MX2007016314A - Conjugados que tienen un enlace degradable y reactivos polimericos utiles en la preparacion de tales conjugados. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona conjugados que tienen un enlace degradable y reactivos polimericos que son utiles para preparar dichos conjugados; los conjugados aspa como los reactivos polimericos que se utilizan para formar los conjugados, incluyen por lo menos uno de cada uno de los siguientes: una porcion aromatica que comprende un atomo de hidrogeno ionizable, una porcion separadora, y un polimero soluble en agua; tambien se proporcionan metodos para elaborar reactivos polimericos y conjugados, asi como metodos para administrar conjugados y composiciones.

Description

CONJUGADOS QUE TIENEN UN ENLACE DEGRADABLE Y REACTIVOS POLIMERICOS ÚTILES EN LA PREPARACIÓN DE TALES CONJUGADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a reactivos poliméricos útiles para proporcionar un conjugado que tiene un enlace degradables entre un polímero y otra porción. Además, la invención se refiere a, entre otras cosas, conjugados de los reactivos poliméricos, métodos para sintetizar los reactivos poliméricos y métodos para conjugar los reactivos poliméricos para agentes activos y otras porciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Científicos y especialistas encaran un número de desafíos en sus tentativos para desarrollar agentes activos en formas adecuadas para suministrar a un paciente. Los agentes activos que son polipéptidos, por ejemplo, son a menudo suministrados vía inyección más bien oralmente. En esta vía, el polipéptido se introduce en la circulación sistémica sin exposición al ambiente proteolítico del estómago, sin embargo, tiene varias desventajas. Por ejemplo, muchos polipéptidos tienen una vida media relativamente corta, con ello necesariamente se repiten las inyecciones, las cuales son a menudo inconvenientes y dolorosas. Sin embargo, algunos polipéptidos pueden exhibir una o más respuestas inmunes con la consecuencia que el sistema inmune del paciente intente destruir o de otra forma neutralizar el polipéptido inmunogénico. Por supuesto, una vez que el polipéptido se ha destruido o de otra forma neutralizado, el polipéptido no puede ejercer su actividad farmacodinámica planeada. Así, el suministro de agentes activos tales como polipéptidos es a menudo problemático aún cuando estos agentes se administren por inyección. Sé han logrado algunos éxitos en la dirección de los problemas en el suministro de agentes activos vía inyección. Por ejemplo, conjugando el agente activo a un polímero soluble en agua ha resultado en conjugados del polímero activo que tienen inmunogenicidad y antigenicidad reducida. Además, estos conjugados de polímero-agente activo a menudo tienen vidas medias muy incrementadas comparadas a sus contrapartes no conjugadas como un resultado de la separación disminuida a través del riñon y/o degradación enzimática disminuida en la circulación sistémica. Como un resultado que tiene una vida media mayor, el conjugado de polímero agente activo requiere dosificación menos frecuente, la cual altamente reduce el número total de inyecciones dolorosas y visitas inconvenientes con un profesional del cuidado de la salud. Sin embargo, los agentes activos que son únicamente marginalmente solubles demuestran un incremento significante en solubilidad en agua cuando se conjugan con un polímero soluble en agua. Debido a su documentada seguridad, así como a su aprobación por la FDA para uso tanto tópico como interno, el polietilenglicol se ha conjugado con agentes activos. Cuando el agente activo se conjuga con un polímero de polietilen glicol o "PEG", el agente activo conjugado es convencionalmente referido como "PEGilado". El éxito comercial de los agentes PEGilados tal como PEGASYS® alfa-2a interferón PEGilado (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), PEG-INTRON® alfa-2b interferón (Schering Corp., Kennilworth, NJ), y PEG-filgrastim NEULASTA™ (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) demuestra que la administración de una forma conjugada de un agente activo puede tener ventajas significantes sobre la contraparte no conjugada. Moléculas pequeñas tales como distearoilfosfatidiletanolamina (Zalipsky (1993) Bioconjg. Chem. 4(4):296-299) y fluorouracilo (Ouchi et al. (1992) Drug Des. Discov. 9(1 ):93-105) también se han PEGilado. Harris et al. Ha proporcionado una revisión de los efectos de Regulación en farmacéuticos. Harris et al. (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2(3):214-221. Estos éxitos describen, conjugación de un polímero a un agente activo para resultar en un fármaco comercialmente relevante es a menudo desafiante. Por ejemplo, la conjugación puede resultar en que el polímero sea unido a o cerca de un sitio en el agente activo que es necesariamente para actividad farmacológica (por ejemplo, en o cerca al sitio enlazante). Tales conjugados pueden por lo tanto tener actividad inaceptablemente baja debido a, por ejemplo, los efectos estéricos inducidos por el polímero. Las tentativas para remediar los conjugados que tienen actividad inaceptablemente baja se puede frustrar cuando el agente activo tiene poco o no tienen otros sitios adecuados para unirse a un polímero. Así, se ha deseado la PEGilación alternativa adicional. Una propuesta sugerida para resolver este y otros problemas es la "PEGilación inversa" en donde se libera el agente activo nativo (o una porción que tiene, actividad incrementada comparada al agente activo PEGilado). Por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2005/0079155 describe conjugados usando enlaces reversibles. Como se describe en esta publicación, los enlaces reversibles pueden ser afectados a través del uso de una porción del sustrato de enzima. Se ha señalado, sin embargo que los enfoque que confía en la actividad enzimática son dependientes de la disponibilidad de enzimas. Véase Peleg-Schulman (2004) J. Med. Chem. 47:4897-4904. Así, enfoques adicionales que no confían en procesos enzimáticos para la degradación se describen por ser deseables. Un enfoque para la PEGilación reversible describe un reactivo polimérico que comprende una porción fluoreno en la cual un polímero ramificado se une usando química de maleimida. Id. Véase Peleg-Schulman (2004) J. Med. Chem. 47:4897-4904 y WO 2004/089280. El enfoque sintético usado para formar el reactivo polimérico descrito es complejo, que requiere muchas etapas. Consecuentemente, se necesitan reactivos poliméricos alternativos que no requieren tales complejos esquemas sintéticos. Otro enfoque de conjugación reversible se describe en la Patente Estadounidense No. 6,514,491. Las estructuras descritas en esta patente incluyen aquellas en donde un polímero no peptídico soluble en agua se une a un grupo no aromático vía un punto de unión único. A pesar que se proporcionan enlaces degradables dentro del conjugado, existe una necesidad para proporcionar aún reactivos poliméricos adicionales que pueden formar enlaces degradables con un conjugado. Así, reactivos poliméricos adicionales útiles para proporcionar conjugados que tienen un enlace degradable entre un polímero y otra porción permanecen necesarios. Además, permanece la necesidad para proporcionar un intervalo de reactivos poliméricos útiles para proporcionar conjugados que tienen un intervalo de frecuencias de liberación. Así, la presente invención busca resolver estas y otras necesidades en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un reactivo polimérico de la siguiente fórmula: (Fórmula I) en donde POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POL |I2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; ?X es una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; R 3e2 , cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un reactivo polimérico de la siguiente fórmula: (Fórmula ll) en donde POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una ppmera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; R >e2 , cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un reactivo polimérico de la siguiente fórmula: (Fórmula en donde: POLI1 es un, primer polímero soluble en agua; "~ POLI2,es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una ppmera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es ún átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un reactivo polimérico de la siguiente fórmula: (Fórmula IV) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; X3 es una tercera porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un reactivo polimérico de la siguiente fórmula: en donde POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. En una o más modalidades de la invención, se proporciona un reactivo polimérico de la siguiente fórmula: en donde POLI es un polímero soluble en agua; X es una porción espaciadora que no incluye una porción C A H es una porción aromática que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re, cuando está presente, es un grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable; tal como un enlace de carbamato. 5 En una o más modalidades de la invención, se proporciona un conjugado de fórmula: en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una ppmera porción espaciadora; 15 X2 es una segunda porción espaciadora; <^^ H. es una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable; Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; 20 (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O u S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un conjugado de fórmula: l Re2 lb (Fórmula ll-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ¡onizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; R , cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un conjugado de la siguiente fórmula: en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; R , cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un conjugado que comprende la estructura: (Fórmula IV-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; X3 es una tercera porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. En una o más modalidades de la presente invención, se proporciona un conjugado que comprende la estructura: (Fórmula V-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; R >e2 , cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. En una o más modalidades de la invención, se proporciona un conjugado que comprende la siguiente estructura: (Fórmula Vl-C) en donde POLI es un polímero soluble en agua; X es una porción espaciadora que no incluye una porción H. es una porción aromática que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re, cuando está presente, es un grupo que altera electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método para preparar un reactivo polimérico, el método comprende: (a) proporcionar una porción aromática que porta un primer sitio de unión, un segundo sitio de unión, opcionalmente un tercer sitio de unión, y sitio de unión adicionales opcionales; (b) hacer reaccionar un reactivo de grupo funcional con el primer sitio de unión para resultar en el primer sitio de unión que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo y resulta en una enlace liberable, tal como un enlace de carbamato; (c) hacer reaccionar un polímero soluble en agua que porta un grupo reactivo con el segundo sitio de unión y, cuando está presente, el tercer sitio de unión opcional resulta en (i) el segundo sitio de unión que porta un polímero soluble en agua a través de una porción espaciadora, en donde la porción espaciadora no incluye una porción 00 el tercer sitio de unión opcional, cuando está presente, porta un segundo polímero soluble en agua a través de una porción espaciadora, en donde la porción En una o más modalidades de la invención, se proporciona un reactivo polimérico preparado de conformidad con los métodos descritos para preparar reactivos poliméricos. En una o más modalidades de la invención, se proporcionan métodos para preparar conjugados. En una o más modalidades de la invención, se proporcionan conjugados preparados usando los nuevos reactivos poliméricos descritos en t este documento. En una o más modalidades de la invención, se proporcionan preparaciones farmacéuticas que comprenden los conjugados. En una o más modalidades de la invención, se proporcionan métodos para administrar los conjugados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un cromatograma CLAR de la mezcla de reacción de insulina y el reactivo polimérico preparado como se descpbe en el Ejemplo 2. La Figura 2 es un cromatograma CLAR del conjugado PEGilado 1 -mer preparado como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 3 es una gráfica que muestra los resultados de un estudio de degradación de un conjugado PEG-insulina 1-mer degradable (realizados a pH 7.35 y 37|C) como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 4 corresponde a un análisis SDS-PAGE de una mezcla de reacción G2PEG2Fmoc2o?-GLP-1 como se describe en el Ejemplo 6. Línea 1 : Invitrogen Marca 12 no teñido estándar. Línea 2: mezcla de reacción G2PEG2Fmoc20?-Nter-GLP-1. La Figura 5 demuestra los resultados de purificación de G2PEG2Fmoc2o?-Nter-GLP-1 PEGilado por cromatografía de intercambio catiónico como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 6 corresponde a un análisis SDS-PAGE de Fmoc2ok-? er-GLP-1 monoPEGilado antes y después de liberar GLP-1 (Ejemplo 6). Línea 1 : Invitrogen Marca 12 no teñido estándar: Línea 2: conjugado G2PEG2-Fmoc20k-?/'er-GLP-1 monoPEGilado después de la purificación por cromatografía de intercambio iónico. Línea 3: Después de la liberación completa de GLP-1 del conjugado G2PEG2Fmoc20K-N,er-GLP-1.

Las Figuras 7A, 7B demuestran un análisis CLAR de fase inversa del conjugado G2PEG2Fmoc2o?-Nter-GLP-1 monoPEGilado después de la purificación por cromatografía de intercambio iónico (FIG. 7A) y posterior liberación de GLP-1 a partir del conjugado G2PEG2Fmoc20?-Nter-CLP-1 (FIG. 7B), como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 8 ilustra los resultados de purificación de G2PEG2Fmoc 0k-/Vter-GLP-1 PEGilado por cromatografía de intercambio catiónico como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 9 muestra los resultados de un análisis SDS-PAGE de G2PEG2Fmoc40k-/Vte?-GLP-1 monoPEGilado antes y después de la liberación de GLP-1 (Ejemplo 7). Línea 1 : Invitrogen Marca 2 no teñida estándar. Línea 2: Conjugado G2PEG2Fmoc40k-?/te?-GLP-1 monoPEGilado después de la purificación por cromatografía de intercambio catiónico. Línea 3: Después de la liberación de GLP-1 a partir del conjugado G2PEG2-Fmoc40K-N,er-GLP-1. La Figura 10 demuestra purificación de G2PEG2Fmoc2ok- ys-GLP-1 monoPEGilado por cromatografía de intercambio catiónico (Ejemplo 8). La Figura 11 corresponde a un análisis SDS-PAGE de G2PEG2Fmoc20k- ys-GLP-1 monoPEGilado purificado por cromatografía de intercambio catiónico (Ejemplo 8). Línea 1 : Invitrogen Marca 12 no teñido estándar. Líneas 2 hasta 6: Fracciones que contienen conjugado G2PEG2Fmoc20k-¿-ys-GLP-1 PEGilado después de las purificaciones individuales por cromatografía de intercambio iónico.

La Figura 12 ilustra los resultados de purificación de G2PEG2Fmoc4ok-/-ys-GLP-1 monoPEGilado por cromatografía de intercambio catiónico (Ejemplo 9). La Figura 13 representa un análisis SDS-PAGE de mezcla de reacción G2PEG2Fmoc4ok- ys-GLP-1 y fracciones de una purificación por cromatografía de intercambio catiónico como se describe en el Ejemplo 9. Línea 1 : Invitrogen Marca 12 no teñida estándar. Línea 2: Mezcla de reacción de G2PEG2Fmoc4ok- -ys-GLP-1. Líneas 3-5: Fracciones a partir del máximo de volumen de reacción de 9.37 ml. Líneas 6-10: Fracciones de G2PEG2Fmoc4ok-í-ys-GLP-1 monoPEGilado se colecta del máximo en volumen de retención de 158.3 ml. La Figura 14 es un lote que demuestra el comparativo de efectos de disminución de glucosa sanguínea durante un tiempo de GLP-1 , cuando el conjugado G2PEG2Fmoc2ok-/-ys-GLP-1 y el conjugado G2PEG2Fmoc4ok- ys-GLP-1 se administra subcutáneamente a ratones db/db como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 15 es un lote que demuestra el comparativo de efectos de disminución de glucosa durante un tiempo de GLP-1 , cuando se administran el conjugado G2PEG2Fmoc2ok-?/fer-GLP-1 y el conjugado G2PEG2Fmoc20k-/Vte'-GLP-1 subcutáneamente a ratones db/db como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 16 es un lote de los resultados obtenidos a partir de los experimentos realizados en el Ejemplo 1 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de la descripción de la presente invención en detalle, se entenderá que esta invención no se limita a los polímeros particulares, técnicas sintéticas, agentes activos y similares, como tal pueden varía. Se debe notar que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente determine otra cosa. Así, por ejemplo, con referencia a un "polímero" incluye un polímero único así como dos o más de el mismo o diferentes polímeros, con referencia a "conjugado" se refiere a un conjugado único así como dos o más del mismo o diferentes conjugados, con referencia a un "excipiente" incluye un excipiente único así como dos o más del mismo o diferentes excipientes y similares. En la descripción y reivindicación de la presente invención, se usa la siguiente terminología de conformidad con las definiciones descritas abajo. "PEG", "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)" como se usa en este documento, significa por abarcar cualquier poli(óxido etilen) soluble en agua. Típicamente, PEGs, para uso de conformidad con la invención comprende la siguiente estructura "-0(CH2CH20)m" en donde (m) es 2 a 400. Como se usa en este documento. PEG también incluye "-CH2CH2-0(CH2CH2?)m-CH2CH2-" y "-(CH2CH2?)m-", dependiendo de si o no los oxígenos terminales se ha desplazado. Cuando PEG además comprende una porción espaciadora (para ser descrita en más detalle abajo), los átomos que comprenden la porción espaciadora, cuando covalentemente se une a un segmento de polímero soluble en agua, no resulta en la formación de un enlace oxígeno-oxígeno (es decir, un enlace "O-O" o peróxido). Durante toda la especificación y reivindicaciones, será recordado que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos terminales o "cubierta terminal" y sucesivamente. El término "PEG" también significa un polímero que contiene una mayoría, en -Otras-palabrasJ mayor que 50% de la subunidad monomérica -CH2CH20-. Con respecto a formas específicas, el PEG puede tomar cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías tal como "ramificado", "lineal", "bifurcado", "multifuncional" y similares, para ser descrito en mayor detalle abajo. Los términos "cubierta terminal" o terminalmente cubierta" se usan intercambiablemente en este documento para referirse a un terminal o punto final de un polímero que tiene una porción de cubierta terminal. Típicamente, aunque no necesariamente, la porción de cubierta Terminal comprende un grupo hidroxi o alcoxi C?-2o- Así, ejemplos de porciones de cubierta Terminal incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi y benciloxi), así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y similares. Además, se contemplan formas saturadas, insaturadas, sustituidas e insustituidas de cada de los anteriores. Sin embargo, el grupo de cubierta final también puede ser un silano. El grupo de cubierta final también ventajosamente puede comprender una marca detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de cubierta final que comprende una marca detectable, la cantidad o ubicación del polímero y/o la porción (por ejemplo, agente activo) de interés al cual el polímero se acopla se puede determinar usando un detector adecuado. Tales marcas incluyen, sin limitación, fluorescentes, quimioluminiscentes, porciones usadas en el marcado de enzimas, colorimétricos (por ejemplo, tintes), iones de metal, porciones radioactivas y similares. Detectores adecuados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros y similares. "No se originan de forma natural" con respecto a un polímero o polímero soluble en agua significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Un polímero que no se origina naturalmente o polímero soluble en agua, sin embargo, contiene una o más subunídades o porciones de una subunidad que se originan naturalmente, así como la estructura del polímero total no se encuentra en la naturaleza. El término "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, un polímero soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de luz, transmitida por la misma solución después del filtrado. Un en base al peso, un polímero soluble en agua preferencialmente será al menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferiblemente al menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, aún más preferiblemente aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua, y aún más preferiblemente aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. Aún más preferido, sin embargo, que el polímero soluble agua es aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua y más preferido que el polímero soluble en agua es completamente soluble en agua. Peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua de la invención tal como PEG, se puede expresar como cualquiera de un número promedio de peso molecular o un peso molecular promedio en peso. A menos que se indique de otra forma, todas las referencias en peso molecular referidos en este documento se refieren al peso molecular promedio en peso. Ambas determinaciones en peso molecular, número promedio y peso promedio, se pueden medir usando cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida. También se pueden usar otros métodos para medir valores de peso molecular, tal como el uso de análisis del grupo terminal o la medición de propiedades coligativas (por ejemplo, disminución del punto de congelamiento, elevación del punto de ebullición o presión osmótica) para determinar el número del peso molecular promedio o el uso de técnicas de dispersión de luz, ultracentrifugación o viscometría para determinar el peso molecular promedio en peso. Los polímeros de la invención son típicamente polidispersados (es decir, peso molecular promedio en número y peso molecular promedio en peso de los polímeros que no son iguales), que poseen valores de baja polidispersidad de preferiblemente menos que aproximadamente 1.2 o más, preferiblemente menos de 1.15, aún más preferiblemente menos de 1.10, aún todavía más preferiblemente menos de 1.05 y más preferiblemente menos de aproximadamente 1.03.

Como se usa en este documento, el término "ácido carboxílico" es una porción que tiene un grupo funcional o -C OH [también representado como un "-COOH" o -C(0)OH], así como porciones que son derivadas de un ácido carboxílico, tales derivados incluyen, por ejemplo, ácidos carboxílicos. Así, a menos que el contexto claramente determine otra forma, el término ácido carboxílico incluye no únicamente la forma acida, pero que corresponde a esteres y formas protegidas también.

Con respecto a grupos protectores adecuados para un ácido carboxílico y cualquier otro grupo funcional descrito en este documento, se hace referencia a Greene et al., "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS" 3ra Edición, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999.

El término "reactivo" o "activado" cuando se usa en conjunción con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto en constaste a aquéllos grupos que requieren condiciones' de reacción fuertes catalizadoras y muy imprácticas para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").

Los términos "protegido" o "grupo protector" o "grupo protector" se refiere a la presencia de una porción (es decir, el grupo protector) que previene o bloquea reacciones de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector puede variar dependiendo del tipo de grupo funcional químicamente reactivo siendo protegido también como las condiciones de reacción a ser empleadas y la presencia de grupos protectores o reactivos adicionales en la molécula, sí cualquiera. Grupos protectores conocidos en la técnica se pueden encontrar en Greene et al., supra. Como se usa en este documento, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo de este significan por abarcar formas protegidas del mismo. Los términos "espaciador" o "porción espaciadora" se usan en este documento para referirse a un átomo o una colección de átomos opcionalmente usados para enlazar una porción a otra, tal como un segmento de polímero soluble en agua a una porción que contiene aromático. Las porciones espaciadoras de la invención pueden ser hidrolíticamente estables o pueden incluir uno o más enlaces fisiológicamente hidrolizables o enzimáticamente degradables. Un "radical orgánico" como se usa incluye, por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. "Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, típicamente que varía de aproximadamente 1 a 20 átomos en longitud. Tales cadenas de hidrocarburo son preferiblemente pero no necesariamente saturadas y pueden ser cadena lineal ó ramificada, aunque se prefieren cadenas típicamente lineales. Grupos alquilo ejemplares incluyen etilo, propilo, butilo, pentilo, 1 -metilbutilo, 1 -etilpropilo, 3-metilpentilo y similares. Como se usa en este documento, "alquilo" incluye cicloalquilo cuando tres ? más átomos de carbono son referenciados y alquilo inferior. "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser cadena lineal o ramificada, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, iso-butilo y terc-butilo. "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclica saturada o insaturada, que incluyen compuestos cíclicos puenteados, fusionados o espiro, preferiblemente hechos hasta 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente 3 a aproximadamente 8. "Sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, son típicamente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula. El término "sustituido" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido" se refiere a una porción (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes que no interfieren, tal como, pero no se limita a: cicloalquilo C3-Cß, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior (por ejemplo, fenilo sustituido 0-2); fenilo sustituido; y similares, "arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como un sustituyente. Por sustitución en un anillo fenilo, los sustituyentes puede estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para). "Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo C1-C20 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, bencilo, etc.), preferiblemente alquilo d-C7.

Como se usa en este documento "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 1 a 15 átomos en longitud, que contiene al menos un doble enlace, tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-butenilo, isobutenilo, octenilo, docenilo, tetradecenilo y similares. El término "alquinilo" como se usa en este documento se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 2 a 15 átomos en longitud, que contiene al menos un triple enlace, etinilo, n-butinilo, isopentinilo, octinilo, decinilo y sucesivamente. "Arilo" significa uno o más anillo aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono en el núcleo. Arilo incluye múltiples anillos arilo que se pueden fusionar, como en naftilo o no fusionar, como en bifenilo. Anillos arilo también se pueden fusionar o no fusionar con uno o más hidrocarburo cíclicos, anillos heteroarilo o heterocíclicos. Como se usa en este documento, "arilo" incluye hetero arilo. Una porción aromática (por ejemplo, Ar1, Ar2 y sucesivamente), significa una estructura que contiene arilo. "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferiblemente N, O o S, o una combinación de los mismos. Anillos heteroarilo también se pueden fusionar con uno o más hidrocarburos cíclicos, heterocíclico, arilo o anillos heteroarilo. "Heterociclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente 5-7 átomos, con o sin carácter de instauración o aromático y que tiene al menos un átomo del anillo el cual no es un carbono.

Heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno y nitrógeno. "Heteroarilo sustituido" es un heteroarilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como sustituyentes. "Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes que no interfieren. "Electrófilo" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrofílico, es decir, un centro que es electrón buscado, capaz de reaccionar con un nucleófilo. "Nucleófilo" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos que tienen un centro nucleofílico, es decir un centro que busca un centro electrofílico o con un electrófilo. Un enlace "fisiológicamente desdoblado" o "hidrolizable" es un enlace relativamente débil que reacciona con agua (es decir, es hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace para hidrolizarse en agua dependerá no únicamente del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales pero también en los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Enlaces débiles o hidrolíticamente inestables apropiados incluyen, pero no se limitan a, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetatos, cetales, éter de aciloxialquilo, iminas, orto esteres, péptidos y oligonucleótidos. Un "enlace degradables" incluye, pero no se limita a, un enlace fisiológicamente desdoblado, un enlace hidrolizable y un enlace enzimáticamente degradable. Así, un enlace "degradable" es un enlace que puede pasar por cualquiera de hidrólisis o desdoblamiento por algunos otros mecanismos (por ejemplo, enzima catalizada, ácido catalizado, base catalizada y sucesivamente) bajo condiciones fisiológicas. Por ejemplo, un "enlace degradable" puede involucrar una reacción de eliminación que tiene una abstracción base de un protón, (por ejemplo, un átomo de hidrógeno ionizable, Ha), como la fuerza de conducción. Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que es sometido a degradación por una o más enzimas. Un enlace o unión "hidrolíticamente estable" se refiere a una unión química, típicamente una unión covalente, que es sustancialmente estable en agua, en otras palabras, no sufre hidrólisis bajo condiciones fisiológicas para cualquier extensión apreciable sobre un periodo prolongado de tiempo. Ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen, pero no se limitan a los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos (carbamatos) y similares. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una proporción de hidrólisis de menos que aproximadamente 1 -2% por día bajo condiciones fisiológicas. La proporción de hidrólisis de uniones químicas representativas se puede encontrar en más libros de texto de química estándar. Se debe apuntar que algunos enlaces pueden ser hidrolíticamente estables o hidrolizables, dependiendo de (por ejemplo) átomos adyacentes y cercanos y condiciones ambientales. Un experto ordinario en la técnica puede determinar sí un enlace o unión proporcionado es hidrolíticamente estable o hidrolizable en un contexto proporcionado, por ejemplo, colocando una molécula que contiene enlace interés bajo condiciones de interés y probarla para evidencia de hidrólisis (por ejemplo, la presencia y cantidad de dos moléculas que resulta del desdoblamiento de una molécula única). También se pueden usar otras propuestas conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica para determinar sí una unión o enlace proporcionado es hidrolíticamente o hidrolizable. Los términos "agente activo", "agente biológicamente activo" y "agente farmacológicamente activo" se usan intercambiablemente en este documento y se definen por incluir cualquier agente, fármaco, compuesto, composición de materia o mezcla que proporciona algún efecto farmacológico, a menudo benéfico que se puede demostrar in vivo o in vitro. Estos incluyen alimento, suplementos alimenticios, nutrientes, nutricéuticos, fármacos, proteínas, vacunas, anticuerpos, vitaminas y otros agentes benéficos. Como se usa en este documento, estos términos además incluyen cualquier sustancia fisiológicamente o farmacéuticamente activa que produce un efecto localizado o sistémico en un paciente. "Excipiente farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que se puede incluir en las composiciones de la invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos significantes al paciente. "Cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad fisiológicamente efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" se usan intercambiablemente en este documento para significar la cantidad de un conjugado de polímero-agente activo, típicamente presente en una preparación farmacéutica, que se necesita para proporcionar un nivel deseado del agente y/o conjugado activo en la corriente sanguínea o en un tejido objetivo. La cantidad exacta dependerá del número de factores, por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y características físicas de la preparación farmacéutica, población de paciente prevista, consideraciones del paciente y similares, y puede ser fácilmente determinada por un experto ordinario en la técnica, en base a la información proporcionada en este documento y disponible en la literatura relevante. "Multifuncional" en el contexto de un polímero de la invención, significa un polímero que tiene 3 o más grupos funcionales contenidos en este documento, en donde los grupos funcionales pueden ser el mismo o diferente. Polímeros multifuncionales de la invención típicamente contienen de aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o de 3-50 grupos funcionales, o de 3-25 grupos funcionales, o de 3-15 grupos funcionales, o de 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales dentro del polímero. Un polímero "difuncional" significa un polímero que tiene dos grupos funcionales contenidos en este documento, ya sea el mismo (es decir, homodifuncional) o diferente (es decir, heterodifuncional). "Ramificado" en referencia a la estructura geométrica o general de un polímero, se refiere a polímero que tiene 2 o más "brazos" del polímero. Un polímero ramificado puede poseer 2 brazos de polímero, 3 brazos de polímero, 4 brazos de polímero, 6 brazos de polímero, 8 brazos de polímero o más. Un tipo particular de polímero muy ramificado es un polímero dendrítico o dendrímero, el cual, para propósitos de la invención, se considera por poseer una estructura distinta de un polímero ramificado. Un polímero "dendrímero" o "dendrítico" es un polímero de tamaño monodisperso, globular en el cual todos los enlaces emergen radialmente de un punto o núcleo focal central con un patrón ramificado regular y con unidades de repetición que cada una contribuye a un punto ramificado. Los dendrímeros exhiben ciertas propiedades de estado dendrítico tal como encapsulación del núcleo, que pueden hacerlos únicos a partir de otros tipos de polímeros. Un reactivo básico o acídico descrito en este documento incluyen neutrales, cargados y cualquiera de las formas salinas del mismo correspondiente. El término "paciente" se refiere a un organismo viviente que sufre de o susceptible a una condición que se puede prevenir o tratar por administración de un conjugado como se proporciona en este documento, e incluye tanto humanos como animales. Como se usa en este documento, el término "átomo de hidrógeno ionizable" ("Ha") significa un átomo de hidrógeno que se puede remover en la presencia de una base, a menudo un hidróxido o base amina. Típicamente, el "átomo de hidrógeno ionizable" ("Ha") será un átomo de hidrógeno unido a un átomo de carbono que, en turno, se une a uno o más porciones aromáticas u otro grupo o grupos que en alguna forma estabiliza el carbanión que se forma a partir de la pérdida del átomo de hidrógeno ionizable como un protón (o la etapa de transición que conduce al carbanión). Como se usa en este documento, "proporción de liberación del fármaco" significa una proporción (estado como una vida media) en la mitad de la cantidad total de los conjugados polímero-agente activo en un sistema desdoblará en el agente activo y un residuo polimérico. "Opcional" y "opcionalmente" significa que la circunstancia subsecuentemente escrita puede o no pude ocurrir, así que la descripción incluye instancias en donde la circunstancia ocurre y ejemplos en donde no. Como se usa en este documento, el designador "halo" (por ejemplo, fluoro, cloro, yodo, bromo y sucesivamente), es generalmente usando cuando el halógeno se une a una molécula, mientras el sufijo "ruro" (por ejemplo, fluoruro, cloruro, yoduro, bromuro y sucesivamente) se usa cuando el halógeno existe en su forma iónica independiente (por ejemplo, tal como cuando un grupo saliente permite una molécula). En el contexto de la presente discusión, se reconocerá que la definición de una variable proporcionada con respecto a una estructura o fórmula es aplicable a la misma variable repetida en una estructura diferente, a menos que el contexto indique otra cosa. Así, por ejemplo, la definición de "POLI", "porción espaciadora", "Re1" y sucesivamente, con respecto a un reactivo polimérico es igualmente aplicable a un conjugado proporcionado en este documento.

Como previamente de describe, la presente invención comprende (entre otras casas) reactivos poliméricos útiles para proporcionar conjugados que tienen un enlace degradable entre un polímero y otra porción. Sin desear ser unido por teoría, se cree que los conjugados se cree que se degradan de tal forma como para minimizar o eliminar completamente cualquier residuo o "etiqueta" del reactivo polimérico usado para formar el conjugado. Como una consecuencia, es posible en la hidrólisis de un conjugado formado de la reacción de un reactivo polimérico descrito en este documento con una amina que contiene un agente activo, para regenerar o recuperar la forma original no conjugada o no modificada del agente activo. Como se describe en este documento y como se evidencia por los fórmulas proporcionadas en este documento, los reactivos poliméricos de la invención comprenden uno o más polímeros solubles en agua (por ejemplo, "POLI1" y "POLI2", como se muestra en varias fórmulas proporcionadas en este documento), una porción que contienen aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; (por ejemplo, CS como se muestra en varias formulas proporcionadas en este documento), y un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable [por ejemplo, "(FIG)" como se muestra en varias fórmulas proporcionadas en este documento]. Además, varios componentes de los reactivos poliméricos descritos en este documento se puede unir al resto del reactivo polimérico a través de una porción espaciadora opcional (por ejemplo, como "X", "X1", "X2" y "X3" como se muestra en varias fórmulas proporcionadas en este documento). Además, uno, dos, tres, cuatro o más grupos que alteran el electrón (por ejemplo, "Re", "Re1", Re2", "Re3", "Re4" y sucesivamente como se muestra en varias fórmulas proporcionadas en este documento) se puede unir a la porción que contiene aromático (tanto en el reactivo polimérico, así como el conjugado). Antes de describir reactivos poliméricos ejemplares de la invención, modalidades de un polímero soluble en agua, una porción aromática, un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato, un grupo que altera el electrón, y una porción espaciadora será discutida. Las siguientes descripciones de un polímero soluble en agua, una porción aromática, un grupo que altera el electrón y una porción espaciadora son aplicables no únicamente al reactivo polimérico, pero a los conjugados correspondientes formados usando los reactivos poliméricos descritos. Con respecto a un polímero soluble en agua proporcionado, cada polímero soluble en agua (por ejemplo, POLI, POLI1 Y POLI2) puede comprender cualquier polímero tan pronto como el polímero es soluble en agua y no peptídico. Aunque preferiblemente un poli(etilen glicol), puede ser un polímero soluble en agua para uso en este documento, por ejemplo, otros polímeros soluble en agua tal como otros poli(alquilen glicoles), tal como poli(propilen glicol)("PPG"), copolímeros de etilen glicol y propilen glicol y similares, poli(alcohol oelfínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamidas), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ácido a-hidroxi), poli(alcohol vinílico), polifosfazeno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), tal como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,629,384. El polímero soluble en agua puede ser un homopolímero, copolímero, terpolímero, polímero en bloque no aleatorio, y polímero el bloque aleatorio de cualquiera de los procedentes. Además, un polímero soluble en agua puede ser lineal, pero también puede estar en otras formas (por ejemplo, ramificado, bifurcado y similares) se describe en más detalle abajo. En el contexto de la presente dentro de una estructura total, un polímero soluble en agua tiene de 1 hasta aproximadamente 300 términos. En ejemplos en donde el reactivo polimérico comprende dos o más polímeros solubles en agua, cada polímero soluble en agua en la estructura total puede ser el mismo o diferente. Se prefiere, sin embargo todos los polímeros solubles en agua en la estructura completa son del mismo tipo. Por ejemplo, se prefiere que todos los polímeros solubles en agua dentro de una estructura proporcionada sean cada uno un poli(etilen glicol). Aunque el peso promedio molecular en peso de cualquiera del polímero soluble en agua individual puede variar, el peso molecular promedio en peso de cualquier polímero soluble en agua proporcionado típicamente será en el siguiente intervalo: 100 Daltons hasta aproximadamente 150,000 Daltons. Intervalos ejemplares, sin embargo, incluyen peso moleculares promedio en peso en los siguientes intervalos: aproximadamente 880 Daltons hasta aproximadamente 5,000 Daltons; en el intervalo de mayor de 5,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 90,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 10,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons; en el intervalo de mayor de 10,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 20,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 53,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 25,000 Daltons hasta aproximadamente 120,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 29,000 Daltons hasta 120,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 35,000 Daltons hasta aproximadamente 120,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 880 Daltons hasta aproximadamente 60,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 440 Daltons hasta aproximadamente 40,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 440 Daltons hasta aproximadamente 30,000 Daltons; y en el intervalo de aproximadamente 40,000 Daltons hasta aproximadamente 120,000 Daltons. Para cualquier polímero soluble en agua proporcionado, se prefieren PEGs tienen un peso molecular en uno o más de estos intervalos. Pesos moleculares promedio en peso ejemplares para el polímero soluble en agua incluyen aproximadamente 100 Daltons, aproximadamente 200 Daltons, aproximadamente 300 Daltons, aproximadamente 400 Daltons, aproximadamente 440 Daltons, aproximadamente 500 Daltons, aproximadamente 600 Daltons, aproximadamente 700 Daltons, aproximadamente 750 Daltons, aproximadamente 800 Daltons, aproximadamente 900 Daltons, aproximadamente 1 ,000 Daltons, aproximadamente 1 ,500 Daltons, aproximadamente 2,000 Daltons, aproximadamente 2,200 Daltons, aproximadamente 2,500 Daltons, aproximadamente 3,000 Daltons, aproximadamente 4,000 Daltons, aproximadamente 4,400 Daltons, aproximadamente 4,500 Daltons, aproximadamente 5,000 Daltons, aproximadamente 5,500 Daltons, aproximadamente 6,000 Daltons, aproximadamente 7,000 Daltons, aproximadamente 7,500 Daltons, aproximadamente 8,000 Daltons, aproximadamente 9,000 Daltons, aproximadamente 10,000 Daltons, aproximadamente 11 ,000 Daltons, aproximadamente 12,000 Daltons, aproximadamente 13,000 Daltons, aproximadamente 14,000 Daltons, aproximadamente 15,000 Daltons, aproximadamente 16,000 Daltons, aproximadamente 17,000 Daltons, aproximadamente 18,000 Daltons, aproximadamente 19,000 Daltons, aproximadamente 20,000 Daltons, aproximadamente 22,500 Daltons, aproximadamente 25,000 Daltons, aproximadamente 30,000 Daltons, aproximadamente 35,000 Daltons, aproximadamente 40,000 Daltons, aproximadamente 45,000 Daltons, aproximadamente 50,000 Daltons, aproximadamente 55,000 Daltons, aproximadamente 60,000 Daltons, aproximadamente 65,000 Daltons, aproximadamente 70,000 Daltons, y aproximadamente 75,000 Daltons. También se pueden usar versiones ramificadas del polímero soluble en agua (por ejemplo, un polímero soluble en agua de 40,000 Dalton ramificado comprendido de dos polímeros de 20,000 Dalton) que tienen un peso molecular promedio en peso de cualquiera de los precedentes. En una o más modalidades de la invención, el reactivo polimérico comprenderá un polímero soluble en agua que tiene un tamaño en el intervalo adecuado para la proporción deseada de liberación del conjugado formado de ahí. Por ejemplo, un conjugado que tiene una proporción relativamente larga se puede preparar de un reactivo polimérico que tiene un tamaño adecuado para a) circulación prolongada antes de la degradación del conjugado, y (b) moderadamente rápido en espacio libre in vivo del polímero soluble en agua restante en la degradación del conjugado. Igualmente, cuando el conjugado tiene una velocidad de liberación relativamente rápida, entonces el reactivo polimérico típicamente tendrá un peso molecular bajo. Cuando se usa un PEG como el polímero soluble en agua en el reactivo polimérico, el PEG típicamente comprende un número de monómeros (OCH2CH2) [o monómeros (CH2CH20), dependiendo de como el PEG se define]. Como se usa a través de la descripción, el número de unidades de repetición se definen por el subíndice "p" en "(OCH2CH )n". Así, el valor de (n) típicamente cae dentro de uno o más de los siguientes intervalos: de 2 hasta aproximadamente 3400, de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 1500, de aproximadamente 100hasta aproximadamente 2300, de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2270, de aproximadamente 136 hasta aproximadamente 2050, de aproximadamente 225 hasta aproximadamente 1930, de aproximadamente 450 hasta aproximadamente 1930, de aproximadamente 1200 hasta aproximadamente 1930, de aproximadamente 568 hasta aproximadamente 2727, de aproximadamente 660 hasta aproximadamente 2730, de aproximadamente 795 hasta aproximadamente 2730, de aproximadamente 795 hasta aproximadamente 2730, de aproximadamente 909 hasta aproximadamente 2730, y de aproximadamente 1 ,200 hasta aproximadamente 1 ,900. Para cualquier polímero proporcionado en el cual el peso molecular se conoce, es posible determinar el número de unidades de repetición (es decir, "n"), dividiendo el peso molecular promedio del peso total del polímero por el peso molecular del monómero de repetición. Cada polímero soluble en agua es típicamente biocompatible y no inmunogénico. Con respecto a biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos benéficos asociados con el uso de la sustancia sola o con otras sustancias (por ejemplo, un agente activo) en conexión con los tejidos vivientes (por ejemplo, administración a un paciente) superar cualquier efecto perjudicial como se evalúa por un especialista, por ejemplo, un médico. Con respecto a no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogénica si el uso de la sustancia sola o con otra sustancia en conexión con tejidos vivientes no produce una respuesta inmune (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmune, tal respuesta no se considera clínicamente significante o importante como se evalúa por un especialista. Es particularmente preferido que los polímeros solubles en agua, descritos en este documento, así como conjugados de agentes activos y los polímeros son biocompatibles y no inmunógenicos. En una forma útil, libre de PEG no unido es un polímero lineal terminado en cada extremo con los grupos hidroxilo: HO-CH2CH20-(CH2CH20)rt?-CH2CH2-OH en donde (m') típicamente varía de cero hasta aproximadamente 4,000, preferiblemente de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 1 ,000. El polímero anterior, alga-, omega-dihidroxipoli(etilenglicol), puede ser representado en formas breves como HO-PEG-OH en donde se entenderá que el símbolo PEG puede representar la siguiente unidad estructural: -CH2CH20-(CH2CH20)m-CH2CH2-en donde (m') es como se define anteriormente. Otro tipo de PEG libre o no unido útil en la presente invención es metoxi-PEG-OH, o PEG en breve, en el cual un término es relativamente grupo metoxi inerte, mientras los otros términos es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se proporciona abajo. CH30-CH2CH20-(CH2CH2?)m'-CH2CH2-en donde (m') es como se describe anteriormente. Moléculas PEG brazos múltiples o ramificadas, tal como aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 5,932,462, también se pueden usar como el polímero PEG. Por ejemplo, PEG puede tener la estructura: poha R R" — C I pohb — Q en donde: polia y polib son esqueletos PEG (ya sea el mismo o diferente), tal como metoxi poli(etilen glicol); R" es una porción no reactiva, tal como H, metilo o una estructura PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En una modalidad preferida, el polímero PEG ramificado es metoxi poli(etilen glicol) lisina disustituida. Además, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de un PEG bifurcado libre o no unido es representado por la siguiente fórmula: Z / PEG-X-C-H \ Z en donde: X es una porción espaciadora y cada Z es un grupo Terminal activado enlazado á CH por una cadena de átomos de longitud definida. La cadena de átomos enlazados a los grupos funcionales Z al átomo de carbono ramificado sirve como un grupo atador y puede comprender, por ejemplo, cadena alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de los mismos. La Patente Estadounidense No. 6,362,254, describe varias estructuras PEG bifurcadas capaces de usarse en la presente invención. El polímero PEG puede comprender una molécula PEG colgante que tiene grupos reactivos, tal como carboxilo, covalentemente unido a lo largo de la longitud de PEG en lugar que en el extremo de la cadena PEG. Los grupos reactivos colgantes se puede unir al PEG directamente o a través de una porción espaciadora, tal como un grupo alquileno. Además a las formas descritas anteriormente de PEG, cada polímero soluble en agua es el reactivo polimérico también puede estar presente con uno o más enlaces débiles o degradables en el polímero, que incluyen cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, PEG se puede preparar con enlaces de éster en el polímero que es sometido a hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en desdoblamiento del polímero en fragmentos de peso molecular bajo: PEG-C02-PEG- + H20 *- -PEG-C02H + HO-PEG- Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como enlaces degradables dentro de un esqueleto de polímero, incluyen enlaces de carbonato; enlaces de ¡mina que resulta, por ejemplo, a partir de reacciones de una imina y un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); enlaces de éster de fosfato formados, por ejemplo, haciendo reaccionar alcohol con un grupo fosfato; enlace de hidrazona los cuales son típicamente formados por reacción de una hidracina y un aldehido; enlaces acetal que son típicamente formados por reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces orto éster que son, por ejemplo, formados por reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces de amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en el extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de otra cadena PEG; enlaces de uretano formados a partir de reacción de, por ejemplo un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol PEG; enlaces de péptido formados por un grupo amina, por ejemplo, en el extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótido formados por, por ejemplo, un grupo fosforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido. Se entenderá por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, que el término poli(etilenglicol) o PEG representa o incluye todas las formas anteriores de PEG. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la discusión precedente que concierne sustancialmente polímeros solubles en agua no significan exhaustivamente y solamente ilustrativos, y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen cualidades descritas anteriormente. Como se usa en este documento, el término "polímero soluble en agua" se refiere tanto a una molécula, así como al residuo de polímero soluble en agua que se ha unido a otra porción. Cada polímero soluble en agua es nido (ya sea directamente o a través de una porción espaciadora comprendida de uno o más átomos) a una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable. Así, la porción que contiene aromático sirve como un punto.de unión para uno o más polímeros solubles en agua.

Sin desear ser unido por teoría, se cree ser ventajoso por tener la porción que contiene aromático que sirve como un punto de unión para uno o más polímeros solubles en agua. Específicamente, por tener cada polímero que contiene aromático unido (ya sea directamente o a través de una porción espaciadora) a la porción que contiene aromático, los efectos a menudo tóxicos con especies aromáticas se puede reducir a través de un efecto estérico o de bloqueo proporcionado por el polímero soluble en agua. Este efecto estérico o de bloqueo puede reducir o eliminar procesos metabólicos potencialmente dañinos que potencialmente ocurren cuando de administran algunas sustancias aromáticas. Así, los reactivos poliméricos actualmente descritos que tienen dos o más polímeros solubles en agua pueden proporcionar conjugados que se cree tienen toxicidad reducida. Tal ventaja se cree diferenciar sobre otros reactivos poliméricos (y conjugados correspondientes) en donde, por ejemplo, un polímero soluble en agua ramificado único se une a una porción que contiene aromático. Aunque más de cualquiera de la porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable se puede usar, la porción que contiene aromático puede proporcionar un sitio o sitios de unión de varios componentes. Además, se puede reconocer que la porción que contiene aromático no es la misma que tiene aromático completamente. La porción que contiene aromático puede, por ejemplo, contener una o más porciones aromáticas opcionalmente enlazadas entre sí directamente o a través de una porción espaciadora que comprende uno o más átomos.

En algunos ejemplos, la porción aromática que porta un átomo de hidrógeno ionizable tomará la forma de una de las siguientes estructuras: en donde: Ar1 es una primera porción aromática, Ar2 es una segunda porción aromática, X3 es una porción espaciadora y Z es un grupo que altera el electrón, en relación a H. Tales grupos que alteran al electrón, los grupos son explicados en más detalle abajo. Grupos Z preferidos incluye, pero no se limitan a, -CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Arilo, -S(02)R, -S(02)Arilo, -S(02)OR, -S(02)OArilo, -S(02)NHR, -S(02)NHArilo, -C(0)R, -C(0)Arilo, -C(0)OR, -C(0)NHR, y similares, en donde R es H o un radical orgánico. Porciones aromáticos ejemplares (las cuales puede además ser sustituidas con uno o más grupos que alteran el electrón, se explican adicionalmente en este documento) incluyen los siguientes (en donde, en cada caso, el átomo de hidrógeno ionizable de interés es un hidrógeno unido a un carbono alifático adyacente a uno o más de los anillos aromáticos, es decir, es bencílico o similar a bencílico): (en donde X es O, SH, NH, NR en donde R es un radical orgánico) en donde R es un radical orgánico, preferiblemente alquilo), en donde cada uno de G1, G2, G3, G4 y G5 es independientemente N, C-H o carbono sustituido con la condición que en donde cualquiera de G1, G2, G3, G4 y G5 de G es N, el átomo adyacente debe ser C-H o un carbono sustituido. Porciones aromáticas preferidas incluyen en donde cada uno de G1, G2, G3, G4 y G5 es independientemente N, C-H o carbono sustituido con la condición que en donde cualquiera de G1, G2, G3, G4 y G5 de G es N, el átomo adyacente debe ser C-H o un carbono sustituido. En una o más modalidades, la porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable opcionalmente incluye uno o más grupos que alteran el electrón ("Re", "Re1", "Re2" y sucesivamente). Un grupo que altera el electrón es un grupo que cualquiera que dona un electrón (y por lo tanto se refiere como un "grupo que dona el electrón"), o de electrón atrayente (y por lo tanto se refiere como un "grupo de electrón atrayente"). Cuando se une a la porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, un grupo que dona el electrón es un grupo que tiene la capacidad para colocar electrones lejos del mismo y cercano a o dentro de la porción que contiene aromático. Cuando se une a la porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, un grupo de electrón atrayente es un grupo que tiene la capacidad para colocar electrones hacia si mismo y lejos de la porción que contiene aromático. Se usa hidrógeno como el estándar para comparación en la determinación de si un grupo proporcionado coloca electrones lejos o en si mismo. Mientras no se desee ser unido por teoría, los grupos que alteran el electrón, cambiando la posición de los electrones (es decir, la "densidad del electrón") de la porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, tiene influencia en la facilidad por la cual somete a ionización el átomo de hidrógeno ionizable. Así, se cree que los grupos que retiran el electrón incrementan la acidez del átomo de hidrógeno ionizable mientras los grupos que donan el electrón disminuyen la acidez de un átomo de hidrógeno ionizable. Grupos que donan y retiran el electrón que afectan la acidez del átomo de hidrógeno ionizable incluyen grupos contenidos dentro de las porciones espaciadoras (por ejemplo, X1 , X2, X3 y sucesivamente) que sirven para enlazar varios constituyentes de las estructuras proporcionadas en este documento. Grupos que retiran el electrón ejemplares incluyen (por ejemplo, bromo, fluoro, cloro y yodo), nitro, carboxi, éster, formilo, ceto, azo, amidocarbonilo, amidosulfonilo, carboxamido, sulfonoxi, sulfamida, ureido y arilo. Grupos que donan electrones ejemplares incluyen hidroxilo, alcoxi inferior (por ejemplo, metoxi, etoxi y similares), alquilo inferior (tal como metilo, etilo y similares), amino, alquilamino inferior, alquilamino di-inferior, ariloxi (tal como feoxi y similares), arilalcoxi (tal como fenoxi y similares), aminoarilo (tal como p-dimetilaminofenilo y similares), mercapto y alquiltio. En una o más modalidades, la porción que contiene aromático puede incluir (además a uno o más polímeros solubles en agua) uno, dos, tres, cuatro o más grupos que alteran el electrón. Ejemplos ejemplares en donde la porción que contienen aromático incluyen dos grupos que alteran el electrón se muestran en las siguientes estructuras abajo: Re1 Ár1 R * Re c £ A R e2 en donde Q Jes una porción que contiene aromático, Ar1 es una primera porción aromática, Ar2 es una segunda porción aromática, Re1 es un grupo que altera el electrón y Re2 es un grupo que altera el electrón, mientras el átomo de hidrógeno ionizables (es decir, Ha), uno o más de los polímeros solubles en agua, y cualquiera de otros constituyentes que pueden estar presentes no se muestran. Cuando cada uno de Re1 y Re2 es diferente, (a) Re1 y Re2 pueden ser diferentes grupos que retiran el electrón, (b) Re1 y Re2 pueden ser diferentes grupos que donan el electrón, (c) o Re1 y Re2 pueden ser tal que uno es un grupo de electrón atrayente y el otro es un grupo que dona el electrón. En muchas circunstancias, cada uno de Re1 y Re2 serán el mismo.

Típicamente, pero no necesariamente, colocando un grupo que altera el electrón en la porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable es a menudo determinado por el punto de entrada preferido de los grupos que alteran el electrón agregados a través de procesos de sustitución electrofílica o nucleofílica aromática. Por ejemplo, con un anillo de fluoreno, posiciones típicas para adición de grupos que alteran el electrón por sustitución aromática electrofílica son las posiciones "2" y "7". Si estas posiciones se acoplan por una porción espaciadora (la cual se une a un polímero soluble en agua) otras posiciones en el anillo de fluoreno serán sustituidas en base a factores tales como (a) la capacidad para dirigir de la porción espaciadora (por ejemplo, X1 y X2), y (b) influencias estéricas. A menudo, sin embargo, las posiciones "4" y "5" de un anillo de fluoreno representa los sitios de enlace para unir cuando las posiciones "2" y "7" no están disponibles y especialmente cuando el carbono alfa, es decir, la posición 9 en fluoreno (es decir, el carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha), es sustituido. Para ilustración, las posiciones en el anillo de fluoreno se identifican en la siguiente estructura: en donde, cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha y (FG) se definen con respecto a la fórmula I, infra. Aunque posiciones ejemplares de grupos que alteran el electrón y otros grupos que se han referido con respecto a un anillo de fluoreno, la presente discusión de la localización de posición de los grupos que alteran el electrón es aplicable a otros sistemas aromáticos también. Un experto ordinario en la técnica puede determinar las ubicaciones de posición en otros sistemas de anillo. Como previamente se indica, grupos que alteran el electrón pueden tener influencia en la acidez del átomo de hidrógeno ionizable de la porción que contiene el aromático en diferentes vías, dependiendo de la naturaleza del grupo que altera en electrón particular. Por ejemplo, debido a la proximidad de los grupos que alteran el electrón en posiciones "V y "8" para el átomo de hidrógeno ionizable en el anillo de fluoreno mostrado abajo, grupos que alteran el electrón en estas posiciones pueden tener la mayor influencia a través de los efectos de unión (inductivo). Cuando el POLI1-X1- y POLI2-X2- se unen en las posiciones 2 y 7, sin embargo, además de un grupo que altera el electrón en las posiciones 4 ó 5 es más probable, por las razones mencionadas anteriormente (es decir, que dirigen efectos de las porciones espaciadoras y efectos estéricos). Grupos que alteran en electrón que interactúan con el anillo a través de efectos de resonancia, tal como grupos amido, carboxi, nitro y aloxi, pueden proporcionar el efecto de resonancia a una distancia significante a partir del hidrógeno alfa. Como una consecuencia, su colocación relativamente cerca al átomo de hidrógeno ionizable puede ser menos importante. A partir de otra perspectiva, puede ser ventajoso permitir posiciones relativamente cerca (por ejemplo, las posiciones "V y "4") insustituidas como el átomo de hidrógeno ionizable que últimamente llegará a ser removido, probablemente ser retardado por efectos esféricos de grupos que alteran el electrón en estas posiciones. Nuevamente, aunque posiciones ejemplares de grupos que alteran el electrón y otros grupos que se ha referido con respecto a un anillo de fluoreno, la presente discusión de la ubicación en posición es aplicable a otros sistemas de anillo también; un experto ordinario en la técnica puede determinar las ubicaciones en posición correspondientes en otros sistemas de anillo. Para entender mejor la reacción de liberación de un conjugado formado con un reactivo polimérico de la invención (y también demostrar el efecto de grupos que alteran el electrón en el proceso) y sin cualquier intento de ser unido por teoría, se proporciona un mecanismo propuesto del proceso de liberación. Un esquema de reacción del mecanismo propuesto se muestra abajo, utilizando una porción de fluoreno como la porción que contiene aromático. En el esquema de reacción, un conjugado ejemplar de la invención se muestre, en donde el enlace de carbamato se conecta al residuo del agente activo ("Fármaco") para la detención de la molécula. Las variables "POLI1", "POLI2", "X1", "X2", "R1", y "R2" son como previamente se definen.

// B-H \ HN- -Fármaco -CO, H,N- Fármaco El proceso de liberación es típicamente iniciado por el ataque de una molécula base, ion o especies que tienen la capacidad para aceptar un protón en un proceso de transferencia ("B": como se muestra en el esquema de reacción), in vivo, esto puede ser cualquiera de varios tipos de especies iónicas o una proteína, la cual tiene varios átomos básicos. La eliminación se origina para formar una porción de fulveno sustituido (o estructura correspondiente cuando una estructura no de fluoreno se emplea), con ello liberando el agente activo o especie de "fármaco", el cual puede inicialmente ser unido a un grupo carboxi, el cual es rápidamente perdido bajo condiciones fisiológicas. Los procesos de liberación pueden ser concertados o en etapas. A pesar de la naturaleza exacta de la etapa que remueve el protón, se involucra ya sea se forma un carbanión como un intermediario o un estado de transición que tiene carácter carbaníónico. Así, los grupos que donan electrón unidos a los anillos aromáticos, los cuales retardan la formación de carbaniones, retardaran los procesos de formación de carbanión, con ello disminuyendo la proporción de liberación. Contrariamente, grupos que retiran el electrón, lo cual facilita la formación de especies carbaniónicas y estados de transición carbaniónicos estabilizados, acelerará los procesos de formación de carbanión, con ello incrementando la proporción de liberación. Ventajosamente, incluyendo uno o más grupos que alteran el electrón a la porción que contiene aromático, es posible para más estrechamente proporcionar la proporción deseada de la liberación del agente activo. Incluyendo uno o más grupos que retiran el electrón en la porción que contiene aromático, la liberación se cree incrementa, mientras la presencia de uno o más grupos que donan electrón se cree disminuye la proporción de liberación. Así, se cree que la presencia de uno o más grupos que alteran el electrón puede proporcionar estabilidad o inestabilidad relativa de un estado de transición o intermediario cargado que se puede involucrar en la reacción de liberación. Por lo tanto, incluyendo uno o más del grupo que altera el electrón en la porción que contiene aromático, es posible para personalizar mejor una proporción deseada de liberación del agente activo original que se conjuga con un reactivo polimérico de la invención. Es posible determinar que afecta tal grupo que altera el electrón tendrá en la proporción de liberación del fármaco del conjugado para preparar un reactivo polimérico que tiene el grupo que altera el electrón propuesto, preparar un conjugado usando este reactivo polimérico, probando el conjugado para la proporción de liberación del fármaco durante un tiempo, y comparando la proporción de liberación del fármaco a un conjugado preparado con un reactivo polimérico control. Para determinar las proporciones de liberación relativa de un conjugado in vitro, se puede preparar un conjugado y estudiar. Véase el Ejemplo 5, infra, La preparación de un conjugado de glicina se ilustra en el esquema abajo (en donde m-PEGO y OPEG-m cada uno se definen como -O-CH2CH2-(OCH2CH2)n-OCH3, en donde cada n es de 4 a 1500).

La proporción de liberación de este conjugado se estudia bajo condiciones in Vitro simuladas, observado la reacción en un medio amortiguado a un pH casi neutral. Siguiendo la apariencia de la porción que contiene fulveno durante un tiempo, uno puede calcular una vida media para la reacción resultando en la liberación. Esta proporción de liberación puede ser cualitativamente comparada a las proporciones de liberación de otros conjugados de glicina que difieren en el número y/o tipo de grupos que alteran el electrón. Haciendo esto, uno puede determinar la proporción de liberación para cualquiera de las especies proporcionadas. El grupo funcional de los reactivos poliméricos descritos en este documento es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. La invención no se limita con respecto al grupo funcional específico tan pronto como el grupo funcional es capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. Grupos funcionales ejemplares capaces de reaccionar con un grupo amino de un agente activo, incluye aquellos grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de carbonatos activos tal como N-succinimidilo, 1 -benzotriazolilo, imidazol, haluros de carbonato (tal como cloruro de carbonato y bromuro de carbonato), fenolatos (tal como p-nitrofenolato) y sucesivamente. También, como un caso especial, si el agente activo está disponible con el grupo amina activo convertido en un grupo isocianato o isotiocianato, después el grupo funcional del reactivo polimérico puede ser hidroxilo como la reacción de estos componentes proporciona un enlace de carbamato degradable. Una porción espaciadora (por ejemplo, "X", "X1", "X2", "X3", y sucesivamente) es cualquier átomo, o series de átomos que conectan una parte de una molécula a otra. Para propósitos de la presente descripción, sin embargo, una serie de átomos no es una porción espaciadora cuando las series de átomos es inmediatamente adyacente a un polímero y las series de átomos es otro monómero de forma tal que la porción espaciadora propuesta representará una simple extensión de la cadena de polímero. Por ejemplo, proporciona la estructura parcial "POLI-X", y POLI se define como "CH30(CH2CH20)m-" en donde (m) es 2 a 4000 y X se define como una porción espaciadora, la porción espaciadora no puede ser definida como "-CH2CH20-" ya que una definición solamente representará una extensión del polímero. En tal caso, sin embargo, una porción espaciadora aceptable puede ser definida como ' "-CH2CH2-". Porciones espaciadoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -C(O)-, -S(02)-, -S(O)-, -NH-S(02)-, -S(02)-NH-, -CH=CH-, -0-CH=CH-, -C(0)-NH-, -NH-C(0)-NH-, -0-C(0)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -0-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2_0-CH2-, -CH2-CH -CH2-CH2-0-, -S-CH2-, -CH2-S-, -S-CH2-CH2-, -CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-S-CH2-CH2-, -CH2-CH -S-CH2-, -CH2-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2"S-CH2_CH2-, -CH2_CH2-CH -S-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-S-, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH- C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH=CH-C(0)-NH-,-C(0)-0-CH2-, -CH2-C(0)-0-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-0-CH2-, -C(0)-0-CH2-CH2-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2;NH-C(0)-CH2-CH2-, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(0)-CH2-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -O-C(0)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)r, -NH-C(0)-0-[CH2]h-(OCH2CH2)r, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R6)-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de las precedentes, en donde R6 es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es cero a seis, y (j) es cero a 20. Otras porciones espadadoras tienen las siguientes estructuras: -NH-CíOJ-NH-ÍCH^-e-NH-CíO)-, y -O-CíOJ-NH-ÍCH^-e-NH-CíO)-, en donde los valores de subíndice después de cada metileno indica el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)?-6 significa que la estructura puede contener 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de las porciones espadadoras puede además incluir una cadena de oligómero de óxido de etileno que comprende de 1 a 20 unidades de monómero de óxido de etileno [es decir, -(CH2CH20)?-2o]- Que es, la cadena de oligómero de óxido de etileno puede originarse antes o después de la porción espaciadora, y opcionalmente entre cualquiera de los dos átomos de una porción espaciadora comprendida de dos o más átomos. También, la cadena de oligómero no será considerada parte de la porción espaciadora si el oligómero es adyacente a un segmento del polímero y solamente representa una extensión del segmento del polímero. Finalmente, se nota que algunas porciones espaciadora incluyen un átomo o grupo de átomos que también funcionan como un grupo que altera el electrón; en tal caso, la inclusión de uno o más "discretos" adicionales (es decir, no es parte de una porción espaciadora) grupos que alteran el electrón no pueden ser deseados o necesarios. Porciones espaciadoras preferidas para X y X1 incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(0)-I -C(0)-NH-(CH2CH20)?.3-CH2-CH2-NH-, 3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)?.3-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-. Porciones espadadoras preferidas para X2 incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?.3-NH-C(0)-.

-C(0)-NH-(CH2CH20)?-3-CH2-CH2-NH-, -CíOJ-NH-CH CH^OCH^H^L 3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)1-3-CH2-CH2-NH-C(0)-) -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-. Cada porción espaciadora, cuando está presente, en la estructura total puede ser la misma o diferente que cualquier otra porción espaciadora en la estructura total. Con respecto a X1 y X2, es algunas veces preferido que X1 y X2 son el mismo. Porciones espaciadoras preferidas que corresponden a X, X1 y/o X2 incluyen amidocarboxi, carboxiamido, sulfonamida, éster y ureido. En algunas modalidades, se prefiere que la porción espaciadora (particularmente X de fórmula VI y Vl-C) satisface una o más de los siguientes: carece de átomos de azufre (por ejemplo, carece "-S-"); carece de átomos fosforosos; es una cadena de mayor de cuatro átomos; y no incluye -CO-CHg-NH-CO-, -CO-CH(CH3)-NH-CO- y -CO-CH2-NH-CO-NH. En algunas modalidades, se prefiere que la porción espaciadora (particularmente X de Fórmula VI y Vl-C) es un átomo o grupos de átomos con la condición que el átomo o grupos de átomos se carece de azufre átomos fosforosos y no es -NH-CO-O-, -NH-CO-CH2-NH2-CO-NH-, -NH-CO-, -NH-CH2-, -NH-CO-NH-, -NH-CS-NH-, -CO-O-, -CO-NH-, y -CH2-NH-. En algunas modalidades la porción espaciadora (particularmente X de Fórmulas VI y Vl-C) no es -R5-R6, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de -NH-, -S-, -CO-, -COO-, -CH2-, -S02-, -SO3-, -P02- and -P03-, y R6 es una unión o un radical seleccionado del grupo que consiste de -CO-, -COO-, -CH2-, -CH(CH )-, -CONH-, -CS-NH, -CO-CH2-NH-CO-, -CO-CH(CH3)-NH-CO-, -CO-CH2-NH-CO-NH-, -CO-R8- (en donde R8 se un alquileno lineal o ramificado), un radical que contiene maleimido, y radical que contiene triazinilo. En algunos ejemplos, una porción espaciadora y/o cualquiera del grupo que altera el electrón puede incluir una funcionalidad de amida unida directamente a la porción que contiene aromático (es decir, en donde el nitrógeno de la amida es covalentemente unido directo a la porción que contiene aromático). En algunas modalidades sin embargo, se prefiere que tanto la porción espaciadora como cualquier grupo que altera en electrón no incluyan una funcionalidad de amida (es decir, -NH-C(O)- o -C(O)-NH-) unida directamente a la porción que contiene aromático. Reactivos poliméricos ejemplares de la invención ahora se discutirán en más detalle. Se debe recordar que mientras la estereoquímica no se muestra específicamente en cualquiera de las fórmulas o estructuras (si para un reactivo polimérico, conjugado o cualquier otra fórmula o estructura), las fórmulas y estructuras proporcionadas contemplan tanto enantiómeros, así como mezclas que comprenden composiciones de cada enantiómero en cantidades iguales (es decir, una mezcla racémica) y cantidades desiguales.

Así, por ejemplo, un reactivo polimérico de Fórmula lie en la cual un grupo que altera en electrón único (Re1) está presente incluye tanto enantiómeros como mezclas del mismo. Un reactivo polimérico ejemplar de la invención tiene la siguiente estructura: (Fórmula I) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; ^^-^H es una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable.

Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula I no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula I], resulta un reactivo polimérico de la i siguiente formula: la) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Z- , , y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula I. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula I tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula I], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula le) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, °^ , (FG), y Re1 es como previamente se define con respecto a la Fórmula I. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula I tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula I], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula 1 b) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2,C3C n?- (FG), Re1 y Re2 es como previamente se define con respecto a la Fórmula I.

En algunos casos, el reactivo polimérico puede incluir porciones aromáticas individuales que son únicamente enlazados entre sí a través de un átomo de carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable. Tal como un reactivo polimérico que tienen la siguiente fórmula: (R?]b (Fórmula II) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula II no , tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos ; son cero, con respecto a la Fórmula II], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula Ha) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula II. i i Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula II ' tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula II], un reactivo polimérico de los [ siguientes resultados: (Fórmula He) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1 , X2, Ar1 , Ar2, Ha, R1 , R2, Re1 , y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula II. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula II tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula II], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula llb) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ar1, Ar2, Ha, R1 , R2, (FG), Re1 , y Re2 es como previamente se define con respecto a la Fórmula II. En aún otros casos, el reactivo polimérico puede incluir porciones aromáticas individuales que se enlazan entre sí tanto a través de un átomo de carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable así como otra unión directa. Tal como un reactivo polimérico que tienen la siguiente fórmula: en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula lll no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula lll], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula Illa) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula lll. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula lll tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula lll], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, Re1, y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula lll. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula lll tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula lll], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, Re1 , Re2, y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula lll. En aún otros casos, el reactivo polimérico puede incluir porciones aromáticas individuales que se enlazan entre sí a través de un átomo de carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable, así como porciones espaciadoras de uno o más átomos. Tal como un reactivo polimérico que tienen la siguiente fórmula: (Fórmula IV) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; X3 es una tercera porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re , cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula IV no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula IV], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, X3, R1, R2, Ar1, Ar2, y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula IV.

Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula IV tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula IV], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula IVc) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, X3, R1, R2, Ar1, Ar2, Re1 y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula IV. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula IV tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula IV], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: Re2 (Fórmula IVb) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, X3, Ar1, Ar2, HQ, R1, R2, Re1, Re2 y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula IV. Un reactivo polimérico preferido comprende la siguiente estructura: (Fórmula V) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula V no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula V], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ha, R1, R2 y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V. Cuando el reactivo polimépco que corresponde a la Fórmula V tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula V], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ha, R\ R2, Re1 y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V. Cuando el reactivo polimérico que corresponde a la Fórmula V tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula V], un reactivo polimérico de los siguientes resultados: (Fórmula Vb) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2, y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V. Aún otro reactivo polimérico preferido es de la siguiente estructura: (Fórmula Vd) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, HQ, Rß1, Re2, (a), (b) y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V, con la condición que Re1 es H cuando (a) es cero, y Re2 es H cuando (b) es cero. Aún otro reactivo polimérico preferido es de la siguiente estructura: (Fórmula Ve) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R , R2, Ha, Re1, Re2 y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V, con la condición que Re1 es H cuando (a) es cero, y Re2 es H cuando (b) es cero. Aún otro reactivo polimérico preferido es de la siguiente estructura: (Fórmula Vf) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2 y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V, con la condición que Re es H cuando (a) es cero, y Re2 es H cuando (b) es cero. Aún otro reactivo polimérico preferido es de la siguiente estructura: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2, (a), (b) y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula V, con la condición que Re1 es H cuando (a) es cero, y Re2 es H cuando (b) es cero. Típicamente, cada uno de POLI1 y POLI2 en cada uno de los reactivos poliméricos de fórmulas I, la, le, Ib, II, lia, Me, llb, lll, Illa, lile, lllb, IV, IVa, IVc, IVb, V, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf y Vg son el mismo. Es posible, sin embargo, para tener reactivos poliméricos en donde cada uno de POLI1 y POLI2 es diferente. Además, cada uno de POLI1 y POLI2 serán típicamente (aunque no necesariamente) un poli(óxido alquileno) tal como un poli(etilen glicol). Además, para un poli(etilen glicol) proporcionado, cada uno de poli(etilen glicol) puede ser terminalmente cubierto con una porción de cubierta terminal seleccionada del grupo que consiste de hidroxilo, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido. Grupos cubiertos terminales preferidos, sin embargo, incluyen metoxi. Pesos moleculares promedio en peso para cada poli(etilen glicol) que sirve como un POLI1 y POLI2 en las Fórmulas I, la, le, Ib, II, lia, lie, llb, lll, Illa, lile, lllb, IV, IVa, IVc, IVb, V, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf y Vg, que incluyen uno o más de lo siguiente: en el intervalo de aproximadamente 120 Daltons hasta aproximadamente 6,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 10,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons; y en el intervalo de aproximadamente 20,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons. Arquitecturas ejemplares para un poli(etilen glicol) proporcionado, sirve como un POLI1 y POLI2 en las Fórmulas I, la, le, Ib, II, lia, lie, llb, lll, Illa, lile, lllb, IV, IVa, IVc, IVb, V, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf y Vg incluye lineal o ramificado. Primeras y segundas porciones espaciadoras ejemplares para cada una de las fórmulas I, la, le, Ib, II, Ha, He, llb, lll, Illa, lile, lllb, IV, IVa, IVc, IVb, V, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf y Vg, incluyen porciones espaciadoras X1 y X2 independientemente seleccionadas del grupo que consiste de -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-. También se prefiere, con respecto a las Fórmulas I, la, le, Ib, II, Ha, He, llb, lll, Illa, lile, lllb, IV, IVa, IVc, IVb, V, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf y Vg, que cada uno de R1 y R2 es H, aunque alquilo inferior (tal como metilo y etilo) también se contempla. Además, con respecto a cualquiera de los grupos que alteran el electrón presente en cualquiera de las Fórmulas I, le, Ib, II, lie, llb, lll, lile, lllb, IV, IVc, IVb, V, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf y Vg cada grupo que altera el electrón es preferiblemente halo, alquilo inferior, arilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Ar, -S(02)R, -S(02)Ar, -S(02)OR, -S(02)OAr, -S(02)NHR, -S(02)NHAr, - C(0)R, -C(0)Ar, -C(0)OR, -C(0)NHR, y similares, en donde Ar es arilo y R es H o un radical orgánico. Otro reactivo polimérico ejemplar tiene la siguiente fórmula: (Fórmula VI) en donde: POLI es un polímero soluble en agua X es una porción espaciadora que no incluye una porción ? es una porción aromática que porta un átomo de hidrógeno, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; Re es un grupo que altera el electrón; (a) es cualquiera de cero o uno; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable. Otro reactivo polimérico ejemplar comprende la siguiente estructura: (Fórmula Via) en donde cada uno de POLI, X, R1, R2, (a) y (FG) es como previamente se define con respecto a la Fórmula VI. Los reactivos poliméricos que corresponden a las Fórmulas VI y Via típicamente (aunque no necesariamente) tendrán POLI que es un poli(óxido de alquileno) tal como un poli(etilen glicol). Además, el poli(etilen glicol) puede terminalmente ser cubierto con una porción de cubierta final seleccionado del grupo que consiste de hidroxilo, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido. Grupos de cubierta terminal preferidos, sin embargo, incluyen metoxi. Pesos moleculares promedio en peso ejemplares para un poli(etilen glicol) que sirve como un POLI en las Fórmulas VI y Via incluyen uno o más de los siguientes: en el intervalo de aproximadamente 120 Daltons hasta aproximadamente 6,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons; en el intervalo de aproximadamente 10,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons; y en el intervalo de aproximadamente 20,000 Daltons hasta aproximadamente 85,000 Daltons. Arquitecturas ejemplares para un poli(etilen glicol) que sirve como un POLI en las Fórmulas VI y Via incluyen lineal y ramificado. Segundas porciones espaciadoras ejemplares para las Fórmulas VI y Via incluyen porciones espaciadoras seleccionadas del grupo que consiste de NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH^CH^C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-. Con respecto a las Fórmulas VI y Via, cada uno de R1 y R2 es preferiblemente H a través alquilo inferior (tal como metilo y etilo) también se contempla. Con respecto a la Fórmula Via, se prefiere que Re es halo, alquilo inferior, arilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Ar, -S(02)R, -S(02)Ar, -S(02)OR, -S(02)0Ar, -S(02)NHR, -S(02)NHAr, -C(0)R, -C(0)Ar, -C(0)OR, -C(0)NHR, y similares, en donde Ar es arilo y R es H o un radical orgánico. En algunas modalidades, se prefiere que una porción aromática para la Fórmula VI (y el correspondiente conjugado representado por la Fórmula Vl-C) no es uno de los siguientes: Ejemplos de reactivos poliméricos de la invención incluyen los siguientes: CH30-(CH2CH 2?)n-CH2C H2-0 CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2- en donde cada (n) es de 4 hasta 1500. Los reactivos poliméricos de la invención se pueden preparar en cualquier número de rutas. Consecuentemente, los polímeros proporcionados en este documento no se limitan a la técnica o procedimiento específico usados en su preparación. Procedimientos ejemplares para la preparación de los reactivos de polímero presentemente descritos, sin embargo, se discutirán en detalle abajo. En un método para preparar un reactivo polimérico, el método comprende: (a) proporcionar una porción que contiene aromático que porta un primer sitio de unión, un segundo sitio de unión y un tercer sitio de unión opcional; (b) hacer reaccionar un reactivo de grupo funcional con el primer sitio de unión para resultar en el primer sitio de unión que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo y resulta en un enlace degradable, tal como un carbamato; y (c) hacer reaccionar un polímero soluble en agua que porta un grupo reactivo con el segundo sitio de unión y, cuando está presente, el tercer sitio de unión opcional resulta en (i) el segundo sitio de unión que porta un polímero soluble en agua a través de una porción espaciadora, en donde la porción espaciadora no incluye una (ii) el tercer sitio de unión opcional, cuando está presente, porta un segundo polímero soluble en agua a través de una porción espaciadora, en donde ° la porción espaciadora no incluye una porción 0 • En algunos ejemplos, (b) es la etapa realizada anteriormente (c) mientras en otros ejemplos, (c) es la etapa realizada anteriormente (b). Así, en este método para preparar un reactivo polimérico, una etapa requerida es (a) proporcionar una porción que contiene aromático que porta un primer sitio de unión, un segundo sitio de unión y un tercer sitio de unión opcional. En el contexto de una preparación sintética, se entenderá que "proporciona" un material significa obtener el material (por, por ejemplo, sintetización u obtención comercialmente). Una porción que contiene aromático ejemplar, para propósitos ilustrativos, es 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno, como se muestra abajo.

Esta porción que contiene aromático; 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno, es un ejemplo de una porción que contiene aromático que tiene tres sitios de unión: un grupo hidroxilo en la posición 9 y grupos amino en cada una de las posiciones 2 y 7. La porción que contiene aromático se puede proporcionar en una forma de básica o salina. Con respecto a 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno, es posible usar la forma diclorhidrato. Se ha proporcionado la porción que contiene aromático, otra etapa en el método que ampliamente incluye la etapa de hacer reaccionar un polímero soluble en agua que porta un grupo reactivo con los sitios de unión en la porción qué contiene aromático. Aquí, se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para unión de un polímero soluble en agua a uno o más sitios de unión en la porción que contiene aromático y el método no se limita al procedimiento específico. Por ejemplo, un PEG de amina reactiva (tal como mPEG éster N-succinimidilo terminado, formado, por ejemplo, a partir de la reacción de N-hidroxisuccinimida y CH30-CH2CH2-(OCH2CH2)-OCH2CH2-OCH2COOH con carbodiimida de diciclohexilo (DCC) o carbodiimida de diisopropilo (DIC) como agente de condensación y opcionalmente en la presencia de una base) puede reaccionar con una amina que porta que porta una porción que contiene aromático tal como 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno. En algunos ejemplos, la reacción del polímero soluble en agua que porta un grupo reactivo con la porción que contiene aromático, resultará en todos los sitios de unión posibles que tienen polímero soluble en agua unido a este. En tales circunstancias es necesario remover al menos un polímero soluble en agua para un sitio de unión se hace disponible para reacción con un reactivo del grupo funcional. Así, por ejemplo, la reacción de mPEG éster N-succinimidilo terminado discutido en el párrafo previo con 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno resulta en una mezcla que comprende (a) una especie que porta dos polímeros solubles en agua, uno en cada uno de los dos sitios amina, y (b) especies que portan tres polímeros solubles en agua, uno en cada uno de los dos sitios amina, y uno del sitio hidroxilo. Aquí, es posible remover y colectar especies de mayor peso molecular usando cromatografía de exclusión por tamaño. Además es posible tratar la mezcla a pH mayor [tratar, por ejemplo, la mezcla por hidróxido de litio (LiOH), hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH)], seguido por cromatografía de intercambio iónico (lEC). En tal caso, el resultado es una composición que contiene principalmente 9-hidroxi-2,7-diaminofluoreno que porta dos polímeros solubles en agua, uno en cada uno de los sitios de las dos aminas. Un tercer sitio de hidroxilo es así disponible para reacción con un reactivo de grupo funcional. La etapa final se hace reaccionar con un sitio reactivo de la porción que contiene aromático con un reactivo del grupo funcional. Un procedimiento preferido es para hacer reaccionar el 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno qué contiene hidroxilo que porta dos polímeros solubles en agua, uno en cada uno de los dos sitios amina con trifósgeno seguido por tratamiento con N-hidroxisuccinimida. En esta ruta, un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato (en este caso, un "carbonato activado") se forma en el sitio reactivo que contiene hidroxilo.

Las etapas del método toman lugar en un solvente apropiado. Uno de experiencia ordinaria en la técnica puede determinar sí cualquier solvente específico es apropiado para cualquier reacción proporcionada. Típicamente, sin embargo, el solvente es preferiblemente un solvente no polar o un solvente aprótico polar. Ejemplos no limitantes de solventes no polares incluyen benceno, xileno, dioxano, tetrahidrofurano (THF), alcohol t-butílico y tolueno. Particularmente solventes no polares preferidos incluyen tolueno, xileno, dioxano, tetrahidrofurano y alcohol t-butílico. Solventes apróticos polares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, DMSO (sulfóxido de dimetilo), HMPA (hexametilfosforamida), DMF (dimetilformamida), DMA (dimetilacetamida), NMP (N-metilpirrolidina). Un procedimiento alternativo inicia con fluoren diamina, un material de partida ya disponible. Un esquema de la reacción (que muestra las etapas sintéticas suficientes para proporcionar un conjugado) se muestra abajo. e = DSC, Fármaco-NH2 En este procedimiento, PEG carboxil metilo terminado ("PEG- CM" disponible de Nektar Therapeutics) se puede hacer reaccionar con fluoren diamina para proporcionar un intermediario que puede subsecuentemente ser usado para formar un conjugado con un agente activo ("Fármaco-NH2"). El fluoren diamina tiene dos grupos amino unidos a los núcleos aromáticos y ya que tiene un efecto suave (en relación a los hidrógenos de estos grupos reemplazados) en la acidez (es decir, valor pKa) del átomo de hidrógeno ionizable (es decir, Ha). Así, la proporción de liberación del fármaco es moderado hacia abajo. También, en otro procedimiento en base a un reactivo de amina tal como el éster del ácido propiónico mPEG comercialmente disponible, "mPEG-SPA", la síntesis es ligeramente diferente pero el resultado puro en la proporción de liberación del fármaco es mínimo. Un esquema de reacción de este procedimiento (que muestra las etapas sintéticas suficientes para proporcionar un conjugado) se muestra abajo.

La diferencia en proporción de liberación del fármaco es mínimo debido a los sustituyentes del anillo aromático que resulta de la reacción con mPEG-CM y mPEG-SPA son similares. Uno puede modificar el método sintético significantemente aumentando el grupo amina por reacción con un anhídrido succínico o anhídrido glutámico como reactivo para proporcionar un ácido carboxílico Terminal. Un esquema de reacción (que muestra las etapas sintéticas suficientes para proporcionar un conjugado) de este procedimiento se muestra abajo.

En este procedimiento, el resultado permite el uso de una amina PEG como el reactivo de PEGilación como opuesto a un ácido carboxílico PEG o éster activo. Así, es posible lograr aún otro método para síntesis del reactivo, pero el resultado puro en la proporción de liberación del fármaco no es sustancialmente cambiado, como el sustituyente de anillo aromático restante en un grupo amido. Un cambio significante en la proporción de liberación del fármaco se hace para originar uno o más del anillo aromático de los tres reactivos anteriores, en alguna etapa en la síntesis, es aumentada por sustitución adicional. Por ejemplo, uno puede iniciar la sustitución de anillo con, por ejemplo, un grupo de ácido sulfónico o un grupo nitro. Cualquiera de estos grupos, son electrón atrayente fuertemente, pueden tener un efecto significante en la acidez (valor pKa) del átomo de hidrógeno ionizable (Ha). Se ilustra abajo otro ejemplo para demostrar la capacidad para influenciar la proporción de liberación del fármaco en el conjugado reactivo-fármaco final.

Aquí, el derivado de fluoreno de partida contiene un grupo de ácido carboxílico. Este material crudo ya disponible puede ser sometido a condiciones de reacción que permite la introducción de un grupo amino en el anillo aromático remoto. Entonces, usando química similar para que en el ejemplo anterior, sea posible proporcionar un reactivo que tiene un grupo amido en un anillo aromático y un grupo carboxamida en el otro anillo. Esta combinación de sustituyentes de anillo es un electrón atrayente puro comparado a aquellos ejemplos anteriores que tienen dos grupos amido y ya que el efecto en la acidez (valor pKa) del átomo de hidrógeno ionizable (Ha) en tal forma que la proporción de liberación del fármaco se mejora. Un mejoramiento más significante para la proporción de liberación del fármaco se puede lograr usando un tipo diferente de enlace de amina. Es posible preparar sulfonamidas usando las etapas de reacciones ilustradas abajo (que muestran las etapas sintéticas suficientes para proporcionar un conjugado). d = desprotección del grupo hidroxilo; e = DCS, Fármaco- NH2 Los grupos sulfonilo unidos a cada anillo, son grupos muy electronegativos, efecto de la acidez (valor pKa) del átomo de hidrógeno ionizable (HQ). Ya que, las proporciones de liberación del fármaco de estos conjugados será relativamente rápido. En otro ejemplo, se ilustra un conjugado del fármaco con una proporción de liberación del intermediario (que muestra las etapas sintéticas suficientes para proporcionar un conjugado).

En este caso, usando el material crudo de isocianato comercialmente disponible, un grupo ureido y grupo sulfonamido se une al núcleo aromático. El grupo ureido, similar al grupo amido anterior, tiene un efecto suave pero el grupo sulfonamido tiene un efecto fuerte. El resultado puro es que los conjugados preparados de este reactivo tendrán una proporción de liberación entre el bis sulfonamido justo discutido y los otros conjugados discutidos antes. Una ventaja que algunas rutas sintéticas tienen sobre otros es el uso opcional de cromatografía de intercambio iónico para purificar el reactivo en una etapa intermedia. Debido a que puede haber varias impurezas formadas a lo largo de la ruta, esto puede ser una ventaja muy significante para un método. Un ejemplo se muestra debajo de la inserción vía reacción química de un grupo de ácido sulfónico de electrón atrayente en una etapa intermedia en la preparación del diamonofluoreno modificado por anhídrido glutámico, a partir de una síntesis ilustrada anteriormente "m-PEG" y "PEG-m" representa metoxi poli(etilen glicol). c = desprotección del grupo hidroxilo En este caso, es posible bloquear el grupo hidroxilo para prevenir la formación del éster de sulfato y entonces llevar a cabo un proceso de sulfonación de aromático electrofílico usando ácido clorosulfónico. Puede resultar una mezcla de productos mono- y disulfonación. Esta mezcla, si se forma, puede ser fácilmente purificada para proporcionar cualquier forma en un estado bastante puro. También, ya que la síntesis no tiene una etapa de cromatografía opcional ya colocada, esto proporciona una oportunidad para remover impurezas neutrales que se pueden llevar a cabo a lo largo de las primeras etapas. Se muestra un ejemplo para usar un grupo sulfonilo, tanto para mejorar la acidez del hidrógeno alfa tanto como un sitio de adición de la cadena de polímero en el esquema de reacción abajo. En este caso, la porción de aromático contiene un anillo de piridina único en el alcohol comercialmente disponible, el cual sirve como el punto de partida para elaborar el reactivo polimérico. La presencia del nitrógeno en el anillo aromático hace este anillo más electrón atrayente, comparado a un anillo de fenilo, y así la acidez del hidrógeno alfa se incrementa. Sin embargo, la acidez del hidrógeno alfa puede ser además incrementada para hacerla relativamente más removible. La unión de un grupo sulfonilo incrementa la acidez del hidrógeno. Las etapas requeridas para agregar el grupo sulfonilo se proporcionan en los esquemas de reacción abajo [en donde diBTC es di(1 -benzotriazolil)carbonato y BTC es un radical benzotriazolilo]. a = c IS03H , entonces, hidrólisis, purificación por cromatografía de intercambio iónico, b = cloruro de tionilo, entonces mPEG- N Hz (2ukD), entonces remover las impurezas iónicas usando cromatografía de intercambio iónico, c = diBTC Los procedimientos mostradas anteriormente, muestran la adición de un grupo que altera el electrón (en una porción anillado único y para un reactivo polimérico que contiene un polímero soluble en agua único. Mientras dos polímeros solubles en agua se prefieren en algunas modalidades, otras modalidades preferirán la incorporación de un polímero soluble en agua único (por ejemplo, cuando el tamaño total del reactivo polimérico se desea para ser relativamente pequeño). Otros grupos que alteran el electrón se pueden agregar en una forma similar. Por ejemplo, nitración aromática combinando ácido nítrico en la presencia de ácido sulfúrico, resulta en un grupo nitro (es decir, -N02) se une al sistema aromático. Además, los métodos de hidrogenación tal como combinar el sistema aromático con un halógeno en la presencia de un catalizador de metal (tal como hierro) resulta en un grupo halo que se une al sistema aromático. Con respecto a métodos de halogenación en donde un ion de metal está presente, se prefiere (por razones explicadas en este documento) para primero llevar a cabo la etapa de agregar el grupo halo al sistema aromático y subsecuentemente remover cualquiera de los iones de metal y entonces unir uno o más polímeros solubles en agua al sistema aromático. Además, los métodos de alquilación y acilación tal como una reacción de Friedel-Crafts se puede usar para agregar un grupo alquilo o acilo que altera el electrón (respectivamente) para el sistema aromático, agregando un haluro de alquilo (por ejemplo, cloruro de isobutilo) o haluro de acilo (por ejemplo, cloruro de propionilo) para el sistema aromático en la presencia de un catalizador de metal (tal como aluminio). Nuevamente, porque un catalizador de metal es típicamente requerido para llevar a cabo tales reacciones, se prefiere para primero llevar a cabo la etapa de agregar el grupo alquilo al sistema aromático y subsecuentemente remover cualquiera de los iones de metal y después unir uno o más polímeros solubles en agua al sistema aromático. Durante la preparación y manipulación de los reactivos poliméricos (así como la preparación y manipulación de los conjugados correspondientes), se prefiere para prevenir la introducción de iones de metal. Por ejemplo, debido a que los iones de metal son bien conocidos por ser coordinados por PEGs, se prefiere le evitación de iones de metal. Además, se conocen iones de metal para catalizar la oxidación de cadena PEG. En particular, cuando PEG se une a un sistema aromático rico en electrón, la presencia de un ion de metal coordinado a la cadena PEG puede proporcionar una ruta para transferencia de electrón a partir de núcleos aromáticos al complejo PEG-ión de metal y facilita el desdoblamiento de la cadena PEG. Así, la invención incluye métodos y composiciones, en donde los iones de metal son sustancialmente ausentes. Se pueden usar estos y otros procedimientos para preparar los reactivos poliméricos descritos en este documento. Una vez preparados, los reactivos poliméricos se puede aislar. Se pueden usar métodos conocidos para aislar reactivos poliméricos, pero es particularmente preferido usar cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño. Alternativamente o además, el método incluye la etapa de purificar el reactivo polimérico una vez que se ha formado. Nuevamente, se pueden usar métodos de purificación conocidos en la técnica estándar para purificar el reactivo polimérico. Los reactivos poliméricos de la invención son sensibles a la humedad y oxígeno, y son idealmente almacenados bajo una atmósfera inerte, tal como bajo argón o bajo nitrógeno, y a baja temperatura. En esta ruta, procesos potencialmente degradativos asociados con, por ejemplo, oxígeno atmosférico, se reducen o evitan completamente. En algunos casos, para evitar la degradación oxidativa, se pueden agregar antioxidantes, tal como hidroxil tolueno butilado (BHT) al reactivo polimérico antes del almacenaje. Además, se prefiere minimizar la cantidad de humedad asociada con las condiciones de almacenaje para reducir reacciones potencialmente perjudiciales asociadas con agua, por ejemplo, hidrólisis del éster activo. Sin embargo, se prefiere mantener las condiciones oscuras de almacenaje para prevenir ciertos procesos degradantes que involucran luz. Así, condiciones de almacenaje incluye uno o más de los siguientes: almacenaje bajo argón seco u otro gas inerte seco; almacenaje a temperaturas debajo de aproximadamente -15°C; almacenaje en la ausencia de luz; y almacenaje con una cantidad adecuada (por ejemplo, aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 partes por millón) de un antioxidante tal como BHT. Los reactivos poliméricos descritos anteriormente son útiles para conjugarse a agentes biológicamente activos. Por ejemplo, un grupo amino (por ejemplo, amina primaria) en un agente activo reaccionará con el grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable, tal como un enlace de carbamato. Así, la invención comprende un conjugado formado con cualquier reactivos polimérico descrito en este documento. Conjugados ejemplares incluyen aquellos de la siguiente fórmula: (Fórmula l-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; ^^C? es una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. Conjugados que corresponden a esta Fórmula l-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula I. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula l-C no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula l-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: (Fórmula la-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, ^^ , Y1, Y2, y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula l-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula la-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula la. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula l-C tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula l-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: NH-D (Fórmula Ic-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, C5: n.. Y1, Y2, D, y Re1 es como previamente se define con respecto a la Fórmula l-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Ic-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula le. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula l-C tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula l-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: (Fórmula Ib-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, <^ , Y1, Y2, D, Re1 y Re2 es como previamente se define con respecto a la Fórmula l-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Ib-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Ib. En algunos casos, el conjugado puede incluir porciones aromáticas individuales que son únicamente enlazadas entre sí a través de un átomo de carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable. Tal conjugado tiene la siguiente fórmula: en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. Conjugados que corresponden a esta Fórmula I l-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula II. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula ll-C no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula ll-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: órmu,a ,|a.C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula ll-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula lla-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Ha. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula II tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula II], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: llc-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ar1, Ar2, Ha, R1, R2, Re1, Y1 , Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula ll-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula llc-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula lie. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula ll-C tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula ll-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ar1, Ar2, Ha, R1, R2, Y1, Y2, D, Re1 y Re2 es como previamente se define con respecto a la Fórmula ll-C.

Conjugados que corresponden a esta Fórmula llb-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula llb. En aún otros casos, el conjugado puede incluir porciones aromáticas individuales que se enlazan entre sí tanto a través de un átomo de carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable así como a otro enlace directo. Tal conjugado tiene la siguiente fórmula: (Fórmula lll-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; H es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. Conjugados que corresponden a esta Fórmula lll-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula lll. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula lll-C no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula lll-C], resulta un conjugado de la siguiente fórmula: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula lll-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula llla-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Illa. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula lll-C tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula lll-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ar1, Ar2, Re1, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula lll-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula lllc-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula lile. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula lll-C tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula lll-C], resulta un conjugado de la siguiente fórmula: en donde cada uno de POLI1 , POLI2, X1 , X2, R1 , R2, Ar1 , Ar2, Re1 , Re2, Y1 , Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula lll-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Illb-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula lllb. En aún otros casos, el conjugado puede incluir porciones aromáticas individuales que se enlazan entre sí tanto a través de un átomo de carbono que porta un átomo de hidrógeno ionizable así como una porción espaciadora de uno o más átomos. Tal conjugado tiene la siguiente fórmula: |R?l (Fórmula IV-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; X3 es una tercera porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo. Conjugados que corresponden a esta Fórmula IV-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula IV. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula IV-C no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula IV-C], resulta un conjugado de la siguiente fórmula: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, X3, R1, R2, Ar1, Ar2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula IV-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula IVa-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula IVa. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula IV-C tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula IV-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: D (Fórmula IVc-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, X3, R1, R2, Ar1, Ar2, Re1, Y1 , Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula IV-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula IVc-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula IVc. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula IV-C tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula IV-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: (Fórmula IVb-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, X3, Ar1, Ar2, Ha, R1, R2, Re1 , Re2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula IV-C.

Conjugados que corresponden a esta Fórmula IVb-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula IVb. Un conjugado preferido comprende la siguiente estructura: en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera el electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera el electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo que porta un grupo funcional amina. Conjugados que corresponden a esta Fórmula V-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula V. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula V-C no tiene grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son cero, con respecto a la Fórmula V-C], resulta un conjugado de la siguiente fórmula: órmula Va-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ha, R\ R2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Va-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Va. Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula V-C tiene un grupo que altera el electrón discreto [por ejemplo, cuando (a) es uno y (b) es cero, con respecto a la Fórmula V-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, Ha, R1, R2, Re1, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vc-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Vc. 5 Cuando el conjugado que corresponde a la Fórmula V-C tiene dos grupos que alteran el electrón discreto [es decir, cuando (a) y (b) ambos son uno, con respecto a la Fórmula V-C], un conjugado de la siguiente fórmula resulta: en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, H0, Re1, Re2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vb-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Vb. Aún otro conjugado preferido es de la siguiente estructura: (Fórmula V -C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2, (a), (b), Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C, con la condición que Re es H cuando (a) es cero y Re2 es H cuando (b) es cero. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vd-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Vd. Aún otro conjugado preferido es de la siguiente estructura: Ve-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C, con la condición que Re1 es H cuando (a) es cero y Re2 es H cuando (b) es cero. Conjugados que corresponden á esta Fórmula Ve-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Ve. Aún otro conjugado preferido es de la siguiente estructura: (Fórmula Vf-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C, con la condición que Re1 es H cuando (a) es cero y Re2 es H cuando (b) es cero. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vf-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Vf. Aún otro conjugado preferido es de la siguiente estructura: Fórmula Vg-C) en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1 , X2, R1, R2, Ha, Re1, Re2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula V-C, con la condición que Re es H cuando (a) es cero y Re2 es H cuando (b) es cero. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vg-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Vg. Otro conjugado ejemplar de la invención tiene la siguiente formula: Fórmula Vl-C) en donde: POLI es un polímero soluble en agua; H. es una porción aromática; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; Re es un grupo que altera el electrón; (a) es cualquiera de cero o uno; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo que porta un grupo funcional amina. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vl-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula VI. Otro conjugado ejemplar comprende la siguiente estructura: R1 ? I n POLI X C — Y1 -C -NH-D Ha (Fórmula Vla-C) en donde cada uno de POLI, X, R1, R2, Y1, Y2 y D es como previamente se define con respecto a la Fórmula VI. Conjugados que corresponden a esta Fórmula Vla-C se pueden preparar usando reactivos poliméricos que corresponden a la Fórmula Via. Ejemplos de la invención incluyen: Cr CHt(Q'Cr CHxV° CHj CH30.( CHJC H?O CHJCH *; CHjCH2-(0CH?C H2)1- OCH3 C H30-(C HsCHjO),. C CH30-(CH;CH;0n-CH CH H S.H >:H O. •: H ••:H CH ••: H CH 0-(CH CH 0)-CH CH CH<OCH CH)-OCH CH30-(CH;CH;Oi1-CH ,H 0 en donde cada (n) es de 4 a 1500. El agente biológicamente activo al cual el reactivo polimérico como se describe en este documento, puede ser conjugado, es un agente biológicamente activo que contiene amina. En algunas modalidades, el agente biológicamente activo será una molécula pequeña (por ejemplo, un agente biológicamente activo que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 3,500 Daltons. En otras modalidades, el agente biológicamente activo será una macromolécula, tal como un polipéptido, que tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 3,500 Daltons. Los polipéptidos farmacológicamente activos representan un tipo preferido de agente biológicamente activo. Se debe entender que para propósitos de la presente discusión, el término "polipéptido", será genérico para oligopéptidos y proteínas. Con respecto a polipéptidos, la amina a la cual el reactivo polimérico se acopla, puede estar en el N-término o una cadena lateral que contiene amina de un aminoácido (tal como lisina) dentro del polipéptido. La invención también proporciona un método para preparar un conjugado, que comprende la etapa de contactar un reactivo polimérico de la invención con un agente biológicamente activo bajo condiciones adecuadas para formar una unión covalente entre el polímero y el agente biológicamente activo. Típicamente, el polímero es agregado al agente activo o superficie a una cantidad equimolar (con respecto al número deseado de grupos adecuados para reacción con el grupo reactivo) a un exceso molar. Por ejemplo, el reactivo polimérico puede ser agregado al agente activo objetivo a una relación molar de aproximadamente 1 :1 (reactivo polimérico:agente activo), 1.5:1 , 2:1 , 3:1 , 4:1 , 5:1 , 6:1 , 8:1 , ó 10:1. La reacción de conjugación se deja proceder hasta que no ocurre sustancialmente conjugación adicional, lo cual puede en general, ser determinado monitoreando el proceso de la reacción con el tiempo. El progreso de la reacción puede ser monitoreado por alícuotas de extracción a partir de la mezcla de reacción a varios puntos de tiempo y analizando la mezcla de reacción por SDS-PAGE o espectrometría de masas por MALDI-TOF, o cualquier otro método analítico adecuado. Una vez que se alcanza un periodo de estancamiento con respecto a la cantidad de conjugado formado o la cantidad de polímero no conjugado que permanece, la reacción se asume por estar completa. Típicamente, la reacción de conjugación toma desde algunos minutos hasta varias horas (por ejemplo, desde 5 minutos hasta 24 horas o más). La mezcla de producto resultante es preferiblemente, pero no necesariamente purificada, para separar los reactivos de exceso, reactivos no conjugados (por ejemplo, agente activo), especies multiconjugadas indeseadas, y polímero libre o sin reaccionar. Los conjugados resultantes pueden entonces ser caracterizados además usando métodos analíticos tales como MALDI, electroforesis capilar, electroforesis en gel y/o cromatografía. Con respecto a los conjugados de agentes activos de polímero, los conjugados pueden ser purificados para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. Alternativamente, y más preferiblemente para polímeros de peso molecular inferior (por ejemplo, menos de aproximadamente 20 kiloDaltons, más preferiblemente menos de aproximadamente 10 kiloDaltons, la mezcla de producto puede ser purificada para obtener la distribución de segmentos de polímeros solubles en agua por agente activo. Por ejemplo, la mezcla de producto puede ser purificada para obtener un promedio de cualquiera de uno a cinco PEG por agente activo (por ejemplo, polipéptido). La estrategia para purificación de la mezcla de reacción de conjugado final, dependerá de un numero de factores, que incluyen por ejemplo, el peso molecular del polímero empleado, el agente particular activo, el régimen de dosificación deseado y la actividad residual y propiedades in vivo de los conjugados individuales. Si se desea, los conjugados que tienen diferentes pesos moleculares pueden ser aislados usando cromatografía de filtración en gel. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se usa para fraccionar relaciones de polímero a agente activo diferentemente numeradas (por ejemplo, 1 -mer, 2-mer, 3-mer- y así sucesivamente, en donde "1 -mer" indica 1 polímero a agente activo, "2-mer" indica dos polímeros a agente activo, y así sucesivamente) en base a sus diferentes pesos moleculares (en donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de los segmentos de polímeros solubles en agua). Por ejemplo, en una reacción ejemplar en donde una proteína de 100 kDa es aleatoriamente conjugada a un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, la mezcla de reacción resultante preferiblemente, contendrá proteína no modificada (PM 100 kDa), proteína mono-PEGilada (PM 120 kDa), proteína di-PEGilada (PM 140 kDa) y así sucesivamente. Mientras este procedimiento puede ser usado para separar PEG y otros conjugados poliméricos que tienen diferentes pesos moleculares, este procedimiento es en general, inefectivo para separar isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de unión de polímero dentro de la proteína. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel, puede ser usada para separar a partir de otras mezclas de 1 -mer, 2-mer, 3-mer-y así sucesivamente de PEG, aunque cada una de las composiciones PEG-mer recuperadas puede contener PEG unido a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro del agente activo. Las columnas de filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La selección de una columna particular, dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución es en general, llevada a cabo usando un amortiguador adecuado, tal como fosfato, acetato o similar. Las fracciones colectadas pueden ser analizadas por un número de métodos diferentes, por ejemplo, (i) densidad óptica (OD) a 280 nm por contenido de proteína, (ii) análisis de proteína de albúmina de suero bovino (BSA), (iii) pruebas de yodo para contenido de PEG [Sims et a/.(1980) Anal. Biochem, 107:60-63], y (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS PAGE), seguido por teñido con yoduro de bario.

La separación de isómeros posicionales se llevó a cabo por cromatografía de fase inversa, usando una columna C18 de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-CLAR) (Amersham Biosciences o Vydac) o por cromatografía de intercambio iónico usando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible de Amersham Biosciences. Cualquier procedimiento puede ser usado para separar isómeros de agente activo de polímero separado que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales). Después de la conjugación y etapas de separación opcionalmente adicionales, la mezcla de conjugado puede ser concentrada, filtrada estéril y almacenada a una baja temperatura, típicamente desde aproximadamente -20°C hasta aproximadamente -80°C. Alternativamente, el conjugado puede ser liofilizado, ya sea con o sin amortiguador residual y almacenado como un polvo liofilizado. En algunos casos, es preferible intercambiar un amortiguador usado para conjugación, tal como acetato de sodio, por un amortiguador volátil, tal como carbonato de amonio o acetato de amonio, que puede ser fácilmente removido durante la liofilización, de manera que el polvo liofilizado es amortiguador residual ausente. Alternativamente, puede ser usada una etapa de intercambio de amortiguador empleando una formulación amortiguadora, de manera que el conjugado liofilizado está en una forma adecuada para reconstitución en un amortiguador de formulación y finalmente, para administración a un mamífero.

Un agente biológicamente activo para uso en el acoplamiento a un polímero como se presenta en este documento, puede ser cualquiera o más de los siguientes. Agentes adecuados pueden ser seleccionados de, por ejemplo, hipnóticos y sedativos, energizantes psíquicos, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anticonvulsionantes, relajantes musculares, agentes antiparkinson (antagonistas de dopamina), analgésicos, anti-inflamatorios, fármacos antiansiedad (anxiolíticos), supresores del apetito, agentes antimigraña, contractantes musculares, anti-infectivos (antibióticos, antivirales, antifúngicos, vacunas), antiartríticos, antimalaria.es, antimiméticos, anepilépticos, broncodilatadores, citocinas, factores de crecimiento, agentes anti-cancerígenos, agentes antitrombóticos, antihipertensivos, fármacos cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxicantes, agentes anti-asma, agentes hormonales que incluyen, anticonceptivos, simpatomiméticos, diuréticos, agentes que regulan los lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasíticos, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglicémicos, agentes nutricionales y suplementos, suplementos de crecimiento, agentes antienteritis, vacunas, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes de contraste. Más particularmente, el agente activo puede caer en uno de un número de clases estructurales, que incluyen pero no se limitan a moléculas pequeñas (preferiblemente, moléculas pequeñas insolubles), péptidos, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, esteroides, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, grasas, electrolitos y similares.

Preferiblemente, un agente activo para acoplamiento a un polímero como se describe en este documento posee un grupo amino nativos, o alternativamente, es modificado para contener al menos, un grupo amino reactivo adecuado para conjugación a un polímero descrito en este documento. La presente invención también incluye preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se proporciona en este documento, en combinación con un excipiente farmacéutico. En general, el conjugado mismo estará en una forma sólida (por ejemplo, un precipitado), el cual puede ser combinado con un excipiente farmacéutico adecuado que puede estar en ya sea forma sólida o líquida. Excipientes ejemplares incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consiste de carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensoactivos, amortiguadores, ácidos, bases y combinaciones de los mismos. Un carbohidrato tal como un azúcar, un azúcar derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado, y/o un polímero de azúcar, pueden estar presentes como un excipiente. Los excipientes de carbohidratos específicos incluyen por ejemplo: monosacáridos, tales como fructuosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares. El excipiente puede también incluir una sal inorgánica o amortiguador tal como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico y combinaciones de los mismos. La preparación puede también incluir un agente antimicrobiano para prevenir o disuadir el crecimiento microbiano. Ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol y combinaciones de los mismos. Un antioxidante puede estar presente en la preparación también. Son usados antioxidantes para prevenir la oxidación, con ello, previniendo el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso. monotioglicerol, propilgalato, bisulfito de sodio, sulfoxilato formaldehído sódico, metabisulfito de sodio, y combinaciones de los mismos. Un tensoactivo puede estar presente como un excipiente. Tensoactivos ejemplares incluyen: polisorbato, tal como "Tween 20" y "Tween 80", y pluronics tales como F68 y F88 (ambos los cuales están disponibles de BASF, Mount Olive, New Jersey); esteres de sorbitán; lípidos, tales como fosfolípidos, tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma liposomal), ácidos grasos y esteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agente quelantes, tales como EDTA, zinc y otros de tales catiónicos adecuados. Los ácidos o bases pueden estar presentes como un excipiente en la preparación. Ejemplos no limitantes de ácidos que pueden ser usados incluyen aquellos ácidos seleccionados del grupo que consiste de ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ác¡dó~fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, y combinaciones de los mismos. Ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste de hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumarato de potasio, y combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas abarcan todos los tipos de formulaciones y en particular, aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos que pueden ser reconstituidos, así como también suspensiones y soluciones. La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero descrito en este documento), en la composición, variará dependiendo de un número de factores, pero óptimamente será una dosis terapéuticamente efectiva cuando la composición es almacenada en un recipiente de dosis única (por ejemplo, un vial).

Además, la preparación farmacéutica puede ser alojada en una jeringa. Una dosis terapéuticamente efectiva puede ser determinada experimentalmente por administración repetida de cantidades incrementadas del conjugado, para determinar cual cantidad produce un punto final clínicamente deseado. La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición, variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual es determinada a través de la experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que contienen cantidades variantes del excipiente (que varían desde baja a alta), examinando la estabilidad y otros parámetros, y después, determinando el intervalo en el cual el desempeño óptimo se logra sin efectos adversos significantes. En general, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 99$ en peso, preferiblemente desde aproximadamente 5%- 98% en peso, más preferiblemente, desde aproximadamente 15-95% en peso del excipiente, con concentraciones de menos de 30% en peso más preferido. Estos excipientes farmacéuticos mencionados anteriormente, junto con otros excipientes, son descritos en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), and Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.

Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención, son típicamente, aunque no necesariamente, administradas vía inyección y son por lo tanto, en general, soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica también puede tomar otras formas tales como jarabes, cremas, ungüentos, tabletas, polvos y similares. Otros modos de administración también están incluidos, tales como, pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosal, oral, intratecal, subcutánea, intaarterial y así sucesivamente. Como se describe previamente, los conjugados pueden ser administrados parenteralmente por inyección intravenosa, o menos preferiblemente por inyección intramuscular o subcutánea. Los tipos de formulación adecuadas para administración parental incluyen, soluciones listas para inyección, polvos secos para recombinación con un solvente antes del uso, suspensiones listas para inyección, composiciones insolubles secas para combinación con un vehículo antes del uso, y emulsiones y concentrados líquidos para dilución antes de la administración, entre otros. La invención también proporciona un método para administración de un conjugado como se proporciona en este documento, a un paciente que sufre de una condición que es sensible a tratamiento con conjugado. El método comprende administras en general, vía inyección, una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado (preferiblemente, proporcionado como parte de una preparación farmacéutica). El método de administración puede ser usado para tratar cualquier condición que puede ser remediada o prevenida por administración del conjugado particular. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, apreciarán cuales condiciones pueden efectivamente tratar un conjugado específico. La dosis actual a ser administrada, variará dependiendo de la edad, peso, y condición general del sujeto, así como también, la severidad a ser tratada, el juicio del profesional al cuidado de la salud y conjugado a ser administrado. Las cantidades terapéuticamente efectivas son conocidas por aquellos expertos en la técnica y/o se describe en los textos y literatura de referencia pertinente. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva variará desde aproximadamente 0.001 mg hasta 100 mg, preferiblemente, en dosis desde 0.01 mg/día hasta 75 mg/día, más preferiblemente, en dosis desde OJO mg/día hasta 50 mg/día. La dosificación unitaria de cualquier conjugado dado (nuevamente, preferiblemente proporcionado como parte de una preparación farmacéutica), puede ser administrada en una variedad de programas de dosificación dependiente del juicio del especialista, necesidades del paciente y así sucesivamente. El programa de dosificación específico será conocido por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, o puede ser determinado experimentalmente usando métodos de rutina. Los programas de dosificación ejemplares incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces mensualmente, una vez mensualmente y cualquier combinación de los mismos. Una vez que el punto final del especialista ha sido logrado, la dosificación de la composición se interrumpe. Se entiende que mientras la invención ha sido descrita en conjunto con las modalidades específicas de la misma, tal descripción mencionada anteriormente así como también la experimental que sigue, están propuestas para ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención.

Experimental La práctica de la invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de síntesis orgánica, y similares, las cuales son entendidas por uno de habilidad ordinaria en la técnica y son explicadas en la literatura. En los siguientes ejemplos, se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas y así sucesivamente), pero algún error experimental y desviación deben ser considerados. A menos que se indique de otro modo, la temperatura está en grados Celsius y la presión está en o cerca de la presión atmosférica a nivel del mar. Todos los reactivos son obtenidos comercialmente a menos que se indique de otro modo. Todas las RNM generadas se obtuvieron de un espectrómetro de RMN de 300 ó 400 MHz, manufacturado por Bruker (Billerica, MA). Todos los procesamientos se llevaron a cabo en recipientes de vidrio o revestidos de vidrio y se contactaron con recipientes que contienen metal o se evita el equipamiento. mPEG-CM CH30-(CH2CH2?)n-CH2CH2-0-CH2-C(0)-OH) anh. anhidro Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo HCl ácido clorhídrico HEPES 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazineetansulfónico RMN Resonancia Magnética Nuclear DCC 1 ,3-diciclohexilcárbodiimida DMF dimetilformamida DMSO dimetiisulfóxido PM peso molecular K o kDa kiloDaltons SEC Cromatografía de Exclusión de Tamaño CLAR Cromatografía Líquida de Alta Resolución SDS-PAGE Dodeciisulfato de sodio-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida MALDI-TOF Ionización de Desorpción Láser de Matriz Asistida de Tiempo de Vuelo TLC Cromatografía de capa delgada THF tetrahidrofurano Materiales Todos los reactivos poliméricos precursores referidos en estos ejemplos, son comercialmente disponibles a menos que se indique de otro modo. El péptido I similar al glucagón (7-36, "GLP-1"), usado en estos Ejemplos, se adquirió de American Peptide Company (Sunnyvale, CA).

EJEMPLO 1 Preparación"de"9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno- N-hidroxisuccinimida por PEGilación Reversible Esquema de Reacción 1 9-form?l-2,7-d?(Boc-am?no)f.uoreno 9-h.drox?met?l-2, 7-d?(Boc-am?no)f luoreno clorhidrato de 9-h?drox?met?l-2J 7-d?a ?nof luoreno C 2 K A. Preparación de 2,7-di(Boc-amino)fluoreno Bajo una atmósfera de argón, se disolvió 2,7-diaminofluoreno (2.45 g, 12.5 mmoles) en 1 ,4-dioxano (28 ml). Se agregaron sucesivamente, agua desionizada (14 ml), NaOH 2M (2.2 eq. 27.5 mmoles,' 13.8 ml) y di-terc-butildicarbonato (BOC20) (2.5 eq. 31.3 mmoles, 6.82 g). La reacción se agitó vigorosamente por 20 horas a temperatura ambiente. El producto precipitó como un sólido marrón. La reacción se apagó por la adición de agua y acidificación a pH con KHSO4 1 M. El producto se extrajo con cloroformo (3 x 400 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con 1/2 de salmuera saturada, se secaron sobre Na2S04 y evaporaron. El producto se purificó por cromatografía instantánea: gel de sílice 60Á eluido con 1 % de metanol en cloroformo. El sólido amarillo purificado (5J g, -99%) fue puro por CCD (teñido de ninhidrina). 1H RMN (CDCI3) d (ppm) 7.7 (bs, 2HH, NH uretano); 7.6 (d, 2H, Ar); 7.2 (d, 2H, Ar); 6.5 (s, 2H, Ar); 3.8 (s, 2H, CH2); 1.5 (s, 18H, Boc).

B. Preparación de 9-formil-2,7-di(Boc-amino)fluoreno 2,7-di(Boc-amino)fluoreno (5 g, 12.5 mmoles) purificado (preparado de la etapa A anterior), se disolvió en formiato de etilo (50 ml) y THF anhidro (60 ml) con calentamiento suave. (Nota: el formiato de etilo se almacenó sobre K2C03 para remover ácido fórmico). La solución se enfrió en un baño helado y se agregó hidruro de sodio al 60% en aceite mineral en forma de porciones (5.5 eq. 69 mmoles, 2.75 g). La reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente y después se calentó a 50°C después de ajustaría con un condensador a reflujo. Después de dos horas, la reacción se enfrió en un baño helado y se apagó por la adición lenta de agua desionizada (50 ml). La capa acuosa se ajustó a pH 5 con ácido glacial acético y se extrajo con acetato de etilo (2 x 400 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2S04, filtraron y evaporaron bajo presión reducida. El producto crudo (sólido marrón oscuro), se purificó por cromatografía instantánea: gradiente de elusión en forma de etapas de gel de sílice 60Á 1-5% metanol en cloroformo. Rendimiento (4.8 g, - 90%) de un sólido amarillo a marrón, dependiendo de la pureza. 1H RMN (de-DMSO); d (ppm) 11.0 (s, 09 H, enol); 9.3 (2s, 1.9H, NH uretano); 7.2-8.3 (m, Ar, C10H enol); 6.5 (2s, 0.1 H, NH uretano); 4.1 (m, 0.3H, CH); 1.5 (s, 18H, Boc).

C. Preparación de 9-hidroximetil-2,7-di(Boc-amino)fluoreno 9-formil-2,7-di(Boc-amino)fluoreno (0.47 g, 1.1 mmoles), se disolvió en metanol anhidro (MeOH) (5 ml) bajo una atmósfera de argón. Se agregó NaBH4 (1.2 eq., 1.3 mmoles, 0.05 g), y la reacción se agitó a temperatura ambiente por cinco horas. La reacción se diluyó con agua desionizada y se acidificó a pH 5 con ácido glacial acético. La reacción se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml) y las capas orgánicas se lavaron con NaHC03 saturado (4 x 20 ml) y salmuera (3 x 20 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre MgS04, filtraron y evaporaron. El producto crudo, sólido naranja, se purificó por cromatografía instantánea; gradiente de elución de gel del sílice 60Á 1 -5% de metanol en cloroformo (gradiente de elución alternativo con 15-20% de acetato de etilo en diclorometano, "DCM"). El producto fue un sólido amarillo (0.39, 83%). 1H RMN (CD3OD): d (ppm) 7.9 (s, 0.5 H, NH uretano); 7.7 (s, 2H, Ar); 7.6 (d, 2H, Ar); 7.4 (d, 2H, Ar); 4.0 (m, 1 H, CH); 3.9 (m, 2H, CH2); 1 .6 (s. 18H, Boc).

D. Preparación de diclorhidrato de 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno Se disolvió 9-hidroximetil-2,7-di(Boc-amino)fluoreno (0.39 g, 0.9 mmoles en 1 ,4-dioxano. A 0°C, se agregó HCl concentrado (2.5 ml) y la reacción se agitó por dos horas a 0°C y por una hora a temperatura ambiente. Los solventes de reacción se removieron a presión reducida (45°C). El producto se disolvió en metanol y evaporó (2 veces). El producto se disolvió en metanol (8~ml) y precipitó por la adición lenta de éter dietílico y enfriamiento (repetido). El producto fue un sólido rojo-naranja (0.25 g, 91 %), que mostró una mancha única por TLC (cloroformo/metanol/ácido acético 85:15:3, teñido de ninhidrina). 1H RMN (CD3OD); (ppm) 8.1 (d, 2H, Ar); 7.8 (s, 2H, Ar); 7.5 (d, 2H, Ar); 4.3 (t, 1 H, CH); 4.0 (d, 2H, CH2).

E. Preparación de 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno) mPEG-CM (20,000) (mPEG-CM que tiene PM = 19.458; 20g, 1.03 mmoles, 3.5 eq.) en tolueno anhidro (80 ml), fue azeotrópicamente destilado bajo presión reducida a 60°C en un evaporador rotatorio. Los sólidos fueron disueltos en diclorometano anhidro (40 ml) bajo una atmósfera de argón seguido por la adición de N-hidroxibenzotriazol (HOBt) anhidro (3.5 eq., 1.03 mmoles, 139 mg) y 1 ,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (3.7 eq., 1.09 mmoles, 224 mg). En un matraz separado, se disolvieron diclorhidrato de 9- hidroximetil-2,7-diaminofluoreno (1 eq., 0.294 mmoles, 88 mg) y 4-dimetilaminopiridina (2.2 eq., 0.65 mmoles, 79 mg) en DMF anhidro (2.5 ml). Después de agitar la reacción DCC por varios minutos (5-15 minutos), la solución DMF de 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno fue cuantitativamente transferida a la reacción de DCC. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 27 horas antes de que el solvente se evaporara a presión reducida. El jarabe espeso fue disuelto en alcohol isopropílico seco ("IPA", 400 ml, adición lenta), con calentamiento suave. El producto PEG precipitó en reposo a temperatura ambiente. Se agregó IPA adicional (100 ml) mientras se agita a 0°C por 30 minutos. Lo precipitado se filtró y lavó con IPA frío/éter dietílico 7:3 (80 ml) y éter dietílico. El producto crudo (polvo amarillo pálido, 9-(mPEG(20,000)metiléster)-metil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno, se secó bajo alto vacío (rendimiento 18.3 g). Bajo una atmósfera de argón, el producto crudo (18.3 g) se disolvió en agua desionizada y se ajustó a pH 12 + 0J con NaOH 1 M. La mezcla de reacción de hidrólisis se agitó a temperatura ambiente por tres horas. El pH se ajustó a 0.3 con ácido fosfórico al 10%. (La solución acuosa se filtró a través de una almohadilla de celite y se enjuagó con agua). Se disolvió NaCI (60 g) en la solución acuosa y después se extrajo con DCM (2 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, filtraron y evaporaron a presión reducida. El producto crudo se disolvió en agua desionizada y se desaló con resina de intercambio iónico. Se realizó cromatografía de intercambio iónico de la solución de PEG en sefarosa DEAE (0.9 I), eluyendo con agua. Las fracciones que contienen PEG fueron colectadas. El producto purificado (polvo amarillo pálido) fue ausente de mPEG-CM(20,000)(análisis de CLAR). Rendimiento 7.3 g, 64% (que representa la cantidad total de material PEG recuperado), sustitución de 75% o mejor (que representa el porcentaje de PEG de la cantidad recuperada, teniendo la funcionalidad deseada). 1H RMN (CD2CI2): d (ppm) 8.9 (s, 2H, NH amida); 7.9 (s, 2H, Ar); 7.7 (m, 4H, Ar); 4.1 (m, 5H, CH2C=0, CH); 4.0 (d, 2H, CH2); 3.6 (s, estructura PEG); 3.3 (s, 3H, -OCH3).

F. Preparación de 9-hidrox¡metil-2.7-di(mPEG(20,000)- metilamida)fluoreno-N-h¡drox¡succ¡nim¡da 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno (0.5 g, 0.013 mmoles) en acetonitrilo anhidro (10 ml), fue azeotrópicamente destilado bajo presión reducida a 50°C en un evaporador rotatorio. El sólido se disolvió en DCM anhidro (2 ml, "CH?Cb"), seguido por adición de trifósgeno. (Se tuvo cuidado para atrapar el exceso de gas de fosgeno de la reacción con trampa base) (1.4 eq., 0.018 mmoles, 5 mg). Después de varios minutos, se agregó piridina anhidra (2 eq., 0.026 mmoles, 2 µl de piridina en DCM [2 µl piridina/50 µl DCM]). A una y una y media horas, la mayoría del solvente de reacción y exceso de fosgeno (uso de trampa base en ventosa) se evaporó con calentamiento suave (40°C). El jarabe se disolvió en DCM anhidro (2 ml), seguido por adición de N-hidroxisuccinimida (5.3 eq., 0.068 mmoles, 8 mg, "NHS") y pipdina anhidra (3.2 eq., 0.041 mmoles, 83 µl de la solución anterior (2:50) en DCM). Después de cuatro horas, el solvente se evaporó bajo una corriente de argón. El jarabe se disolvió en IPA anhidro y se precipitó a temperatura ambiente. Lo precipitado se filtró y lavó con IPA frío y éter dietílico. Los solventes residuales se evaporaron bajo vacío para dar un polvo amarillo muy pálido. Rendimiento 0.4 g, 80%, sustitución carbonato de NHS al 73% por CLAR. 1H RMN (CD2CI2): d (ppm) 8.9 (s, 2H, NH amida); 7.9 (s, 2H, Ar); 7.7 (m, 4H, Ar); 4.7 (d, 2H, CH2); 4.3 (t, 1 H, CH); 4.1 (s, 4H, CH2C=0); 2.8 (s, 4H, CH2CH2 NHS. Usando este mismo procedimiento, los reactivos poliméricos que tienen otros pesos moleculares pueden ser preparados sustituyendo un reactivo polimérico mPEG-CM que tiene un peso molecular distinto de 20,000.

EJEMPLO 2 PEGilación de insulina con carbamato FMOC PEG 40K A. PEGilación El reactivo polimérico preparado en el Ejemplo 1 , 9-hidroxi-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno-N-hidroxisuccinimida, se almacenó a - 20°C y se calentó a temperatura ambiente en un desecador. Se pesó la insulina (8.9 mg) y se disolvió en 1 ml de DMSO. Se usó una relación molar de 3:1 (PEG:insulina). Se pesaron 184.6 mg de 9-hidroxi-2,7-di(mPEG(20,000)- metilamida)fluoreno-N-hidroxisuccinimida y se disolvió en 1 ml de acetonitrilo y después se agregó a la insulina. La reacción se agitó bajo nitrógeno por una hora, y después se apagó diluyéndola con 1 :5 con 20 mM de ácido acético, pH 3.0 para caer el pH de la mezcla de reacción a 3.1. El pH bajo estabiliza el conjugado degradable.

B. Purificación Se usó intercambio catiónico para purificar el conjugado PEG-insulina 1 mer, el cual es el conjugado que tiene PEGilación en un sitio de insulina, a partir del 2-mer, el cual es el conjugado que tiene PEGilación en dos sitios de insulina. Se usaron una columna SP650 de 20 ml y un Sistema Básico ÁKTA (Amersham Biosciences, Piscataway NJ), para purificar los conjugados PEG. El amortiguador de partida fue HAc/NAc 20 mM (ácido acético/acetato de sodio), pH 3.1 y el amortiguador de elución fue 20 mM de HAc/NaAc, 1 M de NaCI, pH 3.1. La velocidad de flujo fue 10 ml/min, y la muestra de carga fue 9 mg de contenido de insulina. El método de purificación se lista en el cuadro 1.

CUADRO 1 Método de Purificación para Conjugado de Insulina PEG Degradable C. Caracterización y cuantificación de conjugados purificados El análisis de CLAR de la mezcla de reacción se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra el análisis de CLAR del conjugado 1-mer PEGilado (o conjugado monoPEGilado). La pureza del conjugado 1-mer PEGilado es 98.1% con 1.9% de 2-mer.

D. Estudio de Degradación de Conjugado Purificado Se realizó un estudio de liberación in vitro en el conjugado purificado. La prueba se realizó en un Agilent 1100 con un automuestreador termoajustado (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). Se usó un método de CLAR para analizar la liberación de la proteína nativa y la reducción del conjugado. El conjugado 1 -mer (o conjugado monoPEGilado) se diluyó 10:1 en amortiguador PBS 10X (salina amortiguada de fosfato), pH 7.35. Se incubó a 37°C, y se removieron alícuotas por puntos de tiempo. El tiempo 0 se asumió por ser antes de la dilución con PBS, de manera que se usaron los resultados de CLAR del conjugado 1 -mer. Los puntos de tiempo fueron tomados a 5 horas, 15 horas y 28 horas, y después una vez al día por 8 días. Los resultados compilados se muestran en la Figura 3. El porcentaje relativo de cada componente en la muestra en cada punto de tiempo, fue trazado usando un software de análisis Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego CA). Los datos se ajustaron a una ecuación no lineal, y esta ecuación se usó para estimar la vida media de 4.5 días para el conjugado 1-mer en amortiguador.

EJEMPLO 3 Preparación de 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-amida amidoqlutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida (o "G2PEG2Fmoc20k- NHS") La síntesis de 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-amida amidoglutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida, es representada esquemáticamente en el Esquema de Reacción 2, abajo.

Esquema de Reacción 2 diclorhidrato de 9- drox¡p.et?l-2,7-d?am?nofluoreno 9-hidrox?metil-2,7-d?(ác?do a ?doglutárico)fluoreno iónico) 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-amida amidoglutárica)fluoreno j. CHjClj 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-amida amidoglutárica)fluoreno-N-h?droxisuccinimida "G2PE02n--oc-orNHS" A. , Preparación de 9-hidroximetil-2,7-di(ácido amidoglutárico)fluoreno Bajo una atmósfera de argón, se disolvió diclorhidrato de 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno (preparación descrita en las etapas A hasta D en el Ejemplo 1 ) en agua desionizada y se ajustó a pH 8 con NaHC03 saturado. La mezcla se diluyó a la mitad con salmuera y lo precipitado se extrajo con acetato de etilo. Las capas de acetato de etilo se secaron sobre Na2S0 , filtraron y evaporaron por 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno (polvo marrón, 84% de rendimiento aislado).

Se disolvió 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno (0.38 g, 1.7 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro ("THF", 10 ml) y se agregó anhídrido glutárico (97%, 2.2 'eq., 3.7 mmoles, 0.435 g). La reacción se agitó por 4.5 horas y se confirmó la ausencia de amina por TLC (teñido de ninhidrina, 90:10:3 acetato de etilo/metanol/ácido acético). La mezcla de reacción se diluyó con hexanos (10 ml), filtró y lavó con 1 :1 THF/hexanos, después hexanos. El producto crudo se disolvió en una cantidad mínima de metanol (1 ml) y THF (10 ml) y precipitó con la adición de hexanos (10 ml). La mezcla se enfrió (4°C), filtró y lavó con 1 :1 THF/hexanos, después hexanos. El rendimiento fue 0.59 g (77%) de polvo amarillo-naranja. 1H RMN (CD3OD): (ppm) 7.9 (s, 2H, Ar); 7.7 (d, 2H, Ar); 7.5 (dd, 2H, Ar); 4.0 (t, 1 H, CH); 3.9 (d, 2H, CH2); 2.5 (t, 4H, CH2); 2.4 (t, 4H, CH2); 2.0 (m, 4H, CH2).

B. Preparación de 9-h¡droximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-amida amidoglutárica)fluoreno mPEG-NH2(10,000)(Mn=10,200; cromatográficamente purificada, 12.75 g, 1.25 mmoles) en tolueno anhidro (100 ml), fue azeotrópicamente destilada bajo presión reducida a 50°C en un evaporador rotatorio. Los sólidos se disolvieron en DCM anhidro (50 ml) bajo una atmósfera de argón. Se agregó cuantitativamente, una solución de 9-hidroximetil-2,7-di(ácido amidoglutárico)fluoreno (1 eq., 0.5 mmoles, 0.225 g) y N-hidroxibenzotriazol (HOBt)anhidro (2.2 eq., 1.1 mmoles, 149 mg) en DMF anhidro (5 ml), a la solución de PEG (2.5 ml de DMF para enjuague). Entonces se agregó 1 ,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (2.4 eq., 1.2 mmoles, 248 mg) a la solución de reacción. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 24 horas antes de que el solvente se evaporara a presión reducida. El jarabe espeso se disolvió en IPA seco (500 ml, adición lenta) con calentamiento suave. El producto PEG se precipitó en reposo a temperatura ambiente. Lo precipitado se enfrió a 10°C por diez minutos, se filtró y lavó con IPA frío (200 ml) y después éter dietílico (200 ml). El producto crudo (polvo blancuzco), se secó bajo alto vacío y después se disolvió en agua desionizada. La cromatografía de intercambio ¡ónico de la solución de PEG se realizó en medio POROS (0J I, Boehringer-Mannheim, GmbH, Mannheim Alemania) eluyendo con agua. Las fracciones que contienen PEG neutral fueron colectadas. El producto purificado no contiene mPEG-NH2(10,000)(análisis de CLAR). Rendimiento 5.5 g, 53%, sustitución 85% o mejor. 1H RMN (CD2CI2): d (ppm) 8.6 (s, 2H, ArNH amida); 7.9 (s, 2H, Ar); 7.6 (m, 4H, Ar); 6.4 (bs, 2H, NH amida); 4.1 (m, 1 H, CH); 4.0 (d, 2H, CH2); 3.6 (s, estructura PEG); 3.3 (s, 3H, -OCH3); 2.4 (t, 4H, CH2); 2.3 (t, 4H, CH2); 2.0 (m, 4H, CH2).

C. Preparación de 9-h¡droximetil-2,7-di(mPEG(10.000)-amida amidoglutámica)-N-hidroxisuccinimida 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-amida amidoglutárica)fluoreno (5.3 g, 0.25 mmoles), en acetonitrilo anhidro (100 ml), fue azeotrópicamente destilada bajo presión reducida a 50°C en un evaporador rotatorio. El sólido se disolvió en DCM anhidro (27 ml), seguido por adición de trifósgeno (1.4 eq., 0.36 mmoles, 106 mg). (Se tuvo cuidado para atrapar el exceso de gas de fosgeno a partir de la reacción con trampa base). Después de varios minutos, se agregó piridina anhidra (2 eq., 0.51 mmoles, 41 µl). Después de una y una hora y media, la mayoría del solvente de reacción y exceso de fosgeno (usado en la trampa base en ventosa), se evaporó con calentamiento suave (40°C). El jarabe se disolvió en DCM anhidro (15 ml), seguido por adición de N-hidroxisuccinimida (5.3 eq., 1.35 mmoles, 155 mg, "NHS"). Después de 15 minutos, se agregó piridina anhidra (3.2 eq., 0.81 mmoles, 66 µl). La reacción se agitó por dos horas y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El jarabe se disolvió en IPA anhidro (200 ml) y se precipitó a temperatura ambiente. Lo precipitado se filtró y lavó con IPA frío y éter dietílico (150 ml que contiene 10 mg de BHT). Los solventes residuales fueron evaporados bajo alto vacío para proporcionar un polvo blancuzco. Rendimiento 5.1 g, 95%, sustitución -70% de carbonato de NHS por CLAR. Otro reactivo polimérico se preparó usando este mismo procedimiento excepto mPEG-NH2 (cromatográficamente purificado), que tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 20,000, fue sustituido por mPEG-NH2(10,000). El reactivo polimérico resultante tiene un peso molecular total de aproximadamente 40,000 Daltons. El nombre del reactivo polimérico así preparado es 9-h.droximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-amida amidoglutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida (o "G2PEG2Fmoc4o?.-NHS"). Otro reactivo polimérico se preparó usando este mismo procedimiento, excepto que mPEG-NH2 (preparado en alta pureza usando métodos convencionales) que tienen un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 30,000 se sustituyó por mPEG-NH2(10,000). El reactivo polimérico resultante tiene un peso molecular total de aproximadamente 60,000 Daltons. El nombre del reactivo polimérico así preparado es 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(30,000)-amida amidoglutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida (o "G2PEG2Fmoc6o?-NHS).

EJEMPLO 4 Preparado de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7- (mPEG(10,000)amida amidoqlutárico)fluoreno-N-h¡droxisuccinim¡da La síntesis de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(mPEG(10,000)-amida amidoglutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida, es representada esquemáticamente en el Esquema de Reacción 4, abajo.

Esquema de Reacción 3 H0--0 HO o NaOH 1 THF Ar purgado (XXX, COA, anhídrido glutárico JOj 20% P?/C (5% uuM) ^r-^ —os — NHj ácido 7-nitro-4-fluorencarboxílico * ^ ' ¿c¡d04-carboxílico 7-aminofluoreno MeOH NÜBHI áci idoglutárico)fluoreno ácido 9-hidroximetil-4-carboxílico de 7-(ácido amidoglutárico) DMF anh. HOBt anh. CHJCIJ mPEOpaj-NHi DCC 9-h¡droximetil-4-(mPEG( 10, 000)-carbox¡a ida)-7-(mPEG( 10.000)-ácido am¡doglutápco)rluoreno 1. CH2Clj 2. CH2Clj NHS trifósgeno piridina piridina mPEGn C1oDn>)--O v0PEGpaj. t. 9-hidroximetil-4-(mPEG( 10.000)-carboxiamida)-7-(mPEG( 10.000)-ácido amidoglutárico)fluoreno-N-hidroxisuccinimida A. Preparación de ácido 4-carboxílico de 7-aminofluoreno En una botella de hidrogenación Parr (Parr Instrument Company, Moline IL) se disolvió ácido 7-nitro-4-fluorencarboxílico (8.0 g, 0.031 moles) [preparado a partir de ácido difénico como se describe en Helvética Chimica Acta (1984) 67, 2009-2016, y también disponible comercialmente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO] en argón (Ar) purgado 1 M NaOH (250 ml, ligeramente calentado si es necesario). Después de la adición cuidadosa de 20% Pd/C (húmeda con 50% de agua) 5% en peso (400 mg), la botella Parr se evacuó/llenó 3 veces en un aparato Parr para asegurar atmósfera de hidrógeno. La suspensión se sacudió bajo 1.40 kg/cm2 de gas de hidrógeno por 18 horas y después el hidrógeno restante se removió a presión reducida. La suspensión se filtró sobre un lecho de celite, se enjuagó con agua adicional y después se ajustó a pH 4 con ácido acético. El producto se extrajo con salmuera y acetato de etilo (3 x 800 ml). Cada capa orgánica se lavó con una pequeña cantidad de salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, filtraron y evaporaron a sequedad. Se agregó tolueno y evaporó a presión reducida para ayudar en la remoción de ácido acético (se repite 2-3 veces si es necesario). La evaporación final fue bajo alto vacío por uno o más días. El rendimiento fue 6J g (86%) 1H-RMN (d6-DMSO): d (ppm) 8.1 (d, 1 H, Ar); 7.62 (d, 1 H, Ar); 7.58 (d, 1 H, Ar); 7.2 (t, 1 H, Ar); 6.8 (s, 1 H, Ar); 6.5 (d, 1 H, Ar); 3.8 (s, 2 H, CH2); 1.9 (s, <0.25 H, HOAc).

B. Preparación de ácido 4-carboxílico de 7-(ácido amidoglutárico)fluoreno Ácido 4-carboxílico de 7-aminofluoreno (8.6 g, 0.038 moles) se disolvió en THF anhidro (150 ml) y se agregó anhídrido glutárico (97%, 4.94 g, 0.042 moles). La reacción se agitó por 4.5 horas y la ausencia de amina se confirmó por CCD (teñido de ninhidrina, 90:10:3 acetato de etilo/metanol/ácido acético, o similar). La mezcla de reacción se diluyó con hexanos (150 ml), enfrió, filtró y lavó con 1 :1 THF frío/hexanos después hexanos. Los solventes residuales se evaporaron a presión reducida. El rendimiento fue 7.2 g (55%). H-RMN (CD3OD): d (ppm) 8.4 (d, 1 H, Ar); 8.0 (s, 1 H, Ar); 7.8 (d, 1 H, Ar); 7.7 (d, 1 H, Ar); 7.5 (d, 1 H, Ar); 7.4 (t, 1 H, Ar); 4.0 (s, 2 H, CH2); 2.5 (t, 2 H, CH2); 2.4 (t, 2 H, CH2); 2.0 (m, 2 H, CH2).

C. Preparación de ácido 9-formil-4-carboxílico de 7-(ácido amidoglutárico)fluoreno El diácido, ácido 4-carboxílico de 7-(ácido amidoglutárico)fluoreno (7J6 g, 0.021 moles), se disolvió en DMF anhidro (200 ml) y formiato de etilo (almacenado sobre K2C03, 350 ml). Terc-butóxido de potasio (95%, 19.9 g, 0.169 moles) fue cuidadosamente agregado en varias porciones. La reacción fue suavemente sometida a reflujo a 45 °C por 30 minutos y después se agitó a temperatura ambiente por 2.5 horas. La solución se enfrió en un baño helado después se agregaron 1 M HCl (500 ml) y salmuera (350 ml). El producto se extrajo con acetato de etilo (3 x 70O ml).

Las capas orgánicas se lavaron con salmuera y después se secaron sobre Na2S0 . El desecante se filtró y el solvente se evaporó a presión reducida. El rendimiento fue > 7.8 g (100%) y contiene DMF residual. 1H-RMN (d6-DMSO): d (ppm) 11.5 (d, 0.5 H, formilo); 11.4 (d, 0.5 H, formilo); 10.0 (d, 1 H, NH); 8.4-7.3 (m, 7 H, Ar); 2.4 (t, 2 H, CH2); 2.3 (t, 2 H, CH2); 1.8 (m, 2 H, CH2).

D. Preparación de 9-hidroximetil-4-ácido carboxílico-7-(ácido amidoqlutárico)fluoreno El ácido 9-formil-4-carboxílico de 7-(ácido amidoglutárico)fluoreno (7.8 g, 0.021 moles) se disolvió en metanol anhidro (MeOH) (150 ml). Con el matraz en un baño a temperatura ambiente, borohidruro de sodio (6.0 g, 0.159 moles) fue cuidadosamente agregado en varias porciones. A dos horas y cuatro horas, porciones adicionales de borohidruro de sodio (2.0 g, 0.053 moles) se agregaron cuidadosamente. Después de siete horas, el solvente se evaporó a presión reducida, el residuo se disolvió en agua y después acidificó con 1 M HCl. Lo precipitado amarillo se extrajo con salmuera y acetato de etilo (4 x 700 ml). Cada capa de acetato de etilo se lavó con salmuera (2x), combinó y secó sobre Na2S04. El solvente se evaporó y el producto crudo se recristalizó de metanol/cloroformo. Rendimiento 4.9 g (63%) de cristales amarillos. 1H-RMN (CD3OD): d (ppm) 8.4 (d, 1 H, Ar); 8.0 (s, 1 H, Ar); 7.85 (d, 1 H, Ar); 7.83 (d, 1 H, Ar); 7.5 (dd, 1 H, Ar); 7.4 (t, 1 H, Ar); 4.1 -3.9 (m, 2 H, CH2, CH); 2.5 (t, 2 H, CH2); 2.4 (t, 2 H, CH2); 2.0 (m, 2 H, CH2).

E. Preparación de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(mPEG(10,000)amida amidoglutárica)fluoreno mPEG-NH2(10,000) (Mn=9,418; cromatográficamente purificado, 75 g, 0.008 moles, también designado como "mPEG(1ok)-NH2") en tolueno anhidro (750 ml) fue azeotrópicamente destilado bajo presión reducida a 50 °C en un evaporador rotatorio. Los sólidos se disolvieron en DCM anhidro (CH2CI2) (300 ml) bajo una atmósfera de argón. Una solución de ácido 9-hidroximetil-4-carboxílico de 7-(ácido amidoglutárico)fluoreno (1.3 g, 0.0036 moles) y N-hidroxibenzotriazol (HOBt) anhidro (1.0 g, 0.0076 moles) en DMF anhidro (33 ml) se agregó cuantitativamente a la solución PEG (20 ml DMF para enjuagar). 1 ,3-Diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1.65 g, 0.008 moles) se agregó después a la solución de reacción. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 16 horas antes de que el solvente se evapore a presión reducida. El jarabe espeso se disolvió en IPA seco (3.6 I, adición lenta) con calentamiento suave. El producto PEG precipitó en reposo a temperatura ambiente. Lo precipitado se enfrió a 10 °C por diez minutos, filtró y lavó con IPA frío (400 ml) y después éter dietílico (400 ml). El producto crudo (polvo blancuzco) se secó bajo alto vacío y después se disolvió en agua desionizada. La cromatografía de intercambio iónico de la solución PEG se realizó en Medio POROS (1 L) eluyendo con agua. Las fracciones que contienen PEG neutral se colectaron y purificaron además con Medio de Sepharosa DEAE (0.5 L). El producto purificado no se encontró por contener productos mPEG-NH2 (10,000) o ácido monoPEG (Análisis de CLAR). Rendimiento 55 g, 79% (sustitución 95%). 1H-RMN (CD2CI2): d (ppm) 8.7 (s, 1 H, ArNH amida); 8.0 (s, 1 H, Ar); 7.9 (d, 1 H, Ar); 7.7 (d, 1 H, Ar); 7.5 (d, 1 H, Ar); 7.4 (d, 1 H, Ar); 7.3 (t, 1 H, Ar); 6.7 (bs, 1 H, NH amida); 6.4 (bs, 1 H, NH amida); 4.0 (m, 3 H, CH, CH2); 3.6 (s, Estructura PEG); 3.3 (s, 6 H, -OCH3); 2.4 (t, 2 H, CH2); 2.3 (t, 2 H, CH2); 2.0 (m, 2 H, CH2).

F. Preparación de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(mPEG(10,000) amida amidoglutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida El 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7- (mPEG(10,000) amida amidoglutárica)fluoreno (14 g, 0.00072 moles) en tolueno anhidro (140 ml) fue azeotrópicamente destilado bajo presión reducida a 45 °C en un evaporador rotatorio. El sólido se disolvió en DCM anhidro (56 ml, más 7 ml de enjuague) y se transfirió por jeringa a una solución de trifósgeno recientemente preparado (el exceso de gas de fosgeno se atrapó de la reacción con trampa base) (0.214 g, 0.00072 moles) y piridina anhidra (0.057 g, 0.00072 moles, se agregó como solución en CH2CI2 (~ 5 ml)). A una hora, se comenzó una rápida corriente de argón (mantenida a temperatura ambiente) para evaporar el exceso de fosgeno (uso de trampa base en ventosa). Después de 30 minutos de purga de argón, se agregó N-hidroxisuccinimida (NHS) (0.43 g, 0.0037 moles) y se agitó por diez minutos. Se agregó piridina anhidra (0.285 g, 0.0036 moles, agregada como solución en CH2CI2 (~ 25 ml)). Una corriente de argón se continuó para evaporar la mayoría del solvente de reacción después de 1.5 horas. El jarabe espeso se disolvió en IPA anhidro (700 ml) y precipitó a temperatura ambiente. Lo precipitado se filtró y lavó con IPA frío y éter dietílico (100 ml que contiene 10 mg BHT). Los solventes residuales se evaporaron bajo vacío por polvo blancuzco. Rendimiento 13.5 g, 96%, sustitución 87% Carbonato de NHS por CLAR. 1 H-RMN (CD3OD): d (ppm) 8.7 (s, 1 H, NH Ar amida); 7.9 (m, 2 H, Ar); 7.6 (m, 2 H, Ar); 7.5 (d, 1 H, Ar); 7.3 (t, 1 H, Ar); 6.8 (bs, 1 H, NH); 6.4 (bs, 1 H, NH); 4.7 (m, 2 H, CH2); 4.3 (t, 1 H, CH); 3.6 (s, Estructura PEG); 3.3 (s, 6 H, -OCH3); 2.8 (s, 4 H, CH2CH2); 2.5 (t, 2 H, CH2); 2.3 (t, 2 H, CH2); 2.0 (m, 2 H, CH2). Otro reactivo polimérico se preparó usando este mismo procedimiento, excepto mPEG-NH2 (cromatográficamente purificado) que tiene un peso molecular promedio de 20,000 se sustituyó por mPEG- NH2(10,000). El reactivo polimérico resultante tiene un peso molecular total de aproximadamente 40,000 Daltons. Otro reactivo polimérico se preparó usando este mismo procedimiento, excepto mPEG-NH (preparado en alta pureza usando métodos convencionales) que tiene un peso molecular promedio de 30,000 se sustituyó por mPEG-NH2(10,000). El reactivo polimérico resultante tiene un peso molecular total de aproximadamente 60,000 Daltons.

EJEMPLO 5 Preparación de Conjugados de glicina con Reactivos poliméricos ejemplares y Datos de liberación 9-Hidroximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno-N-hidroxisuccinimida (10 mg, -70% NHS activo), preparada como se describe en el Ejemplo 1 , se disolvió en una solución amortiguadora de 1 % glicina + 25 mM HEPES pH 7.4 (25 µL), se mezcló por vórtices y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos para formar una solución de conjugado. Posteriormente, dos alícuotas de la solución de conjugado se trataron como sigue: una alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 7.4 (1.25 ml), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos; otra alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 8.2 (buffer), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos. G2PEG2Fmoc20k-NHS, preparado como se describe en el Ejemplo 3, se disolvió en una solución amortiguadora de 1% glicina + 25 mM HEPES pH 7.4 (25 µL), se mezcló por vórtices y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos para formar una solución de conjugado. Posteriormente, dos alícuotas de la solución de conjugado se trataron como sigue: una alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 7.4 (1.25 ml), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos; otra alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 8.2 (buffer), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos. G2PEG2Fmoc 0k-NHS, preparado como se describe en el Ejemplo 3 se disolvió en una solución amortiguadora de 1 % glicina + 25 mM HEPES pH 7.4 (25 µL), se mezcló por vórtices y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos para formar una solución de conjugado. Posteriormente, dos alícuotas de la solución de conjugado se trataron como sigue: una alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 7.4 (1.25 ml), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos; otra alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 8.2 (buffer), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos. 9-Hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(Mpeg(10,000) amida amidoglutárica)fluoreno-N-hidroxisuccinimida, preparada como se describe en el Ejemplo 4, se disolvió en una solución amortiguadora de 1 % glicina + 25 mM HEPES pH 7.4 (25 µL), se mezcló por vórtices y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos para formar una solución de conjugado. Posteriormente, dos alícuotas de la solución de conjugado se trataron como sigue: una alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 7.4 (1.25 ml), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos; otra alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 8.2 (buffer), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos. 4,7-CAC-PEG2-Fmoc20?-NHS, preparado como se describe en el Ejemplo 12, se disolvió en una solución amortiguadora de 1 % glicina + 25 mM HEPES pH 7.4 (25 µL), se mezcló por vórtices y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos para formar una solución de conjugado. Posteriormente, dos alícuotas de la solución de conjugado se trataron como sigue: una alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 7.4 (1.25 ml), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos; otra alícuota se diluyó con 25 mM HEPES pH 8.2 (buffer), se incubó a 37 °C y se inyectó en un sistema de CLAR a varios intervalos. Datos de liberación para los valores t1 2 se obtuvieron de la inclinación del ajuste lineal a un trazo de en([conjugado]) vs. tiempo, de conformidad con la primera ley de proporción de orden. Datos de liberación para el conjugado 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(10,000)-metilamida)fluoreno-carbamato de glicina a 37 °C: pH 7.4, ti 2 = 9.9 días; pH 8.2, t? 2 = 5.5 días (para un experimento). Datos de liberación para el conjugado G2PEG2Fmoc2ok-carbamato de glicina a 37 °C: pH 7.52 ± 0.13, t1 2 = 14.8 ± 2.8 días; pH 8.14 ± 0.04, ti 2 = 7.0 ± 1 días (en donde los intervalos ± se consideran par dos experimentos). Datos de liberación para el conjugado G2PEG2Fmoc 0k-carbamato de glicina a 37 °C: pH 7.52 ± 0.13, t. 2 = 12.2 ± 2.6 días; pH 8.14 ± 0.04, t 2 = 6.7 ± 0J días (en donde los intervalos ± se consideran para 2 experimentos).

Datos de liberación para el conjugado 9-hidroximetil-4- (carboxamido mPEG(10,000)-7-(amida amidoglutárica mPEG(10,000))fluoreno-carbamato de glicina a 37 °C: pH 7.52 ± 0J3, t? = 4.0 ± 1 días; pH 8.14 ± 0.04, /2 = 1.95 ± OJ 5 días (en donde los intervalos ± se consideran para 2 experimentos). Datos de liberación para el conjugado 4,7-CAC-PEG2-Fmoc2o?-carbamato de glicina a 37 °C: pH 7.4, t1 2 = 18.0 ± OJ días; pH 8.2, t1 2 = 7.5 ± OJ días (en donde los intervalos ± se consideran para 2 experimentos).

EJEMPLO 6 Preparación de un Conjugado de Proteína-Polímero Ejemplar: Preparación de G2PEG2Fmoc?n -?/,er-GLP-1 Un reactivo polimérico ilustrativo, G2PEG2Fmoc2ok-NHS, fue covalentemente unido al N-término de un polipéptido ilustrativo, GLP-1 , para proporcionar una forma de profármaco de la proteína, en donde una porción PEG liberable está unida. La naturaleza de dos brazos del reactivo polimérico proporcionar estabilidad incrementada a la porción GLP-1 subsecuente a la administración, para con ello, proporcionar una formulación de liberación sostenida por lo cual, el GLP-1 es liberado del conjugado vía hidrólisis para proporcionar el precursor GLP-1 nativo o no modificado. La estructura de G2PEG2Fmoc20k-?/ter-GLP-1 se proporciona abajo (en la estructural, "GLP-1" representa un residuo de GLP-1 ). Otros polipéptidos y proteínas pueden ser sustituidos por GLP-1.

'O2PE C-OFmoCa-?P'-GLP-l " El reactivo polimérico, G2PEG2Fmoc2o?-NHS, se preparó como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Se preparó una solución de 50 mg GLP-1 (nominalmente 1 .2276 x 10"5 moles) (la pureza actual del GLP-1 fue de 98.5% (por CLAR), y el contenido peptídico fue de 82.2%) en 25 ml de 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 5.50, seguida por adición de 876.8 mg de G2PEG2Fmoc20k-NHS (3.0692 x 10"5 moles) con agitación. La solución se dejó agitar por 16 horas a temperatura ambiente, con ello permitiendo la formación de G2PEG2Fmoc2ok-A e?-GLP-1 , un conjugado GLP-1 PEGilado. La mezcla de reacción después se acidificó a pH 4.30 por 20 mM HAc. La reacción se monitoreó por Análisis de SDS-PAGE (FIG. 4). El G2PEG2Fmoc2ok-/V'e?-GLP-1 se purificó para obtener el conjugado monoPEGilado de GLP-1 por cromatografía de intercambio catiónico en un Sistema Básico ÁKTA (FIG. 5) usando una fase móvil de 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.30 (solución A) y 20 mM de amortiguador de acetato de sodio con 1 M NaCI a pH 4.30 (solución B). La columna fue una HiTrap™ SP HP envasada de resina de 75 ml, disponible de Amersham Biosciences, envasada con Medio de intercambio iónico de Alta Resolución de Sefarosa SP, también disponible de Amersham Biosciences, y la velocidad de flujo en la columna fue 14 ml/min. La solución a ser purificada se cargó primero sobre la columna. El producto cargado se eluyó después por la fase móvil usando un gradiente. Se usó el siguiente gradiente: por volúmenes de retención 0 ml hasta 550 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 550 ml hasta 1041 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1041 ml hasta 1093 ml, 10% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1093 ml hasta 1338 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1338 ml hasta 1486 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1486 ml y superiores, 0% de la fase móvil contiene solución B. La absorbancia UV del eluyente se monitoreó a 215 nm. La fracción que corresponde al pico G2PEG2Fmoc2ok-?/er-GLP-1 (forma monoPEGilada) a un volumen de retención de 689.3 ml se colectó (FIG. 5) y liofilizó. El polvo liofilizado se disolvió en 25 ml 20mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.3, y el proceso de purificación se repitió nuevamente bajo las mismas condiciones cromatográficas de intercambio catiónico. Rendimiento: 179.4 mg. El G2PEG2Fmoc2ok-A/'e?-GLP-1 purificado se analizó por SDS-PAGE (FIG. 6, Línea 2) y CLAR de fase inversa (FIG. 7A). La naturaleza escindible del conjugado G2PEG2Fmoc20k-? e''-GLP-1 en solución de medio acuoso [50 mM tris(hidroximet?l)aminometano (Tris), pH 10, durante la noche a 50 °C] también se estudió por tanto Análisis de SDS-PAGE (FIG. 6, Línea 3) como CLAR de fase inversa (FIG. 7B), a partir del cual se observó la liberación completa de GLP-1 a partir del conjugado. La columna fue una columna C18 100 mm X 2? mm ID Betasil con 5 µm de partículas, disponible de Thermo Electron Corp. La CLAR de fase inversa usó una fase móvil de 0.1 % de TFA en agua desionizada (solución C) y 0.1% de TFA en acetonitrilo (solución D) conducida a 37 °C. El gradiente usado por CLAR de fase inversa fue como sigue: por tiempo 0.00 hasta 20.00 minutos, 35% de la fase móvil contiene solución D; por tiempo 20.00 hasta 21.00 minutos, 55% de la fase móvil contiene solución D; por tiempo 21.00 hasta 23.00 minutos, 80% de la fase móvil contiene solución D; por tiempo 23.00 hasta 24.00 minutos, 80% de la fase móvil contiene solución D; por tiempo 24.00 hasta 25.00 minutos, 35% de la fase móvil contiene solución D; por tiempo 25.00 y anterior, 35% de la fase móvil contiene solución D. El Sitio de PEGilación N-terminal (His7) del conjugado G2PEG2Fmoc20k-?/'er-GLP-1 (especies monoPEGiladas) se confirmó por análisis MALDI-TOF después de la digestión de proteasa del conjugado usando endoproteinasa Glu-C de Straphylococcus aureus V8.

EJEMPLO 7 Preparación de un Conjugado de Proteína-Polímero Ejemplar: Preparación de G2PEG2Fmoc4nk-?/fer-GLP-1 "G2PE G2Fmoc,B-?r2r-GLP-1 " El reactivo polimérico, G2PEG2Fmoc 0k-NHS, se preparó como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Se preparó una solución de 50 mg GLP-1 (nominalmente 1 .2276 x 10"5 moles) (la pureza actual de GLP-1 fue 98.5 % (por CLAR), y el contenido peptídico fue 82.2 %) en 25 ml de 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 5.50, seguida por adición de 1.4971 gm de G2PEG2Fmoc40k-NHS (3.0692 x 10"5 moles) con agitación. La solución se dejó agitar por 15 horas a temperatura ambiente, con ello, permitiendo la formación de G2PEG2Fmoc 0k-A er-GLP-1 , un conjugado GLP-1 PEGilado. La mezcla de reacción se acidificó hasta pH 4.00 por 2 N HAc, seguida por dilución hasta 50 ml con 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.00.

El G2PEG2Fmoc40k-/Víe'-GLP-1 se purificó para obtener el conjugado monoPEGilado de GLP-1 por cromatografía de intercambio catiónico en un Sistema Básico ÁKTA (FIG. 8). La columna fue una HiTrap™ SP HP envasada de resina de 75 ml, disponible de Amersham Biosciences, envasada con Medio de intercambio iónico de Alta Resolución de Sefarosa SP, también disponible de Amersham Biosciences, y la velocidad de flujo en la columna fue 14 ml/min. La fase móvil usada para la purificación consiste de 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.00 (solución A) y 20 mM de amortiguador de acetato de sodio con 1 M NaCI a pH 4.00 (solución B). La solución a ser purificada se cargó primero sobre la columna. El producto cargado se eluyó después por fase móvil usando un gradiente. Se usó el siguiente gradiente: por volúmenes de retención 0 ml hasta 550 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 550 ml hasta 1041 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1041 ml hasta 1093 ml, 10% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1093 ml hasta 1338 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1338 ml hasta 1486 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1486 ml y superiores, 0% de la fase móvil contiene solución B. La absorbancia UV del eluyente se monitoreó a 215 nm. La fracción que corresponde al pico mono G2PEG2Fmoc40k-?/íß?-GLP-1 a volumen de retención de 668.4 ml se colectó (FIG. 8) y liofilizó. El polvo liofilizado se disolvió en 25 ml 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.0, y el proceso de purificación se repitió nuevamente bajo las mismas condiciones cromatográficas de intercambio catiónico. La fracción de colección a 668 ml se liofilizó. El G2PEG2Fmoc4ok-?/te -GLP-1 purificado se analizó por SDS-PAGE (FIG. 9, Línea 2). La naturaleza escindible del conjugado G2PEG2Fmoc40k- er-GLP-1 en solución de medio acuoso [50 mM tris(hidroximetil)aminometano (Tris), pH 10, durante la noche a 50 °C] también se estudió por Análisis de SDS-PAGE (FIG. 9, Línea 3), a partir del cual se observó la liberación completa de GLP-1 a partir del conjugado.

EJEMPLO 8 Preparación de un Conjugado de Proteína-Polímero Ejemplar: Preparación de G2PEG2Fmoc? ,-Lyg-GLP-1 El reactivo polimérico liberable ejemplar, G2PEG2Fmoc20k-NHS, fue covalentemente y de manera liberable, unido a una posición de lisina de GLP-1 , referido en este documento como PEGilación "interna" de GLP-1. Se preparó una solución de 30 mg GLP-1 (nominalmente 7.3658 x 10'6 moles) (la pureza actual de GLP-1 fue 98.5 % (por CLAR), y el contenido peptídico fue 82.2 %) en 24.5 ml de 20 mM de bicarbonato-carbonato de sodio a pH 10.0, seguida por adición de 276.3 mg de G2PEG2Fmoc20k-NHS (1.1049 x 10"5 moles, preparado como se describe anteriormente en el Ejemplo 3) con agitación. La solución se dejó agitar por diez minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción después se acidificó a pH 4.30 por 2 N HAc. Para obtener el G2PEG2Fmoc20k-/-ys-GLP-1 en forma monoPEGilada, la mezcla de reacción fue dividida en cinco alícuotas, y cada alícuota fue individualmente purificada por cromatografía de intercambio catiónico en un Sistema Básico ÁKTA. La columna fue una HiTrap™ SP HP envasada de resina de 5 ml, disponible de Amersham Biosciences, y la velocidad de flujo en la columna fue 5 ml/min. La fase móvil usada por la purificación fue 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.30 (solución A) y 20 mM de amortiguador de acetato de sodio con 1 M NaCI a pH 4.30 (solución B). La fase móvil fue corrida usando un gradiente. Se usó el siguiente gradiente: 0 ml hasta 1 18.6 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 118.6 ml hasta 219J ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 219.1 ml hasta 229.2 ml, 10% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 229.2 ml hasta 269.4 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 269.4 ml hasta 279.4 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 279.4 ml y superiores, 0% de la fase móvil contiene solución B. La absorbancia UV del eluyente se monitoreó a 215 nm. La fracción GLP-1 monoPEGilada que corresponde al pico G2PEG2Fmoc20k- ys-GLP-1 a un volumen de retención de 150.4 ml se colectó (FIG. 10) durante cada corrida de purificación. El G2PEG2Fmoc20k- ys-GLP-1 purificado (en la forma GLP-1 monoPEGilada) de cada corrida de purificación fue después analizada por SDS-PAGE (FIG. 1 1 ). Las fracciones colectadas se combinaron y liofilizaron. Rendimiento: 41 mg.

EJEMPLO 9 Preparación de un Conjugado de Proteína-Polímero Ejemplar: Preparación de G2PEG2Fmoc4ok-Lys-GLP-1 El reactivo polimérico liberable ejemplar, G2PEG2Fmoc4ok-NHS, fue covalentemente y de manera liberable, unido a una posición de lisina de GLP-1 , referida en este documento como PEGilación "interna" de GLP-1 . Se preparó una solución de 50 mg GLP-1 (nominalmente 1 .2276 x 10"5 moles) (la pureza actual de GLP-1 fue 98.5 % (por CLAR), y el contenido peptídico fue 82.2 %) en 45 ml de 20 mM de amortiguador de carbonato-bicarbonato de sodio a pH 10.0, seguida por adición de 898.0 mg de G2PEG2Fmoc4ok-NHS (1.8414 x 10"5 moles, preparada como se describe en el Ejemplo 3) con agitación. La solución se dejó agitar por diez minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción después se acidificó a pH 4.00 por 2 N HAc. Para obtener el G2PEG2Fmoc4ok-Lys-GLP-1 en forma monoPEGilada, la mezcla de reacción acidificada (50 ml), fue dividida en 10 alícuotas, y cada alícuota de 5 ml se purificó por cromatografía de intercambio catiónico en un Sistema Básico ÁKTA. La columna fue una HiTrap™ SP HP envasada de resina de 5 ml, disponible de Amersham Biosciences, y la velocidad de flujo en la columna fue 5 ml/min. La fase móvil usada por la purificación fue 20 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 4.00 (solución A) y 20 mM de amortiguador de acetato de sodio con 1 M NaCI a pH 4.00 (solución B). La fase móvil fue corrida usando un gradiente. Se usó el siguiente gradiente: 0 ml hasta 118.6 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 1 18.6 ml hasta 219.1 ml, 0% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 219.1 ml hasta 229:2 ml, 10% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 229.2 ml hasta 269.4 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 269.4 ml hasta 279.4 ml, 100% de la fase móvil contiene solución B; por volúmenes de retención 279.4 ml y superiores, 0% de la fase móvil contiene solución B. La absorbancia UV del eluyente se monitoreó a 215 nm. La fracción GLP-1 monoPEGilada que corresponde al pico G2PEG2-Fmoc4ok- ys-GLP-1 a un volumen de retención de 158.3 ml se colectó (FIG. 12) durante cada corrida de purificación. El G2PEG2Fmoc40k- ys-GLP-1 purificado (en la forma GLP-1 monoPEGilada) de cada corrida de purificación se analizó por SDS-PAGE (FIG. 13). Las fracciones colectadas se combinaron, concentraron por ultrafiltración y liofilizaron. Rendimiento: 187.5 mg.

EJEMPLO 10 Estudio in vivo en Ratones para Examinar los Efectos de Disminución de Glucosa Sanguínea de Conjugados Poliméricos GLP-1 Ilustrativos Ratones macho diabéticos (BKS.Cg-+Lepr db/+Lepr db/01 aHsd) se adquirieron de Harían Laboratories, Ltd. (Jerusalén, Israel). Los animales de 8-9 semanas de edad (30-40 mg), se colocaron en jaulas para ratones (dos animales por jaula), y se dejaron al menos, por 48 horas para aclimatización antes de iniciar el estudio. La preparación de G2PEG2Fmoc20k-? e?-GLP-1 (Ejemplo 6), G2PEG2Fmoc40k- er-GLP-1 (Ejemplo 7), G2PEG2Fmoc20k- -ys-GLP-1 (Ejemplo 8), y G2PEG2Fmoc40k- ys-GLP-1 (Ejemplo 9), se describe en los ejemplos precedentes. Cada compuesto fue exactamente pesado en un vial de vidrio y disueltos en solución salina normal para preparar una concentración que podría acomodar la dosis (basada en equivalentes GLP-1 ) y el volumen de inyección de 100 µl. El estudio fue dividido en dos fases: una fase de factibilidad y una fase de evaluación. En la fase de factibilidad, la factibilidad de usar ratones diabéticos db/db para probar la efectividad de GLP-1 , fue primero evaluada. Realizando la fase de factibilidad, se usaron varios grupos de ratones, en donde cuatro ratones fueron usados en cada grupo. Los datos en los niveles de glucosa de línea base fueron reunidos para cada ratón por 2-3 días antes de la dosificación del fármaco. Esto se realizó para identificar cualquier valor extremo en el grupo de animales. Al día del tratamiento (día 0), cada animal fue pesado. Se colectó una muestra se sangre al día 0 (5 hasta 10 µL) a partir de la vena de la cola. Se midió el nivel de glucosa mg/dl) usando un analizador de glucosa. Cada animal fue después dosificado subcutáneamente (SC) por debajo de la piel en la espalda. La cantidad de artículo de prueba y la dosis (60 y 120 µg/ratón) administrada, se basa en el peso corporal promedio del animal, y el volumen total de la dosis no excede 10 ml/kg. Los animales fueron entonces dejados regresar a sus jaulas. Las muestras de sangre de 5 hasta 10 µL (< 0.5% de 2 ml de volumen de sangre para un ratón de 35 g), se removieron a través de un piquete de aguja tubo capilar a los siguientes puntos de tiempo: -3, -2, -1 , 0, 0.04, 0.16, 0.33, 1.0, 1.16 días. Cada muestra de sangre colectada fue probada por su nivel de glucosa, al final del estudio, los animales fueron humanamente eutanizados por asfixia de dióxido de carbono. En la fase de evaluación, los resultados a partir de la fase de factibilidad se usaron para seleccionar la dosis apropiada requerida para lograr un suministró sostenido de GLP-1 por un efecto de 3-5 días. En la realización de la fase de evaluación, ocho ratones se usaron en cada grupo. Los datos en los niveles de glucosa de línea base fueron reunidos para cada ratón tres días antes de la dosificación del fármaco. Al día del tratamiento (Día 0), cada animal fue pesado. Se colectó una muestra de sangre al día 0 (5 hasta 10 µL) a partir de la vena de la cola. El nivel de glucosa (mg/dl) fue medido usando un analizador de glucosa. Cada animal fue entonces dosificado subcutáneamente (SC) por debajo de la piel en la espalda. La cantidad el artículo de prueba administrada se basa en el peso corporal promedio del animal, y el volumen total de la dosis no excede 10 ml/kg. Los animales fueron entonces dejados regresar a sus jaulas. Las muestras de sangre de 5 hasta 10 µl (< 0.5% de 2 ml de volumen de sangre para un ratón de 35 g), se removieron a través de un piquete de aguja/tubo capilar a los siguientes puntos de tiempo: -3, -2, -1 , 0, 0.04, 0J6, 0.33, 0.5, 1 , 2, 3, 6 días.

Cada muestra de sangre colectada fue probada por su nivel de glucosa. El alimento fue retirado de los animales por las primeras cuatro horas después de la dosificación. Al final del estudio, los animales fueron humanamente eutanizados por asfixia de dióxido de carbono. El cuadro 2 siguiente, describe los compuestos de prueba y las dosis para cada grupo de animales.

CUADRO 2 Compuestos de Prueba y Dosis para Cada Grupo de Animales Los datos a partir del estudio se colectaron y analizaron. No se notó que los animales toleraron la dosis subcutánea única. Como se ilustra en la FIG. 14, el efecto de disminución de glucosa sanguínea de GLP-1 y cada uno de los conjugados G2PEG2Fmoc2o?- ys-GLP-1 (designado como "PEG20-Lys-GLP1 " en la figura) y G2PEG2Fmoc40?- -ys-GLP-1 (designado como "PEG40-Lys-GLP1 " en la figura) fue confirmado. Se puede observar a partir de las mediciones farmacodinámicas (PD), que el GLP-1 fue separado rápidamente del ratón, pero que los conjugados GLP-1 liberan el péptido durante un periodo de 3 hasta 4 días. Es decir, los conjugados degradables GLP-1 ejemplares de la invención, funcionan algo similar a una bomba molecular, liberando el GLP-1 intacto con el tiempo por hidrólisis in vivo. El polímero hidrofílico covalentemente unido (es decir, PEG), funciona no solamente para estabilizar el GLP-1 in vivo (es decir, para proteger la proteína de la degradación enzimática), sino también para extender su vida media de circulación por liberación lentamente de la proteína en la corriente sanguínea durante un periodo extendido de 3 hasta 4 días. El conjugado PEG de 40 kiloDaltons, también se observó por tener un efecto PD menor pero extendido, cuando se compara con el conjugado PEG de 20 kiloDaltons. Los datos de la FIG. 14 sugieren que: (a) GLP-1 es liberado en la sangre del ratón a partir del sitio de inyección por difusión y por hidrólisis a partir del conjugado PEGilado; y (b) la actividad de disminución de glucosa sanguínea del conjugado PEG-GLP1 de lisina, puede ser debida a la combinación de la actividad de los conjugados intactos y la liberación in vivo aparente del péptido a partir de los conjugados sujetos. La FIG. 15 ilustra el efecto de disminución de glucosa en la sangre de GLP-1 y G2PEG2Fmoc20?-?/fe'-GLP-1 (designado como "PEG20-His-GLP1 " en la figura) y G2PEG2Fmoc4o?-?/er-GLP-1 (designado como "PEG40-His-GLP1" en la figura). Es evidente a partir de las mediciones farmacodinámicas (PD), que el GLP-1 es separado rápidamente del ratón, pero los conjugados GLP-1 PEG, liberan el péptido durante un periodo de 3 hasta 4 días. También se observa que el conjugado PEG de 40 kilodaltons, tiene un efecto menor pero extendido cuando se compara con el conjugado PEG de 20 kilodaltons. Esta serie de datos (FIG. 15) sugiere que: (a) GLP-1 es liberado en la sangre del ratón a partir del sitio de inyección por difusión y por hidrólisis a partir del conjugado PEGilado; y (b) el PEG-GLP1 conjugado de histidina no es activo, y la actividad de disminución de glucosa en la sangre observada, es el resultado de la liberación del péptido a partir del conjugado. Este estudio demuestra que una inyección del GLP-1 PEGilado como se describe en este documento, puede ser usada para controlar la diabetes durante un periodo prolongado de más de 48 horas. Este estudio también demuestra la propiedad de liberación sostenida de los reactivos G2PEG2Fmoc cuando se conjugan a GLP-1. Este estudio también muestra que el GLP-1 puede ser PEGilado al N-término para proporcionar un producto para administración parenteral.

EJEMPLO 11 Perfil de liberación in vitro de G2PEG2FmocpnK-? er-GLP-1 Se determinó el perfil de liberación in vitro de G2PEG2Fmoc?n?- ?/^-GLP-l G2PEG2Fmoc20?-?/'er-GLP-1 (en la forma de GLP-1 monoPEGilado), se preparó como se describe en el Ejemplo 6 y fue usado para evaluar la liberación de una proteína. Las condiciones usadas para determinar el perfil de liberación in vitro de G2PEG2Fmoc2o?-?/ftt-GLP-1 incluyen: 2 mg/ml de G2PEG2Fmoc20K-? er-GLP-1 (forma GLP-1 monoPEGilada) en solución salina amortiguada de fosfato, pH 7.4, 37 °C, con muestras tomadas a varios puntos de tiempo y probadas para determinar la presencia de GLP-1 "libre" o no conjugado. La liberación de GLP-1 se monitoreó por CLAR de fase inversa a 215 nm.

La FIG. 16 expone los resultados del experimento en forma gráfica, en donde Y = At/Amax (At es el área máxima de CLAR de GLP-1 liberada un tiempo de t (hr) y Ama? es el área máxima de CLAR de GLP-1 que alcanza su liberación máxima). Debido a que las cinéticas de reacción representan una primera reacción de orden debido a la linealidad del trazo, se puede concluir que In1/(1 -Y) = M, en donde / es la inclinación, t?/2 = In2/ .

EJEMPLO 12 Preparación de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(3- (mPEG(10,000))carbamoil-propil)fluoreno-N-hidroxisuccinimida; (o "4,7-CAC-PEG2-Fmocpn?-NHS") La síntesis de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(3-(mPEG(10,000))carbamoil-propil)fluoreno-N-hidroxisuccinimida es representada esquemáticamente en el Esquema de Reacción 4 siguiente 4-fluorencarboxíko ácido 7-(3-carboxi-propionil)-4-fluorencarboxílico sio ácido 9-formil-7-(3-carboxi-propil)-4-fluorencarboxílico ácido 9-hidrox?metil-7-(3-carboxi-prop?l)-4-fluorencarboxíl?co -hidroxi?metil---4--(mBEG( 10, 000)-carboxiamida)-7-(3-(mPEG( 10,000))carbamo¡l-prop?l)f luoreno l . DCM 2. DCM trifósgeno NHS piridina piridina -h?dro??mmer?l- A. Preparación de ácido 7-(3-carboxi-propionil)-4-fluoreno carboxílico En un matraz seco de fondo redondo purgado con argón, se suspendió AICI3 anhidro (26.9g, 0.202 moles) en 1 ,2-dicloroetano anhidro (60 ml). Se agregó ácido 4-fluorencarboxílico (10.0 g, 0.048 moles) a la suspensión. El matraz de reacción se colocó en un baño a temperatura ambiente y anhídrido succínico (5.72 g, 0.057 moles) fue cuidadosamente agregado. La reacción se agitó por cinco horas y después se enfrió a 0 °C. La reacción fue muy cuidadosamente apagada por la adición lenta por porciones de 3 M HCl (¡Precaución! La reacción puede reaccionar violentamente cuando se agrega HCl también rápidamente). La suspensión final bien mezclada fue acídica y no reactiva a la solución de HCl adicional. El solvente orgánico se removió a presión reducida y el producto se filtró y lavó bien con agua. El producto crudo se disolvió en solución NaOH caliente (aproximadamente <1 M NaOH), filtró y precipitó con la adición de HCl concentrado. El producto se filtró, lavó con agua y después se secó a presión reducida en la presencia de P2O5. El producto fue un sólido amarillo pálido (14.3 g, 97%). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 8.4 (d, 1 H, Ar); 8.2 (s, 1 H, Ar); 8.0 (d, 1 H, Ar); 7.8 (m, 2H, Ar); 7.5 (t, 1 H, Ar); 4.1 (s, 2H, CH2); 2.6 (t, 2H, CH2) 2.5 (bajo DMSO, CH2).

B. Preparación de ácido 7-(3-carboxi-propil)-4-fluorencarboxílico En un matraz purgado de argón, se suspendió ácido 7-(3-carboxi-propionil)-4-fluorencarboxílico (14.0 g, 0.045 moles) en dietilenglicol (200 ml). El matraz se colocó en un baño de aceite a temperatura ambiente y después se agregaron sucesivamente NaOH (18 g, 0.450 moles) y una solución al 80% de hidrato de hidrazina (13.6 ml, 0.223 moles). La mezcla de reacción se calentó lentamente a 110 °C y se sometió a reflujo por aproximadamente dos horas. La temperatura de reacción se elevó a 200 °C con remoción de agua durante el proceso de calentamiento. Después de tres horas a temperatura de reacción de 200 °C, la reacción se enfrió hasta aproximadamente 60 °C. La mezcla de reacción fue cuidadosamente vertida en agua (aproximadamente 1 L) y la mezcla se acidificó a pH 2 con HCl concentrado. El producto se filtró y lavó con agua. El producto se disolvió en solución NaOH caliente (0.5M) y precipitó por acidificación a pH 2 con HCl. El producto se filtró y lavó con agua. Producto fue un sólido blancuzco (10.9 g, 82%). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 8.3 (d, 1 H, Ar); 7.7 (m, 2H, Ar); 7.4 (s, 1 H, Ar); 7.4 (t, 1 H, Ar); 7.2 (d, 1 H, Ar); 3.9 (s, 2H, CH2); 2.7 (t, 2H, CH2); 2.3 (t, 2H, CH2); 1.9 (m, 2H, CH2).

C. Preparación de ácido 9-formil-7-(3-carboxi-propil)-4-fluorencarboxílico En un matraz seco purgado con argón con un condensador a reflujo, se disolvió ácido 7-(3-carboxi-propil)-4-fluorencarboxílico (4.0 g, 0.0135 moles) en DMF anh. (120 ml) a 40 °C. Se agregó formiato de etilo (40 ml, almacenado sobre K2C03 anh.) seguido por adición de terc-butóxido de potasio 95% (12.8 g, 0J 08 moles, agregado en 2 porciones). La reacción se agitó a aproximadamente 40 °C - 50 °C por cuatro horas con la adición de DMF anh. (80 ml), THF anhidro (5 ml) y formiato de etilo (25 ml) a varios intervalos para ayudar a la solubilidad. La reacción después se agitó otras 17 horas a temperatura ambiente. El formiato de etilo se evaporó a presión reducida. La reacción se apagó con agua (150 ml) y acidificó a pH 2 con HCl concentrado. El producto se extrajo dos veces con acetato de etilo (600 ml después 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron 3 veces con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, filtraron y evaporaron a sequedad. El producto crudo (4.7 g, -100%, pureza 80%) contiene algún material de partida sin reaccionar. 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 11.4 (s, 1 H, formilo); 8.3 - 7.0 (m, 7H, Ar); 2.7 (m, 2H, CH2); 2.3 (m, 2H, CH2); 1.9 (m, 2H, CH2).

D. Preparación de ácido 9-hidroximetil-7-(3-carboxi-propil)-4-fluorencarboxílico En un matraz purgado con argón, se disolvió ácido 9 -formilo-7-(3-carboxi-propil)-4-fluorencarboxílico crudo (4.0 g, 0.0123 moles) en metanol anhidro (50 ml). El matraz se colocó en un baño a temperatura ambiente y borohidruro de sodio (2.3g, 0.0615 moles) fue cuidadosamente agregado a la reacción en porciones (¡Precaución! Desprendimiento de gas inflamable). La reacción se agitó por dos horas y se agregó otra porción de borohidruro de sodio (1.2g, 0.031 moles). Después de otras seis horas la reacción se trató con una pequeña cantidad de agua. El solvente orgánico fue parcialmente removido a presión reducida y la mezcla se acidificó con HCl concentrado. Se agregó salmuera y el producto se extrajo dos veces con acetato de etilo (300 ml y 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, filtraron y evaporaron a sequedad. El producto crudo (3.3g, 83%) se purificó por cromatografía instantánea: gel de sílice 60 Á eluida con 50:50:2 acetato de etilo/cloroformo/ ácido glacial acético. El producto purificado fue un sólido naranja (1.7 g, 43%). 1H-RMN (CD3OD): d (ppm) 8.3 (d, 1 H, Ar); 7.8 (m, 2H, Ar); 7.6 (s, 1 H, Ar); 7.4 (t, 1 H, Ar); 7.2 (m, 1 H, Ar); 4.0 (m, 2H, CH2); 3.9 (m, 1 H, GH); 2.8 (t, 2H, CH2); 2.4 (t, 2H, CH2); 2.0 (m, 2H, CH2).

E. Preparación de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carbox¡amida)-7-(3-(mPEG(10,000))carbamoil-propil)fluoreno mPEG-NH ( 10,000) (Mn=9,418; cromatográficamente purificado, 25.8 g, 0.0026 moles, también designado como "mPEG(iok)-NH2") en tolueno anhidro (250 ml) fue azeotrópicamente destilado bajo presión reducida a 45 °C en un evaporador rotatorio. Los sólidos se disolvieron en DCM anhidro (CH2CI2) (130 ml) bajo una atmósfera inerte. Una solución de 9-hidroximetil-7-(3-carboxi-propil)-ácido 4-fluorencarboxílico (0.38 g, 0.0012 moles) y anhidro N-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0.33 g, 0.0025 moles) en DMF anhidro (12.5 ml) se agregó cuantitativamente a la solución PEG (5 ml DMF para enjuagar). 1 ,3-Diciclohexilcarbodiimida (DCC) (0.54 g, 0.0026 moles) se agregó después a la solución de reacción. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 21 horas antes de que el solvente se evapore a presión reducida. El jarabe espeso se disolvió en IPA seco (900 ml, adición lenta) con calentamiento suave. El producto PEG precipitó por adición de éter dietílico (400 ml) a temperatura ambiente. Lo precipitado se enfrió a 10 °C por diez minutos, filtró y lavó con IPA frío (300 ml) y después éter dietílico (300 ml). El producto crudo (polvo blancuzco) se secó bajo alto vacío y después se disolvió en agua desionizada. La cromatografía de intercambio iónico de la solución PEG se realizó en Medio POROS (500 ml) eluyendo con agua. Las fracciones que contienen PEG neutral se colectaron y purificaron además con Medio de Sepharosa DEAE (200 ml). El producto purificado no se encontró por contener productos mPEG-NH2 (10,000) o ácido monoPEG (Análisis de CLAR). Rendimiento 17 g, 71 % (sustitución 95%). 1H-RMN (CD2CI2): d (ppm) 7.9 (d, 1 H, Ar); 7.7 (d, 1 H, Ar); 7.5 (s, 1 H, Ar); 7.4 (m, 1 H, Ar); 7.3 (t, 1 H, Ar); 7.2 (d, 1 H, Ar); 6.7 (bs, 1 H, amida); 6.2 (bs, 1 H, amida); 4.1 (m, 2H, CH2); 3.8 (m, 1 H, CH); 3.6 (s, Estructura PEG); 3.3 (s, 6 H, -OCH3); 2.7 (m, 2H, CH2); 2.2 (m, 2H, CH2); 1.9 (agua + m, 2H, CH2).

F. Preparación de 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(3-(mPEG(10,000))carbamoil-propil)fluoreno-N-hidroxisuccinimida El 9-hidroximetil-4-(mPEG(10,000)-carboxiamida)-7-(3- (mPEG(10,000))carbamoil-propil)fluoreno (2.9 g, 0.00015 moles) en tolueno anhidro (50 ml) fue azeotrópicamente destilado bajo presión reducida a 45 °C en un evaporador rotatorio. El sólido se disolvió en DCM anhidro (15 ml, más 1 ml de enjuague) y se transfirió por jeringa a una solución de trifósgeno recientemente preparada (el exceso de gas de fosgeno se atrapó de la reacción con trampa base) (0.047 g, 0.00016 moles) y se agregó piridina anhidra (0.013 g, 0.00016 moles, como solución en CH2CI2 (~ 0.9 ml)). A una hora, se comenzó una rápida corriente de argón (mantenida a temperatura ambiente) para evaporar el exceso de fosgeno (uso de trampa base en ventosa). Después de 30 minutos de purga de argón, se agregó N-hidroxisuccinimida (NHS) (0.09 g, 0.00078 moles) y se agitó por diez minutos. Se agregó piridina anhidra (0.059 g, 0.00075 moles, agregada como solución en CH2CI2 (- 4.5 ml)). Una corriente de argón se continuó para evaporar la mayoría del solvente de reacción después de 1.5 horas. El jarabe espeso se disolvió en IPA anhidro (150 ml) y precipitó a temperatura ambiente. Lo precipitado se filtró y lavó con IPA frío y éter dietílico (30 ml que contiene 5 mg BHT). Los solventes residuales se evaporaron bajo vacío por polvo blancuzco. Rendimiento 2.7 g, 90%, sustitución 76% Carbonato de NHS por CLAR. 1H-RMN (CD3OD): d (ppm) 7.9 (m, 1 H, Ar); 7.7 (m, 1 H, Ar); 7.5 (m, 2H, Ar); 7.4 (m, 1 H, Ar); 7.2 (m, 1 H, Ar); 6.8 (bs, 1 H, amida); 6.1 (bs, 1 H, amida); 4.7 (m, 2H, CH2); 4.3 (t, 1 H, CH); 3.6 (s, Estructura PEG); 3.3 (s, 6H, - OCH3); 2.7 (s, 4H, CH2CH2); 2.7 (m, 2H, CH2); 2.2 (t, 2H, CH2); 2.0 (m, 2H, CH2).

EJEMPLO 13 Preparación dé ácido 9-hidroximetil-2,7-fluorenodicarboxílico- un intermediario para la preparación de 9-hidroximetil-2,7-(bis-mPEG?o?- carboxiamida)-fluoreno-N-hidroxisuccinimida (2,7-C2-PEG2-Fmoc2o?- NHS) La síntesis de 9-hidroximetil-2,7-fluorenodiácido carboxílico es representada esquemáticamente en el Esquema de Reacción 5, siguiente.

Esquema de Reacción 5 - _> ,-. -:, • . -- --. -- •.. reflujo a 110°C acido 9-fluoren-2,7-d?carboxíl?co ¿c¡do 2,7-fluorendicarboxílico éster dibencílico del ácido 2,7-fluorendicarboxílico éster dibencílico del ácido 9-formil-2,7-fluorend.carboxílico ácido 9-formil-2.7-fluorendicarboxil.co ácido 9-hidroximetü-2, 7-f luorendicarboxílico A. Preparación de ácido 2,7-fluorenodicarboxílico En un matraz purgado con argón, se suspendió ácido 9-fluorenona-2,7-dicarboxílico (10.0 g, 0.037 moles) en dietilenglicol (75 ml). El matraz se colocó en un baño de aceite a temperatura ambiente después se agregaron sucesivamente NaOH (6.2 g, 0.155 moles) y una solución al 80% de hidrato de hidrazina (7.4 ml, 0.12 moles). La mezcla de reacción se calentó lentamente a 110 °C y se sometió a reflujo por aproximadamente cuatro horas. La mezcla de reacción se enfrió, cuidadosamente vertió en agua y acidificó a pH 2 con HCl concentrado. El producto se filtró y lavó con agua. El producto se disolvió en solución NaOH caliente (0.5M, caliente) y precipitó por acidificación a pH 2 con HCl. El producto se filtró y lavó con agua. El producto fue un sólido amarillo (9.0 g, 96%). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 8.2 (s, 2H, Ar); 8.1 (m, 2H, Ar); 8.0 (m, 2H, Ar); 4.1 (s, 2H, CH2).

B. Preparación de éster dibencílico del ácido 2,7-fluorenodicarboxílico En un matraz seco purgado con nitrógeno, se disolvió ácido 2,7-fluorenodicarboxílico (8.0 g, 0.031 moles) en DMF anhidro (400 ml). Se agregaron alcohol bencílico anhidro (82 ml, 0.788 moles), DMAP (0.58 g, 0.0047 moles) y clorhidrato de EDAC (16 g, 0.082 moles) a la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Después de agitación por 24 horas, la mezcla de reacción se calentó y apagó por la adición de HCl muy diluto (1.5 L). La suspensión se enfrió, filtró y lavó con agua. El producto se disolvió en acetona caliente (800 ml) y filtró mientras está caliente. Lo filtrado se evaporó a sequedad a presión reducida (Rendimiento 5.9 g, 43%) ("Bz" en el Esquema de Reacción 5 representa bencilo). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 8.3 (s, 2H, Ar); 8.2 (m, 2H, Ar); 8.1 (m, 2H, Ar); 7.5-7.4 (m, 10H, Bz); 5.4 (s, 4H CH2); 4.1 (s, 2H, Ar).

C. Preparación de éster dibencílico del ácido 9-formilo-2,7-fluorenodicarboxílico En un matraz seco purgado con argón, se disolvió éster dibencílico del ácido 2,7-fluorenodicarboxílico (3.0 g, 0.0065 moles) en THF anh. (60 ml) a temperatura ambiente. Se agregó formiato de bencilo (4.2 ml, 0.035 moles, almacenado sobre K2C03 anhidro) seguido por adición de terc-butóxido de potasio 95% (2.7 g, 0.023 moles). La reacción se agitó por tres horas, después la reacción se apagó con la adición de agua y acidificó con HCl a pH 2. El solvente orgánico fue parcialmente evaporado a presión reducida. El producto se extrajo dos veces con acetato de etilo (600 ml después 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron tres tiempos con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, filtraron y evaporaron a sequedad. El producto crudo se lavó con hexanos y metanol (1.9 g, 60%). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 11.9 (s, ~1 H, formilo); 8.8 (s, 1 H, Ar); 8.5 (s, 1 H, Ar); 8.4 (s, 1 H, Ar); 8.2 (m, 2H, Ar); 7.9 (m, 2H, Ar); 7.5-7.4 (m, 10H, Bz); 5.4 (s, 4H, Ar).

D. Preparación de ácido 9-formilo-2,7-fluorenodicarboxílico En una botella de hidrogenación Parr (Parr Instrument Company, Moline IL) se disolvió éster dibencílico del ácido 9-formilo-2,7-fluorenodicarboxílico (3.0 g, 0.0061 moles) en THF anh. (350 ml). Después de la adición cuidadosa de 20% Pd/C (húmeda con 50% de agua) 20% en peso (600 mg), la botella Parr se evacuó/llenó 3 veces en un aparato Parr para asegurar la atmósfera de hidrógeno. La suspensión se sacudió bajo 1.40-2.10 kg/cm2 de gas de hidrógeno por aproximadamente 60 horas y después el hidrógeno restante se removió a presión reducida. La suspensión se filtró sobre un lecho de celite, se enjuagó con THF adicional y evaporó. 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 9.0 (s, 1 H, Ar); 8.5-8.1 (m, 6H, Ar).

E. Preparación de ácido 9-hidroximetil-2,7-fluorenodicarboxílico Una muestra pequeña de ácido 9-formilo-2,7-fluorenodicarboxílico (5-10 mg) se disolvió en agua con una pequeña cantidad de THF. Se agregó una cantidad en exceso de borohidruro de sodio y se dejó reaccionar por dos horas. La reacción se apagó con la adición cuidadosa de de 1 M HCl hasta ser acídico. El producto se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato de sodio, filtró y evaporó a sequedad. 1H-RMN (CD3OD): d (ppm) 8.4 (s, 2H, Ar); 8.2 (m, 2H, Ar); 8.0 (m, 2H, Ar); 4.2 (t, 1 H, CH); 4.0 (d, 2H, CH2).

EJEMPLO 14 Preparación de 9-hidroximetil-2,7-di(3-carboxi-propil)fluoreno, un Intermediario para la Preparación de 9-hidroximetil-2,7-bis-(3-(mPEG?o? carbamoil-propil))fluoreno-N-hidroxisuccinimida; (2 -CA2-PEG2- La síntesis de 9-hidroximetil-2,7-di(3-carboxi-propil)fluoreno es representada esquemáticamente en el Esquema de Reacción 6, siguiente.

Esquema de Reacción 6 Aia3 anh. dietilenglicol 1,2-dicloroetano NaHO hidrato de hidrazina al 80% anhídrido succínico reflujo a 110°C fluoreno 2,7-di(3-carboxi-propionil)fluoreno 175"C 2,7-di(3-carbox?-propil)fluoreno EDAC HC éster dibencílico de 2, 7-di(3-carboxi-propil)f luoreno t éster dibencílico de 9-formil-2,7-di(3-carboxi-propil)fl?oreno 9-formil-2.7-di(3-carboxi-propil)fluoreno 9-hidroximetil-2,7-di(3-carboxi-prop¡l)fluoreno A. Preparación de 2.7-di(3-carboxi-propionil)fluoreno En un matraz seco de fondo redondo purgado con argón, se suspendió AICI3 anhidro (98 g, 0.735 moles) en 1 ,2-dicloroetano anhidro (140 ml). En un matraz separado, se disolvió fluoreno (23 g, 0.138 moles) en 1 ,2-dicloroetano anh. (125 ml) después se agregó a la suspensión de AICI3. El matraz de reacción se colocó en un baño a temperatura ambiente y anhídrido succínico (34.5 g, 0.345 moles) fue cuidadosamente agregado. La reacción se agitó por 16 horas y después fue muy cuidadosamente apagada por adición lenta de 3 M HCl frío (¡Precaución! La reacción puede reaccionar violentamente cuando se agrega HCl también rápidamente). La suspensión final bien mezclada fue acídica y no reactiva a la solución de HCl adicional. El solvente orgánico se removió a presión reducida, después el producto se filtró y lavó bien con agua. El producto crudo se disolvió en solución de NaOH caliente (aproximadamente <1 M NaOH), filtró y precipitó con la adición de HCl concentrado. El producto se filtró, lavó con agua y después se secó a presión reducida en la presencia de P205. El producto fue un sólido amarillo pálido (49.3 g, 97%). 1H-RMN (CD3OD): d (ppm) 8.3 (s, 2H, Ar); 8.2 (m, 2H, Ar); 8.1 (m, 2H, Ar); 4.1 (s, 2H, CH2); 3.5 (t, 4H, CH2); 2.8 (t, 4H, CH2).

B. Preparación de 2,7-di(3-carbox¡-propil)fluoreno En un matraz purgado con argón se suspendió 2,7-di(3-carboxi-propionil)f luoreno (12.8 g, 0.035 moles) en dietilenglicol (150 ml). El matraz se colocó en un baño de aceite a temperatura ambiente después se agregaron sucesivamente, NaOH (14 g, 0.35 moles) y una solución al 80% de hidrato de hidrazina (13.1 ml, 0.21 moles). La mezcla de reacción se calentó lentamente a 1 10 °C y se sometió a reflujo por aproximadamente dos horas. La temperatura de reacción se elevó a 200 °C con remoción de agua durante el proceso de calentamiento. Después de tres horas a temperatura de reacción de 200 °C la reacción se enfrió a aproximadamente 60 °C. La mezcla de reacción fue cuidadosamente vertida en agua (500 ml) y la mezcla se acidificó a pH 2 con HCl concentrado. El producto se filtró y lavó con agua. El producto se disolvió en solución de NaOH caliente (0.5M) y precipitó por acidificación a pH 2 con HCl. El producto se filtró y lavó con agua (Rendimiento 10.9 g, 92%). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 12.0 (s, 2H, COOH); 7.8 (m, 2H, Ar); 7.4 (s, 2H, Ar); 7.2 (m, 2H, Ar); 3.9 (s, 2H, CH2); 2.7 (t, 4H, CH2); 2.3 (t, 4H, CH2); 1.8 (m, 4H, CH2).

C. Preparación de éster dibencílico de 2,7-di(3-carboxi-propiQfluoreno En un matraz seco purgado con nitrógeno, 2,7-di(3-carboxi-propil)fluoreno (3.0 g, 0.009 moles) se disolvió en DMF anhidro (50 ml). Alcohol bencílico anhidro (23 ml, 0.22 moles), DMAP (0.27 g, 0.0022 moles) y clorhidrato de EDAC (4.5 g, 0.023 moles) se agregaron a la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Después de agitación por 21 horas, la mezcla de reacción se calentó y apagó por la adición de HCl muy diluto (400 ml). La suspensión se enfrió, filtró y lavó con agua. El producto se disolvió en acetona caliente y filtró mientras está caliente. Lo filtrado se evaporó a sequedad a presión reducida (Rendimiento 3.8 g, 78%). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 7.7 (m, 2H, Ar); 7.4 (m, 12H, Ar); 7.1 (m, 2H, Ar); 5.1 (s, 4H, CH2); 3.8 (s, 2H, CH2); 2.7 (t, 4H, CH2); 2.4 (t, 4H, CH2); 1.9 (m, 4H, CH2).

D. Preparación de éster dibencílico de 9-formilo-2.7-di(3-carboxi-propiDfluoreno En un matraz seco purgado con argón, se disolvió éster dibencílico de 2,7-di(3-carboxi-propil)fluoreno (2.0 g, 0.0039 moles) en THF anh. (40 ml) a temperatura ambiente. Se agregó formiato de bencilo (2.3 ml, 0.019 moles, almacenado sobre K2C03 anh.) seguido por adición de terc-butóxido de potasio 95% (1.5 g, 0.013 moles). La reacción se agitó por cuatro horas, después la reacción se apagó con la adición de agua y acidificó con HCl a pH 2. El solvente orgánico fue parcialmente evaporado a presión reducida. El producto se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron tres tiempos con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, filtraron y evaporaron a sequedad. El producto crudo fue triturado con hexanos (permanece algo de formiato de bencilo). 1H-RMN (de-DMSO): d (ppm) 11.0 (s, ~1 H, formilo); 8.0 (s, 1 H, Ar); 7.9 (s, 1 H, Ar); 7.7 (m, 2H, Ar); 7.6 (s, 1 H, Ar); 7.4-7.2 (m, Bz); 7.0 (m, 2H, Ar); 5.0 (s, 4H, CH2); 2.7 (m, 4H, CH2); 2.4 (m, 4H, CH2); 1.9 (m, 4H, CH2).

EJEMPLO 15 Preparación de fluoren-N-hidroxisuccinimida del ácido 9-hidroximetil-2,7- di(mPEG(20,000)-metilamida)-sulfónico En un matraz seco purgado con argón, se disolvió 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno-N-hidroxisuccinimida (1 g, 0.026 mmoles) en DCM anhidro (10 ml). Una solución de ácido clorosulfónico (0.05 ml en 50 ml ácido trifluoroacético, 2.1 ml) se agregó a la mezcla de reacción. Durante las siguientes horas, se agregó ácido clorosulfónico adicional (0.287 ml) a la reacción y se agitó por más de cinco horas. El solvente se evaporó a presión reducida y después se disolvió en DCM. El solvente fue nuevamente evaporado a presión reducida. El producto crudo demostró la presencia de la estructura modificada de ácido sulfónico por Análisis de CLAR. 1H-RMN (d6-DMSO): d (ppm) 8.2 (bs, 1 H, NH amida); 7.6 (m, 1 H, Ar); 7.5 (m, 1 H, Ar); 7.2 (t, 1 H, Ar); 6.7 (s, 1 H, Ar); 6.5 (d, 1 H, Ar); 5.3 (bs, 1 H, NH amida); 3.8 (s, 2H, CH2); 3.5 (s); 3.3 (bs, Estructura PEG); estuvieron presentes cambios de contaminantes adicionales por debajo de 2.5 ppm en el producto crudo El grupo que altera el electrón de ácido sulfúrico, puede ser agregado a los reactivos poliméricos distintos de 9-hidroximetil-2,7-di(mPEG(20,000)-metilamida)fluoreno-N-h¡droxisuccinimida abarcados por la presente invención (que incluyen, aquellos reactivos poliméricos descrito en la sección Experimental).

Claims (70)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un reactivo polimérico de Fórmula I:

(Fórmula I) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; C5í? es una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable. 2.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es de Fórmula II:

(Fórmula II) en donde POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H i o un radical orgánico; R es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un ¡ primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo ' grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar i con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable. 3.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1 , ¡ caracterizado además porque es de Fórmula lll: en donde POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; H0 es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable. 4.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es de Fórmula IV:

(Fórmula IV) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; X3 es una tercera porción espaciadora; Ar1 es una primera porcióp aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable.

5.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es de Fórmula V: en donde POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable. 6.- Un reactivo polimérico que es de Fórmula VI:

Fórmula VI) en donde POLI es un polímero soluble en agua; X es una porción espaciadora que no incluye una porción . EA es una porción aromática que porta un átomo de hidrógeno ionizable, Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re, cuando está presente, es un grupo que altera electrón; y (FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace degradable.

7.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque

8.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 5, caracterizado además porque cada POLI1 y POLI2 es un poli(etilenglicol).

9.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque POLI es un poli(etilenglicol).

10.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 5, caracterizado además porque cada poli(etilenglicol) tiene un peso molecular en peso, en el intervalo desde aproximadamente 120 Daltons hasta aproximadamente 6,000 Daltons.

11.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo desde aproximadamente' 120 Daltons hasta aproximadamente 6,000 Daltons.

12.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, y 5, caracterizado además porque cada poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso, en el intervalo desde aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons.

13.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo desde aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 1000,000 Daltons.

14.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 5, caracterizado además porque la primera porción espaciadora se selecciona del grupo que consiste de -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-ÑH-C(0)-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?-3-NH-C(0)-. -C(0)-NH-(CH2CH20)?.3-CH2-CH2-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?. 3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)?.3-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-, y la segunda porción espaciadora se selecciona del grupo que consiste de -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, ¡ -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?.3-NH-C(0)-I -C(0)-NH-(CH2CH2?)1-3-CH2-CH2-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?- I 3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)?-3-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, ¡ -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, |¡ -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, ! i. -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, ¡ -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-.

15.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizado además porque R1 es H y R2 ' es H.

16.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las ¡ reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizado además porque el grupo ' funcional capaz de reacción con un grupo amino de un agente activo, se selecciona del grupo que consiste de carbonatos de N-succinimidilo, 1 - | i benzotriazolilo, imidazol, imidazole, haluros y fenolatos. '

17.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizado además porque el grupo

I funcional capaz de reaccionar con un grupo amino es un carbonato de N-succinimidilo. 18.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, y 5, caracterizado además porque (a) es cero y (b) es cero.

19.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque (a) es cero.

20.- El reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, y 5, caracterizado además porque (a) es uno, (b) es cero, y el primer grupo que altera electrón se selecciona del grupo que consiste de halo, alquilo inferior, arilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Ar, -S(02)R, -S(02)Ar, -S(02)OR, -S(02)OAr, -S(02)NHR, -S(02)NHAr, -C(0)R, -C(0)Ar, -C(0)OR, and -C(0)NHR, en donde Ar es arilo y R es H o un radical orgánico.

21.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque (a) es uno y el grupo que altera electrón se selecciona del grupo que consiste de halo, alquilo inferior, arilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Ar, -S(02)R, -S(02)Ar, -S(02)OR, -S(02)OAr, -S(02)NHR, -S(02)NHAr, -C(0)R, -C(0)Ar, -C(0)OR, and -C(0)NHR, en donde Ar es arilo y R es H o un radical orgánico.

22.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste de

C H30- (C HjC H20.w C H3C HJ- en donde para cada estructura, (n) es de 4 a 1500. 23.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es de la fórmula: CHjCHz (OCHzCHz , OCH- en donde cada (n) es de 4 a 1500.

24.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es de la fórmula:

CH30-(C H?CH?0)1-CHsCH?-0 ,0-CHjCHr(OCHjCH ¿)r CH3 - en donde cada (n) es de 4 a 1500. 25.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es de la fórmula:

CH30 (C HJC HJO),-C H?C H2-0 en donde cada (n) es de 4 a 1500. 26.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es de la fórmula:

C H3O (CH ?C Hz0),- CH?CH?.0 en donde cada (n) es de 4 a 1500. 27.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es de la fórmula:

CH -(CHjCH30)--CH-CHz-0 OC Hj en donde cada (n) es de 4 a 1500. 28.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es de la fórmula:

CH30-(CHaCH20 CH2CHr en donde cada (n) es de 4 a 1500. ¿ — \ 29.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación en donde cada (n) es de 4 a 1500.

30.- Un conjugado de Fórmula l-C: l-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; EA es una porción que contiene aromático que porta un átomo de hidrógeno ionizable; Ha; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es OJTS7 Y2 es O u S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

31.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de fórmula ll-C: lRí2lb (Fórmula ll-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

32.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de Fórmula lll-C: en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

33.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de Fórmula IV-C: (Fórmula IV-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; X3 es una tercera porción espaciadora; Ar1 es una primera porción aromática; Ar2 es una segunda porción aromática; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

34.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de Fórmula V-C: (Fórmula V-C) en donde: POLI1 es un primer polímero soluble en agua; POLI2 es un segundo polímero soluble en agua; X1 es una primera porción espaciadora; X2 es una segunda porción espaciadora; Ha es un átomo hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re1, cuando está presente, es un primer grupo que altera electrón; Re2, cuando está presente, es un segundo grupo que altera electrón; y Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

35.- Un conjugado de Fórmula Vl-C: (Fórmula Vl-C) en donde: POLI es un polímero soluble en agua; X es una porción o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cualquiera de cero o uno; (b) es cualquiera de cero o uno; Re, cuando está presente, es un grupo que altera electrón; Y1 es O o S; Y2 es O o S; y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

36.- El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque

37.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33 y 34 caracterizado además porque cada POLI1 y POLI2 es un poli(etilenglicol).

38.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque POLI es un poli(etilenglicol).

39.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33 y 34 caracterizado además porque cada poli(etilenglicol) tiene un peso molecular en peso, en el intervalo desde aproximadamente 120 Daltons hasta aproximadamente 6,000 Daltons.

40.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo desde aproximadamente 120 Daltons hasta aproximadamente 6,000 Daltons.

41.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33 y 34, caracterizado además porque cada poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso, en el intervalo desde aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons.

42.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo desde aproximadamente 6,000 Daltons hasta aproximadamente 1000,000 Daltons.

43.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33 y 34, caracterizado además porque la primera porción espaciadora se selecciona del grupo que consiste de - C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2.-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?-3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)?.3-CH2-CH2-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?- 3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)1.3-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-, y la segunda porción espaciadora se selecciona del grupo que consiste de -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH- -NH-C(0)-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -C(0)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-, -NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH20)?.3-CH2-CH2-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)?. 3-NH-C(0)-, -C(0)-NH-(CH2CH2?)?-3-CH2-CH2-NH-C(0)-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-0-, -0-CH2-C(0)-NH-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(0)-NH-CH2-CH2-0-, y -0-CH2-CH2-NH-C(0)-

44.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, caracterizado además porque R1 es H y R2 es H.

45.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33, 34 y 35, caracterizado además porque Y1 es O y Y2 es O.

46.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33, 34 y 35, caracterizado porque el agente biológicamente activo es un polipéptido.

47.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33 y 34, caracterizado porque (a) es cero y (b) es cero.

48.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque (a) es cero.

49.- El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33 y 34, caracterizado además porque (a) es uno, (b) es cero, y el primer grupo que altera electrón se selecciona del grupo que consiste de halo, alquilo inferior, arilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Ar, -S(02)R, -S(02)Ar, -S(02)OR, -S(02)OAr, -S(02)NHR, -S(02)NHAr, -C(0)R, -C(0)Ar, -C(0)OR, and -C(0)NHR, en donde Ar es arilo y R es H o un radical orgánico.

50.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque (a) es uno y el grupo que altera electrón se selecciona del grupo que consiste de halo, alquilo inferior, arilo, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, CF3, -CH2CF3, -CH2C6F5, -CN, -N02, -S(0)R, -S(0)Ar, -S(02)R, -S(02)Ar, -S(02)OR, -S(02)OAr, -S(02)NHR, -S(02)NHAr, -C(0)R, -C(0)Ar, -C(0)OR, and -C(0)NHR, en donde Ar es arilo y R es H o un radical orgánico. 51.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste de en donde para cada estructura, (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo. 52.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de la fórmula:

CHjCHHOCHjCHái-OCHj,

CHSO-CCHJCH.O CHJCHZ-O en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

53.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de la fórmula: CH3O-(C H2CH2O),J:H?CH?-O en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

54.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de la fórmula: CH30 (C Hr(OCHJCH¿)l -OCH3 en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

55.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de la fórmula:

HjCH j-(OC HjC Hj),-OC Ha en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo. 56.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de la fórmula: en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

57.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es de la fórmula: CH30-(CHsCHaOT - en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

58.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque es de la fórmula: en donde cada (n) es de 4 a 1500, y D es un residuo de un agente biológicamente activo.

59.- Un método para preparar un reactivo polimérico, que comprende: (a) proporcionar una porción aromática que porta un primer sitio de unión, un segundo sitio de unión y un tercer sitio de unión; (b) hacer reaccionar un reactivo de grupo funcional con el primer sitio de unión para resultar en el primer sitio de unión que porta un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo y que resulta en un carbamato hidrolizable; (c) hacer reaccionar una pluralidad de polímeros solubles en agua que portan un grupo reactivo con el segundo sitio de unión y el tercer sitio de unión para resultar en (i) el segundo sitio de unión que porta un polímero soluble en agua a través de una porción espaciadora, y (ii) el tercer sitio de unión que porta un segundo polímero soluble en agua a través I de una porción espaciadora.

60.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque la etapa (b) se realiza antes de la etapa (c).

61.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque la etapa (c) se realiza antes de la etapa (b).

62.- Un método para preparar un conjugado, que comprende hacer reaccionar bajo condiciones de conjugación, un reactivo polimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6, con un agente biológicamente activo que contiene amina.

63.- Un conjugado que se prepara por el método de conformidad con la reivindicación 62.

64.- Una composición farmacéutica, que comprende un conjugado de conformidad con la reivindicación 63 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

65.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada además porque está en forma liofilizada.

66.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada además porque también comprende un diluyente líquido.

67.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada además porque el diluyente líquido se selecciona del grupo que consiste del agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, salina amortiguada de fosfato, solución Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de los mismos.

68.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada además porque está en forma de dosificación unitaria.

69.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada además porque se aloja en un vial de vidrio.

70.- El uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31 , 32, 33, 34 y 35 en la fabricación de una composición útil para suministrar un conjugado en un paciente.