocinas/quimiocinas para determinar se o tratamento com o an- ticorpo NKG2A.9 apresenta risco de segurança da síndrome de libera- ção de citocina.
Nenhuma indução relacionada à NKG2A.9 das citocinas ou quimiocinas humanas analisadas foi observada.
EXEMPLO 26 Avaliação de risco de imunogenicidade para anticorpos anti-NKG2A Os anticorpos terapêuticos têm o potencial de desencadear uma resposta imune em pacientes contra o anticorpo terapêutico.
Essa resposta imune é geralmente manifestada pela geração de anticorpos antifármaco (ADA), tais como por meio de uma resposta de anticorpo anti-humano humano (HAHA), que pode alterar a exposição, neutralizar a função terapêutica, e/ou até resultar em consequências clínicas gra- ves para o paciente.
A “estranheza” do anticorpo terapêutico, que é re- conhecido como “não próprio” pelo sistema imune, é considerada o prin- cipal impulsionador de uma resposta imune de ADA mediada por MHC classe II.
É importante para um anticorpo anti-NKG2A seguro e eficaz,
como descrito neste documento, ter baixa ou nenhuma imunogenici- dade. O potencial de imunogenicidade humana de diversos anticorpos monoclonais anti-NKG2A foi avaliado por ferramentas de ligação de HLA in silico e in vitro por ensaios de proliferação de células T:DC. Como discutido neste documento, o anticorpo NKG2A.9 foi geneticamente ma- nipulado para ter baixos riscos de imunogenicidade humana, como ava- liado por ferramentas de ligação de HLA in silico. O risco de vários anti- corpos anti-NKG2A (NKG2A.6, NKG2A.9 e NKG2A.11) provocarem uma resposta imune indesejável em seres humanos contra os anticor- pos foi determinada como sendo baixa com base em ensaios de proli- feração de células T:DC in vitro.
1. Análise de ligação de HLA in silico foi usada para geneticamente pro- jetar anticorpos anti-NKG2A com baixo risco de imunogenicidade A ativação e proliferação de células T são etapas necessá- rias para desenvolver uma resposta imune. Especificamente, a ligação de antígeno peptídico a HLA Classe II é uma etapa crítica no desenvol- vimento da resposta imune mediada por anticorpo IgG de alta afinidade. Usando uma ferramenta de ligação a HLA in silico (IEDB) (vide, por exemplo, Wang P, et al., PLoS Comput Biol, 4(4)(2008)), analisamos as regiões de CDR de anticorpos monoclonais dividindo a sequência de aminoácido em 15 peptídeos sobrepostos e classificação a ligação para 27 alelos HLA DRB1 (que cobre cerca de 95% da população humana) contra todos os outros peptídeos submetidos à base de dados IEDB. Os peptídeos que estão entre os 10 primeiros percentis de um determinado alelo HLA são considerados um “aglutinante”, e uma região que apre- senta um aglutinante para 50% dos alelos é designada “agrupamento de ligação”. Um “aglutinante” ou “agrupamento de ligação” dentro de uma molécula biológica são considerados um fator impulsionador no de- senvolvimento de imunogenicidade (Sinu, P et al., Clinical & Deve- lopmental Immunology Vol. 2013 (2013)).
Como mostrado na Figura 54A, o anticorpo 13F3.A4 contém dois agrupamentos de ligação a HLA; vários peptídeos abrangendo a região de VH CDR 2 e a região de VL CDR2 foram previstos para se ligar a até 70% ou 19/27 de alelos HLA call II DRB1 (como denotado pelos números sombreados da sequência na Figura 54A). Como discu- tidos neste documento, um “agrupamento de ligação” é uma região que apresenta um aglutinante para 50% dos alelos; um número sombreado 6 significa que 60% dos alelos apresentam ligação e é, portanto, um “agrupamento de ligação”. Além disso, como mostrado na Figura 54B e descrito neste documento, uma reversão de quadro VH-I107T (isto é, substituindo iso- leucina por treonina na posição 107) removeu um agrupamento de liga- ção do anticorpo 13F3.A4. Essa substituição I107T do anticorpo 13F3.A4 foi selecionada, tal como isoleucina na posição 107 foi seleci- onada no anticorpo NKG2A.9 (T na posição 107 é mostrada pela seta na segunda linha da Figura 54B). Como mostrado na Figura 54C e descrito neste documento, para geneticamente projetar e minimizar o potencial de imunogenici- dade do anticorpo 13F3.A4, na CDR1 de cadeia leve do anticorpo 13F3.A4, a asparagina (N) na posição 30 (primeira linha da Figura 54C) foi geneticamente manipulada para uma prolina (P) (segunda linha da Figura 54c), glutamina (Q) (terceira linha da Figura 54C) ou serina (S) (quarta linha da Figura 54C). A substituição N30S (como mostrado na quarta linha da Figura 54C) foi selecionada porque não apresentou po- tencial de ligação a HLA (como indicado por “0” na região sombreada). Esta substituição N30S do anticorpo 13F3.A4 (N na posição 30) foi se- lecionada para inclusão no anticorpo NKG2A.9 (S na posição 30). Na Figura 54B-C, apenas algumas porções das sequências do 13F3.A4 são mostradas para maior clareza.
2. Risco de imunogenicidade de anticorpos anti-NKG2A (NKG2A.6,
NKG2A.9 e NKG2A.11) foi baixo com base em resultados do ensaio de proliferação de células T:DC in vitro Após uma molécula HLA Classe II ligar um antígeno peptí- dico, o próximo passo crítico no desenvolvimento de uma resposta imune a um anticorpo terapêutico é a ativação de células T CD4+. Essa ativação de células T ocorre como resultado do reconhecimento de um complexo de peptídeo-MHC cognato (HLA) em uma célula apresenta- dora de antígeno.
A ativação e proliferação de células T (entre vários outros fatores) são necessárias para desenvolver uma resposta imune.
Ensaios de previção de imunogenicidade baseados em células mono- nucleares de sangue periférico (PBMC) in vitro usando diversos conjun- tos de doadores são usados para determinar se uma molécula é poten- cialmente imunogênica por sua capacidade de estimular essas células T CD4+ ativadas específicas ex vivo.
Um ensaio de proliferação de células T:DC in vitro (vide, por exemplo, métodos descritos em Joubert MK, et al., PLOS ONE 11(8) (2016)) foi realizado para vários anticorpos NKG2A anti-humanos (anti- corpos NKG2A.6, NKG2A.9 e NKG2A.11) para ainda avaliar o potencial de imunogenicidade humana desses anticorpos.
Resumidamente, PBMCs de voluntários saudáveis foram isoladas por Ficoll (GE Heal- thcare). A centrifugação do gradiente e o antígeno linfocitário humano (HLA) Classe II foram caracterizados utilizando amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) e hibridização com sondas oligonucle- otídicas (ProImmune). Um painel de 40 doadores de PBMC composto de tipos de HLA Classe II que correspondem estreitamente às frequên- cias da população mundial foi usado para uma execução de ensaio.
Monócitos cheios de PBMC usando um método baseado em esfera negativa (Intellicyt) foram cultivados em Media DC (Lonza) con- tendo Il-4 e GM-CSF para gerar células dendríticas imaturas (DC), pul- sadas com anticorpos NKG2A anti-humanos (anticorpos NKG2A.6,
NKG2A.9 e NKG2A.11) e proteínas de controle de qualidade por quatro horas, seguido por uma etapa de maturação de DC de dois dias em mídia contendo TNF-a, IL-1b, IL-6, e PGE2. DC pulsadas foram adicionadas a PBMC autóloga rotulada com carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) (Invitrogen) para mo- nitorar a proliferação, e plaqueadas em placas de 96 cavidades em seis replicatas a 200.000 células por cavidade em meio DC (Lonzo) contendo pen-strep (Gibco) por sete dias, após, o meio foi retirado por lavagem e as células foram rotuladas com anticorpos monoclonais APC anti-CD4 humanos (BD Biosciences). Após a remoção das células de anticorpos monoclonais anti-CD4 não ligadas com uma etapa de lavagem, as cé- lulas foram fixadas com formalina 3,7% (Sigma) em PBS, analisadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de proliferação de células T CD4+. Como mostrado na Figura 55, NKG2A.9 produziu resposta de proliferação de células T CD4+ em comparação com células dendrí- ticas pulsadas em apenas três de 40 doadores (7,5%) neste ensaio in vitro de células T:DC.
Este resultado foi comparável à proliferação de 12,5% de CD4+ para o anticorpo monoclonal de controle (bevacizu- mab), que demonstrou ter uma imunogenicidade muito baixa na clínica (“controle baixo”) (Saffari F., et al., Int J Cancer Manag.; 11(11)(2018)). O anticorpo de “alto controle” (ATR-107) mostrou proliferação de CD4+ em 70% dos doadores, e demonstrou ter uma alta taxa de ADA de 76% em estudos clínicos (Hua, F., et al., The Journal of Clinical Pharmaco- logy, 54: 14-22 (2014)). NKG2A.11 também produziu resposta de proliferação de CD4+ em apenas 3 de 40 doadores.
O anticorpo NKG2A.6 não produziu resposta proliferativa de CD4+ em nenhum doador.
Os dados de repe- tibilidade para os anticorpos de alto e baixo controle para este ensaio mostram um % de coeficiente de variação (CV%) de 5-10%. Portanto,
nenhum desses anticorpos monoclonais é significativamente diferente quanto ao seu risco de baixa imunogenicidade.
Para resumir, o risco dos anticorpos NKG2A.6, NKG2A.9 e NKG2A.11 de desencadearem uma resposta imune indesejável em seres humanos contra os anticor- pos foi determinado como sendo de baixo com base em ensaios in vitro de proliferação de células T:DC.
EXEMPLO 27 Toxicocinética de dose única intravenosa, tolerabilidade e estudo de far- macodinâmica em macacos O anticorpo NKG2A.9 foi bem tolerado quando administrado por via intravenosa como uma dose única a macacos cinomolgos a 0,5 mg/kg, 10 mg/kg e 50 mg/kg (AUC0-42 dias ≤101 µM • dia), e nenhuma anormalidade foi identificada pela patologia clínica.
Especificamente, este estudo foi conduzido para determinar a toxicidade potencial do anticorpo NKG2A.9 quando administrado por via intravenosa em dose única a macacos (1) para determinar a exposição sistêmica a NKG2A.9, e (2) para avaliar a resposta farmacodinâmica a NKG2A.9, após imunização com vetores de adenovírus serótipo 5 (Ad5) que expressam proteínas gag e nef do vírus da imunodeficiência símia (Ad5-gag e Ad5-nef, respectivamente). O anticorpo NKG2A.9 foi adminis- trado por via intravenosa como uma injeção em bolus lento nas doses de 0 mg/kg (veículo), 0,5 mg/kg, 10 mg/kg, ou 50 mg/kg para grupos de três macacos virgens para proteína (1 ou 2 por sexo). As doses foram admi- nistradas a 0,25 mL/kg, 0,5 mL/kg ou 2,5 mL/kg em veículo/portador de 20 mM de histidina, 260 mM de sacarose, pH 6,0. Os 2 vetores Ad5 foram administrados por via intramuscular no quadríceps posterior ou coxas caudais em 1 injeção com aproximadamente 3,3 109 partículas virais a 0,5 mL.
Os critérios de avaliação incluíram sobrevivência, toxicocinética, observações clínicas, pesos corporais, avaliações patológicas clínicas,
avaliações imunotoxicológicas e farmacodinâmicas (anticorpos antifár- maco, fenotipagem de linfócitos de sangue periférico, ativação de células T e exterminadoras naturais, respostas de recolha ex vivo a Nef e Gag, fenotipagem de células T específicas de antígeno, e ocupação de recep- tor de NKG2A e expressão de receptor). Os macacos foram observados durante o período de seis semanas pós-dose, após serem devolvidos ao estoque.
As exposições AUC(0-T) e Cmax do anticorpo NKG2A.9 au- mentaram de maneira proporcional à dose nos níveis de dose avaliados.
Após a administração intravenosa, as exposições sistêmicas em machos foram comparáveis àquelas em fêmeas em todos os níveis de dose.
Como não houve diferenças substanciais de sexo nos valores de exposi- ção sistêmica, todos os resultados e conclusões foram baseados em da- dos combinados por sexo.
Um em cada nove macacos que receberam o anticorpo NKG2A.9 a 10 mg/kg desenvolveu anticorpos antifármaco, e o mesmo macaco afetado pelos anticorpos antifármaco apresentou um de- clínio mais rápido nas concentrações de fármaco em comparação com outros macacos.
O resumo toxicocinético para o anticorpo NKG2A.9 é mos- trado abaixo: Resumo toxicocinético - Valores médios combinados por sexo Parâmetro Dose de Anticorpo NKG2A.9
0,5 mg/kg 10 mg/kg 50 mg/kg
Cmax; g/mL 16,8 380 1,470
AUC(0-1008 h); gh/mL 3,620 79,000 365,000
Todos os animais sobreviveram e foram devolvidos ao esto- que no final do estudo.
O anticorpo NGK2A.9 foi bem tolerado em todas as doses, sem efeitos em observações clínicas, peso corporal ou patolo- gia clínica.
Não houve alterações mediadas por NKG2A.9 nas porcenta- gens de células T de sangue periférico, células T auxiliares, células T citotóxicas, células B, células NK, CD4+ ativadas, CD8+, células T CD8+ de memória efetora, ou linfócitos enriquecidos com células NK.
As res- postas de recolha ex vivo aos peptídeos gag e nef também não foram alteradas.
As porcentagens de células T CD8+ específicas para o antí- geno não foram alteradas, embora tenha havido alta variabilidade em to- das as doses.
Quatro horas após a dosagem no Dia 1, a ocupação média do receptor de NKG2A do grupo em linfócitos enriquecidos com células NK foi de 81%, 99% e 100% em relação ao pré-teste a 0,5 mg/kg, 10 mg/kg e 50 mg/kg de NKG2A.9, respectivamente.
No dia 43, para macacos do- seados com 0,5 mg/kg de NKG2A.9, a ocupação de receptor diminuiu para uma faixa de 21% a 45%; para macacos doseados com 10 mg/kg de NKG2A.9, a ocupação de receptor diminuiu para um intervalo de 72% a 95%. Por 4 horas após a dosagem no Dia 1, a expressão média do receptor de NKG2A do grupo em linfócitos enriquecidos com células NK foi de 50%, 52% e 58% em relação ao pré-teste a 0,5 mg/kg, 10 mg/kg, e 50 mg/kg de NKG2A.9, respectivamente, que apresentou internalização ou sub-regulação do receptor após a dosagem com NKG2A.9. No dia 43, a expressão do receptor de NKG2A variou de 65% a 80%, 47% a 99%, e 41% a 46% a 0,5 mg/kg, 10 mg/kg e 50 mg/kg de anticorpo NKG2A.9, respectivamente.
Em conclusão, o anticorpo NKG2A.9 foi bem tolerado por ma- cacos após uma única administração intravenosa a ≤50 mg/kg (AUC mé- dia combinada por sexo [0-1008h] ≤365.000 µg·h/mL). A ocupação de receptor e reduzida expressão do receptor foram observadas em todas as doses testadas.
EXEMPLO 28 Estudo de toxicidade subcutânea e intravenosa de dose intermitente de um mês em macacos cinomolgos Um estudo de um mês foi conduzido para determinar a toxici- dade potencial do anticorpo NKG2A.9 quando administrado a macacos cinomolgos uma vez por semana durante um mês (1) para avaliar a re- versibilidade potencial de quaisquer descobertas, (2) para determinar a exposição sistêmica a NKG2A.9, e (3) para fornecer dados para dar su- porte ao uso de NKG2A.9 em seres humanos. NKG2A.9 foi administrado por injeção subcutânea em doses de 0 mg/kg (veículo), 10 mg/kg ou 100 mg/kg a três grupos de cinco macacos/sexo/grupo. As formulações para as doses subcutâneas de 10 mg/kg ou 100 mg/kg de NKG2A.9 incluíram
2.000 U/mL de rHuPH20. Além disso, o NKG2A.9 foi administrado por injeção intravenosa (bolus lento) na dose de 1 mg/kg para um único grupo de cinco macacos/sexo. Todas as doses foram administradas a 2 mL/kg em um veículo de 20 mM de histidina, 250 mM de sacarose, 0,05 mM de ácido dietilenotriamina penta-acético (DTPA) e 0,05% (p/v) de polissor- bato-80 (PS-80), pH 6. Os critérios de avaliação incluíram sobrevivência, toxicociné- tica, observações clínicas, pesos corporais, estimativas visuais de con- sumo alimentar, exames físicos (incluindo respiratórios e neurológicos) e oftalmológicos, avaliações de patologia clínica, imunofenotipagem, ativa- ção de células exterminadoras naturais (NK), expressão de receptor (RE), ocupação de receptor (RO), pesos dos órgãos, e análises de pato- logia macroscópica e microscópica. As necropsias programadas foram realizadas após 1 mês de dosagem semanal - 5 doses no total - (3/sexo/grupo) e após um período de recuperação de 8 semanas (2/sexo/grupo). No Dia 22, as exposições sistêmicas médias de NKG2A.9 (AUC[0-168h]) aumentaram a dose proporcionalmente entre 10 mg/kg e 100 mg/kg. Não houve diferenças entre sexo substanciais em qualquer dose. A acumulação de NKG2A.9 foi observada após administração re- petida em todos os níveis de dose, com exposições sistémicas médias (AUC[0-168h]) que foram aproximadamente 2,5 a 2,9 vezes aquelas do Dia 1. A presença de anticorpos antifármaco/NKG2A.9 emergentes do tratamento foi detectada em 1 de 10, 2 de 10, e 3 de 10 macacos a 1 mg/kg (intravenoso), 10 mg/kg (subcutâneo), ou 100 mg/kg (subcutâneo), respectivamente, em e/ou após o Dia 8; estes não tiveram impacto subs- tancial nas exposições sistêmicas médias a NKG2A.9. O resumo toxicocinético para o anticorpo NKG2A.9 é apre- sentado na tabela a seguir: a Período Dose de NKG2A.9 Parâmetro 1 mg/kg 10 mg/kg 100 mg/kg
(Intravenoso) (Subcutâneo com 2000 U/mL de (Subcutâneo com 2000 U/mL de rHuPH20) rHuPH20)
Cmax Dia 1 29,4 143 1,270 (µg/mL) Dia 22 49,3/49,9 416/372 3,120/3,100
AUC(0-168h) Dia 1 1,960 19,200 170,000 (µg•h/mL) Dia 22 4,820/4,850 55,500/52,700 425,000/424,000 a Os valores foram calculados com dados de todos os macacos dispo- níveis/apenas macacos sem anticorpos anti-NKG2A.9 (ADAs) emergen- tes do tratamento detectáveis, que foram detectados em e/ou após o Dia 8 (isto é, 168 horas após a administração no Dia 1). Não houve mortalidades relacionadas a NKG2A.9; todos os macacos sobreviveram a suas necropsias programadas.
NKG2A.9 foi bem tolerado em todas as doses sem efeitos nas observações clínicas, peso corporal, estimativas visuais de consumo alimentar, parâmetros cardiovasculares, neurológicos, oftalmológicos, de patologia clínica ou histopatológicos.
Não houve alterações relacionadas a NKG2A.9 em células T (T total, T auxiliar ou T citotóxica), células B, ou números de células NK ou ativação de populações de células de sangue periférico enriquecidas com células NK.
Ocupação de receptor dependente de dose (RO) em células NK foi observada (84%, 95% e 100% a 1 mg/kg, 10 mg/kg e 100 mg/kg de NKG2A.9, respectivamente), quatro horas após a primeira dose.
Pos- teriormente, em todos os pontos de tempo até o Dia 29, a faixa de RO média do grupo foi de 72% a 84% e 94% a 98% a 1 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente, com RO máxima (100%) a 100 mg/kg.
Enquanto a RO foi completa e mantida ao longo da fase de recuperação (até o Dia 85) a 100 mg/kg, perda parcial de RO foi observada a 1 mg/kg e 10 mg/kg.
A 1 mg/kg, a perda parcial de RO foi observada do Dia 71 ao Dia 85 (RO média do grupo de 39%), que se correlacionou com uma queda nas concentrações séricas de NKG2A.9 abaixo de 4 µg/mL.
A 10 mg/kg, a perda parcial de ocupação foi observada no Dia 85 (RO média do grupo de 74%), que se correlacionou com uma queda nas concentrações sé- ricas de NKG2A.9 abaixo de 50 µg/mL.
O engajamento de NKG2 por NKG2A.9 é conhecido por re- sultar em sub-regulação parcial como consequência da internalização do receptor.
Houve uma redução não dependente de dose de NKG2 RE em células NK durante a fase de dosagem (faixa geral de 36 a 75% de valores de pré-teste em todas as doses) com recuperação mínima du- rante a fase de recuperação a 1 mg/kg, e sem recuperação a 10 mg/kg ou 100 mg/kg.
Em conclusão, NKG2A.9 foi bem tolerado por macacos cino- molgos por um mês a ≤100 mg/kg/semana (AUC média ≤425.000 µg·h/mL) com evidência de engajamento de alvo robusto em todas as doses.
O bloqueio in vivo mediado por NKG2A.9 da interação de NKG2A/HLA-E de células NK em macacos cinomolgos não induziu ati- vação de células imunes, sugerindo a falta de, ou contribuição mínima da via de NKG2A no contexto de uma configuração fisiológia livre de doença.
Com base na tolerabilidade e falta de descobertas patológicas anatômicas ou clínicos, o nível de efeitos adversos não observados (NOAEL) foi considerado 100 mg/kg, que também é considerada a dose mais alta não severamente tóxica (HNSTD). EXEMPLO 29 Análise imuno-histoquímica de expressão de NKG2A em tumores
Acredita-se que a atividade do anticorpo NKG2A.9 reduz a atividade inibitória de NKG2A e leva a uma citotoxicidade aumentada no sítio do tumor.
Consequentemente, os critérios para priorização de tu- mor incluem a expressão de NKG2A e HLA-E.
Para identificar possíveis indicações de tumor, o perfil preli- minar de NKG2A em tipos de tumor selecionados foi avaliado com NKG2A.6 conjugado a FITC (o clone parental do anticorpo NKG2A.9) em seções congeladas.
NKG2A estava presente em uma pequena fra- ção de células mononucleares e distribuídas principalmente no estroma tumoral, como mostrado na Figura 45. A Figura 45 mostra exemplos representativos de coloração de NKG2A em amostras de tumor humano comercialmente adquiridas coradas com anticorpo NKG2A.6 conjugado a FITC e reagente de controle negativo (IgG1.1-FITC humana anti-KLH). Na Figura 45, “cervical” indica carcinoma cervical; “cabeça e pescoço” indica carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; “bexiga” indica carcinoma de bexiga; e NSCLC-Adc indica câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma. “St” são estroma tumoral, e “TuEp” são células epiteliais tumorais.
Foi realizada análise de imagem da expressão de NKG2A por imuno-histoquímica em seções tumorais congeladas.
Análise de imagens por “pontos quentes” utilizando o software HALOTM foi reali- zada em três pontos por amostra.
A coloração com controle de isótipo foi subtraída da coloração com o anticorpo NKG2A.6 conjugado com FITC.
Essa análise de imagem revelou uma alta abundância de expres- são de NKG2A em carcinomas cervicais e de cabeça e pescoço, ex- pressão moderada em carcinomas bexiga e de pulmão de células de não pequenas, e baixa expressão em carcinomas pancreáticos e color- retais, como mostrado na Figura 46. A Figura 46 mostra os níveis de expressão de NKG2A em diferentes tipos de tumor.
O eixo Y representa o número de células positivas por ponto de 1,15 mm 2, e os resultados são apresentados como média mais erro padrão.
EXEMPLO 30 Análise imuno-histoquímica de expressão de HLA-E em 7 tipos de tumor Avaliar a expressão de HLA-E, um anticorpo anti-HLA-E co- mercial (clone MEM-E/02) foi validado para imuno-histoquímica em te- cidos embebidos em parafina e fixados em formalina (FFPE). HLA-E foi amplamente expresso nas amostras tumorais examinadas.
Coloração positiva foi observada em ambos o epitélio tumoral e estroma.
A análise da imagem inteira da lâmina usando software HALOTM revelou uma abundância relativamente maior de HLA-E em HNSCC e NSCLC, e uma abundância menor em carcinoma pancreático e câncer colorretal (CRC), como mostrado na Figura 47. A Figura 47 mostra os resultados da análise de imagem de lâmina inteira de expressão de HLA-E usando o software HALO em 13 carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço HPV+ (NNSCC/HPV+), 11 carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço HPV- (HNSCC/HPV-), 10 adenocarcinoma de pul- mão de células não pequenas (NSCLC-ADC), 10 HNSCC, 10 carcinoma de células escamosas de pulmão de células não pequenas (NSCLC- SCC), 6 carcinoma pancreático, e 10 carcinoma de cólon (CRC). A imu- norreatividade de HLA-E foi calculada da seguinte forma: área total de 'marrom' x OD média de 'marrom'/área total de tecido.
Os dados foram normalizados para mm2. Os resultados são apresentados como médias mais erro padrão.
Em células epiteliais tumorais, a coloração positiva foi princi- palmente citoplasmática.
A coloração notável da membrana também foi exibida em algumas células tumorais.
No estroma tumoral, a coloração positiva distribuiu-se principalmente em células mononucleares e sub- conjuntos de células intersticiais, podendo ocorrer ocasionalmente na microvasculatura e neutrófilos em alguns casos.
Em geral, a expressão de HLA-E no estroma esteve presente em quase todos os casos.
No entanto, a expressão em células epiteliais tumorais variou significativa- mente de amostra para amostra em todos os tipos de tumor examina- dos. Expressão epitelial do tumor de alto nível foi observada na maioria dos casos, enquanto expressão negativa ou expressão muito baixa foi observada em um pequeno número de casos, como mostrado na Figura
48. Na Figura 48, “st” são estroma tumoral, e “TuEp” são células epite- liais tumorais. A Figura 48 mostra imagens representativas da expres- são de HLA-E em tumores múltiplos. Imuno-histoquímica com um anti- corpo monoclonal comercial validado em seções FFPE de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço HPV+ (NNSCC/HPV+), ade- nocarcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC-ADC), carci- noma de células escamosas de células não pequenas (NSCLC-SCC), e carcinoma de cólon (CRC). Pacientes com tumores derivados de vírus: Infecções virais podem induzir a expressão de NKG2A em células NK, como observado em pacientes cronicamente infectados com hepatite C. (Harrison RJ et al., “Association of NKG2A with treatment for chronic hepatites C vírus infection” Clin Exp Immuno 161:306-14 (2010)). Além disso, a frequên- cia de células T CD8 NKG2A+ foi demonstrada ser maior em TIL de pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço HPV-16+, em compara- ção com tumores HPV-16. (van Hall T, et al. “NKG2A checkpoint recep- tor expression. On tumor-infiltrating CD8+ T cells restrains eficácia of immunotherapy.” Cancer Res Supplement; Abstract 2999 (2017)). Foi avaliada uma associação entre o status de HPV em tumores de cabeça e pescoço e a expressão da via NKG2A/HLA-E medindo-se a expressão de HLA-E por IHC entre biópsias de tumores de cabeça e pescoço HPV+ e HPV-. Nossa avaliação inicial em um número relativamente pe- queno de amostras mostrou que a expressão de HLA-E por IHC não foi significativamente diferente entre amostras HPV+ e HPV-, como mos- trado na Figura 48. Testaremos o status de HPV em tumores de cabeça e pescoço e a expressão da via de NKG2A/HLA-E medindo a expressão de CD8 (como substituto da expressão de NKG2A) e de HLA-E por IHC entre biópsias de tumores de cabeça e pescoço HPV+ e HPV-. Também foi dado prosseguimento à análise de IHC com tipos de tumor adicionais e tamanhos de amostra maiores, e esta análise é descrita no Exemplo 31 abaixo.
EXEMPLO 31 Análise imuno-histoquímica de expressão de HLA-E em 17 tipos de tu- mor Foram traçados o perfil de expressão de HLA-E em 17 tipos de tumor por avaliação imuno-histoquímica (IHC). Acredita-se que paci- entes com câncer são mais propensos a responder a tratamento antitu- mor com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento para os tipos de tumor que expressam altos níveis de HLA-E.
Para avaliar a expressão de HLA-E, imuno-histoquímica (IHC) foi realizada em seções embebidas em parafina e fixadas com formalina (FFPE) de 17 tipos/subtipos de tumor, incluindo cervical, be- xiga, mama, adenocarcinoma colorretal (CRC), endometrial, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), gástrico, glioblastoma (GBM), melanoma, linfoma não Hodgkin (follicular lin- foma), ovariano, células renais (RCC), pancreático, próstata, carcinoma de pulmão de células pequenas (SCLC), adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC-AD), e carcinoma de células escamosas de pulmão de células não pequenas (NSCLC-SQC), com anticorpo mo- noclonal comercial bem caracterizado (clone MEM/02). Havia 14 a 43 amostras por tipo/subtipo de tumor.
As lâminas coradas foram avaliadas pelos patologistas do estudo para identificar o tipo de tecido ou célula.
Todas as lâminas foram avaliadas quanto à adequação dos elementos de tecido e coloração.
Uma pontuação convencional/manual foi reali- zada por patologistas do estudo.
Os resultados mostraram que a expressão de HLA-E pode ser observada em compartimentos de células endoteliais, imunes e cé- lulas tumorais em várias indicações.
Em células tumorais, a coloração positiva foi predominantemente citoplasmática em todos os tipos de tu- mores humanos com expressão limitada observada na membrana plas- mática de superfície.
A expressão total de HLA-E variou de positividade de células tumorais difusas à expressão heterogênea para alguns casos com baixa a quase nenhuma expressão de HLA-E.
A Figura 57 mostra um boxplot de pontuação de positividade total de HLA-E em 17 diferen- tes tipos de tumor, como avaliado por imuno-histoquímica.
A pontuação de HLA-E total é definida como a porcentagem de positividade de HLA- E citoplasmática e/ou membranar combinada nas células tumorais.
Os dados utilizados para gerar a Figura 57 são mostrados na Tabela abaixo.
Pontuação Positiva de HLA-E de Tumor Porcentagem Positiva de HLA-E de tumor Tipo de Tumor Amostras (N) Média Mediana Desvio Padrão 25º Percentil 75º Percentil Total1 total2 Câncer de bexiga 20 17 85% 37,3 40,0 30,4 11,5 52,5 Câncer de mama 20 14 70% 16,3 7,5 22,9 0 21,25 Glioblastoma Multiforme 19 16 84,21% 9,9 5,0 15,1 2 10 Gástrico Cancer 20 17 85% 32,7 15,0 36,4 2,75 58,75 Câncer renal, Células Claras 20 15 75% 20,4 9,0 23,4 1,5 37,5 Células renais NSCLC-AD 40 38 95% 35,8 25,0 33,6 6 61,25 NSCLC-SCC 40 37 92,50% 39,1 30,0 32,0 10 65 271/301 Melanoma 20 18 90% 32,0 10,0 35,0 1,88 62,5 Câncer Endometrial 20 19 95% 27,3 12,5 31,9 3 41,25 Câncer ovariano 20 20 100% 25,0 16,5 25,0 9,88 25 CRC 39 38 97,44% 30,2 20,0 28,7 8 47,5 NHL, Linfoma Folicular 20 20 100% 58,3 61,3 26,3 32,38 77,5 HNSCC 40 39 97,50% 48,7 46,5 30,9 19 76,25 Câncer de próstata 20 20 100% 5,4 4,5 4,4 2,38 5,5 Câncer Cervical 20 20 100% 54,7 62,5 27,2 28,75 75 Pancreático 43 41 95,35% 44,1 42,5 33,7 10 72,5 SCLC 14 9 64,29% 14,9 4,5 20,6 0 23,75 1 Para calcular a “pontuação positiva de HLA-E tumoral total” foi utilizado um ponto de corte de 1% nos valores de HLA-E. Em outras palavras, se mais do que ou igual a 1% dos tumores fossem HLA-E positivo (HLA-E citoplasmático e/ou membranar), então a amostra foi rotulada como “positiva”.
2 “Porcentagem positiva de HLA-E tumoral total” é a porcentagem de pacientes HLA-E positivos no tipo de tumor.
Na Figura 57, cada uma das caixas nos boxplots mostra o valor positivo de HLA-E tumoral total no 25º percentil; a linha do meio de cada uma das caixas é o valor mediano; e o limite superior de cada uma das caixas mostra o valor no 75º percentil.
Em conclusão, houve uma variação dinâmica da expressão de HLA-E total nas indicações tumorais.
Acredita-se que pacientes com câncer com alta expressão de HLA-E em células tumorais são mais pro- pensos a responder ao tratamento antitumoral com os anticorpos anti- NKG2A descritos neste documento.
Os tumores linfoma não Hodgkin (linfoma folicular), cervical, HNSCC, pancreático, NSCLC e de bexiga tiveram o maior nível de expressão de HLA-E total; dessa forma, os pa- cientes com esses cânceres têm a maior probabilidade de responder ao tratamento antitumor com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste do- cumento.
Este estudo fornece dados de perfil tumoral para apoiar a pri- orização de seleção de indicação para incluir, por exemplo, cânceres HNSCC, RCC, NSCLC e CRC em desenvolvimento clínico.
Próstata, GBM e SCLC demonstraram o nível mais baixo de expressão de HLA-E.
No entanto, acredita-se que os pacientes com ti- pos de tumor que têm expressão inferior de HLA-E também responde- rão ao tratamento antitumor com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento.
Este estudo é descrito com mais detalhes abaixo.
Materiais e Métodos Amostras de Tecido No geral, 17 tipos/subtipos de câncer de dois conjuntos de amostras foram estudados.
Lâminas de FFPE de 6 tipos/subtipos de tumor em tamanho real, incluindo adenocarcinoma colorretal (CRC), carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), ade- nocarcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC-AD), carci- noma de células escamosas de pulmão de células não pequenas
(NSCLC-SQC), carcinoma pancreático, e carcinoma de pulmão de cé- lulas pequenas (SCLC), com 14-24 amostras por tipo de tumor, foram estudados.
As amostras de tecido de FFPE foram obtidas de vários for- necedores de tecidos comerciais (BioIVT, Detroit, MI; BioChain Institute Inc.
Newark, CA; Conversant Biologics Inc, Huntsville, AL; Cooperative Human Tissue Network, Filadélfia, PA; Indivumed GmbH, Lewisburg, PA; The MT Group Inc.
Van Nuys, CA; TriStar Technology Group LLC, Rockville, MD). Além disso, blocos multitumor (MTBs) contendo 16 ti- pos/subtipos de tumor incluindo bexiga, mama, GBM, gástrico, RCC, NSCLC-AD, NSCLC-SQC, melanoma, endometrial, ovariano, CRC, HNSCC, próstata, cervical, carcinoma pancreático, e linfoma não Hod- gkin (linfoma folicular), com 20 casos/tipos de tumor.
Cada MTB conti- nha 5 casos de uma única indicação por bloco de FFPE e 1 tonsila hi- perplásica como controle positivo.
Os MTBs foram feitos pela Folio Bios- ciences (agora Discovery Life Sciences) para a BMS.
Anticorpos e Reagentes - HLA-E anti-humano de anticorpo monoclonal de camun- dongo, Clone MEM/02 (Abcam, Cambridge, MA, Catálogo ab2216, Lote GR251472-15) - Isótipo de IgG1 de camundongo, Clone 11711 (R&D Sys- tems, Mineápolis, MN, Catálogo MAB002, Lote IX2415091) - Detecção de Refino de Polímero de Ligação (Leica Biosys- tems, Buffalo Grove, ILA, Catálogo DS9800, Lote 46396 e 46794) - Recuperação de Epítopo Ligado 2 (Leica Biosystems, Buf- falo Grove, ILA, Catálogo AR9640, Lote ER20180) - Bloco de Proteína, Sem soro (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Catálogo X0909, Lote 10117172) Gama globulina humana (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, Catálogo G-4386, Lote SLV M0524V) Métodos IHC Seções de FFPE a 4 µm foram preparadas, mergulhadas em parafina e armazenadas a 4ºC até o uso.
Para MTBs, seções de 4 µm foram cortadas e armazenadas a 4ºC em sacos vedados a vácuo até o uso.
Todos os ensaios IHC, incluindo respectivos controles de isótipo, foram otimizados para IHC automatizado usando a plataforma Leica BondRX.
Seções de FFPE do mesmo bloco de tecido de tonsila humana hiperplásica foram usadas como controles positivos para todas as exe- cuções de IHC.
Para a imunocoloração, as lâminas de FFPE foram cozidas, desparafinizadas em xilenos e reidratadas por meio de uma série gra- duada de etanol seguindo procedimentos histológicos de rotina.
A recu- peração de antígenos foi realizada no instrumento Leica Bond RX.
Os procedimentos de coloração IHC automatizados foram realizados à tem- peratura ambiente no Leica Bond RX.
Resumidamente, as lâminas fo- ram bloqueadas em bloco de peroxidase por 10 minutos seguido por bloco de proteína não específica por 20 minutos.
Os anticorpos primá- rios foram incubados por 60 minutos, seguidos por Ligante de Refino por 30 minutos.
As lâminas foram, então, incubadas com Polímero de Refino por 30 minutos.
Finalmente, as lâminas foram reagidas com a solução de substrato-cromogênio DAB por 6 minutos, contrastadas por 8 minutos com Leica Hematoxilina, e então desidratadas, limpas e co- bertas por lamela com Permount seguindo procedimento histológico de rotina.
Após a imunocoloração, todas as lâminas foram escaneadas a 20x utilizando o escâner de lâminas inteiras Aperio AT2 (Leica Biosys- tems Imaging, Vista, CA), e as imagens foram armazenadas e organiza- das com o Software Aperio eSlide Manager.
Avaliação de Patologia e Métodos de Pontuação Manual O patologista do estudo avaliou as lâminas para determinar a adequação do tecido e a qualidade da coloração.
O patologista do es-
tudo pontuou manualmente as lâminas coradas com HLA-E IHC e revi- sou as lâminas de controle positivo e isótipo.
A avaliação patológica con- sistiu na avaliação de H&E para determinação do conteúdo tumoral e confirmação do tipo tumoral.
As lâminas coradas com imuno-histoquí- mica (IHC) de HLA-E foram pontuadas manualmente usando imagens digitalizadas de toda a lâmina para positividade de tumor e células imu- nes.
Nenhuma coloração de fundo foi observada nas lâminas de controle de isótopo.
A expressão de HLA-E em células tumorais (TC), células imunes (IC) e células endoteliais foi avaliada.
A porcentagem de HLA-E citoplasmático e HLA-E membranar foi registrada.
A pontuação de HLA- E total foram os dados principais reportáveis para expressão de HLA-E, que é composta de positividade para HLA-E citoplasmático e/ou mem- branar combinada nas células tumorais, e foi relatada como porcenta- gem de HLA-E positivo de células tumorais totais.
A porcentagem de po- sitividade de células imunes para HLA-E juntamente com a localização geográfica predominante de células imunes positivas para HLA-E e en- dotélio também foram avaliadas.
Resultados O HLA-E foi difusamente positivo na tonsila hiperplásica.
A coloração membranosa/citoplasmática de HLA-E foi observada no epité- lio da cripta, centros germinativos e zonas interfoliculares com maior in- tensidade nas zonas do manto.
Nos tecidos tumorais, a expressão es- pecífica de HLA-E foi observada em células tumorais, células imunes e células endoteliais.
A localização citoplasmática e membranosa de HLA- E foi observada dentro das células tumorais em todas as indicações e apresentou uma variação dinâmica de intensidade variando de fraca (in- tensidade 1+) a forte (intensidade 3+). A expressão de HLA-E foi predo- minantemente citoplasmática em tipos de tumores humanos com ex- pressão limitada observada na membrana plasmática.
A expressão total de HLA-E variou de positividade de células tumorais difusas à expressão heterogênea para alguns casos com expressão baixa a muito baixa de HLA-E.
Os tumores cervicais, HNSCC, pancreático, NSCLC, bexiga e linfoma não Hodgkin tiveram o maior nível de expressão total de HLA-E com próstata, GBM e SCLC sendo os mais baixos, como mostrado na Figura 59. RRC teve o nível mais alto de expressão de HLA-E membra- noso entre os tipos de tumores examinados, embora o nível total de HLA- E tenha sido relativamente baixo.
Conclusão Em conclusão, os dados mostraram uma faixa dinâmica de expressão de HLA-E total em várias indicações de tumor.
Os tumores cervicais, HNSCC, pancreático, NSCLC e de bexiga tiveram os níveis mais altos de expressão total de HLA-E, enquanto próstata, GBM e SCLC demonstraram as menores frequências de expressão.
Este es- tudo fornece dados de perfil de tumor para apoiar a priorização de sele- ção de indicação para incluir, por exemplo, cânceres HNSCC, RCC, NSCLC e CRC no desenvolvimento clínico de anticorpos anti-NKG2A neste documento.
Em algumas modalidades, acredita-se que os pacien- tes com tipos de tumor que têm expressão inferior de HLA-E também responderão ao tratamento antitumor com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento.
EXEMPLO 32 Pacientes com altos níveis séricos de HLA-E solúvel Pacientes de câncer com melanoma apresentam títulos mai- ores de HLA-E solúvel em seu soro em comparação com doadores sau- dáveis. (Allard M et al., “Serum soluble HLA-E in melanoma: a new po- tencial immune-related marker in cancer,” PLoS One, 6:e21118 (2011)). Dados recentes de um ensaio clínico com nivolumab em pa- cientes com NSCLC (Checkmate 063) sugerem que os pacientes com sHLA-E alta têm uma taxa de resposta mais baixa a nivolumab. (Reb-
mann V et al., “Soluble HLA-G and -E (sHLA-G/E) as potential bi- omarkers of clinical outcomes in patients (pts) with advanced, refractory squamous (SQ) NSCLC treated with nivolumab (NIVO): CheckMate 063”, Cancer Res; AM2017-CT126 (2017)). Acredita-se que pacientes com alto nível de expressão de HLA-E em tumores são mais propensos a se beneficiarem de trata- mento com os anticorpos anti-NKG2A descritos neste documento, inclu- indo o anticorpo NKG2A.9, isoladamente ou em combinação com, por exemplo, nivolumab.
Em algumas modalidades, um profissional de sa- úde seleciona pacientes com um nível específico de HLA-E, tal como HLA-E solúvel, para tratamento com os anticorpos anti-NKG2A.9 des- critos neste documento.
Em outras modalidades, um profissional de sa- úde seleciona pacientes com um nível específico de expressão de CD8+ (como um substituto da expressão de NKG2A) para tratamento com os anticorpos anti-NKG2A.9 descritos neste documento.
Um imunoensaio seletivo e sensível baseado em SIMOA para medir sHLA-E (LLOQ: 11 pg/mL) foi desenvolvido e usado para teste de dois conjuntos de amostras independentes: (A) um primeiro conjunto que contém soro e plasma de controles saudáveis (n = 17) e de pacientes com seis tipos de câncer (n = 10 pacientes por tipo de câncer) (Figura 49A) e (B) um segundo conjunto de 100 controles sau- dáveis e 100 pacientes com câncer de pulmão (Figura 49B). Em ambos os conjuntos, foi observada variabilidade interpaciente, com faixas simi- lares em doadores saudáveis e pacientes com câncer.
Este ensaio con- firmará os níveis de HLA-E solúvel como um marcador preditivo de res- posta a nivolumabe usando este ensaio.
Dentro de cada tipo de tumor, foi observada uma variabili- dade interpaciente significativa para a expressão de HLA-E, como mos- trado na Figura 49. Acredita-se pacientes com HLA-E tumor mais alto e CD8+ mais alto (usando CD8+ como substituto para expressão de
NKG2A) se beneficiarão da inibição de NKG2A para restaurar a ativi- dade antitumor das células NK e T CD8+. EXEMPLO 33 Estudo de Fase 1/Fase 2 com o Anticorpo NKG2A.9 Será conduzido um estudo de Fase I/II com o anticorpo NKG2A.9 para desenvolver uma terapia segura e eficaz para tratar o câncer. Embora não ligada por nenhum mecanismo, a terapia restaurará a resposta de células T a inibidores de ponto de verificação em tumores resistentes/refratários a PD-L1 e/ou aumentará a atividade de NK em tumores sólidos enriquecidos com NK. O plano de desenvolvimento clínico é resumido na Tabela 9 abaixo. Tabela 9: Plano de Desenvolvimento Clínico de Anticorpo anti-NKG2A Anticorpo anti-NKG2A com Nivolumab O bloqueio de ponto de verificação com anticorpo anti-NKG2A em combi- Seleção de pacientes com: nação com nivolumab sinergizará para estender o benefício e aprofundar • Tumores inflamados ou de TMB alto com atividade anti-PD-1 conhe- a resposta em tumores resistentes ou refratários à terapia anti-PD-L1 ou cida, mas menos do que resposta completa E alta expressão de HLA-E associados com baixa resposta à terapia anti-PD-L1 e/ou CD8 (como um substituto para a expressão de NKG2A); e/ou • Tumores associados a uma etiologia viral E alta expressão de CD8 (substituto de NKG2A) e/ou HLA-E; e/ou  • Tumores que recidivam após tratamento com anti-PD-1 e têm alta ex- pressão de CD8 (substituto de NKG2A) e/ou HLA-E tumoral total.
Anticorpo anti-NKG2A com outros agentes I-O e combinações de múltiplos pontos de verificação Seleção de pacientes com: O anticorpo anti-NKG2A em combinação com vários inibidores de ponto Tumores inflamados ou com TMB alto com expressão de múltiplas pro- de verificação superará a resistência de I-O por vias de ponto de verifica- teínas de ponto de verificação imune ção redundantes e otimizará o benefício clínico.
O desenvolvimento clínico do anticorpo NKG2A.9 começará com um primeiro estudo de Fase 1/2 em seres humanos (FIH). Será realizado um escalonamento da dose de monoterapia inicial para deter- minar a segurança, dose máxima tolerada (MTD) ou dose máxima ad- ministrada, PK, PD e avaliação preliminar da atividade clínica. A via de administração intravenosa será usada inicialmente no estudo, com a ad- ministração subcutânea em outros braços do estudo. Alternativamente, uma via de administração intravenosa pode ser usada. Com um início escalonado, um escalonamento de dose paralelo ocorrerá com a com- binação de anticorpo NKG2A.9 com nivolumab, como ilustrado na Fi- gura 50. A segurança, MTD ou dose máxima administrada, PK, PD e avaliação preliminar da atividade clínica serão avaliados a seguir com a terapia de combinação.
Combinações de bloqueio de ponto de verifica- ção em triplicata também serão avaliadas durante o escalonamento de dose e incluem o anticorpo NKG2A.9, nivolumab, e outros inibidores de ponto de verificação incluindo, mas sem limitação, relatlimab (anti-LAG- 3), anti-TIM-3, anti-TIGIT, ipilimumab, CTLA-4 NF ou Probody, ou outras terapias anticâncer, incluindo, por exemplo, quimioterapia, agentes de transdução de sinal, tais como cetuximab, entre outras terapias.
A seleção de paciente/tumor para coortes de escalonamento e expansão será baseada na análise contínua de perfis de expressão do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), perfis de expressão de ensaios internos de nivolumab, perfil amostras de tumor para níveis de CD8 (como um substituto para níveis de NKG2A), e criação de perfil de tumor e amostras de soro dirigida para HLA-E, incluindo tumores induzidos por vírus.
Por exemplo, a seleção de pacientes se baseará na escolha de pacientes cujos tumores sejam CD8+ (como substituto de NKG2A) e HLA-E+, como ilustrado na Figura 50. Em outra modalidade, a seleção de pacientes também será com base em tumores com alta carga de inflamação ou de mutação tumoral.
Os pacientes inscritos neste estudo serão obrigados a forne- cer biópsias pré-tratamento e sob tratamento, bem como amostras de sangue periférico serial para testar a hipótese de que o tratamento com anti-NKG2A sozinho ou em combinação com nivolumab aumenta o nú- mero ou atividades funcionais de células NK e T CD8+ no tumor.
Aten- ção particular será dedicada à análise de se tais mudanças no micro- ambiente imune tumoral se correlacionam com a resposta clínica.
Estu- dos farmacodinâmicos avaliarão marcadores de engajamento ao alvo,
ativação de células T, alterações na expressão de superfície de NKG2A, IFN-γ, e sHLA-E sérico.
Indivíduos com tumores NKG2A-positivos e HLA-E+ (incluindo, mas sem limitação, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma de células renais (RCC), e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC)) e tumores de origem viral (câncer de cabeça e pescoço, cervical, hepatocelular) serão opcionalmente incluídos.
Os indivíduos podem ter tumores que são re- sistentes/refratários à terapia anti-PD-1/PD-L1 ou tumores relatados como insensíveis à terapia anti-PD-1/PD-L1. Alternativamente, os indi- víduos podem ser virgens ao tratamento com PD-1/PD-L1. A Listagem de Sequências é fornecida na Tabela abaixo.
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 1 Sequência de nu- ATGGATAACC AAGGAGTAAT CTACTCAGAC CTGAATCTGC CCCCAAACCC 50 AAAGAGGCAG CAA- cleotídeo de NKG2A CGAAAAC CTAAAGGCAA TAAAAACTCC ATTTTAGCAA 100 humana CTGAACAGGA AATAACCTAT GCGGAATTAA ACCTTCAAAA AGCTTCTCAG 150 (CCDS8625.1) GATTTTCAAG GGAATGACAA AACCTATCAC TGCAAAGATT TACCATCAGC 200 TCCAGAGAAG CTCATTGTTG GGATCCTGGG AATTATCTGT CTTATCTTAA 250 TGGCCTCTGT GGTAACGATA GTTGTTATTC CCTCTACATT AATACAGAGG 300 CACAACAATT CTTCCCTGAA TACAAGAACT CAGAAAGCAC GTCATTGTGG 350 CCATTGTCCT GAGGAGTGGA TTACATATTC CAACAGTTGT TACTACATTG 400 GTAAGGAAAG AAGAACTTGG GAAGAGAGTT TGCTGGCCTG TACTTCGAAG 450 AACTCCAGTC TGCTTTCTAT AGATAATGAA GAAGAAATGA AATTTCTGTC 500 CATCATTTCA CCATCCTCAT GGATTGGTGT GTTTCGTAAC AGCAGTCATC 550 ATCCATGGGT GACAATGAAT GGTTTGGCTT TCAAACATGA GATAAAAGAC 600 TCAGATAATG CTGAACTTAA CTGTGCAGTG CTACAAGTAA ATCGACTTAA 650 ATCAGCCCAG TGTGGATCTT CAATAATATA TCATTGTAAG CATAAGCTTT 700 AG 702
2 Sequência de ami- MDNQGVIYSD LNLPPNPKR QQRKPKGNKNS ILATEQEITY AELNLQKASQ 50 noácido de NKG2A DFQGNDKTYH CKDLPSAPE KLIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSTLIQR 100 humana HNNSSLNTRT QKARHCGHC PEEWITYSNSC YYIGKERRTW EESLLACTSK 150 (GenBank NSSLLSIDNE EEMKFLSII SPSSWIGVFRN SSHHPWVTMN GLAFKHEIKD 200 NP_002250.2 SDNAELNCAV LQVNRLKSA QCGSSIIYHCK HKL 233
3 Sequência de ami- MSKQRGTFSE VSLAQDPKRQ QRKPKGNKSS ISGTEQEIFQ VELNLQNPSL 50 noácido de NKG2C NHQGIDKIYD CQGLLPPPEK LTAEVLGIIC IVLMATVLKT IVLIPFLEQN 100 humana NSSPNTRTQK ARHCGHCPEE WITYSNSCYY IGKERRTWEE SLLACTSKNS 150 (GenBank: SLLSIDNEEE MKFLASILPS SWIGVFRNSS HHPWVTINGL AFKHKIKDSD 200 CAA0492.1) NAELNCAVLQ VNRLKSAQCG SSMIYHCKHK L 231
Anticorpo NKG2A.9 (Anticorpo 13F3.A4 com reversão de quadro VH-I107T e VK-N30S para remover sítio de desamida- ção)(SEQ ID NOs: 4-17, 163) 4 Sequência de nu- gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga 50 cleotídeo de ca- cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gggcatttcc agtgctttag 100 deia leve de cctggtatca gcagaaacca gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat 150 NKG2A.9 gcctccagtt tgaaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc 200 (incluindo códon tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg 250 de parada “tag” C- caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctctcac cttcggccaa 300 terminal) gggacacgac tggagattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat 350 cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt 400
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 450 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga 500 cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag 550 cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
5 Sequência de ami- AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 noácido de cadeia ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 leve de NKG2A.9 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
6 Sequência de nu- gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggggtc 50 cleotídeo de ca- cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt tcccatagta 100 deia pesada de tgaactgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcc 150 NKG2A.9 ataagtagta gtagtagtta catatactac gcagactcag tgaagggccg 200 attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat ctgcaaatga 250 (mesmo que acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagag 300 sequência de nu- tgggggctac cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc 350 cleotídeo de ca- ctcagctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca 400 deia pesada de agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 450 NKG2A.11-G1.3f) ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 500 cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca 550 (incluindo códon gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 de parada “tga” C- tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga 650 terminal) gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgcc cagcacctg 700 aagccgaagg ggccccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 750 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 800 gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg 850 aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg 950 caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg 1000 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1050 accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac 1100 ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga 1150 gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag 1250 gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 1300 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtccccggg ttga 1344
7 Sequência de ami- EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 noácido de cadeia ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 pesada de NKG2A.9 WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 (mesmo que CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 sequência de ami- TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 noácido de cadeia YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 pesada de TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 NKG2A.11-G1.3f) SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG 447
(lisina terminal está ausente)
163 Sequência de ami- EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 noácido de cadeia ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 pesada de NKG2A.9 WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 (mesmo que CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 sequência de ami- TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 noácido de cadeia YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 pesada de TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 NKG2A.11-G1.3f) SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 447
(mostrado com a
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência lisina terminal)
8 Domínio variável EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 de cadeia pesada ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 de NKG2A.9 WGLPFDYWGQ GTLVTVSS 118
(mesmo que domínio variável de cadeia pesada de NKG2A.11)
9 Domínio variável AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 de cadeia leve de ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 NKG2A.9 GTRLEIK 107
10 NKG2A.9 VH CDR1 SHSMN 5
11 NKG2A.9 AISSSSSYIY YADSVKG 17 VH CDR2
12 NKG2A.9 EEWGLPFDY 9 VH CDR3
13 NKG2A.9 RASQGISSAL A 11 VL CDR1
14 NKG2A.9 DASSLKS 7 VL CDR2
15 NKG2A.9 QQFNSYPLT 9 VL CDR3
16 Domínio constante ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 de cadeia pesada HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 100 de NKG2A.9 KSCDKTHTCP PCPAPEAEGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 329
17 Domínio constante RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 de cadeia leve de NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 NKG2A.9 SFNRGEC 107
Anticorpo NKG2A.11 (13F3.A4 VH-I107T, VK-N30P)(13F3.A4 com reversão de quadro VH-I107T e VK-N30P para remover sítio de desamidação) (SEQ ID NOs: 18-21, 164-165)
(SEQ ID NOs: 6-7 (sequências de nucleotídeo e de aminoácido de cadeia pesada de NKG2A.11, respectivamente))
18 Sequência de nu- gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga 50 cleotídeo de ca- cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gggcattccc agtgctttag 100 deia leve de cctggtatca gcagaaacca gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat 150 NKG2A.11 gcctccagtt tgaaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc 200 tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg 250 (incluindo códon caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctctcac cttcggccaa 300 de parada “tag” C- gggacacgac tggagattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat 350 terminal) cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt 400 gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 450 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga 500 cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag 550 cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 19 Sequência de ami- AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIP SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 noácido de cadeia ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 leve de NKG2A.11 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
164 Sequência de ami- AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIP SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 noácido de domínio ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 variável de cadeia GTRLEIK 107 leve de NKG2A.11
165 Sequência de ami- RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 noácido de domínio NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 constante de ca- SFNRGEC 107 deia leve de NKG2A.11
20 Sequência de nu- atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc 50 cleotídeo sinal de c 51 osteonectina
21 Sequência de ami- MRAWIFFLLC LAGRALA 17 noácido sinal de osteonectina
Anticorpo NKG2A.6 (anticorpo 13F3.A4) (SEQ ID NOs: 22-36, 166-169)
22 Sequência de ami- MELGLRWVFL VAILEGVQC 19 noácido sinal para 13F3.A4 cadeia pe- sada 23 13F3.A4 VH (se- ATGGAACTGG GGCTCCGCTG GGTTTTCCTT GTTGCTATTT TAGAAGGTGT -57 quência de nucleo- CCAGTGT -7 tídeo de região variável de cadeia GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTCAAGC CGGGGGGGTC 50 pesada) CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT TCCCATAGTA 100 TGAACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCTCAGCC 150 (com sequência si- ATAAGTAGTA GTAGTAGTTA CATATACTAC GCAGACTCAG TGAAGGGCCG 200 nal de 57 nucleo- ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA 250 tídeos) ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAG 300 TGGGGGCTAC CCTTTGACTA CTGGGGCCAG GGAATCCTGG TCACCGTCTC 350 CTCA 354 166 13F3.A4 VH (se- GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTCAAGC CGGGGGGGTC 50 quência de nucleo- CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT TCCCATAGTA 100 tídeo de região TGAACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCTCAGCC 150 variável de cadeia ATAAGTAGTA GTAGTAGTTA CATATACTAC GCAGACTCAG TGAAGGGCCG 200 pesada) ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA 250 ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAG 300 (sem sequência si- TGGGGGCTAC CCTTTGACTA CTGGGGCCAG GGAATCCTGG TCACCGTCTC 350 nal) CTCA 354
24 13F3.A4 VH sequên- MELGLRWVFL VAILEGVQC -19 cia de aminoácido de região variável EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 de cadeia pesada ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 (com sequência si- WGLPFDYWGQ GILVTVSS 118 nal de 19 aminoá- cidos)
167 13F3.A4 VH sequên- EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 cia de aminoácido ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GILVTVSS 118 (sem sequência si- nal)
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 25 13F3.A4 VL sequên- ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT -66 cia de nucleotídeo CCCAGGTGCC AGATGT -16
(com sequência si- GCCATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 nal de 66 nucleo- CAGAGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGGCATTAAC AGTGCTTTAG 100 CCTGGTATCA GCA- tídeos) GAAACCA GGGAAAGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGAT 150 GCCTCCAGTT TGAAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC 200 TGGGACAGAT TTCAC- TCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 CAACTTATTA CTGTCAACAG TTTAATAGTT ACCCTCTCAC CTTCGGCCAA 300 GGGACACGAC TGGAGATTAA A 321 168 13F3.A4 VL sequên- GCCATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 cia de nucleotídeo CAGAGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGGCATTAAC AGTGCTTTAG 100 CCTGGTATCA GCA- GAAACCA GGGAAAGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGAT 150 (sem sequência si- GCCTCCAGTT TGAAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC 200 TGGGACAGAT TTCAC- nal) TCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 CAACTTATTA CTGTCAACAG TTTAATAGTT ACCCTCTCAC CTTCGGCCAA 300 GGGACACGAC TGGAGATTAA A 321 26 13F3.A4 VL MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RC -22 (sequência de ami- noácido de região AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 variável de cadeia ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 leve) GTRLEIK 107 (com sequência si- nal de 22 aminoá- cidos)
169 13F3.A4 VL sequên- AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 cia de aminoácido ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIK 107 (sem sequência si- nal)
27 13F3.A4 VH CDR1 SHSMN 5
28 13F3.A4 VH CDR2 AISSSSSYIY YADSVKG 17 29 13F3.A4 VH CDR3 EEWGLPFDY 9 30 13F3.A4 VL CDR1 RASQGINSAL A 11 31 13F3.A4 VL CDR2 DASSLKS 7 32 13F3.A4 VL CDR3 QQFNSYPLT 9 33 13F3.A4 CH ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 região constante HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP 100 de cadeia pesada KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 330
34 13F3.A4 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107
35 13F3.A4 sequência EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 de aminoácido de ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cadeia pesada (sem WGLPFDYWGQ GILVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 sequência sinal) FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD 250 Lisina terminal TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 pode estar au- YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 sente.
TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG(K) 448
36 13F3.A4 sequência AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 de aminoácido de ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência cadeia leve (sem GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 sequência sinal) DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
Anticorpo NKG2A.5 (Anticorpo 11H9.A1 (SEQ ID NOs: 37-50, 170-173)
37 11H9.A1 VH ATGGAACTGG GGCTCCGCTG GGTTTTCCTT GTTGCTATTT TAGAAGGTGT -57 CCAGTGT -7 (sequência de nu- cleotídeo de re- GAGGTGCAGT TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTCAAGC CTGGGGGGTC 50 CCTGAGACTC TCCTGTG- gião variável de CAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATAGCA 100 TGAACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG cadeia pesada) GGCTGGAGTG GGTCTCATCC 150 ATTAGTAGTA GTAGTAGTTA CATATACTAC GCAGACTCAG TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA 250 (com sequência si- ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGACTACTA 300 nal de 57 nucleo- TGGTTCGGGG AGATTTTTGA CTACTGGGGC CAGGGAACCC TGGTCACCGT 350 CTCCTCA 357 tídeos)
170 11H9.A1 VH GAGGTGCAGT TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTCAAGC CTGGGGGGTC 50 CCTGAGACTC TCCTGTG- (sequência de nu- CAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATAGCA 100 TGAACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG cleotídeo de re- GGCTGGAGTG GGTCTCATCC 150 ATTAGTAGTA GTAGTAGTTA CATATACTAC GCAGACTCAG gião variável de TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA 250 cadeia pesada) ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGACTACTA 300 TGGTTCGGGG AGATTTTTGA CTACTGGGGC CAGGGAACCC TGGTCACCGT 350 CTCCTCA 357 (sem sequência si- nal)
38 11H9.A1 VH (se- MELGLRWVFL VAILEGVQC -19 quência de aminoá- cido de região va- EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMNWVRQA PGKGLEWVSS 50 riável de cadeia ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARLL 100 WFGEIFDYWG pesada) QGTLVTVSS 119
(com sequência si- nal de 19 aminoá- cidos)
171 11H9.A1 VH (se- EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMNWVRQA PGKGLEWVSS 50 quência de aminoá- ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARLL 100 WFGEIFDYWG cido de região va- QGTLVTVSS 119 riável de cadeia pesada)
(sem sequência si- nal)
39 11H9.A1 VL (se- ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT -66 quência de nucleo- CCCAGGTGCC AGATGT -16 tídeo de região variável de cadeia GCCATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 leve) CAGAGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGGCATTAGC AGTGCTTTAG 100 CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGAT 150 (com sequência si- GCCTCCAGTT TGAAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC 200 nal de 66 nucleo- TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 tídeos) CAACTTATTA CTGTCAACAG TTTAATAGTT ACCCGATCAC CTTCGGCCAA 300 GGGACACGAC TGGAGATTAA A 321 172 11H9.A1 VL (se- GCCATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 quência de nucleo- CAGAGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGGCATTAGC AGTGCTTTAG 100 tídeo de região CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGAT 150 variável de cadeia GCCTCCAGTT TGAAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC 200 leve) TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 (sem sequência si- CAACTTATTA CTGTCAACAG TTTAATAGTT ACCCGATCAC CTTCGGCCAA 300 nal) GGGACACGAC TGGAGATTAA A 321
40 11H9.A1 VL MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RC -22
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência (sequência de ami- AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 noácido de região ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPITFGQ 100 variável de cadeia GTRLEIK 107 leve)
(com sequência si- nal de 22 aminoá- cidos)
173 11H9.A1 VL AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de ami- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPITFGQ 100 noácido de região GTRLEIK 107 variável de cadeia leve)
(sem sequência si- nal)
41 11H9.A1 VH CDR1 SYSMN 5 42 11H9.A1 VH CDR2 SISSSSSYIY YADSVKG 17 43 11H9.A1 VH CDR3 LLWFGEIFDY 10 44 11H9.A1 VL CDR1 RASQGISSAL A 11 45 11H9.A1 VL CDR2 DASSLKS 7 46 11H9.A1 VL CDR3 QQFNSYPIT 9 47 11H9.A1 CH ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 região constante HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP 100 de cadeia pesada KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 330
48 11H9.A1 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107
49 Cadeia pesada de EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMNWVRQA PGKGLEWVSS 50 11H9.A1 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARLL 100 WFGEIFDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 150 (sem sequência si- YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 200 nal) ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK 250 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 300 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 350 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 400 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK 449
50 Cadeia leve de AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 11H9.A1 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPITFGQ 100 (sem sequência si- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 nal) DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
NKG2A.16 Anticorpo (anticorpo 2G6.C2)(SEQ ID NOs: 51-64)
51 2G6.C2 VH (sequên- GAGGTGCAAC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC GGGGGGGGTC 50 cia de nucleotídeo CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCAATAGCA 100 de região variável TGAACTGGAT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTTGCACAC 150 de cadeia pesada) ATTAGTAGTG GTAGCAGTTT CATATACTAC GCAGACTCTG TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ATGCCAAGAA CTCTCTGTCT CTGCAAATGA 250 ACAGCCTGAG AGACGAAGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGATGAC 300 TGGGGAATTG ATGCTTTTAA TATCTGGGGC CAAGGGACAA TGGTCACCGT 350 CTCTTCA 357 52 2G6.C2 VH (sequên- EVQLVESGGG LVQRGGSLRL SCAASGFTFS SNSMNWIRQA PGKGLEWVAH 50 cia de aminoácido ISSGSSFIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLS LQMNSLRDED TAVYYCARDD 100
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência de região variável WGIDAFNIWG QGTMVTVSS 119 de cadeia pesada) 53 2G6.C2 VL (sequên- GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 cia de nucleotídeo AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTCCTTAG 100 de região variável CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT 150 de cadeia leve) GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 200 TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG 250 CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGATATTCAC TTTCGGCCCT 300 GGGACCAAAG TGGATATCAA A 321
54 2G6.C2 VL (sequên- EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 cia de aminoácido ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWIFTFGP 100 de região variável GTKVDIK 107 de cadeia leve) 55 2G6.C2 VH CDR1 SNSMN 5 56 2G6.C2 VH CDR2 HISSGSSFIY YADSVKG 107 57 2G6.C2 VH CDR3 DDWGIDAFNI 10 58 2G6.C2 VL CDR1 RASQSVSSSL A 11 59 2G6.C2 VL CDR2 DASNRAT 7 60 2G6.C2 VL CDR3 QQRSNWIFT 9 61 2G6.C2 CH ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 região constante HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 100 de cadeia pesada KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVD- GVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 330
62 2G6.C2 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107
63 2G6.C2 cadeia pe- EVQLVESGGG LVQRGGSLRL SCAASGFTFS SNSMNWIRQA PGKGLEWVAH 50 sada ISSGSSFIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLS LQMNSLRDED TAVYYCARDD 100 WGIDAFNIWG QGTMVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 150 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 200 ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK 250 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 300 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 350 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 400 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK 459
64 2G6.C2 cadeia leve EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWIFTFGP 100 GTKVDIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 anticorpo 4G5.D1 (SEQ ID NOs: 65-78, 174-177)
65 4G5.D1 VH (sequên- ATGAAACACC TGTGGTTCTT CCTCCTCCTG GTGGCAGCTC CCAGATGGGT -57 cia de nucleotídeo CCTGTCC -7 de região variável de cadeia pesada) CAGATGCAGC TGCAGGAGTC GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC 50 CCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCGTCAGC AGTGGTCGTT 100 (com sequência si- ACTACTGGAG TTGGATCCGG CAGCCCCCCG GGAAGGGACT GGAGTGGATT 150 nal de 57 nucleo- GGGTATATCT ATTACAGTGG GAGCACCAAC TACAACCCCT CCCTCAAGAG 200 tídeos) TCGAGTCACC ATATCAGTAG ACACGTCCAA GAACCAGTTC TCCCTGAAGC 250 TGACCTCTGT GACCGCTGCG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGAG 300 GGTGGAGACT ACTACTACTA CAATATGGAC GTCTGGGGCC CAGGGACCAC 350 GGTCACCGTC TCCTCA 367
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 174 4G5.D1 VH sequên- CAGATGCAGC TGCAGGAGTC GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC 50 cia de nucleotídeo CCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCGTCAGC AGTGGTCGTT 100 ACTACTGGAG TTGGATCCGG CAGCCCCCCG GGAAGGGACT GGAGTGGATT 150 (sem sequência si- GGGTATATCT ATTACAGTGG GAGCACCAAC TACAACCCCT CCCTCAAGAG 200 nal) TCGAGTCACC ATATCAGTAG ACACGTCCAA GAACCAGTTC TCCCTGAAGC 250 TGACCTCTGT GACCGCTGCG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGAG 300 GGTGGAGACT ACTACTACTA CAATATGGAC GTCTGGGGCC CAGGGACCAC 350 GGTCACCGTC TCCTCA 367
66 4G5.D1 VH MKHLWFFLLL VAAPRWVLS -19 sequência de ami- noácido QMQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGRYYWSWIR QPPGKGLEWI 50 GYIYYSGSTN YNPSLKSRVT ISVDTSKNQF SLKLTSVTAA DTAVYYCARE 100 (com sequência si- GGDYYYYNMD VWGPGTTVTV SS 122 nal de 19 aminoá- cidos)
175 4G5.D1 VH QMQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGRYYWSWIR QPPGKGLEWI 50 sequência de ami- GYIYYSGSTN YNPSLKSRVT ISVDTSKNQF SLKLTSVTAA DTAVYYCARE 100 noácido GGDYYYYNMD VWGPGTTVTV SS 122
(sem sequência si- nal)
67 4G5.D1 VL sequên- ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA -60 cia de nucleotídeo TACCACCGGA -10
(com sequência si- GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 nal de 60 nucleo- AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT 100 tídeos) TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT 150 GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG 200 GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT 250 TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCGTA CACTTTTGGC 300 CAGGGGACCA AGCTGGAGAT CAAA 324 176 4G5.D1 VL sequên- GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 cia de nucleotídeo AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT 100 TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT 150 (sem sequência si- GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG 200 nal) GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT 250 TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCGTA CACTTTTGGC 300 CAGGGGACCA AGCTGGAGAT CAAA 324 68 4G5.D1 VL sequên- METPAQLLFL LLLWLPDTTG -20 cia de aminoácido EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY 50 (com sequência si- GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPYTFG 100 nal de 20 aminoá- QGTKLEIK 108 cidos)
177 4G5.D1 VL sequên- EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY 50 cia de aminoácido GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPYTFG 100 QGTKLEIK 108 (sem sequência si- nal)
69 4G5.D1 VH CDR1 SGRYYWS 8 70 4G5.D1 VH CDR2 YIYYSGSTNY NPSLKS 16
71 4G5.D1 VH CDR3 EGGDYYYYNM DV 12
72 4G5.D1 VL CDR1 RASQSVSSSY LA 12
73 4G5.D1 VL CDR2 GASSRAT 7 74 4G5.D1 VL CDR3 QQYGSSPYT 9
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 75 4G5.D1 CH região ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 constante de ca- HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 100 deia pesada KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 330
76 4G5.D1 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107
77 4G5.D1 cadeia pe- QMQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGRYYWSWIR QPPGKGLEWI 50 sada GYIYYSGSTN YNPSLKSRVT ISVDTSKNQF SLKLTSVTAA DTAVYYCARE 100 GGDYYYYNMD VWGPGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 150 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 200 QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 250 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 300 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 350 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 400 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 450 GK 452
78 4G5.D1 cadeia leve EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY 50 GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPYTFG 100 QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK 150 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ 200 GLSSPVTKSF NRGEC 215 Anticorpo 1G5.B2 (SEQ ID NOs: 79-92, 178-181)
79 1G5.B2 VH sequên- ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GGTTTTCCTC GTTGCTCTTT TAAGAGGTGT -57 cia de nucleotídeo CCAGTGT -7
(com sequência si- CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGGTC 50 nal de 57 nucleo- CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT GACTATGCTA 100 tídeos) TGCACTGGGT CCGCCAGACT CCAGGCAGGG GGCTGGAGTG GCTGACATTT 150 ATATCATATG ATGGAAGCAA TAAATACCAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTTT CTGCAAATGA 250 ACAGTCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCTGTTT ATTACTGTGC GAGAGATTCC 300 TGGGATCGGG GGTACTTCGA TCTCTGGGGC CGTGGCACCC TGGTCACTGT 350 CTCCTCA 357 178 1G5.B2 VH sequên- CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGGTC 50 cia de nucleotídeo CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT GACTATGCTA 100 TGCACTGGGT CCGCCAGACT CCAGGCAGGG GGCTGGAGTG GCTGACATTT 150 (sem sequência si- ATATCATATG ATGGAAGCAA TAAATACCAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG 200 nal) ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTTT CTGCAAATGA 250 ACAGTCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCTGTTT ATTACTGTGC GAGAGATTCC 300 TGGGATCGGG GGTACTTCGA TCTCTGGGGC CGTGGCACCC TGGTCACTGT 350 CTCCTCA 357 80 1G5.B2 VH MEFGLSWVFL VALLRGVQC -19 sequência de ami- noácido QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DYAMHWVRQT PGRGLEWLTF 50 ISYDGSNKYH ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCARDS 100 (com sequência si- WDRGYFDLWG RGTLVTVSS 119 nal de 19 aminoá- cidos)
179 1G5.B2 VH QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DYAMHWVRQT PGRGLEWLTF 50 sequência de ami- ISYDGSNKYH ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCARDS 100 noácido WDRGYFDLWG RGTLVTVSS 119
(sem sequência si- nal)
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência
81 1G5.B2 VL sequên- ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA -60 cia de nucleotídeo TACCACCGGA -10
(com sequência si- GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 nal de 60 nucleo- AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG 100 tídeos) CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT 150 GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 200 TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG 250 CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGTGGACGTT CGGCCAAGGG 300 ACCAAGGTGG AAATCAAA 318 180 1G5.B2 VL sequên- GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 cia de nucleotídeo AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG 100 CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT 150 (sem sequência si- GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 200 nal) TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG 250 CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGTGGACGTT CGGCCAAGGG 300 ACCAAGGTGG AAATCAAA 318 82 1G5.B2 VL sequên- MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG -20 cia de aminoácido EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 (com sequência si- ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWWTFGQG 100 nal de 20 aminoá- TKVEIK 106 cidos)
181 1G5.B2 VL sequên- EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 cia de aminoácido ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWWTFGQG 100 TKVEIK 106 (sem sequência si- nal)
83 1G5.B2 VH CDR1 DYAMH 5 84 1G5.B2 VH CDR2 FISYDGSNKY HADSVKG 17
85 1G5.B2 VH CDR3 DSWDRGYFDL 10 86 1G5.B2 VL CDR1 RASQSVSSYL A 11 87 1G5.B2 VL CDR2 DASNRAT 7 88 1G5.B2 VL CDR3 QQRSNWWT 8 89 1G5.B2 CH região ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 constante de ca- HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 100 deia pesada KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 330
90 1G5.B2 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107
91 1G5.B2 cadeia pe- QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DYAMHWVRQT PGRGLEWLTF 50 sada ISYDGSNKYH ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCARDS 100 WDRGYFDLWG RGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 150 (sem sequência si- YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 200 nal) ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK 250 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 300 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 350 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 400 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK 449
92 1G5.B2 cadeia leve EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWWTFGQG 100
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência (sem sequência si- TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 150 nal) NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 200 SSPVTKSFNR GEC 213
P1-069366 Anticorpo (SEQ ID NOs: 93-104)
93 P1-069366 VH QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYAMHWVRQA PGKGLEWVAV 50 (sequência de ami- ISYDGSYKEY ADSVKGRFTI SRDSSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAQ 100 noácido de região ISEYFDYWGQ GTLVTVSS 118 variável de cadeia pesada)
94 P1-069366 VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA 50 (sequência de ami- ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPLTFGQ 100 noácido de região GTKVEIK 107 variável de cadeia leve)
95 P1-069366 VH CDR1 SYAMH 5 96 P1-069366 VH CDR2 VISYDGSYKEYADSVKG 97 P1-069366 VH CDR3 AQISEYFDY 98 P1-069366 VL CDR1 RASQGISSWLA 99 P1-069366 VL CDR2 AASSLQS 100 P1-069366 VL CDR3 QQYNSYPLT 101 P1-069366 CH re- ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 gião constante de HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 100 cadeia pesada KSCDKTHTCP PCPAPEAEGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 329
102 P1-069366 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107 103 P1-069366 cadeia QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYAMHWVRQA PGKGLEWVAV 50 pesada ISYDGSYKEY ADSVKGRFTI SRDSSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAQ 100 sem sequência si- ISEYFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 nal FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG 447
104 P1-069366 cadeia DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA 50 leve ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPLTFGQ 100 sem sequência si- GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 nal DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
NKG2A.17 Anticorpo (chimeric anti-NKG2A 27H4.D4)(mG1-D265A isótipo)(SEQ ID NOs: 105-118)
105 27H4.D4 VH CAGGTGCAAC TAGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTCAAGC CTGGAGGGTC 50 (sequência de nu- CCTCAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGGTT CACCTTCAGT GACTTCTACA 100 cleotídeo de re- TGAGCTGGAT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GATTTCATAC 150 gião variável de ATTAGTAGTA GTGATTTTAC CATATACTAC GCAGACTCTG TGGAGGGCCG 200 cadeia pesada) ATTCACCATC TCCAGGGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTTT CTGCAAATGA 250 ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAAGAGGG 300 AGCCTTCCTT TCAACTACGA TATGGACGTC TGGGGCCAAG GGACCACGGT 350 CACCGTCTCC TCA 363 106 27H4.D4 VH QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DFYMSWIRQA PGKGLEWISY 50 ISSSDFTIYY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLF LQMNSLRAED TAVYYCARRG 100
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência (sequência de ami- SLPFNYDMDV WGQGTTVTVS S 121 noácido de região variável de cadeia pesada)
107 27H4.D4 VL GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 (sequência de nu- CAGAGTCACC ATCTCTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTAGC AGCTACTTAG 100 cleotídeo de re- CCTGGTATCA GCATAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT 150 gião variável de GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC 200 cadeia leve) TGGGACAGCT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAATAGTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA 500 GGGACCAAGG TGGAGATCAA A 521 108 27H4.D4 VL DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ISCRASQGIS SYLAWYQHKP GKAPKLLIYA 50 (sequência de ami- ASSLQSGVPS RFSGSGSGTA FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANSFPLTFGG 100 noácido de região GTKVEIK 107 variável de cadeia leve)
109 27H4.D4 VH CDR1 DFYMS 5 110 27H4.D4 VH CDR2 YISSSDFTIY YADSVEG 17 111 27H4.D4 VH CDR3 RGSLPFNYDM DV 12 112 27H4.D4 VL CDR1 RASQGISSYL A 11 113 27H4.D4 VL CDR2 AASSLQS 7 114 27H4.D4 VL CDR3 QQANSFPLT 9
115 27H4.D4 CH região ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 constante de ca- HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP 100 deia pesada KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC 250 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 330
116 27H4.D4 CL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 região constante NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 de cadeia leve SFNRGEC 107
117 27H4.D4 cadeia pe- QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DFYMSWIRQA PGKGLEWISY 50 sada sem sequência ISSSDFTIYY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLF LQMNSLRAED TAVYYCARRG 100 sinal SLPFNYDMDV WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV 150 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ 200 TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK 250 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY 300 NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 350 QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 400 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 450 K 451
118 27H4.D4 cadeia DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ISCRASQGIS SYLAWYQHKP GKAPKLLIYA 50 leve sem sequência ASSLQSGVPS RFSGSGSGTA FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANSFPLTFGG 100 sinal GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
Anticorpo NKG2A.10 (13F3.A4 VH-I107T, VK-N30Q)) (13F3.A4 com reversão de quadro VH-I107T e VK-N30Q para remover sítio de desamidação) (SEQ ID NOs: 126-127)
126 NKG2A.10 cadeia EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 pesada ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPA 173
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 127 NKG2A.10 cadeia AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIQ SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 leve ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 NKG2A.12 Anticorpo (13F3.A4 VH-I107T) (anticorpo 13F3.A4 com VH-107T framework reversion) (SEQ ID NOs: 128-129)
128 NKG2A.12 cadeia EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 pesada ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 129 NKG2A.12 cadeia AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 leve ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.14 (13F3.A4 VK-N30Q) (anticorpo 13F3.A4 com N30Q para remover sítio de desamidação) (SEQ ID NOs: 130-131)
130 NKG2A.14 cadeia EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 pesada ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GILVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 131 NKG2A.14 cadeia AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIQ SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 leve ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.15 (13F3.A4 VK-N30P) (anticorpo 13F3.A4 com N30P para remover sítio de desamidação) (SEQ ID NOs: 132-133)
132 NKG2A.15 cadeia EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 pesada ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GILVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 133 NKG2A.15 cadeia AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIP SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 leve ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.18 (13F3.A4 VH-I107T, VK-N30S-Y49S) (SEQ ID NOs: 134-135)
134 NKG2A.18 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 135 NKG2A.18 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLISD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.19 (13F3.A4 VH-I107T, VK-N30S-Y94T) (SEQ ID NOs: 136-137)
136 NKG2A.19 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 137 NKG2A.19 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS (sequência de nu- RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSTPLTFGQ 100 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP cleotídeo de re- SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT gião variável de LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 cadeia leve) Anticorpo NKG2A.20 (13F3.A4 VH-I107T, VK-N30S-Y94A) (SEQ ID NOs: 138-139)
138 NKG2A.20 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 139 NKG2A.20 VH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSAPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.21 (13F3.A4 VH-I107T, VK-N30S-Y94N) (SEQ ID NOs: 140-141)
140 NKG2A.21 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 141 NKG2A.21 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSNPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.22 (13F3.A4 VH-Y56T-I107T, VK-N30S) (SEQ ID NOs: 142-143)
142 NKG2A.22 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSTIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 143 NKG2A.22 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.23 (13F3.A4 VH-I57T-I107T, VK-N30S) (SEQ ID NOs: 144-145)
144 NKG2A.23 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 145 NKG2A.23 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.24 (13F3.A4 VH-Y58N-I107T, VK-N30S) (SEQ ID NOs: 146-147)
146 NKG2A.24 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYINY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 147 NKG2A.24 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 Anticorpo NKG2A.25 (13F3.A4 VH-Y58S-I107T, VK-N30S) (SEQ ID NOs: 148-149)
148 NKG2A.25 VH EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 (sequência de nu- ISSSSSYISY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 cleotídeo de re- WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 gião variável de FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 cadeia pesada) CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 149 NKG2A.25 LH AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 (sequência de nu- ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 cleotídeo de re- GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 gião variável de DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 cadeia leve) LSSPVTKSFN RGEC 214 NKG2A.13-G1,3f (SEQ ID NOs: 150-151)
150 NKG2A.13-G1,3f AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS FSGSGSG- TDF TLTISSLQPE DFATYYCQQF NSYPLTFGQG 100 TRLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS (sequência de ca- VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 150 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV deia leve) YACEVTHQGL 200 SSPVTKSFNR GEC 213 151 NKG2A.13-G1,3f EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GILVTVSSAS TKG- PSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência (sequência de ca- SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 deia pesada) TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPS- DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 mNKG2A.3-mG1-D265A (SEQ ID NOs: 152-153)
152 mNKG2A.3-mG1-D265A DIVMTQSPSS LAVSAGDKVT INCKSSQTLF SGRYNYLAWY QQKTGQAPKL 50 LIYYTSTRHT GVPGR- FIGSG SGTDFTLTIN NLQTEDLGNY YCQQHYSTPY 100 TFGAGTNLEI RRADAAPTVS IFPPSSEQLT (Sequência de ca- SGGASVVCFL NNFYPKDINV 150 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLTKDEY deia leve) ERHNSYTCEA 200 THKTSTSPIV KSFNRNEC 218 153 mNKG2A.3-mG1-D265A QVQLKQSGAE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DGYMHWVEQN PGQGLEWIGR 50 IDPDSGYTMY NQKFQD- KATL TRDKSSSTVY MELRSLTSED SAVYYCAINY 100 GEYWYFDFWG QGTQVTVSSA KTTPPSVYPL (Sequência de ca- APGSAAQTNS MVTLGCLVKG 150 YFPEPVTVTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTW- deia pesada) PSETVT 200 CNVAHPASST KVDKKIVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT 250 LTPKVTCVVV AISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVS 300 ELPIMHQDWL NGKEFK- CRVN SAAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP 350 KEQMAKDKVS LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY 400 FVYSKLNVQK SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK 443
154 RASQGIPSAL A 11 155 RASQGINSAL A 11 156 LSIDNEEMKF 10 157 PSSWIGVFRN SSHHPW 16 158 LAFKHEIKDS DN 12 159 QVNRLKSAQQ CGSSIIYHC 19 160 GGGGSGGGGS GGGGS 15 161 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT 50 ELKHLQCLEE ELKPLEE- VLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET 100 TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT 132 162 VSNK 4 163 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKG- PSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPS- DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 448 164 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIP SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIK 107 165 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 NSQESVTEQD SKDSTYS- LSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 SFNRGEC 107 166 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTCAAGC CGGGGGGGTC 50 CCTGAGACTC TCCTGTG- CAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT TCCCATAGTA 100 TGAACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCTCAGCC 150 ATAAGTAGTA GTAGTAGTTA CATATACTAC GCAGACTCAG TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA 250 ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAG 300 TGGGGGCTAC CCTTTGACTA CTGGGGCCAG GGAATCCTGG TCACCGTCTC 350 CTCA 354 167 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GILVTVSS 118 168 GCCATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 CAGAGTCACC ATCAC- TTGCC GGGCAAGTCA GGGCATTAAC AGTGCTTTAG 100 CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGAT 150 GCCTCCAGTT TGAAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTG- GATC 200 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 CAACTTA- TTA CTGTCAACAG TTTAATAGTT ACCCTCTCAC CTTCGGCCAA 300 GGGACACGAC TGGAGATTAA A 321 169 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIK 107 170 GAGGTGCAGT TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTCAAGC CTGGGGGGTC 50 CCTGAGACTC TCCTGTG- CAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATAGCA 100 TGAACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCTCATCC 150 ATTAGTAGTA GTAGTAGTTA CATATACTAC GCAGACTCAG TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA 250 ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGACTACTA 300 TGGTTCGGGG AGA- TTTTTGA CTACTGGGGC CAGGGAACCC TGGTCACCGT 350 CTCCTCA 357
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 171 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMNWVRQA PGKGLEWVSS 50 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARLL 100 WFGEIFDYWG QGTLVTVSS 119 172 GCCATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 50 CAGAGTCACC ATCAC- TTGCC GGGCAAGTCA GGGCATTAGC AGTGCTTTAG 100 CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGAT 150 GCCTCCAGTT TGAAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTG- GATC 200 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG 250 CAACTTA- TTA CTGTCAACAG TTTAATAGTT ACCCGATCAC CTTCGGCCAA 300 GGGACACGAC TGGAGATTAA A 321 173 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPITFGQ 100 GTRLEIK 107 174 CAGATGCAGC TGCAGGAGTC GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC 50 CCTGTCCCTC ACCTG- CACTG TCTCTGGTGG CTCCGTCAGC AGTGGTCGTT 100 ACTACTGGAG TTGGATCCGG CAGCCCCCCG GGAAGGGACT GGAGTGGATT 150 GGGTATATCT ATTACAGTGG GAGCACCAAC TACAACCCCT CCCT- CAAGAG 200 TCGAGTCACC ATATCAGTAG ACACGTCCAA GAACCAGTTC TCCCTGAAGC 250 TGAC- CTCTGT GACCGCTGCG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGAG 300 GGTGGAGACT ACTACTACTA CAATATGGAC GTCTGGGGCC CAGGGACCAC 350 GGTCACCGTC TCCTCA 366 175 QMQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGRYYWSWIR QPPGKGLEWI 50 GYIYYSGSTN YNPSLKS- RVT ISVDTSKNQF SLKLTSVTAA DTAVYYCARE 100 GGDYYYYNMD VWGPGTTVTV SS 122 176 GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT 100 TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGG- CCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT 150 GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG 200 GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT 250 TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCGTA CACTTTTGGC 300 CAGGGGACCA AGCTG- GAGAT CAAA 324 177 EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY 50 GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPYTFG 100 QGTKLEIK 108 178 CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGGTC 50 CCTGAGACTC TCCTGTG- CAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT GACTATGCTA 100 TGCACTGGGT CCGCCAGACT CCAGGCAGGG GGCTGGAGTG GCTGACATTT 150 ATATCATATG ATGGAAGCAA TAAATACCAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG 200 ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTTT CTGCAAATGA 250 ACAGTCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCTGTTT ATTACTGTGC GAGAGATTCC 300 TGGGATCGGG GGTAC- TTCGA TCTCTGGGGC CGTGGCACCC TGGTCACTGT 350 CTCCTCA 357 179 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DYAMHWVRQT PGRGLEWLTF 50 ISYDGSNKYH ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCARDS 100 WDRGYFDLWG RGTLVTVSS 119 180 GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG 100 CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCA- GGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT 150 GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 200 TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG 250 CA- GTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGTGGACGTT CGGCCAAGGG 300 ACCAAGGTGG AAATCAAA 318 181 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWWTFGQG 100 TKVEIK 106 182 MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKSS ILATEQEITY AELNLQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSA- PEK LIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSTLIQR 100 HNNSSLNTRT QKARHCGHCP EEWITYSNSC YYIGKERRTW EESLLACTSK 150 NSSLLSIDNE EEMKFLSIIS PSSWIGVFRN SSHHPWVTMN GLAF- KHEIKD 200 SDNAELNCAV LQVNRLKSAQ CGSSIIYHCK HKL 233 183 XEWGLPFD 8 184 EXWGLPFD 8 185 EEXGLPFD 8 186 EEWXLPFD 8 187 EEWGXPFD 8 188 EEWGLXFD 8 189 EEWGLPXD 8 190 EEWGLPFX 8 191 GTFSSYSMN 9 192 GFTFSSHSMN 10 193 EEWGLPFD 8 194 RASQGSNSAL A 11 195 QQFNNYPLT 9 196 GFTFSSYSMN 10 197 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GILVTVSSAS TKG- PSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 FPEPVTVSWN 160
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência 198 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYcQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEI 106 199 LQMNSLRAED TAVYYCAREE WGLPFDYWGQ GILVTVSSAS TKGPSVFPLA 50 PSSKSTSGGT AALG- CLVKDY FPEPVTVSWN 80 200 LQMNSLRAED TAVYYCAREE WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA 50 PSSKSTSGGT AALG- CLVKDY FPEPVTVSWN 80 201 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP 80 202 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIP SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP 80 203 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIQ SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP 80 204 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP 80 205 NP_001291377.1 MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKSS ILATEQEITY AELNLQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSA- PEK LIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSTLIQR 100 HNNSSLNTRT QKARHCGHCP EEWITYSNSC YYIGKERRTW EESLLACTSK 150 NSSLLSIDNE EEMKFLSIIS PSSWIGVFRN SSHHPWVTMN GLAF- KHEIKD 200 SDNAELNCAV LQVNRLKSAQ CGSSIIYH 228 206 NP_015567.2 MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKNS ILATEQEITY AELNLQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSA- PEK LIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSRHCGH 100 CPEEWITYSN SCYYIGKERR TWEESLLACT SKNSSLLSID NEEEMKFLSI 150 ISPSSWIGVF RNSSHHPWVT MNGLAFKHEI KDSDNAELNC AVLQVN- RLKS 200 AQCGSSIIYH CKHKL 215 207 NP_998822.1 MDNQGVIYSD LNLPPNPKRQ QRKPKGNKSS ILATEQEITY AELNLQKASQ 50 DFQGNDKTYH CKDLPSA- PEK LIVGILGIIC LILMASVVTI VVIPSRHCGH 100 CPEEWITYSN SCYYIGKERR TWEESLLACT SKNSSLLSID NEEEMKFLSI 150 ISPSSWIGVF RNSSHHPWVT MNGLAFKHEI KDSDNAELNC AVLQVN- RLKS 200 AQCGSSIIYH CKHKL 215 208 NM_001304448.1 ACAGTTGAGA GGAGTTTGAG TGGAGATTCA GGGCCATTTT AGTATCTTCT 50 GTAGGACAGA GGTCAG- CAAG CATGCCCCAG AGGTACAGAT GTATATGTCT 100 CCCAGGAAGT CTCTGTGGGT GAAGGACTGA TCTCAAGTTG TGGCTGACAC 150 TAGTTAAAGC CAAGTTAGAG GGCTGTTTCA GGGTCTACAT TGAGAC- TACA 200 GTTGATATGC CTACCTCCTG AGACACTAGT GTGTGAGTCT CCTCCTGGGC 250 CCCTGGG- CAA ATGGTTTTGG CAGCATGACC AAGGCCTAAA TGGGGCTGAA 300 GGCAAGCACA GGAGGATGGG TCCCTTTTCA GGTCTGGAGA TGGAATCACT 350 GTTGCTATAG CAGGCCTTTT TATGAGACTA ACCTGG- CCTC TCCACTAAAG 400 GATGTGTGAC TTTCTGGGGA CAGAAGAGTA CAGTCCCTGA CATCACACAC 450 TGCAGAGATG GATAACCAAG GAGTAATCTA CTCAGACCTG AATCTGCCCC 500 CAAACCCAAA GAGGCAGCAA CGAAAACCTA AAGGCAATAA AAGCTCCATT 550 TTAGCAACTG AACAGGAAAT AACCTA- TGCG GAATTAAACC TTCAAAAAGC 600 TTCTCAGGAT TTTCAAGGGA ATGACAAAAC CTATCACTGC AAAGATTTAC 650 CATCAGCTCC AGAGAAGCTC ATTGTTGGGA TCCTGGGAAT TATCTGTCTT 700 ATCTTAATGG CCTCTGTGGT AACGATAGTT GTTATTCCCT CTACATTAAT 750 ACAGAGGCAC AACAA- TTCTT CCCTGAATAC AAGAACTCAG AAAGCACGTC 800 ATTGTGGCCA TTGTCCTGAG GAGTGGATTA CATATTCCAA CAGTTGTTAC 850 TACATTGGTA AGGAAAGAAG AACTTGGGAA GAGAGTTTGC TGG- CCTGTAC 900 TTCGAAGAAC TCCAGTCTGC TTTCTATAGA TAATGAAGAA GAAATGAAAT 950 TTCTG- TCCAT CATTTCACCA TCCTCATGGA TTGGTGTGTT TCGTAACAGC 1000 AGTCATCATC CATGGGTGAC AATGAATGGT TTGGCTTTCA AACATGAGAT 1050 AAAAGACTCA GATAATGCTG AACTTAACTG TGCAG- TGCTA CAAGTAAATC 1100 GACTTAAATC AGCCCAGTGT GGATCTTCAA TAATATATCA TTAAACTTGT 1150 TAATTTAATA CAATTTACAA CACACCTGC 1179 209 NM_002259.5 CCACTCTTGA CTCACTCTGA GCCTTCACAG GGCAGTCTGC GAAGATTGCA 50 GGCATTGTTT GTTCTTG- TCT TGGATTTATG CCTTTAAATT TCACCTTTTA 100 TTACACAGCT ATAGCAGGCC TTTTTATGAG AC- TAACCTGG CCTCTCCACT 150 AAAGGATGTG TGACTTTCTG GGGACAGAAG AGTACAGTCC CTGACAT- CAC 200 ACACTGCAGA GATGGATAAC CAAGGAGTAA TCTACTCAGA CCTGAATCTG 250 CCCCCAAACC CAAAGAGGCA GCAACGAAAA CCTAAAGGCA ATAAAAACTC 300 CATTTTAGCA ACTGAACAGG AAA- TAACCTA TGCGGAATTA AACCTTCAAA 350 AAGCTTCTCA GGATTTTCAA GGGAATGACA AAACCTATCA CTGCAAAGAT 400 TTACCATCAG CTCCAGAGAA GCTCATTGTT GGGATCCTGG GAATTATCTG 450 TCTTATCTTA ATGGCCTCTG TGGTAACGAT AGTTGTTATT CCCTCTACAT 500 TAATACAGAG GCACAA- CAAT TCTTCCCTGA ATACAAGAAC TCAGAAAGCA 550 CGTCATTGTG GCCATTGTCC TGAGGAGTGG ATTACATATT CCAACAGTTG 600 TTACTACATT GGTAAGGAAA GAAGAACTTG GGAAGAGAGT TTG- CTGGCCT 650 GTACTTCGAA GAACTCCAGT CTGCTTTCTA TAGATAATGA AGAAGAAATG 700 AAA- TTTCTGT CCATCATTTC ACCATCCTCA TGGATTGGTG TGTTTCGTAA 750 CAGCAGTCAT CATCCATGGG TGACAATGAA TGGTTTGGCT TTCAAACATG 800 AGATAAAAGA CTCAGATAAT GCTGAACTTA ACTGTG- CAGT GCTACAAGTA 850 AATCGACTTA AATCAGCCCA GTGTGGATCT TCAATAATAT ATCATTGTAA 900 GCATAAGCTT TAGAGGTAAA GCGTTTGCAT TTGCAGTGCA TCAGATAAAT 950 TGTATATTTC TTAAAATAGA AATATATTAT GATTGCATAA ATCTTAAAAT 1000 GAATTATGTT ATTTGCTCTA ATAAGAAAAT TCTAAATCAA TTATTGAAAC 1050 AGGATACACA CAATTACTAA AGTACAGACA TCC- TAGCATT TGTGTCGGGC 1100 TCATTTTGCT CAACATGGTA TTTGTGGTTT TCAGCCTTTC TAAAAG-
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência TTGC 1150 ATGTTATGTG AGTCAGCTTA TAGGAAGTAC CAAGAACAGT CAAACCCATG 1200 GAGACA- GAAA GTAGAATAGT GGTTGCCAAT GTCTGAGGGA GGTTGAAATA 1250 GGAGATGACC TCTAACTGAT AGAACGTTAC TTTGTGTCGT GATGAAAACT 1300 TTCTAAATTT CAGTAGTGGT GATGGTTGTA AC- TCTGCGAA TATACTAAAC 1350 ATCATTGATT TTTAATCATT TTAAGTGCAT GAAATGTATG CTTTGTA- CAC 1400 GACACTTCAA TAAAGCTATC CAGAAAAAAA AAAAAA 1436 210 NM_007328.4 CCACTCTTGA CTCACTCTGA GCCTTCACAG GGCAGTCTGC GAAGATTGCA 50 GGCATTGTTT GTTCTTG- TCT TGGATTTATG CCTTTAAATT TCACCTTTTA 100 TTACACAGCT ATAGCAGGCC TTTTTATGAG AC- TAACCTGG CCTCTCCACT 150 AAAGGATGTG TGACTTTCTG GGGACAGAAG AGTACAGTCC CTGACAT- CAC 200 ACACTGCAGA GATGGATAAC CAAGGAGTAA TCTACTCAGA CCTGAATCTG 250 CCCCCAAACC CAAAGAGGCA GCAACGAAAA CCTAAAGGCA ATAAAAACTC 300 CATTTTAGCA ACTGAACAGG AAA- TAACCTA TGCGGAATTA AACCTTCAAA 350 AAGCTTCTCA GGATTTTCAA GGGAATGACA AAACCTATCA CTGCAAAGAT 400 TTACCATCAG CTCCAGAGAA GCTCATTGTT GGGATCCTGG GAATTATCTG 450 TCTTATCTTA ATGGCCTCTG TGGTAACGAT AGTTGTTATT CCCTCACGTC 500 ATTGTGGCCA TTG- TCCTGAG GAGTGGATTA CATATTCCAA CAGTTGTTAC 550 TACATTGGTA AGGAAAGAAG AACTTGGGAA GAGAGTTTGC TGGCCTGTAC 600 TTCGAAGAAC TCCAGTCTGC TTTCTATAGA TAATGAAGAA GAAA- TGAAAT 650 TTCTGTCCAT CATTTCACCA TCCTCATGGA TTGGTGTGTT TCGTAACAGC 700 AGTCAT- CATC CATGGGTGAC AATGAATGGT TTGGCTTTCA AACATGAGAT 750 AAAAGACTCA GATAATGCTG AACTTAACTG TGCAGTGCTA CAAGTAAATC 800 GACTTAAATC AGCCCAGTGT GGATCTTCAA TAATA- TATCA TTGTAAGCAT 850 AAGCTTTAGA GGTAAAGCGT TTGCATTTGC AGTGCATCAG ATAAATTGTA 900 TATTTCTTAA AATAGAAATA TATTATGATT GCATAAATCT TAAAATGAAT 950 TATGTTATTT GCTCTAATAA GAAAATTCTA AATCAATTAT TGAAACAGGA 1000 TACACACAAT TACTAAAGTA CAGA- CATCCT AGCATTTGTG TCGGGCTCAT 1050 TTTGCTCAAC ATGGTATTTG TGGTTTTCAG CCTTTCTAAA AGTTGCATGT 1100 TATGTGAGTC AGCTTATAGG AAGTACCAAG AACAGTCAAA CCCATGGAGA 1150 CAGAAAGTAG AATAGTGGTT GCCAATGTCT GAGGGAGGTT GAAATAGGAG 1200 ATGACCTCTA ACTGA- TAGAA CGTTACTTTG TGTCGTGATG AAAACTTTCT 1250 AAATTTCAGT AGTGGTGATG GTTGTAACTC TGCGAATATA CTAAACATCA 1300 TTGATTTTTA ATCATTTTAA GTGCATGAAA TGTATGCTTT GTACA- CGACA 1350 CTTCAATAAA GCTATCCAGA AAAAAAAAAA AA 1382 211 NM_213657.2 GCATGCCCCA GAGGTACAGA TGTATATGTC TCCCAGGAAG TCTCTGTGGG 50 TGAAGGACTG ATCT- CAAGTT GTGGCTGACA CTAGTTAAAG CCAAGTTAGA 100 GGGCTGTTTC AGGGTCTACA TTGAGACTAC AGTTGATATG CCTACCTCCT 150 GAGACACTAG TGTGTGAGTC TCCTCCTGGG CCCCTGGGCA AATGG- TTTTG 200 GCAGCATGAC CAAGGCCTAA ATGGGGCTGA AGGCAAGCAC AGGAGGATGG 250 GTCCCTTTTC AGGTCTGGAG ATGGAATCAC TGTTGCTATA GCAGGCCTTT 300 TTATGAGACT AAC- CTGGCCT CTCCACTAAA GGATGTGTGA CTTTCTGGGG 350 ACAGAAGAGT ACAGTCCCTG ACATCACACA CTGCAGAGAT GGATAACCAA 400 GGAGTAATCT ACTCAGACCT GAATCTGCCC CCAAACCCAA AGAGG- CAGCA 450 ACGAAAACCT AAAGGCAATA AAAGCTCCAT TTTAGCAACT GAACAGGAAA 500 TAACCTA- TGC GGAATTAAAC CTTCAAAAAG CTTCTCAGGA TTTTCAAGGG 550 AATGACAAAA CCTATCACTG CA- AAGATTTA CCATCAGCTC CAGAGAAGCT 600 CATTGTTGGG ATCCTGGGAA TTATCTGTCT TATCTTA- ATG GCCTCTGTGG 650 TAACGATAGT TGTTATTCCC TCACGTCATT GTGGCCATTG TCCTGAGGAG 700 TGGATTACAT ATTCCAACAG TTGTTACTAC ATTGGTAAGG AAAGAAGAAC 750 TTGGGAAGAG AGTTTG- CTGG CCTGTACTTC GAAGAACTCC AGTCTGCTTT 800 CTATAGATAA TGAAGAAGAA ATGAAATTTC TGTCCATCAT TTCACCATCC 850 TCATGGATTG GTGTGTTTCG TAACAGCAGT CATCATCCAT GGGTGA- CAAT 900 GAATGGTTTG GCTTTCAAAC ATGAGATAAA AGACTCAGAT AATGCTGAAC 950 TTAACTG- TGC AGTGCTACAA GTAAATCGAC TTAAATCAGC CCAGTGTGGA 1000 TCTTCAATAA TATATCATTG TAAGCATAAG CTTTAGAGGT AAAGCGTTTG 1050 CATTTGCAGT GCATCAGATA AATTGTATAT TTCT- TAAAAT AGAAATATAT 1100 TATGATTGCA TAAATCTTAA AATGAATTAT GTTATTTGCT CTAATAAGAA 1150 AATTCTAAAT CAATTATTGA AACAGGATAC ACACAATTAC TAAAGTACAG 1200 ACATCCTAGC ATTTGTGTCG GGCTCATTTT GCTCAACATG GTATTTGTGG 1250 TTTTCAGCCT TTCTAAAAGT TGCATGTTAT GTGAGTCAGC TTATAGGAAG 1300 TACCAAGAAC AGTCAAACCC ATGGAGACAG AAAG- TAGAAT AGTGGTTGCC 1350 AATGTCTGAG GGAGGTTGAA ATAGGAGATG ACCTCTAACT GATAGAACGT 1400 TACTTTGTGT CGTGATGAAA ACTTTCTAAA TTTCAGTAGT GGTGATGGTT 1450 GTAACTCTGC GAATATACTA AACATCATTG ATTTTTAATC ATTTTAAGTG 1500 CATGAAATGT ATGCTTTGTA CACGA- CACTT CAATAAAGCT ATCCAGAAAA 1550 AAAAAAAAAA AAA 1563 212 NM_213658.2 GCATGCCCCA GAGGTACAGA TGTATATGTC TCCCAGGAAG TCTCTGTGGG 50 TGAAGGACTG ATCT- CAAGTT GTGGCTGACA CTAGTTAAAG CCAAGTTAGA 100 GGGCTGTTTC AGGGTCTACA TTGAGACTAC AGTTGATATG CCTACCTCCT 150 GAGACACTAG TGTGTGAGTC TCCTCCTGGG CCCCTGGGCA AATGG- TTTTG 200 GCAGCATGAC CAAGGCCTAA ATGGGGCTGA AGGCAAGCAC AGGAGGATGG 250 GTCCCTTTTC AGGTCTGGAG ATGGAATCAC TGTTGCTATA GCAGGCCTTT 300 TTATGAGACT AAC- CTGGCCT CTCCACTAAA GGATGTGTGA CTTTCTGGGG 350 ACAGAAGAGT ACAGTCCCTG ACATCACACA CTGCAGAGAT GGATAACCAA 400 GGAGTAATCT ACTCAGACCT GAATCTGCCC CCAAACCCAA AGAGG- CAGCA 450 ACGAAAACCT AAAGGCAATA AAAGCTCCAT TTTAGCAACT GAACAGGAAA 500 TAACCTA- TGC GGAATTAAAC CTTCAAAAAG CTTCTCAGGA TTTTCAAGGG 550 AATGACAAAA CCTATCACTG CA- AAGATTTA CCATCAGCTC CAGAGAAGCT 600 CATTGTTGGG ATCCTGGGAA TTATCTGTCT TATCTTA- ATG GCCTCTGTGG 650 TAACGATAGT TGTTATTCCC TCTACATTAA TACAGAGGCA CAACAATTCT 700
Listagem de sequências SEQ ID NO Nome Sequência TCCCTGAATA CAAGAACTCA GAAAGCACGT CATTGTGGCC ATTGTCCTGA 750 GGAGTGGATT ACATA- TTCCA ACAGTTGTTA CTACATTGGT AAGGAAAGAA 800 GAACTTGGGA AGAGAGTTTG CTGGCCTGTA CTTCGAAGAA CTCCAGTCTG 850 CTTTCTATAG ATAATGAAGA AGAAATGAAA TTTCTGTCCA TCATTT- CACC 900 ATCCTCATGG ATTGGTGTGT TTCGTAACAG CAGTCATCAT CCATGGGTGA 950 CAATGAA- TGG TTTGGCTTTC AAACATGAGA TAAAAGACTC AGATAATGCT 1000 GAACTTAACT GTGCAGTGCT ACAAGTAAAT CGACTTAAAT CAGCCCAGTG 1050 TGGATCTTCA ATAATATATC ATTGTAAGCA TAAG- CTTTAG AGGTAAAGCG 1100 TTTGCATTTG CAGTGCATCA GATAAATTGT ATATTTCTTA AAATAGAAAT 1150 ATATTATGAT TGCATAAATC TTAAAATGAA TTATGTTATT TGCTCTAATA 1200 AGAAAATTCT AAATCAATTA TTGAAACAGG ATACACACAA TTACTAAAGT 1250 ACAGACATCC TAGCATTTGT GTCGGGCTCA TTTTGCTCAA CATGGTATTT 1300 GTGGTTTTCA GCCTTTCTAA AAGTTGCATG TTATG- TGAGT CAGCTTATAG 1350 GAAGTACCAA GAACAGTCAA ACCCATGGAG ACAGAAAGTA GAATAGTGGT 1400 TGCCAATGTC TGAGGGAGGT TGAAATAGGA GATGACCTCT AACTGATAGA 1450 ACGTTACTTT GTGTCGTGAT GAAAACTTTC TAAATTTCAG TAGTGGTGAT 1500 GGTTGTAACT CTGCGAATAT AC- TAAACATC ATTGATTTTT AATCATTTTA 1550 AGTGCATGAA ATGTATGCTT TGTACACGAC ACTTCAA- TAA AGCTATCCAG 1600 AAAAAAAAAA AAAAAAA 1617
Tabela 2. Sequências de aminoácido de VH, VL, CH, CL, cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal NKG2A.9 (também conhecido como 13F3-VH-I107T-Vk-N30S IgG1.3) (doravante referido como “Anticorpo NKG2A.9”) Sequências de aminoácido (SEQ ID NOs) Domínio variável de EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 cadeia pesada (VH) ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 WGLPFDYWGQ GTLVTVSS 118
(SEQ ID NO:8) Domínio variável de AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 cadeia leve(VL) ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIK 107
(SEQ ID NO:9) Domínio constante de ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 50 cadeia pesada (CH) HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP 100 KSCDKTHTCP PCPAPEAEGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS 150 (C-lisina terminal (K) não HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 é mostrada, mas pode es- EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC 250 tar incluída em algumas LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300 modalidades) QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 329
(SEQ ID NO:16) Domínio constante de RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 50 cadeia leve (CL) NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 100 SFNRGEC 107
(SEQ ID NO:17) Cadeia pesada EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SHSMNWVRQA PGKGLEWVSA 50 ISSSSSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE 100 (C-lisina terminal (K) não WGLPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 150 é mostrada, mas pode es- FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 200 tar incluída em algumas CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD 250 modalidades) TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 300 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 350 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 400 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG 447
(SEQ ID NO:7) Cadeia leve AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP GKAPKLLIYD 50 ASSLKSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGQ 100 GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214
(SEQ ID NO: 5)
Tabela 3. Sequências de aminoácido para os seis domínios de CDR do anticorpo NKG2A.9 Sequências de aminoácido (SEQ ID NOs) VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 SHSMN AISSSSSYIY- EEWGLPFDY RASQGISSALA DASSLKS QQFNSYPLT
YADSVKG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:11) Tabela 4. Sequências de aminoácido para os seis domínios de CDR do anticorpo NKG2A.11 Sequências de aminoácido (SEQ ID NOs) VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
SHSMN AISSSSSYI EEWGLPFDY RASQGIPSALA DASSLKS QQFNSYPLT
YYADSVKG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:154) (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:11) Tabela 5. Sequências de aminoácido para os seis domínios de CDR do anticorpo 13F3.A4 Sequências de aminoácido (SEQ ID NOs) VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
SHSMN AISSSSSYIYYADSVKG EEWGLPFDY RASQGINSALA DASSLKS QQFNSYPLT (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:155) (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:15)

Claims (52)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, especificamente liga a proteína do grupo de receptores inibidores de células exterminadoras naturais humanas 2A (NKG2A) e apresenta pelo menos uma das se- guintes propriedades: (a) reduz a ligação e/ou interação de HLA-E à proteína NKG2A humana; (b) reverte sinalização inibidora mediada por NKG2A; (c) não liga, ou liga com baixa afinidade para, proteína NKG2C humana; (d) liga-se à proteína NKG2C humana ou de cinomolgo; (e) aumenta a resposta de célula exterminadora natural; (f) aumenta a atividade funcional de células T; (g) tem ligação reduzida a receptor Fc gama humano (FcγR); (h) induz e/ou aumenta uma resposta imune antitumor; e/ou (i) tem baixa imunogenicidade em indivíduos humanos.
2. Anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma ou mais das seguintes propriedades: (a) tem um valor de EC50 de cerca de 0,6 nM ou menos para ligação à proteína NKG2A humana como medido por ensaio de ligação celular; (b) tem um valor de EC50 de cerca de 9,0 nM ou mais para ligação à proteína NKG2C humana como medido por ensaio de ligação celular; (c) tem um valor de EC50 para ligação à proteína NKG2A hu- mana que é cerca de 15 vezes menor do que um segundo valor de EC50 para ligação à proteína NKG2C humana;
(d) tem um valor de IC50 de cerca de 1,0 nM ou menos como medido por ensaio de bloqueio celular; (e) liga-se à proteína NKG2A humana com uma KD de cerca de 0,4 nM ou menos como medido por análise de Scatchard; (f) liga-se à proteína NKG2A humana com uma KD de cerca de 61 nM ou menos como medido por ressonância de plasmons de su- perfície; (g) liga-se à proteína NKG2A de cinomolgo com uma KD de cerca de 1,0 nM ou menos como medido por análise de Scatchard; (h) é internalizado mediante ligação a células que expressam NKG2A; (i) aumenta a produção de interferon-gama (IFNγ); (j) em que a meia-vida do complexo de anticorpo anti- NKG2A:proteína NKG2A é cerca de 40 segundos ou mais; e/ou (k) apresenta internacionalização com um valor de EC50 de cerca de 0,5 nM ou menor.
3. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo reduz a ligação e/ou interação de HLA-E à proteína NKG2A humana.
4. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à proteína NKG2A humana.
5. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A hu- mana, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 11, 12, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 13, 14, e 15;
(b) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 11, e 12, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 154, 14, e 15; ou (c) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 11, e 12, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 155, 14, e 15.
6. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A hu- mana, e compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, carac- terizado pelo fato de que (a) a região variável de cadeia pesada compreende uma se- quência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 167, e/ou (b) a região variável de cadeia leve compreende uma se- quência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85% pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 164, ou SEQ ID NO: 169.
7. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 8, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9.
8. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 8, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 164.
9. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 167, e a região variável de cadeia leve compre- ende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 169.
10. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, caracterizado pelo fato de que as cadeias leves e pesadas consistem essencialmente em: (a) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7 e 5, res- pectivamente; (b) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7 e 19, respectivamente; ou (c) as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente.
11. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compete para ligação à proteína NKG2A com ou se liga ao mesmo epítopo que qual- quer um dos anticorpos acima.
12. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que, quando ligado à proteína NKG2A humana, especificamente se liga aos seguintes resíduos de aminoácido como determinado por espectrometria de massa com troca hidrogênio-deuté- rio (HDX-MS): (a) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156);
(b) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157); (c) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158); e (d) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159), caracterizado pelo fato de que o anticorpo bloqueia a ligação de HLA-E à proteína NKG2A humana.
13. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que, quando ligado à NKG2A humana, especi- ficamente se liga aos seguintes resíduos de aminoácido como determi- nado por HDX-MS e/ou mapeamento de epítopo por oxidação fotoquí- mica rápida de proteínas (FPOP): (a) LSIDNEEMKF (SEQ ID NO: 156) (b) PSSWIGVFRNSSHHPW (SEQ ID NO: 157) (c) LAFKHEIKDSDN (SEQ ID NO: 158) (d) L; e (e) QVNRLKSAQQCGSSIIYHC (SEQ ID NO: 159), caracterizado pelo fato de que o anticorpo bloqueia a ligação de HLA-E à proteína NKG2A humana.
14. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de compri- mento total.
15. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de alto comprimento é um anticorpo IgG1.
16. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
17. Fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 16, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv ou scFv.
18. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, hu- manizado ou quimérico.
19. Anticorpo monoclonal de comprimento total isolado que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100% ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, e/ou a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5.
20. Anticorpo monoclonal de comprimento total isolado que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7, e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 19.
21. Anticorpo monoclonal de comprimento total isolado que especificamente se liga à NKG2A humana, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada consiste essencialmente na sequência de amino- ácido estabelecida na SEQ ID NO: 7, e a cadeia leve consiste essenci- almente na sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 19.
22. Anticorpo monoclonal de comprimento total isolado que especificamente se liga à proteína NKG2A humana, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, e a cadeia leve é uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19.
23. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à proteína NKG2A humana e compete de forma cruzada para ligação à proteína NKG2A humana com um anticorpo de referência compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), caracterizado pelo fato de que: (a) a VH compreende as sequências de aminoácido estabe- lecidas na SEQ ID NO: 8 e a VL compreende a sequência de aminoá- cido estabelecida na SEQ ID NO: 9; (b) a VH compreende as sequências de aminoácido estabe- lecidas na SEQ ID NO: 8 e a VL compreendendo a sequência de ami- noácido estabelecida na SEQ ID NO:164; ou (c) a VH compreende as sequências de aminoácido estabe- lecidas na SEQ ID NO: 167 e a VL compreendendo a sequência de ami- noácido estabelecida na SEQ ID NO: 169.
24. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica a região variável de cadeia leve e/ou pesada do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
25. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico é DNA complementar (cDNA).
26. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que com- preende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 24 ou 25.
27. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser trans- formada com o vetor de expressão, como definido na reivindicação 26.
28. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compre- ende o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ligado a um agente.
29. Método de produzir o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o an- ticorpo é produzido.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que ainda compreende recuperar o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da célula hospedeira.
31. Molécula biespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, li- gado a uma segunda porção funcional.
32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como de-
finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou a molécula bies- pecífica, como definida na reivindicação 31, e um veículo farmaceutica- mente aceitável.
33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracte- rizada pelo fato de que ainda compreende um agente terapêutico adici- onal.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracte- rizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA-4.
35. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, carac- terizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para tratar câncer.
36. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cer- vical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer testicular, câncer eso- fágico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer renal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de células germinativas, câncer ósseo, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de pele, neoplasia do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, endometrial, cervical, gástrico, melanoma, renal, urotelial, glioblastoma multiforme ou câncer relacionado a vírus.
37. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o câncer é cervical, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, pancreático, câncer de pulmão de células não pequenas do tipo adenocarcinoma, câncer de pulmão de células não pequenas do tipo células escamosas, gástrico, melanoma, colorretal, endometrial,
ovariano, carcinoma de células renais, carcinoma urotelial, mama, pul- mão de células pequenas, glioblastoma multiforme, câncer de próstata, ou linfoma não Hodgkin.
38. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, carac- terizado pelo fato de ser para uso no aumento de uma resposta imune.
39. Uso do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de câncer.
40. Método para tratar ou retardar a progressão de câncer em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, o imunocon- jugado, como definido na reivindicação 28, a molécula biespecífica, como definida na reivindicação 31, ou a composição, como definida na reivindicação 33 ou 34, para tratar ou retardar a progressão de câncer.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer testicular, câncer esofágico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer renal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de células germinativas, câncer ósseo, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de pele, neoplasia do sis- tema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, endome- trial, cervical, gástrico, melanoma, renal, urotelial, glioblastoma multi- forme, ou câncer relacionado a vírus.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o câncer é cervical, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, pancreático, câncer de pulmão de células não pequenas do tipo adenocarcinoma, câncer de pulmão de células não pequenas do tipo células escamosas, gástrico, melanoma, colorretal, endometrial, ovariano, carcinoma de células renais, carcinoma urotelial, mama, pulmão de células pequenas, glioblastoma multiforme, câncer de próstata ou linfoma não Hodgkin.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, carac- terizado pelo fato de que ainda compreende administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao indivíduo humano.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que os um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um agente quimioterápico, um agente radioterápico e/ou um agente imuno- terápico.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o agente imunoterápico é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA-4.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab, e o anticorpo anti- CTLA-4 é ipilulimab.
47. Método de estimular uma resposta imune em um indiví- duo humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, do imunoconjugado, como definido na reivindicação 28, da molécula biespecífica, como definida na reivindicação 31, ou da composição, como definida na reivindicação 33, 34 ou 35, para estimular a resposta imune.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano tem um tumor, e uma resposta imune antitumor é estimulada.
49. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano tem uma infecção viral crônica, e uma resposta imune antiviral é estimulada.
50. Método de detectar a presença de proteína NKG2A em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende contactar a amostra com o anticorpo, ou fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 23, sob condições que permitem a formação de um com- plexo entre o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e proteína NKG2A, e detectar a formação do complexo.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, forma um complexo mais rapidamente com proteína NKG2A do que com proteína NKG2C.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, forma um complexo 15 mais rapidamente com proteína NKG2A do que com proteína NKG2C.
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