JP2024037894A - 抗ｎｋｇ２ａ抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｎｋｇ２ａ抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】高い親和性でヒトナチュラルキラー細胞阻害性受容体２Ａ群（ＮＫＧ２Ａ）タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。【解決手段】ＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合し、以下の特性：（ａ）ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合もしくは相互作用を低減すること、（ｂ）ＮＫＧ２Ａに媒介される阻害性シグナル伝達を逆転させること、（ｃ）ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質と結合しないか、低い親和性で結合すること、（ｄ）ヒトもしくはカニクイザルＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、（ｅ）ナチュラルキラー細胞応答を増強すること、（ｆ）Ｔ細胞の機能的活性を増強すること、（ｇ）ＦｃγＲとの結合が低減されていること、（ｈ）抗腫瘍免疫応答を誘導もしくは増強すること、ならびに（ｉ）ヒト対象において低い免疫原性を有すること、のうちの少なくとも１つを呈する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１６日に出願された米国仮出願第６２／７６８，４７１号および２０１９年１０月２９日に出願された米国仮出願第６２／９２７，２１１号の優先権の利益を主張し、これらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、抗ＮＫＧ２Ａ（ナチュラルキラー細胞阻害性受容体２Ａ群）抗体およびその医薬組成物に関する。本発明はまた、抗ＮＫＧ２Ａ抗体およびその医薬組成物を投与することによって癌などの疾患を治療するための方法を含む、そのような抗体を使用するための方法にも関する。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１９年１１月４日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、１３１１９－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが２７３，４６７バイトである。
癌は、世界的に蔓延している。Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄａｔａ Ｅｘｃｈａｎｇｅによると、癌は、疾患の主因の１つであり、また死亡の２番目の主因であり、世界中で死亡の約１７％を引き起こしている。（"Hannah Ritchie and Max Roser, "Causes of Death - Share of deaths by cause, World, 2017", OurWorldInData.org, 2018、https://ourworldindata.org/grapher/share-of-deaths-by-cause-2016で入手可能）。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎによると、２０１０年でさえ、癌の経済的影響は、１．１６兆ドルであり、２０１８年では、癌は世界中で推定９６０万人の死亡を占めていた。（"Cancer." World Health Organization. World Health Organization, 2018、https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancerで入手可能）。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの推定によると、２０１９年には、１７０万人を超える新しい患者が、癌と診断され、６００，０００人を超える患者が、米国内で癌により死亡する見込みである。（"Cancer Stat Facts: Cancer of Any Site." SEER Training Modules, U. S. National Institutes of Health, National Cancer Institute, 2019 <https://seer.cancer.gov/statfacts/html/all.html>）。
従来的な癌の治療としては、その他の治療法の中でもとりわけ、外科手術、放射線療法、および化学療法が挙げられる。近年では、免疫－腫瘍学または免疫療法が、身体の免疫系を使用して癌を治療する新しい選択肢として出現してきた。免疫－腫瘍学は、例えば腫瘍を直接的に標的とすることおよび／または腫瘍血液供給を破壊することを試みていた従来的な癌治療とは異なる。代わりに、免疫－腫瘍学は、患者自身の免疫系を利用して、患者の抗腫瘍免疫応答を復元または増強するのを補助するように設計されている。免疫－腫瘍学アプローチがなければ、患者自身の免疫応答は、様々な理由で腫瘍成長を妨げることに失敗することが多い。例えば、多くの腫瘍は、患者の免疫応答を回避するための特化した機序が発達している。腫瘍細胞はまた、患者の免疫系によって認識され得る抗原の発現が失われている場合がある。他の事例では、腫瘍の急速な成長は、免疫系が腫瘍を効果的に制御する能力を凌駕することさえあり得る。（Abbas et al., "Chap. 18: Immunity to Tumors", in Cellular and Molecular Immunology, 9th ed. Elsevier, Inc., (2018)）。免疫系がどのように癌の発生に影響を及ぼすか、およびどのようにして免疫系を使用して癌を治療することができるかを理解することは、困難な多面的問題を提示している。例えば、多くの患者は、既存の免疫－腫瘍学治療には応答せず、特定の種類の白血球であるＴ細胞が正しく機能しなくなるＴ細胞消耗などの耐性機序を生じる患者もいる。（Dempke et al., Eur. J. of Cancer, 74: 55-72 (2017)）。
患者は、現在利用可能な癌免疫療法を含む従来的な治療法を改善する、癌などの疾患の改善された治療を必要としている。患者の応答率を改善し、薬物耐性を克服するために、単独または既存の薬剤との組合せのいずれかで使用される新規な免疫－腫瘍学薬剤に対して、大きな必要性が存在する。
本発明は、いくつかの態様において、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質（配列番号１）と結合する単離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体）、すなわち、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、例えば、望ましい機能的特性を呈する抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。一態様では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の望ましい機能的特性としては、免疫応答を刺激すること、例えば、癌を治療することが挙げられる。別の態様では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の望ましい機能的特性としては、ヒト患者を含め、ウイルスに感染した対象を治療することが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、感染性疾患を治療する。別の態様では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、自己免疫状態を治療する。他の実施形態では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、対象において免疫応答を刺激および／または増強するため、例えば、ナチュラルキラー細胞および／またはＴ細胞を含む、免疫系の抗腫瘍応答を刺激および／または増強するためのアンタゴニスト抗ＮＫＧ２Ａ抗体として使用される。他の実施形態では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、癌、ウイルス感染症を含む感染性疾患、および自己免疫疾患を含む、様々な状態を治療するために、その他の抗体と組み合わせて使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、単独、またはその他の治療、例えば、他の免疫－腫瘍学治療および／もしくは化学療法および／もしくは外科手術と組み合わせてのいずれかで、癌およびウイルス感染症を含む様々な状態または疾患を治療するために使用される。他の実施形態では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、サンプル中のＮＫＧ２Ａタンパク質を検出するための方法において使用される。
一態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合し、以下の特性：
（ａ）ＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／もしくは相互作用を低減（例えば、遮断）すること、
（ｂ）ＮＫＧ２Ａに媒介される阻害性シグナル伝達を逆転させること、
（ｃ）ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質と結合しないか、もしくは低い親和性で結合すること、
（ｄ）ヒトおよび／もしくはカニクイザルＮＫＧ２Ａと結合すること、
（ｅ）ナチュラルキラー細胞応答を増強すること、
（ｆ）Ｔ細胞の機能的活性を増強すること、
（ｇ）ヒトＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との結合が低減されていること、
（ｈ）抗腫瘍免疫応答を誘導および／もしくは増強すること、
（ｉ）抗ウイルス免疫応答を誘導および／もしくは増強すること、
ならびに／または
（ｊ）ヒト対象を含む、対象において低い免疫原性を有すること
のうちの少なくとも１つを呈する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、以下の特性：
（ａ）細胞結合アッセイによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に関して、約０．６ｎＭ以下のＥＣ５０値を有すること、
（ｂ）細胞結合アッセイによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合に関して、約９．０ｎＭ以上のＥＣ５０値を有すること、
（ｃ）ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に関して、ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合に関する第２のＥＣ５０値よりも約１５倍低いＥＣ５０値を有すること、
（ｄ）細胞遮断アッセイによって測定される場合、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／もしくはそれとの相互作用を低減することに関して、約１．０ｎＭ以下のＩＣ５０値を有すること、
（ｅ）スキャッチャード解析によって測定される場合、約０．４ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
（ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約６１ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＮＫＧ２Ａと結合すること、
（ｇ）スキャッチャード解析によって測定される場合、約１．０ｎＭ以下のＫＤで、カニクイザルＮＫＧ２Ａと結合すること、
（ｈ）ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合すると、内部移行されること、
（ｉ）インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）産生を増大させること、
（ｊ）約０．５ｎＭ以下のＥＣ５０値で内部移行（internationalization）を示すこと、ならびに／または
（ｋ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体：ＮＫＧ２Ａ複合体の半減期が、約４０秒以上であること
のうちの１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体：ＮＫＧ２Ａ複合体の半減期は、表面プラズモン共鳴分析を使用して測定される。
一実施形態では、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質とヒトＮＫＧ２Ａリガンド（すなわち、ＨＬＡ－Ｅ）との相互作用を低減（例えば、遮断）する。
別の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号１０、１１、１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｂ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５４、１４、および１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｃ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５５、１４、および１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
それぞれ、
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号８もしくは配列番号１６７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／または
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１６４、もしくは配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖が、
（ａ）それぞれ、配列番号７および５のアミノ酸配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号７および１９のアミノ酸配列、または
（ｃ）それぞれ、配列番号３５および３６のアミノ酸配列
から本質的になる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＮＫＧ２Ａタンパク質との結合について、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体と競合するか、またはそれと同一のエピトープと結合する。
別の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合したときに、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
（ａ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）；
（ｂ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）；
（ｃ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）；および
（ｄ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を遮断する。
別の態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａと結合したときに、ＨＤＸ－ＭＳおよび／またはタンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）エピトープマッピングによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
（ａ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）
（ｂ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）
（ｃ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）
（ｄ）L;および
（ｅ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を遮断する。
いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、全長抗体である。他の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、全長ＩｇＧ１抗体である。いくつかの他の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、抗体断片である。他の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片である。他の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
一態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離された全長モノクローナル抗体であって、
（ａ）重鎖が、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／または
（ｂ）軽鎖が、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
単離された全長モノクローナル抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、単離された全長モノクローナル抗体の重鎖は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、単離された全長モノクローナル抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合し、ここで、重鎖は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列から本質的になり、軽鎖は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列から本質的になる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸分子を含む、発現ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される発現ベクターが形質転換された、宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、薬剤と連結している本明細書に記載される抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む。
別の態様では、本発明は、第２の機能性部分と連結している本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む、二重特異性分子を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体または本明細書に記載される二重特異性分子と、医薬上許容される担体および／または可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質とを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、さらなる治療剤をさらに含む。他の実施形態では、さらなる治療剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体である。他の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブであり、抗ＣＴＬＡ抗体は、イピリムマブである。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、癌を治療するための医薬品として使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体、イムノコンジュゲート、二重特異性分子、および組成物を使用して治療される癌は、膀胱癌、乳癌、子宮癌／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌（gastric cancer）、黒色腫、腎癌、尿路上皮癌、多型神経膠芽腫、またはウイルス関連癌である。他の実施形態では、癌は、子宮頸癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、膵臓癌、非小細胞肺癌－腺癌型（ＮＳＣＬＣ－ＡＤ）、非小細胞肺癌－扁平上皮細胞型（ＮＳＣＬＣ－ＳＱＣ）、胃癌、黒色腫、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、尿路上皮癌（ＵＣＣ）、乳癌、小細胞肺癌、多型神経膠芽腫、前立腺癌（前立腺もしくはＰＲＣの腺癌としても知られる）、または非ホジキンリンパ腫である。
いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、免疫応答を増強する際に使用するためのものである。他の実施形態では、本発明は、癌の治療のための医薬品の製造における、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の使用を提供する。
一態様では、本発明は、ヒト対象における癌を治療するかまたはその進行を遅延させるための方法であって、ヒト対象に、有効量の、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体、イムノコンジュゲート、二重特異性分子、または組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮癌／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、腎癌、尿路上皮癌、多型神経膠芽腫、またはウイルス関連癌である。他の実施形態では、癌は、子宮頸癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、膵臓癌、非小細胞肺癌－腺癌型（ＮＳＣＬＣ－ＡＤ）、非小細胞肺癌－扁平上皮細胞型（ＮＳＣＬＣ－ＳＱＣ）、胃癌、黒色腫、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、尿路上皮癌（ＵＣＣ）、乳癌、小細胞肺癌、多型神経膠芽腫、前立腺癌（前立腺もしくはＰＲＣの腺癌としても知られる）、または非ホジキンリンパ腫である。
他の実施形態では、方法は、ヒト対象に、１つまたは複数のさらなる治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のさらなる治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、および／または免疫療法剤である。他の実施形態では、１つまたは複数のさらなる治療剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブであり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリルマブ（ipililumab）である。
別の態様では、本発明は、ヒト対象における免疫応答を刺激する方法であって、ヒト対象に、有効量の、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体、二重特異性分子、または組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、腫瘍を有し、抗腫瘍免疫応答が、刺激される。他の実施形態では、ヒト対象は、慢性ウイルス感染症を有し、抗ウイルス免疫応答が、刺激される。
別の態様では、本発明は、サンプル中のＮＫＧ２Ａタンパク質の存在を検出する方法であって、サンプルを、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合断片と、抗体またはその抗原結合断片とＮＫＧ２Ａタンパク質との間の複合体の形成を可能にする条件下において接触させることと、複合体の形成を検出することとを含む、方法を提供する。方法のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも１５倍迅速に、ＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成する。
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるが、これらは制限と解釈されてはならない。本願を通じて引用されているすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋおよびその他の配列エントリー、特許、および公開特許出願の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
図１Ａ～Ｃは、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見および試験するために使用した３つの方法を図示する。図１Ａは、高いレベルで、ハイブリドーマ方法ならびに抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見および開発工程を図示する。図１Ｂは、抗体発見に使用した抗体ライブラリー生成方法を図示する。図１Ｃは、単一Ｂ細胞クローニング（ＳＢＣＣ）方法を図示する。 図１Ａ～Ｃは、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見および試験するために使用した３つの方法を図示する。図１Ａは、高いレベルで、ハイブリドーマ方法ならびに抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見および開発工程を図示する。図１Ｂは、抗体発見に使用した抗体ライブラリー生成方法を図示する。図１Ｃは、単一Ｂ細胞クローニング（ＳＢＣＣ）方法を図示する。 図１Ａ～Ｃは、本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見および試験するために使用した３つの方法を図示する。図１Ａは、高いレベルで、ハイブリドーマ方法ならびに抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見および開発工程を図示する。図１Ｂは、抗体発見に使用した抗体ライブラリー生成方法を図示する。図１Ｃは、単一Ｂ細胞クローニング（ＳＢＣＣ）方法を図示する。 図２は、発見された抗ＮＫＧ２Ａ抗体を最適化するために使用される突然変異スキャン分析を図示する。具体的には、図２は、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の変異体を生成し、そのＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を特徴付けるための工程を示す。この分析により、発明者らが、改善された特性を有する１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の変異体を生成することが可能となり、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体のＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に対する単一アミノ酸置換の作用に関する豊富な情報セットが得られた。図２は、それぞれ、上から下の出現順に、配列番号１８３～１９０を開示している。 図３は、突然変異スキャン分析を使用して生成された、単一アミノ酸置換の配列－活性関係性の解釈を可能にする、例示的なヒートマップである。図３は、配列番号１９１（生殖系列）および配列番号１９２（親）を開示している。 図４は、突然変異スキャン分析を使用して１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ 抗ＮＫＧ２Ａ抗体について分析した、ＣＤＲ位置を示す。図４は、それぞれ、出現順に、配列番号３０、１５、１９２、１１、および１９３を開示している。 図５Ａ～Ｅは、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の突然変異スキャン分析を使用して生成された、ＬＣＤＲ１置換（配列番号１９４および３０、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ａ）、ＬＣＤＲ３置換（配列番号１９５および１５、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｂ）、ＨＣＤＲ１置換（配列番号１９６および１９２、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｃ）、ＨＣＤＲ２置換（配列番号４２および１１、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｄ）、ならびにＨＣＤＲ３置換（配列番号１９３および１９３、それぞれ、生殖系列および親（図５Ｅ）に関するヒートマップである。 図５Ａ～Ｅは、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の突然変異スキャン分析を使用して生成された、ＬＣＤＲ１置換（配列番号１９４および３０、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ａ）、ＬＣＤＲ３置換（配列番号１９５および１５、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｂ）、ＨＣＤＲ１置換（配列番号１９６および１９２、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｃ）、ＨＣＤＲ２置換（配列番号４２および１１、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｄ）、ならびにＨＣＤＲ３置換（配列番号１９３および１９３、それぞれ、生殖系列および親（図５Ｅ）に関するヒートマップである。 図５Ａ～Ｅは、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の突然変異スキャン分析を使用して生成された、ＬＣＤＲ１置換（配列番号１９４および３０、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ａ）、ＬＣＤＲ３置換（配列番号１９５および１５、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｂ）、ＨＣＤＲ１置換（配列番号１９６および１９２、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｃ）、ＨＣＤＲ２置換（配列番号４２および１１、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｄ）、ならびにＨＣＤＲ３置換（配列番号１９３および１９３、それぞれ、生殖系列および親（図５Ｅ）に関するヒートマップである。 図５Ａ～Ｅは、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の突然変異スキャン分析を使用して生成された、ＬＣＤＲ１置換（配列番号１９４および３０、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ａ）、ＬＣＤＲ３置換（配列番号１９５および１５、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｂ）、ＨＣＤＲ１置換（配列番号１９６および１９２、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｃ）、ＨＣＤＲ２置換（配列番号４２および１１、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｄ）、ならびにＨＣＤＲ３置換（配列番号１９３および１９３、それぞれ、生殖系列および親（図５Ｅ）に関するヒートマップである。 図５Ａ～Ｅは、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の突然変異スキャン分析を使用して生成された、ＬＣＤＲ１置換（配列番号１９４および３０、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ａ）、ＬＣＤＲ３置換（配列番号１９５および１５、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｂ）、ＨＣＤＲ１置換（配列番号１９６および１９２、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｃ）、ＨＣＤＲ２置換（配列番号４２および１１、それぞれ、生殖系列および親）（図５Ｄ）、ならびにＨＣＤＲ３置換（配列番号１９３および１９３、それぞれ、生殖系列および親（図５Ｅ）に関するヒートマップである。 図６は、全長ヒトＮＫＧ２Ａ（配列番号１８２）およびヒトＮＫＧ２Ｃ（配列番号３）アミノ酸配列のカノニカル配列のアラインメントを示す。アミノ酸残基のうちの約７６％（２３３個中１７７個のアミノ酸残基）が、保存されており、アミノ酸残基のうちの約６％（２３３個中１４個のアミノ酸残基）が類似であり、アミノ酸残基のうちの約１８％（２３３個中４２個のアミノ酸残基）のみが、ヒトＮＫＧ２ＡとヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との間で異なっている。 図７Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体１３Ｆ３．Ａ４の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６６）およびアミノ酸配列（配列番号１６７、シグナル配列なし）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号２７）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２８）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２９）のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図７Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１６８）およびアミノ酸配列（配列番号１６９）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３０）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号３２）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図７Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体１３Ｆ３．Ａ４の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６６）およびアミノ酸配列（配列番号１６７、シグナル配列なし）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号２７）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２８）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２９）のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図７Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１６８）およびアミノ酸配列（配列番号１６９）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３０）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号３２）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図８Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体２Ｇ６．Ｃ２の成熟ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号５５）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５６）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５７）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図８Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体２Ｇ６．Ｃ２の成熟ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号５８）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号５９）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号６０）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図８Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体２Ｇ６．Ｃ２の成熟ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号５５）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５６）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５７）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図８Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体２Ｇ６．Ｃ２の成熟ＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号５８）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号５９）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号６０）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図９Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体１１Ｈ９．Ａ１の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１７０）およびアミノ酸配列（配列番号１７１）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号４２）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号４３）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図９Ｂは、成熟抗ＮＫＧ２Ａ抗体１１Ｈ９．Ａ１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１７２）およびアミノ酸配列（配列番号１７３）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号４４）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号４５）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４６）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図９Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体１１Ｈ９．Ａ１の成熟重鎖可変（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１７０）およびアミノ酸配列（配列番号１７１）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号４２）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号４３）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図９Ｂは、成熟抗ＮＫＧ２Ａ抗体１１Ｈ９．Ａ１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１７２）およびアミノ酸配列（配列番号１７３）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号４４）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号４５）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４６）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図１０Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体４Ｇ５．Ｄ１の成熟ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７４）およびアミノ酸配列（配列番号１７５）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号６９）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号７０）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号７１）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図１０Ｂは、４Ｇ５．Ｄ１抗体のＶＬのヌクレオチド配列（配列番号１７６）およびアミノ酸配列（配列番号１７７）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７２）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号７３）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号７４）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図１０Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体４Ｇ５．Ｄ１の成熟ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７４）およびアミノ酸配列（配列番号１７５）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号６９）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号７０）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号７１）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図１０Ｂは、４Ｇ５．Ｄ１抗体のＶＬのヌクレオチド配列（配列番号１７６）およびアミノ酸配列（配列番号１７７）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７２）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号７３）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号７４）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図１１Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体１Ｇ５．Ｂ２の成熟ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７８）およびアミノ酸配列（配列番号１７９）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号８３）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号８４）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号８５）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図１１Ｂは、１Ｇ５．Ｂ２抗体のＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１８０）およびアミノ酸配列（配列番号１８１）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８６）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号８７）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号８８）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図１１Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体１Ｇ５．Ｂ２の成熟ＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７８）およびアミノ酸配列（配列番号１７９）を示す。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号８３）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号８４）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号８５）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。図１１Ｂは、１Ｇ５．Ｂ２抗体のＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１８０）およびアミノ酸配列（配列番号１８１）を示す。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８６）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号８７）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号８８）配列のアミノ酸配列は、灰色の枠で示されている。 図１２は、１３Ｆ３．Ａ４抗体において評価したアミノ酸配列傾向を示す。Ｖ、Ｄ、およびＪ生殖系列起源が示されている。１３Ｆ３．Ａ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６７）が、左側に示されており、１３Ｆ３．Ａ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６９）が右側に示されている。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３０）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号３２）配列のアミノ酸配列は、下線で示されている。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号２７）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２８）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２９）配列のアミノ酸配列は、下線で示されている。評価した配列傾向は、丸で示し、ラベルが付けられている。 図１３は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体ＮＫＧ２Ａ．９の全長アミノ酸配列を示す。軽鎖アミノ酸配列は、配列番号５に示されており、重鎖アミノ酸配列は、配列番号１６３に示されている（別の実施形態では不在である末端リシンを有して示されている）。図１３は、ＮＫＧ２Ａ．９配列を得るために１３Ｆ３．Ａ４のＶＬ配列（Ｎ３０Ｓ）およびＶＨ配列（Ｉ１０７Ｔ）に対して行われた楕円で示した２つの突然変異を特定する。Ｎ－グリコシル化モチーフは、破線の楕円で示されている。Ｆｃ領域に行われた３つの突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２７３Ａ）は、太字の斜体で示されている。重鎖配列の末端アミノ酸リシンは、成熟配列から除去した。ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１４）、およびＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１５）配列のアミノ酸配列は、太字かつ下線で示されている。ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１１）、およびＶＨ ＣＤＲ３（配列番号１２）配列のアミノ酸配列は、太字かつ下線で示されている。 図１４は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体ＮＫＧ２Ａ．９の全長アミノ酸配列を示す。軽鎖アミノ酸配列は、配列番号５に示されており、重鎖アミノ酸配列は、配列番号７に示されている。 図１５は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体ＮＫＧ２Ａ．１１の全長アミノ酸配列を示す。軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１９に示されており、重鎖アミノ酸配列は、配列番号７に示されている。 図１６は、単一Ｂ細胞クローニング方法（ＳＢＣＣ）によって生成された例示的な抗体のエピトープビニングの結果の円形プロットを示し、これらの抗体の多様性を示す。互いに交差遮断する抗体は、線で繋がれている。ベンチマーク抗体（１３Ｆ３．Ａ４、Ｚ２７０、ＲＤ－ａｈＮＫＧ２ａ（クローン１３１４１１、カタログ番号ＭＡＢ１０５９）、およびＲＤ－ａｈＣＤ９４（クローン１３１４１２、カタログ番号ＭＡＢ１０５８））と比較して類似の遮断プロファイルを有するサンプル抗体を、群１～４、６～７、および９に一緒にグループ分けする。サンプル抗体と類似の遮断プロファイルを有するベンチマーク抗体も、群５、８、および１０に一緒にグループ分けする。 図１７Ａは、ＳＢＣＣ方法を使用して生成された抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する能力を評価するためのアッセイ方法を示す。図１７Ｂは、サンプル抗体が、陽性対照（ＮＫＧ２Ａ．９抗体）および陰性対照（アイソタイプ）と比較して、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を部分的にしか遮断しなかったかまたは遮断しなかったことを示す。 図１７Ａは、ＳＢＣＣ方法を使用して生成された抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する能力を評価するためのアッセイ方法を示す。図１７Ｂは、サンプル抗体が、陽性対照（ＮＫＧ２Ａ．９抗体）および陰性対照（アイソタイプ）と比較して、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を部分的にしか遮断しなかったかまたは遮断しなかったことを示す。 図１８Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫ２ＧＡ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｃ）との結合を評価するための結合アッセイ方法（図１８Ａ）を示す。図１８Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。図１８Ｄ～Ｆは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｅ）およびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｆ）の遮断を評価するために使用した遮断アッセイ方法（図１８Ｄ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し（図１８Ｅに示される）、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆに示される）。 図１８Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫ２ＧＡ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｃ）との結合を評価するための結合アッセイ方法（図１８Ａ）を示す。図１８Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。図１８Ｄ～Ｆは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｅ）およびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｆ）の遮断を評価するために使用した遮断アッセイ方法（図１８Ｄ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し（図１８Ｅに示される）、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆに示される）。 図１８Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫ２ＧＡ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｃ）との結合を評価するための結合アッセイ方法（図１８Ａ）を示す。図１８Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。図１８Ｄ～Ｆは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｅ）およびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｆ）の遮断を評価するために使用した遮断アッセイ方法（図１８Ｄ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し（図１８Ｅに示される）、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆに示される）。 図１８Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫ２ＧＡ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｃ）との結合を評価するための結合アッセイ方法（図１８Ａ）を示す。図１８Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。図１８Ｄ～Ｆは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｅ）およびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｆ）の遮断を評価するために使用した遮断アッセイ方法（図１８Ｄ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し（図１８Ｅに示される）、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆに示される）。 図１８Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫ２ＧＡ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｃ）との結合を評価するための結合アッセイ方法（図１８Ａ）を示す。図１８Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。図１８Ｄ～Ｆは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｅ）およびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｆ）の遮断を評価するために使用した遮断アッセイ方法（図１８Ｄ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し（図１８Ｅに示される）、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆに示される）。 図１８Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫ２ＧＡ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞（図１８Ｃ）との結合を評価するための結合アッセイ方法（図１８Ａ）を示す。図１８Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。図１８Ｄ～Ｆは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｅ）およびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用（図１８Ｆ）の遮断を評価するために使用した遮断アッセイ方法（図１８Ｄ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し（図１８Ｅに示される）、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆに示される）。 図１９Ａ～Ｂは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図１９Ａ）、これにより、ヒトＮＫＧ２Ａ＋ ナチュラルキラー細胞株（ＮＫＬ）と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（図１９Ｂに示される）。図１９Ｃ～Ｄは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図１９Ｃ）、これにより、図１９Ｄに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞との結合を遮断したことが示された。 図１９Ａ～Ｂは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図１９Ａ）、これにより、ヒトＮＫＧ２Ａ＋ ナチュラルキラー細胞株（ＮＫＬ）と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（図１９Ｂに示される）。図１９Ｃ～Ｄは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図１９Ｃ）、これにより、図１９Ｄに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞との結合を遮断したことが示された。 図１９Ａ～Ｂは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図１９Ａ）、これにより、ヒトＮＫＧ２Ａ＋ ナチュラルキラー細胞株（ＮＫＬ）と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（図１９Ｂに示される）。図１９Ｃ～Ｄは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図１９Ｃ）、これにより、図１９Ｄに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞との結合を遮断したことが示された。 図１９Ａ～Ｂは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図１９Ａ）、これにより、ヒトＮＫＧ２Ａ＋ ナチュラルキラー細胞株（ＮＫＬ）と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（図１９Ｂに示される）。図１９Ｃ～Ｄは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図１９Ｃ）、これにより、図１９Ｄに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞との結合を遮断したことが示された。 図２０Ａ～Ｃは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図２０Ａ）、これにより、図２０Ｂ～Ｃに示されるように、試験した抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体が、ｈＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞におけるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断したことが示された。 図２０Ａ～Ｃは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図２０Ａ）、これにより、図２０Ｂ～Ｃに示されるように、試験した抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体が、ｈＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞におけるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断したことが示された。 図２０Ａ～Ｃは、使用した遮断アッセイ方法を図示し（図２０Ａ）、これにより、図２０Ｂ～Ｃに示されるように、試験した抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体が、ｈＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞におけるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断したことが示された。 図２１Ａ～Ｃは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図２１Ａ）、これにより、図２１Ｂ～Ｃに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合したことが示された。 図２１Ａ～Ｃは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図２１Ａ）、これにより、図２１Ｂ～Ｃに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合したことが示された。 図２１Ａ～Ｃは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図２１Ａ）、これにより、図２１Ｂ～Ｃに示されるように、試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合したことが示された。 図２２Ａ～Ｃは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図２２Ａ）、これにより、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（結果は、図２２Ｂ～Ｃに示される）。 図２２Ａ～Ｃは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図２２Ａ）、これにより、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（結果は、図２２Ｂ～Ｃに示される）。 図２２Ａ～Ｃは、使用した結合アッセイ方法を図示し（図２２Ａ）、これにより、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した（結果は、図２２Ｂ～Ｃに示される）。 図２３Ａ～Ｂは、望ましいことにＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｂ）を評価するために使用した遮断アッセイ方法を図示する（図２３Ａ）。図２３Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｄ）を示した、使用した結合アッセイ方法（図２３Ｃ）を示す。 図２３Ａ～Ｂは、望ましいことにＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｂ）を評価するために使用した遮断アッセイ方法を図示する（図２３Ａ）。図２３Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｄ）を示した、使用した結合アッセイ方法（図２３Ｃ）を示す。 図２３Ａ～Ｂは、望ましいことにＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｂ）を評価するために使用した遮断アッセイ方法を図示する（図２３Ａ）。図２３Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｄ）を示した、使用した結合アッセイ方法（図２３Ｃ）を示す。 図２３Ａ～Ｂは、望ましいことにＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｂ）を評価するために使用した遮断アッセイ方法を図示する（図２３Ａ）。図２３Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力（図２３Ｄ）を示した、使用した結合アッセイ方法（図２３Ｃ）を示す。 図２４Ａ～Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体がカニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ＮＫＬと結合するかどうか（図２４Ｂ）を評価するために使用した結合アッセイ方法（図２４Ａ）を示す。図２４Ｂに示されるように、１１Ｈ９．Ａ１および４Ｇ５．Ｄ１抗体は、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞と結合しなかったが、１３Ｆ３．Ａ４抗体は、０．２ｎＭのＥＣ５０によって示されるように、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞と望ましく結合した。 図２４Ａ～Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体がカニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ＮＫＬと結合するかどうか（図２４Ｂ）を評価するために使用した結合アッセイ方法（図２４Ａ）を示す。図２４Ｂに示されるように、１１Ｈ９．Ａ１および４Ｇ５．Ｄ１抗体は、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞と結合しなかったが、１３Ｆ３．Ａ４抗体は、０．２ｎＭのＥＣ５０によって示されるように、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞と望ましく結合した。 図２５Ａは、抗ＮＫＧＡ抗体がＮＫ細胞脱顆粒化を増大したかどうかを評価するために使用したインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法を図示する。図２５Ｂ～Ｃは、フローサイトメトリー分析結果のグラフであり、すべての試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、２Ｇ６．Ｃ２、および４Ｇ５．Ｄ１抗体）が、ＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞において、ＮＫ細胞脱顆粒化（アイソタイプ対照と比較したＣＤ１０７ａ ％の倍率変化によって測定される）を増強したことを示す。２５Ｅ７．Ｇ８クローン（図２５Ｂに示される）は、陰性対照として使用した非遮断抗体である。 図２５Ａは、抗ＮＫＧＡ抗体がＮＫ細胞脱顆粒化を増大したかどうかを評価するために使用したインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法を図示する。図２５Ｂ～Ｃは、フローサイトメトリー分析結果のグラフであり、すべての試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、２Ｇ６．Ｃ２、および４Ｇ５．Ｄ１抗体）が、ＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞において、ＮＫ細胞脱顆粒化（アイソタイプ対照と比較したＣＤ１０７ａ ％の倍率変化によって測定される）を増強したことを示す。２５Ｅ７．Ｇ８クローン（図２５Ｂに示される）は、陰性対照として使用した非遮断抗体である。 図２５Ａは、抗ＮＫＧＡ抗体がＮＫ細胞脱顆粒化を増大したかどうかを評価するために使用したインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法を図示する。図２５Ｂ～Ｃは、フローサイトメトリー分析結果のグラフであり、すべての試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、２Ｇ６．Ｃ２、および４Ｇ５．Ｄ１抗体）が、ＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞において、ＮＫ細胞脱顆粒化（アイソタイプ対照と比較したＣＤ１０７ａ ％の倍率変化によって測定される）を増強したことを示す。２５Ｅ７．Ｇ８クローン（図２５Ｂに示される）は、陰性対照として使用した非遮断抗体である。 図２６Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、活性化されたＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断し、ＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示す、ＮＫＬ細胞およびＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅを使用したインビトロ実験を図示する。図２６Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および４Ｇ５．Ｄ１抗体が、アイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１．３抗体）と比較して、ＩＦＮ－γ産生を望ましく増大させたことを示す。２５Ｅ７．Ｇ８クローンは、陰性対照として使用した。 図２６Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、活性化されたＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断し、ＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示す、ＮＫＬ細胞およびＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅを使用したインビトロ実験を図示する。図２６Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および４Ｇ５．Ｄ１抗体が、アイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１．３抗体）と比較して、ＩＦＮ－γ産生を望ましく増大させたことを示す。２５Ｅ７．Ｇ８クローンは、陰性対照として使用した。 図２７Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、膵臓癌細胞株であるＨｓ７６６Ｔ標的細胞において、増大したＩＦＮγであるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強させたかどうかを評価するために使用したインビトロ実験を図示する。図２７Ｂは、アッセイ結果の図による表示であり、１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体が、アイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示した。２５Ｅ７．Ｇ８クローンは、陰性対照として使用した。 図２７Ａは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、膵臓癌細胞株であるＨｓ７６６Ｔ標的細胞において、増大したＩＦＮγであるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強させたかどうかを評価するために使用したインビトロ実験を図示する。図２７Ｂは、アッセイ結果の図による表示であり、１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体が、アイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示した。２５Ｅ７．Ｇ８クローンは、陰性対照として使用した。 図２８Ａ～Ｂは、それぞれＮＫＧ２Ａ．９抗体（図２８Ａ）および１３Ｆ３．Ａ４抗体（図２８Ｂ）との相互作用時のｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４の示差的水素－重水素交換（ＨＤＸ）分析の結果を示す。エピトープ配列は、図２８Ａ～Ｂにおいて標識されている（配列番号１１９～１２２、分析に沿って左から右に開示される）。 図２８Ａ～Ｂは、それぞれＮＫＧ２Ａ．９抗体（図２８Ａ）および１３Ｆ３．Ａ４抗体（図２８Ｂ）との相互作用時のｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４の示差的水素－重水素交換（ＨＤＸ）分析の結果を示す。エピトープ配列は、図２８Ａ～Ｂにおいて標識されている（配列番号１１９～１２２、分析に沿って左から右に開示される）。 図２９Ａ～Ｂは、４つの残基（Ｍ１６３、Ｆ１７９、Ｈ１８４、Ｌ２０６）に関して、それぞれ、ＮＫＧ２Ａ．９抗体（図２９Ａ）および１３Ｆ３．Ａ４抗体（図２９Ｂ）との相互作用時のｈＮＫＧ２ＡにおけるＦＰＯＰ保護パーセンテージを示す。 図２９Ａ～Ｂは、４つの残基（Ｍ１６３、Ｆ１７９、Ｈ１８４、Ｌ２０６）に関して、それぞれ、ＮＫＧ２Ａ．９抗体（図２９Ａ）および１３Ｆ３．Ａ４抗体（図２９Ｂ）との相互作用時のｈＮＫＧ２ＡにおけるＦＰＯＰ保護パーセンテージを示す。 図３０は、ＨＤＸ－ＭＳおよびＦＰＯＰによって判定された、ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４配列（配列番号１２５）にマッピングされた、ＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４抗体のエピトープを示す。太字の下線で示されるエピトープは、ＨＤＸ－ＭＳによって判定され、丸で囲んだエピトープは、ＦＰＯＰ分析によって判定された。 図３１は、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４／ＨＬＡ－Ｅ結晶構造で可視化された、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の（例えば、ＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４抗体の）エピトープを示す。抗ＮＫＧ２Ａ抗体エピトープは、黒色で示されている。 図３２Ａ～Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体（１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１）の特定の部分のＶＨ領域（上から下の出現順に、それぞれ配列番号１６７、８、および８）のアラインメント（図３２Ａ）、ならびにＶＬ領域（配列番号１６９、９、および１６４、上から下の出現順に）のアラインメント（図３２Ｂ）を示す。このアラインメントは、枠内に示されるコンセンサスＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見をもたらした。 図３２Ａ～Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体（１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１）の特定の部分のＶＨ領域（上から下の出現順に、それぞれ配列番号１６７、８、および８）のアラインメント（図３２Ａ）、ならびにＶＬ領域（配列番号１６９、９、および１６４、上から下の出現順に）のアラインメント（図３２Ｂ）を示す。このアラインメントは、枠内に示されるコンセンサスＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見をもたらした。 図３３は、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、アイソタイプと比較して、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅによって刺激されるＮＫＧ２Ａ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＮＫ－κＢシグナル伝達の阻害を逆転させたアッセイ結果を示す。 図３４Ａは、健常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ誘導に対するＮＫＧ２Ａ．９および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の作用を、単独または組合せのいずれかで分析するために使用した実験方法を図示する。図３４Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組合せが、用量依存的様式で、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を増強させた、この方法の結果を示す。 図３４Ａは、健常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ誘導に対するＮＫＧ２Ａ．９および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の作用を、単独または組合せのいずれかで分析するために使用した実験方法を図示する。図３４Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組合せが、用量依存的様式で、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を増強させた、この方法の結果を示す。 図３５Ａ～Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１とともに共培養したヒト腫瘍から単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞においてＩＦＮ－γ産生を増強させたこと（図３５Ｂ）を示すために使用したアッセイ方法（図３５Ａ）を図示する。 図３５Ａ～Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１とともに共培養したヒト腫瘍から単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞においてＩＦＮ－γ産生を増強させたこと（図３５Ｂ）を示すために使用したアッセイ方法（図３５Ａ）を図示する。 図３６Ａは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合した後に内部移行されたことを示すグラフである。図３６Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の結合動態を示すグラフであり、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、０．５ｎＭのＥＣ５０で、用量依存的様式で内部移行されたことを示す。 図３６Ａは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合した後に内部移行されたことを示すグラフである。図３６Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の結合動態を示すグラフであり、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、０．５ｎＭのＥＣ５０で、用量依存的様式で内部移行されたことを示す。 図３７Ａ～Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ１０７ａ発現％によって測定される場合、アイソタイプと比較して、用量依存的様式でＮＫ細胞脱顆粒化を増大させたことを示すために使用した方法（図３７Ａ）を図示する。図３７Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、アイソタイプと比較して、用量依存的様式で、ＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解を増大させたこと（図３７Ｄ）を示した使用した実験方法（図３７Ｃ）を図示する。 図３７Ａ～Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ１０７ａ発現％によって測定される場合、アイソタイプと比較して、用量依存的様式でＮＫ細胞脱顆粒化を増大させたことを示すために使用した方法（図３７Ａ）を図示する。図３７Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、アイソタイプと比較して、用量依存的様式で、ＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解を増大させたこと（図３７Ｄ）を示した使用した実験方法（図３７Ｃ）を図示する。 図３７Ａ～Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ１０７ａ発現％によって測定される場合、アイソタイプと比較して、用量依存的様式でＮＫ細胞脱顆粒化を増大させたことを示すために使用した方法（図３７Ａ）を図示する。図３７Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、アイソタイプと比較して、用量依存的様式で、ＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解を増大させたこと（図３７Ｄ）を示した使用した実験方法（図３７Ｃ）を図示する。 図３７Ａ～Ｂは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ１０７ａ発現％によって測定される場合、アイソタイプと比較して、用量依存的様式でＮＫ細胞脱顆粒化を増大させたことを示すために使用した方法（図３７Ａ）を図示する。図３７Ｃ～Ｄは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、アイソタイプと比較して、用量依存的様式で、ＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解を増大させたこと（図３７Ｄ）を示した使用した実験方法（図３７Ｃ）を図示する。 図３８Ａは、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅとともに共培養したＮＫＬにおけるＩＦＮ－γ産生に対する１３Ｆ３．Ａ４抗体の作用を測定するために使用した方法を図示する。図３８Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４抗体が、アイソタイプと比較して、ＮＫＬにおけるＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示す。 図３８Ａは、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅとともに共培養したＮＫＬにおけるＩＦＮ－γ産生に対する１３Ｆ３．Ａ４抗体の作用を測定するために使用した方法を図示する。図３８Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４抗体が、アイソタイプと比較して、ＮＫＬにおけるＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示す。 図３９は、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．３）を、単剤療法として投与し、結腸癌腫瘍モデルにおいて、腫瘍成長が阻害され、平均腫瘍体積にそれぞれ４８％、５６％、および３０％の低減があった、用量滴定研究の結果を示す。０．３ｍｇ／ｋｇの用量では有効性は観察されなかった。 図４０Ａ～Ｅは、抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＰＤ－１抗体が、マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減させたインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究の結果を示し、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単剤療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤活性を示した。図４０Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４０Ａ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独（図４０Ｂ）、抗ｍＰＤ－１抗体単独（図４０Ｃ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ１抗体の組合せ（図４０Ｄ）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４０Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独、抗ｍＰＤ－１抗体単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ－１抗体の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４０Ａ～Ｅは、抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＰＤ－１抗体が、マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減させたインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究の結果を示し、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単剤療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤活性を示した。図４０Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４０Ａ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独（図４０Ｂ）、抗ｍＰＤ－１抗体単独（図４０Ｃ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ１抗体の組合せ（図４０Ｄ）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４０Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独、抗ｍＰＤ－１抗体単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ－１抗体の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４０Ａ～Ｅは、抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＰＤ－１抗体が、マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減させたインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究の結果を示し、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単剤療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤活性を示した。図４０Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４０Ａ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独（図４０Ｂ）、抗ｍＰＤ－１抗体単独（図４０Ｃ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ１抗体の組合せ（図４０Ｄ）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４０Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独、抗ｍＰＤ－１抗体単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ－１抗体の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４０Ａ～Ｅは、抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＰＤ－１抗体が、マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減させたインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究の結果を示し、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単剤療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤活性を示した。図４０Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４０Ａ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独（図４０Ｂ）、抗ｍＰＤ－１抗体単独（図４０Ｃ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ１抗体の組合せ（図４０Ｄ）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４０Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独、抗ｍＰＤ－１抗体単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ－１抗体の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４０Ａ～Ｅは、抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＰＤ－１抗体が、マウスモデルにおいて腫瘍成長を低減させたインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究の結果を示し、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単剤療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤活性を示した。図４０Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４０Ａ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独（図４０Ｂ）、抗ｍＰＤ－１抗体単独（図４０Ｃ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ１抗体の組合せ（図４０Ｄ）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４０Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独、抗ｍＰＤ－１抗体単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ－１抗体の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４１Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＰＤ－１抗体が、マウス結腸癌モデルにおいて、ＮＫ（図４１Ａ）および腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞毒性およびＩＦＮ－γを増大させたこと（図４１Ｂ～Ｃ）インビボ研究の結果を示すグラフである。 図４１Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＰＤ－１抗体が、マウス結腸癌モデルにおいて、ＮＫ（図４１Ａ）および腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞毒性およびＩＦＮ－γを増大させたこと（図４１Ｂ～Ｃ）インビボ研究の結果を示すグラフである。 図４１Ａ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＰＤ－１抗体が、マウス結腸癌モデルにおいて、ＮＫ（図４１Ａ）および腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞細胞毒性およびＩＦＮ－γを増大させたこと（図４１Ｂ～Ｃ）インビボ研究の結果を示すグラフである。 図４２Ａ～Ｅは、１９５６マウス肉腫モデルにおける単独または組合せのいずれかでの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍活性を示す。図４２Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４２Ａ）、抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（図４２Ｂ、ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（図４２Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せ（図４２Ｄ）で処置したマウスにおける腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４２Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＣＴＬＡ－４単独、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４２Ａ～Ｅは、１９５６マウス肉腫モデルにおける単独または組合せのいずれかでの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍活性を示す。図４２Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４２Ａ）、抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（図４２Ｂ、ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（図４２Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せ（図４２Ｄ）で処置したマウスにおける腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４２Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＣＴＬＡ－４単独、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４２Ａ～Ｅは、１９５６マウス肉腫モデルにおける単独または組合せのいずれかでの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍活性を示す。図４２Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４２Ａ）、抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（図４２Ｂ、ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（図４２Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せ（図４２Ｄ）で処置したマウスにおける腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４２Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＣＴＬＡ－４単独、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４２Ａ～Ｅは、１９５６マウス肉腫モデルにおける単独または組合せのいずれかでの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍活性を示す。図４２Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４２Ａ）、抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（図４２Ｂ、ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（図４２Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せ（図４２Ｄ）で処置したマウスにおける腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４２Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＣＴＬＡ－４単独、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４２Ａ～Ｅは、１９５６マウス肉腫モデルにおける単独または組合せのいずれかでの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍活性を示す。図４２Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４２Ａ）、抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（図４２Ｂ、ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（図４２Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せ（図４２Ｄ）で処置したマウスにおける腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４２Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＣＴＬＡ－４単独、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。 図４３は、マウスリンパ腫モデルにおける抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＰＤ－１抗体、および抗ＬＡＧ３抗体、ならびにこれらの組合せの抗腫瘍活性を示す。抗ＮＫＧ２Ａ抗体を単独で投与することには、生存率１０％で生存利益があった。抗ＮＫＧ２Ａ抗体と抗ｍＰＤ－１抗体または抗ｍＬＡＧ－３抗体のいずれかとの併用療法は、それぞれ、生存率を５０％および７０％延長した。抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体、抗ｍＰＤ－１抗体、および抗ｍＬＡＧ－３抗体の三重の組合せは、生存率８０％で最大の利益をもたらした。 図４４は、マウスＣＴ２６結腸癌モデルにおける抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体での処置の後に、ＮＫＧ２Ａ発現レベルが、脾臓および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の両方のＮＫ細胞において、アイソタイプと比較して低減されたことを示す。 図４５は、異なる腫瘍型における免疫組織化学によって評価されるＮＫＧ２Ａ発現の結果を示す。 図４６は、複数の腫瘍におけるＦＩＴＣコンジュゲートＮＫＧ２Ａ．６抗体の結合プロファイルを示す。 図４７は、免疫組織化学によって評価される、７つの異なる腫瘍型におけるＨＬＡ－Ｅ発現の結果を示す。 図４８は、免疫組織化学によって評価される、異なる腫瘍型におけるＨＬＡ－Ｅ発現の代表的な画像を示す。 図４９Ａ～Ｂは、健常対照患者および癌患者にわたる可溶性ＨＬＡ－Ｅレベルのレベルを示す。 図４９Ａ～Ｂは、健常対照患者および癌患者にわたる可溶性ＨＬＡ－Ｅレベルのレベルを示す。 図５０は、患者選択工程および本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体との併用療法を含む、本明細書において論じられる抗ＮＫＧ２Ａ抗体の臨床開発計画を示す。 図５１Ａ～Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって判定される、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の動態および結合親和性を示すグラフである。 図５２Ａ～Ｂは、スキャッチャード解析によって測定される、ＮＫＧ２Ａ．９の動態および結合親和性を示す。 図５２Ａ～Ｂは、スキャッチャード解析によって測定される、ＮＫＧ２Ａ．９の動態および結合親和性を示す。 図５３は、Ｐ１－０６９３６６をＮＫＧ２Ａ．９およびアイソタイプと比較した、ＮＫ脱顆粒化アッセイの結果を示す。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫ脱顆粒化アッセイにおいて機能性を示したが、Ｐ１－０６９３６６抗体は示さなかった。 図５４Ａ～Ｃは、望ましくない結合クラスターに関してインシリコＨＬＡ結合ツールを使用して１３Ｆ３．Ａ４抗体を分析した結果を示す。図５４Ａ～Ｃは、上から下の出現順に、それぞれ、配列番号１９７～２０４を開示している。 図５４Ａ～Ｃは、望ましくない結合クラスターに関してインシリコＨＬＡ結合ツールを使用して１３Ｆ３．Ａ４抗体を分析した結果を示す。図５４Ａ～Ｃは、上から下の出現順に、それぞれ、配列番号１９７～２０４を開示している。 図５５は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、特に、ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体の低い免疫原性リスクを示すインビトロＤＣ：Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示す。 図５６Ａ～Ｄは、単一サイクル動態（図５６Ａおよび５６Ｃ）ならびに多重サイクル動態（図５６Ｂおよび５６Ｄ）の両方を使用してＢｉａｃｏｒｅによって判定される、３７℃におけるＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４ヘテロ二量体（図５６Ａ～Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４ヘテロ二量体（図５６Ｃ～Ｄ）との結合親和性を示す。ＳＰＲ応答は、検体の結合および解離の関数として示されている。 図５７は、免疫組織化学によって評価される、１６個の異なる腫瘍型にわたる総ＨＬＡ－Ｅ陽性スコアの箱ひげ図を示す。総ＨＬＡ－Ｅスコアは、腫瘍細胞における細胞質および／または膜ＨＬＡ－Ｅ陽性率を組み合わせたパーセントとして定義される。
いくつかの態様では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａ（「ｈＮＫＧ２Ａ」）と特異的に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激するアンタゴニスト活性を有する、単離された抗体、例えば、モノクローナル抗体、例えば、ヒト化、ヒト、およびキメラモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、特定の構造特徴、例えば、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を含む。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合について、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体と競合するか、またはそれと同一もしくは類似のエピトープと結合する。
いくつかの態様では、本発明は、そのような抗ＮＫＧ２Ａ抗体、そのような抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片を含むイムノコンジュゲート、および二重特異性分子、ならびに抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片を含んで製剤化される医薬組成物を作製する方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、単独で、またはその他の薬剤、例えば、その他の免疫－腫瘍学薬剤（例えば、抗体）、化学療法、放射線療法、および／もしくは外科手術と組み合わせてのいずれかで使用して、免疫応答を増強する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、癌および／または感染症を安全かつ効果的に治療するためを含め、様々な状態を治療するために使用される。
免疫系の重要な役割は、正常な細胞と「外来」細胞との間の区別を行うその能力である。免疫系は、したがって、外来細胞を攻撃し、正常細胞のみを残すことができる。腫瘍は、宿主によって外来物として認識される抗原を発現する。免疫系は、免疫応答を開始するために活性化または不活性化される必要がある特定の免疫細胞上の分子である「チェックポイント」を使用する。腫瘍細胞は、これらのチェックポイントを使用して、免疫系によって攻撃されることを回避することが可能な場合がある。一部の免疫－腫瘍学薬は、チェックポイント阻害剤として作用することによって、これらのチェックポイントを標的とする。プログラム死タンパク質１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃することを防止するための制動として作用する、チェックポイント阻害剤である。ＰＤ－１は、一部の正常（および癌）細胞上のタンパク質であるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合した場合に、これを行う。ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１と結合すると、この相互作用は、Ｔ細胞に、他の細胞を攻撃しないようにシグナルを送る。一部の癌細胞は、大量のＰＤ－Ｌ１を有しており、これが、癌細胞が免疫攻撃を回避するのを補助している。このＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を標的とするモノクローナル抗体などの治療剤、例えば、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合を遮断して、腫瘍細胞に対する身体の免疫応答を増大させることができる。
ナチュラルキラー細胞阻害性受容体２Ａ群（ＮＫＧ２Ａ）は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫＧ２Ｅも含まれるＮＫＧ２レクチン受容体ファミリーのメンバーである。（Iwaszko and Bogunia-Kubik, Arch Immunol Ther Exp, 59:353-67 (2011)）。ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＮＫＧ２Ｅは、細胞外ドメインのアミノ酸配列に高い相同性を有し、一方で、ＮＫＧ２Ｄは、機能的に異なる種類の受容体である。ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４とヘテロ二量体を形成する。ＮＫＧ２／ＣＤ９４ヘテロ二量体の中で、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４は、阻害性機能を有する唯一の受容体であり、一方でＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ｅ／ＣＤ９４は、活性化受容体である。ＮＫＧ２Ｄもまた、活性化受容体であるが、これは、ＣＤ９４とヘテロ二量体を形成せず、またＮＫＧ２ＤがＨＬＡ－Ｅと結合することもない。ＮＫＧ２／ＣＤ９４受容体は、ヒトにおけるヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）およびマウスにおけるＱａ－１である非古典的主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩ分子を認識する。（Braud et al, Nature, 391:795-99 (1998), Vance et al., J. Exp. Med. 188:1841-48 (1998)。ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４は、ＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４よりも約６倍強い親和性で、ＨＬＡ－Ｅと結合する。同著。ＮＫＧ２Ａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）、エフェクター／メモリーＣＤ８＋ Ｔ、ＮＫＴ、およびガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に発現する。ＮＫＧ２Ａ発現は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合によって、およびＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１を含む特定のサイトカインによる刺激後に誘導されるが、サイトカインがＮＫＧ２Ａ発現を誘導する能力は、ＴＣＲの結合に依存する（Cho, Blood, 118:116-28 (2011）。ＮＫＧ２Ａは、細胞内阻害性シグナルを伝達する２つの免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフ（ＩＴＩＭＳ）を有する。（Kabat et al, J. Immunol, 169:1948-58 (2002)、Le Drean El, Eur. J. Immunol 28:264076 (1998)。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａタンパク質を阻害し、したがって、チェックポイント阻害剤として作用する。
定義
本明細書において説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者によって広く理解されているものと同一の意味を有する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示されている。本明細書において提供される見出しは、全体として本明細書への参照によって理解することができる本開示の様々な態様を制限するものではない。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。
本明細書において、「ＮＫＧ２Ａ」は、ヒトにおいてＮＫＧ２Ａ遺伝子によってコードされる、ナチュラルキラー細胞阻害性受容体２群タンパク質を指す。ＮＫＧ２Ａはまた、例えば、ＣＤ１５９抗原様ファミリーメンバーＡ、ＮＫ細胞受容体Ａ、ＮＫＧ２Ａ活性化ＮＫ受容体、ＮＫＧ２－Ａ／Ｂ活性化ＮＫ受容体、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＣＤ１５９ａ）、およびＮＫＧ２－Ａ／ＮＫＧ２－Ｂ ＩＩ型内在性膜タンパク質としても知られている。
ｍＲＮＡ転写産物の５つの変異体に対応するヒトＮＫＧ２Ａタンパク質の３つのアイソフォームが、特定されている。
変異体１（ヌクレオチド配列は配列番号１または２０９に記載され、アミノ酸配列は配列番号２に記載される）および変異体３（ヌクレオチド配列は配列番号２１２に記載され、アミノ酸配列は配列番号１８２に記載される）に対応するアイソフォーム１は、２３３個のアミノ酸からなり、カノニカルＮＧＫ２Ａ配列を表す。アイソフォーム１変異体３はまた、残基２９におけるアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に変更された、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、すなわち、Ｎ２９Ｓである天然に存在する変異体でもある（配列番号１８２）。
変異体２（ヌクレオチド配列は配列番号２１０に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０６に記載される）および変異体４（ヌクレオチド配列は配列番号２１１に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０７に記載される）に対応するアイソフォーム２は、それぞれ、変異体１および変異体３と比較して、インフレームコーディングエクソンが欠如し、残基９６～１１３が不在となっており、ＮＫＧ２ＡアイソフォームＮＫＧ２－Ｂとも称される。変異体４は、Ｎ２９Ｓ ＳＮＰを有する。
変異体５（ヌクレオチド配列は配列番号２０８に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０５に記載される）に対応するアイソフォーム３は、２２８個のアミノ酸からなり、５つのＣ末端アミノ酸をコードする残基２２９～２３３が欠如している。この変異体もまた、Ｎ２９Ｓ ＳＮＰを有する。
以下に、公知のヒトＮＧＫ２Ａ変異体のアミノ酸配列を示す。
（１）変異体１：ヒトＮＧＫ２Ａアイソフォーム１（ヌクレオチド配列は配列番号１または２０９（受託番号ＮＭ ００２２５９．５）に記載され、アミノ酸配列は配列番号２（受託番号ＮＰ ００２２５０．２、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ２６７１５－１）に記載される）：
（配列番号２）
（２）変異体２：ヒトＮＧＫ２Ａアイソフォーム２はまた、ＮＫＧ２ＡアイソフォームＮＫＧ２Ｂとも称される（ヌクレオチド配列は配列番号２１０（受託番号ＮＭ ００７３２８．４）に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０６（受託番号ＮＰ ０１５５６７．２、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ２６７１５－２）に記載される）：
（配列番号２０６）
（３）変異体３：ヒトＮＧＫ２Ａアイソフォーム１、太字かつ強調して示されるＮ２９Ｓ ＳＮＰを有する（ヌクレオチド配列は配列番号２１２（受託番号ＮＭ ２１３６５８．２）に記載され、アミノ酸配列は配列番号１８２（受託番号ＮＰ ９９８８２３．１またはＡＡＬ６５２３４．１）に記載される：
（配列番号１８２）
（４）変異体４：ヒトＮＫＧ２Ａアイソフォーム２はまた、変異体４にも対応する（ヌクレオチド配列は配列番号２１１（受託番号ＮＭ＿２１３６５７．２）に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０７（受託番号ＮＰ ９９８８２２．１）に記載される）：
（配列番号２０７）
（５）変異体５：ヒトＮＧＫ２Ａアイソフォーム３はまた、ＮＫＧ２ＡアイソフォームＣとも称される（ヌクレオチド配列は配列番号２０８（受託番号ＮＭ ００１３０４４４８．１）に記載され、アミノ酸配列は配列番号２０５（受託番号ＮＭ ００１２９１３７７．１）に記載される）：
（配列番号２０５）
以下の表は、上述のＤＮＡおよびタンパク質の受託番号および対応する配列番号の概要を提供する。



用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、本明細書において同義的に使用され、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）および重鎖定常領域（本明細書において、ＣＨと略される）からなる。特定の抗体、例えば、天然に存在する抗体では、重鎖定常領域は、ヒンジならびに３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。特定の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（本明細書において、ＣＬと略される）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域と散在している超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および伝統的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）との結合を媒介し得る。重鎖は、Ｃ末端リシンを有してもよく、または有さなくてもよい。本明細書において別途指定されない限り、可変領域のアミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用して番号付けされ、定常領域のアミノ酸は、ＥＵシステムを使用して番号付けされている。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含めた、知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分けられる：ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、多くても２、３個のアミノ酸で互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。「抗体」は、例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体ならびに完全合成抗体を含む。
本明細書において、「ＩｇＧ抗体」は、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有する、すなわち、それは、同じサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同一の数の重鎖および軽鎖ならびにジスルフィド結合を有する。例えば、抗ＮＫＧ２Ａ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）からなり、ここで、これらの２つの重鎖および軽鎖は、それぞれ、天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体において生じるものと同一の数および位置のジスルフィド架橋によって連結されている（抗体が、ジスルフィド結合を修飾するように突然変異されている場合を除く）。
「抗原」は、免疫応答をトリガーし、抗体が結合する、分子または物質である。抗体は、通常、そのコグネイト抗原と、１０－５～１０－１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって反映される高親和性で特異的に結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない。約１０－４Ｍより大きい任意のＫＤは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において、抗原と「特異的に結合する」抗体とは、抗原およびいくつかの事例では実質的に同一の抗原と、１０－６Ｍ以下のＫＤ、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、または１０－８Ｍと１０－１０Ｍ以下との間のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない抗体を指す。抗原は、所与の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合、例えば、所与の抗原の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す場合、所与の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合する抗体は、いくつかの実施形態では、特定の非ヒト霊長類種に由来するＮＫＧ２Ａ抗原（例えば、カニクイザルＮＫＧ２Ａ）とも交差反応するが、その他の種に由来するＮＫＧ２Ａ抗原ともＮＫＧ２Ａ以外の抗原とは交差反応しない。
本明細書において、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、本明細書において同義的に使用され、抗原（例えば、ヒトＮＫＧ２Ａ）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の部分を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片または部分によって実施され得ることが示されている。抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、
（１）Ｆａｂ断片（パパイン切断に由来する断片）またはＶＬ、ＶＨ、ＬＣ、およびＣＨ１ドメインからなる類似の一価断片、
（２）Ｆ（ａｂ’）２断片（ペプシン切断に由来する断片）またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む類似の二価断片、
（３）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、
（４）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、
（５）ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-46）、
（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに
（７）合成リンカーによって接続されていてもよい、２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ
が挙げられる。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域対が、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して接続され得る。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語内に包含される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる結合特異性、例えば、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有し、異なる抗原に対して特異性を有する２つの抗原結合部位を生じさせる人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた種々の方法によって生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照のこと。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団内の個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のある変異体を除き、実質的に類似であり、同一のエピトープと結合し（例えば、抗体は、単一の結合特異性および親和性を示す）、そのような変異体は、一般に、少量で存在している。「モノクローナル」という修飾語は、抗体が、実質的に均質な抗体集団から得られているという特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものではない。用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および適宜定常領域を有する、実質的に均質な抗体集団に由来する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法によって産生される。ハイブリドーマ方法を使用して、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスを、抗原に曝露し、Ｂ細胞として知られている白血球が、抗原と結合する抗体を産生し、それを、トランスジェニック非ヒト動物から回収する。単離されたＢ細胞を、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマと称されるハイブリッド細胞株を産生させる。一実施形態では、ハイブリドーマは、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、（１）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体またはそれから調製されたハイブリドーマである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（２）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（３）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含むが、その後の再編成および例えば、抗体成熟の間に起こる突然変異を含む。当技術分野で公知のように（例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと）、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するよう再編成する種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。可変領域は、再配列に加えて、外来抗原に対する抗体の親和性を増大するよう、複数の単一アミノ酸変更（体細胞突然変異または高頻度突然変異とも呼ばれる）によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応じて変化する（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原に応じた、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再編成され、体細胞突然変異された核酸分子は、元の核酸分子との配列同一性を有さない場合があるが、代わりに、実質的に同一または同様となる（例えば、少なくとも８０％の同一性を有する）。
本明細書において、「ヒト抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異による）を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」はマウスなどの別の非ヒト哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むよう意図されない。本明細書において、用語「ヒト」および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体のＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト抗体に由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト抗体に由来するアミノ酸で置換されているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたはすべてのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入、置換、または修飾は、抗体が特定の抗原と結合することを防止しない限り許容される。「ヒト化抗体」は、元の抗体のものと同様の抗原特異性を保持する。
「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。
本明細書において、「アイソタイプ」とは、抗体の重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ならびにＩｇＥ抗体）を指す。
「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプ群内の天然に存在する変異体を指し、これらの変異体は、２、３個のアミノ酸で異なっている。（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照されたい）。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、任意のアロタイプのものであり得る。本明細書において、「ＩｇＧ１ｆ」、「ＩｇＧ１．１ｆ」、または「ＩｇＧ１．３ｆ」アイソタイプと称される抗体は、それぞれ、アロタイプ「ｆ」のＩｇＧ１、エフェクターレスＩｇＧ１．１、またはエフェクターレスＩｇＧ１．３抗体である。
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、語句「抗原と特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
本明細書において、「単離された抗体」は、他のタンパク質および細胞材料を実質的に含まない抗体を指す。
本明細書において、「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドとの相互作用、またはそれにより生じる生化学的事象を指す。例示的「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能ならびに細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるＦｃ領域を必要とする。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、対立遺伝子変異体およびこれらの受容体の別法としてスプライシングされた形態を含めたＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種の活性化（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１種の阻害性（ＦｃγＲＩＩｂ、または同等にＦｃγＲＩＩＢ）受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の例示的な特性は、当技術分野において公知である。先天性エフェクター細胞種の大部分は、１種または複数の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩｂを同時に発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１種の活性化Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩおよびヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲＩＩｂを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体と結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に関してマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられる。
本明細書において、「Ｆｃ領域」（結晶化可能断片（fragment crystallizable）領域）または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」とは、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体とのまたは伝統的な補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）との結合を含めた、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除いた、抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の定常ドメインに由来する２つの同一なタンパク質断片を含む。ＩｇＭおよびＩｇＥの抗体アイソトープにおいて、Ｆｃ領域は、それぞれのポリペプチド鎖に、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２～４）を含む。ＩｇＧについては、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は、本明細書に定義されるように、多様であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１についてはアミノ酸残基Ｄ２２１から、ＩｇＧ２についてはＶ２２２から、ＩｇＧ３についてはＬ２２１から、ＩｇＧ４についてはＰ２２４から、重鎖のカルボキシ末端までのストレッチと定義され、この番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指数（Kabat, et al., 1991）によるものである。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３７からアミノ酸３４０にわたり、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する、すなわち、ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧのアミノ酸３４１から、アミノ酸４４７または４４６（Ｃ末端リシン残基が不在の場合）または４４５（Ｃ末端グリシンおよびリシン残基が不在の場合）にわたる。本明細書において、Ｆｃ領域は、任意のアロタイプ変異体または変異体Ｆｃ（例えば、天然に存在しないＦｃ）を含めた天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた、単離において、または「Ｆｃ融合タンパク質」（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とも呼ばれる、「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃを含むタンパク質ポリペプチドに関連して、この領域を指し得る。
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃｈ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、例えば、それを同定するために使用される特定の方法によって定義される場合、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ｈＮＫＧ２Ａタンパク質）上の部位を指す。エピトープは、（１）連続アミノ酸（通常、直鎖エピトープ）または（２）タンパク質の三次元フォールディングによって並置された非連続アミノ酸（通常、コンホメーションエピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、必ずではないが、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次元フォールディングから形成されるエピトープは、通常、変性溶媒を用いる処理の際に失われる。エピトープは、通常、独特の空間コンホメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸を含む。
用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識に関与する分子決定基の同定のプロセスを指す。所与の抗体によって結合されるエピトープを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野で周知であり、例えば、タンパク質に由来する（例えば、ＮＫＧ２Ａに由来する）重複ペプチドまたは連続ペプチドが、所与の抗体（例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体）との反応性について試験される、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが挙げられる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法として、当技術分野で公知の技術および本明細書に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶解析、抗原突然変異分析、２次元核磁気共鳴、酵母ディスプレイ、および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）が挙げられる（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）。
２種以上の抗体に関して、用語「同一エピトープと結合する」は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基の同一セグメントと結合することを意味する。本明細書に記載される抗体を用いて、抗体が「ＮＫＧ２Ａ上の同一エピトープ」と結合するか否かを調べる技術として、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析、ＨＤＸ－ＭＳ、およびタンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）などのエピトープマッピング方法が挙げられる。その他の方法は、抗体の抗原断片（例えば、タンパク質分解断片）との、または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、ここでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失が、アラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081）または突然変異体標的配列変異体の酵母ディスプレイなど、エピトープ成分の指標と考えられることが多い。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。これらの方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。同一のＶＨおよびＶＬまたは同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する抗体は、同一エピトープと結合すると予想される。
「標的との結合について別の抗体と競合する」抗体とは、その他の抗体の標的との結合を（部分的にまたは完全に）阻害する抗体を指す。２種の抗体が、標的との結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、その他の抗体の標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するかは、公知の結合競合実験、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用して判定することができる。特定の実施形態では、抗体は、別の抗体の標的との結合と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合する、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」であるか（すなわち、標的とともに最初にインキュベートされるコールド抗体）に応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc. 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施できる。２つの抗体は、一方の抗体が、競合実験において抗原と最初に接触するかまたは他方の抗体が最初に接触するかにかかわらず、互いに、両方の方向で少なくとも５０％遮断する場合に、「交差競合する」。
２つの抗体が、結合について競合または交差競合するかどうかを判定するための競合的結合アッセイには、例えば、フローサイトメトリーによる、ＮＫＧ２Ａを発現するＴ細胞との結合についての競合が含まれる。その他の方法として、ＳＰＲ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照のこと）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照のこと）、固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと）、１－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照のこと）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）、および直接標識化ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）が挙げられる。
本明細書において、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープとの抗体結合を指す。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組換えヒトＮＫＧ２Ａおよびリガンドとして抗体を使用したＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＳＰＲ機器におけるＳＰＲ技術、または抗原陽性細胞との抗体の結合のスキャッチャード解析によって決定される場合に、およそ１０－６Ｍ未満、例えば、およそ１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、または１０－１０Ｍ、またはさらにそれより小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、（２）所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合に対するその親和性よりも、少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原と結合する。したがって、「ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合する」抗体とは、１０－６Ｍ以下、例えば、およそ１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはさらにそれより小さいＫＤで、可溶性または細胞結合型ヒトＮＫＧ２Ａと結合する抗体を指す。「カニクイザルＮＫＧ２Ａと交差反応する」抗体とは、１０－６Ｍ以下、例えば、およそ１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはさらにそれより低いＫＤでカニクイザルＮＫＧ２Ａと結合する抗体を指す。
用語「ｋａ」、「ｋａｓｓｏｃ」、または「ｋｏｎ」は、本明細書において、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指して、同義的に使用される。用語「ｋｄ」、「ｋｄｉｓ」、または「ｋｏｆｆ」は、本明細書において、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指して、同義的に使用される。用語「ＫＤ」は、本明細書において、平衡解離定数を指し、これはｋａに対するｋｄの割合（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定するための利用可能な方法としては、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ならびにフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ＩＣ５０」は、半数阻害濃度を意味し、物質、例えば抗体が、特定の生物学的または生化学的応答を阻害する効力を測定する。換言すると、ＩＣ５０は、効力の尺度として使用され、ＩＣ５０が小さいほど、物質はより強力である。抗体またはその抗原結合断片を使用したインビトロまたはインビボアッセイの文脈において、ＩＣ５０は、最大の生物学的または生化学的応答を５０％低減させる、抗体またはその抗原結合断片の濃度を指す。
用語「ＥＣ５０」は、半数効果濃度を意味し、物質、例えば抗体が、特定の生物学的または生化学的応答を誘導する効力を測定する。ＩＣ５０と同様に、ＥＣ５０は、効力の尺度として使用され、ＥＣ５０が小さいほど、物質はより強力である。抗体またはその抗原結合断片を使用したインビトロまたはインビボアッセイの文脈において、ＥＣ５０は、最大の生物学的または生化学的応答の５０％である応答を誘導する、抗体またはその抗原結合断片の濃度を指す。
本明細書において、「受容体占有率」または「受容体の占有率」は、免疫刺激性受容体（例えば、ヒトＮＫＧ２Ａ）と結合している抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体）の量を指す。「受容体占有率パーセント（％）」または「受容体の占有率パーセント（％）」は、以下の式を使用して計算することができる：（［試験のΔＭＦＩ］／［合計のΔＭＦＩ］）×１００。平均蛍光単位（ΔＭＦＩ）における変化は、アイソタイプ対照抗体を用いたバックグラウンド染色のＭＦＩを、結合した抗体からのＭＦＩから差し引くことによって計算する。総受容体レベルは、飽和量の抗体を添加して、最大発現、したがって、特定の免疫刺激性受容体のＭＦＩを判定することによって、判定される。総受容体発現を計算する代替的な方法は、受容体占有率を計算している抗体と競合しない、同じ免疫刺激性受容体に対する抗体を使用することである。
本明細書において、物質に適用される用語「天然に存在する」は、人間によって意図的に修飾されていない、自然に存在する物質である。例えば、実験室において人によって意図的に修飾されていない、自然界における供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。
「ポリペプチド」とは、少なくとも２個の連続して連結しているアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１個または複数のアミノ酸残基は、それだけには限らないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの修飾を含有し得る。「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドを含む。
用語「核酸分子」とは、本明細書において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい。
用語「ｃＤＮＡ」または「相補的ＤＮＡ」は、ｍＲＮＡから作製または導出された、すなわち、非コード領域が除去された、天然に存在しない核酸分子を指す。
本明細書において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼさないかまたはそれを変化させない、アミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって、本発明の抗体に導入され得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基の、類似の側鎖を有するアミノ酸残基との置換を指す。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体中の予想される非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換される。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Brummel et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと）。
核酸については、用語「実質的な相同性」は、２種の核酸またはその指定された配列は、最適にアラインされ、比較される場合に、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、少なくとも約９０％～９５％、または、ヌクレオチドの少なくとも約９８％～９９．５％において適当なヌクレオチド挿入または欠失を用いて同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、核酸鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。
ポリペプチドについては、用語「実質的な相同性」は、２種のポリペプチドまたはその指定された配列が、最適にアラインされ、比較される場合に、アミノ酸の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％～９５％、または、アミノ酸の少なくとも約９８％～９９．５％において適当なアミノ酸挿入または欠失を用いて同一であることを示す。
２種の配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、相同性パーセント＝（同一位置の数）／（位置の総数）×１００）、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮する。２種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の限定されない例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（CABIOS, 4:11-17 (1989)）を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定できる。さらに、２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。本明細書に記載された核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施できる。本明細書に記載されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長（wordlength）＝３を用いて実施できる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。（例えば、National Center for Biotechnology Information (NCBI)、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/で入手可能を参照されたい）。
核酸は、全細胞、例えば、宿主細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸（例えば、染色体のその他の部分）またはタンパク質から精製された場合に「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。（F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと）。
本明細書において、用語「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すものとする。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターとしては、プラスミドが挙げられる。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのその他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
用語「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、同義的に使用され、細胞中に天然に存在しない核酸を含み、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の後代も指すということは理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって後世において起こり得るので、このような後代は実際、親の細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
「免疫応答」とは、当技術分野において理解される通りであり、一般に、外来作用物質または異常な、例えば、癌性細胞に対する、脊椎動物における生物学的応答を指し、この応答は、これらの作用物質およびそれらによって引き起こされる疾患から脊椎動物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つまたは複数の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、または好中球）およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用によって媒介され、これは、進入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、例えばヒト細胞もしくは組織を含む、正常な細胞もしくは組織の、選択的標的化、それらとの結合、それらの損傷、それらの破壊、および／またはそれらの脊椎動物の身体からの排除をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋ Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞もしくはヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の活性化もしくは阻害、またはＴｒｅｇ細胞の阻害もしくは枯渇を含む。
「エフェクターＴ」（「Ｔｅｆｆ」）細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ならびにヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞である。Ｔｈ細胞は、サイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指向させるが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は含まれない。
制御性Ｔ（「Ｔｒｅｇ」）細胞は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、自己免疫疾患を防止する、Ｔ細胞の部分集団である。メモリーＢ細胞は、一次感染後に胚中心内に形成されるＢ細胞サブタイプであり、再感染した場合に加速されたより強力な抗体媒介免疫応答を発生させるのに重要である（二次免疫応答としても知られている）。
「ナチュラルキラー」（ＮＫ）細胞は、病原体および腫瘍に対する免疫応答の重要な媒介因子であり、先天免疫系の一部である。ＮＫ細胞はまた、獲得免疫応答を制御する役割も有し、異なる状況において、Ｔ細胞応答を刺激または阻害することが示されている。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に対して急速な応答を提供し、腫瘍形成に応答する。
本明細書において、用語「Ｔ細胞媒介性応答」とは、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）によって媒介される応答を指す。Ｔ細胞媒介性応答は、例えば、Ｔ細胞細胞傷害性および増殖を含む。
本明細書において、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞によって誘導される免疫応答を指す。ＣＴＬ応答は、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって媒介される。
「免疫調節物質（immunomodulator）」または「免疫制御物質（immunoregulator）」とは、免疫応答の調節、制御、または修飾に関与し得る作用物質、例えば、シグナル伝達経路の成分を指す。免疫応答の「調節」、「制御」、または「修飾」とは、免疫系の細胞における、またはこのような細胞（例えば、エフェクターＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞）の活性における任意の変更を指す。このような調節は、免疫系の刺激または抑制を含み、種々の細胞型の数の増大もしくは減少、これらの細胞の活性の増大もしくは減少、および／または免疫系内で起こり得る任意のその他の変化によって示され得る。阻害的および刺激的免疫調節物質の両方とも同定されており、その一部は、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。いくつかの実施形態では、免疫調節物質は、Ｔ細胞の表面に位置する。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、作用物質、部分、化合物または分子による結合に対して標的化される免疫調節物質であり、その活性は、物質、作用物質、部分、化合物または分子の結合によって変更される。免疫調節性標的は、例えば、細胞の表面の受容体（「免疫調節性受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節性リガンド」）を含む。
「免疫療法」とは、免疫応答を誘導、増強、抑制またはそうでなければ修飾することを含む方法によって、疾患の再発に苦しむかまたはそれを起こすまたは患うリスクにある対象、例えば、ヒト対象の治療を指す。
「免疫賦活性（immunostimulating）療法」または「免疫賦活性（immunostimulatory）療法」とは、例えば、癌を治療するための、対象における免疫応答の増大（誘導または増強）をもたらす療法を指す。
「内因性免疫応答を増強する」とは、対象、例えば、ヒト対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増大させることを意味する。この有効性および効力の増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって達成され得る。
本明細書において、用語「連結している」とは、２つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合である場合も、非共有結合である場合もある。連結はまた、遺伝的であり（すなわち、組換えによって融合され）得る。このような連結は、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質生産などの様々な当技術分野において認識される技術を使用して達成され得る。
本明細書において、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して、治療剤、例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む組成物の対象への物理的導入を指す。「投与すること」には、例えば、他者、例えば、１人または複数の医療従事者などによるヒト患者への投与、およびヒト患者による自己投与が含まれる。本明細書に記載される抗体の様々な投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、例えば、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸性に、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与することは、例えば、１回、複数回および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって実施され得る。
本明細書において、「補助的」投与または「組合せ」投与（共投与）には、同じかもしくは異なる剤形での化合物の同時投与または化合物の別個の投与（例えば、逐次投与）が含まれる。したがって、第１の抗体、例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、および第２、第３、またはそれ以上の抗体は、単一の製剤において同時に投与することができる。あるいは、第１および第２（またはそれ以上）の抗体は、別個の投与のために製剤化することができ、並行してまたは逐次的に投与される。「併用」療法は、本明細書において、協働様式での２つ以上の治療剤の投与を意味し、同時投薬が含まれるがこれに限定されない。具体的には、併用療法は、共投与（例えば、共製剤の投与または別個の治療用組成物の同時投与）、および連続的または逐次的投与の両方を包含するが、１つの治療剤の投与が、何らかの方法で別の治療剤の投与を左右することを条件とする。例えば、１つの治療剤は、異なる治療剤が投与され所定の期間の作用が許容された後にのみ投与することができる。（例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423を参照されたい）。
例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体がまず投与され、続いて（例えば、直後に続いて）第２の抗体の投与が行われてもよく、またはその逆であってもよい。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第２の抗体の投与の前に投与される。別の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、第２の抗体の約３０分以内に投与される。このような同時投与または逐次投与は、好ましくは、治療される患者に、両方の抗体が同時に存在することをもたらす。
本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」は、同義的に使用され、部分的および完全阻害／遮断の両方を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、本明細書においてさらに記載されるように判定される場合、ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ－Ｅとの結合を、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、本明細書においてさらに記載されるように判定される場合、ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ－Ｅとの結合を、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％阻害する。
本明細書において、「癌」は、身体中での異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患の広い群を指す。未制御細胞成長または分裂は、隣接する組織へ浸潤し、リンパ系または血流によって身体の遠隔部位へ転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
用語「治療する」、「治療すること」および「治療」とは、本明細書において、症状の進行、発生、重症度もしくは再発、合併症、疾病と関連している状態または生化学的兆候を逆転させ、軽減し、寛解し、阻害し、または減速することを目的とした、対象で実施される任意の種類の介入もしくはプロセスまたは対象へ活性薬剤を投与することを指す。対照的に、「予防」または「防止」とは、疾患が発生するのを防ぐための、疾患を有していない対象への投与を指す。本明細書において、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、予防または防止を包含しない。
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止によって証明される疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の「予防的有効量」または「予防的有効投与量」は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、疾患を発生するか、または疾患の再発を患うリスクにある対象に投与される場合に、疾患の発生または再発を防止する薬物の量である。疾患退縮を促進する治療剤の能力または疾患の発生もしくは再発を防止する予防剤の能力は、臨床治験の際にヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、インビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の種々の方法を使用して評価することができる。
本明細書に提供される方法のいずれかによる、抗ＮＫＧ２Ａ抗体単独で、または例えば、抗ＰＤ－１抗体との組合せ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せ、もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体との組合せでの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量の投与は、例えば、腫瘍成長もしくはサイズの低減、経時的に出現する転移病変数の低減、完全寛解、部分寛解、または疾患の安定を含む、少なくとも１つの治療効果をもたらし得る。例えば、治療の方法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与なしで達成されるものよりも、または組み合わせた抗体のうちのいずれか単独の投与で達成されるものよりも良好な、比較臨床有用率（clinical benefit rate）（ＣＢＲ＝完全寛解（ＣＲ）＋部分寛解（ＰＲ）＋疾患の安定（ＳＤ）が６ヶ月以上継続）をもたらし、例えば、臨床有用率の改善が、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上である。
例として、抗癌剤は、ヒト対象を含む対象において、癌進行を減速するか、または癌退縮を促進する薬物である。いくつかの実施形態では、治療上有効な量の薬物は、癌を排除するところまで癌退縮を促進する。「癌退縮を促進すること」とは、有効量の薬物を、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与することが、患者において、腫瘍成長または大きさの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１種の疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止またはそうでなければ疾患症状の寛解をもたらすことを意味する。「薬理学的有効性」、「有効性」、または「効力」とは、薬物が患者において癌退縮を促進する能力を指す。「生理学的安全性」とは、薬物の投与に起因する、容認できるほど低レベルの毒性または細胞、臓器および／または生物レベルでのその他の有害な生理学的効果（有害効果）を指す。
例として、腫瘍の治療に関して、薬物の治療上有効な量または投与量は、未治療の対象と比較して、腫瘍細胞成長を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％超、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。いくつかの実施形態では、薬物の治療上有効な量または投与量は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害し、すなわち、細胞成長または腫瘍成長を１００％阻害する。抗体を含む、化合物の腫瘍成長を阻害する能力は、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価することができ、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍成長の阻害は、治療の直後ではない場合があり、ある期間の後または反復投与後にしか生じない場合がある。本明細書に記載される他の実施形態では、腫瘍退縮が観察され、少なくとも約２０日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、もしくは少なくとも約６０日間、またはそれ以上、継続される。
本明細書において、用語「固定用量」、「一定用量」、および「一定固定用量」は、同義的に使用され、患者の体重または体表面積に関係なく、患者に投与される用量を指す。固定または一定用量は、したがって、ｍｇ／ｋｇ用量ではなく、むしろ治療剤の絶対量として提供される。
本明細書において、用語「体重に基づく」用量または投薬とは、患者に投与される用量が、患者の体重に基づいて計算されることを意味する。例えば、６０ｋｇの患者が、３ｍｇ／ｋｇの抗ＮＫＧ２Ａ抗体を必要とする場合、投与に適切な量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（すなわち、１８０ｍｇ）を計算し、使用することができる。
「患者」という用語には、治療的または予防的処置のいずれかを受けるヒト対象および他の哺乳動物対象が含まれる。
用語「対象」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。例えば、本明細書において開示される方法および組成物は、癌を有する対象を治療するために使用され得る。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリを含む哺乳動物および非哺乳動物、両生類、爬虫類などが含まれる。一実施形態では、対象は、ヒト対象である。
本明細書において、「１つの（a）」または「１つの（an）」実体という用語は、別途示されない限り、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「１つのヌクレオチド配列」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。したがって、「１つの（a）」または「１つの（an）」、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において同義的に使用することができる。
本明細書において、「および／または」は、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれが、互いを伴う場合も伴わない場合もあるという具体的な開示として解釈されるものとする。したがって、用語「および／または」は、「Ａおよび／またはＢ」といった語句において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」単独、ならびに「Ｂ」単独を含む。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」といった語句において使用されるとき、以下：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ単独；Ｂ単独；ならびにＣ単独のそれぞれを包含する。
態様が、「含む（comprising）」という言葉を用いて本明細書に記載されている場合、別途「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載される類似の態様もまた提供されることが理解される。
単位、接頭辞、および記号は、別途示されない限り、国際単位系（ＳＩ）に認められた形式で示される。数値範囲は、その範囲を定める数を含む。別途示されない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に、５’から３’の方向で記述される。アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向で記述される。
本明細書において、用語「約」または「およそ」とは、おおよそ、大体、またはその範囲内を意味する。用語「約」が、数値範囲とともに使用されている場合、この用語は、境界を、記載されている数値の上下に拡大することにより、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、数値を、記述された値の上下、例えば、１０パーセント上または下（高いかまたは低い）に修飾し得る。
本明細書において提供される見出しは、本開示の様々な態様を制限するものではなく、全体として本明細書への参照によって読み取るべきである。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
Ｉ．抗ＮＫＧ２Ａ抗体
本開示は、いくつかの実施形態において、望ましい機能または特性を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体、例えば、完全ヒト、ヒト化、およびキメラ抗体について記載する。例えば、抗体は、高い親和性で、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ媒介性阻害を遮断または逆転させる、アンタゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＮＫＧ２Ａ（抗ｈｕＮＫＧ２Ａ）抗体は、疾患、例えば、癌または感染を治療する際に治療剤として使用するのに望ましい特性を有する。
本明細書に記載される特定の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、本明細書に記載される単離され構造的に特徴付けられている抗体１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．７、ＮＫＧ２Ａ．８、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有する抗体、ならびに本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９９％の同一性）を有する抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の可変領域またはＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９９％の同一性）を有する。
いくつかの態様では、本発明の抗体は、具体的な機能的特徴または特性によって特徴付けられる。例えば、抗体は、高い親和性で、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２ＡのそのリガンドＨＬＡ－Ｅとの結合を阻害し、これにより、ＨＬＡ－Ｅを発現する腫瘍に対するＮＫおよびＴ細胞応答が回復する。換言すると、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａタンパク質とそのリガンドであるＨＬＡ－Ｅとの相互作用を阻害または遮断することによって、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の抗腫瘍応答を刺激する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の特性：
（１）ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合すること、
（２）ＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／もしくは相互作用を遮断もしくは低減すること（他の実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａリガンドの非ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／もしくは相互作用を遮断もしくは低減する）、
（３）ＮＫＧ２Ａに媒介される阻害性シグナル伝達を逆転させること、
（４）ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質と結合しないか、もしくは低い親和性で結合すること、
（５）高い親和性で、ヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａと結合すること、
（６）マウスもしくはラットＮＫＧ２Ａと結合しないか、もしくはそれに対して低い親和性を示すこと、
（７）ＨＬＡ－ＥのＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合による活性化シグナルを妨害しないこと、
（８）ヒトＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との結合が低減されていること、
（９）抗腫瘍免疫応答を誘導および／もしくは増強すること、
（１０）Ｔ細胞の機能的活性を増強すること（いくつかの実施形態では、例えば、ＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解によって測定される場合、細胞傷害性Ｔ細胞機能を増大させること）、
（１１）例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化を誘導することによって、ＮＫ細胞の機能的活性を増強すること、
（１２）サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ産生を増大させること、ならびに／または
（１３）ＨＤＸ－ＭＳおよび／もしくはＦＰＯＰエピトープマッピングによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３、
領域４：Ｌ（配列番号２のアミノ酸残基２０６）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）
を含む不連続な領域内に位置するエピトープと特異的に結合すること、
（１４）ＨＤＸ－ＭＳによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５）、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）
を含む不連続な領域内に位置するエピトープと特異的に結合すること、
のうちの１つまたは複数を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、高い親和性で、ヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａと結合し、非霊長類ＮＫＧ２Ａ、例えば、マウスまたはラットＮＫＧ２Ａとは結合しないか、または低い親和性で結合する。具体的には、いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の特性：
（ａ）細胞結合アッセイによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に関して、約０．６ｎＭ以下のＥＣ５０値を有すること、
（ｂ）細胞結合アッセイによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合に関して、約９．０ｎＭ以上のＥＣ５０値を有すること、
（ｃ）細胞遮断アッセイによって測定される場合、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／もしくは相互作用を低減することに関して、約１．０ｎＭ以下のＩＣ５０値を有すること、
（ｄ）スキャッチャード解析によって測定される場合、約０．４ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
（ｅ）表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約６１ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
（ｆ）スキャッチャード解析によって測定される場合、約１．０ｎＭ以下のＫＤで、カニクイザルＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
（ｇ）ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合すると、内部移行されること、
（ｈ）インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）産生を増大させること、ならびに／または
（ｉ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体：ＮＫＧ２Ａタンパク質複合体の半減期が、約４０秒以上であること
のうちの１つまたは複数を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａリガンド（ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／または相互作用を遮断する。具体的には、いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の特性：
ａ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＮＫＬについては約０．３０ｎＭのＩＣ５０およびＣＨＯ－ｈＮＫＧ２Ａ細胞については約１．０ｎＭのＩＣ５０で、ＨＬＡ－Ｅ五量体がヒトＮＫＧ２Ａを発現する細胞と結合するのを遮断すること、
ｂ）ＨＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４－ｍＦＣまたはカニクイザルＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４－ｍＦｃタンパク質と複合体を形成した抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ヒトＨＬＡ－Ｅ結合を遮断すること
のうちの１つまたは複数を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａに特異的である。具体的には、いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の特性：
ａ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ａとの結合に関して、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合に関する第２のＥＣ５０値よりも約１５倍低いＥＣ５０値を有すること。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ａとの結合に関するＥＣ５０値は、約０．６ｎＭであり、一方で抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ｃとの結合に関するＥＣ５０値は、約９．０ｎＭであった。
ｂ）ＳＰＲ分析に基づいて、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ｃとの特異的結合がないこと、および／または
ｃ）フローサイトメトリーによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２ＣおよびＨＬＡ－Ｅの相互作用を遮断しないこと
のうちの１つまたは複数を示す。
いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａは、ＦｃγＲ結合を低減または予防するために、不活性Ｆｃを有する（例えば、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである）。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ８＋ ＴおよびＮＫ細胞上に発現される阻害性受容体であるため、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ ＴまたはＮＫ細胞のアゴニズムまたは枯渇を低減させることは、抗腫瘍機能に有益である。したがって、ＮＫＧ２ＡおよびＨＬＡ－Ｅの相互作用の遮断は、ヒトＦｃγＲと相互作用しない抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いて行うことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａは、Ｔ細胞の抗腫瘍機能的活性を増強させる。具体的には、いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の特性：
ａ）約０．２ｎＭ以下のＥＣ５０値で、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅによって刺激されるＮＫＧ２Ａ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株におけるＮＫ－κＢシグナル伝達の阻害を逆転させること、
ｂ）ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１と共培養した健常ドナーＰＢＭＣから単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔにおいて、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を誘導すること、
ｃ）ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１と共培養したヒト腫瘍から単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞において、ＩＦＮ－γを誘導すること
のうちの１つまたは複数を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫ細胞の抗腫瘍機能的活性を増強させる。具体的には、いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の特性：
ａ）ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅと共培養したＮＫＬ細胞において、ＩＦＮ－γ産生を増大させること、
ｂ）ＮＫ細胞脱顆粒化およびＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解の用量依存的増大を誘導すること
のうちの１つまたは複数を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合した後に、内部移行される。具体的には、いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、約０．５ｎＭ低いかまたはそれ以下のＥＣ５０で、内部移行を示す。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、約０．５ｎＭ低いかまたはそれ以下のＥＣ５０で、用量依存的内部移行を示す。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、抗体の化学的安定性を低減させる配列傾向が欠如している。本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、ＮＫＧ２Ａ発現および／または活性と関連する癌およびその他の障害の治療および／または診断のための種々の重要な用途を有する。
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列によって本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、実施例４に記載されるように、ヒトＮＫＧ２Ａ上の特定のエピトープと結合する。
ヒトＮＫＧ２Ａとの結合は、当技術分野において十分に確立されている１つ以上の技術を使用して評価することができる。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａを発現する細胞株、例えば、ヒトＮＫＧ２Ａをその細胞表面上に発現するようにトランスフェクトされているＣＨＯ細胞と抗体を反応させる、フローサイトメトリーアッセイによって試験される。さらに、またはあるいは、抗体の結合は、結合動態（例えば、ＫＤ値）を含め、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにおいて試験することができる。なおも他の好適な結合アッセイとしては、例えば、組換えヒトＮＫＧ２Ａタンパク質を使用した、ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片は、高い親和性で、例えば、１×１０－６Ｍ以下、１×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、または１０－１０Ｍ以下のＫＤを含む、ナノモル規模の親和性で、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合する。
本発明のいくつかの実施形態は、ＨＤＸ－ＭＳおよび／またはＦＰＯＰエピトープマッピングによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２（天然のｈＮＫＧ２Ａアミノ酸配列）のアミノ酸残基１５５～１６５、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、
領域４：Ｌ（配列番号２のアミノ酸残基２０６）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）
を含む不連続な領域内に位置するエピトープと特異的に結合する、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＸ－ＭＳによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５）、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９
を含む不連続な領域内に位置するエピトープと特異的に結合する、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を対象とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅに媒介される阻害を遮断することによって、ＮＫ細胞機能を増強させる。別の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合し、抗腫瘍免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞応答を刺激する。抗ＮＫＧ２Ａ抗体が免疫応答を刺激する能力は、本明細書の実施例に記載されるように、インビボ腫瘍グラフトモデルにおけるものなど、腫瘍成長を測定することによって試験することができる。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合部分は、ＮＫＧ２Ａ発現Ｔ細胞においてサイトカイン産生（例えば、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を増大させ、かつ／またはエフェクターＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても知られる）を含むＴ細胞増殖を増大させる。
別の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＮＫＧ２Ａと結合し、以下の特性：
ａ）ＨＤＸ－ＭＳおよび／もしくはＦＰＯＰエピトープマッピングによって判定される場合、以下の残基のうちの１つもしくは複数と結合すること：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２（天然のｈＮＫＧ２Ａアミノ酸配列）のアミノ酸残基１５５～１６５、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、
領域４：Ｌ（配列番号２のアミノ酸残基２０６）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）、
ｂ）ＮＫＧ２Ａ．１１および１３Ｆ３．Ａ４抗体と同一のヒトＮＫＧ２Ａ上のエピトープと結合すること、
ｃ）ヒトＮＫＧ２Ａとの結合について、ＮＫＧ２Ａ．１１および１３Ｆ３．Ａ４抗体と競合すること、
ｄ）Ｂｉｏｃｏｒｅによって測定される場合、約０．４ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＮＫ細胞と結合すること、
ｅ）Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、約０．３ｎＭのＩＣ５０で、ヒトＮＫ細胞のＨＬＡ－Ｅとの結合を遮断すること、
ｆ）約１ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合すること、
ｇ）約９．０ｎＭ以上のＥＣ５０で、ヒトＮＫＧ２Ｃとの低い結合を有すること（換言すると、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２ＣのＨＬＡ－Ｅとの相互作用を遮断しない）、ならびに／または
ｈ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の抗腫瘍応答を増強すること、例えば、
ｉ．初代Ｔ：ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＨＬＡ－Ｅ－ＰＤＬ１アッセイにおいて、ＩＦＮ－γ産生を増大させること、
ｉｉ．Ｔ細胞腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）：ＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＨＬＡ－Ｅ－ＰＤＬ１アッセイにおいて、ＩＦＮ－γ産生を増大させること、および／もしくは
ｉｉｉ．初代ＮＫ細胞アッセイにおいて、細胞傷害性およびＩＦＮ－γ産生を増大させること
のうちの少なくとも１つを示す。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト化および完全ヒトモノクローナル抗体を含む。他の実施形態では、抗体は、例えば、キメラモノクローナル抗体である。
ａ．抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１であり、これらは、以下の実施例に記載されるように、単離され構造的に特徴付けされている。ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、配列表および配列一覧に記載されている。
これらの抗体のそれぞれが、ヒトＮＫＧ２Ａに結合し得ることを踏まえ、ＶＨおよびＶＬ配列を「混合および対応させた（mixed and matched）」、本発明の他の抗ｈＮＫＧ２Ａ結合分子を作成することができる。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬ鎖を混合および対応させた場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨを、構造的に類似のＶＨ配列と置き換える。同様に、いくつかの実施形態では、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似のＶＬ配列と置き換える。したがって、一態様では、本開示は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、軽鎖および重鎖可変領域が、
（ａ）それぞれ、配列番号９および８のアミノ酸配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号１６４および８のアミノ酸配列、または
（ｃ）それぞれ、配列番号１６９および１６７のアミノ酸配列
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の態様では、本開示は、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および１３Ｆ３Ａ．４抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む抗体を提供する。したがって、一態様では、本開示は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、抗体が、
（ａ）それぞれ、配列番号１０、１１、１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ、配列番号１５４、１４、および１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｃ）それぞれ、配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ、配列番号１５５、１４、および１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
ＣＤＲ３ドメインが、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインとは独立して、単独で、コグネイト抗原に対する抗体の結合特異性を決定し得ること、ならびに予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を生成することができることは、周知である。（例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)を参照されたい。したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物に由来する抗体に由来する１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体であって、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合することができる、モノクローナル抗体を提供する。特定の態様では、本開示は、非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体であって、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合することができる、モノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態内では、非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むそのような発明的抗体は、対応する親非ヒト抗体と、（ａ）結合について競合し得る、（ｂ）その機能的特徴を保持する、（ｃ）同一のエピトープと結合する、かつ／または（ｄ）類似の結合親和性を有する。
他の態様では、本開示は、ヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られたヒト抗体などに由来する１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体であって、ヒト抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合することができる、モノクローナル抗体を提供する。他の態様では、本開示は、第１のヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られたヒト抗体などに由来する１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体であって、第１のヒト抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合することができ、第１のヒト抗体に由来するＣＤＲ３ドメインが、ＮＫＧ２Ａに対する結合特異性が欠如したヒト抗体のＣＤＲ３ドメインと置き換えられて、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合することができる第２のヒト抗体が生成される、モノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、第１のヒト抗体に由来する１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むそのような発明的抗体は、対応する親非ヒト抗体と、（ａ）結合について競合し得る、（ｂ）その機能的特徴を保持する、（ｃ）同一のエピトープと結合する、かつ／または（ｄ）類似の結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、アイソタイプとして不活性ＦｃヒトＩｇＧ１．３を有する抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。いくつかの実施形態では、そのような不活性Ｆｃを有する抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、他のアイソタイプと比較して、癌の治療において優れた有効性を示す。
ｂ．保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体（例えば、１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体）に基づく指定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、それらの抗体は、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の所望される機能的特性を保持する。抗原結合を除去しない特定の保存的配列修飾が行われてもよいことが、当技術分野において理解される。（例えば、Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8を参照されたい）。したがって、本開示は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列またはその保存的修飾を含み、
（ｂ）抗体またはその抗原結合部分が、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
さらなる実施形態では、抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａとの高親和性結合、および／またはＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する能力など、本明細書に記載される機能的特性のうちの１つまたは複数を有する。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２配列を含む重鎖可変領域は、配列番号１１に記載されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、ＣＤＲ２配列を含む軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ１配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３、１５４、または１５５に記載されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を含むＣＤＲ１配列を含む。
種々の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
ｃ．抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と同一のエピトープと結合する抗体
別の実施形態では、本開示は、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体のうちのいずれかと同一のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質上のエピトープと結合する抗体（すなわち、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合について、本発明のモノクローナル抗体のうちのいずれかと交差競合する能力を有する抗体）を提供する。いくつかの実施形態では、交差競合研究の参照抗体は、標準的なヒトＮＫＧ２Ａ結合アッセイにおけるモノクローナル抗体ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および１３Ｆ３．Ａ４である。例えば、組換えヒトＮＫＧ２Ａタンパク質をプレートに固定化し、抗体のうちの１つを蛍光標識し、非標識化抗体が標識化抗体の結合と競合する能力を評価する、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。さらに、またはあるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して、抗体が交差競合する能力を評価することができる。試験抗体が、例えば、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および／または１３Ｆ３．Ａ４のヒトＮＫＧ２Ａとの結合を阻害する能力は、試験抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａとの結合について、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および／または１３Ｆ３．Ａ４と競合し得、したがって、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および／または１３Ｆ３．Ａ４と同一のヒトＮＫＧ２Ａ．９上のエピトープと結合することを示す。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および／または１３Ｆ３．Ａ４と同一のヒトＮＫＧ２Ａ上のエピトープと結合する抗体は、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体である。
実施例４においてさらに論じられるように、ＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４の結合は、特定の残基にマッピングされている。したがって、一実施形態では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合したときに、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
（ｅ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）；
（ｆ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）；
（ｇ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）；および
（ｈ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体が、ＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を遮断する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａと結合したときに、ＨＤＸ－ＭＳおよび／またはタンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）エピトープマッピングによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
（ｆ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）；
（ｇ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）；
（ｈ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）；
（ｉ）L;および
（ｊ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体が、ＮＫＧ２Ａリガンド（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ）のヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を遮断する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
そのようなヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製および単離することができる。例えば、本明細書において開示される抗体と同一または類似のエピトープと結合する抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、免疫処置プロトコール、例えば、本明細書に記載されるものを使用して、作製することができる。結果として得られた抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａとの高親和性結合について、スクリーニングすることができる。選択された抗体を、次いで、例えば、ｈＮＫＧ２Ａの配列変異体が酵母細胞の表面上に提示される酵母ディスプレイアッセイにおいて、または水素－重水素交換実験および／もしくはＦＰＯＰによって、研究して、抗体が結合する正確なエピトープを決定することができる。
エピトープ決定は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ｈＮＫＧ２Ａの少なくとも１つの領域内の同じ残基のうちの１つもしくは複数と接触する場合、ｈＮＫＧ２Ａの少なくとも１つの領域内の残基の大半と接触する場合、ｈＮＫＧ２Ａのそれぞれの領域内の残基の大半と接触する場合、ｈＮＫＧ２Ａの全長にわたって接触の大半と接触する場合、ｈＮＫＧ２Ａの同じ別個の領域のすべて内で接触する場合、ｈＮＫＧ２Ａ上のいずれか１つの領域で残基のすべてと接触する場合、または同じ領域のすべてにおいて、同じ残基のすべてと接触する場合、本明細書において開示される抗抗ｈＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体と同一のエピトープと結合すると考えられる。エピトープ「領域」は、一次配列に沿っているが、必ずしもそれと直接隣接しているわけではない、残基のクラスターである。
本明細書に記載される抗体を用いて「ｈＮＫＧ２Ａ上の同一エピトープ」と結合する抗体を調べる技術として、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析が挙げられ、これは、エピトープの原子分解を提供する。その他の方法は、抗体の抗原断片または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、ここでは、抗原配列内のアミノ酸修飾による結合の喪失は、エピトープ成分を示す。方法はまた、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーまたは標的タンパク質のプロテアーゼ消化物から、特定の短いペプチド（天然の三次元形態または変性された形態のいずれか）を親和性単離する能力に頼る可能性がある。そこで、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングのために、計算アルゴリズムも開発されており、コンホメーション的に不連続なエピトープをマッピングすることが示されている。
エピトープまたはエピトープを含む領域はまた、ＮＫＧ２Ａに広がる一連の重複するペプチドとの結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。あるいは、Jespers et al. (1994) Biotechnology;12:899の方法を使用して、同一エピトープを有する、したがって、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体に対して同様の特性を有する抗体の選択を導いてもよい。ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖を、（例えば、ヒト）軽鎖のレパートリーと対形成して、ＮＫＧ２Ａ結合性抗体を選択し、次いで、新規軽鎖を（例えば、ヒト）重鎖のレパートリーと対形成して、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体と同一エピトープまたはエピトープ領域を有する（例えば、ヒト）ＮＫＧ２Ａ結合性抗体を選択する。あるいは、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列の突然変異誘発によって、本明細書に記載される抗体の変異体を得ることができる。
Cunningham & Wells, Science 244: 1081(1989)によって記載されるようなアラニンスキャニング突然変異誘発またはＮＫＧ２Ａ中のアミノ酸残基の点突然変異誘発のいくつかのその他の形態を使用して、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の機能的エピトープを調べてもよい。
特異的抗体によって結合されるエピトープまたはエピトープ領域（「エピトープ領域」は、エピトープを含むか、またはエピトープと重複する領域である）はまた、抗体の、ＮＫＧ２Ａ断片を含むペプチドとの結合を評価することによって決定してもよい。ＮＫＧ２Ａ配列（例えば、ヒトＮＫＧ２Ａ）を包含する一連の重複するペプチドを合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ（ペプチドが、抗体の、マイクロタイタープレートのウェルと結合しているＮＫＧ２Ａとの結合を防ぐその能力について評価される）において、またはチップ上で、結合についてスクリーニングしてもよい。このようなペプチドスクリーニング方法は、いくつかの不連続な機能的エピトープ、すなわち、ＮＫＧ２Ａポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出することができない場合もある。
エピトープはまた、ＭＳベースのタンパク質フットプリント法、例えば、ＨＤＸ－ＭＳおよびタンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）などによって同定してもよい。ＨＤＸ－ＭＳは、例えば、Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95にさらに記載されるように実施することができ、その方法は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057に記載されるように実施することができ、その方法は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体によって結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリング、ならびに遊離している場合および対象の抗体との複合体中に結合されている場合にはＮＫＧ２Ａ中の不安定なアミド水素のＨ－Ｄ交換速度の核磁気共鳴（ＮＭＲ）判定を含む、ＮＭＲ分光法など、構造的方法によって決定してもよい（Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335、Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884）。
別途示されない限り、および特許請求の範囲を参照して、抗体が結合するエピトープは、ＨＤＸ－ＭＳ方法によって決定されるエピトープである。
高い親和性で結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、高い親和性でｈＮＫＧ２Ａと結合するため、有効な治療剤となっている。種々の実施形態では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、３００ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満のＫＤで、ｈＮＫＧ２Ａと結合する。ｈＮＫＧ２Ａに対する抗体の結合能力を評価するための標準アッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）、およびＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析（実施例１０を参照されたい）が挙げられる。
ｄ．抗ＮＫＧ２Ａ抗体配列変異体
本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体配列変異体は、本明細書において開示される望ましい機能的特性を維持する。ＣＤＲ領域は、別途示されない限り、Ｋａｂａｔシステム（Kabat, et al., 1991）を使用して描写される。いくつかの実施形態では、本発明は、さらに、本明細書において開示される抗体のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるＣＤＲ配列を含むヒトまたはヒト化抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。本発明はまた、本明細書において開示される抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む抗抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体、ならびに本明細書において開示される抗体の重鎖および／または軽鎖配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である全長重鎖および／または軽鎖配列を含む抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。
ＩＩ．遺伝子操作された、および修飾された抗体
ａ．ＶＨおよびＶＬ領域
修飾された抗体を遺伝子操作するために、出発材料として本明細書において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうち１種または複数を有する抗体を使用して調製され得る、遺伝子操作された、および修飾された抗体もまた提供され、この修飾された抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することによって、遺伝子操作した。さらに、またはあるいは、本明細書に記載される抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能（単数または複数）を変更するために、定常領域（単数または複数）内の残基を修飾することによって遺伝子操作した。
一実施形態では、可変領域の遺伝子操作には、ＣＤＲグラフティングが含まれる。そのようなグラフティングは、非ヒト抗ＮＫＧ２Ａ抗体、例えば、結合について、本明細書において開示される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と競合する、および／または本明細書において開示される選択的な抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と同一のエピトープと結合する、抗ＨＮＫＧ２Ａ抗体を、ヒト化する際に特に有用である。抗体は、主に重鎖および軽鎖ＣＤＲ中に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。ＣＤＲは、配列が超可変であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する。発現ベクターは、特定の参照（「親」とも称される）抗体に由来するＣＤＲ配列が異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフティングされたものを含むように、構築することができる（例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327、Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525、Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。いくつかの場合には、結果として得られる組換え抗体は、親抗体に類似する特性を有する。遺伝子操作された抗体は、次いで、親抗体とは異なる特性を獲得するようにさらに修飾することができる。他の場合には、親ＣＤＲ配列をフレームワークにグラフティングすることにより、親抗体の特定の特徴が抑制され、その結果、組換え抗体はこれらの特徴をもはや有さなくなる。１つの例示的な特徴は、抗原に対する結合親和性である。そのような場合には、遺伝子操作された抗体を、親抗体の所望される特徴を取り戻すようにさらに修飾することが有利な場合がある。
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースに、ならびにKabat, E. A., et al. (1991); Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見い出すことができ、それらの各々の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される抗体において使用するためのフレームワーク配列は、本明細書に記載される抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に同様であるものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域上にグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較した場合に最大２０個の、保存的なアミノ酸置換を含むアミノ酸置換を含有するフレームワーク領域上にグラフトされ得る。例えば、特定の場合には、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることが有益であることがわかっている（例えば、Queen et alの米国特許第５，５３０，１０１号；同５，５８５，０８９号；同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと）。
本明細書に記載される遺伝子操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、例えば、抗体の免疫原性を減少させるために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が行われているものを含む。例えば、１つのアプローチとして、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することがある。より詳しくは、体細胞突然変異を起こしている抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列に対して比較することによって同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、体細胞突然変異を生殖系列配列に「復帰突然変異する」ことができる。このような「復帰突然変異された」抗体も本開示に包含される。
別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の免疫原性の可能性を低減するために、フレームワーク領域内の、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を突然変異することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Carr et alによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
別の種類の可変領域修飾は、対象の抗体の１種または複数の結合特性（例えば、親和性）を改善するためにＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を突然変異することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、抗体結合または対象のその他の機能的特性に対して突然変異（単数または複数）および効果を導入できる。保存的修飾が導入されることが好ましい。突然変異は、アミノ酸付加、欠失または置換であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基は、酸化され、その結果、化学的分解の可能性および結果としての抗体の効力の低減をもたらし得る。したがって、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ中の１つまたは複数のメチオニン残基が酸化分解を受けないアミノ酸残基と置換されている抗ＮＫＧ２Ａ抗体もまた、本明細書において提供される。同様に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体から、特に、ＣＤＲ中の脱アミド化部位も除去され得る。抗原結合に干渉し得るグリコシル化を防ぐために、抗原結合ドメイン内の可能性あるグリコシル化部位が排除されている抗体もまた、本明細書において提供される。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号を参照されたい。
ｂ．抗体マスキング
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される抗体は、特定の細胞および／または組織との結合を制限するように修飾される。一実施形態では、そのような抗体は、抗体の抗原結合表面と特異的に結合し、抗原結合に干渉する、遮断ペプチド「マスク」を含む。いくつかの実施形態では、マスクは、プロテアーゼ切断可能リンカーによって、抗体の結合アームのそれぞれに連結されている。例えば、ＣｙｔｏｍＸの米国特許第８，５１８，４０４号を参照のこと。プロテアーゼ切断可能リンカーを有する抗体は、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、マスキング／遮断ペプチドの解離が可能となり、これが、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
別の実施形態では、（二価）抗体の両方の抗原結合表面と結合し、抗原結合を干渉する、２つの抗原結合ドメインを含む二価結合化合物（「マスキングリガンド」）が開発されている。一実施形態では、２つの結合ドメインマスクは、切断可能なリンカー、例えば、ペプチダーゼによって切断可能なリンカーによって互いに（抗体ではなく）連結される。（例えば、Ｔｅｇｏｐｈａｒｍ Ｃｏｒｐの国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３を参照のこと。）マスキングリガンドは、抗体が結合するよう意図される抗原を含み得るか、もしくはそれに由来し得るか、または独立に作製され得る。（例えば、抗イディオタイプ結合断片）。このようなマスキングリガンドは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、２つの結合ドメインの互いからの解離が可能となり、抗体の抗原結合表面の結合力を低下させる。結果として生じる、抗体からのマスキングリガンドの解離が、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
ｃ．Ｆｃおよび修飾されたＦｃ領域
一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、抗体の生物学的活性に基づいて選択されるＦｃ領域を含み得る。Salfeld, Nat. Biotechnol. 25:1369 (2007)。ヒトＩｇＧは、例えば、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類することができる。これらのサブクラスのそれぞれは、Ｆｃγ受容体（活性化受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ａ，ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ａ，ｂ）、ならびに阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）のうちの１つまたは複数との結合について、ならびに補体の第１成分（Ｃ１ｑ）について、固有のプロファイルを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、すべてのＦｃγ受容体と結合し；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１と結合し、ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１ ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８に対してより低い親和性を有し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８と結合し；阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に対して、すべてのその他のＦｃγ受容体よりも低い親和性を有する。（Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716）。研究によって、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ２と結合せず、ＦｃγＲＩＩＩＢは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４と結合しないことが示された。同著。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３≫ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２。いくつかの実施形態では、例えば、ＡＤＣＣが所望されるため、治療組成物における使用については、ＩｇＧ２でもＩｇＧ４でもなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択される。
本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃと連結され得（例えば、共有結合によって連結されるか、または融合される）、これは、例えば、ＩｇＧ１の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１（ａ）、Ｇ１ｍ２（ｘ）、Ｇ１ｍ３（ｆ）、Ｇ１ｍ１７（ｚ）；ＩｇＧ２の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３（ｎ）；ＩｇＧ３の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１（ｇ１）、Ｇ３ｍ２８（ｇ５）、Ｇ３ｍ１１（ｂ０）、Ｇ３ｍ５（ｂ１）、Ｇ３ｍ１３（ｂ３）、Ｇ３ｍ１４（ｂ４）、Ｇ３ｍ１０（ｂ５）、Ｇ３ｍ１５（ｓ）、Ｇ３ｍ１６（ｔ）、Ｇ３ｍ６（ｃ３）、Ｇ３ｍ２４（ｃ５）、Ｇ３ｍ２６（ｕ）、Ｇ３ｍ２７（ｖ）であり得る。（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1）を参照のこと）。アロタイプの選択は、例えば、抗薬物抗体の形成を最小化するために、可能性ある免疫原性の懸念によって影響を受け得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＦｃγＲと相互作用することができない。ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ８＋ ＴおよびＮＫ細胞上に発現される阻害性受容体であるため、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ ＴまたはＮＫ細胞のアゴニズムまたは枯渇を回避または低減させることにより、抗腫瘍免疫が増強される。したがって、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断は、ヒトＦｃγＲと相互作用することができない抗ＮＫＧ２Ａ抗体に所望される。
ｄ．半減期の延長
いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、その生物学的半減期、例えば、抗体の血清半減期を増大させるように修飾される。種々のアプローチが、当技術分野において公知である。一実施形態では、抗体は、Presta et alによって米国特許第５，８６９，０４６号および同６，１２１，０２２号に記載されるようにＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとられるサルベージ受容体結合エピトープを含有するようＣＨ１またはＣＬ領域内で変更される。例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組合せＦｃ変異体は、半減期を４倍近く増大する。（Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514）。ＦｃＲｎ結合を増大するためのその他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；第６，２７７，３７５号；同６，８２１，５０５号；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
本明細書に記載の抗体の血清半減期はまた、ペグ化によって増大され得る。抗体を、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増大するようペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、通常、抗体またはその断片を、１つまたは複数のＰＥＧ基が、抗体または抗体断片と結合するようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－またはアリールオキシ－ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール－マレイミドなどの、その他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの任意の形態を包含するものとする。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、技術分野で公知であり、本明細書に記載される抗体に適用され得る。（例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照のこと）。
いくつかの場合には、抗体の半減期を、増大させるのではなく減少させることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、その半減期を減少させるような修飾を含む。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ（Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355）およびＨ４３５Ａ／Ｒ Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ（Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819）などの修飾は、医用画像のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を減少させ、ひいては、半減期を減少（クリアランスを増大）させ得る。（Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照のこと）。クリアランスを増強するためのその他の手段として、本発明の抗原結合ドメインを、Ｆａｂ断片などのＦｃＲｎと結合する能力を欠く抗体断片としてフォーマットすることが挙げられる。このような修飾は、例えば、抗体の循環半減期を２、３週間から数時間に減少させ得る。次いで、抗体断片の選択的ペグ化を使用して、所望される場合に、抗体断片の半減期を増大させることができる。（Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780）。半減期を増大するために、抗体断片をまた、ヒト血清アルブミンと融合して、例えば、融合タンパク質コンストラクトにしてもよい。（Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904）。あるいは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する、本発明の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを用いて、二重特異性抗体を構築してもよい。（国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびその中で引用される特許参考文献を参照のこと）。あるいは、半減期を増大するために、特殊化ポリペプチド配列、例えば、「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列を抗体断片に添加することができる。（Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186;国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２）。
ｅ．さらなるＦｃ変異体
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常ドメインを使用する場合、ＩｇＧ１コンストラクトのヒンジ中の可能性あるプロテアーゼ切断部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾によって排除し、抗体の安定性を増大させることができる。（ＷＯ２０１４／０４３３４４）。
Ｆｃ変異体のそのリガンド（Ｆｃ受容体）に対する親和性および結合特性は、それだけには限らないが、平衡方法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析）および間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などのその他の方法を含めた、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ法（例えば、生化学または免疫学ベースのアッセイ）によって決定され得る。これらおよびその他の方法は、調べられている１種もしくは複数の成分上の標識を使用してもよく、および／またはそれだけには限らないが、発色、蛍光、発光もしくは同位体標識を含めた種々の検出方法を利用してもよい。結合親和性および速度論の詳細な説明は、抗体免疫原相互作用に焦点を当てる、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見い出すことができる。
さらにその他の実施形態では、抗体のグリコシル化は、エフェクター機能を増大または低減するよう修飾される。例えば、位置２９７の保存されたアスパラギン残基を突然変異し（例えば、Ｎ２９７Ａ）、ひいては、補体およびＦｃγＲＩ結合を消滅させることによって、すべてのエフェクター機能を欠く非グリコシル化抗体を作製できる。（Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595（ＩｇＧ１中のＮ２９７Ｑを使用して、位置２９７でのグリコシル化を排除する）も参照のこと）。
非グリコシル化抗体は、一般に、エフェクター機能を欠くが、その機能を回復させるよう、突然変異を導入することができる。非グリコシル化抗体、例えば、Ｎ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ突然変異に起因するものか、またはタンパク質をグリコシル化しない系（例えば、大腸菌）において産生されたものを、ＦｃγＲ結合を回復させるよう、さらに突然変異することができる、例えば、Ｓ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／もしくはＨ（ＷＯ２００９／０７９２４２）またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ（Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604）。
糖鎖操作はまた、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７で結合している炭水化物鎖のα２，６シアリル含量を変更することによって、ＩｇＧコンストラクトの抗炎症特性を修飾するために使用され得、これでは、α２，６シアリル化形態の割合の増加が、抗炎症効果の増強をもたらす。（Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513を参照のこと）。逆に、α２，６シアリル化炭化水素を有する抗体の割合の減少は、抗炎症特性が望まれない場合には有用であり得る。例えば、α２，６シアリル化形態の選択的精製によって、または酵素的修飾によって、抗体のα２，６シアリル化含量を修飾する方法は、米国特許出願公開第２００８／０２０６２４６号に提供されている。その他の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾を含めることによって、α２，６シアリル化の効果を模倣するよう修飾され得る（ＷＯ２０１３／０９５９６６）。
ＩＩＩ．抗体物理的特性
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１つまたは複数のグリコシル化部位を含有する。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増大または変更された抗原結合による抗体薬物動態の変更をもたらし得る（Marshall et al (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702、Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94、Wallick et al (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109、Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R、Parekh et al (1985) Nature 316:452-7、Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こると知られている。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、可変領域グリコシル化を含有しない。このような抗体は、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによってか、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによって得ることができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－ＧまたはＤ－Ｇ配列で起こり得、その結果、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を低減する（イソアスパラギン酸効果として知られている）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、６～９．５のｐＨ範囲に等電点（ｐＩ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、７～９．５または６～８のｐＨ範囲にｐＩを有する。所望されるｐＩ範囲内にｐＩを有する抗体は、そのｐＨ範囲内にｐＩを有する抗体を候補群から選択すること、または特定の抗体の荷電表面残基を突然変異させることのいずれかによって、得ることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、最初のアンフォールディングの温度（ＴＭ１）が６０℃超、６５℃超、または７０℃超となるように選択および／または遺伝子操作される。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando et al (1999) Immunol Lett. 68:47-52）または円偏光二色性（Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9）を使用して測定できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、有利な分解特性、例えば、インビトロおよび／またはインビボでの緩徐な分解を有するように選択および／または遺伝子操作される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ－ＭＳ（Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32）を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、望ましい凝集特性を有するように、例えば、望ましくない免疫応答および／または変更されたかもしくは望ましくない薬物動態特性を誘起し得る、インビトロおよび／またはインビボでの凝集を最小限に示す抗体が、選択および／または遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、親抗体の凝集と比較して、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の凝集を示す。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含めた、いくつかの技術によって測定できる。
ＩＶ．核酸分子および組換え方法
本明細書に記載される別の態様は、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、例えば、宿主細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準的な技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸（例えば、その他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界では単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から精製された場合に、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。（F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい）。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロンを含有する場合も、含有しない場合もある。特定の実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
本明細書において記載される核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）から得られる抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するよう、標準組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と作動可能に連結している。この文脈において使用されるような、用語「作動可能に連結された」は、２種のＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるよう、２種のＤＮＡ断片が接続されることを意味する。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, et al., 1991を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３（配列番号１６０）をコードする可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照のこと）。
Ｖ．抗体の生成
本発明の種々の抗体、例えば、選択された本明細書に開示される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と同一のエピトープと結合するものは、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)によって記載される標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術などの種々の公知の技術を使用して産生することができる。モノクローナル抗体を産生するためのその他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
ハイブリドーマを調製するための例示的な動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、十分に確立された手順である。免疫処置プロトコールおよび融合のために免疫処置された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
本明細書に記載されるキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、対象のマウスハイブリドーマから得、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよう遺伝子操作できる。例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる（例えば、Cabilly et al.の米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ領域を挿入できる（例えば、Winterの米国特許第５，２２５，５３９号およびQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１号；同５，５８５，０８９号；同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと）。
一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトＮＫＧ２Ａに対して向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を保持する、トランスジェニックまたはトランスクロモソミック（transchromosomic）マウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミック（transchromosomic）マウスは、本明細書において、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（miniloci）を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された突然変異とともに含有する（例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照のこと）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫処置に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖 導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Lonberg, N. et al. (1994)、前掲; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説されている）。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスによって保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724;Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830;Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、それらの開示内容は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。（また、すべてLonbergおよびKayの米国特許第５，５４５，８０６号；同５，５６９，８２５号；同５，６２５，１２６号；同５，６３３，４２５号；同５，７８９，６５０号；同５，８７７，３９７号；同５，６６１，０１６号；同５，８１４，３１８号；同５，８７４，２９９号；および同５，７７０，４２９号；Surani et al.の米国特許第５，５４５，８０７号；すべてLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ ９９／４５９６２ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスを使用して作製される。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を作製するために使用できる。例えば、Xenomouse（Abgenix、Inc.）と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５，９３９，５９８号；同６，０７５，１８１号；同６，１１４，５９８号；同６、１５０，５８４号および同６，１６２，９６３号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスクロモソミック（transchromosomic）動物系は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ｎｋｇ２ａ抗体を作製するために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体（transchromosome）およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体（transchromosome）を保持するウシが、当技術分野で記載されており（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を作製するために使用できる。
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を作製するための当技術分野において記載されるさらなるマウス系として、（ｉ）内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体（ヒトＶ／マウスＣ）が作製され、次いで、その後、標準組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）ならびに（ｉｉ）マウスが再編成されていないヒト重鎖可変領域、しかし単一の再変性されたヒト共通軽鎖可変領域を含有するＭｅＭｏ（登録商標）マウス（Ｍｅｒｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載されている。
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。（例えば、Ladner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号；同５，４０３，４８４号；および同５，５７１，６９８号；Dower et al.の米国特許第５，４２７，９０８号および同５，５８０，７１７号； McCafferty et al.の米国特許第５，９６９，１０８号および同６，１７２，１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５，８８５，７９３号；同６，５２１，４０４号；同６，５４４，７３１号；同６，５５５，３１３号；同６，５８２，９１５号および同６，５９３，０８１号を参照のこと）。
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再構成されている重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスを使用して調製することができる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌの米国特許第５，４７６，９９６号および同５，６９８，７６７号に記載されている。
免疫処置
ヒトＮＫＧ２Ａに対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851、およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスまたはトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルマウス（例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７、もしくはＫＭマウス）を、ＮＫＧ２Ａ抗原および／またはＮＫＧ２Ａを発現する細胞の精製または濃縮された調製物を用いて免疫処置することができる。あるいは、マウスを、ヒトＮＫＧ２ＡをコードするＤＮＡを用いて免疫処置することができる。好ましくは、マウスは、第１の注入の際に６～１６週齢とする。例えば、マウスを腹膜内に免疫処置するために、組換えヒトＮＫＧ２Ａ抗原の精製または濃縮された調製物（例えば、５μｇ～５０μｇ）を使用することができる。ＮＫＧ２Ａ抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫処置により抗体が生じない場合には、ＮＫＧ２Ａを発現する細胞、例えば、細胞株を用いてマウスを免疫処置して、免疫応答を促進することもできる。
ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、最初に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いて腹膜内または皮下（ＳＣ）で免疫処置し、続いて、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いて隔週でＩＰ／ＳＣ免疫処置（最大合計１０回）することができる。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿サンプルを用いて、免疫処置プロトコールの過程にわたってモニタリングできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき（以下に記載されるように）、抗ＮＫＧ２Ａヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫処置のために２～３回の融合が実施され得る。各抗原について、６から２４匹の間のマウスが、免疫処置され得る。いくつかの実施形態では、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は両方とも、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）単一マウスに一緒に育種され得る。
ＮＫＧ２Ａタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記載されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫処置されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、５０％ ＰＥＧを用いて、免疫処置マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１）と融合できる。細胞を、およそ２×１０５で平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」コンディショニング培地、５％オリゲン（origen）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１Ｘ ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する選択培地で２週間インキュベートする。およそ２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置換されている培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、１０～１４日後に普通に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
モノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ－セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、－８０℃で保存できる。
ＶＩ．抗体の製造
ＮＫＧ２Ａに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
配列が提供される特異的抗体およびその他の関連抗ＮＫＧ２Ａ抗体の両方を含めた、本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させることができる（Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすよう、抗体遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって、発現ベクター（単数または複数）中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数または複数）と作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結されるように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、他の因子の中でもとりわけ、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの因子に応じて変わり得ることが、当業者には明らかであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、およびポリオーマウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲαプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる調節エレメント（Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製の起点）などのさらなる配列および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてAxel et al.による米国特許第４，３９９，２１６号、同４，６３４，６６５号および同５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。例示的な選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ－宿主細胞において使用するための）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のための）が挙げられる。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単数または複数）を、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のためによく使用される様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含する。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記載される抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高効率の産生にとっては有効ではないと報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。本発明の抗体はまた、酵母の糖鎖操作株においても産生することができる。（ピキア・パストリス（Pichia pastoris）。Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210)。
本明細書に記載される組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞として、ＣＨＯ細胞（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されるように、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の例示的な発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞中に導入され、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、よく観察される翻訳後修飾によって予測される配列とは異なることもある。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖から失われていることが多い。（Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132）。N末端グルタミン残基およびより少ない程度であるが、グルタミン酸残基は、治療用抗体の軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換されることが頻繁にある。（Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544;Liu et al. (2011) JBC 28611211;Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211）。
本発明の種々の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体のアミノ酸配列は、配列表に提供されている。上記で論じられた理由から、Ｃ末端リシンは、重鎖または重鎖定常ドメインについて、配列表の配列の多くには含まれていない。しかしながら、代替的な実施形態では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体のそれぞれの重鎖、および／またはそのような抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝子コンストラクトは、重鎖のＣ末端に、このさらなるリシン残基を含む。
ＶＩＩ．アッセイ
本明細書に記載される抗体は、ＮＫＧ２Ａとの結合について、例えば、標準ＥＬＩＳＡによって試験することができる。例えば、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１～２μｇ／ｍＬの精製されたＮＫＧ２Ａでコーティングし、次いで、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物（例えば、ＮＫＧ２Ａ免疫処置マウスから得た血漿の希釈物）を添加し、３７℃で１～２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次試薬（例えば、ヒト抗体、またはそれ以外はヒト重鎖定常領域を有する抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄した後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ、ｐｒｏｄｕｃｔ：ＡＢＴＳ－１０００）を用いて発色させ、ＯＤ４１５～４９５で分光光度計によって分析する。次いで、免疫処置されたマウスから得た血清を、ＮＫＧ２Ａを発現しない対照細胞株とではなく、ヒトＮＫＧ２Ａを発現する細胞株との結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。手短には、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の結合を、ＮＫＧ２Ａ発現性ＣＨＯ細胞を１：２０希釈の抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともにインキュベートすることによって評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施する。最高の力価を発生するマウスが、融合に使用されることが好ましい。マウス抗ＨＮＫＧ２Ａ抗体を検出しようとする場合には、類似の実験を、抗マウス検出抗体を使用して行ってもよい。
上記のようなＥＬＩＳＡなどを使用して、抗体、ひいては、ＮＫＧ２Ａ免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングできる。好ましくは、高親和性でＮＫＧ２Ａと結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。細胞バンクを作製するために、抗体精製のために、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによって）各ハイブリドーマから１つのクローンを選択できる。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを成長させることができる。プロテインＡ－セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、－８０℃で保存できる。
選択された抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体が独特のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＮＫＧ２ＡコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩コーティングできる。１％ ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１～２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
モノクローナル抗体の、ＮＫＧ２Ａを発現する生存細胞との結合を調べるために、フローサイトメトリーを使用できる。手短には、膜結合性ＮＫＧ２Ａを発現する細胞株（標準成長条件下で成長させた）を、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、ある濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフィコエリスリン（ＰＥ）標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析して、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、または代わりに）、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて減少した感受性を有し得る。
抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ウエスタンブロッティングによってＮＫＧ２Ａ抗原との反応性についてさらに試験できる。手短には、ＮＫＧ２Ａを発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランにトランスファーし、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いてプロービングする。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
種々の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の結合親和性、交差反応性、および結合動態を解析するための方法としては、当技術分野において公知の標準アッセイ、例えば、Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）分析、およびＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ機器を使用したＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ分析が挙げられる。
一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａの細胞外領域と特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、ＮＫＧ２Ａの細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能的ドメイン）と結合する。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａの細胞外領域およびカニクイザルＮＫＧ２Ａの細胞外領域と特異的に結合する。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、高い親和性で、ヒトＮＫＧ２Ａと結合する。
ＶＩＩＩ．多重特異性分子
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性または三重特異性の分子である。多重特異性抗原結合分子、例えば、多重特異性抗体は、それぞれが異なるエピトープに対して特異的な２つ以上の抗原結合部位を含む。異なるエピトープは、同じ抗原または異なる抗原の一部であり得る。一実施形態では、一方の抗原結合部位は、ヒトＮＫＧ２Ａに特異的であり、他方は、異なる抗原に特異的である。一実施形態では、本明細書に記載される抗ｈ ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を生成するように、異なる結合特異性を有する別の抗原結合分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体もしくは抗体断片または受容体のリガンド）と連結している。一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、２つを上回る異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を生成するように、誘導体化されるか、または１つを上回る他の抗原結合分子と連結している。したがって、少なくとも１つのＮＫＧ２Ａに対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が、本明細書において提供される。二重特異性分子が多重特異性である本明細書に記載される一実施形態では、分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖを含めたその抗体断片を含む。参照によりその開示内容が明確に組み込まれるLadner et al.米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるように、抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体またはＦｖもしくは一本鎖コンストラクトなどのその任意の最小断片であり得る。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記載される二重特異性抗体において利用することができるその他の抗体には、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体がある。
本明細書に記載される二重特異性抗体は、当技術分野において公知の方法を使用して、構成要素としての結合特異性をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を、別個に作製し、次いで、互いにコンジュゲートできる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合には、共有結合コンジュゲーションのために種々のカップリングまたは架橋剤を使用できる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシニミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686;Liu、MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと）。その他の方法として、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されるものが挙げられる。好ましいコンジュゲート剤として、ＳＡＴＡおよびスルホ－ＳＭＣＣがあり、両方とも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合には、それらを、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートできる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションに先立って奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは、１を含有するよう修飾される。
あるいは、両結合特異性は、同一ベクター中にコードされ、同一宿主細胞において発現され、アセンブルされ得る。この方法は、二重特異性分子が、（ｍＡｂ×ｍＡｂ）、（ｍＡｂ×Ｆａｂ）、（Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２）、または（リガンド×Ｆａｂ）融合タンパク質などの結合特異性の組合せを有する場合に、特に有用である。本明細書に記載される二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；同５，４５５，０３０号；同４，８８１，１７５号；同５，１３２，４０５号；同５，０９１，５１３号；同５，４７６，７８６号；同５，０１３，６５３号；同５，２５８，４９８号および同５，４８２，８５８号に記載されている。
二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定法（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイを使用するなど、当技術分野で認識される方法を使用して確認することができる。これらのアッセイは各々、一般に、対象の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に対象とされるタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。
ＩＸ．組成物
医薬上許容される担体と一緒に製剤化された、１種または複数の本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片（単数または複数）を含有する組成物、例えば、医薬組成物が、さらに提供される。したがって、本発明の組成物は、本明細書に記載されるＣＤＲ配列、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列、または全長重鎖および／もしくは軽鎖配列を有するヒトまたはヒト化抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体（またはその抗原結合断片）を含む。本発明の組成物はまた、配列表に記載される配列の変異体である配列を有する抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体も含む。例えば、そのような抗体は、配列表に記載されるＣＤＲ配列、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域配列、または全長重鎖および／もしくは軽鎖配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含み得る。
このような組成物はまた、（例えば、２種以上の異なる）本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子のうち１種または組合せを含み得る。例えば、本明細書に記載される医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または補完的活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲートもしくは二重特異性抗体）の組合せを含み得る。
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法として、すなわち、その他の薬剤と組み合わせた抗ＮＫＧ２Ａ抗体として投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激（例えば、活性化）剤と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療薬の例は、本明細書に記載される抗体の使用に関する節において以下により詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される医薬組成物は、癌の治療のために使用されるその他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤として、例えば、所与の癌に対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、抗ｈ ＮＫＧ２Ａに特異的な第１の抗体および第２の抗体を含む。
いくつかの実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、固定用量（すなわち、固定比）で組成物中に存在する。他の実施形態では、固定用量は、少なくとも約１：２００～少なくとも約２００：１、少なくとも約１：１５０～少なくとも約１５０：１、少なくとも約１：１００～少なくとも約１００：１、少なくとも約１：７５～少なくとも約７５：１、少なくとも約１：５０～少なくとも約５０：１、少なくとも約１：２５～少なくとも約２５：１、少なくとも約１：１０～少なくとも約１０：１、少なくとも約１：５～少なくとも約５：１、少なくとも約１：４～少なくとも約４：１、少なくとも約１：３～少なくとも約３：１、または少なくとも約１：２～少なくとも約２：１の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体ｍｇ対第２の抗体ｍｇである。いくつかの実施形態では、固定用量は、少なくとも約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２０、約１：１４０、約１：１６０、約１：１８０、または約１：２００の抗ｈ ＮＫＧ２Ａ抗体対第２の抗体である。いくつかの実施形態では、固定用量は、少なくとも約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１２０：１、約１４０：１、約１６０：１、約１８０：１、または約２００：１の第１の抗体ｍｇ対第２の抗体ｍｇである。例えば、一実施形態では、抗ｈ ＮＫＧ２Ａ抗体および第２の抗体は、実施例に記載されるように投与される。
さらなる抗体としては、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、および／もしくはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、または抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体のうちの１つまたは複数が挙げられる。
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。いくつかの実施形態では、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。いくつかの実施形態では、担体は、静脈内投与に好適である。他の実施形態では、担体は、皮下投与に好適である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む組成物は、ヒアルロナンを一時的に分解する組換えヒトヒアルロニダーゼ酵素（ｒＨｕＰＨ２０）を含むＨａｌｏｚｙｍｅのＥＮＨＡＮＺＥ（登録商標）薬物送達技術を使用して皮下送達される。いくつかの実施形態では、ＥＮＨＡＮＺＥ（登録商標）薬物送達技術は、静脈内投与と比較してより迅速な組成物の皮下投与を可能にする。他の実施形態では、投与経路に応じて、化合物を、酸および化合物を不活性化し得るその他の天然条件作用から保護するために、材料において、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子をコーティングしてもよい。
本明細書に記載される医薬化合物は、１種または複数の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、何らかの望ましくない毒物学的影響を付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などといった非毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などといった非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといったアルカリ土類金属に由来するものならびにＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどといった非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどといった水溶性抗酸化物質、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなどといった油溶性抗酸化物質および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などといった金属キレート化剤が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどといった）およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌法手順、前掲によって、また種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。本明細書における例示的な医薬上許容される担体としては、さらに、間質的薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。
医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が考慮される。補足活性化合物も、組成物中に組み込まれ得る。
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含めることが好ましいであろう。組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射用組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込むことと、それに続く、滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記のものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法として、その前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与様式に応じて変わる。単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生産する組成物の量となる。医薬上許容される担体との組合せにおいて、この量は、１００パーセントのうち、有効成分の約０．０１パーセント～約９９パーセント、例えば、約０．１パーセント～約７０パーセント、例えば、有効成分の約１パーセント～約３０パーセントの範囲となり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、例えば、ＮＫＧ２Ａ．９を含む。組成物は、静脈内投与のための滅菌で非発熱性の単回使用の保存剤不含等張水溶液である。組成物は、未希釈または注入前に０．９％塩化ナトリウム注射で必要とされるタンパク質濃度にさらに希釈して投与されてもよい。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、以下の賦形剤を含む：Ｌ－ヒスチン（histine）、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、スクロース、ペンテト酸（ジエチレントリアミン五酢酸としても知られる、ポリソルベート８０、および注射用水。
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に低減または増大してもよい。投与の容易性および投与形の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療されている対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生産するよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記載される投与単位形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。
抗体の投与のために、投薬量は、約０．０００１～１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通例的には、０．０１～５ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲に及び得る。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇ、もしくは１０ｍｇ／体重１ｋｇ、または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。あるいは、抗体の投与は、２ｍｇ～８００ｍｇの範囲に及び得る一定用量、例えば、２５ｍｇ、８０ｍｇ、２００ｍｇ、または４００ｍｇの用量である。例示的な治療計画は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月間に１回、２ヶ月間に１回、３ヶ月間に１回、４ヶ月間に１回、５ヶ月間に１回、または６ヶ月間に１回の投与を必要とする。いくつかの実施形態では、治療計画は、初回用量、および続いて、間欠的な投薬間隔で、異なる用量の維持用量を含む。
いくつかの実施形態では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合には、投与されるそれぞれの抗体の投薬量は、示された範囲内に入る。いくつかの実施形態では、治療用抗体は、複数の状況で投与される。単一投薬間の間隔は、例えば、毎週、３週間ごと、４週間ごと、毎月、３ヶ月ごと、または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則である場合もある。いくつかの実施形態では、投薬量は、約１～１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法では、約２５～３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するよう調整される。
いくつかの実施形態では、抗体は、持続放出製剤として投与されてもよい。持続放出製剤による投与は、必要とする投与の頻度が低くなり得る。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。投与の投与量および頻度は、治療が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。いくつかの実施形態では、比較的短い間隔で比較的高い投薬量が、治療的処置のために投与される。いくつかの実施形態では、比較的高い投薬量は、疾患の進行が低減または停止されるまで、例えば、患者が、疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、投与される。いくつかの実施形態では、予防的処置は、治療的処置の後に患者に投与される。
本明細書に記載される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るよう変えてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴および医薬の技術分野において周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に応じて変わる。
本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらす。癌に関連して、治療上有効な用量は、好ましくは、癌と関連する身体症状のさらなる増悪を防止する。癌の症状は、当技術分野で周知であり、例えば、普通ではない黒子の特徴、非対称、境界、色および／または直径を含めた黒子の外観の変化、新規に着色した皮膚領域、異常な黒子、爪の下の黒くなった領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、脱力感、過度の疲労、摂食障害、食欲の喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹膜腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。治療効果は、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体の最初の投与の直後に観察することができる場合があるか、または所定の期間および／もしくは一連の投薬の後にしか観察されない場合がある。そのような遅延効果は、処置の数ヶ月後、例えば、最大６、９、または１２ヶ月後にしか観察されない場合がある。
疾患の早期または先行する徴候が存在する場合に望まれ得るような治療上有効な用量は、癌の発生を防ぐかまたは遅延し得る。したがって、前記のうちいずれかをモニタリングする任意の臨床または生化学アッセイを使用して、特定の治療が、癌を治療するための治療上有効な用量であるか否かを調べてもよい。当業者ならば、対象の大きさ、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択された投与経路のような因子に基づいてこのような量を決定できるであろう。
本明細書に記載される組成物は、当技術分野で公知の１種または複数の種々の方法を使用して、１種または複数の投与経路によって投与できる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載される抗体の例示的な投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。
あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸性、舌下にまたは局所になど、非経口ではない経路によって投与できる。
留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など、活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
治療用組成物は、当技術分野において公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同５，３８３，８５１号、同５，３１２，３３５号、同５，０６４，４１３号、同４，９４１，８８０号、同４，７９０，８２４号、または同４，５９６，５５６号に開示されるデバイスなどの注射針なし皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体で使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として、制御された速度で医薬を分配するための埋込み可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号が挙げられる。；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する同４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する同４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋込み可能注入器具を開示する同４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするよう製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本明細書に記載される治療用化合物が、ＢＢＢを通過することを確実にするために（必要に応じて）、それらを、例えば、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームを作製する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同５，３７４，５４８号、および同５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送され、したがって、標的化された薬物送達を増強する１つまたは複数の部分を含み得る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと）。例示的標的化部分として、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
本明細書に記載される抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子、またはイムノコンジュゲート）および使用のための説明書を含む、キットもまた、本明細書に記載の範囲内に含まれる。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬、または１つもしくは複数の本明細書に記載されるさらなるヒト抗体をさらに含み得る。キットは、キットの内容物の意図される使用を示す表示を含み得る。用語表示は、キット上にもしくはキットとともに供給されるか、またはそうでなければキットに添付されている任意の文書または記録材料を含む。
Ｘ．使用の方法
本明細書に記載される抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断することによる免疫応答の増強を含む、多数のインビトロおよびインビボでの用途がある。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、モノクローナルヒトまたはヒト化抗体である。一実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１）は、インビトロもしくはエキソビボで培養液中の細胞に、または種々の疾患において免疫性を増強するためにヒト対象に、投与することができる。具体的な実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、アンタゴニスト抗体である。対象において免疫応答を修飾する方法であって、対象において免疫応答が増強、刺激、または上方制御されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を投与することにより、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞応答が増強される。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を投与することにより、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激、増強、または上方制御される。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞、および細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞であり得る。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。特定の実施形態では、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、非免疫原性である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陽性である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陰性である。対象はまた、ウイルスを有する対象であり得、ウイルスに対する免疫応答が増強される。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を投与することにより、ＮＫ細胞応答が刺激、増強、または上方制御される。
一実施形態では、方法は、ヒト対象における免疫応答の増強をもたらし、そのような増強は、望ましい効果を有する。一実施形態では、ヒト対象は、免疫応答、例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答を増強することによって治療することができる障害を有するヒト患者である。具体的な実施形態では、ヒト患者は、癌を有する。一実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、対象の抗原と一緒に投与できるか、または抗原が、治療されるべき対象、例えば、腫瘍を有するかもしくはウイルスを有する対象においてすでに存在していてもよい。抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合には、２種は、別個に投与することも、同時に投与することもできる。
対象において腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、腫瘍細胞の成長が、対象、例えば、ヒト対象において阻害されるように、対象に、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を投与することを含む、方法が、さらに提供される。また、対象において慢性ウイルス感染を治療する方法であって、慢性ウイルス感染が、対象、例えば、ヒト対象において治療されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を投与することを含む、方法も提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、補助療法、アジュバント療法、またはネオアジュバント療法として、対象、例えば、ヒト患者に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いた癌を有する対象の治療は、現在の標準治療と比較して長期間耐久性のある応答、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれ以上の長期間の生存、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年またはそれ以上の再発のない生存をもたらし得る。特定の実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を用いた癌を有する対象の治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０年間またはそれ以上、癌の再発を予防するか、または癌の再発を遅延させる。抗ＮＫＧ２Ａ治療は、第１選択肢、第２選択肢、またはそれ以降の選択肢の治療として使用することができる。
本明細書に記載されるこれらおよびその他の方法は、以下にさらに詳述される。
癌
癌を有する対象を治療するための方法であって、対象が治療されるように、例えば、癌性腫瘍の成長が阻害もしくは低減される、および／または腫瘍が退縮するように、対象に、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。抗ＮＫＧ２Ａ抗体を単独で使用して、癌性腫瘍の成長を阻害することができる。あるいは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、別の薬剤、例えば、以下に記載されるような、その他の免疫原性剤、標準癌治療、またはその他の抗体とともに使用することができる。ＰＤ－１の阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せもまた、提供される。ＣＴＬＡ－４の阻害剤、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体との組合せもまた、提供される。ＰＤ－１の阻害剤およびＣＴＬＡ－４の阻害剤との組合せもまた、提供される。ＩＣＯＳのアゴニスト抗体との組合せもまた、提供される。
一態様では、対象における癌を治療する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体であり得る。一実施形態では、本明細書に記載される癌を治療する方法は、
（ａ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）；
（ｂ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）；
（ｃ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）；および
（ｄ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＮＫＧ２Ａと接触する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を投与することを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される癌を治療する方法は、
（ａ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）；
（ｂ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）；
（ｃ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）；
（ｄ）L;および
（ｅ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＮＫＧ２Ａと接触する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を投与することを含む。
別の実施形態では、方法は、癌を治療するためにＮＫＧ２Ａ．９抗体を投与することを含む。別の実施形態では、方法は、癌を治療するために１３Ｆ３．Ａ４抗体を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態では、方法は、癌を治療するためにＮＫＧ２Ａ．１１抗体を投与することを含む。別の実施形態では、方法は、癌を治療するためにＮＫＧ２Ａ．９抗体を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態では、方法は、癌を治療するためにＮＫＧ２Ａ．１１抗体を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態では、方法は、癌を治療するために１３Ｆ３．Ａ４抗体またはその変異体を投与することを含む。別の実施形態では、方法は、癌を治療するために１３Ｆ３．Ａ４抗体またはその変異体を含む組成物を投与することを含む。
癌の例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎癌（例えば、明細胞癌）、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌）、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、神経膠芽腫（多型神経膠芽腫）、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌腫および頭頸部癌（または癌腫）、胃癌（gastric cancer）、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、上皮小体腺の癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳癌、例えば、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導性癌、ウイルス関連癌（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）および２種の主要な血液細胞系統のいずれか、すなわち、骨髄系細胞株（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する）またはリンパ球系細胞株（Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する）に由来する血液悪性腫瘍、例えば、すべての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（Ｍ０）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変異体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ球系組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ １＋）大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる）およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（低悪性度骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫を含めたその他の腫瘍、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；好ましくは、Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜種）；血管中心性（鼻腔の）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記の癌の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載される方法はまた、転移性癌、難治性癌（例えば、遮断性ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１抗体を用いる、例えば、これまでの免疫療法に対して難治性の癌）および再発性癌の治療のために使用してもよい。
一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、単剤療法として投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体は、唯一の免疫賦活性薬剤として投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａは、別の薬剤とともに患者に投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、免疫原性剤とともに投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、癌ワクチンとともに投与される。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、癌性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞を含む（He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28）。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、ペプチド癌ワクチンであり、これは、いくつかの実施形態では、個別化されたペプチドワクチンである。いくつかの実施形態では、ペプチド癌ワクチンは、多価長鎖ペプチド、多重ペプチド、ペプチドカクテル、ハイブリッドペプチド、またはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである（例えば、Yamada et al., Cancer Sci, 104:14-21, 2013を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、アジュバントとともに投与される。使用される腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１、および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている（Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62;Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302;Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428;Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738を参照のこと; DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition中のRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと）。これらの戦略のうちの１つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ－ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であるとわかっている。ＧＭ－ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであるとわかっている。Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43。
その他の癌ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、ならびにカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒト癌に関わるウイルスに由来するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａ阻害とともに使用される腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達で高度に効率的である（Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588;Tamura et al. (1997) Science 278:117-120）。
いくつかの実施形態では、樹状細胞は、抗原特異的応答をプライムするために使用される強力な抗原提示細胞である。樹状細胞は、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載させることができる（Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。樹状細胞はまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝的手段によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫処置を目的として腫瘍細胞と直接融合されている（Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化（放出）するよう、樹状細胞免疫処置を、抗ＮＫＧ２Ａ抗体と効果的に組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａは、標準治癒治療、例えば、外科手術、放射線照射、および／または化学療法とともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、化学療法剤とともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ｎａｂ－パクリタキセル、ゲムシタビン、またはＦＯＬＦＯＸのうちの１つまたは複数とともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、カルボプラチンまたはｎａｂ－パクリタキセルとともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、カルボプラチンおよびパクリタキセルととともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、シスプラチンおよびペメトレキセドとともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、シスプラチンおよびゲムシタビンとともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ＦＯＬＦＯＸとともに投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ＦＯＬＦＩＲＩとともに投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、黒色腫の処置のためにダカルバジンとともに投与される。いくつかの実施形態では、シスプラチンは、４週間に１回の１００ｍｇ／ｍｌの用量として、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジン、および／またはシクロホスファミドヒドロキシ尿素とともに投与される。いくつかの実施形態では、アドリアマイシンは、２１日間に１回の６０ｍｇ／ｍｌ～７５ｍｇ／ｍｌの用量として静脈内投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、少なくとも１つの薬物での治療に耐性であるヒト患者に投与され、ここで、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の投与は、少なくとも１つの薬物に対する耐性を低減、軽減、または抑制する。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、アゴニスト抗体、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体とともに投与される。
上述の併用療法は、互いに種々の組合せで投与することができ、組合せ投与（２つ以上の治療剤が、同じかまたは別個の製剤に含まれる）および別個の投与が包含され、別個の投与の場合には、本発明の抗体の投与は、さらなる治療剤および／またはアジュバントの投与の前、それと同時、および／またはその後に、生じ得る。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
いくつかの実施形態では、そのような組合せの別の例は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と組み合わせて投与される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびＩＬ－２の組合せは、腎細胞癌および黒色腫の治療のためを含む、種々の癌を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書において論じられる抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、種々の癌を治療するために、ＩＬ－２経路アゴニストと組み合わされる。組合せとしては、種々のＩＬ－２経路アゴニスト、例えば、ＷＯ２０１２／０６５０８６（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）およびＷＯ２０１５／１２５１５９（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に記載されるものが挙げられ、これらの内容は、参照によりその全体が組み込まれる。ＷＯ２００６／１３８５７２（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、分解可能な連結を有するコンジュゲートおよびそのようなコンジュゲートを調製するのに有用な重合試薬、ならびに重合試薬およびコンジュゲートを作製する方法を提供し、参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体、例えば、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、または１３Ｆ３．Ａ４抗体と、ＩＬ－２経路アゴニスト、例えば、ＮＫＴＲ－２１４との組合せは、癌を治療するために患者に投与される。以下により詳細に記載されるように、ＮＫＴＲ－２１４は、以下の構造（ｍＰＥＧ２－Ｃ２－ｆｏｍｃ－２０Ｋ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミデート誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２－Ｃ２－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳ」）：
を有する、平均でおよそ６つのＦＭＯＣ（フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド）に基づくポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬を、
以下の１３２アミノ酸配列を有するタンパク質にコンジュゲートすることによって産生される。
（配列番号１６１）
ＷＯ２０１２／０６５０８６は、ＩＬ－２部分と、ポリエチレングリコールまたはその誘導体を含む１つまたは複数の非ペプチド水溶性ポリマーとのコンジュゲートを提供する。具体的には、ＷＯ２０１２／０６５０８６の実施例２（段落２０２～２０４）は、上記に示されたｍＰＥＧ２－Ｃ２－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳ構造を得るためのｍＰＥＧ２－Ｃ２－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳを用いたｒＩＬ－２のペグ化について記載している。ＷＯ２０１５／１２５１５９の実施例１（段落６３～６６）は、ＲＳＬＡＩＬ－２（ＮＫＴＲ－２１４）が得られるｍＰＥＧ２－Ｃ２－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳを用いたＩＬ－２のペグ化のための規模拡大したアプローチについて記載している。ＮＫＴＲ－２１４は、抗腫瘍効果を促進するためにこれらの細胞を増殖させるために、特定の免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞）に見出されるタンパク質であるＣＤ１２２（インターロイキン－２受容体ベータサブユニット、ＩＬ－２Ｒβとしても知られる）を標的とするように設計されたサイトカインである。
いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、抗血管新生剤と組み合わせて投与される。
細胞死によって本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体との相乗作用をもたらし得るその他の併用療法としては、放射線照射、外科手術、およびホルモン欠乏がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、二重特異性抗体とともに投与される。二重特異性抗体を使用して、２種の異なる抗原を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、腫瘍細胞を治療するために、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用される（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同５，８３７，２４３号を参照のこと）。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ）二重特異性抗体が、マクロファージを腫瘍の部位へと標的化するために使用されている。いくつかの実施形態では、これらの応答のＴ細胞アームは、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の機能的活性によって増大される。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によって、ＤＣに直接送達される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、腫瘍によって発現される免疫抑制タンパク質を低減または不活性化する抗体、例えば、抗ＴＧＦ－β抗体、抗ＩＬ－１０抗体、および抗Ｆａｓリガンド抗体と組み合わせて使用される。
感染性疾患
別の態様では、本明細書に記載される発明は、ヒト対象を含む対象における感染性疾患を治療する方法であって、対象が感染性疾患について治療されるように、対象に、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法を提供する。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
本明細書において論じられるその腫瘍の治療と同様に、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、慢性ウイルス感染症を治療するためを含め、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を増強するために、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて、投与することができる。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例として、現在有効なワクチンが存在しない病原体または従来のワクチンが完全に有効とまではいかない病原体が挙げられる。これらの病原体は、それだけには限らないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢおよびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ状球菌（staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスの例として、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌の例として、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（pneumonococci）、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌が挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌の例として、カンジダ（Candida）（アルビカンス（albicans）、クルゼイ（krusei）、グラブラータ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis)など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス（Aspergillus）（フミガツス（fumigatus）、ニガー（niger）など）、ケカビ目（Mucorales）の属（ケカビ属（mucor）、ユミケカビ属（absidia）、クモノスカビ属（rhizopus））、スポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenkii）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、南アメリカ分芽菌（Paracoccidioides brasiliensis）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）が挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物の例として、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸バランチジウム（Balantidium coli）、フォーラーネグレリア（Naegleriafowleri）、アカントアメーバ属（Acanthamoeba）の種、ランブル鞭毛虫（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium）の種、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、ネズミバベシア（Babesia microti）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、ブラジル鉤虫（Nippostrongylus brasiliensis）が挙げられる。
対象に抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を投与する本明細書に記載される方法は、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２）、または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法などのその他の形態の免疫療法と組み合わせることができる（例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123を参照されたい）。
自己免疫反応
いくつかの態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、自己免疫応答を増大させる。腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用した抗腫瘍応答の誘導により、多くの抗腫瘍応答には、抗自己反応性が関与することがわかっている（van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489、Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987、Hurwitz, (2000)前掲、Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4）。したがって、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、疾患の治療のためのこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成するワクチン接種プロトコールを考案するために、これらの自己タンパク質とともに使用される。例えば、アルツハイマー病は、脳内でのアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適切な蓄積を伴い、アミロイドに対する抗体応答により、これらのアミロイド沈着を除去することができる（Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177）。
他の自己タンパク質もまた、アレルギーおよび喘息の治療についてはＩｇＥおよびリウマチ性関節炎についてはＴＮＦαなど、標的として使用することができる。最終的には、種々のホルモンに対する抗体応答が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の使用によって誘導され得る。生殖ホルモンに対する抗体応答の中和は、受胎調節に使用できる。ホルモンおよび特定の腫瘍の成長に必要とされる他の可溶性因子に対する抗体応答の中和は、さらなるワクチン接種標的である。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の使用についての上記のような類似の方法は、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着、ＴＮＦαなどのサイトカインおよびＩｇＥなど他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者を治療するための治療的自己免疫応答の誘導に使用できる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、対象の抗原（例えば、ワクチン）とともに抗ＮＫＧ２Ａ抗体を投与して、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用される。したがって、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に、（ｉ）抗原、および（ｉｉ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。抗体は、ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、本明細書に記載されるヒト抗ＮＫＧ２Ａ抗体のうちのいずれか）であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体に由来する抗原であり得る。このような抗原の限定されない例として、本明細書で論じられた腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）または本明細書に記載されるウイルス、細菌もしくはその他の病原体に由来する抗原などの本明細書の節において論じられたものが挙げられる。
特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の代わりに、または抗ＮＫＧ２Ａ抗体に加えて、ワクチンとして使用される。
インビボおよびインビトロで、本明細書に記載される、抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート）を投与する適した経路は、当技術分野で周知であり、当業者ならば選択できる。例えば、抗体組成物は、静脈内または皮下経路によって投与できる。使用される組成物の適した投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に応じて変わる。
これまでに記載したように、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、１種またはその他の複数の治療薬、例えば、細胞傷害性薬剤、放射性毒性薬剤（radiotoxic agent）または免疫抑制剤と同時投与できる。抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、薬剤と連結できる（免疫複合体として）か、または薬剤と別個に投与できる。後者の場合には（別個の投与）、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、薬剤の前に、後に、もしくは同時に投与することができるか、またはその他の公知の療法、例えば、抗癌療法、例えば、化学療法および／もしくは放射線照射と共投与することができる。このような治療薬として、中でも、それ自体では、患者とって毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗腫瘍、抗新生物薬剤が挙げられる。シスプラチンは、１００ｍｇ／ｍｌの用量で４週間に１回静脈内に投与され、アドリアマイシンは、６０～７５ｍｇ／ｍｌの用量で２１日間に１回静脈内に投与される。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片の、化学療法剤との共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害性効果をもたらす異なる機序によって作動する２種の抗癌剤を提供する。そのような共投与は、薬物に対する耐性の発生、または抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決し得る。
本明細書に記載される抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子、またはイムノコンジュゲート）および使用のための説明書を含む、キットもまた、本明細書に記載の範囲内に含まれる。キットは、少なくとも１種のさらなる試薬または１種もしくは複数のさらなる本明細書に記載されるヒト抗ＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、第１のヒト抗体とは別個のＮＫＧ２Ａ抗原中のエピトープと結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含有し得る。キットは、通常、キットの内容物の意図される使用を示す表示を含む。用語表示は、キット上にもしくはキットとともに供給された、またはそうでなければキットに添付されている任意の文書または記録材料を含む。
併用療法
一態様では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を、１つまたは複数のさらなる薬剤、例えば、免疫応答を刺激するのに有効である抗体とともに投与し、それによって、ヒト対象を含む対象において免疫応答を増強、刺激、または上方制御する、併用治療の方法、例えば、癌の治療のための方法が、本明細書において提供される。個体における癌を治療するかまたはその進行を遅延させるための方法であって、個体に、別の抗癌剤または癌療法とともに抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１１、および１３Ｆ３．Ａ４）を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、上述のように、化学療法もしくは化学療法剤、または放射線療法もしくは放射線療法剤とともに投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、アゴニスト抗体、例えば、抗ｈＩＣＯＳ抗体とともに投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、標的化療法または標的化療法剤とともに投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、免疫療法または免疫療法剤、例えば、モノクローナル抗体とともに投与され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、（ｉ）別の共刺激受容体のアゴニスト、および／または（ｉｉ）Ｔ細胞における阻害性シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体とアゴニストおよび／またはアンタゴニストとを含む併用療法は、対象における抗原特異的Ｔ細胞応答の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、免疫応答を増大させるために、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである共刺激性および共阻害性分子を標的とする薬剤とともに投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、共刺激性または共阻害性分子のリガンドを標的とする薬剤とともに投与され得る。共刺激性または共阻害性受容体と結合する膜結合リガンドのファミリーとして、Ｂ７ファミリーがあり、これは、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳ－Ｌ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、およびＢ７－Ｈ６を含む。共刺激または共阻害性受容体と結合する膜結合リガンドの別のファミリーとして、同種ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーと結合するＴＮＦファミリーの分子があり、これは、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む。
別の態様では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、免疫応答を刺激するため、例えば、増殖性疾患、例えば、癌を治療するために、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、もしくはその他の「免疫抑制性サイトカイン」のアンタゴニスト、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインと組み合わせて使用することができる。
一態様では、Ｔ細胞応答は、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ－１、およびＴＩＭ－４のアンタゴニスト、ならびに（ｉｉ）Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＤＲ３、およびＣＤ２８Ｈのアゴニストのうちの１つまたは複数との組合せによって、刺激される。
上述のタンパク質のうちのいずれかを調節し、癌を治療するために、抗ｈＮＫＧ２Ａ、例えば本明細書に記載されるものと組み合わせることができる、例示的な薬剤としては、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）／イピリムマブもしくはトレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４に対する）、ガリキシマブ（Ｂ７．１に対する）、ＢＭＳ－９３６５５８（ＰＤ－１に対する）、ピディリズマブ／ＣＴ－０１１（ＰＤ－１に対する）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）／ペンブロリズマブ／ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１に対する）、ＡＭＰ２２４（Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２に対する）、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂ７－Ｈ１に対する）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｂ７－Ｈ１に対する）、ＣＰ－８７０８９３もしくはダセツズマブ／ＳＧＮ－４０（ＣＤ４０－Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309、Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035）、ＡＭＧ５５７（Ｂ７Ｈ２に対する）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する－ＷＯ１１／１０９４００）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ－３に対する）、ウレルマブ／ＢＭＳ－６６３５１３およびＰＦ－０５０８２５６６（ＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する）、バルリルマブ／ＣＤＸ－１１２７（ＣＤ２７に対する）、ＭＥＤＩ－６３８３およびＭＥＤＩ－６４６９（ＯＸ４０に対する）、ＲＧ－７８８８（ＯＸ４０Ｌに対する－ＷＯ０６／０２９８７９）、アタシセプト（ＴＡＣＩに対する）、ムロモナブ－ＣＤ３（ＣＤ３に対する）、イピルムマブ（ipilumumab）（ＣＴＬＡ－４に対する）が挙げられる。したがって、一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、ＮＫＧ２Ａ．９）は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ）および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）と組み合わされる。
癌の治療のために抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と組み合わせることができるその他の分子として、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えば、リリルマブ（lirilumab））と組み合わせることができる。
併用療法のためのさらにその他の薬剤として、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤、それだけには限らないが、ＲＧ７１５５（ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４）またはＦＰＡ－００８（ＷＯ１１／１４０２４９、ＷＯ１３／１６９２６４、ＷＯ１４／０３６３５７）を含めたＣＳＦ－１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ－１Ｒアンタゴニストが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、正の共刺激性受容体とライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断剤、ならびに一種または複数の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる薬剤、腫瘍微小環境内の別個の免疫抑制経路を克服する（例えば、阻害性受容体の関与（例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用）を遮断するか、Ｔｒｅｇを枯渇もしくは阻害するか（例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）（例えば、ダクリズマブ）を使用してもしくはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって）、代謝酵素、例えば、ＩＤＯを阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転／防止する）薬剤、ならびに先天性免疫活性化および／または腫瘍部位における炎症をトリガーする薬剤のうちの一種または複数と一緒に、使用される。
例えば、腫瘍成長を阻害するよう、または抗ウイルス性応答を刺激するよう、対象において免疫応答が刺激されるように、対象に、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体ならびにＰＤ－１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／またはＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体などの１種または複数のさらなる免疫賦活性抗体を投与することを含む、対象において免疫応答を刺激するための方法が本明細書において提供される。一実施形態では、対象は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体を投与される。一実施形態では、対象は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与される。一実施形態では、対象は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与される。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体（例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ－１、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体）は、ヒト抗体である。あるいは、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウスまたはハムスター抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製された）であり得る。
抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびアンタゴニストＰＤ－１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸癌（ＣＲＣ）である。いくつかの実施形態では、癌は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｅレベルの上昇、および／または（ｉｉ）高い腫瘍突然変異量を有する腫瘍によって特徴付けられる。特定の実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ－１抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。免疫賦活性薬剤を用いた過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法もまた、本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体および治療用量以下の抗ＰＤ－１抗体を、対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、当技術分野において公知である抗ＰＤ－１抗体が、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体と組み合わせて、本明細書に記載される方法において使用される。高い親和性でＰＤ－１と特異的に結合する種々のヒトモノクローナル抗体が、米国特許第８，００８，４４９号に開示されている。米国特許第８，００８，４４９号に開示されている抗ＰＤ－１ヒト抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を示すことが実証されている：（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴によって判定される場合、１×１０－７Ｍ以下のＫＤで、ヒトＰＤ－１と結合すること、（ｂ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、またはＩＣＯＳと実質的に結合しないこと、（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を増大させること、（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいて、インターフェロン－γ産生を増大させること、（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＬ－２分泌を増大させること、（ｆ）ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１と結合すること、（ｇ）ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１との結合を阻害すること、（ｈ）抗原特異的メモリー応答を刺激すること、（ｉ）抗体応答を刺激すること、ならびに（ｊ）インビボで腫瘍細胞成長を阻害すること。本発明において使用可能な抗ＰＤ－１抗体としては、ヒトＰＤ－１と特異的に結合し、前述の特徴のうちの少なくとも１つ、いくつかの実施形態では少なくとも５つを示す、モノクローナル抗体が挙げられる。
その他の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第６，８０８，７１０号、同第７，４８８，８０２号、同第８，１６８，７５７号、および同第８，３５４，５０９号、米国公開第２０１６／０２７２７０８号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２００８／１５６７１２、ＷＯ２０１５／１１２９００、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１４／２０６１０７、ＷＯ２０１５／３５６０６、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１７／０２０２９１、ＷＯ２０１７／０２０８５８、ＷＯ２０１６／１９７３６７、ＷＯ２０１７／０２４５１５、ＷＯ２０１７／０２５０５１、ＷＯ２０１７／１２３５５７、ＷＯ２０１６／１０６１５９、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１７／０４０７９０、ＷＯ２０１７／１３３５４０、ＷＯ２０１７／１３２８２７、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１０６０６１、ＷＯ２０１７／１９８４６、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５、およびＷＯ２０１７／１３３５４０に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、およびＯＮＯ－４５３８としても知られている）、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブロリズマブ、およびＭＫ－３４７５としても知られている、ＷＯ２００８／１５６７１２を参照のこと）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＷＯ２０１５／１１２９００を参照のこと）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＡＭＰ－５１４としても知られている、ＷＯ２０１２／１４５４９３を参照のこと）、セミピリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、ＲＥＧＮ－２８１０としても知られている、ＷＯ２０１５／１１２８００を参照のこと）、ＪＳ００１（ＴＡＩＺＨＯＵ ＪＵＮＳＨＩ ＰＨＡＲＭＡ、Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照のこと）、ＢＧＢ－Ａ３１７（Ｂｅｉｇｅｎｅ、ＷＯ２０１５／３５６０６および米国第２０１５／００７９１０９号を参照のこと）、ＩＮＣＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＳＨＲ－１２１０としても知られている、ＷＯ２０１５／０８５８４７、Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照のこと）、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、ＡＮＢ０１１としても知られている、ＷＯ２０１４／１７９６６４を参照のこと）、ＧＬＳ－０１０（Ｗｕｘｉ／Ｈａｒｂｉｎ Ｇｌｏｒｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＷＢＰ３０５５としても知られている、Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照のこと）、ＡＭ－０００１（Ａｒｍｏ）、ＳＴＩ－１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＷＯ２０１４／１９４３０２を参照のこと）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ、ＷＯ２０１７／０４０７９０を参照のこと）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ、ＷＯ２０１７／１９８４６を参照のこと）、またはＩＢＩ３０８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５、およびＷＯ２０１７／１３３５４０を参照のこと）である。
一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブは、ＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）との相互作用を選択的に防止し、それによって、抗腫瘍Ｔ細胞機能の下方制御を遮断する、完全ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤抗体である（米国特許第８，００８，４４９号、Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56）。
別の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブは、ヒト細胞表面受容体ＰＤ－１（プログラム死－１またはプログラム細胞死－１）を対象とするヒト化モノクローナルＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）抗体である。ペンブロリズマブは、例えば、米国特許第８，３５４，５０９号および同第８，９００，５８７号に記載されている。
開示される方法において使用可能な抗ＰＤ－１抗体としてはまた、ヒトＰＤ－１と特異的に結合し、ヒトＰＤ－１との結合について、本明細書において開示される任意の抗ＰＤ－１抗体、例えば、ニボルマブと交差競合する、単離された抗体が挙げられる（例えば、米国特許第８，００８，４４９号および同第８，７７９，１０５号、ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、本明細書に記載される抗ＰＤ－１抗体、例えば、ニボルマブと同一のエピトープと結合する。抗原との結合について交差競合する抗体の能力は、これらのモノクローナル抗体が、抗原の同一のエピトープ領域と結合し、他の交差競合する抗体のその特定のエピトープ領域との結合を立体的に妨害することを示す。これらの交差競合する抗体は、ＰＤ－１の同一のエピトープ領域との結合を踏まえると、参照抗体、例えば、ニボルマブのものと非常に類似する機能的特性を有することが予測される。交差競合する抗体は、標準的なＰＤ－１結合アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーにおいて、ニボルマブと交差競合する能力に基づいて容易に特定することができる（例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照されたい）。
特定の実施形態では、ヒトＰＤ－１との結合について、ヒトＰＤ－１抗体、ニボルマブと交差競合するか、またはそれと同一のエピトープ領域と結合する抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト対象への投与に関して、これらの交差競合する抗体は、キメラ抗体、遺伝子操作された抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体である。そのようなキメラ、遺伝子操作、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製および単離することができる。
開示される発明の方法において使用可能な抗ＰＤ－１抗体としてはまた、上述の抗体の抗原結合部分が挙げられる。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが十分に示されている。
開示される方法または組成物における使用に好適な抗ＰＤ－１抗体は、高い特異性および親和性でＰＤ－１と結合し、ＰＤ－Ｌ１およびまたはＰＤ－Ｌ２の結合を遮断し、ＰＤ－１シグナル伝達経路の免疫抑制作用を阻害する、抗体である。本明細書において開示される組成物または方法のいずれにおいても、抗ＰＤ－１「抗体」は、ＰＤ－１受容体と結合し、リガンド結合の阻害および免疫系の上方制御に関して完全抗体のものと類似の機能的特性を示す、抗原結合部分または断片を含む。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－１との結合について、ニボルマブと交差競合する。
抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＮＫＧ２Ａ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、例えば、本明細書において開示される抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。
当技術分野において公知である抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、本開示の方法において使用することができる。本開示の方法において有用な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例は、米国特許第９，５８０，５０７号に開示される抗体を含む。米国特許第９，５８０，５０７号に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１ヒトモノクローナル抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を示すことが実証されている：（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを使用してＳＰＲによって判定される場合、１×１０－７Ｍ以下のＫＤで、ヒトＰＤ－Ｌ１と結合すること、（ｂ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を増大させること、（ｃ）ＭＬＲアッセイにおいて、インターフェロン－γ産生を増大させること、（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいて、ＩＬ－２分泌を増大させること、（ｅ）抗体応答を刺激すること、ならびに（ｆ）Ｔ細胞、エフェクター細胞、および／または樹状細胞上に対する制御性Ｔ細胞の作用を逆転させること。本発明において使用可能な抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、ヒトＰＤ－Ｌ１と特異的に結合し、前述の特徴のうちの少なくとも１つ、いくつかの実施形態では少なくとも５つを示す、モノクローナル抗体が挙げられる。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９（１２Ａ４、ＭＤＸ－１１０５としても知られている、例えば、米国特許第７，９４３，７４３号およびＷＯ２０１３／１７３２２３を参照のこと）、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６としても知られている、米国第８，２１７，１４９号を参照されたく、またHerbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000も参照されたい）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）、ＭＥＤＩ－４７３６としても知られている、ＷＯ２０１１／０６６３８９を参照されたい）、アベルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ、ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃとしても知られている、ＷＯ２０１３／０７９１７４を参照されたい）、ＳＴＩ－１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ、ＷＯ２０１３／１８１６３４を参照されたい）、ＣＸ－０７２（Ｃｙｔｏｍｘ、ＷＯ２０１６／１４９２０１を参照されたい）、ＫＮ０３５（３ＤＭｅｄ／Ａｌｐｈａｍａｂ、Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)を参照されたい、ＬＹ３３０００５４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏ、例えば、ＷＯ２０１７／０３４９１６を参照されたい）、またはＣＫ－３０１（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)を参照されたい）である。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））である。アテゾリズマブは、完全ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（商標））である。デュルバルマブは、ヒトＩｇＧ１カッパモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））である。アベルマブは、ヒトＩｇＧ１ラムダモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
他の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、２８－８、２８－１、２８－１２、２９－８、５Ｈ１、またはこれらの任意の組合せである。
開示される方法において使用可能な抗ＰＤ－Ｌ１抗体としてはまた、ヒトＰＤ－Ｌ１と特異的に結合し、ヒトＰＤ－Ｌ１との結合について、本明細書において開示される任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、および／またはアベルマブと交差競合する、単離された抗体も挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のうちのいずれか、例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、および／またはアベルマブと同一のエピトープと結合する。抗原との結合について交差競合する抗体の能力は、これらの抗体が、抗原の同一のエピトープ領域と結合し、他の交差競合する抗体のその特定のエピトープ領域との結合を立体的に妨害することを示す。これらの交差競合する抗体は、ＰＤ－Ｌ１の同一のエピトープ領域との結合を踏まえると、参照抗体、例えば、アテゾリズマブおよび／またはアベルマブのものと非常に類似する機能的特性を有することが予測される。交差競合する抗体は、標準的なＰＤ－Ｌ１結合アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーにおいて、アテゾリズマブおよび／またはアベルマブと交差競合する能力に基づいて容易に特定することができる（例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照されたい）。
特定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１との結合について、ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、および／またはアベルマブと交差競合するか、またはそれと同一のエピトープ領域と結合する、抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト対象への投与に関して、これらの交差競合する抗体は、キメラ抗体、遺伝子操作された抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体である。そのようなキメラ、遺伝子操作、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製および単離することができる。
開示される発明の方法において使用可能な抗ＰＤ－Ｌ１抗体としてはまた、上述の抗体の抗原結合部分が挙げられる。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが十分に示されている。
開示される方法または組成物における使用に好適な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、高い特異性および親和性でＰＤ－Ｌ１と結合し、ＰＤ－１の結合を遮断し、ＰＤ－１シグナル伝達経路の免疫抑制作用を阻害する、抗体である。本明細書において開示される組成物または方法のいずれにおいても、抗ＰＤ－Ｌ１「抗体」は、ＰＤ－Ｌ１と結合し、受容体結合の阻害および免疫系の上方制御に関して完全抗体のものと類似の機能的特性を示す、抗原結合部分または断片を含む。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１との結合について、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、および／またはアベルマブと交差競合する。
一実施形態では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、第３の免疫療法剤（例えば、抗ＩＣＯＳ抗体、例えば、ＩＣＯＳ．３３ ＩｇＧ１ｆ Ｓ２６７Ｅ（米国特許第１０，２５１，９４５号に記載されている）、ニボルマブおよびイピリムマブと組み合わされる）と組み合わせて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のアンタゴニスト、例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、ニボルマブ、ＭＤＸ１１０６としても知られ、ＷＯ０６／１２１１６８に記載されている）、またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストと組み合わされる。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（イピリムマブまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載される）またはトレメリムマブ（前のチシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６）である。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ－４０アンタゴニスト、例えば、本明細書において開示される抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０抗体である。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、アゴニストＧＩＴＲ抗体である。好適なＧＩＴＲ抗体としては、例えば、ＢＭＳ－９８６１５３、ＢＭＳ－９８６１５６、ＴＲＸ－５１８（ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６）、およびＭＫ－４１６６（ＷＯ１１／０２８６８３）が挙げられる。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。好適なＩＤＯアンタゴニストとして、例えば、ＩＮＣＢ－０２４３６０（ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２）、インドキシモド（indoximod）、またはＮＬＧ－９１９（ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７）が挙げられる。
本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
当技術分野において公知である抗ＣＴＬＡ－４抗体を、本開示の方法において使用することができる。本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＴＬＡ－４のヒトＢ７受容体との相互作用を破壊するように、ヒトＣＴＬＡ－４と結合する。ＣＴＬＡ－４のＢ７との相互作用により、ＣＴＬＡ－４受容体を有するＴ細胞の不活性化をもたらすシグナルが伝達されるため、この相互作用の破壊は、そのようなＴ細胞の活性化を効果的に誘導、増強、または延長し、それによって、免疫応答を誘導、増強、または延長する。
高い親和性でＣＴＬＡ－４と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体は、米国特許第６，９８４，７２０号に開示されている。その他の抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第５，９７７，３１８号、同第６，０５１，２２７号、同第６，６８２，７３６号、および同第７，０３４，１２１号、ならびに国際公開ＷＯ２０１２／１２２４４４、ＷＯ２００７／１１３６４８、ＷＯ２０１６／１９６２３７、およびＷＯ２０００／０３７５０４に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明に有用な抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、ヒトＣＴＬＡ－４と特異的に結合し、前述の特徴のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを示す、モノクローナル抗体が挙げられる。
特定の実施形態では、ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、ＭＤＸ－０１０、１０Ｄ１としても知られる、米国特許第６，９８４，７２０号を参照されたい）、ＭＫ－１３０８（Ｍｅｒｃｋ）、ＡＧＥＮ－１８８４（Ａｇｅｎｕｓ Ｉｎｃ．、ＷＯ２０１６／１９６２３７を参照されたい）、またはトレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、チシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６としても知られる、ＷＯ２０００／０３７５０４およびRibas, Update Cancer Ther. 2(3): 133-39 (2007)を参照されたい）である。具体的な実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブである。
具体的な実施形態では、ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書において開示される方法において使用するためにはイピリムマブである。イピリムマブは、ＣＴＬＡ－４のそのＢ７リガンドとの結合を遮断し、それによって、Ｔ細胞活性化を刺激し、進行性黒色腫を有する患者において全生存期間（ＯＳ）を向上させる、完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。
具体的な実施形態では、ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブである。
具体的な実施形態では、ＣＴＬＡ－４抗体は、ＭＫ－１３０８である。
具体的な実施形態では、ＣＴＬＡ－４抗体は、ＡＧＥＮ－１８８４である。
開示される方法において使用可能な抗ＣＴＬＡ－４抗体はまた、ヒトＣＴＬＡ－４と特異的に結合し、ヒトＣＴＬＡ－４との結合について、本明細書において開示される任意の抗ＣＴＬＡ－４抗体、例えば、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと交差競合する、単離された抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ－４抗体のうちのいずれか、例えば、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと同一のエピトープと結合する。抗原との結合について交差競合する抗体の能力は、これらの抗体が、抗原の同一のエピトープ領域と結合し、他の交差競合する抗体のその特定のエピトープ領域との結合を立体的に妨害することを示す。これらの交差競合する抗体は、ＣＴＬＡ－４の同一のエピトープ領域との結合を踏まえると、参照抗体、例えば、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブのものと非常に類似する機能的特性を有することが予測される。交差競合する抗体は、標準的なＣＴＬＡ－４結合アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーにおいて、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと交差競合する能力に基づいて容易に特定することができる（例えば、ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照されたい）。
特定の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ－４との結合について、ヒトＣＴＬＡ－４抗体、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと交差競合するか、またはそれと同一のエピトープ領域と結合する、抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト対象への投与に関して、これらの交差競合する抗体は、キメラ抗体、遺伝子操作された抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体である。そのようなキメラ、遺伝子操作、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製および単離することができる。
開示される発明の方法において使用可能な抗ＣＴＬＡ－４抗体としてはまた、上述の抗体の抗原結合部分が挙げられる。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが十分に示されている。
開示される方法または組成物における使用に好適な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、高い特異性および親和性でＣＴＬＡ－４と結合し、ＣＴＬＡ－４の活性を遮断し、ＣＴＬＡ－４のヒトＢ７受容体との相互作用を破壊する、抗体である。本明細書において開示される組成物または方法のいずれにおいても、抗ＣＴＬＡ－４「抗体」は、ＣＴＬＡ－４と結合し、ＣＴＬＡ－４のヒトＢ７受容体との相互作用の阻害および免疫系の上方制御に関して完全抗体のものと類似の機能的特性を示す、抗原結合部分または断片を含む。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＴＬＡ－４との結合について、イピリムマブおよび／またはトレメリムマブと交差競合する。
一実施形態では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、第３の免疫療法剤との組合せで、抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わされる。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ－４０アンタゴニスト、例えば、本明細書において開示される抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０抗体である。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、アゴニストＧＩＴＲ抗体である。好適なＧＩＴＲ抗体としては、例えば、ＢＭＳ－９８６１５３、ＢＭＳ－９８６１５６、ＴＲＸ－５１８（ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６）、およびＭＫ－４１６６（ＷＯ１１／０２８６８３）が挙げられる。一実施形態では、第３の免疫療法剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。好適なＩＤＯアンタゴニストとして、例えば、ＩＮＣＢ－０２４３６０（ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２）、インドキシモド（indoximod）、またはＮＬＧ－９１９（ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７）が挙げられる。
抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＬＡＧ－３抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。さらなる実施形態では、アゴニスト抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＬＡＧ－３抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ－３抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、例えば、本明細書において開示される抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例として、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。一実施形態では、抗ＬＡＧ－３抗体は、ＢＭＳ－９８６０１６である。使用できる、その他の抗ＬＡＧ－３抗体として、ＵＳ２０１１／００７０２３またはＩＭＰ－３２１に記載されるＩＭＰ７３１が挙げられる。これらの抗体のうちのいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＬＡＧ－３抗体も、併用治療において使用され得る。
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ－３抗体は、５×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３と結合するか、１×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３と結合するか、５×１０－９Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３と結合するか、または１×１０－８Ｍ～１×１０－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３と結合する。
本明細書に記載される抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体、ならびにＬＡＧ－３および／またはＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１などの１つまたは複数の第２の標的抗原に対する他のアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強する。本開示の抗体を使用して成長が阻害され得る癌として、通常免疫療法に応答性である癌が挙げられる。本明細書に記載される併用療法を用いる治療のための癌の例としては、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を用いた単剤療法の考察において上述されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書において論じられる治療用抗体の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の各抗体を有する別個の組成物として同時に投与できる。別の実施形態では、治療用抗体の組合せを逐次に投与できる。例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ＣＴＬＡ－４抗体を最初に投与し、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を２番目に投与するか、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を最初に投与し、抗ＣＴＬＡ－４抗体を２番目に投与するなど、逐次投与することができる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ－１抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ＰＤ－１抗体を最初に投与し、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を２番目に投与するか、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を最初に投与し、抗ＰＤ－１抗体を２番目に投与するなど、逐次投与することができる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を最初に投与し、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を２番目に投与するか、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を最初に投与し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を２番目に投与するなど、逐次投与することができる。さらに、またはあるいは、抗ＬＡＧ－３抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ＬＡＧ－３抗体を最初に投与し、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を２番目に投与するか、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を最初に投与し、抗ＬＡＧ－３抗体を２番目に投与するなど、逐次投与することができる。
さらに、２以上の用量の併用療法が逐次投与される場合には、逐次投与の順序は、各投与時点で逆転させることができ、同一順序で維持することができ、逐次投与は、同時投与またはその任意の組合せと組み合わせることができる。例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の組合せの第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＣＴＬＡ－４抗体が第１および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が第１および抗ＣＴＬＡ－４抗体が第２で逐次であり得る、など。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ－１抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ－１抗体が最初で抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が２番目の逐次であり得、第３の投与は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が最初で抗ＰＤ－１抗体が２番目の逐次であり得る、などである。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が最初で抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が２番目の逐次であり得、第３の投与は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が最初で抗ＰＤ－Ｌ１抗体が２番目の逐次であり得る、などである。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＬＡＧ－３抗体および抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体の第１の投与は同時であり得、第２の投与は、抗ＬＡＧ－３抗体が最初で抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が２番目の逐次であり得、第３の投与は、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体が最初で抗ＬＡＧ－３抗体が２番目の逐次であり得る、などである。別の代表的な投薬スキームは、抗ｈＮＫＧ２Ａが最初で抗ＣＴＬＡ－４抗体（および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体）が２番目の逐次である第１の投与を含み得、その後の投与は同時であってもよい。
一実施形態では、唯一の免疫療法剤としての抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体と１つもしくは複数のさらなる免疫療法抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４および／もしくは抗ＰＤ－１および／もしくは抗ＰＤ－Ｌ１および／もしくは抗ＬＡＧ－３抗体）との組合せを、癌性細胞などの免疫原性剤、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、ならびに免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞（He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28）とさらに組み合わせることができる。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。（以下にさらに論じられる）。ＩＣＯＳアゴニストならびに１種または複数のさらなる抗体（例えば、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断）はまた、標準癌治療とさらに組み合わせることができる。例えば、ＩＣＯＳアゴニストならびに１種または複数のさらなる抗体（例えば、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断）を、化学療法治療計画と組み合わせることができる。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、黒色腫の治療のために、ダカルバジンと組み合わせた、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体とともに、患者に投与される。一実施形態では、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体は、黒色腫を含む、癌の治療のために、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と組み合わせた、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体とともに、患者に投与される。細胞傷害性によるＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３アンタゴニズムを伴うかまたは伴わずに、組合せの抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体で相乗作用をもたらし得るその他の併用療法としては、放射線照射、外科手術、またはホルモン欠乏が挙げられる。別の実施形態では、血管新生阻害剤を、抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体ならびにＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３アンタゴニズムと組み合わせることができる。
一実施形態では、唯一の免疫治療薬として抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を使用でき、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断抗体の組合せをまた、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体発現性エフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる。例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同５，８３７，２４３号参照。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。
一実施形態では、唯一の免疫治療薬として抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体を使用でき、または抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体およびさらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体の組合せを、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼバリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプルツズマブ（eprtuzumab））、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）などの抗新生物剤とともに使用できる。例として、理論に捉われようとは思わないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートしている抗癌抗体を用いる治療は、癌細胞死（例えば、腫瘍細胞）につながり得、これは、免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＩＣＯＳ抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体によって免疫応答媒介性を増強し得る。一実施形態では、過剰増殖性疾患（例えば、癌腫瘍）の治療は、抗癌剤、例えば、抗体を、同時にまたは逐次またはそれらの任意の組合せで、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体と組み合わせて含み得、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３抗体を伴うかまたは伴わずに、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患（例えば、癌）の治療と関連する有害事象を低減、緩和、または抑制するための方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。本明細書に記載される一実施形態では、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）（Ａｓｔｒａ－Ｚｅｎｅｃａ）は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。クローン病の治療のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の通常の経口投与量は、６～９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、腸管において放出され、その後、腸粘膜において吸収され、保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、肝臓においてシトクロムＰ４５０系によって、無視できるほどのグルココルチコイド活性を有する代謝産物に広範に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、あまり広範ではない初回通過代謝を有するその他のグルココルチコイドと比較して改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身活性化コルチコステロイドよりも少ない視床下部－下垂体抑制を含め、より少ない有害作用しかもたらさない。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の慢性投与は、全身性高コルチコイド症（hypercorticism）および副腎抑制などの全身グルココルチコイド作用をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610を参照のこと。
一実施形態では、非吸収性ステロイドとともに、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３アンタゴニストを伴うか、または伴わない抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸として、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ ＵｐＪｏｈｎ）；オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ ＵｐＪｏｈｎ）；バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬ（登録商標）、Ｓａｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；およびメサラミン（ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ ＵＳ；ＣＡＮＡＳＡ（登録商標）、Ａｘｃａｎ Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．；ＲＯＷＡＳＡ（登録商標）、Ｓｏｌｖａｙ）などの５－ＡＳＡ薬剤が挙げられる。
本明細書に記載される方法に従って、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３抗体および非吸収性ステロイドを伴うか、または伴わない、抗ＮＫＧ２Ａ抗体と組み合わせて投与されるサリチル酸として、免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率の低減を目的とした、サリチル酸および非吸収性ステロイドの任意の重複または逐次投与が挙げられる。したがって、例えば、本明細書に記載される免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率を低減するための方法は、サリチル酸および非吸収性を同時にまたは逐次投与すること（例えば、サリチル酸は、非吸収性ステロイドの６時間後に投与される）、またはその任意の組合せを包含する。さらに、サリチル酸および非吸収性ステロイドを、同一経路によって（例えば、両方を経口投与する）、または異なる経路によって（例えば、サリチル酸を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸に投与する）投与でき、これは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３抗体を投与するために使用される経路（単数または複数）とは異なり得る。
本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体および組合せ抗体療法を、治療されている適応症（例えば、癌）に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤（単数または複数）と逐次使用してもよい。
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体および組合せ抗体療法は、放射線照射、化学療法（例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ－１１）、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン－パクリタキセル（タキソール）、ドキソルビシン、５－ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ（６Ｘ ｃｏｍｂｏ）を使用する）、１種または複数のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２）、１種または複数のＢｃｌ－２阻害剤（例えば、ＢＨ３Ｉ－２’（ｂｃｌ－ｘｌ阻害剤）、インドールアミンジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ２４３６０）、ＡＴ－１０１（Ｒ－（－）－ゴシポール誘導体）、ＡＢＴ－２６３（小分子）、ＧＸ－１５－０７０（オバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ））またはＭＣＬ－１（骨髄系白血病細胞分化タンパク質－１）アンタゴニスト）、ｉＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）アンタゴニスト（例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド（Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15）、ＩＳＩＳ２３７２２（ＬＹ２１８１３０８）またはＡＥＧ－３５１５６（ＧＥＭ－６４０））、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤（例えば、アバスチン（登録商標））、合成トリテルペノイド（Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと）、ｃ－ＦＬＩＰ（細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質）モジュレーター（例えば、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００）、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド（Lenalildomide）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて（例えば、同時または別個に）使用できる。
本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体および組合せ抗体療法は、１種または複数の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
アルキル化剤（制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤（制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）：メトトレキサート、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカププリン、６－チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
当技術分野で公知のその他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、制限するものではないが、タキサン、パクリタキセル（パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬＴＭとして市販されている）、ドセタキセル、ディスコデルモリド（ＤＤＭ）、ジクチオスタチン（ＤＣＴ）、ペロルシド（Peloruside）Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］－デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２，１３－シクロプロピル－エポチロンＡ、Ｃ６－Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス－９，１０－デヒドロエポチロンＤ、シス－９，１０－デヒドロエポチロンＤ、１６－デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモリド（discoderomolide）、パツピロン（patupilone）（ＥＰＯ－９０６）、ＫＯＳ－８６２、ＫＯＳ－１５８４、ＺＫ－ＥＰＯ、ＡＢＪ－７８９、ＸＡＡ２９６Ａ（ディスコデルモリド（discoderomolide））、ＴＺＴ－１０２７（ソブリドチン）、ＩＬＸ－６５１（タシドチン塩酸塩（tasidotin hydrochloride）)、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩（Eribulin mesylate）（Ｅ－７３８９）、ヘミアステリン（ＨＴＩ－２８６）、Ｅ－７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ－３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート（ＤＭ－１）、ＭＫＣ－１、ＡＢＴ－７５１、Ｔ１－３８０６７、Ｔ－９００６０７、ＳＢ－７１５９９２（イスピネシブ（ispinesib））、ＳＢ－７４３９２１、ＭＫ－０７３１、ＳＴＡ－５３１２、エリュテロビン、１７β－アセトキシ－２－エトキシ－６－オキソ－Ｂ－ホモ－エストラ－１，３，５（１０）－トリエン－３－オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４－エピ－７－デヒドロキシ－１４，１６－ジデメチル－（＋）－ディスコデルモリドおよびクリプトチロン（cryptothilone）１と組み合わせるための適した抗増殖性薬剤。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体抗体を用いる治療とともに、またはそれに先立って、例えば、患者に、ホルモンおよびステロイド（合成類似体を含む）、例えば、１７ａ－エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル－テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ＺＯＬＡＤＥＸ（商標）を投与することによって、異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合がある。本明細書に記載される方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
化学療法薬の安全および有効な投与のための方法は、当業者に公知である。さらに、その投与は標準的な文献に記載される。例えば、多数の化学療法薬の投与は、その開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Physicians' Desk Reference (PDR)、例えば、1996年版(Medical Economics Company、Montvale、N.J. 07645-1742、USA)に記載されている。
化学療法薬（単数または複数）および／または放射線療法を、当技術分野で公知の治療用プロトコールに従って投与できる。化学療法薬（単数または複数）および／または放射線療法の投与は、治療されている疾患およびその疾患に対する化学療法薬（単数または複数）および／または放射線療法の公知の効果に応じて変わり得るということは、当業者には明らかであろう。また、熟練した臨床医の知識に従って、患者に対する投与された治療薬の観察された効果を考慮して、また投与された治療薬に対する疾患の観察された応答を考慮して、治療プロトコール（例えば、投与の投与量および時間）を変えることができる。
結果
腫瘍応答は、例えば、ＮＣＩによって確立された、修正されたＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ （ＲＥＣＩＳＴ）によって、判定される。
標的病変部に関して、治療法に対する応答として、以下のものを挙げることができる。







非標的病変部に関して、治療法に対する応答として、以下のものを挙げることができる。



本明細書に開示される方法により治療される患者は、好ましくは、癌の少なくとも１つの兆候における改善を経験する。一実施形態では、改善は、測定可能な腫瘍病変部の数および／またはサイズの低減によって測定される。別の実施形態では、病変部は、胸部ｘ線またはＣＴもしくはＭＲＩフィルムで測定できる。別の実施形態では、細胞学または組織学を使用して、治療法に対する応答性を評価できる。
一実施形態では、治療される患者は、完全な応答（ＣＲ）、部分的な応答（ＰＲ）、安定な疾患（ＳＤ）、免疫関連の全疾患（immune-related complete disease）（ｉｒＣＲ）、免疫関連の部分的な応答（ｉｒＰＲ）または免疫関連の安定な疾患（ｉｒＳＤ）を示す。別の実施形態では、治療される患者は、腫瘍縮小および／または成長速度の減少、すなわち、腫瘍成長の抑制を経験する。別の実施形態では、望ましくない細胞増殖が、低減または阻害される。さらに別の実施形態では、以下のうちの１種または複数が生じ得る：癌細胞の数が低減され得る、腫瘍サイズが低減され得る、末梢器官への癌細胞浸潤が阻害、妨害、減速または停止され得る、腫瘍転移が減速または阻害され得る、腫瘍成長が阻害され得る、腫瘍の再発が防止または遅延され得る、癌と関連する症状のうちの１種または複数がある程度緩和され得る。
他の実施形態では、本明細書において提供される方法のうちのいずれかによる有効量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（または抗ＮＫＧ２Ａ抗体と、少なくとも１つのさらなる抗体、例えば、抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体との組合せ）の投与は、腫瘍サイズの低減、経時的に出現する転移病変部数の低減、完全な寛解、部分的な寛解、または疾患の安定をもたらす。さらに他の実施形態では、治療の方法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体単独（または組合せの抗体のうちのいずれか単独）で達成されるものよりも良好な比較臨床有用率（ＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋６ヶ月以上のＳＤ）をもたらす。他の実施形態では、臨床有用率の改善は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体単独（または組合せの抗体のうちのいずれか単独）と比較して、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上である。
ワクチンアジュバント
本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体と対象の抗原（例えば、ワクチン）との共投与によって、抗原特異的免疫応答を増強させるために使用することができる。したがって、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に、（ｉ）抗原、および（ｉｉ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または病原体に由来する抗原であり得る。このような抗原の限定されない例として、上記で論じられた腫瘍抗原（もしくは腫瘍ワクチン）、または上記のウイルス、細菌、もしくはその他の病原体に由来する抗原など、上記のセクションにおいて論じられたものが挙げられる。
検出および診断
別の態様では、サンプル中のヒトＮＫＧ２Ａ抗原の存在を検出するか、またはヒトＮＫＧ２Ａ抗原の量を測定するための方法であって、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合する抗ＮＫＧ２Ａ抗体、例えば、モノクローナル抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、またはその抗原結合断片と、抗体またはその断片とヒトＮＫＧ２Ａとの間で複合体の形成を可能にする条件下において接触させることを含む、方法が、本明細書において提供される。次いで、複合体の形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較した、サンプル間の複合体形成の相違が、サンプル中のヒトＮＫＧ２Ａ抗原の存在を示す。さらに、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＮＫＧ２Ａを精製するために使用できる。
以下の実施例によって本開示をさらに例示するが、これは、制限と解釈されてはならない。本願を通じて引用された、すべての図およびすべての参考文献の内容、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
以下は、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体、組成物、および方法の非限定的な例である。種々の他の実施形態を、本明細書に提供される一般的な説明と矛盾することなく実施することができることが理解される。
抗ｈｕＮＫＧ２Ａ抗体の生成
完全ヒトおよびキメラ抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体、ならびに抗ＮＫＧ２Ａ抗体と同一のエピトープと結合するおよび／またはその結合を交差遮断する完全ヒトおよびキメラ抗体が、本開示において記載されている。本発明者らは、ヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａ発現細胞と特異的に結合するが、ヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ｃ発現細胞とは特異的に結合しない、抗体を所望していた。本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、この実施例に記載されるいくつかの方法を使用して、生成することができる。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の生成、スクリーニング、および選択の方法
１．ハイブリドーマ方法および開発
ハイブリドーマ方法を使用して、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して生成した。ヒトＩｇＧトランスジェニックＫｕｎｍｉｎｇ（ＫＭ）マウスを、ＢＡＦ３（マウス前駆Ｂ細胞株）－ヒトＮＫＧ２Ａ（ＢＡＦ３－ｈＮＫＧ２Ａ）およびｈＣＤ９４細胞の形質膜、またはｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃタンパク質で、足蹠注射によって免疫処置した。これらのマウスのリンパ節を採取し、電流パルスを使用して細胞膜の透過性を増大させ、例えば、ＤＮＡを細胞内に導入することを可能にする、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅエレクトロポレーション機器を使用して、ハイブリドーマを生成した。ヒトＮＫＧ２Ａに特異的な抗体を、ＣＨＯ－Ｓ－ヒトＮＫＧ２Ａと結合するそれらの能力に関してＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ）による一次スクリーニングで選択した。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析による二次的な確認スクリーニングを行って、ＣＨＯ－Ｓトランスフェクタント細胞の細胞表面上に発現されるヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合するモノクローナル抗体を特定した。
図１Ａに示されるように、工程１０１において、骨髄腫細胞株に融合したリンパ節細胞の４０個の融合体から、１５３個の抗体クローンを得た。
続いて、工程１０２において、ハイブリドーマ上清を、ＨＬＡ－Ｅ五量体（蛍光標識したＭＨＣ－ペプチド複合体、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）のヒトＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合を遮断するそれらの能力に関して、試験した。このアッセイにより、ＨＬＡ－Ｅ五量体のヒトＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合を遮断することができた抗体が特定され、さらなる開発のための抗体クローンの数が、１５３個から２８個の抗体クローンへと狭まった。
次に、精製された抗体のヒトまたはカニクイザルＮＫＧ２Ａ発現細胞またはＮＫＧ２Ｃ発現細胞との結合によって、抗原特異性を判定した。具体的には、工程１０３において、ＨＬＡ－Ｅ／ＮＫＧ２Ａ相互作用を遮断した２８個の抗体クローンを、精製された抗体のヒトＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合によってさらにスクリーニングし、ｈＣＤ９４またはｈＮＫＧ２Ｃ発現細胞との結合に対してスクリーニングした。この工程では、３つの抗体クローン（１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ４、および４Ｇ５．Ｄ１）が発見され、これらをさらなる調査のために選択した。
工程１０４では、３つの抗体クローン（１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ４、および４Ｇ５．Ｄ１）を、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対する交差反応性に関してスクリーニングした。
工程１０５では、本明細書の実施例に記載されている種々の機能的アッセイおよびエピトープビニング実験を使用して、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を特徴付けた。
工程１０６では、さらなる抗体最適化および突然変異スキャン分析により、本明細書に記載される所望される機能的特性を有するさらなる抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見が可能となった。
２．抗体ライブラリー生成方法
抗体を生成するためのハイブリドーマ方法に加えて、抗体ライブラリー方法も使用して、さらなる抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生成した。この方法により、Ｐ１－０６９３６６抗体を含む抗ＮＫＧ２Ａ抗体が生成され、それらは、ヒトおよびカニクイザルの両方のＮＫＧ２Ａ発現細胞株との望ましい特異的結合を示したが、有利なことにヒトＮＫＧ２Ｃ発現細胞との結合が観察されなかった。
この抗体ライブラリー生成方法では、図１Ｂに示されるように、工程１０７において、ヒト抗体を発現する９匹のトランスジェニックマウスに、組換えｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃ融合タンパク質およびカニクイザルＮＫＧ２Ａを発現する細胞株に由来する形質膜で免疫処置を行った。工程１０８では、免疫処置した動物のリンパ節を採取し、これを使用して免疫抗体ライブラリーを生成した。このライブラリーを、酵母表面ディスプレイによって発現させ、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃ組換えタンパク質と結合したが、ｈＮＫＧ２Ｃ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃ組換えタンパク質とは結合しなかった抗体を分取した。工程１０９では、得られた集団を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して配列決定し、対象の抗体を合成し、アッセイにおいて試験した。工程１１０では、機能の特徴付けを行った。例えば、Ｐ１－０６９３６６抗体を特徴付けるために、ＦＡＣＳによって、抗体の、ヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４、カニクイザルＮＫＧ２Ａ、またはヒトＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４を発現するように遺伝子操作したＣＨＯ細胞株との結合を測定した。さらに、エピトープビニングを、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を含め、１３Ｆ３．Ａ４抗体および変異体に対して行った。
３．単一Ｂ細胞クローニング（ＳＢＣＣ）方法
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生成するためのハイブリドーマ方法および抗体ライブラリー方法とともに、第３の方法を使用して、２００個を上回るさらなる抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生成した。
抗ｈｕＮＫＧ２Ａ抗体を、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して生成した。このＳＢＣＣ方法を使用して、２００個を上回るヒト抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体を生成した。図１Ｃに示されるように、工程１１１において、ヒトＩｇＧトランスジェニック（ＫＭ）マウスに、それぞれヒトＮＫＧ２ＡおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａを発現するＢＡＦ３細胞株の形質膜、ならびにｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃタンパク質で、足蹠注射によって免疫処置した。工程１１２では、これらのマウスのリンパ節を採取し、得られた細胞を、ＳＢＣＣ方法に使用した。工程１１３では、１０×１０６個のリンパ節細胞を、リンパ節から単離した。工程１１４において、抗原特異的Ｂ細胞選択／分取は、細胞表面のヒトＩｇＧ発現に基づき、主として、フローサイトメトリーを使用して抗原陽性（Ａｇ＋）Ｂ細胞を分取した。免疫処置した動物のリンパ節を採取し、それを使用して、抗原特異的Ｂ細胞、すなわち、ＮＫＧ２Ａに特異的なＢ細胞を単離した。
本発明者らのＦＡＣＳ染色戦略は、蛍光標識／ビオチン化した可溶性標的抗原の使用を必要とし、Ｂ細胞特異的な細胞表面に発現されるマーカー、例えば、マウスＣＤ１９、マウスＢ２２０、およびヒトＩｇＧのパネルを含んでいた。この多重パラメーターのＦＡＣＳにより、ＮＫＧ２Ａ特異的Ｂ細胞の特定および分取の成功がもたらされた。選択的なＦＡＣＳ染色により、ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃ組換えタンパク質が陽性であるが、ｈＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４－Ｆｃ組換えタンパク質は陽性でないＢ細胞の単離がもたらされた。これらの分取したＢ細胞に由来するヒトＩｇＧ ＶＨおよびＶＫ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、組換えヒトＩｇＧ１として分子的に発現させた。このようにして生成した抗体を、結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＴＲＦ、およびＦＡＣＳで試験した。
ＮＫＧ２Ａと特異的に結合するが、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とは特異的に結合しない抗体を生成することが、目標であった。本発明者らは、ＮＫＧ２Ａと特異的に結合するいくつかの抗体を特定し、ＮＫＧ２Ｃ陰性であったものをいくつか特定した。カニクイザルおよびヒトＮＫＧ２Ａ交差反応性でありＮＫＧ２Ｃ陰性であった非常に少数の（希少な）Ｂ細胞クローンを特定した。ＮＧＳを、ＳＢＣＣで得られたＢ細胞クローンに行って、ヒトＩｇＧ ＶＨおよびＶＫの配列決定データを生成した。選択したＮＫＧ２Ａ特異的抗体のパネルを、さらなるアッセイに関して試験した。しかしながら、これらのクローンはいずれも、ヒトＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を十分に遮断しなかったため、これらの抗体は、以下の実施例３（２）においてさらに詳細に論じられるように、さらなる開発には続かなかった。
突然変異スキャンおよびその他の抗体最適化
突然変異スキャンを行い、そこで、単一部位突然変異のライブラリーにより、ＮＫＧ２Ａ．１１抗体（１３Ｆ３．Ａ４ ＶＨ Ｉ１０７Ｔ、ＶＫ Ｎ３０Ｐとしても知られる）を含む、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のさらなる変異体を生成した。
図２は、突然変異スキャン分析を図示する。高スループット配列決定をタンパク質ディスプレイと組み合わせることで、より従来的なアプローチでは負担となるような規模で、すべての可能性のある単一部位ＣＤＲ突然変異体の相対的な適合性の同時測定が可能となった。高深度突然変異スキャンニングアプローチは、Araya et al., Trends in Biotechnology 29: 435-442 (2001)、Forsynth et al., mAbs 5:523-53 (2013)、およびWrenbeck et al. (2017) Curr. Opin. Struct. Biol. 45:36に記載されている。
まず、工程２０１において、抗体の突然変異を生成するための対象の抗体を選択した。具体的には、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗ＮＫＧ２Ａ抗体を選択した。１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔハイブリドーマ抗体のＮＧＫ２Ａとの結合パラトープを、高深度突然変異スキャンを使用して調査した。第２に、工程２０２において、ｓｃＦｖ（一本鎖）ライブラリーを作製し、そこで軽鎖ＣＤＲ１領域（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ３領域（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖ＣＤＲ１～３領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）におけるそれぞれの個々のアミノ酸置換を、ＮＮＫオリゴヌクレオチドを使用して生成した。この単一突然変異体のライブラリーを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術を使用して配列決定した。この単一突然変異体のライブラリーを生成する際、それぞれのＣＤＲ配列について、それぞれの位置にＮＮＫコドン（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔであり、Ｋ＝Ｇ、Ｔである）を個別に組み込んだ複数のオリゴヌクレオチドを設計した。これらの縮重コドンの使用により、ＮＮＫコドンを組み込んだ位置において２０個すべての天然に存在するアミノ酸（加えて終止コドン）をコードすることが可能となった。Ｋａｂａｔ定義を、ＡｂＭ定義を使用した（Abhinandan and Martin (2008) Mol. Immunol. 45:3832、Swindells et al. (2017) J. Mol. Biol. 429:356）ＨＣＤＲ１を除くすべてのＣＤＲに使用し、ＨＣＤＲ３の１０２位は、分析に含まれなかった。第３に、工程２０３において、ｍＲＮＡディスプレイ（Xu L et al. (2002) Chemistry & Biology 9: 933、Roberts RW and JW Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297、Kurz et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(18): E83）を使用して、ＤＮＡライブラリーを、１回のインビトロ転写および翻訳によって取得し、この間に、コーディングｍＲＮＡを、ピューロマイシン連結を介してそれ自体のｓｃＦｖタンパク質分子と融合させた。選択の間、ビオチン標識したｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃ融合タンパク質と結合したすべてのｓｃＦｖを、磁気ストレプトアビジンビーズによって捕捉し、溶出させ、ＰＣＲによって増幅させた（工程２０５）。工程２０４に示されるように、ヒトＮＫＧ２Ａと結合しなかった抗体は、さらなる試験および開発に選択しなかった。最後に、工程２０６では、工程２０２で生成された初期ライブラリーおよび工程２０５で溶出されたＤＮＡを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して配列決定した。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データ分析：ＮＧＳデータ分析の間、ＮＧＳから得られた末端対合の順方向および逆方向に読み取った配列を、ＦＬＡＳＨ（Magoc and Salzberg (2011) Bioinformatics 27:2957）を使用してアセンブリし、突然変異したアミノ酸の集団、突然変異位置、および同一性によって、ビニングした。品質の悪かった配列および複数の突然変異部位を含むものはすべて、分析から排除した。次に、選択後集団におけるそれぞれの配列の頻度を、開始集団における頻度で除して、濃縮比（ＥＲ）を得た。換言すると、濃縮比は、ＮＫＧ２Ａ結合サンプル（工程２０５）における特定の配列変異体の計数を、初期ライブラリー（工程２０２）における計数で除算したものである。これを、次いで、親１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体の濃縮比に対して正規化した。
この方式で、本明細書において論じられるＣＤＲ領域におけるすべての単一アミノ酸置換のＮＫＧ２Ａ結合に対する作用を、評価した。図３は、突然変異スキャンデータ分析を使用して生成された、単一アミノ酸置換の配列－活性関係性の解釈を可能にする、例示的なヒートマップである。親クローンのＨＣＤＲ１配列（ＡｂＭ定義）５０１が示されており、配列５０２における位置もまた示されている。一般に、この方法におけるエラーは、およそ２倍である。したがって、０．５～２の濃縮比（ＥＲ）値は、中立の置換、すなわち、ＮＫＧ２Ａタンパク質との結合特性を維持する置換であると考えられる。２を上回るＥＲ値は、結合に関して望ましいかまたは好ましいと考えられ、０．５未満のＥＲ値は、結合に関して望ましくないと考えられる。例として、３５位における親クローンＮからＳへの置換は、５．１６のＥＲ値をもたらし、これは、２よりも大きいため、望ましいまたは好ましい置換の例である。
突然変異スキャン方法を使用して分析したＣＤＲ位置を、図４に示す。本明細書において論じられるように、Ｋａｂａｔ定義を、ＡｂＭ定義を使用したＨＣＤＲ１を除くすべてのＣＤＲに使用した。望ましい生物物理学的特性を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を開発するために、突然変異スキャンデータを使用して、１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗体と類似するＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を保持するであろうアミノ酸置換を特定することによって、ＬＣＤＲ１における「ＮＳ」脱アミド化の化学的傾向を除去した。この分析に基づいて、図５Ａに示されるように、ＬＣＤＲ１におけるＮ３０Ｐを、好ましい（望ましい）置換として選択し、ＮＫＧ２Ａ．１１抗体（１３Ｆ３ ＶＨ Ｉ１０７Ｔ ＶＫ Ｎ３０Ｐとしても知られる）を生成した。この分子を合成し、ヒトＩｇＧ１．３ｆ Ｆｃ領域およびヒト定常カッパ（軽鎖）を有するＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。さらなる下流の特徴付けのために、ＩｇＧタンパク質を発現させた。
突然変異スキャン分析により、図５Ａ～Ｅに示され、以下の表１に概説されるように、ＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に対する１３Ｆ３．Ａ４ Ｉ１０７Ｔ抗ＮＫＧ２Ａ抗体における単一アミノ酸置換の作用に関する豊富な情報セットが得られた。
表1-NKG2Aと結合する抗体の能力を維持するかまたは増大させる、13F3.A4 I107T抗NKG2A抗体のCDR配列における単一部位突然変異













完全な高深度突然変異スキャニングデータを使用することで、当業者であれば、図５Ａ～Ｅのデータに示されるように、多数のアミノ酸位置が突然変異に耐容であること、すなわち、アミノ酸置換をこれらの位置に行うことができ、ＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する所望される機能的能力を依然として維持できることを理解するであろう。当業者であれば、特定の位置、例えば、ＬＣＤＲ ８９位（図５Ｂに示される）、ならびにＨＣＤＲ ２６位、２７位、２９位、３２位、および３４位（図５Ｃに示される）；ＨＣＤＲ ５２位、５２ａ位、５３位、５４位、５６位、５７位（図５Ｄに示される）；およびＨＤＣＲ ９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１００ａ位、および１０１位（図５Ｅに示される）が、最も保存されており、これらの位置における単一または数個のアミノ酸型のみにより、ＮＫＧ２Ａタンパク質との結合が維持されたことを理解するであろう。当業者であれば、このデータを使用して、ＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を維持するアミノ酸置換を設計することができるであろう。
所望される機能的特徴を示さなかった数百個の抗体を分析した後の、予想外なそのような特徴を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見。
（１）抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見、設計、および実験的試験
数百個の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の開発は、これらの抗体が本明細書に記載される特定の所望される機能的特性を示していなかったため、追求しなかった。所望される機能的特性を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見におけるこの困難は、図６に例示されるように、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質とヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との間の高度な配列相同性に部分的に起因していた。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアおよびＡｌｉｇｎ Ｘプログラムを使用して、配列アラインメントを行った。図６は、アミノ酸残基のうちの７６％（２３３個中１７７個のアミノ酸残基）が、保存されており、アミノ酸残基のうちの６％（２３３個中１３個のアミノ酸残基）が、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質のカノニカル配列（配列番号１８２）とヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質（ｈＮＫＧ２Ｃ、配列番号３）との間で類似であることを示す。
２０個の異なるアミノ酸が自然界で発生すること、アミノ酸が、異なるクラスにあるように一緒にグループ分けでき、したがって、それらの物理化学的特性に基づいて「類似」であることは、当技術分野において周知である。物理化学的に類似であるアミノ酸は、そうでないものよりも互換可能である、すなわち、置換可能であることが多い。以下の表は、例えば、側鎖によって定義される類似の特徴を有するアミノ酸のグループ分けを提供する。



まとめると、ヒトＮＫＧ２ＡおよびヒトＮＫＧ２Ｃは、およそ８２％の同じかまたは類似のアミノ酸配列を共有している。ヒトＮＫＧ２ＡとヒトＮＫＧ２Ｃとの間のこの高度な配列相同性により、高い親和性および特異性でＮＫＧ２Ａタンパク質と結合するだけでなく、親和性および特異性が低いかまたはなしでＮＫＧ２Ｃタンパク質と結合する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見することは非常に困難なプロセスとなっていた。
驚くべきことに、本発明者らは、１３Ｆ３．Ａ４抗体が、本明細書に詳細に記載される特定の所望される機能的特徴を示したことを発見した。図７Ａ～Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖可変領域（図７Ａ）および軽鎖可変領域（図７Ｂ）のアミノ酸配列を示す。例えば、癌を治療するための所望される機能的特徴を示す抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見することの難しさを示すと、当初は有望なリード抗体であると考えられていた１３Ｆ３．Ａ４抗体のいくつかの変異体でさえも、最終的には所望される機能的特性を示さなかった。表２は、１３Ｆ３．Ａ４抗体の変異体を含め、生成して機能的に特徴付けた特定の抗ＮＫＧ２Ａ抗体をまとめている。ＮＫＧ２Ａ．９抗体を含め、１３Ｆ３．Ａ４抗体の特定の変異体が、予想外なことに、本明細書に記載される所望される機能的特徴を示した。
















本明細書に記載される理由から、また望ましくない機能的特徴に起因してさらなる開発に選択しなかった多数の抗ＮＫＧ２Ａ抗体によって示されるように、所望される機能的特性を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生成および発見することは、極めて困難なプロセスであった。例えば、抗ＮＫＧ２Ａ抗体開発の進行した段階であっても、当初は有望なリード抗体と考えられていた２Ｇ６．Ｃ２、４Ｇ５．Ｄ１、１１Ｈ９．Ａ４、および１Ｇ５．Ｂ２抗体は、所望される機能的特性のすべてを示したわけではなかったため、最終的にはさらなる開発に選択しなかった。図８Ａ～Ｂは、２Ｇ６．Ｃ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。図９Ａ～Ｂは、１１Ｈ９．Ａ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。図１０Ａ～Ｂは、４Ｇ５．Ｄ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。図１１Ａ～Ｂは、１Ｇ５．Ｂ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。これらの例は、本明細書に記載されるその他のものの中でもとりわけ、ＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合しＮＫＧ２Ｃタンパク質とは特異的に結合しないことを含め、所望される機能的特徴を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を生成することの困難さを示す。本明細書に説明されるように、所望される機能的特性を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見におけるこの困難は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質とヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との間の高度な配列相同性に起因していた。
１３Ｆ３．Ａ４抗体の変異体を、発見し、さらに特徴付けた。図１２～１３に示されるように、配列の傾向を１３Ｆ３．Ａ４抗体において評価した。完全ヒト抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体ＮＫＧ２Ａ．９の可変配列は、ＶＨ－Ｉ１０７Ｔ生殖系列逆突然変異およびＶＫ－Ｎ３０残基の脱アミド化傾向を軽減するためのＶＫ－Ｎ３０Ｓ突然変異を有する１３Ｆ３．Ａ４ハイブリドーマに由来していた。定常領域は、ＩｇＧ１ｆ骨格（ＩｇＧ１．３）に由来し、抗体のＦｃγ受容体およびＣ１ｑとの結合を最小化または排除するために、重鎖における３つの突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａを含む。Ｍ３４酸化は、可能性のある酸化リスクとして特定されたが、後続の加速安定性研究に基づいてリスク除去された。ＮＫＧ２Ａ．９抗体の全長アミノ酸配列を、図１４に示す。ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、選択し、安定性および有効性を示すために、単独で、および例えば、癌を治療するための他の薬剤と組み合わせて、本明細書に記載される多数の機能的アッセイにおいて試験した。
ＮＫＧ２Ａ．１１抗体の全長アミノ酸配列を、図１５に示す。ＮＫＧ２Ａ．１１は、ＶＨ－Ｉ１０７Ｔフレームワーク逆転および脱アミド化部位を除去するためのＶＫ－Ｎ３０Ｐを有する１３Ｆ３．Ａ４に由来する。ＮＫＧ２Ａ．９（Ｎ３０Ｓ）とＮＫＧ２Ａ．１１（Ｎ３０Ｐ）との間には、軽鎖における１つのアミノ酸の相違があり、重鎖にはアミノ酸の相違はなかった。ＮＫＧ２Ａ．９およびＮＫＧ２Ａ．１１は、類似の熱安定性および可溶性特性を有する。ＮＫＧ２Ａ．９は、ＮＫＧ２Ａ．１１よりも良好な熱可逆性および良好な免疫原性を有する（インシリコで）。ＮＫＧ２Ａ．９の免疫原性は、実施例１６および２６においてより詳細に記載されている。
（２）単一Ｂ細胞クローニング方法を使用して生成した数百個の抗体は、所望される機能的特徴が欠如していた
図１６は、Ｂ細胞クローニング方法によって生成された例示的な抗体のエピトープビニング結果の円形プロットを示す。エピトープビニングは、「インタンデム（in-tandem）形式」を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器において行った。まず、ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４－ｍＦｃ融合タンパク質を、Ｏｃｔｅｔセンサーチップに捕捉した。次に、必要に応じて、残りの捕捉部位を遮断した。第３に、抗原を、上清から、単一Ｂ細胞クローニングで得られた抗体で飽和させた。最後に、参照抗体の結合を試験した。エピトープビニング実験を、添加、先に参照抗体で飽和させ、次いで単一Ｂ細胞クローニングで得られた抗体を含む上清の結合を調べるという逆の順序で反復した。このエピトープビニングにより、エピトープにおける高い多様性に対応する、結合および遮断挙動における高い多様性が示された。図１６は、互いに交差遮断する抗体を線で接続して示すことによって、エピトープビニングの結果を示す。ベンチマーク抗体（１３Ｆ３．Ａ４、Ｚ２７０、ＲＤ－ａｈＮＫＧ２ａ（クローン１３１４１１、カタログ番号ＭＡＢ１０５９）、およびＲＤ－ａｈＣＤ９４（クローン１３１４１２、カタログ番号ＭＡＢ１０５８））と比較して類似の遮断プロファイルを有するサンプル抗体を、群１～４、６～７、および９に一緒にグループ分けする。サンプル抗体と類似の遮断プロファイルを有するベンチマーク抗体も、群５、８、および１０に一緒にグループ分けする。同じ群の抗体は、同様に互いに交差遮断し得る可能性があるが、これはこれらの実験では試験しなかった。サンプル抗体は、互いに対して試験せず、ベンチマーク抗体は、交差遮断に関して互いに対して試験しなかった。
ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する、単一Ｂ細胞クローニング方法を使用して生成した抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の能力を、評価した。図１７Ａに示されるように、１×１０６個のヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞を、１００μＬの上清または１０μｇ／ｍＬの生成された抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したＨＬＡ－Ｅ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）で染色して、細胞表面上の結合したＨＬＡ－Ｅを検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図１７Ｂは、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との結合を遮断する、Ｂ細胞クローニングによって生成した抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の能力を示す。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、陽性対照としての機能を果たし、アイソタイプは、陰性対照としての機能を果たした。ＳＢＣＣ方法を使用して生成した数百個の抗体は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を部分的にのみ遮断したか、または遮断しなかった。これらの数百個の抗体でさらなる開発に選択したものはなく、所望される機能的特徴を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見することの難しさの根拠を提供する。
（３）望ましいことにＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断し、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡＥ相互作用を遮断しなかった、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体
ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－ＥおよびＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した。図１８Ｄに示されるように、１×１０６個のヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したＨＬＡ－Ｅ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）で染色して、細胞表面上の結合したＨＬＡ－Ｅを検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図１８Ｅ～Ｆは、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現またはＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞との結合の遮断に関する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のＨＬＡ－Ｅ遮断曲線およびＩＣ５０を示す。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、望ましいことに、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的結合を示し（図１８Ｅ）、望ましいことに、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった（図１８Ｆ）。しかしながら、２ＥＢ．Ｂ１抗体は、望ましくないことに、ヒトＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞と結合し、ＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断した。したがって、２ＥＢ．Ｂ１抗体は、さらなる開発には選択しなかった。
ナチュラルキラー細胞（ＮＫＬ）におけるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力もまた、評価した。図１９Ｃに示されるように、１×１０６個の内因的に発現するヒトＮＫＬ細胞を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したＨＬＡ－Ｅ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）で染色して、細胞表面上の結合したＨＬＡ－Ｅを検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図１９Ｄは、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞との結合の遮断に関する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のＨＬＡ－Ｅ遮断曲線およびＩＣ５０値を示す。１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、４Ｇ５．Ｄ１、およびＩＧ５．Ｂ２抗体は、ＮＫＬ細胞において、それぞれ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、および０．４ｎＭのＩＣ５０値で、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断を示した。
ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断するさらなる抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した。図２０Ａに示されるように、１×１０６個のヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したＨＬＡ－Ｅ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）で染色して、細胞表面上の結合したＨＬＡ－Ｅを検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図２０Ｂ～Ｃは、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との結合を遮断する能力に関する、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体のＨＬＡ－Ｅ遮断曲線およびＩＣ５０値を示す。図２０Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、およびＮＫＧ２Ａ．１５抗体は、すべてが、比較的低いＩＣ５０値（それぞれ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、および０．１ｎＭ）を示し、これにより、抗体が、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断したことが示された。同様に、図２０Ｃに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．５、４Ｇ５．Ｄ１、および１Ｇ５．Ｂ２抗体は、それぞれ、０．３ｎＭ、０．９ｎＭ、および０．７ｎＭの比較的低いＩＣ５０値を示した。したがって、これらの抗体を、さらなる開発に選択した。しかしながら、本明細書に記載されるように、ＮＫＧ２Ａ．５および４Ｇ５．Ｄ１抗体は、後に、カニクイザルＮＫＧ２Ａタンパク質との結合が良好でないことに起因して、さらなる開発から除外した。
しかしながら、図２０Ｃに示されるように、２５Ｅ７．Ｇ８抗体（黒塗りの円形で示されている）は、約４ｎＭという比較的高いＩＣ５０値によって示されるように、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった。したがって、２５Ｅ７．Ｇ８抗体は、さらなる開発には選択しなかった。
（４）ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との望ましい特異的結合を示した抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
図１８Ａに示されるように、１×１０６個のヒトＮＫＧ２Ａ発現またはヒトＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ二次抗体で、４℃で３０分間染色して、細胞表面上の結合した抗体を検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図１８Ｂ～Ｃは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ａ発現またはＮＫＧ２Ｃ発現ＣＨＯ細胞との、結合曲線およびＥＣ５０（ｎＭ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および２ＥＢ．Ｂ１抗体は、それぞれ、０．７ｎＭ、０．７ｎＭ、および０．３ｎＭのＥＣ５０値によって示されるように、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示した。
図２１Ａに示されるように、１×１０６個のヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞を、滴定量の抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ二次抗体で、４℃で３０分間染色して、細胞表面上の結合した抗体を検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図２１Ｂ～Ｃは、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との、結合曲線およびＥＣ５０値を示す。
図２１Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、およびＮＫＧ２Ａ．１５抗体は、すべてが、比較的低いＥＣ５０値（それぞれ、０．１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、および０．１ｎＭ）を示し、これにより、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、望ましいことに、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞において、ＮＫＧ２Ａ受容体と特異的に結合したことが示された。同様に、図２１Ｃに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．５、４Ｇ５．Ｄ１、および１Ｇ５．Ｂ２抗体は、比較的低いＥＣ５０値（それぞれ、０．３ｎＭ、０．６ｎＭ、および０．６ｎＭ）を示し、これにより、抗体がＮＫＧ２Ａ受容体と結合したことが示された。したがって、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、４Ｇ５．Ｄ１、および１Ｇ５．Ｂ２は、この段階で、さらなる開発に選択した。
（５）カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合した抗ＮＫＧ２Ａ抗体
カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞と結合した抗ＮＫＧ２Ａ抗体の能力を評価した。図２２Ａに示されるように、１×１０６個のカニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したＨＬＡ－Ｅ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）で染色して、細胞表面上の結合したＨＬＡ－Ｅを検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図２２Ｂ～Ｃは、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体のカニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との、結合曲線およびＥＣ５０値を示す。
図２２Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、およびＮＫＧ２Ａ．１５抗体は、すべてが、比較的低いＥＣ５０値（それぞれ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｎＭ、１．２ｎＭ、１．２ｎＭ、および１．５ｎＭ）を示し、これにより、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞において、ＮＫＧ２Ａ受容体と結合したことが示された。
図２２Ｃに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．５、４Ｇ５．Ｄ１、および１Ｇ５．Ｂ２抗体は、それぞれ、１７２ｎＭ、約３１４ｎＭ、および２１ｎＭの比較的高いＥＣ５０値によって示されるように、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との結合の不良を示した。したがって、これら３つの抗体は、さらなる開発に選択しなかった。２Ｇ６．Ｃ２抗体は、０．６ｎＭのＥＣ５０値を有し、これは、望ましいことに、カニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との特異的な結合を示し、したがって、２Ｇ６．Ｃ２抗体を、さらなる開発に選択した。
ＮＫＧ２Ａ受容体と特異的に結合し、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断する２Ｇ６．Ｃ２抗体の能力を、この実施例３（３）および３（４）において記載されるものと同一の方法を使用して、図２３Ａおよび２３Ｃに示されるように、評価した。２Ｇ６．Ｃ２抗体は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断するその能力が、例えば、図２３Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体については１．１ｎＭおよび２Ｇ６．Ｃ２抗体については１．３ｎＭという類似のＩＣ５０値によって示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体に匹敵していた。同様に、２Ｇ６．Ｃ２抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞におけるＮＫＧ２Ａ受容体と結合するその能力が、例えば、図２３Ｄに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体については０．８ｎＭおよび２Ｇ６．Ｃ２抗体については１ｎＭという類似のＥＣ５０値によって示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体に匹敵していた。
望ましいことにＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断し、ＮＫＧ２Ａ受容体と結合することができるにもかかわらず、２Ｇ６．Ｃ２抗体は、ＮＫＧ２Ａ陰性（－）ＮＫ細胞間で機能性を非特異的に増強したため、２Ｇ６．Ｃ２はさらなる開発に選択しなかった。これは、癌を治療するのに所望される本明細書に記載される機能的特徴を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を開発することの難しさを示す。
（６）ヒトＮＫＧ２Ａ＋ナチュラルキラー細胞株（ＮＫＬ）と結合した抗ＮＫＧ２Ａ抗体
図１９Ａに示されるように、１×１０６個のＮＫＧ２Ａを内因的に発現するヒトＮＫＬ細胞を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ二次抗体で、４℃で３０分間染色して、細胞表面上の結合した抗体を検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図１９Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のヒトＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞との、結合曲線およびＥＣ５０値（ｎＭ）を示す。１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、４Ｇ５．Ｄ１、およびＩＧ５．Ｂ２抗体のＥＣ５０値は、それぞれ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、および０．３ｎＭであり、これらの値は、これらの抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、望ましいことに、ＮＫＧ２Ａ＋ナチュラルキラー細胞と特異的に結合したことを示した。
（７）カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫＬと結合した抗ＮＫＧ２Ａ抗体
図２４Ａに示されるように、カニクイザルから単離した１×１０６個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、滴定量の抗ＮＫＧ２Ａ抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ二次抗体で、４℃で３０分間染色して、細胞表面上の結合した抗体を検出した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで新しく読み取った。図２４Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のカニクイザルＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞との、結合曲線およびＥＣ５０値（ｎＭ）を示す。図２４Ｂに示されるように、１１Ｈ９．Ａ１および４Ｇ５．Ｄ１抗体は、それぞれ、２８ｎＭおよび３８ｎＭのＥＣ５０値によって示されるように、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞と結合しなかった。したがって、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞との結合の欠如に起因して、１１Ｈ９．Ａ１および４Ｇ５．Ｄ１抗体は、例えば、癌を治療するためのさらなる開発から除外した。１３Ｆ３．Ａ４抗体は、望ましいことに、０．２ｎＭのＥＣ５０値によって示されるように、カニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞と結合した。したがって、１３Ｆ３．Ａ４抗体は、望ましい結合機能性を示し、さらなる修飾および開発に選択した。
（８）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の脱顆粒化応答を増強した抗ＮＫＧ２Ａ抗体
健常ヒトドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用したインビトロ実験において、活性化ＮＫ細胞における抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断は、ＮＫ細胞脱顆粒化を増大させた。ＮＫ細胞がそれらの標的、例えば腫瘍細胞を排除する機序の１つは、溶解酵素パーフォリンおよびグランザイムを含む顆粒の指向的分泌をもたらす複雑な多段階プロセスを通じたものである。この顆粒からの分子の指向的分泌の細胞プロセスは、脱顆粒化として知られている。ＮＫ細胞が、例えば、標的腫瘍細胞に、分泌性溶解顆粒を放出した後、パーフォリンは、標的腫瘍細胞膜に細孔を生成し、グランザイムは、次いで、標的腫瘍細胞の細胞質にアクセスし、腫瘍細胞死（アポトーシスとしても知られる）を誘導する。このプロセス中に、リソソーム膜タンパク質－１（ＬＡＭＰ－１、ＣＤ１０７Ａとしても知られる）は、ＮＫ細胞の表面へと輸送され、それによって、抗体結合にアクセス可能となり、したがって、脱顆粒化において活性となっているＮＫ細胞を特定することが可能となる。本発明者らは、次いで、腫瘍細胞死の増大をもたらす脱顆粒化プロセスにおけるＮＫ細胞活性化およびＮＫ細胞機能性の増強に対する本明細書において開示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の作用を測定した。このプロセスは、図２５Ａに部分的に図示されている。ＮＫ細胞内のＸは、ＮＫＧ２ＡがＨＬＡ－Ｅと相互作用する際の阻害性シグナルを示す。ＮＫ細胞内の濃い円は、顆粒を表す。
正常なＰＢＭＣドナーから単離されたＮＫ細胞を、組換えヒト（ｒｈ）インターロイキン－２（ＩＬ－２）で一晩活性化した。具体的には、ＮＫ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配およびヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してヒト全血から単離した。ＮＫ細胞を、ｒｈ ＩＬ－２（４００ＩＵ／ｍｌ）とともに一晩培養した。活性化の後に、細胞生存率は、細胞カウンターによって判定すると、９０％を上回っていた。ＮＫ細胞、次いで、ＨＬＡ－Ｅを発現する５×１０４個のヒトＢ－リンパ芽球様標的細胞株７２１．２２１とともに、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、２Ｇ６．Ｃ２、４Ｇ５．Ｄ１、２５Ｅ７．Ｇ８）およびアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ１．３）の存在下で４時間共培養した。次いで、細胞を回収し、以下のマーカーで染色した：抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ５６、生／死、および抗ヒトＣＤ１０７ａ、ならびに非競合抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（２７Ｈ４．Ｄ４クローン）。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）で新しく取得した。続いて、ＮＫＧ２Ａ＋またはＮＫＧ２Ａ－ ＮＫ細胞間の脱顆粒化パーセント（ＣＤ１０７％）を、ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（フローサイトメトリーソフトウェア）で分析した。倍率増大を、アイソタイプ対照に対するＣＤ１０７ａ％の増大によって計算した。
抗ヒトＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体の存在下において、フローサイトメトリーによるＣＤ１０７ａ発現によって測定すると、ＮＫ細胞脱顆粒化の増大があった。ＮＫ細胞応答の増大は、ＮＫＧ２Ａ陰性（－）ＮＫ細胞では観察されなかったため、これにより、抗体の作用が、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞に特異的であったことが示された。
図２５Ｂ～Ｃは、フローサイトメトリー分析の図による表示であり、陰性対照として含まれた２５Ｅ７．Ｇ８クローン（非遮断抗体）を除き、すべての試験した抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、２Ｇ６．Ｃ２、および４Ｇ５．Ｄ１抗体）が、ＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞において、ＮＫ細胞脱顆粒化（アイソタイプ対照と比較したＣＤ１０７ａ％の倍率変化によって測定される）を増強させたことを示す（図２５Ｂに示される）。（換言すると、２５Ｅ７．Ｇ８抗体は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ経路を遮断しないため、ＮＫ細胞脱顆粒化を増大させないであろうことが予測されていた）。
具体的には、１０μｇ／ｍｌの固定濃度のＮＫＧ２Ａ．９抗体を用いて複数のドナーに由来するＮＫ細胞を評価したときに、ＮＫＧ２Ａ＋発現ＮＫ細胞には、ヒトＩｇＧ１．３アイソタイプ対照と比較して、脱顆粒化パーセントにおよそ２倍の増大があった。図２５Ｃに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、および４Ｇ５．Ｄ１抗体については、ＮＫ細胞応答の増大は、ＮＫＧ２Ａ陰性（－）（本明細書においてＮＫＧ２Ａ－とも称される）ＮＫ細胞では観察されなかったため、これにより、ＣＤ１０７％の増大は、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞に特異的であったことが示された。換言すると、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のうちのいくつか（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、４Ｇ５．Ｄ１抗体）について、ＮＫＧ２Ａ陽性（＋）（本明細書においてＮＫＧ２Ａ＋とも称される）ＮＫ細胞における脱顆粒化の増強、およびＮＫＧ２Ａ陰性（－）ＮＫ細胞における脱顆粒化増強の欠如により、ＮＫＧ２Ａ受容体発現が機能性の増強に必要であったことが示された。この結果の１つの例外は、図２５Ｃに示されるように、２Ｇ６．Ｃ２抗体であり、これは、ＮＫＧ２Ａ陰性（－）ＮＫ細胞においてさえも、ＮＫ細胞脱顆粒化の増強を示した。換言すると、２Ｇ６．Ｃ２抗体による脱顆粒化の増強は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用に特異的ではなかった。したがって、２Ｇ６．Ｃ２抗体は、さらなる調査には選択しなかった。
まとめると、ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１０、ＮＫＧ２Ａ．１１、ＮＫＧ２Ａ．１２、ＮＫＧ２Ａ．１４、ＮＫＧ２Ａ．１５、ＮＫＧ２Ａ．５、および４Ｇ５．Ｄ１抗体は、驚くベきことに、また望ましいことに、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞において、アイソタイプ対照と比較して、脱顆粒化を特異的に増強させた。図２５Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体に関して、この増強された脱顆粒化は、アイソタイプ対照と比較して、およそ２倍であった。しかしながら、その他の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、所望される機能的特徴を示さなかったため、さらなる開発には選択しなかった。例えば、２Ｇ６．Ｃ２抗体は、ＮＫＧ２Ａ陰性（－）発現細胞の機能性の増強をもたらし、これにより、２Ｇ６．Ｃ２抗体が、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用に直接的に影響を及ぼさなかったことが示唆された。Ｐ１－０６９３６６抗体もまた、ＮＫ脱顆粒化アッセイにおいて機能性を示さなかった。図５３に示されるように、Ｐ１００６９３６６抗体は、ＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞内で類似のＣＤ１０７＋％を有し、アイソタイプであった。したがって、２Ｇ６．Ｃ２およびＰ１－０６９３６６抗体は、ＮＫ細胞において脱顆粒化を増強させなかったため、さらなる開発には選択しなかった。
（９）インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）産生の増大であるＮＫ細胞応答を増強させた抗ＮＫＧ２Ａ抗体
抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体は、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ、およびＮＫ細胞活性化受容体ＮＫＧ２ＤのリガンドであるＭＩＣＡを発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞）と共培養したＮＫＬ細胞においてＩＦＮ－γ産生を増大させた。図２６Ａに示されるように、ＮＫＬ細胞およびＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅを使用したインビトロ実験において、活性化ＮＫ細胞（ＭＩＣＡ－ＮＫＧ２Ｄ経路による）における抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断は、望ましいことに、ＩＦＮ－γ産生を増大させた。本発明者らは、まず、活性化されたＮＫＬ細胞が、標的細胞、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅ細胞を殺滅することができるように、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトしたＭＩＣＡを使用してＮＫＬ細胞を活性化した。ＭＩＣＡは、ＮＫ細胞の表面上に発現される活性化受容体ＮＫＧ２Ｄによって認識されるリガンドとして機能する。抗体は、ＮＫＬおよびＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅ細胞の共培養物を使用して、アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、ＣＨＯ細胞上のＭＩＣＡは、ＮＫＧ２ＡによってＮＫＬ細胞を活性化するように機能し（正のシグナル）、ＣＨＯ細胞上のＨＬＡ－Ｅの発現は、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫＬ細胞を阻害する（負のシグナル）。アッセイでは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断し、望ましいことに、ＩＦＮ－γ産生を増大させるかどうかを試験した。
具体的には、ＮＫＬ細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下において、４：１のエフェクター細胞対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅと共培養した。３７℃のインキュベーターで一晩刺激した後に、ＩＦＮ－γ産生を、ＥＬＩＳＡによって上清において測定した。図２６Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４、１１Ｈ９．Ａ１、および４Ｇ５．Ｄ１抗体が、望ましいことに、アイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１．３）と比較して、ＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示す。ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しない抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体である２５Ｅ７．Ｇ８抗体は、陰性対照として使用し、予想した通り、アイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮ－γ産生を増大させなかった。
（１０）ＩＦＮγ産生の増大であるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強させた抗ＮＫＧ２Ａ抗体
抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体は、膵臓癌細胞株Ｈｓ７６６Ｔと共培養したＣＤ８＋ Ｔ細胞においてＩＦＮ－γ産生を増大させた。
正常ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プレート結合ＣＤ３（ＯＫＴ３）およびｒｈＩＬ－１５とともに３日間活性化して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞においてＮＫＧ２Ａの発現を増大させた。図２７Ａに示されるように、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体またはアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ１．３）の存在下において、１：１のエフェクター細胞対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で、Ｈｓ７６６Ｔ標的細胞（マイトマイシンＣで処置）と共培養した。３７℃で５日間刺激した後、ＩＦＮ－γ産生を、ＥＬＩＳＡによって上清において測定した。
図２７Ｂに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、アイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮ－γ産生を増大させた。ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しない抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体である２５Ｅ７．Ｇ８抗体は、陰性対照として使用し、予想した通り、アイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮ－γ産生を増大させなかった。具体的には、ＨＳ７６６Ｔは、ＨＬＡ－Ｅを内因的に発現する膵臓癌細胞株である。健常ドナーＰＢＭＣに由来するＣＤ８＋ Ｔ細胞は、一般に、低いレベルのＮＫＧ２Ａを発現する。しかしながら、抗ＣＤ３およびＩＬ－１５刺激により、本発明者らは、これらの細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現を増大させることができた。この系において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＮＫＧ２Ａを発現し、標的ＨＳ７６６Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｅを発現する。１３Ｆ３．Ａ４および１１Ｈ９．Ａ１抗体は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞傷害機能性を増大させ、これは、ＩＦＮ－γ産生の増大によって示された。
（１１）ＮＫＧ２Ａ．９抗体を含め、１３Ｆ３．Ａ４抗体および変異体は、安全なレベルの望ましくない抗体凝集を示した
抗体凝集体は、細胞培養物における抗体発現、産物精製、または抗体薬製品としての保管中に不可逆的に形成される変性した抗体分子のクラスターである。凝集のプロセスは、複雑であり、抗体の生化学的および生物物理学的特性、ならびに抗体が処理および保管中に曝露される物理化学的環境によって影響を受ける。抗体凝集は、通常は露出されていないエピトープを露出させ、免疫原性の増大につながり得る。抗体産物の精製プロセスは、低い凝集レベル、例えば、２％未満の可溶性凝集体を達成することを目指している。加速安定性研究（強制分解研究としても知られる）を、１３Ｆ３．Ａ４抗体の８つの変異体（ＮＫＧ２Ａ．９、ＮＫＧ２Ａ．１３、ＮＫＧ２Ａ．１８、ＮＫＧ２Ａ．１９、ＮＫＧ２Ａ．２１、ＮＫＧ２Ａ．２２、ＮＫＧ２Ａ．２３、およびＮＫＧ２Ａ．２４）に行って、１ヶ月間、４℃および２５℃におけるこれらの抗体の凝集傾向を確認した。ＮＫＧ２Ａ．２０の安定性は、材料の入手可能性の制限に起因して、４℃でのみ試験した。２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）、２６０ｍＭスクロース、５０μＭ ＤＴＰＡ、および０．０５％ポリソルベート８０を含む製剤を、すべての抗体の試験製剤として使用した。可溶性凝集体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によってモニタリングした。試験した濃度は、材料の入手可能性に基づいた。ＳＥＣにより、複数のピークが観察されたＮＫＧ２Ａ．１９を除き、すべての抗体で同様の凝集傾向が明らかとなった。任意の他の機序に束縛されるものではないが、ＮＫＧ２Ａ．１９は、試験した材料のバッチにおける相当レベルのプロテアーゼの存在に起因して、分解を受けた可能性がある。
全体として、凝集レベル（２５℃で１ヶ月保管後に２％未満の可溶性凝集体）は、試験したその他の抗体について、ｐＨ６．０で製剤化することに対する好適性を示した。物理的安定性データは、２５℃で１ヶ月間の保管後に２％未満の可溶性凝集体を示し、これにより、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を有する試験した製剤が、試験した濃度において、薬物物質に許容可能な保管安定性を付与する予備的な製剤として好適だったことが示された。



（１２）ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＧ２Ｃタンパク質と比べてＮＫＧ２Ａに対して高い親和性で結合した
ＮＫＧ２Ａ．９抗体の、ＮＫＧ２Ｃタンパク質を上回る、ＮＫＧ２Ａタンパク質に対する特異性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ＳＰＲ機器を使用して、動態および親和性を判定することによって評価した。ＮＫＧ２Ａタンパク質およびＮＫＧ２Ｃタンパク質の細胞外ドメインを、それぞれ、ＣＤ９４の細胞外ドメインとのヘテロ二量体として調製した。アッセイ温度は３７℃であり、泳動緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および１ｇ／Ｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ｐＨ７．４であった。ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、抗ヒトＦｃ捕捉試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０８１－０１）を事前に固定化したＣＭ４センサーチップに捕捉した。ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４ヘテロ二量体を、検体として、それぞれ、２つの５連続３倍希釈系列において、捕捉された抗体上に流した。一方の濃度系列を、単一サイクル動態に使用し、もう一方は、多重サイクル動態に使用した。多重サイクル動態分析については、２番目に高い濃度を、二連に注入した。ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４の最高濃度は、２５０ｎＭであり、ＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４の最高濃度は、１．５ｕＭであった。すべてのデータは、二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．１を使用して、質量移行を用いて１：１結合モデルに適合させた。
一般に、本明細書において論じられるように、２つの動態パラメーターにより、結合親和性が決定する。第１のパラメーターは、複合体がどれほど速く形成されるか（結合速度、ｋａ）であり、第２のパラメーターは、複合体がどれほど速く解離または崩壊するか（解離速度、ｋｄ）である。いずれの動態パラメーターも、平衡解離定数（ＫＤ）に集約することができ、これは、ｋｄ／ｋａとして定義される。この比較Ｂｉａｃｏｒｅ実験により、両方の相互作用パラメーター：ＮＫＧ２Ａ．９抗体／ＮＫＧ２タンパク質複合体がどれほど速く形成されたか（ｋａ）およびそれがどれほど速く崩壊したか（ｋｄ）に対処した。
この比較Ｂｉａｃｏｒｅ実験において、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＧ２Ａタンパク質に対して、ＮＫＧ２Ｃタンパク質よりも１５倍強力な結合を示した（ＮＫＧ２Ａとの結合に関して３．９×１０－８ＭのＫＤ、これに対してＮＫＧ２Ｃとの結合に関して５．７×１０－７ＭのＫＤ）。換言すると、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＧ２Ａタンパク質とよりも１５倍弱いＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合を示した。これらの結果により、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、以下の表に要約されるように、ＮＫＧ２Ｃタンパク質と比較して、ＮＫＧ２Ａタンパク質に対して高い選択性を有したことが示された。ＮＫＧ２Ａ．９抗体のＮＫＧ２Ａタンパク質との強力な結合は、より高速な結合速度（ｋａ）、すなわち、ＮＫＧ２Ａ．９抗体／ＮＫＧ２Ａタンパク質複合体が、ＮＫＧ２Ａ．９抗体／ＮＫＧ２Ｃタンパク質複合体と比較して、どれほど高速に形成されるか、によって作動されていた。換言すると、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも１５倍迅速に、ＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成した。
表:NKG2A.9抗体の、NKG2AおよびNKG2Cタンパク質に対する親和性の比較



図５６Ａ～Ｄは、単一サイクル動態（図５６Ａおよび５６Ｃ）ならびに多重サイクル動態（図５６Ｂおよび５６Ｄ）の両方を使用してＢｉａｃｏｒｅによって判定される、３７℃におけるＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４ヘテロ二量体（図５６Ａ～Ｂ）およびＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４ヘテロ二量体（図５６Ｃ～Ｄ）との結合親和性を示す。ＳＰＲ応答は、検体の結合および解離に関して示されている。
他の実施形態では、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも１４倍迅速に、１３倍迅速に、１２倍迅速に、１１倍迅速に、１０倍迅速に、９倍迅速に、８倍迅速に、７倍迅速に、６倍迅速に、５倍迅速に、４倍迅速に、３倍迅速に、または２倍迅速に、ＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成する。
（１３）抗ＮＫＧ２Ａ抗体の驚くべきかつ望ましい機能的特性の概要
まとめると、本発明者らは、予想外なことに、例えば、癌の治療のための種々の所望される機能的特性を示した特定の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を発見した。特定の実施形態では、これらの抗ＮＫＧ２Ａ抗体には、所望される機能的特性を示さなかった数百個の抗体から特定および選択された、１３Ｆ３．Ａ４抗体クローンならびにＮＫＧ２Ａ．９およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体を含む変異体が含まれる。具体的には、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、１３Ｆ３．Ａ４－ＶＨ－Ｉ１０７Ｔ－Ｎ３０Ｓ ＩｇＧ１．３としても知られる抗ｈＮＫＧ２Ａ抗体であり、本明細書において、「ＮＫＧ２Ａ．９」抗体と称される。残基ＶＨ－１０７Ｔにおける突然変異（生殖系列に逆転したフレームワーク突然変異）および脱アミド化能を低くし免疫原性リスクを低減させるための残基ＶＫ－Ｎ３０Ｓにおける突然変異により、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の発見がもたらされた。本明細書に記載され、図１３に示されるように、種々の配列傾向を、１３Ｆ３．Ａ４抗体において評価し、これが、例えば、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の最適化および開発につながった。
本明細書の実施例においてさらに詳細に記載されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を含め、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えば、以下の驚くべきかつ望ましい機能的特徴を示した：
ａ）ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断したこと、
ｂ）ＮＫＧ２Ａに媒介される阻害性シグナル伝達を逆転させたこと、
ｃ）ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質を発現する細胞と結合しなかったか、もしくは低い親和性で結合したこと、
ｄ）高い親和性で、ヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａを発現する細胞と結合したこと、ならびに／または
ｅ）ヒトおよびカニクイザルＮＫＧ２Ａ＋ナチュラルキラー細胞と結合したこと、
ｆ）例えば、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）の増大であるナチュラルキラー細胞応答を増強したこと、ならびに／または
ｇ）例えば、ＩＦＮγ産生の増大であるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を増強したこと、ならびに／または
ｈ）ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも迅速にＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成したこと、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも１５倍迅速にＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成したこと。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、単独および本明細書の実施例に記載されるようにさらなる抗体と組み合わせて、特徴付けし、試験した。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、高い親和性および特異性で、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合した。ＮＫＧ２Ａ．９のＮＫＧ２Ａタンパク質との結合のＥＣ５０値は、以下の通りであり、ＮＫＧ２Ａ．９のＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を示した。



ＮＫＧ２Ａ．９のＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合のＥＣ５０値は、以下の通りであり、望ましいことに、ＮＫＧ２Ａ．９のヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合の欠如が示された。



細胞遮断アッセイにおいてＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断を示したＮＫＧ２Ａ．９のＩＣ５０値は、以下の通りであった：



ＥＣ５０値は、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断したことを示した。ＮＫＧ２Ａ．９抗体のＥＣ５０値は、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合が、ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも約１５倍低かったことを示した（ＮＫＧ２Ａについては０．６ｎＭ、対してＮＫＧ２Ｃについては９．０ｎＭ）。さらに、ＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒトＮＫＧ２Ｃとの特異的結合は、ＳＰＲ実験において観察されなかった。対照的に、ＮＫＧ２Ａ．９抗体がカニクイザルＮＫＧ２ＡおよびカニクイザルＮＫＧ２Ｃタンパク質と結合するＥＣ５０値は、類似であった（ＮＫＧ２Ａについては１．２ｎＭ、対してＮＫＧ２Ｃについては０．８ｎＭ）。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、本明細書において論じられる条件下においてフローサイトメトリーによって評価される場合、ヒトＮＫＧ２Ｃ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断しなかった。マウスまたはラットＮＫＧ２Ａとの結合は、初代ＮＫ細胞でのフローサイトメトリーによって観察されなかった。
本発明者らは、スキャッチャード解析を使用して、ＮＫＧ２Ａ．９の結合親和性を測定した。ＮＫＧ２Ａ．９については、図５２Ａ～Ｂに示されるように、ＣＨＯ－ｈＮＫＧ２ＡおよびＣＨＯ－カニクイザルＮＫＧ２Ａの飽和細胞結合およびスキャッチャード解析により、それぞれ、約０．４ｎＭおよび１．０ｎＭの特異的結合親和性（ＫＤ値）が確立された。具体的には、ＩＯＤＯ－ＧＥＮ（登録商標）固相ヨウ素化試薬（１，３，４，６－テトラクロロ－３ａ－６ａ－ジフェニルグリコウリル、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ２８６０１）を使用して、ＮＫＧ２Ａ．９を１２５Ｉ－Ｎａ（１ｍＣｉ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒカタログＮＥＺ０３３Ｈ００１ ＭＣ）で放射ヨウ素標識した。過剰なヨウ素を、脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ４３２４３）を使用して除去した。標識した抗体の画分を採取し、Ｗｉｚａｒｄ１４７０ガンマカウンターで放射活性について分析した。それぞれの画分における１２５Ｉ－ＮＫＧ２Ａ．９濃度を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕｂｉｔフルオロメーターを用いて計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射活性画分の薄層クロマトグラフィーによって確立した。放射ヨウ素標識したＮＫＧ２Ａ．９のヒトまたはカニクイザルＮＫＧ２Ａ過剰発現ＣＨＯ細胞との結合を、ＣＨＯヒトまたはカニクイザルＮＫＧ２Ａ細胞を１２５Ｉ－ＮＫＧ２Ａ．９の滴定物とともにインキュベートすることによって示した。１００倍モル過剰の非標識抗体の滴定物の存在下における結合によって非特異的結合を決定し、これを総ＣＰＭから差し引いて特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ－ＮＫＧ２Ａ．９の濃度の線形標準曲線を使用して、特異的活性、最大のｎＭでの１２５Ｉ－ＮＫＧ２Ａ．９の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。スキャッチャード解析の結果は、ＮＫＧ２Ａ．９が、０．４ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＣＨＯ－ｈＮＫＧ２Ａと、および０．１ｎＭのＫＤでＣＨＯ－ｃｙｎｏＮＫＧ２Ａトランスフェクタントと、特異的に結合したことを示した。ＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂを、サルＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４－ｍＦｃ（発現を達成する短縮型コンストラクト）を固定化したＣＭ４チップに流すことによって、ＳＰＲにより、カニクイザルＮＫＧ２Ａに対するＮＫＧ２Ａ．９の相対結合親和性を判定した。第２のフローセルに連結したヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４－ｍＦｃは、対照としての機能を果たした。別のフローセルは、参照減算のためにブランクのままにした。測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器において、３７℃で、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および１ｇ／Ｌ ＢＳＡを補充したＨｅｐｅｓ緩衝食塩水（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ｐＨ７．４を泳動緩衝液として使用して、行った。ＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂの濃度系列を、異なるフローセルに注入した。すべてのデータは、二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．１を使用して、１：１ラングミュアモデルに適合させた。このアッセイにおいて、ＮＫＧ２Ａ．９ ＦａｂのヒトＮＫＧ２Ａとの一価結合は、カニクイザルＮＫＧ２Ａとの結合よりもおよそ２６倍強力であった。以下の表に示されるように、ＳＰＲによって測定されるヒトＮＫＧ２ＡについてのＫＤ値は、６１ｎＭであり、ＳＰＲによって測定されるカニクイザルＮＫＧ２ＡについてのＫＤ値は、１６００ｎＭであった。これらのＫＤ値は、ＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂが、組換えカニクイザルＮＫＧ２Ａと結合するが、ヒトＮＫＧ２Ａのものと類似の結合レベル（飽和レベル）を達成するにはより高いＦａｂ濃度を使用しなければならないことを示した。



抗ＮＫＧ２Ａ抗体のエピトープマッピング
当技術分野において公知の方法を使用して、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、具体的には、１３Ｆ３．Ａ４およびＮＫＧ２Ａ．９抗体が結合するＮＫＧ２Ａの領域を探求した。水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）およびタンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）を使用して、１３Ｆ３．Ａ４およびＮＫＧ２Ａ．９抗体とのｈＮＫＧ２Ａの結合エピトープを探求した。
ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ．９に対するＨＤＸ－ＭＳ実験により、ｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４に関して９５％の配列カバレッジを得た。ＦＰＯＰ測定により、ＮＫＧ２Ａに対して９９％の配列カバレッジを得た。ＮＫＧ２Ａの総配列カバレッジは、ＨＤＸ－ＭＳおよびＦＰＯＰのデータセットを組み合わせると１００％であった。同様に、ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４／１３Ｆ３に対するＨＤＸ－ＭＳ実験により、ｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４に関して９５％の配列カバレッジを得た。ＦＰＯＰ測定により、ＮＫＧ２Ａに対して９９％の配列カバレッジを得た。ＮＫＧ２Ａの総配列カバレッジは、ＨＤＸ－ＭＳおよびＦＰＯＰのデータセットを組み合わせると１００％であった。
この実施例においてより詳細に論じられるように、本発明の特定の実施形態は、ＨＤＸ－ＭＳおよび／またはＦＰＯＰエピトープマッピングによって判定される場合、およそ以下のアミノ酸残基：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２（天然のｈＮＫＧ２Ａアミノ酸配列）のアミノ酸残基１５５～１６５、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、
領域４：Ｌ（配列番号２のアミノ酸残基２０６）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）
に及ぶ不連続な領域内に位置するエピトープと特異的に結合する、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＸ－ＭＳによって判定される場合、以下のアミノ酸残基：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５）、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）
からなる不連続な領域内に位置するエピトープと特異的に結合する、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を対象とする。
エピトープマッピング実験の準備。
エピトープマッピング実験の前に、非変性実験を行って、組換えｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４ならびにｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４および親１３Ｆ３ ＦａｂまたはＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂのタンパク質複合体（１５μＭ、１：１のモル比）について、共通のペプチドの一覧を得た。ＨＤＸ－ＭＳ実験では、５μＬのそれぞれのサンプル（ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４またはＦａｂを有するｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４）を、５５μＬの酸化重水素（Ｄ２Ｏ）緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＤ７．０）中に希釈して、標識反応を開始した。反応は、異なる期間：２０秒間、１分間、１０分間、および４時間行った。それぞれの標識反応期間の終わりに、反応停止緩衝液（４Ｍ塩酸グアニジン（ＧｄｎＣｌ）および０．４Ｍトリス（２－カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ２．５、１：１、体積／体積）を添加することによって、反応を停止させ、反応停止したサンプル５０μＬを、分析のためにＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ－ＭＳシステムに注入した。共通の消化性ペプチドの重水素取込みレベルを、Ｆａｂの不在下または存在下でモニタリングした。
ＨＤＸ－ＭＳによる１３Ｆ３およびＮＫＧ２Ａ．９のエピトープマッピング
ＨＤＸ－ＭＳ。ＨＤＸ－ＭＳは、骨格アミドの水素原子の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることによって、溶液中のタンパク質立体構造および立体構造動態を探求する（R. Huang and G. Chen, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406: 6541-58 (2014)、Wei et al., Drug Discovery Today, 19: 95-102 (2014)。ＨＤＸのレベルは、骨格アミドの水素原子の溶媒接触可能性およびタンパク質の水素結合に依存する。ＨＤＸ時のタンパク質の質量増大は、ＭＳによって正確に測定することができる。この技術を酵素消化と組み合わせた場合、ペプチドレベルでの構造特性を分解することができ、表面に露出しているペプチドを内部に折り畳まれているものと区別することが可能となる。典型的には、重水素標識および後続の反応停止処理の実験を行い、続いて、酵素消化、ペプチド分離、およびＭＳ分析を行う。
図２８Ａは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体との相互作用時のｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４の示差的ＨＤＸを示す。図２８Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４との相互作用時のｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４の示差的ＨＤＸを示す。図２８Ａ～Ｂにおけるデータは、エピトープが、ＮＧＫ２Ａ．９および１３Ｆ．３．Ａ４抗体で同じであったことを示し、具体的には、ｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４におけるＮＫＧ２Ａ９抗体に対するＨＤＸ－ＭＳデータ分析は、ＮＫＧ２Ａ９および１３Ｆ３．Ａ４親モノクローナル抗体で、同一のエピトープを共有していることを示し、そのエピトープは、ｈＮＫＧ２Ａの以下の４つの不連続な領域である（残基番号は、天然のｈＮＫＧ２Ａ配列に対応する）：
領域１：１５５ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ１６５（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５）、
領域２：１７１ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ１８６（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：１９２ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ２０３（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、および
領域５：２１２ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ２２９（配列番号２アミノ酸残基２１２～２２９）。
ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４配列にマッピングしたエピトープおよび結晶構造。
ＦＰＯＰ。タンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）は、ヒドロキシル（ＯＨ）ラジカルによって誘導される酸化をマッピングすることによって、構造情報を判定するためのタンパク質フットプリント技術である。（Li et al., Analytical Chemistry, 2017, 89, 2250-2258）。ヒドロキシルラジカルに誘導される酸化の程度は、アミノ酸側鎖の溶媒露出性および露出したアミノ酸の化学特性に直接的に依存する。レーザー活性化により過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から生じるヒドロキシルラジカルは、高度に反応性であり、骨格切断を引き起こすことなく、側鎖の共有結合による不可逆的修飾をもたらす。ＦＰＯＰを酵素消化およびＭＳ分析と併用することにより、タンパク質－タンパク質相互作用に起因して、側鎖の溶媒露出性の変化をペプチドレベルで評価することが可能である。残基レベルの情報は、ＭＳ／ＭＳにより選択されたペプチド領域の気相断片化によって達成することができる。この技術は、ＨＤＸに対する補完的な情報を提供する。
ＦＰＯＰによるエピトープマッピングを、ｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４および親１３Ｆ３ Ｆａｂと複合体を形成したｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４（１５μＭ、１：１のモル比）に行った。同様に、ＦＰＯＰによるエピトープマッピングを、ｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂと複合体を形成したｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４（１５μＭ、１：１のモル比）に行った。
１３Ｆ３．Ａ４およびＮＫＧ２Ａ．９抗体の両方のエピトープマッピングのために、フッ化クリプトン（ＫｒＦ）エキシマレーザーを使用して、Ｈ２Ｏ２の光分解によってヒドロキシルラジカルを生成し、励起波長は、任意のレーザーに誘導されるタンパク質の立体構造変化を回避するために２４８ｎｍに設定した。標識の直前に、５μＬのヒスチジンおよび５μＬのＨ２Ｏ２を、タンパク質アリコートに添加した。タンパク質溶液の最終容積は、５０μＬであり、ヒスチジンの最終濃度は、５００μＭであり、Ｈ２Ｏ２の最終濃度は、１５ｍＭであった。サンプルを、次いで、紫外線（ＵＶ）透過ウインドウを有する溶融石英チュービングに注入した。レーザーエネルギーを、７．４Ｈｚの周波数で７０ｍＪ／パルスに調節した。ＦＰＯＰおよびレーザーなし対照の実験の両方を、三連に行った。それぞれの複製物を、１１μＬの反応停止溶液（５０ｎＭのカタラーゼおよび２０ｍＭのメチオニン）を含む微量遠心チューブに収集した。サンプルを変性させ、還元し、アルキル化し、脱グリコシル化し、トリプシンで消化させた後、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／ＭＳ分析を行った。トリプシンペプチドの酸化レベルを、ＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂの不在下または存在下でモニタリングした。
ＦＰＯＰ実験において、ｈＮＫＧ２Ａにおける４つの残基Ｍ１６３、Ｆ１７９、Ｈ１８４、およびＬ２０６が、親１３Ｆ３ Ｆａｂとの結合時に、酸化レベルに有意な低減（Ｐ値＜０．０２５）を示した。同様に、ＦＰＯＰ実験において、ｈＮＫＧ２Ａにおける４つの残基Ｍ１６３、Ｆ１７９、Ｈ１８４、およびＬ２０６が、ＮＫＧ２Ａ９との結合時に、酸化レベルに有意な低減（Ｐ値＜０．０２５）を示した。
１３Ｆ３．Ａ４およびＮＫＧ２Ａ．９抗体のいずれについても、Ｆａｂの結合時のＦＰＯＰ保護パーセンテージは、次のように計算した：
図２９Ａは、ＮＫＧ２Ａ．９との相互作用時のｈＮＫＧ２Ａにおける４つの残基（Ｍ１６３、Ｆ１７９、Ｈ１８４、Ｌ２０６）の保護パーセンテージを示す。図２９Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４との相互作用時のｈＮＫＧ２Ａにおける４つの残基（Ｍ１６３、Ｆ１７９、Ｈ１８４、Ｌ２０６）のＦＰＯＰ保護パーセンテージを示す。
ｍＦｃ－ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４配列にマッピングしたエピトープおよび結晶構造。
図３０に示されるように、ＨＤＸ－ＭＳおよびＦＰＯＰによって判定したＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４抗体のエピトープを、ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４配列にマッピングした。ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４配列において、ｍＦｃは、マウスＦｃ領域であり、これが、リンカー配列ＡＳＩＥＧＲ（配列番号１２３）（破線の枠で示される）によって、ｈＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインと連結しており、これが、リンカー配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２４）（破線の枠で示される）によってヒトＣＤ９４タンパク質であるｈＣＤ９４に連結されている。
図３１に示されるように、抗ＮＫＧ２Ａ抗体エピトープ（例えば、ＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４抗体のエピトープ）は、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４／ＨＬＡ－Ｅ結晶構造で可視化することができる。具体的には、図３１は、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４／ＨＬＡ－Ｅ結晶構造における抗ＮＫＧ２Ａ抗体エピトープ（黒色で示される）を示す（ＨＬＡ－Ｅと複合体を形成したヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの結晶構造は、Petrie et al., J. Exp. Med. 205: 725-35 (2008)によって公開されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる）。ＨＬＡ－Ｅ結晶構造は、実線の楕円で示され、ＣＤ９４結晶構造は、破線の楕円で示される。
まとめると、本明細書において論じられるＨＤＸ－ＭＳおよびＦＰＯＰ実験に基づいて、ＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４抗体が結合するＮＫＧ２Ａエピトープは、以下の不連続な結合領域を含む：
領域１：ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５）、
領域２：ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、
領域４：Ｌ（配列番号２のアミノ酸残基２０６）、および
領域５：ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）。
他の実施形態では、本明細書において論じられるＨＤＸ－ＭＳ実験に基づいて、ＮＫＧ２Ａ．９および１３Ｆ３．Ａ４抗体が結合するＮＫＧ２Ａエピトープは、以下の不連続な結合領域を含む：
領域１：ＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦ（配列番号２のアミノ酸残基１５５～１６５）、
領域２：ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷ（配列番号２のアミノ酸残基１７１～１８６）、
領域３：ＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮ（配列番号２のアミノ酸残基１９２～２０３）、および
領域５：ＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣ（配列番号２のアミノ酸残基２１２～２２９）。
エピトープビニング実験
（１）Ｐ１－０６９３６６抗体は１３Ｆ３．Ａ４を交差遮断した
Ｐ１－０６９３６６および１３Ｆ３．Ａ４のエピトープビニング実験を、「サンドイッチ形式」を使用してＳＰＲによって行ったが、この形式では、抗体１を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ＣＭ５チップに固定化し、組換えヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４タンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ＣＭ５チップに流して結合させた後、抗体２をチップに流す。具体的には、１３Ｆ３．Ａ４またはＰ１－抗体を、アミン結合によって、ＣＭ５センサーチップに固定化した。組換えＮＫＧ２Ａタンパク質の溶液を、センサーチップに流すと、Ｐ１－０６９３６６および１３Ｆ３．Ａ４の両方の抗体との結合が観察された。次いで、競合抗体の溶液を、チップに流し、さらなる結合を測定した（ＮＫＧ２Ａとの共結合を示す）。最後に、センサーチップを、結合したＮＫＧ２Ａおよび競合抗体を除去するＭｇＣｌ２の溶液を使用して再生させた。実験は、２５℃で行った。分析のために、参照フローセルとの非特異的結合を、解析フローセルとの結合から除算した。Ｐ１－０６９３６６抗体を、フローセル２に直接固定化した。次いで、２００ｎＭのＮＫＧ２Ａを、フローセル２に流し、およそ６００ＲＵの結合が観察された。続いての１３Ｆ３．Ａ４抗体、Ｐ１－０６９３６６抗体、または緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ）の注入では、結合シグナルの増大は生じなかった。１３Ｆ３．Ａ４抗体を、フローセル３に固定化した。次いで、２００ｎＭのＮＫＧ２Ａを、フローセル３に流し、およそ９００ＲＵの結合が観察された。続いてのＰ１－０６９３６６抗体、１３Ｆ３．Ａ４抗体、または緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ）の注入では、結合シグナルの増大は生じなかった。結論として、Ｐ１－０６９３６６抗体は、エピトープビニング実験の結果に基づくと、１３Ｆ３．Ａ４を交差遮断すると思われた。
（２）１３Ｆ３．Ａ４、２Ｇ６．Ｃ２は、互いに、ならびにＨＬＡ－Ｅを、ヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４と結合するのを遮断した。
「サンドイッチ形式」を使用してＯｃｔｅｔ ＨＴＸ機器で行った別のエピトープビニングおよび遮断実験では、１３Ｆ３．Ａ４抗体、２Ｇ６．Ｃ２抗体、ならびにＨＬＡ－Ｅを、ヒトＮＫＧ２Ａとの同時結合について試験した。抗体およびビオチン化ＨＬＡ－Ｅを、別個のＯｃｔｅｔセンサーチップに捕捉した。次に、必要に応じて、残りの捕捉部位を遮断し、ヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４を結合させた。続いて、１３Ｆ３．Ａ４抗体、２Ｇ６．Ｃ２抗体、およびＨＬＡ－Ｅの、事前に結合させたＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４との結合を、試験し、これらの３つのサンプルの対での組合せをすべて調べた。これらのエピトープビニング実験により、１３Ｆ３．Ａ４および２Ｇ６．Ｃ２抗体が、互いに、ならびにＨＬＡ－Ｅを、ヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４との結合から遮断することが示された。
（３）２Ｇ６．Ｃ２抗体の結合活性
Ｏｃｔｅｔ実験はまた、２Ｇ６．Ｃ２抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４と結合するだけでなく、カニクイザルＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４－ｍＦｃコンストラクトとも結合することも示した。２Ｇ６．Ｃ２抗体の、ヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４ヘテロ二量体との結合の動態を、３７℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器において、抗ｈＦｃ抗体を事前に固定化したＣＭ４チップに抗体を捕捉し、抗原を適切な濃度範囲で検体として流すことによって、測定した。すべてのデータは、二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．１を使用して、１：１結合モデルに適合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ実験により、以下に要約されるように、２Ｇ６．Ｃ２抗体が、１３Ｆ３．Ａ４抗体よりも弱い結合親和性を有すること、およびそれがＮＫＧ２Ｃとのいくらかの交差反応性を有することが、示された。



さらなる抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見
図３２Ａ～Ｂに示されるように、特定の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（１３Ｆ３．Ａ４、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１）の重鎖および軽鎖可変領域を、Ｃｌｕｔｓａｌ ２．１ソフトウェアを使用してアラインメントした。このアラインメントは、以下のコンセンサスＣＤＲ配列を有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の発見をもたらした。
Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合を低減または防止するための不活性Ｆｃ（ＩｇＧ１．３）を有するＮＫＧ２Ａ．９抗体の開発
ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ８＋ ＴおよびＮＫ細胞上に発現される阻害性受容体であるため、本発明者らは、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８＋ ＴまたはＮＫ細胞のアゴニズムまたは枯渇を回避または低減させることにより、抗腫瘍免疫が増強されると考えている。したがって、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断は、ヒトＦｃγＲと相互作用することができない抗ＮＫＧ２Ａ抗体に所望される。
以下の研究１に要約されるように、本発明者らは、１９５６肉腫モデルにおいて、腫瘍成長阻害を媒介することにおけるアイソタイプの役割を評価した。ＮＫＧ２Ａ．２抗体は、抗腫瘍活性におけるＦｃの役割を評価するためのｍＩｇＧ２ａまたはｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａアイソタイプとして生成されたマウス代理抗体である。



埋込み後２１日目に、ＮＫＧ２Ａ．２－ｍＩＧｇ１ Ｄ２６５Ａは、アイソタイプ対照と比較して、腫瘍成長を４１％阻害した。換言すると、不活性Ｆｃを含む抗ｍＮＫＧ２Ａ ｍＡｂ（ｍＮＫＧ２Ａ．２ ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）での腫瘍保持マウスの処置は、強力な抗腫瘍活性をもたらした。しかしながら、ＮＫＧ２Ａ．２ ｍＩｇＧ２ａを投与した場合、抗体は、腫瘍成長を阻害しなかった。換言すると、マウスＦｃγＲ（ｍＮＫＧ２Ａ．２ ｍＩｇＧ２ａ）と相互作用することができるＦｃを有するＮＫＧ２Ａ．２抗体を試験した場合、腫瘍は、インビボで急速に成長した。
ＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗ｈＮＫＧ２Ａ ｍＡｂを試験した場合、特に、強力な刺激の存在下において、ＮＫ細胞応答が阻害された。
まとめると、これらのデータは、不活性ＦｃヒトＩｇＧ１．３の有益な機能が、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の好ましいアイソタイプであったことを示した。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、Ｔ細胞の機能的活性を増強させた
このアッセイでは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ（一本鎖ＯＫＴ３およびリガンドＨＬＡ－Ｅを発現するように遺伝子操作されているチャイニーズハムスター卵巣細胞）によって刺激したＮＫＧ２Ａ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株において、ＮＫ－κＢシグナル伝達の阻害を逆転させるその機能的活性に関して試験した。ＮＫＧ２Ａ発現Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ標的細胞とともに、１：１のエフェクター細胞対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で、共培養した。ＮＫＧ２Ａ．９抗体またはアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ１．３）を、滴定濃度で、共培養物に添加した。３７℃で４時間の刺激の後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（１００μｌ／ウェル）およびＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して、ルシフェラーゼ活性を定量した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）データを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎｃからのＰｒｉｓｍ ｖ５．０１ソフトウェアを使用してプロットした。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅに媒介されるＴ細胞応答の阻害を逆転させた。具体的には、図３３に示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、０．２ｎＭのＥＣ５０値で、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅによって刺激されるＮＫＧ２Ａ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株におけるＮＫ－κＢシグナル伝達の阻害を逆転させた。
単独または抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体と組み合わせたＮＫＧ２Ａ．９抗体のＩＦＮ－γ産生
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１（一本鎖ＯＫＴ３およびリガンドＨＬＡ－ＥおよびＰＤ－Ｌ１を発現するように遺伝子操作されているチャイニーズハムスター卵巣細胞）と共培養した、健常ドナーのＰＢＭＣから単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔにおいて、ＩＦＮ－γを誘導した。増強されたＩＦＮ－γ産生は、Ｔ細胞機能性の増強の尺度である。効果は、ＮＫＧ２Ａ．９を抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体と組み合わせた場合に有意に増幅された。
簡単に述べると、図３４Ａに示されるように、健常ＰＢＭＣから単離したＴ細胞を、ＮＫＧ２Ａ．９抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＢＭＳ－９３６６５９）、またはこれらの組合せの存在下において、４日間、照射したＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベートした。Ｔ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配およびヒトＴ細胞単離キット（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ヒト全血から単離した。細胞生存率は、細胞カウンター（Ｎｅｘｃｅｌｃｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ ２０００）によって判定すると、９０％を上回っていた。１．５×１０５個の細胞を、ｒｈＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地において、アイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ１．３）またはＮＫＧ２Ａ．９および／もしくは抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体（ＢＭＳ－９３６６５９）のいずれかの存在下において、２．５×１０４個の照射した（６７，０００ＲＡＤで８０分間、Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ、ＲＳ－２０００ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１細胞とともに、４日間共培養した。
（ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡＥ／ＰＤ－Ｌ１細胞は、一本鎖ＯＫＴ３ならびにリガンドＨＬＡ－ＥおよびＰＤ－Ｌ１を発現するように遺伝子操作されているチャイニーズハムスター卵巣細胞である）。培養の４日目に、細胞を採取し、抗ヒトＣＤ４、抗ヒトＣＤ８、生／死、抗ヒトＮＫＧ２Ａ（２７Ｈ４クローン）で染色した。ＩＦＮ－γ産生を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを使用して、細胞内サイトカイン染色によって評価した。固定された細胞を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）で読み取った。ＮＫＧ２Ａ＋またはＮＫＧ２Ａ－ ＣＤ８ Ｔ細胞間でのＩＦＮ－γのパーセントを、ＦｌｏｗＪｏによって計算した。
図３４Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた場合に、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生の用量依存的増強が、観察された。注目すべきことにＩＦＮ－γ産生の増大は、ＮＫＧ２Ａ－ ＣＤ８ Ｔ細胞においては観察されず、これにより、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の作用が、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞に特異的かつ固有であったことが示された。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体はまた、ＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１と共培養したヒト腫瘍から単離したＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞においてもＩＦＮ－γを誘導した。効果は、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ＢＭＳ－９３６６５９）と組み合わせた場合に有意に増幅された。簡単に述べると図３５Ａ～Ｂに示されるように、腎細胞癌、黒色腫、または子宮内膜腫瘍サンプルに由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ＮＫＧ２Ａ．９抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、またはこれらの組合せの存在下において、４日間、照射したＣＨＯ／ｓｃＯＫＴ３／ＨＬＡ－Ｅ／ＰＤ－Ｌ１と共培養した。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、対照モノクローナル抗体と比べてＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ ＴＩＬによるＩＦＮ－γレベルを増大させなかったが、一方で抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アイソタイプ対照抗体と比べて、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ ＴＩＬによるＩＦＮ－γレベルを刺激した（Ｐ＝０．０１）。図３５Ｂに示されるように、アイソタイプ対照と比較して（Ｐ＝０．００３）、ならびに抗ＰＤ－Ｌ１単独と比較して（Ｐ＝０．０４）、ＮＫＧ２Ａ．９抗体および抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂの組合せで、最大のＩＦＮ－γ応答が観察された。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、望ましいことに、ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合した後に、内部移行される
上述の実施例に記載されるように、本発明者らは、ヒトＣＤ８＋ Ｔ またはＮＫ細胞をＮＫＧ２Ａ．９抗体とともにインキュベートした後に、ＮＫＧ２Ａの表面発現の下方制御を観察した。ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、細胞内に内部移行されたかどうかを判定するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＮＫＧ２Ａ．９抗体またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体（ＫＬＨヒトＩｇＧ１抗体）を、ＮＫＬ細胞に添加し、細胞内および表面に結合したモノクローナル抗体のレベルを、測定した。抗体の内部移行は、抗体の受容体との標的結合を示す。図３６Ａに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、１時間以内に内部移行を示し、２０時間にわたって増大した。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ＮＫＬ細胞に徐々に内部移行され、２０時間で約４０％の内部移行のプラトーレベルに達した。用量応答形式でＮＫＧ２Ａ．９抗体の内部移行を定量するために、ｐＨ感受性色素アッセイを、ＮＫＬ細胞を使用して行った。図３６Ｂに示されるように、２時間で、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、０．５ｎＭのＥＣ５０で用量依存的内部移行を示した。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、ナチュラルキラー細胞脱顆粒化およびＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解を増大させた
正常ドナーに由来するＰＢＭＣを使用したインビトロ実験において、活性化ＮＫ細胞における抗ＮＫＧ２Ａ抗体によるＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用の遮断は、ＮＫ細胞脱顆粒化の増大をもたらした。図３７Ａに示されるように、正常なＰＢＭＣドナーから単離されたＮＫ細胞を、組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－２で一晩活性化した。ＮＫ細胞を、次いで、ＨＬＡ－Ｅを発現するヒトＢ－リンパ芽球様標的細胞株７２１．２２１と共培養した。図３７Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、フローサイトメトリーによりＣＤ１０７ａ発現％によって測定される場合、アイソタイプと比較して、用量依存的様式で、ＮＫ細胞脱顆粒化を増大させた。ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅに媒介されるＮＫ細胞細胞傷害性の阻害の逆転を、インビトロで評価した。図３７Ｃに示されるように、ヒト口腔癌細胞株ＨＳＣ－３を、その内因性ＨＬＡ－Ｅ発現に基づいて選択した。ＮＫＬ細胞を、ＮＫＧ２Ａ．９またはアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ１．３）の存在下において、２０：１のエフェクター対標的の比で、カルセインＡＭ（細胞透過性色素）で標識したＨＳＣ－３標的細胞と共培養した。２時間後に放出されたカルセインの量を測定し、これを使用して標的細胞溶解のレベルを示した。図３７Ｄに示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、アイソタイプと比較して、用量依存的様式で、ＨＬＡ－Ｅ発現腫瘍細胞の溶解を増大させた。
１３Ｆ３．Ａ４抗体は、ＮＫ細胞機能性の増強を示した
図３８Ａは、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅと共培養したＮＫＬ細胞におけるＩＦＮ－γ産生に対する１３Ｆ３．Ａ４抗体の作用を測定するために使用した方法を図示する。ＮＫＧ２Ａ．９抗体と同様に、図３８Ｂは、１３Ｆ３．Ａ４抗体が、アイソタイプと比較して、ＣＨＯ／ＭＩＣＡ／ＨＬＡ－Ｅ（ＭＩＣＡおよびＨＬＡ－Ｅを発現するように遺伝子操作されているチャイニーズハムスター卵巣細胞）と共培養したナチュラルキラーリンパ球（ＮＫＬ）におけるＩＦＮ－γ産生を増大させたことを示す。
ＮＫＧ２Ａ．９の結合親和性の比較
ｈＮＫＧ２Ａ－ｈＣＤ９４との結合に関するＮＫＧ２Ａ．９、Ｚ２７０、およびモナリズマブの動態および結合親和性の比較を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサー機器、ならびにヒトＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４の細胞外ドメインのヘテロ二量体を使用して、行った。温度は３７℃であり、泳動緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および１ｇ／Ｌ ＢＳＡを補充したＨｅｐｅｓ緩衝食塩水（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ｐＨ７．４であった。抗体を、抗ヒトＦｃ捕捉試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０８１－０１）を事前に固定化したＣ１センサーチップに捕捉した。ヒトＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを、最高濃度２５０ｎＭで２つの５連続３倍濃度系列において、捕捉した抗体に検体として流した。一方の濃度系列を、単一サイクル動態に使用し、もう一方は、多重サイクル動態に使用し、８３ｎＭで二連に注入した。すべてのデータは、二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．１を使用して、１：１結合モデルに適合させた。独立して２回行い、２回目はそれぞれのモノクローナル抗体について、異なるフローセルを使用した。したがって、４つのＫＤ測定値を得た。該当する場合、動態適合および安定状態適合の両方を使用して、データを分析した。
図５１Ａ～Ｄは、単一サイクルおよび多重サイクルの両方の動態を使用して四連測定においてＢｉａｃｏｒｅによって判定した、３７℃におけるＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒトＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４ヘテロ二量体との結合親和性を示す。図５１Ａ～Ｄは、秒単位での時間に対するＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４結合の応答単位（ＲＵ）を示す。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、このアッセイにおいて、以下の表に要約されるように、Ｚ２７０（ＫＤ＝２５ｎＭ±３ｎＭ、平均±標準偏差）およびモナリズマブ（ＫＤ＝２６ｎＭ±３ｎＭ）よりも高い親和性（ＫＤ＝１６ｎＭ±０．４ｎＭ）を示した。ＮＫＧ２Ａ．９の全体的な親和性は、このアッセイにおいて、実施例３におけるＮＫＧ２Ａ．９ Ｆａｂを使用した実験よりも高く、この差は、結合速度（ｋａ）がより高速であるが、解離速度（ｋｄ）は非常に類似していることに起因し得る。このアッセイにおけるより高速な結合速度（ｋａ）は、より最適化された条件、特に、ヒト対カニクイザルＮＫＧ２Ａの試薬の制限が低いために使用したフラットセンサーチップの使用を反映している可能性がある。
表-抗NKG2A抗体の親和性および抗体/検体複合体の半減期の比較




KDは、4回の測定から平均した。標準偏差は、該当する場合に示す。
１つの抗体結合部位が１つのＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４ヘテロ二量体に結合するなどの１：１複合体の半減期は、抗体／検体複合体（ここでは、抗体：ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体）の量の半分が解離するのにかかる時間である。半減期は、数学的に、ｌｎ（２）／ｋｄと記述することができる。抗体：ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体の半減期は、ＮＫＧ２Ａ．９については、Ｚ２７０およびモナリズマブ（３～４秒）のいずれよりも、およそ１２倍長かった（４１秒）。
細胞表面における一価結合（例えば、低い抗原発現に起因して）の条件下では、ＮＫＧ２Ａ．９は、したがって、Ｚ２７０およびモナリズマブよりも長い期間、ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体と結合することができる。本発明者らは、抗体／ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体のこの長い半減期により、リガンド遮断効率の増大が可能であると考える。換言すると、モナリズマブ／ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４またはＺ２７０／ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４と比較して長いＮＫＧ２Ａ．９／ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体の半減期は、モナリズマブまたはＺ２７０と比較して、より良好にＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用を遮断するＮＫＧ２Ａ．９抗体の能力の根拠を提供する。
インビトロにおける抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体の特性
抗ｍＮＫＧ２Ａ代理抗体であるＮＫＧ２Ａ．２（２０Ｄ５クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）およびＮＫＧ２Ａ．３（７Ｅ６クローン、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）は、インビトロで評価した場合、ＮＫＧ２Ａ．９抗体と類似の機能的特性を有していたため、これらの抗体は、概念の証明、作用機序（ＭＯＡ）、およびヒト用量予測研究のための代理抗体として機能することが可能である。抗ＮＫＧ２Ａマウス抗体ＮＫＧ２Ａ．２およびＮＫＧ２Ａ．３は、以下の機能的特性を有していた：
１）ｍＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との結合に関するＥＣ５０値が、０．２ｎＭ（ＮＫＧ２Ａ．２）および０．３ｎＭ（ＮＫＧ２Ａ．３）であったこと。
２）Ｑａ－１ｂ四量体のｍＮＫＧ２Ａ発現ＣＨＯ細胞との結合の遮断に関するＩＣ５０値が、０．３ｎＭ（ＮＫＧ２Ａ．２）および０．４ｎＭ（ＮＫＧ２Ａ．３）であったこと。（Ｑａ－１ｂは、ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅの社内相同体である。したがって、これは、ＣＨＯ ｈＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ遮断アッセイに匹敵する）。
３）ＮＫＧ２Ａ．２およびＮＫＧ２Ａ．３が、ＮＫＧ２Ａ－／－ ＮＫまたはＣＤ８ Ｔ細胞とは結合しなかったため、ｍＮＫＧ２Ａと特異的に結合したこと。
４）ＮＫＧ２Ａ．２およびＮＫＧ２Ａ．３抗体が、マウスＮＫ細胞脱顆粒化の用量依存的増大を誘導したこと。
抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体は、単独またはその他の薬剤との組合せの両方で、インビボで抗腫瘍活性を誘導した
（１）抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体は、マウスモデルにおいて、単剤療法として抗腫瘍活性を誘導した
抗ｍＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体（ＮＫＧ２Ａ．２およびＮＫＧ２Ａ．３抗体を含む）は、以下の研究２に要約されるように、単一の薬剤として投与した場合に、ＣＴ２６結腸癌、１９５６肉腫、およびＡ２０ Ｂ細胞リンパ腫皮下（ＳＣ）モデルにおいて、腫瘍成長を阻害した。






図３９に示されるように、ＣＴ２６腫瘍モデルを用いた用量滴定研究（上述の研究番号２）において、ＮＫＧ２Ａ．３抗体は、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合に、腫瘍サイズを低減させた（それぞれ、平均腫瘍体積に４８％、５６％、および３０％の低減）。
（２）抗ｍＰＤ－１および抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体の組合せは、複数のマウス腫瘍モデルにおいて、いずれか単独の薬剤だけと比較して、抗腫瘍活性を増強させた。
抗ＮＫＧ２Ａ（ｍＮＫＧ２Ａ．３－ｍＧ１－Ｄ２６５Ａ（７Ｅ６クローン）および抗ＰＤ－１抗体（ＰＤ１－４Ｈ２－ｍＧ１－Ｄ２６５Ａ、６Ａ１クローン）での共遮断は、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体単独により単剤活性が示されたモデルにおいて、腫瘍成長を低減した。抗ｍＰＤ－１および抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体の組合せは、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、いずれか単一の薬剤のみよりも高い抗腫瘍活性を示した。
ＣＴ２６モデルにおいて、抗ｍＮＫＧ２Ａまたは抗ｍＰＤ－１抗体での単剤処置は、それぞれ、平均腫瘍体積を４３％および６１％低減した。ＮＫＧ２ＡおよびＰＤ－１の共遮断は、比較的強力な腫瘍成長の阻害をもたらし、１０匹中７匹のマウスが、研究の終了時に腫瘍なし（ＴＦ）となり（図４０Ｄ）、平均腫瘍体積に９１％の減少があった（図４０Ｅ）。図４０Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４０Ａ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独（図４０Ｂ）、抗ｍＰＤ－１抗体単独（図４０Ｃ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ１抗体の組合せ（図４０Ｄ）で処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４０Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体単独、抗ｍＰＤ－１抗体単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体および抗ｍＰＤ－１抗体の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。
同様の効果が、以下の研究３および４に要約されるように、１９５６肉腫またはＡ２０リンパ腫ＳＣ腫瘍を接種したマウスにおいて観察された。
マウス腫瘍モデル研究3および4の概要




ＮＫＧ２Ａ／ＰＤ－１共遮断は、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体単独（ＮＫＧ２Ａ．３－ｍＧ１－Ｄ２６５Ａ（７Ｅ６クローン）またはＮＫＧ２Ａ．２－ｍｇ１－Ｄ２６５Ａ（４Ｆ１２クローン））が単剤活性を示さなかったモデルにおいてさえも、腫瘍成長阻害を改善した。Ｍ１０９肺腫瘍モデルにおいて、抗ＮＫＧ２Ａおよび抗ＰＤ－１抗体の共遮断は、以下の研究５に要約されるように、アイソタイプ対照と比較して、平均腫瘍体積に７２％の減少をもたらした。



ＢＲ５．１卵巣腫瘍モデルにおいて、ＮＫＧ２ＡおよびＰＤ－１の共遮断は、以下の研究６に要約されるように、アイソタイプ対照と比較して、平均腫瘍体積に３６％の減少をもたらした。



本発明者らは、以下の研究７に示されるように、ＭＣ３８結腸癌モデルにおいて、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独も抗ｍＰＤ－１との組合せでも活性を観察しなかった。



（３）抗ＮＫＧ２Ａおよび抗ＰＤ－１抗体は、マウスナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗腫瘍活性および機能性を増強させた。
ＮＫＧ２Ａ／ＰＤ－１共遮断の有効性は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方に依存していた。ＣＴ２６保持マウスを、抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＰＤ－１モノクローナル抗体での処置の前に、ＣＤ８＋ ＴまたはＮＫ細胞のいずれかを枯渇させた。抗ｍＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａ．３、７Ｅ６クローン、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）／抗ｍＰＤ－１（４Ｈ２クローン、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）抗体で処置したマウスは、以下の研究８に要約されるように、枯渇モノクローナル抗体を受容しなかったマウス（平均腫瘍体積７７８±６８６ｍｍ３）と比較して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（１９１％の増大、平均腫瘍体積２２７１±６９９ｍｍ３）またはＮＫ細胞（９４％の増大、平均腫瘍体積１５０９±８００ｍｍ３）のいずれかを枯渇させた場合に、平均腫瘍体積の増大を有した。
マウス腫瘍モデル研究8の概要



ＮＫＧ２Ａ／ＰＤ－１共遮断は、ＮＫおよびＣＤ８＋ Ｔ ＴＩＬの機能性を増強させた。４回のモノクローナル抗体の投薬後（処置開始後１２日目）に、ＮＫおよびＣＤ８＋ Ｔ ＴＩＬを、フローサイトメトリーによって分析した。抗ｍＮＫＧ２Ａ／抗ｍＰＤ－１処置は、図４１Ａに示されるように、アイソタイプ対照処置群と比べて、ＣＤ１０７ａ＋ ＮＫ細胞の頻度の増大をもたらした。ＣＴ２６モデルにおける免疫表現型決定研究により、抗ＮＫＧ２Ａおよび抗ＰＤ－１抗体での共遮断が、ＮＫおよび腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ－γの統計学的に有意な増大を示したことが示された。抗ｍＮＫＧ２Ａ／抗ｍＰＤ－１処置は、ＣＤ１０７ａ＋ ＮＫ細胞の頻度の増大をもたらし、アイソタイプ対照処置群と比べて、およそ１．５倍の増大であった。細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度における類似の増大が、図４１Ｂに示されるように、腫瘍特異的ＡＨ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞で確認され、アイソタイプ対照処置群と比べて、ＣＤ１０７ａ＋ グランザイムＢ＋ ＡＨ１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞におよそ１３倍の増大があった。ＮＫＧ２Ａ／ＰＤ－１共遮断はまた、ＩＦＮ－γ産生ＡＨ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度も増大させ、図４１Ｃに示されるように、アイソタイプ対照処置群と比べて、ＩＦＮ－γ＋ ＡＨ－１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞におよそ５．５倍の増大があった。
まとめると、抗ＮＫＧ２Ａおよび抗ＰＤ－１抗体は、単独または組合せのいずれかで、腫瘍特異的ＡＨ－１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞の中で、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を増大させた。抗ＮＫＧ２Ａおよび抗ＰＤ－１抗体の投与は、ＣＴモデルにおいて、ＮＫおよび腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮ－γを増大させた。
（４）抗ｍＰＤ－１抗体は、マウス肉腫モデルにおいて、抗ｍＮＫＧ２Ａと組み合わせた場合に、抗ｍＬＡＧ－３または抗ｍＴＩＧＩＴ抗体との組合せと比較して、より高い程度に腫瘍成長を阻害した。
抗ＬＡＧ－３および抗ＰＤ－１抗体によるＰＤ－１と、抗ＴＩＧＩＴ抗体との二重遮断は、マウス腫瘍モデルにおいて、単剤処置と比較して、腫瘍成長を相乗的に遅延させることが、これまでに示されている。（Woo et al., "Immune inhibitory molecules LAG-3 and PD-1 synergistically regulate T-cell function to promote tumoral immune escape." Cancer Res 72:917-27 (2012)、Johnston RJ et al., "The immunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8 (+) T cell effector function." Cancer Cell 26:923-937 (2014)。
本発明者らは、以下の研究９に要約されるように、抗ｍＰＤ－１抗体を抗ｍＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａ．３、７Ｅ６クローン、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５ａ）、抗ｍＬＡＧ－３（１Ａ５クローン、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）、または抗ｍＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）抗体と組み合わせることの、１９５６肉腫モデルにおける腫瘍成長制御に対する作用を、試験した。
マウス腫瘍モデル研究9の概要

ＰＤ－１／ＮＫＧ２Ａ二重遮断は、１）抗ＰＤ－１／抗ＬＡＧ－３抗体（１０匹中４匹のマウスが腫瘍なし）および２）抗ＰＤ－１／抗ＴＩＧＩＴ抗体（１０匹中１匹のマウスが腫瘍なし）の組合せと比較して、最も強力な抗腫瘍効果（１０匹中６匹のマウスが腫瘍なし）を示した。
抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体を、複数のマウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を増強させるために、抗ｍＣＴＬＡ－４および抗ＬＡＧ－３抗体を含むその他のチェックポイント阻害剤と組み合わせた。１９５６モデルにおいて、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ｍＣＴＬＡ－４と組み合わせた場合に強い活性を示し、研究１０に要約される研究および図４２Ａ～Ｅに示されるように、アイソタイプ対照と比較して、平均腫瘍成長体積に８７％の低減があり、１０匹中３匹のマウスが、腫瘍なしであった。
マウス腫瘍モデル研究10の概要



図４２Ａ～Ｅは、１９５６マウス肉腫モデルにおける単独または組合せのいずれかでの抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（０．１ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍活性を示す。図４２Ａ～Ｄは、アイソタイプ（図４２Ａ）、抗ｍＣＴＬＡ－４抗体（図４２Ｂ、ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ２ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体（図４２Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せ（図４２Ｄ）で処置したマウスにおける腫瘍埋込み後の様々な時点における腫瘍体積を示す。図４２Ｅは、アイソタイプ、抗ｍＣＴＬＡ－４単独、抗ｍＮＫＧ２Ａ単独、または抗ｍＮＫＧ２Ａおよび抗ｍＣＴＬＡ－４の組合せで処置したマウスにおける、時間（腫瘍埋込み後の日数）の関数としての平均腫瘍体積を示す。
Ａ２０リンパ腫静脈内モデルにおいて、抗ＮＫＧ２Ａ抗体単独では、生存率１０％で生存利益があった。抗ｍＰＤ－１抗体または抗ｍＬＡＧ－３抗体のいずれかとの併用療法は、それぞれ、生存利益を５０％および７０％に拡大した。抗ｍＮＫＧ２Ａ抗体、抗ｍＰＤ－１抗体、および抗ｍＬＡＧ－３抗体の三重の組合せは、以下の研究１１に要約され、図４３に示されるように、生存率８０％で最大の利益をもたらした。
マウス腫瘍モデル研究11の概要



図４３は、Ａ２０全身性リンパ腫モデルにおける抗ｍＮＫＧ２Ａ、抗ＰＤ－１、抗ＬＡＧ３抗体の、単独および組合せの両方の抗腫瘍活性を示す。具体的には、図４３は、アイソタイプ、抗ｍＮＫＧ２Ａ、抗ｍＰＤ－１、抗ＬＡＧ３単独またはこれらの組合せで処置したマウス（ｎ＝１０匹／群）における、腫瘍埋込み後の様々な時点における生存パーセントを示す。
まとめると、これらのデータは、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、および抗ＬＡＧ－３抗体でのコンビナトリアル遮断が、マウス腫瘍成長の低減において増強された有効性を有することを示した。
（５）インビボ投与した抗ｍＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体は、マウスＮＫ細胞の表面ＮＫＧ２Ａを下方制御した
抗ｍＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体（ＮＫＧ２Ａ．３（７Ｅ６クローン）、ｍＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ）での処置の後に、ＮＫＧ２Ａの発現レベルは、図４４に示されるように、脾臓およびＴＩＬ ＮＫ細胞の両方において、アイソタイプと比較して、低減された。図４４は、マウスＣＴ２６結腸癌モデルの脾臓および腫瘍において、最初の処置後５日目に測定した、ＮＫＧ２Ａ＋ ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞のパーセントを示す。本発明者らは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与後にＮＫＧ２Ａ発現の下方制御を観察し、これは、それを標的結合のマーカーとして使用することができることを示す。下方制御とは、表面ＮＫＧ２Ａ発現の下方制御を指す。標的結合は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＮＫＧ２Ａ受容体と結合することを意味する。
本明細書において論じられる内部移行データと合わせると、これらのデータは、ＮＫＧ２Ａ下方制御が、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の標的結合マーカーとしての機能を果たすことを裏付ける。
生物物理学的特性、親和性、およびエピトープマッピング、ならびに免疫原性
本明細書に記載されるように、完全ヒト抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体ＮＫＧ２Ａ．９の可変配列は、ＶＨ－Ｉ１０７Ｔ生殖系列逆突然変異およびＶＫ－Ｎ３０アミノ酸残基の脱アミド化傾向を軽減するためのＶＫ－Ｎ３０Ｓ突然変異を有する１３Ｆ３．Ａ４ハイブリドーマに由来する。定常領域は、ＩｇＧ１ｆ骨格（ＩｇＧ１．３）に由来し、抗体のＦｃγ受容体およびＣ１ｑとの結合を最小化または排除するために、重鎖における３つの突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａを含む。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、１３Ｆ３－ＶＨ－Ｉ１０７Ｔ－ＶＨ－Ｎ３０Ｓ ＩｇＧｆ１．３およびＮＫＧ２Ａ．９ ＩｇＧｆ１．３としても知られている。以下の表は、ＥｘｐｉＣＨＯ一過的発現系に由来する材料の分析に基づくＮＫＧ２Ａ．９抗体の生物物理学的特徴を要約する。







*脱グリコシル化および部分的還元方法を軽鎖および重鎖の質量の確認に使用した。
**ヒトNKG2A-CD94ヘテロ二量体(hNKG2A-CD94-mFc)を結合研究の抗原として使用した。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体の生物物理学的特性は、好ましいものであった。ＮＫＧ２Ａ．９抗体の同一性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび質量分析による分析によって確認した。抗体の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験すると、９８％を上回った。単一のＮグリコシル化部位が、重鎖のＮ２９７において確認され、グリカンプロファイルは、ＣＨＯ細胞において発現されるＩｇＧ１モノクローナル抗体のグリカンプロファイルと一致したグリカンプロファイルであった。フコシル化グリカン（Ｇ０ｆ、Ｇ１ｆ、Ｇ２ｆ、およびＭａｎ５）のみが、それらに確認された。ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、良好な熱安定性および可逆性を有し、すなわち、抗体は、熱ストレス下においてその構造の完全性を保持し、ストレスを解放した場合に中等度の再フォールディング特性を有した。
前臨床薬物動態研究
薬物動態データは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の有効性を裏付けた。カニクイザルへの静脈内（ＩＶ）投与後に、ＮＫＧ２Ａ．９は、０．５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、線形抗体薬物動態（ＰＫ）特徴を示し、予測されるヒト半減期（Ｔ１／２）は１６日であった。血中における完全（９９％）受容体占有率（ＲＯ）を達成するための安定状態トラフ濃度（Ｃｔｒｏｕｇｈ，ｓｓ）を標的とするヒト有効用量は、４週間ごとに２．５ｍｇ／ｋｇ ＩＶと算出された。皮下（ＳＣ）投与後の用量は、ヒトにおけるＳＣバイオアベイラビリティ（典型的には５０～１００％）および緩徐なＳＣ吸収率によりＣｔｒｏｕｇｈ，ｓｓが改善されるかどうかに応じて変動し得る。
製剤化の取り組みにより、プラットフォーム製剤アプローチを、すぐに使用できる（ＲＴＵ）製剤に使用することができることが示された。高い（１５０ｍｇ／ｍＬ）濃度および予測されたヒト有効用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）でのＮＫＧ２Ａ．９抗体の予備的な粘度および安定性評価は、皮下投与が、最適化された製剤条件下において可能であり得ることを示す。
毒性学データは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体が、安全に投与できることを示した。カニクイザルにおける０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇの用量は、十分に耐容され、異常は特定されなかった。４３日目における受容体占有率（０．１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ３６％、８４％、および９７％）ならびに標的結合（表面ＮＫＧ２Ａの下方制御）は、すべての用量で示された。下方制御とは、表面ＮＫＧ２Ａ発現の下方制御を指す。本発明者らは、抗体の投与後にＮＫＧ２Ａ発現の下方制御を観察し、これは、それを標的結合のマーカーとして使用することができる（すなわち、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａ受容体と結合する）ことを示す。
マウスにおける抗ｍＮＫＧ２Ａ．３の薬物動態
薬物動態研究を、Ｃ５７ＢＬ６マウスへの静脈内（ＩＶ）または腹膜内（ＩＰ）投与後に、ＮＫＧ２Ａ．９抗体と類似の特性を有する抗ｍＮＫＧ２Ａマウス代理物（ＮＫＧ２Ａ．３）を用いて、行った。表３は、この研究から得られた薬物動態パラメーターを要約する。




注記:PKパラメーターは、血清薬物濃度-時間データの非コンパートメント解析を使用して得た。n.a.は該当なしを示す。
*血清薬物レベルは、連続マイクロサンプリングから得たものであり、理論上の希釈係数17または実験により判定した希釈係数20のいずれかについて補正した。**初回サンプリング時点。
ＮＫＧ２Ａ．３抗体は、マウスにおいて非線形薬物動態を示した。１：３：３０の静脈内用量比で、曲線下面積（ＡＵＣ）比は、１：５．１：９７であった。終末期半減期は、用量を０．３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに増大させると、３．２日間から９．４日間に増大した。同様に、１：１００のＩＰ用量比で、ＡＵＣ比は、０．１～１０ｍｇ／ｋｇで１：５７１であった。加えて、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成は、ＮＫＧ２Ａ．３のＰＫに有意に影響を及ぼさなかった。まとめると、これらのデータは、ＮＫＧ２Ａ．３抗体が、マウスにおいて標的に媒介される薬物消長（ＴＭＤＤ）を受けたことを示した。
ＩＰバイオアベイラビリティは、１０ｍｇ／ｋｇにおけるＡＵＣ値をＩＶ経路とＩＰ経路の間で比較した場合、完全であった。加えて、腫瘍保持マウスと非腫瘍保持マウスとの間、ならびにＣ５７ＢＬ６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスとの間で、全身曝露に明らかな違いはなかった。
さらに、単回用量ＰＫ／薬力学（ＰＤ）研究を、ＣＴ２６モデルにおいてＮＫＧ２Ａ．３抗体を用いて行い、薬物レベルおよび受容体占有率（ＲＯ）の時間過程を、循環中および腫瘍の両方において判定した。平均の腫瘍対血清薬物濃度比は、０．１０±０．０７（Ｎ＝３３）であり、血中および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＲＯは、１ｍｇ／ｋｇのマウス有効用量で、完全であった。
カニクイザルにおけるＮＫＧ２Ａ．９抗体の薬物動態
本発明者らは、０．５ｍｇ～５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、カニクイザルにおけるＮＫＧ２Ａ．９抗体の薬物動態特徴を特徴付けた）。単回用量毒物動態（ＴＫ）／ＰＤおよび耐容性研究から得られたＮＫＧ２Ａ．９抗体のＰＫパラメーターを、以下の表４に要約する。




注記:PKパラメーターは、血清薬物濃度-時間データの非コンパートメント解析を使用して得た。*初回サンプリング時点。
**ADAにより影響を受ける2つの薬物濃度は、T1/2計算に含めなかった。
ＡＵＣ０－４２ｄは、０．５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量で用量に比例しており、半減期は１４日間から２３日間の範囲に及んだ。加えて、ＰＫ結果は、１匹のサルにおいてのみ、ＡＤＡによって影響を受けた。さらに、サル血中ＲＯデータのＰＫ／ＰＤモデリングにより、血清薬物ＥＣ５０が、２０±５．４ｎＭであったことが判明し、これは、３１±５．４ｎＭのインビトロＥＣ５０と一致する。
結論として、研究は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、良好な受容体占有率を示し、カニクイザルにおいて十分に耐容性であったことを示した。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒト薬物動態
ＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒトＰＫは、サルにおけるものと同一となることが想定される。結果として、以下の表５に要約されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の予測されるヒト静脈内用量は、１０ｍｇ／ｋｇとなり、ヒトにおけるＮＫＧ２Ａ．９抗体の予測される半減期は、１６日間となる。



ヒト有効用量の予測
ＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒト有効用量を、ＲＯに基づくアプローチを使用して、予測した。マウスおよびサルにおけるＲＯならびにマウス抗腫瘍有効性を含む、利用可能なインビトロおよびインビボ前臨床データを、評価した。抗ｍＰＤ－１と組み合わせた最大抗腫瘍効果は、１９５６およびＣＴ２６同系モデルにおいて、３～４日ごとに１ｍｇ／ｋｇを合計５用量（Ｑ３／４Ｄ ｘ５）投与する投与計画で示され、１０ｍｇ／ｋｇまでの用量で、有効性にさらなる改善はなかった。重要なことに、１ｍｇ／ｋｇにおいて、血中および腫瘍（すなわち、ＴＩＬ）の両方において、ＮＫＧ２Ａ受容体は完全に占有されており、完全なＲＯを示した。加えて、サル血中ＲＯデータのＰＫ／ＰＤモデリングにより、インビトロおよびインビボのＲＯ ＥＣ５０間で、一致が明らかとなり、これは、インビトロＥＣ５０を使用して、インビボＲＯを予測することができることを示唆した。まとめると、ＮＫＧ２Ａ．９抗体のヒト有効用量は、１ｎＭのインビトロヒトＲＯ ＥＣ５０を使用して、トラフにおける血中９９％ ＲＯを標的とすることによって、予測される。マウスにおいてＮＫＧ２Ａ．３で観察された平均の腫瘍対血清薬物濃度比は、約０．１０であったため、ヒト腫瘍生検サンプルにおいて抗ＯＸ４０抗体（ＢＭＳ－９８６１７８）で同様の比が観察されたという事実と合わせると、トラフにおける血中９９％ ＲＯを標的とすることにより、処置期間全体で腫瘍において約９０％ ＲＯが得られるであろう。結果として、予測されるヒト有効用量は、４週間ごとに２．５ｍｇ／ｋｇの投与となる。この用量では、予測されるヒト安定状態ＡＵＣおよびＣｔｒｏｕｇｈは、マウスにおける１ｍｇ／ｋｇ Ｑ３／４Ｄｘ５の最大有効用量で達成される曝露をカバーする。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体の安定性および製剤化
製剤化の取り組みにより、プラットフォーム製剤アプローチを、ＮＫＧ２Ａ．９抗体のすぐに使用できる（ＲＴＵ）製剤の開発に使用することができることが示された。１５０ｍｇ／ｍＬでの予備的な粘度および安定性の評価は、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、最適化された製剤化条件下において、皮下投与により投与することができることを示した。
凍結解凍安定性研究および加速安定性研究を含む製剤の評価を、以下の表６に要約されるように、２５ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＫＧ２Ａ．９抗体に関して行った。




*LMW=低分子量、HMW=高分子量
プラットフォーム製剤（２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０、２６０ｍＭスクロース、５０μＭペンテト酸、０．０５％ポリソルベート８０）中２５ｍｇ／ｍＬにおいて、凍結－解凍ストレス（５回のサイクル）中に物理的安定性の問題は観察されなかった。２５ｍｇ／ｍＬにおいてプラットフォーム緩衝液での加速安定性研究を、４℃、２５℃、および４０℃で行った。試験した条件下で３ヶ月間にわたり、機能的活性に影響を及ぼさない微小な化学修飾が、ＮＫＧ２Ａ．９抗体のＣＤＲ領域で観察された。ＮＫＧ２Ａ．９抗体におけるこれらの微小な化学修飾としては、例えば、上昇した温度における溶液の保管に起因して予測される、抗体の結合活性に悪影響を及ぼさなかった、アミノ酸残基の酸化、脱アミド化、および異性体化における変化が含まれる。ＦｃのＶＳＮＫ領域（配列番号１６２）におけるＮ３２６の脱アミド化が、ストレス条件下において観察され（４０℃で３ヶ月後に約１８％）、これは、ＩｇＧ１モノクローナル抗体に典型的である。２５℃で３ヶ月間の保管の後、脱アミド化が観察され、約１．４％で許容可能であった。物理的安定性の問題も機能的活性の消失も、試験した条件下で３ヶ月間にわたって、観察されなかった。
粘度（見かけの粘度＝７．３センチポアズ（ｃＰ））または凝集（０．４％の可溶性凝集体）の問題は、１５０ｍｇ／ｍＬまでのＮＫＧ２Ａ．９抗体濃度で観察されなかった。物理的安定性の問題は、プラットフォーム製剤中１５０ｍｇ／ｍＬにおいて、凍結－解凍ストレス（５回のサイクル）中に観察されなかった。プラットフォーム製剤中１５０ｍｇ／ｍＬにおいて、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、以下の表７に要約されるように、４℃、２５℃、および４０℃で、３ヶ月間、加速安定性に供した。



微小な物理的安定性の問題が、４℃で３ヶ月後および２５℃で１ヶ月後の安定性に観察された（いずれの温度でも高分子量凝集体、ＨＭＷの０．８％の増大）。クリッピングおよび物理的不安定性が、１ヶ月を上回る保管の後に、２５℃および４０℃の上昇温度で観察された。上昇温度でより長い期間の保管後に確認された不安定性は、評価に使用した発見ロットのわずかな汚染によって説明できる可能性がある。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体の組織分布
２０個の凍結ヒト組織パネルにおけるＮＫＧ２Ａ．９抗体を使用した免疫組織化学は、時折の単核細胞発現を示したが、予想外の結合はなかった。主として脾臓において、単核細胞の小サブセットに強力な染色があり、扁桃腺、子宮、胃、小腸、胸腺、および肝臓における単核細胞の染色はわずかであった。
カニクイザルにおけるＮＫＧ２Ａ．９の単回用量薬物動態、毒物動態、耐容性、および薬力学研究
カニクイザルは、完全抗体のＮＫＧ２Ａとの結合が類似しているため、前臨床毒物学種である。加えて、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を使用したサル組織の免疫組織化学的分析は、ヒトのものに類似しており、単核細胞の少サブセットにおいて陽性染色を示す。本明細書において論じられるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、サルにおいてはＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃの両方と結合するが、ヒトにおいてはＮＫＧ２Ａに選択的に結合し、ＮＫＧ２Ｃには結合しない。ＮＫＧ２Ｃは、活性化受容体であるため、サルにおいて、免疫応答の上方制御（ＮＫＧ２Ａ遮断に起因する）および免疫応答の下方制御（ＮＫＧ２Ｃ遮断に起因する）が同時に存在し得ることが可能である。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇで、カニクイザル（１群当たりｎ＝３匹、性別混合）に単回静脈内用量として投与し、動物を、４２日間観察した。研究のエンドポイントには、臨床観察、体重、臨床病理、薬物動態および毒物動態、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成、ＲＯ、表面ＮＫＧ２Ａ発現、およびＰＢＭＣ免疫組織型決定が含まれた。すべての動物に、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＧａｇおよびＮｅｆで免疫処置し、２つの別個のアデノウイルス－５ベクターにおいて発現させて、可能性のあるＰＤエンドポイント（２２日目におけるＳＩＶ反応性Ｔ細胞［四量体］アッセイ、２２日目における抗原に対するエキソビボＴ細胞応答）として、免疫応答の増強を評価した。これは、剖検も組織病理もない非終端研究であった。
すべての用量は、最大５０ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ０－４２ｄａｙｓ≦１０１μＭ・日）の投薬量で耐容性であった。以下の表８に要約されるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体関連の臨床兆候も、体重の変化も、またはＮＫＧ２Ａ．９抗体関連の血液学もしくは臨床化学における変化もなかった。



ＡＤＡが、最初の時点である８日目に開始して、１匹の動物において観察された（１０ｍｇ／ｋｇ）。薬物動態／毒物動態は、評価した用量範囲において線形であった。５０ｍｇ／ｋｇの高用量では、Ｃｍａｘは、９．８μＭ（１日目、０．５時間）であり、ＡＵＣ０－４２ｄａｙｓは、１０１μＭ・日であった。まとめると、単回用量サル研究は、最大５０ｍｇ／ｋｇの投薬量での単回用量投与に関して、ＲＯ、標的結合のマーカーとしてＮＫＧ２Ａの表面発現の下方制御、およびいずれの有害所見もない許容可能なＴＫ（ＡＵＣ０－４２ｄａｙｓ≦１０１μＭ・日）を示した。
サイトカイン放出アッセイ
インビトロサイトカイン放出アッセイを、可溶性ＮＫＧ２Ａ．９抗体および１５人のヒトドナーに由来する全血を使用して行った。ＮＫＧ２Ａ．９抗体での処置が、サイトカイン放出症候群の安全性リスクを有するかどうかを判定するために、７５個のサイトカイン／ケモカインのＬｕｍｉｎｅｘパネルによって、サイトカインおよびケモカインを評価した。アッセイしたＮＫＧ２Ａ．９関連のヒトサイトカインまたはケモカインの誘導は、観察されなかった。
抗ＮＫＧ２Ａ抗体の免疫原性リスク評価
治療用抗体は、患者において治療用抗体に対する免疫応答を誘起する可能性を有する。この免疫応答は、通常、ヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答によるものなど、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成によって顕在化し、これは、曝露を変化させ、治療機能を中和し、および／またはさらには患者に重篤な臨床上の結果をもたらす可能性がある。免疫系によって「自己ではない」として認識される治療用抗体の「外来性」が、ＭＨＣクラスＩＩ媒介型ＡＤＡ免疫応答の主要な作動因子であると考えられる。本明細書に記載される安全かつ有効な抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、低い免疫原性を有するかまたは免疫原性を有さないことが、重要である。いくつかの抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体のヒト免疫原性の可能性を、インシリコＨＬＡ結合ツールによって、およびＤＣ：Ｔ細胞増殖アッセイによってインビトロで、評価した。本明細書において論じられるように、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、インシリコＨＬＡ結合ツールによって評価される場合、低いヒト免疫原性傾向を有するように遺伝子操作した。種々の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体）が、抗体に対するヒトにおいて望ましくない免疫応答を誘起するリスクは、インビトロＤＣ：Ｔ細胞増殖アッセイに基づいて、低いと判定された。
１．インシリコＨＬＡ結合分析を使用して、低い免疫原性リスクを有するように抗ＮＫＧ２Ａ抗体を遺伝子操作した
Ｔ細胞活性化および増殖は、免疫応答を生じるために必要な工程である。具体的には、ペプチド抗原のＨＬＡクラスＩＩ結合が、高親和性ＩｇＧ抗体に媒介される免疫応答の発生における重要な工程である。インシリコＨＬＡ結合ツール（ＩＥＤＢ）（例えば、Wang P, et al., PLoS Comput Biol.4(4) (2008)を参照されたい）を使用して、本発明者らは、アミノ酸配列をオーバーラップする１５個のペプチドに分割し、２７個のＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子の結合を、ＩＥＤＢデータベースに提出されたすべての他のペプチドに対して、ランク付けすることによって（ヒト集団の約９５％をカバーする）、モノクローナル抗体のＣＤＲ領域を分析した。所与のＨＬＡ対立遺伝子に関して、上位１０パーセンタイルにランク入りするペプチドは、「結合因子」と考えられ、対立遺伝子の５０％について結合因子を示す領域を、「結合クラスター」と表記する。生物学的分子内の「結合因子」または「結合クラスター」は、免疫原性の発生における作動因子であると考えられる（Sinu, P et al., Clinical & Developmental Immunology Vol. 2013 (2013)）。
図５４Ａに示されるように、１３Ｆ３．Ａ４抗体は、２つのＨＬＡ結合クラスターを含み、ＶＨ ＣＤＲ ２領域およびＶＬ ＣＤＲ２領域にまたがる複数のペプチドが、最大７０％または２７個中１９個のＨＬＡ ｃａｌｌ ＩＩ ＤＲＢ１対立遺伝子と結合することが予測された（図５４Ａにおいて配列の下に網掛けの数字で示される）。本明細書において論じられるように、「結合クラスター」は、対立遺伝子のうちの５０％について結合因子を示す領域であり、網掛けの数字６は、対立遺伝子のうちの６０％が結合を示し、したがって、「結合クラスター」であることを意味する。
加えて、図５４Ｂに示され、本明細書に記載されるように、ＶＨ－Ｉ１０７Ｔフレームワーク逆転（すなわち、１０７位においてイソロイシンをトレオニンと置換すること）により、１３Ｆ３．Ａ４抗体から結合クラスターが除去された。１３Ｆ３．Ａ４抗体のこのＩ１０７Ｔ置換を選択した、例えば、１０７位のイソロイシンを、ＮＫＧ２Ａ．９抗体において選択した（１０７位のＴは、図５４Ｂの２行目に矢印によって示される）。
図５４Ｃに示され、本明細書に記載されるように、１３Ｆ３．Ａ４抗体の免疫原性の可能性を操作し最小限にするために、１３Ｆ３．Ａ４抗体の軽鎖ＣＤＲ１において、３０位のアスパラギン（Ｎ）（図５４Ｃの１行目）を、プロリン（Ｐ）（図５４ｃの２行目）、グルタミン（Ｑ）（図５４Ｃの３行目）、またはセリン（Ｓ）（図５４Ｃの４行目）に操作した。Ｎ３０Ｓ置換（図５４Ｃの４行目に示される）は、ＨＬＡ結合の可能性を示さなかったため（網掛け領域において「０」で示される）、それを選択した。１３Ｆ３．Ａ４抗体のこのＮ３０Ｓ置換（３０位におけるＮ）を、ＮＫＧ２Ａ．９抗体に含めるために選択した（３０位におけるＳ）。図５４Ｂ～Ｃでは、明確さのために、１３Ｆ３．Ａ４の配列の特定の位置だけが示されている。
２．抗ＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１）の免疫原性リスクは、インビトロＤＣ：Ｔ細胞増殖アッセイ結果に基づくと低かった
ＨＬＡクラスＩＩ分子がペプチド抗原に結合した後、治療用抗体に対する免疫応答の発生における次の重要な工程は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化である。このＴ細胞活性化は、抗原提示細胞における同種ペプチド－ＭＨＣ複合体（ＨＬＡ）の認識の結果として生じる。Ｔ細胞活性化および増殖（複数のその他の因子の中でもとりわけ）は、免疫応答の発生に必要である。インビトロで、多様なドナーセットを使用した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に基づく免疫原性予測アッセイを使用して、分子が、これらの特定の活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞をエキソビボで刺激する能力によって、免疫原性となる可能性があるかどうかを判定する。
インビトロＤＣ：Ｔ細胞増殖アッセイ（例えば、Joubert MK, et al., PLOS ONE 11(8) (2016)に記載される方法を参照されたい）を、いくつかの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体）に関して行って、これらの抗体のヒト免疫原性の可能性をさらに評価した。簡単に述べると、健常志願者に由来するＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単離した。勾配遠心分離およびヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅およびオリゴヌクレオチドプローブ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）でのハイブリダイゼーションを使用して特徴付けた。世界人口の頻度にほぼ一致するＨＬＡクラスＩＩ型から構成される４０人のＰＢＭＣドナーのパネルを、アッセイ実施に使用した。
陰性ビーズに基づく方法（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用してＰＢＭＣから単離した単球を、Ｉｌ－４およびＧＭ－ＣＳＦを含有するＤＣ培地（Ｌｏｎｚａ）において培養して、未成熟樹状細胞（ＤＣ）を生成し、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体）ならびに品質制御タンパク質で４時間パルスした後、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、およびＰＧＥ２を含有する培地において、２日間のＤＣ成熟工程を行った。
パルスしたＤＣを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した自家ＰＢＭＣに添加して、増殖をモニタリングし、７日間、ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＣ培地（Ｌｏｎｚｏ）において９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００，０００個の細胞で６連に播種した後、培地を洗い流し、細胞を、抗ヒトＣＤ４ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）モノクローナル抗体で標識した。未結合の抗ＣＤ４モノクローナル抗体細胞を洗浄工程により除去した後、細胞を、ＰＢＳ中３．７％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で固定し、フローサイトメトリーによって分析して、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを判定した。
図５５に示されるように、ＮＫＧ２Ａ．９は、このインビトロＤＣ：Ｔ細胞アッセイにおいて、４０人のドナー中３人（７．５％）のみで、培地でパルスした樹状細胞と比較して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖応答をもたらした。この結果は、対照モノクローナル抗体（ベバシズマブ）の１２．５％のＣＤ４＋増殖と同等であり、これは、臨床において非常に低い免疫原性を有することが示されている（「低対照」）（Saffari F., et al., Int J Cancer Manag.; 11(11)(2018)）。「高対照」抗体（ＡＴＲ－１０７）は、ドナーのうちの７０％においてＣＤ４＋増殖を示し、臨床試験において７６％という高いＡＤＡ率を有することが示されている（Hua, F., et al., The Journal of Clinical Pharmacology, 54: 14-22 (2014)）。
ＮＫＧ２Ａ．１１もまた、４０人のドナーのうち３人においてのみＣＤ４＋増殖応答をもたらした。ＮＫＧ２Ａ．６抗体は、いずれのドナーにおいてもＣＤ４＋増殖応答をもたらさなかった。このアッセイに関して高および低対照抗体の反復可能なデータは、５～１０％の変動係数％（ＣＶ％）を示す。したがって、これらのモノクローナル抗体のいずれも、低い免疫原性リスクに有意な差はない。まとめると、ＮＫＧ２Ａ．６、ＮＫＧ２Ａ．９、およびＮＫＧ２Ａ．１１抗体が、抗体に対するヒトにおいて望ましくない免疫応答を誘起するリスクは、インビトロＤＣ：Ｔ細胞増殖アッセイに基づいて、低いと判定された。
サルにおける単回用量静脈内毒物動態、耐容性、および薬力学研究
ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇで単回用量としてカニクイザルに静脈内投与した場合、十分に耐容性であり（ＡＵＣ０－４２ｄａｙｓ≦１０１μＭ・日）、臨床病理による異常は特定されなかった。
具体的には、この研究は、サル免疫不全ウイルスタンパク質ｇａｇおよびｎｅｆを発現するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクター（それぞれ、Ａｄ５－ｇａｇおよびＡｄ５－ｎｅｆ）を用いて免疫処置した後に、（１）ＮＫＧ２Ａ．９への全身曝露を判定するため、および（２）ＮＫＧ２Ａ．９に対する薬力学的応答を評価するために、単回用量としてサルに静脈内投与した場合のＮＫＧ２Ａ．９抗体の可能性のある毒性を判定するために行った。ＮＫＧ２Ａ．９抗体を、０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル）、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で、３匹のタンパク質ナイーブのサルの群（性別ごとに１匹または２匹）に、緩徐なボーラス注射として静脈内投与した。用量は、２０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭスクロース、ｐＨ６．０のビヒクル／担体において、０．２５ｍＬ／ｋｇ、０．５ｍＬ／ｋｇ、または２．５ｍＬ／ｋｇで投与した。２つのＡｄ５ベクターを、後部四頭筋または尾側大腿に、０．５ｍＬでおよそ３．３×１０９個のウイルス粒子を含む１回の注射で、筋肉内投与した。評価の基準としては、生存期間、毒物動態、臨床観察、体重、臨床病理評価、ならびに免疫毒性学および薬力学的評価（抗薬物抗体、末梢血リンパ球表現型判定、ナチュラルキラーおよびＴ細胞活性化、ＮｅｆおよびＧａｇに対するエキソビボリコール応答、抗原特異的Ｔ細胞表現型判定、ならびにＮＫＧ２Ａ受容体占有率および受容体発現）が挙げられる。サルは、投薬後６週間の期間にわたって観察した後、ストックに戻した。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体ＡＵＣ（０－Ｔ）およびＣｍａｘ曝露は、評価した用量レベルで、用量比例様式で増大した。静脈内投与の後、雄性における全身曝露は、すべての用量レベルにおいて、雌性におけるものと同等であった。全身曝露値には実質的な性別による違いがなかったため、すべての結果および結論は、性別をまとめたデータに基づいた。ＮＫＧ２Ａ．９抗体を１０ｍｇ／ｋｇで与えた９匹のサルのうちの１匹は、抗薬物抗体を生じ、抗薬物抗体による影響を受けた同じサルは、他のサルと比較して、より急速な薬物濃度の低下を示した。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体の毒物動態の概要を、以下に示す。
毒物動態の概要-性別合算平均値



すべての動物が生存し、研究の終了時にストックに戻した。ＮＧＫ２Ａ．９抗体は、すべての用量で十分に耐容性であり、臨床観察、体重、または臨床病理に対する作用はなかった。末梢血Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、活性化ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、エフェクターメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはＮＫ細胞濃縮リンパ球のパーセンテージに、ＮＫＧ２Ａ．９に媒介される変化はなかった。ｇａｇおよびｎｅｆペプチドに対するエキソビボリコール応答もまた、変化しなかった。抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージは変化しなかったが、すべての用量にわたって高い変動性があった。
１日目の投薬の４時間後に、ＮＫ細胞濃縮リンパ球における群平均ＮＫＧ２Ａ受容体占有率は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９で、それぞれ、試験前と比べて、８１％、９９％、および１００％であった。４３日目までに、０．５ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９を投薬したサルについて、受容体占有率は、２１％～４５％の範囲に減少し、１０ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９を投薬したサルについては、受容体占有率は、７２％～９５％の範囲に減少した。１日目の投薬の４時間後までに、ＮＫ細胞濃縮リンパ球における群平均ＮＫＧ２Ａ受容体発現は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９で、それぞれ、試験前と比べて、５０％、５２％、および５８％であり、これは、ＮＫＧ２Ａ．９を投薬した後の受容体の内部移行または下方制御を示した。４３日目までに、ＮＫＧ２Ａ受容体発現は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９抗体で、それぞれ、６５％～８０％、４７％～９９％、および４１％～４６％の範囲に及んだ。
結論として、ＮＫＧ２Ａ．９抗体は、５０ｍｇ／ｋｇ以下で単回静脈内投与した後、サルによって十分に耐容性であった（平均性別合計ＡＵＣ［０－１００８ｈ］≦３６５，０００μｇ・ｈ／ｍＬ）。受容体占有率および低減された受容体発現は、試験したすべての用量で観察された。
カニクイザルにおける１ヶ月の間欠用量皮下および静脈内毒性研究
１ヶ月研究を行って、（１）任意の所見の可能性のある可逆性を評価するため、（２）ＮＫＧ２Ａ．９に対する全身曝露を判定するため、および（３）ヒトにおけるＮＫＧ２Ａ．９の使用を裏付けるデータを提供するために、週１回１ヶ月間カニクイザルに投与した場合のＮＫＧ２Ａ．９抗体の可能性のある毒性を判定した。ＮＫＧ２Ａ．９を、０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクル）、１０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で、５匹のサル／性別／群の３つの群に皮下注射によって投与した。１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９の皮下投薬用の製剤には、２０００Ｕ／ｍＬのｒＨｕＰＨ２０が含まれた。加えて、ＮＫＧ２Ａ．９を、１ｍｇ／ｋｇの用量で、５匹のサル／性別の単一の群に静脈内注射（緩徐なボーラス）によって投与した。すべての用量は、２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース、０．０５ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０（ＰＳ－８０）、ｐＨ６のビヒクルにおいて、２ｍＬ／ｋｇで投与した。
評価の基準には、生存期間、毒物動態、臨床観察、体重、目視による推定食物消費量、身体検査（呼吸器および神経学を含む）ならびに眼科検査、臨床病理評価、免疫表現型判定、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化、受容体発現（ＲＥ）、受容体占有率（ＲＯ）、器官重量、ならびに肉眼および顕微での病理分析が含まれた。予定されていた剖検を、１週間に１回で１ヶ月間、合計５用量の投薬後（３匹／性別／群）、および８週間の回復期間後（２匹／性別／群）に行った。
２２日目に、平均ＮＫＧ２Ａ．９全身曝露（ＡＵＣ［０－１６８ｈ］）は、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇで用量に比例して増大した。いずれの用量でも、実質的な性別による差はなかった。ＮＫＧ２Ａ．９の蓄積を、すべての用量レベルで反復投与後に観察し、平均全身曝露（ＡＵＣ［０－１６８ｈ］）は、１日目のおよそ２．５倍～２．９倍であった。処置により生じた抗薬物／ＮＫＧ２Ａ．９抗体の存在は、１ｍｇ／ｋｇ（静脈内）、１０ｍｇ／ｋｇ（皮下）、または１００ｍｇ／ｋｇ（皮下）で、８日目および／またはそれ以降に、それぞれ、１０匹中１匹、１０匹中２匹、および１０匹中３匹のサルにおいて検出され、これらは、ＮＫＧ２Ａ．９に対する平均全身曝露に実質的な影響を有さなかった。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体の毒物動態の概要を、以下の表に示す。




a値は、すべての利用可能なサル/8日目(すなわち、1日目の投薬から168時間後)および/またはそれ以降に検出された検出可能な処置により生じた抗NKG2A.9抗体(ADA)のないサルのみから得られたデータを用いて計算した。
ＮＫＧ２Ａ．９関連の死亡はなく、すべてのサルは、予定されている剖検まで生存した。ＮＫＧ２Ａ．９は、臨床観察、体重、目視による推定食物消費量、心臓血管、神経学、眼科、臨床病理、または組織病理のパラメーターに対する作用がなく、すべての用量で十分に耐容性であった。
Ｔ細胞（総Ｔ、ヘルパーＴ、もしくは細胞傷害性Ｔ）、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞の数、またはＮＫ細胞濃縮末梢血細胞集団の活性化に、ＮＫＧ２Ａ．９関連の変化はなかった。
ＮＫ細胞における用量依存的な受容体占有率（ＲＯ）が、初回投薬の４時間後に、観察された（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇのＮＫＧ２Ａ．９で、それぞれ、８４％、９５％、および１００％）。その後、２９日目までのすべての時点で、群平均ＲＯ範囲は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ、７２％～８４％および９４％～９８％であり、１００ｍｇ／ｋｇでは最大（１００％）ＲＯであった。ＲＯは、１００ｍｇ／ｋｇでは、完全であり、回復段階（８５日目まで）の間持続したが、ＲＯの部分的な消失が、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで観察された。１ｍｇ／ｋｇでは、ＲＯの部分的な消失が、７１日目から８５日目に観察され（３９％の群平均ＲＯ）、これは、血清ＮＫＧ２Ａ．９濃度の４μｇ／ｍＬ未満への下落と相関していた。１０ｍｇ／ｋｇでは、占有率の部分的な消失は、８５日目に観察され（７４％の群平均ＲＯ）、これは、血清ＮＫＧ２Ａ．９濃度の５０μｇ／ｍＬ未満への下落と相関していた。
ＮＫＧ２Ａ．９によるＮＫＧ２の結合は、受容体内部移行の結果として、部分的な下方制御をもたらすことが知られている。投薬段階中のＮＫ細胞上のＮＫＧ２ ＲＥの非用量依存的低減はなく（すべての用量で、試験前の値の３６～７５％の全体的な範囲）、１ｍｇ／ｋｇでは回復段階中の回復が最小限であり、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇでは回復はなかった。
結論として、ＮＫＧ２Ａ．９は、≦１００ｍｇ／ｋｇ／週で、１ヶ月間、カニクイザルによって十分に耐容性であり（平均ＡＵＣ≦４２５，０００μｇ・ｈ／ｍＬ）、すべての用量で強力な標的結合の根拠があった。カニクイザルにおけるＮＫＧ２Ａ．９に媒介されるＮＫ細胞ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ相互作用のインビボ遮断は、免疫細胞の活性化を誘導せず、疾患のない生理学的環境において、ＮＫＧ２Ａ経路の寄与が欠如しているかまたは最小限であることを示唆する。耐容性および解剖学的または臨床的病理所見の欠如に基づいて、有害事象が観察されないレベル（ＮＯＡＥＬ）は、１００ｍｇ／ｋｇであると考えられたため、これは、最も高い非重度毒性用量（ＨＮＳＴＤ）とも考えられる。
腫瘍におけるＮＫＧ２Ａ発現の免疫組織化学的分析
本発明者らは、ＮＫＧ２Ａ．９抗体の活性が、ＮＫＧ２Ａの阻害性活性を低減させ、腫瘍部位における細胞傷害性の増強をもたらすと考えている。その結果、腫瘍優先順位付けの基準には、ＮＫＧ２ＡおよびＨＬＡ－Ｅの発現が含まれた。
可能性のある腫瘍兆候を特定するため、選択した腫瘍型におけるＮＫＧ２Ａの予備プロファイリングを、凍結切片においてＦＩＴＣコンジュゲートＮＫＧ２Ａ．６（ＮＫＧ２Ａ．９抗体の親クローン）を用いて評価した。ＮＫＧ２Ａは、単核細胞の少しの割合に存在し、主として、図４５に示されるように、腫瘍間質に分布していた。図４５は、ＦＩＴＣコンジュゲートＮＫＧ２Ａ．６抗体および陰性対照試薬（抗ＫＬＨヒトＩｇＧ１．１－ＦＩＴＣ）で染色した市販入手したヒト腫瘍サンプルにおけるＮＫＧ２Ａ染色の代表的な例を示す。図４５において、「子宮頸」は、子宮頸癌を示し、「頭頸部」は、頭頸部扁平上皮細胞癌を示し、「膀胱」は、膀胱癌を示し、ＮＳＣＬＣ－Ａｄｃは、非小細胞肺癌腺癌を示す。「Ｓｔ」は、腫瘍間質であり、「ＴｕＥｐ」は、腫瘍上皮細胞である。
凍結腫瘍切片における免疫組織化学によるＮＫＧ２Ａ発現の画像分析を行った。ＨＡＬＯ（商標）ソフトウェアを使用した「ホットスポット」画像分析を、サンプル１つ当たり３つのスポットに行った。アイソタイプ対照での染色を、ＦＩＴＣコンジュゲートＮＫＧ２Ａ．６抗体での染色から差し引いた。この画像分析により、図４６に示されるように、子宮頸癌および頭頸部癌における比較的高いＮＫＧ２Ａの存在度、膀胱癌および非小細胞肺癌における中等度の発現、ならびに膵臓癌および結腸直腸癌における低い発現が明らかとなった。図４６は、様々な腫瘍型にわたるＮＫＧ２Ａ発現レベルを示す。Ｙ軸は、１．１５ｍｍ２のスポット当たりの陽性細胞数を表し、結果は、平均＋標準誤差として示す。
７つの腫瘍型におけるＨＬＡ－Ｅ発現の免疫組織化学的分析
ＨＬＡ－Ｅ発現を評価するために、市販の抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（クローンＭＥＭ－Ｅ／０２）を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織における免疫組織化学について検証した。ＨＬＡ－Ｅは、試験した腫瘍サンプルにおいて広く発現していた。陽性染色が、腫瘍上皮および間質の両方で観察された。ＨＡＬＯ（商標）ソフトウェアを使用した全スライド画像分析により、図４７に示されるように、ＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣにおける比較的高いＨＬＡ－Ｅの存在度、ならびに膵臓癌および結腸直腸癌（ＣＲＣ）における低い存在度が明らかとなった。図４７は、１３個のＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮細胞癌（ＮＮＳＣＣ／ＨＰＶ＋）、１１個のＨＰＶ－頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ／ＨＰＶ－）、１０個の非小細胞肺癌腺癌（ＮＳＣＬＣ－ＡＤＣ）、１０個のＨＮＳＣＣ、１０個の非小細胞肺扁平上皮細胞癌（ＮＳＣＬＣ－ＳＣＣ）、６個の膵臓癌、および１０個の結腸直腸癌（ＣＲＣ）サンプルにおける、ＨＡＬＯソフトウェアを使用したＨＬＡ－Ｅ発現の全スライド画像分析の結果を示す。ＨＬＡ－Ｅの免疫反応性は、次のように計算した：「茶色」の全面積×「茶色」の平均ＯＤ／組織の全面積。データは、ｍｍ２に対して正規化した。結果を、平均＋標準誤差として示す。
腫瘍上皮細胞において、陽性染色は、主として、細胞質であった。注目すべき膜染色もまた、一部の腫瘍細胞において示された。腫瘍間質においては、陽性染色は、主として、単核細胞および間質細胞のサブセットに分布しており、同様に、一部の事例では微小血管および好中球に分布していることもあった。一般に、間質におけるＨＬＡ－Ｅ発現は、ほぼすべての事例で存在していた。しかしながら、腫瘍上皮細胞における発現は、試験したすべての腫瘍型において、サンプルごとに有意に変動していた。図４８に示されるように、高レベルの腫瘍上皮発現は、ほとんどの事例で見られたが、陰性または非常に低い発現が、少数の事例で見られた。図４８において、「Ｓｔ」は、腫瘍間質であり、「ＴｕＥｐ」は、腫瘍上皮細胞である。図４８は、複数の腫瘍におけるＨＬＡ－Ｅ発現の代表的な画像を示す。ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮細胞癌（ＮＮＳＣＣ／ＨＰＶ＋）、非小細胞肺腺癌（ＮＳＣＬＣ－ＡＤＣ）、非小細胞肺扁平上皮細胞癌（ＮＳＣＬＣ－ＳＣＣ）、および結腸癌（ＣＲＣ）に由来するＦＦＰＥ切片に対する検証された市販のモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学。
ウイルス由来の腫瘍を有する患者：ウイルス感染は、Ｃ型肝炎慢性感染患者において観察されたように、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ発現を誘導し得る。（Harrison RJ et al., "Association of NKG2A with treatment for chronic hepatitis C virus infection." Clin Exp Immuno 161:306-14 (2010)）。加えて、ＮＫＧ２Ａ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は、ＨＰＶ－１６＋頭頸部癌を有する患者に由来するＴＩＬでは、ＨＰＶ－１６腫瘍と比較して高くなることが示された。（van Hall T, et al. "NKG2A checkpoint receptor expression on tumor-infiltrating CD8+ T cells restrains efficacy of immunotherapy." Cancer Res Supplement; Abstract 2999 (2017)）。本発明者らは、ＨＰＶ＋およびＨＰＶ－の頭頸部腫瘍に由来する生検間で、ＩＨＣによりＨＬＡ－Ｅ発現を測定することによって、頭頸部腫瘍におけるＨＰＶステータスと、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ経路の発現との間の関係を評価した。本発明者らの比較的少数のサンプルにおける最初の評価では、ＩＨＣによるＨＬＡ－Ｅ発現は、図４８に示されるように、ＨＰＶ＋サンプルとＨＰＶ－サンプルとの間で有意差はなかったことが示された。本発明者らは、ＨＰＶ＋およびＨＰＶ－の頭頸部腫瘍に由来する生検間で、ＩＨＣによりＣＤ８（ＮＫＧ２Ａ発現の代理物）およびＨＬＡ－Ｅ発現を測定することによって、頭頸部腫瘍におけるＨＰＶステータスおよびＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ経路の発現を試験した。本発明者らはまた、さらなる腫瘍型およびより大きなサンプルサイズでＩＨＣ分析を継続したが、この分析は、以下の実施例３１に記載されている。
１７個の腫瘍型におけるＨＬＡ－Ｅ発現の免疫組織化学的分析
本発明者らは、免疫組織化学的（ＩＨＣ）評価によって、１７個の腫瘍型にわたってＨＬＡ－Ｅ発現をプロファイリングした。本発明者らは、高レベルのＨＬＡ－Ｅを発現する腫瘍型について、癌患者が、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体での抗腫瘍処置に対して応答する可能性が最も高いと考える。
ＨＬＡ－Ｅ発現を評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）を、十分に特徴付けられている市販のモノクローナル抗体（クローンＭＥＭ／０２）を用いて、子宮頸、膀胱、乳房、結腸直腸腺癌（ＣＲＣ）、子宮内膜、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、胃、膠芽腫（ＧＢＭ）、黒色腫、非ホジキンリンパ腫（濾胞性リンパ腫）、卵巣、腎細胞（ＲＣＣ）、膵臓、前立腺、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺腺癌（ＮＳＣＬＣ－ＡＤ）、および非小細胞肺扁平上皮細胞癌（ＮＳＣＬＣ－ＳＱＣ）を含む、１７個の腫瘍型／サブタイプに由来するホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片に行った。腫瘍型／サブタイプ当たり１４～４３個のサンプルがあった。染色したスライドを、研究病理学者が評価して、組織または細胞型を特定した。すべてのスライドを、組織エレメントおよび染色の適切さに関して判断した。従来的／手作業によるスコア付けを、研究病理学者が行った。
結果は、ＨＬＡ－Ｅ発現が、様々な適応症にわたって、腫瘍細胞、免疫、および内皮細胞コンパートメントにおいて観察されたことを示した。腫瘍細胞において、陽性染色は、ヒト腫瘍型にわたって主として細胞質にあり、表面形質膜に認められた発現は限られていた。総ＨＬＡ－Ｅ発現は、拡散的な腫瘍細胞陽性から、不均一な発現に及び、一部の事例ではＨＬＡ－Ｅ発現は低いかまたはほとんどなかった。図５７は、免疫組織化学によって評価される、１７個の異なる腫瘍型にわたる総ＨＬＡ－Ｅ陽性スコアの箱ひげ図を示す。総ＨＬＡ－Ｅスコアは、腫瘍細胞における細胞質および／または膜ＨＬＡ－Ｅ陽性率を組み合わせたパーセントとして定義される。図５７を生成するために使用したデータを、以下の表に示す。






図５７において、箱ひげ図の箱のそれぞれは、２５パーセンタイルにおける総腫瘍ＨＬＡ－Ｅ陽性値を示し、箱のそれぞれの中央線は、中央値であり、箱のそれぞれの上限は、７５パーセンタイルの値を示す。
結論として、腫瘍適応症にわたって、またその中で、動的な総ＨＬＡ－Ｅ発現範囲が存在した。本発明者らは、腫瘍細胞において高いＨＬＡ－Ｅ発現を有する癌患者が、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体での抗腫瘍処置に対して応答する可能性がより高いと考える。非ホジキンリンパ腫（濾胞性リンパ腫）、子宮頸、ＨＮＳＣＣ、膵臓、ＮＳＣＬＣ、および膀胱腫瘍は、最も高い総ＨＬＡ－Ｅ発現レベルを有し、したがって、これらの癌を有する患者は、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体での抗腫瘍処置に対して応答する可能性が最も高い。この研究により、臨床開発において、例えば、ＨＮＳＣＣ、ＲＣＣ、ＮＳＣＬＣ、およびＣＲＣ癌を含むように適応症の選択肢を優先順位付けするのを補助するための腫瘍プロファイリングデータが得られた。
前立腺、ＧＢＭ、およびＳＣＬＣは、最も低いＨＬＡ－Ｅ発現レベルを示した。いずれにせよ、本発明者らは、低いＨＬＡ－Ｅ発現を有する腫瘍型を有する患者もまた、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体での抗腫瘍処置に応答するであろうと考える。この研究を、以下により詳細に記載する。
材料および方法
組織サンプル
全体として、２つのサンプルセットから１７個の癌型／サブタイプを研究した。結腸直腸腺癌（ＣＲＣ）、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、非小細胞肺腺癌（ＮＳＣＬＣ－ＡＤ）、非小細胞肺扁平上皮細胞癌（ＮＳＣＬＣ－ＳＱＣ）、膵臓癌、および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む、６つの腫瘍型／サブタイプの完全サイズのＦＦＰＥスライドを、１腫瘍型当たり１４～２４個のサンプルを用いて研究した。ＦＦＰＥ組織サンプルを、種々の市販組織供給業者（ＢｉｏＩＶＴ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ；ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ． Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ；Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ；Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ ＧｍｂＨ、Ｌｅｗｉｓｂｕｒｇ、ＰＡ；Ｔｈｅ ＭＴ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ． Ｖａｎ Ｎｕｙｓ、ＣＡ；ＴｒｉＳｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。さらに、膀胱、乳房、ＧＢＭ、胃、ＲＣＣ、ＮＳＣＬＣ－ＡＤ、ＮＳＣＬＣ－ＳＱＣ、黒色腫、子宮内膜、卵巣、ＣＲＣ、ＨＮＳＣＣ、前立腺、子宮頸、膵臓癌、および非ホジキンリンパ腫（濾胞性リンパ腫）を含む１６個の腫瘍型／サブタイプを含む多重腫瘍ブロック（ＭＴＢ）を、２０症例／腫瘍型で、研究した。それぞれのＭＴＢは、ＦＦＰＥブロック当たり単一の適応症の５症例、および陽性対照として１つの過形成扁桃腺を含んだ。ＭＴＢは、ＢＭＳのために、Ｆｏｌｉｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（現Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって作製された。
抗体および試薬
・マウスモノクローナル抗体抗ヒトＨＬＡ－Ｅ、クローンＭＥＭ／０２（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、カタログａｂ２２１６、ロットＧＲ２５１４７２－１５）
・マウスＩｇＧ１アイソタイプ、クローン１１７１１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログＭＡＢ００２、ロットＩＸ２４１５０９１）
・結合ポリマー精査検出（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、カタログＤＳ９８００、ロット４６３９６および４６７９４）
・結合エピトープ賦活２（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、カタログＡＲ９６４０、ロットＥＲ２０１８０）
・タンパク質遮断、無血清（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、カタログＸ０９０９、ロット１０１１７１７２）ヒトガンマグロブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログＧ－４３８６、ロットＳＬＶ Ｍ０５２４Ｖ）
ＩＨＣ方法
４μｍのＦＦＰＥ切片を調製し、パラフィンに浸漬し、使用するまで４℃で保管した。ＭＴＢのために、４μｍの切片を切り出し、使用するまで真空密封バッグにおいて４℃で保管した。それぞれのアイソタイプ対照を含むすべてのＩＨＣアッセイは、Ｌｅｉｃａ ＢｏｎｄＲＸプラットフォームを使用した自動化ＩＨＣ用に最適化した。同じ過形成ヒト扁桃腺組織ブロックに由来するＦＦＰＥ切片を、すべてのＩＨＣ実行の陽性対照として使用した。
免疫染色のために、ＦＦＰＥスライドを焼成し、キシレンにおいて脱パラフィン処理し、勾配エタノール系列に通して再水和させた後、日常的な組織学手順を行った。抗原賦活は、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸ機器において行った。自動化ＩＨＣ染色手順を、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸにおいて室温で行った。簡単に述べると、スライドを、１０分間ペルオキシダーゼブロックでブロッキングした後、非特異的タンパク質ブロックで２０分間ブロッキングした。一次抗体を、６０分間インキュベートした後、精査リンカーとともに３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、３０分間、精査ポリマーとともにインキュベートした。最後に、スライドをＤＡＢ基質－色素原溶液と６分間反応させ、Ｌｅｉｃａヘマトキシリンで８分間対比染色し、次いで、日常的な組織学手順に従って、脱水し、清浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔとともにカバーガラスをかけた。
免疫染色した後、すべてのスライドを、Ａｐｅｒｉｏ ＡＴ２全スライドスキャナー（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を使用して２０倍でスキャンし、画像を、Ａｐｅｒｉｏ ｅＳｌｉｄｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅで保管および整理した。
病理評価および手作業でのスコア付け方法
研究病理学者が、スライドを評価して、組織の適切さおよび染色の品質を判定した。研究病理学者は、ＨＬＡ－Ｅ ＩＨＣ染色したスライドを手作業でスコア付けし、アイソタイプおよび陽性対照スライドを評価した。病理評価は、腫瘍含量を判定し、腫瘍型を確認するために、Ｈ＆Ｅ評価からなっていた。ＨＬＡ－Ｅ免疫組織化学（ＩＨＣ）染色スライドは、腫瘍および免疫細胞陽性率に関して、全スライドのスキャン画像を使用して手作業でスコア付けした。アイソタイプ対照スライドにおいてバックグラウンド染色は観察されなかった。腫瘍細胞（ＴＣ）、免疫細胞（ＩＣ）、および内皮細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現を、評価した。細胞質ＨＬＡ－Ｅおよび膜ＨＬＡ－Ｅのパーセンテージを記録した。総ＨＬＡ－Ｅスコアは、ＨＬＡ－Ｅ発現の重要な報告できるデータであり、これは、腫瘍細胞における細胞質および／または膜ＨＬＡ－Ｅの陽性率を合わせたもので構成され、総腫瘍細胞に対するＨＬＡ－Ｅ陽性パーセントとして報告した。ＨＬＡ－Ｅ陽性免疫細胞および内皮の主要な地理的位置とともに、ＨＬＡ－Ｅ免疫細胞陽性パーセントもまた、評価した。
結果
ＨＬＡ－Ｅは、過形成扁桃腺において拡散的に陽性であった。ＨＬＡ－Ｅ膜／細胞質染色は、腺窩上皮、胚中心、および毛包間帯に認められ、外套帯で強度が最も強かった。腫瘍組織において、特異的ＨＬＡ－Ｅ発現が、腫瘍細胞、免疫細胞、および内皮細胞において観察された。ＨＬＡ－Ｅの細胞質および膜の局在化が、適応症全体で腫瘍細胞内で認められ、弱い（強度１＋）～強い（強度３＋）の強度の動的範囲を示した。ＨＬＡ－Ｅ発現は、ヒト腫瘍型にわたって主として細胞質にあり、形質膜に認められた発現は限られていた。総ＨＬＡ－Ｅ発現は、拡散的な腫瘍細胞陽性から、不均一な発現に及び、一部の事例ではＨＬＡ－Ｅ発現は低いかまたは非常に低かった。図５９に示されるように、子宮頸、ＨＮＳＣＣ、膵臓、ＮＳＣＬＣ、膀胱、および非ホジキンリンパ腫腫瘍は、総ＨＬＡ－Ｅ発現レベルが最も高く、一方で前立腺、ＧＢＭ、およびＳＣＬＣは、最も低かった。ＲＣＣは、試験した腫瘍型の中で膜ＨＬＡ－Ｅの発現レベルが最も高かったが、総ＨＬＡ－Ｅレベルは比較的低かった。
結論
結論として、データは、種々の腫瘍適応症にわたって、またその中で、動的な総ＨＬＡ－Ｅの発現範囲を示した。子宮頸、ＨＮＳＣＣ、膵臓、ＮＳＣＬＣ、膀胱腫瘍は、総ＨＬＡ－Ｅ発現レベルが最も高く、一方で前立腺、ＧＢＭ、およびＳＣＬＣは、最も低い発現頻度を示した。この研究により、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体の臨床開発において、例えば、ＨＮＳＣＣ、ＲＣＣ、ＮＳＣＬＣ、およびＣＲＣ癌を含むように適応症の選択肢を優先順位付けするのを補助するための腫瘍プロファイリングデータが得られた。いくつかの実施形態では、本発明者らは、低いＨＬＡ－Ｅ発現を有する腫瘍型を有する患者もまた、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体での抗腫瘍処置に応答するであろうと考える。
可溶性ＨＬＡ－Ｅの高い血清レベルを有する患者
黒色腫を有する癌患者は、健常ドナーと比較して、高い力価の血清中の可溶性ＨＬＡ－Ｅを示す。（Allard M et al., "Serum soluble HLA-E in melanoma: a new potential immune-related marker in cancer," PLoS One, 6:e21118 (2011)）。
ＮＳＣＬＣを有する患者におけるニボルマブの臨床試験から得られた最近のデータ（Ｃｈｅｃｋｍａｔｅ ０６３）は、高いｓＨＬＡ－Ｅを有する患者が、ニボルマブに対する低い応答率を有することを示唆している。（Rebmann V et al., "Soluble HLA-G and -E (sHLA-G/E) as potential biomarkers of clinical outcomes in patients (pts) with advanced, refractory squamous (SQ) NSCLC treated with nivolumab (NIVO): CheckMate 063", Cancer Res; AM2017-CT126 (2017)）。
本発明者らは、腫瘍において高いＨＬＡ－Ｅ発現レベルを有する患者が、単独または例えばニボルマブとの組合せのいずれかで、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を含む、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ抗体での処置により利益を得られる可能性が高いと考える。いくつかの実施形態では、医療従事者は、特定のレベルのＨＬＡ－Ｅ、例えば可溶性ＨＬＡ－Ｅを有する患者を、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ．９抗体での治療に選択する。他の実施形態では、医療従事者は、特定のレベルのＣＤ８＋発現（ＮＫＧ２Ａ発現の代理物として）を有する患者を、本明細書に記載される抗ＮＫＧ２Ａ．９抗体での治療に選択する。
ｓＨＬＡ－Ｅ（ＬＬＯＱ：１１ｐｇ／ｍＬ）を測定するための選択的および感受性ＳＩＭＯＡに基づくイムノアッセイを開発し、これを使用して、２つの独立したサンプルセットを試験した：（Ａ）健常対照に由来する血清および血漿（ｎ＝１７人）および６つの癌型の患者（癌型１つ当たりｎ＝１０人の患者）を含む第１のセット（図４９Ａ）、ならびに（Ｂ）１００人の健常対照および１００人の肺癌患者の第２のセット（図４９Ｂ）。いずれのセットにおいても、患者間の変動性が観察され、健常ドナーおよび癌患者で範囲は類似であった。このアッセイにより、このアッセイを使用したニボルマブに対する応答の予測マーカーとして、可溶性ＨＬＡ－Ｅレベルを確認する。
図４９に示されるように、それぞれの腫瘍型内で、ＨＬＡ－Ｅ発現に関して有意な患者間変動性が、観察された。本発明者らは、高い腫瘍ＨＬＡ－Ｅおよび高いＣＤ８＋（ＮＫＧ２Ａ発現の代理物としてＣＤ８＋を使用）を有する患者が、ＣＤ８＋ ＴおよびＮＫ細胞の抗腫瘍活性を回復させるためのＮＫＧ２Ａ阻害により利益を得られると考える。
ＮＫＧ２Ａ．９抗体を用いたフェーズ１／フェーズ２研究
本発明者らは、癌を治療するための安全かつ有効な治療法を開発するために、ＮＫＧ２Ａ．９抗体を用いてフェーズＩ／ＩＩ研究を行う。いずれの機序によっても束縛されるものではないが、治療法は、ＰＤ－Ｌ１耐性／不応性腫瘍において、チェックポイント阻害剤に対するＴ細胞応答を回復させ、かつ／またはＮＫ濃縮固形腫瘍においてＮＫ活性を増強させる。
臨床開発計画を、以下の表９に要約する。



ＮＫＧ２Ａ．９抗体の臨床開発は、ヒトにおける初回（ＦＩＨ）フェーズ１／２研究で開始する。初回単剤療法用量漸増を行って、安全性、最大耐用量（ＭＴＤ）または最大投与用量、ＰＫ、ＰＤ、および臨床活性の予備評価を判定する。静脈内投与経路を、まず、研究において使用し、皮下投与は研究の他のアームで使用する。あるいは、静脈内投与経路を使用してもよい。ずらして開始することにより、図５０に例示されるように、並行した用量漸増が、ニボルマブと組み合わせたＮＫＧ２Ａ．９抗体で生じる。安全性、ＭＴＤ、または最大投与用量、ＰＫ、ＰＤ、および臨床活性の予備評価を、次に、併用療法で評価する。三重チェックポイント遮断の組合せもまた、用量漸増中に評価し、これには、ＮＫＧ２Ａ．９抗体、ニボルマブ、およびレラトリマブ（抗ＬＡＧ－３）、抗ＴＩＭ－３、抗ＴＩＧＩＴ、イピリムマブ、ＣＴＬＡ－４ ＮＦ、もしくはＰｒｏｂｏｄｙを含むがこれらに限定されない他のチェックポイント阻害剤、または例えば、その他の治療法の中でもとりわけ、化学療法、シグナル伝達剤、例えば、セツキシマブを含むその他の抗癌療法が含まれる。
漸増および拡大コホートの患者／腫瘍の選択は、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ （ＴＣＧＡ）発現プロファイル、内部ニボルマブ試験から得られた発現プロファイル、ＣＤ８レベル（ＮＫＧ２Ａレベルの代理物として）に関する腫瘍サンプルのプロファイリング、ならびにウイルスにより誘導される腫瘍を含む、腫瘍および血清サンプルのＨＬＡ－Ｅに関するプロファイリングの進行中の分析に基づくであろう。例えば、患者の選択は、図５０に例示されるように、腫瘍がＣＤ８＋（ＮＫＧ２Ａの代理物として）およびＨＬＡ－Ｅ＋である患者を選択することに基づくであろう。別の実施形態では、患者の選択はまた、高い炎症または腫瘍突然変異量を有する腫瘍に基づくであろう。
この研究に登用される患者は、単独またはニボルマブと組み合わせた抗ＮＫＧ２Ａでの治療が、腫瘍におけるＣＤ８＋ ＴおよびＮＫ細胞の数または機能的活性を増大させるという仮説を試験するために、治療前および治療中の生検、ならびに末梢血サンプル系列を提供する必要がある。腫瘍免疫微小環境におけるそのような変化が、臨床応答と相関するかどうかを分析するために、特定の注意が払われる。薬力学研究により、標的結合、Ｔ細胞活性化、ＮＫＧ２Ａ表面発現の変化、ＩＦＮ－γ、および血清ｓＨＬＡ－Ｅのマーカーを評価する。ＮＫＧ２Ａ陽性およびＨＬＡ－Ｅ＋腫瘍（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、および頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）を含むがこれらに限定されない）、ならびにウイルス起源の腫瘍（頭頸部、子宮頸、肝細胞癌）を有する対象が、含まれてもよい。対象は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に耐性／不応性である腫瘍、または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に非感受性となることが報告されている腫瘍を有し得る。あるいは、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療に対してナイーブであってもよい。
配列表を、以下の表に提供する。












Claims (52)

  1. 単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトナチュラルキラー細胞阻害性受容体２Ａ群（ＮＫＧ２Ａ）タンパク質と特異的に結合し、以下の特性：
    （ａ）ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／もしくは相互作用を低減すること、
    （ｂ）ＮＫＧ２Ａに媒介される阻害性シグナル伝達を逆転させること、
    （ｃ）ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質と結合しないか、もしくは低い親和性で結合すること、
    （ｄ）ヒトもしくはカニクイザルＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
    （ｅ）ナチュラルキラー細胞応答を増強すること、
    （ｆ）Ｔ細胞の機能的活性を増強すること、
    （ｇ）ヒトＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との結合が低減されていること、
    （ｈ）抗腫瘍免疫応答を誘導および／もしくは増強すること、ならびに／または
    （ｉ）ヒト対象において低い免疫原性を有すること
    のうちの少なくとも１つを呈する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  2. 抗体が、以下の特性：
    （ａ）細胞結合アッセイによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に関して、約０．６ｎＭ以下のＥＣ５０値を有すること、
    （ｂ）細胞結合アッセイによって測定される場合、ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合に関して、約９．０ｎＭ以上のＥＣ５０値を有すること、
    （ｃ）ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合に関して、ヒトＮＫＧ２Ｃタンパク質との結合に関する第２のＥＣ５０値よりも約１５倍低いＥＣ５０値を有すること、
    （ｄ）細胞遮断アッセイによって測定される場合、約１．０ｎＭ以下のＩＣ５０値を有すること、
    （ｅ）スキャッチャード解析によって測定される場合、約０．４ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
    （ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約６１ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
    （ｇ）スキャッチャード解析によって測定される場合、約１．０ｎＭ以下のＫＤで、カニクイザルＮＫＧ２Ａタンパク質と結合すること、
    （ｈ）ＮＫＧ２Ａ発現細胞と結合すると、内部移行されること、
    （ｉ）インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）産生を増大させること、
    （ｊ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体：ＮＫＧ２Ａタンパク質複合体の半減期が、約４０秒以上であること、ならびに／または
    （ｋ）約０．５ｎＭ以下のＥＣ５０値で内部移行を示すこと
    のうちの１つまたは複数を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 抗体が、ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合および／または相互作用を低減する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合する、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号１０、１１、１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
    （ｂ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５４、１４、および１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
    （ｃ）配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５５、１４、および１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
    を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  6. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）重鎖可変領域が、配列番号８もしくは配列番号１６７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／または
    （ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１６４、もしくは配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
    単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  7. 重鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 重鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  9. 重鎖可変領域が、配列番号１６７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  10. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号７および５のアミノ酸配列、
    （ｂ）それぞれ、配列番号７および１９のアミノ酸配列、または
    （ｃ）それぞれ、配列番号３５および３６のアミノ酸配列
    から本質的になる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  11. ＮＫＧ２Ａタンパク質との結合について、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体のうちのいずれかと競合するか、またはそれと同一のエピトープと結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  12. 単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合したときに、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって判定すると、以下のアミノ酸残基：
    （ａ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）；
    （ｂ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）；
    （ｃ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）；および
    （ｄ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
    と特異的に結合し、
    ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を遮断する、
    単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  13. 単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトＮＫＧ２Ａと結合したときに、ＨＤＸ－ＭＳおよび／またはタンパク質の迅速光化学酸化（ＦＰＯＰ）エピトープマッピングによって判定すると、以下のアミノ酸残基：
    （ａ）LSIDNEEMKF（配列番号１５６）
    （ｂ）PSSWIGVFRNSSHHPW（配列番号１５７）
    （ｃ）LAFKHEIKDSDN（配列番号１５８）
    （ｄ）L;および
    （ｅ）QVNRLKSAQQCGSSIIYHC（配列番号１５９）
    と特異的に結合し、
    ＨＬＡ－ＥのヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合を遮断する、
    単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  14. 抗体が、全長抗体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. 高長抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  16. 抗体が、抗体断片である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  17. 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片である、請求項１６に記載の抗原結合断片。
  18. 抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  19. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離された全長モノクローナル抗体であって、
    重鎖が、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／または
    軽鎖が、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
    単離された全長モノクローナル抗体。
  20. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離された全長モノクローナル抗体であって、重鎖が、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む、単離された全長モノクローナル抗体。
  21. ヒトＮＫＧ２Ａと特異的に結合する単離された全長モノクローナル抗体であって、重鎖が、配列番号７に記載されるアミノ酸配列から本質的になり、軽鎖が、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列から本質的になる、単離された全長モノクローナル抗体。
  22. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と特異的に結合する単離された全長モノクローナル抗体であって、
    重鎖が、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
    軽鎖が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列である、
    単離された全長モノクローナル抗体。
  23. ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質と結合し、ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質との結合について参照抗体と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
    （ａ）ＶＨが、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む、
    （ｂ）ＶＨが、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１６４に記載されるアミノ酸配列を含む、または
    （ｃ）ＶＨが、配列番号１６７に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１６９に記載されるアミノ酸配列を含む、
    単離された抗体またはその抗原結合断片。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子。
  25. 核酸分子が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である、請求項２４に記載の単離された核酸。
  26. 請求項２４または２５に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  27. 請求項２６に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞。
  28. 薬剤と連結している請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノコンジュゲート。
  29. 抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項２７に記載の宿主細胞を培養することを含み、抗体が産生される、方法。
  30. 宿主細胞から、抗体またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 第２の機能性部分と連結している請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、二重特異性分子。
  32. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項３１に記載の二重特異性分子と、医薬上許容される担体とを含む、組成物。
  33. さらなる治療剤をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. さらなる治療剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項３３に記載の組成物。
  35. 癌を治療するための医薬品として使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  36. 癌が、膀胱癌、乳癌、子宮癌／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、腎癌、尿路上皮癌、多型神経膠芽腫、またはウイルス関連癌である、請求項３５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  37. 癌が、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、膵臓癌、非小細胞肺癌－腺癌型、非小細胞肺癌－扁平上皮細胞型、胃癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、乳癌、小細胞肺癌、多型神経膠芽腫、前立腺癌、または非ホジキンリンパ腫である、請求項３６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  38. 免疫応答を増強させるのに使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  39. 癌の治療のための医薬品の製造における、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
  40. ヒト対象における癌を治療するかまたはその進行を遅延させるための方法であって、ヒト対象に、有効量の請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート、請求項３１に記載の二重特異性分子、または請求項３３もしくは３４に記載の組成物を投与して、癌を治療するかまたはその進行を遅延させることを含む、方法。
  41. 癌が、膀胱癌、乳癌、子宮癌／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、腎癌、尿路上皮癌、多型神経膠芽腫、またはウイルス関連癌である、請求項４０に記載の方法。
  42. 癌が、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、膵臓癌、非小細胞肺癌－腺癌型、非小細胞肺癌－扁平上皮細胞型、胃癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、乳癌、小細胞肺癌、多型神経膠芽腫、前立腺癌、または非ホジキンリンパ腫である、請求項４１に記載の方法。
  43. ヒト対象に、１つまたは複数のさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. １つまたは複数のさらなる治療剤が、化学療法剤、放射線療法剤、および／または免疫療法剤である、請求項４３に記載の方法。
  45. 免疫療法剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項４４に記載の方法。
  46. 抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブであり、抗ＣＴＬＡ－４抗体が、イピルリマブである、請求項４５に記載の方法。
  47. ヒト対象における免疫応答を刺激する方法であって、ヒト対象に、有効量の請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体、請求項２８に記載のイムノコンジュゲート、請求項３１に記載の二重特異性分子、または請求項３３、３４、もしくは３５に記載の組成物を投与して、免疫応答を刺激することを含む、方法。
  48. ヒト対象が、腫瘍を有し、抗腫瘍免疫応答が刺激される、請求項４７に記載の方法。
  49. ヒト対象が、慢性ウイルス感染症を有し、抗ウイルス免疫応答が刺激される、請求項４７に記載の方法。
  50. サンプル中のＮＫＧ２Ａタンパク質の存在を検出する方法であって、
    サンプルを、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、抗体またはその抗原結合断片とＮＫＧ２Ａタンパク質との間の複合体の形成を可能にする条件下において接触させることと、
    複合体の形成を検出することと
    を含む、方法。
  51. 抗体またはその抗原結合断片が、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも迅速に、ＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成する、請求項５０に記載の方法。
  52. 抗体またはその抗原結合断片が、ＮＫＧ２Ｃタンパク質とよりも１５迅速に、ＮＫＧ２Ａタンパク質と複合体を形成する、請求項５１に記載の方法。
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