SK286898B6 - Fyziologicky aktívny konjugát, prostriedok a spôsob prípravy - Google Patents

Fyziologicky aktívny konjugát, prostriedok a spôsob prípravy Download PDF

Info

Publication number
SK286898B6
SK286898B6 SK1035-2001A SK10352001A SK286898B6 SK 286898 B6 SK286898 B6 SK 286898B6 SK 10352001 A SK10352001 A SK 10352001A SK 286898 B6 SK286898 B6 SK 286898B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
conjugates
conjugate
peg
gcsf
integer
Prior art date
Application number
SK1035-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK10352001A3 (sk
Inventor
Pascal Sebastian Bailon
Original Assignee
Amgen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen, Inc. filed Critical Amgen, Inc.
Publication of SK10352001A3 publication Critical patent/SK10352001A3/sk
Publication of SK286898B6 publication Critical patent/SK286898B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Abstract

Sú opísané fyziologicky aktívne konjugáty PEG-GCSF všeobecného vzorca (I), v ktorom G je faktor stimulujúci kolónie granulocytov bez svojej amínovej skupiny alebo skupín, ktoré vytvárajú amidovú väzbu s polyetylénglykolovou zložkou v konjugáte; R je nižší alkyl, ktorý má 1 až 6 atómov uhlíka; n je celé číslo od 240 do 550; m je celé číslo od 1 do 5, prostriedky s ich obsahom a spôsob ich prípravy.

Description

Oblasť techniky
Faktor stimulujúci kolónie granolocytov (GCSF) je farmaceutický aktívny proteín, ktorý reguluje množenie, diferenciáciu a funkčnú aktiváciu neurofilných granulocytov (Metcalf, Blood 67: 257 (1986); Yan a kol., Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger a kol., Blood 81(1): 3158-3163 (1993); Roberts a kol., Exptl. Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben a kol., Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF môže mobilizovať kmeňové bunky a prekurzorové bunky kostnej drene a je používaný na liečenie pacientov, ktorých granulocyty boli vyčerpané chemoterapiou alebo ako príprava pred transplantáciou kostnej drene.
Doterajší stav techniky
Patent US 5 214 132 opisuje mutovanú formu ľudského GCSF, ktorá sa líši od prirodzeného hGCSF na pozíciách 1, 3, 4, 5 a 17, kde namiesto prirodzených GCSF aminokyselín má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, prípadne Ser. (Pozri taktiež Kuga a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun, 159: 103-111 (1989)). M. Okabe a kol., (Blood 75(9): 1788-1793 (1. máj 1990)) opisuje derivát rhGCSF, v ktorom boli zamenené aminokyseliny na piatich pozíciách v N-koncovej oblasti rhGCSF, ktorý mal v dvoch testoch na myšiach a/alebo ľudských bunkách kostnej drene vyššiu špecifickú aktivitu ako pôvodný rhGCSF. Patent US 5 218 092 opisuje mutovanú formu ľudského GCSF, ktorá sa líši od prirodzeného hGCSF na pozíciách 1, 3, 4, 5, 17, 145 a 147, kde namiesto prirodzených GCSF aminokyselín má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn, prípadne Ser. Obsahy patentov US 5 214 132 a 5 218 092 sú tu zahrnuté ako odkaz.
Biologická dostupnosť proteínových liečiv, ako je GCSF, je často obmedzená ich krátkym polčasom v plazme a citlivosťou na degradáciu protetázou, čo bráni maximálne využiť ich klinické možnosti. Štúdie iných terapeutických proteínov ukázali, že takéto ťažkosti môžu byť prekonané konjugáciou proteínu k polyméru, ako je polyetylénglykol (PEG), typicky napríklad pomocou zložky kovalentne viazanej tak k proteínu, ako k PEG.
V takýchto biologických molekulách konjugovaných s PEG bolo dokázané, že majú užitočné klinické vlastnosti (Inada a kol., J. Bioact. and Compatible Polymers, 5:343 (1990); Delgado a kol., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carher Systems, 9: 249 (1992); a Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10: 91 (1993)). Ide napríklad o lepšiu fyzikálnu a tepelnú stabilitu, ochranu proti citlivosti k enzymatickej degradácii, zvýšenú rozpustnosť, dlhší in vivo polčas cirkulácie a znížené vylučovanie, zníženú imunogenitu a antigenicitu a zníženú toxicitu.
Konjugáty PEG-GCSF, ktoré majú inú štruktúru ako konjugáty, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, sú opísané v publikácii európskeho patentu EP 0 335 423; v publikácii európskeho patentu EP 0 401 384; R. W. Niven a kol., J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); a Satake-lshikawa a kol., Celí Structure and Function 17: 157-160(1992)).
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je nová trieda PEG derivátov GCSF. Konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, má amidový linker a je zobrazený ďalej.
V porovnaní s nemodifikovanými GCSF (t. j. GCSF bez pripojeného PEG), má konjugát zvýšený polčas cirkulácie a času výskytu v plazme, znížené vylučovanie a zvýšenú aktivitu tvorenia granolocytov in vivo. Ďalej v porovnaní s PEG-GCSF konjugátmi, konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, má vynikajúce vlastnosti, pokiaľ sa týka podpory tvorenia granulocytov. Iné PEG-GCSF konjugáty sú opísané v publikácii európskeho patentu EP 0 335 423; v publikácii európskeho patentu EP 0 401 384; a v Niven a kol., J. Controlled Release 32: 177-189 (1994). Ale konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, má odlišnú štruktúru od týchto konjugátov a má vynikajúce vlastnosti, obzvlášť má dlhodobú, vysokú aktivitu podpory tvorenia granulocytov in vivo pri nízkej dávke.
Výhodný GCSF, ktorý je predmetom tohto vynálezu, je mutovaná forma GCSF, ktorá má vlastnosti rovnocenné alebo lepšie ako prirodzený GCSF a má rovnaké spôsoby použitia ako GCSF. Mutovaná forma má rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako GCSF, okrem pozícií 1, 3, 4, 5 a 17, kde namiesto prirodzených aminokyselín má mutovanú formu Ala, Thr, Tyr, Arg, prípadne Ser (mutovaná forma GCSF) (pozri obrázok 1). Táto mutovaná forma je opísaná v patente US 5 214 132, ktorýje tu zahrnutý ako odkaz.
Fyziologicky aktívny PEG - GCSF konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu má všeobecný vzorec (I):
SK 286898 Β6
G (i), m (I).
Súčasťou tohto vynálezu sú taktiež prostriedky pripravené z nárokovaných konjugátov, kde m a n môžu byť rôzne celé čísla pre konjugáty v prostriedku.
Konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, má rovnaké použitie ako GCSF. Konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, je obzvlášť užitočný na liečenie tých pacientov, ktorých granulocyty boh vyčerpané chemoterapiou alebo ako príprava pred transplantáciou kostnej drene rovnakým spôsobom, ako je GCSF používaný na liečenie rovnakých stavov. Ale konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, má vylepšené vlastnosti, vrátane vynikajúcej stability, vyššej rozpustnosti, zvýšeného polčasu cirkulácie a predĺženého času výskytu v plazme.
Nárokovaným vynálezom je fyziologicky aktívny konjugát PEG - GCSF, ktorý má všeobecný vzorec (I):
O ľ II 1
RO(CH2CH2O)nCH2CHrC-NH-m kde G je faktor stimulujúci kolónie granulocytov, bez tých jeho amínových skupín, ktoré sa zúčastňujú amidovej väzby so štruktúrou PEG, ako je uvedené vo všeobecnom vzorci (I), R je nižší alkyl, ktorý má 1 až 6 atómov uhlíka a je celé číslo od 420 do 550 a m je celé číslo od 1 do 5.
Čísla n a m sú vybrané tak, že výsledný konjugát všeobecného vzorca (I) má fyziologickú aktivitu porovnateľnú s nemodifikovaným GCSF, táto aktivita môže byť rovnaká, väčšia alebo môže predstavovať časť zodpovedajúcej aktivity nemodifikovaného GCSF. n predstavuje počet etylénoxidových zvyškov v jednotke PEG. Jedna podjednotka PEG, t. j. OCH2CH2, má molekulovú hmotnosť asi 44 daltonov. m predstavuje počet jednotiek PEG pripojených k molekule GCSF. Konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, môže mať jednu, dve, tri, štyri, päť alebo šesť počet jednotiek PEG na molekulu GCSF. Molekulová hmotnosť konjugátu (okrem molekulovej hmotnosti GCSF) závisí od čísel nam.
n môže mať hodnotu 420 až 550 a vytvára tak konjugát, v ktorom každá jednotka PEG má priemernú molekulovú hmotnosť od asi 18 000 daltonov do asi 25 000 daltonov na jednotku PEG. Je výhodné, keď n má hodnotu 450 až 490 a vytvára tak konjugát, v ktorom každá jednotka PEG má priemernú molekulovú hmotnosť asi 20 000 daltonov, m môže mať hodnotu 1,2, 3, 4 alebo 5. Výhodné m je 1 až 4 a obzvlášť výhodné m je 2. Rozsah molekulovej hmotnosti PEG častí konjugátu, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, je asi od 18 000 daltonov (n=420; m=l) do asi 125 000 daltonov (a=550; m=5). Keď n je 420 až 550 a m je celé číslo 1 až 4, rozsah molekulovej hmotnosti PEG častí konjugátu, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, je asi od 18 000 daltonov (n=420; m=l) do asi 97 000 daltonov (n=500; m=4). Molekulová hmotnosť „asi“ určité číslo znamená, že molekulová hmotnosť je v primeranej blízkosti tohto čísla, pri zisťovaní bežnými analytickými technikami.
Vo výhodnom uskutočnení konjugátu jen 450 až 490 a m je 1 až 4, a v tomto prípade je rozsah molekulovej hmotnosti PEG časti konjugátu od asi 20 000 daltonov (n=450; m=l) do asi 86 000 daltonov (n=490; m=4). V inom výhodnom konjugáte je n 420 až 550 a m je 2, v tomto prípade je rozsah molekulovej hmotnosti PEG časti konjugátu asi od 37 000 daltonov (n=420) do asi 48 000 daltonov (n=550). V obzvlášť výhodnom konjugáte je n 450 až 490 a m je 2, v tomto prípade je rozsah molekulovej hmotnosti PEG časti konjugátu asi od 40 000 daltonov (n=450) do asi 43 000 daltonov (n=490).
R môže byť akýkoľvek nižší alkyl, čím sa rozumie alkylová skupina, ktorá má 1 až 6 atómov uhlíka, ako sú metyl, etyl, izopropyl atď. Sú zahrnuté aj rozvetvené alkyly. Výhodným alkylom je metyl.
Skratkou GCSF sa rozumie prirodzený alebo rekombinantný proteín, výhodne ľudský, ktorý je získaný z akéhokoľvek bežného zdroja, ako sú tkanivá, syntéza proteínov, bunková kultúra prirodzených alebo rekombinantných buniek. Je tu zahrnutý akýkoľvek proteín, ktorý má aktivitu GCSF, ako sú muteíny alebo inak modifikované proteíny. Získanie a izolácia GCSF z prirodzených alebo rekombinantných zdrojov sú dobre známe (pozri napríklad patent US 4 810 643 a patent US 5 532 341, ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako odkaz). Výhodný GCSF konjugát je konjugát s CGSF muteínom, ako je opísané v patente US 5 214 132.
Fyziologicky aktívny konjugát všeobecného vzorca (I) má GCSF aktivitu, čím sa rozumie akákoľvek časť alebo násobok akejkoľvek známej GCSF aktivity, čo je určované rôznymi testami, známymi v odbore. Zvlášť platí, že konjugát, ktorý je predmetom tohto vynálezu, má GCSF aktivitu, ktorá sa prejavuje schopnosťou zvyšovať počet PMN. Toto je známa aktivita GCSF. Tento druh aktivity konjugátu môže byť určený testami, ktoré sú v odbore dobre známe, napríklad testy, ktoré sú opísané ďalej (pozri taktiež: Asano a kol., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773; Yamasaki a kol., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; a Neben a kol., Blood(1993) 81: 1960).
Konjugát všeobecného vzorca (I) vzniká kovalentnou väzbou GCSF s reakčným činidlom, kyselinou sukcínimidylpropiónovou (SPA), ktorá má všeobecný vzorec (II):
kde R je nižší alkyl, ktorý má 1 až 6 atómov uhlíka.
Reakčné činidlo všeobecného vzorca (II) môže byť získané bežnými metódami, podľa známych postupov (pozri patent US 5 672 662, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz), n je rovnaké ako vo všeobecnom vzorci (I) a je vybrané tak, aby bol vytvorený konjugát požadovanej molekulovej hmotnosti. Sú výhodné také reagencie, v ktorých je n od 450 do 490 (molekulová hmotnosť = 20 000 daltonov). Iné molekulové hmotnosti môžu byť získané pomocou bežných metód zmenami n vo východiskovom materiáli PEG-alkohol pre reakčné činidlo všeobecného vzorca (II). Reakčné činidlo SPA všeobecného vzorca (II) s molekulovou hmotnosťou 5,10,15 a 20 000 môže byť získané od Sheaerwater PolymersPolymers, Inc., (Huntswille, Alabama).
Reakčné činidlo všeobecného vzorca (Π) môže byť konjugované k GCSF pomocou bežných metód. Väzba sa uskutočňuje pomocou amidovej väzby. Presnejšie povedané, reakčné činidlo všeobecného vzorca (II) primáme reaguje s jednou alebo viacerými primárnymi amínovými skupinami (napríklad N-koniec a postranné reťazce lyzínu) GCSF a vytvára amidovú väzbu medzi GCSF a polymérovou kostrou PEG. NH uvedené vo všeobecnom vzorci (I) je odvodené z tejto primárnej amínovej skupiny (skupín) GCSF, ktorá reaguje s reakčným činidlom všeobecného vzorca (II) a vytvára amidovú väzbu. V menšom rozsahu môže reakčné činidlo všeobecného vzorca (II) taktiež reagovať s hydroxylovou skupinou šermu na pozícii 66 v GCSF a vytvorí esterovú väzbu medzi GCSF a polymérovou kostrou PEG. Podmienky reakcie sú známe osobám so skúsenosťou v odbore a sú detailne opísané ďalej.
Pripojenie reakčného činidla na GCSF môže byť uskutočnené bežnými metódami. V tomto vynáleze môže byť použitý PEG s akoukoľvek vybranou molekulovou hmotnosťou (n). Napríklad reakcia môže byť uskutočnená v roztoku pri pH od 5 do 10, pri teplote od 4 °C do teploty miestnosti, v čase od 30 minút do 20 hodín, s použitím molámeho pomeru reakčného činidla k proteínu od 4 : 1 do 30 : 1. Reakčné podmienky môžu byť vybrané tak, aby reakcia smerovala k vytváraniu požadovaného stupňa substitúcie. Všeobecne platí, že nízka teplota, nízke pH (napr. pH 5) a krátky čas reakcie majú tendenciu znižovať počet pripojených PEG (nízke m). Vysoká teplota, neutrálne až vysoké pH (napr. pH>7) a dlhší čas reakcie zvyšujú počet pripojených PEG (vyššie m). Napríklad v prípade reakčného činidla všeobecného vzorca (I) s molekulovou hmotnosťou 5 000 daltonov, pri pH 7,3 a molámom pomere reakčného činidla k proteínu 30 : 1, teplote 4 °C a reakčnom čase 30 minút, vzniká prevažne konjugát s jedným PEG (mono-PEG); pri teplote 4 °C a reakčnom čase 4 hodiny vzniká prevažne konjugát s dvoma PEG (di-PEG); a pri teplote miestnosti a reakčnom čase 4 hodiny vzniká prevažne konjugát s troma PEG (tri-PEG). Reakcia je ukončená okyslením reakčnej zmesi a zmrazením na -20 °C. Všeobecne je dávaná prednosť pH od 7 do 7,5 a molámemu pomeru reakčného činidla k proteínu od 4 : 1 do 6 : 1.
Purifikačné metódy, ktoré účinne oddeľujú konjugáty podľa ich rozdielnych molekulových hmotností, ako je katiónová výmenná chromatografia, môžu byť použité na oddelenie konjugátov podľa rozdielu v náboji. Napríklad stĺpec na výmenu katiónov môže byť navrstvený a potom premytý -20 mM octanom sodným, pH ~4 a potom vymývaný lineárnym gradientom (0 M až 0,5 M) NaCI, pufrovaným pri pH od 3 do 5,5, výhodne pri pH ~4,5. Obsah frakcií, získaných katiónovovou výmennou chromatografiou môže byť určovaný podľa molekulovej hmotnosti pomocou bežných metód, napríklad hmotnostnej spektroskopie, SDS-PAGE alebo inými známymi metódami na oddeľovanie molekúl látok podľa molekulovej hmotnosti. Podľa toho sú určené frakcie obsahujúce konjugát všeobecného vzorca (I), ktorý má požadovaný počet (m) pripojených PEG, vyčistený od nemodifikovaného GCSF a konjugátov, ktoré majú pripojený iný počet PEG.
Súčasťou tohto vynálezu je prostriedok z konjugátov, kde sú zastúpené v špecifických pomeroch konjugáty, ktoré majú rôzne hodnoty m. Výhodným prostriedkom tohto vynálezu je zmes konjugátov, kde m=l, 2, 3 a 4. Percento konjugátov, kde m=l, je 18 až 25 %, percento konjugátov, kde m=2, je 50 až 66 %, percento konjugátov, kde m=3, je 12 až 16 % a percento konjugátov, kde m=4, je až 5 %. Takýto prostriedok je pripravovaný reakciou pegylačného reakčného činidla s GCSF v molárnom pomere od 4 : 1 do 6: (nadbytok re akčného činidla). Reakcia sa uskutočňuje pri 4 až 8 °C počas 20 hodín pri pH blízkom 7,5. Na konci reakcie je pridaná kyselina octová. Konjugát je potom purifikovaný od zostatkového nemodifikovaného proteínu, nadbytku pegylačného reakčného činidla, ostatných nečistôt a zložiek pufra, prítomných počas reakcie. Spolu s pegylovaným proteínom vznikajú ako vedľajšie reakčné produkty N-hydroxysukcínimid a polyetylénglykolkarboxylová kyselina.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Primárna štruktúra GCSF muteínu
Uvedený GCSF muteín sa líši od štandardného typu ľudského GCSF na pozíciách 1, 3,4,5 a 17, kde namiesto prirodzených aminokyselín má muteín Ala, Thr, Tyr, Arg, prípadne Ser.
Obrázok 2 : Reagencie pre pegyláciu.
Obrázok 3 : Vzájomné oddelenie 20 kDa GCSF muteínu, modifikovaného pomocou PEG od formy nemodifikovanej PEG. Typický elučný profil pre PEG reakčnú zmes.
Stĺpec : 1 až 2 ml Fractogel® EMD SO3650S.
Ekvilibračný pufer: 10 mM octan amónny, pH 4m5
Elučné pufre: 1. 0,15 M NaCl v ekvilibračnom pufri
2. 0,5 M NaCl v ekvilibračnom pufri
Obrázok 4 : Aktivita PEG-GCSF muteínu na 5. deň po jednej injekcii
Samice myšieho kmeňa C57BL/6J dostali podkožné injekcie obsahujúce 25,2 pg pegylovaných konjugátov GCSF muteínu; 5. deň po podaní injekcie boli odobraté vzorky žilovej krvi z dutiny za očnicou. Boli urobené hematologické a leukocytové diferenciálne analýzy; výsledné počty neutrofilov boli štandardizované k nosičovej kontrole, uskutočnené v každom pokuse. Uvedené údaje predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku (S.E.) zo štyroch myší v skupine.
Obrázok 5 : Zvýšenie počtov PMN ako funkcia hmotnosti PEG (kDa) v amidom a močovinou viazaných konjugátoch PEG-GCSF muteínu. Pre konjugáty pripravené pomocou reakčného činidla SPA PMN= =0,277*molekuláma hmtnosť+3,95. Pre konjugáty pripravené pomocou močoviny PMN=0,152* molekulárna hmotnosť+2,74.
Obrázok 6 : Aktivita PEG-GCSF muteínu na 7. deň po jednej injekcii
Samice myšieho kmeňa dostali podkožné injekciu obsahujúcu 25,2 pg pegylovaných konjugátov GCSF muteínu; 7. deň po podaní injekcie boli odobraté vzorky žilovej krvi z dutiny za očnicou. Boli uskutočnené hematologické a leukocytové diferenciálne analýzy; výsledné počty neutrofilov boli štandardizované k nosičovej kontrole, uskutočnené v každom pokuse. Uvedené údaje predstavujú priemer±štandardnú odchýlku (S.E.) zo štyroch myší v skupine.
Obrázok 7 : Test mobilizácie kolónií myších PBSC.
Obrázok 8 : Test mobilizácie kolónií myších PBSC.
Obrázok 9 : Test mobilizácie kolónií myších PBSC.
Obrázok 10 : Test mobilizácie kolónií myších PBSC.
Obrázok 11 : Test mobilizácie kolónií myších PBSC.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu tu opísaného vynálezu a žiadnym spôsobom ho neobmedzujú. V týchto príkladoch je použitý GCSF muteín. Iné druhy GCSF môžu byť taktiež pomocou uvedených metód konjugované s PEG.
Príklad 1: Pegylačné reakčné činidlá
1. GABA amidový linkér (P-6GA-1, P-12Ga-l)
Reakčné činidlo GABA amidového linkeru obsahuje 2 reťazce PEG, každý s molekulovou hmotnosťou 6 000 alebo 12 000 daltonov. Štruktúry pozri na obrázku 2-A.
2. Amidový linker (P-5 am-1, P-10 am-1)
Boli pripravené amidové linkery s molekulárnou hmotnosťou 5 000 a 10 000 daltonov. Štruktúru pozri na obrázku 2-B.
3. Amidový linker
Týmto reakčným činidlom bola komerčne dostupná kyselina sukcínimidylpropiónová (SPA), pripravená s PEG s molekulovou hmotnosťou 5, 10,15 a 20 000 daltonov a ich všeobecná štruktúra je zobrazená na obrázku 2-C.
4. Linker odvodený od močoviny
Toto reakčné činidlo bolo pripravené s molekulami PEG 5, 10 a 25 000 daltonov a všeobecná štruktúra je zobrazená na obrázku 2-D.
5. Uretánový linker
Boli pripravené uretánové linkery s molekulovou hmotnosťou 10 a 20 000 daltonov a štruktúra je zobrazená na obrázku 2-E.
6. Uretánový linker
Ako ukazuje štruktúra tohto komerčne pripraveného reakčného činidla PEG s molekulovou hmotnosťou 36 daltonov, zobrazeného na obrázku 2-G, jeden koniec reakčného činidla je zakončený t-butylovou skupinou. Toto reakčné činidlo bol PEG s najvyššou molekulovou hmotnosťou, použitý v tomto príklade.
7. Sulfanyluretánový linker
Štruktúru tohto pegylačného reakčného činidla je možné vidieť na obrázku 2-F. Molekulová hmotnosť PEG použitého v tomto reakčnom činidle bola 20 000 daltonov.
Nasledujúce reakčné činidlá boli poskytnuté Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo Japonsko : (1) G-CSF muteín označený GCSF muteín, GCSF muteín konjugovaný s reakčným činidlom metoxypolyetylénglykolom s vetveným reťazcom (m-PEG), obsahujúcim 2 reťazce m-PEG s molekulovou hmotnosťou buď 6 000, alebo 12 000 daltonov (PEG-GABA-NHS, pozri obrázok 2A), GCSF muteín konjugovaný s lineárnym reakčným činidlom ester/amid m-PEG (pozri obrázok 2B) s molekulovou hmotnosťou 5 000 a 10 000 daltonov. Reakčné činidlá m-PEG-sukcínimidylpropiónová kyselina-NHS (PEG-SPA) s molekulovými hmotnosťami 5 000,10 000,15 000 a 20 000 daltonov bola zakúpená od Shearwater Polymers (Huntsville, Alabama, pozri obrázok 2C). Nasledujúce reakčné činidla pre pegyláciu proteínov boli pripravené v Hoffmann La Roche, Inc: (1) linker m-PEG-močovina (5 000, 10 000 a 25 000 daltonov, pozri obrázok 2D), (2) linker m-PEG-uretán (5 000, 10 000 a 25 000 daltonov, pozri obrázok 2E), m-PEG-sulfanyluretánový linker (10 000 a 20 000 daltonov, pozri obrázok 2E) a t-butyl-m-PEG-uretánový linker s priemernou molekulovou hmotnosťou 36 000 daltonov bol získaný od DDI Pharmaceuticals, Inc. (Mountainview, CA, pozri obrátok 2G).
Pegylačné reakcie
Faktory, ktoré ovplyvňujú pegylačné reakcie sú (1) pH, (2) teplota, (3) čas reakcie, (4) molámy pomer proteínu k reakčnému činidlu PEG a (5) koncentrácia proteínu. Kontrolou jedného alebo viacerých z týchto faktorov je možné reakciu riadiť smerom k produkcii mono-, di-, tri- atď. PEG konjugátov. Napríklad reakčné podmienky pre reakčné činidlo Shearwater Polymers SPA-PEG 5000 (N-hydroxysukcínimid) boli: (1) pH
7,3, (2) teplota 4 °C pre mono-PEG a di-PEG, a teplota miestnosti pre tri-PEG, (3) čas reakcie 30 minút pre mono-PEG; 4 hodiny pre di-PEG a tri-PEG; a (4) molámy pomer proteínu k reakčnému činidlu 1 : 30. Pre všetky reakčné činidlá boli optimálne reakčné podmienky na prípravu požadovaného druhu PEG individuálne určené. Sú uvedené v tabuľke 1. Reakcia je ukončená okyslením reakcie a zmrazením na -20 °C.
Oddelenie modifikovaného a voľného GCSF muteínu z reakčnej zmesi (výmena katiónov na sulfopropylovej skupine (SP))
Reakčná zmes obsahujúca približne 5 mg proteínu bola zriedená 10 až 20x vodou a pH bolo upravené ľadovou kyselinou octovou na 4,5. Zriedené vzorky potom boli nanesené na vopred navrstvený 1 až 2 ml stĺpec Fractogel EMD SO - 650S (EM Separations, Gibbstown, New Jersey), ktorý bol v rovnováhe s 10 mM octanom amónnym, pH 4,5. Neadsorbované reakčné činidlo a vedľajšie produkty reakcie boli odstránené pri prietoku. Modifikovaný GCSF muteín bol vymytý pomocou stupňovitého gradientu, s použitím 0,15 M NaCl v rovnovážnom pufri.
Nemodifikovaný GCSF muteín, zostávajúci na stĺpci, bol eluovaný pomocou 0,5 M NaCl v rovnovážnom pufri. Rozdelená zmes PEG konjugátu GCSF muteínu bola sterilizovaná filtráciou pomocou 0,2 pm filtra a uložená zmrazením pri -20 °C.
Charakterizácia PEG konjugátov GCSF muteínu Určovanie proteínu
Koncentrácie proteínu v purifikovaných PEG konjugátoch GCSF muteínu boli zisťované pomocou A28o, ktorá sa rovná 0,86 v roztoku s koncentráciou 1 mg/ml.
Analýza pomocou SDS-PAGE
Táto analýza bola uskutočnená s použitím 12 % a 15 % polyakrylamidových gélov alebo 8 až 16 % polyakrylamidových gradientových gélov v redukčných podmienkach podľa Laemmliho, Náture 227: 680-685, 1970.
Určenie percentuálneho zloženia v prostriedku
Percentuálne zastúpenie každého druhu (mono-, di-, tri- atď.) v rôznych reakčných zmesiach PEG konjugátov GCSF muteínu bolo určované pomocou denzitometrických meraní SDS-PAGE gélov, zafarbených modridlom Coomassie (pozri tabuľku 2).
Určenie hmotnosti PEG v PEG konjugátoch GCSF muteínu
Celková hmotnosť PEG, substituovaného v rôznych prípravkoch, bola určovaná podľa priemernej molekulovej hmotnosti PEG, určenia jednotlivých PEG konjugátov (mono, di atď.) na základe elektroforetickej pohyblivosti, počtu pripojených molekúl PEG a na percentuálnom zastúpení, určenom na základe denzitometrických meraní SDS-PAGE gélov, zafarbených modridlom Coomassie. Celková hmotnosť PEG v určitom prípravku je súčtom hmotnosti jeho jednotlivých PEG. Hmotnosť jednotlivých PEG je spočítaná z nasledujúcej rovnice:
hmotnosť PEG = molekulová hmotnosť PEG x počet molekúl PEG x % obsahu, kde molekulová hmotnosť PEG = 5 000, 10 000,20 000 daltonov, počet molekúl PEG = 1, 2,3 a pre mono, di, prípadne tri.
Hmotnostná spektrometria (MALDI-TOF) bola taktiež používaná na určovanie celkovej hmotnosti PEG. V takomto prípade hmotnostné spektrum umožňovalo určenie molekulovej hmotnosti jednotlivých konjugátov PEG. Molekulová hmotnosť PEG pripojeného ku každému PEG konjugátu je sumou molekulových hmotností jednotlivých PEG konjugátov mínus molekulová hmotnosť GCSF muteínu (18 900 daltonov). Tieto hodnoty násobené percentuálnym zastúpením dávajú jednotlivé hmotnosti PEG; ich súčtom je celková hmotnosť PEG.
Obidve metódy boli použité na určovanie hmotnosti PEG v rôznych prípravkoch. Výsledky sú súhrne uvedené v tabuľke 2.
Určovanie hladín endotoxínov
Hladiny endotoxínov boli určované pomocou metódy LAL, podľa návodu výrobcu (Associates of Cápe Cod. Inc., Woods Hople, Massachusetts).
Biologické aktivity
Biologický test in vitro na bunkách M-NFS-60 a in vivo test na samici myšieho kmeňa C57BL/6J boli uskutočnené tak, ako bolo už opísané skôr (pozri Asano a kol., Jpn. Pharmacol. Ther. ( 1991) 19: 2767-2773).
Výsledky a diskusia
Pegylačné reakcie
Výsledky všeobecne ukazujú, že menej reaktívne reakčné činidlá, ako je linker odvodený od močoviny, vyžadujú vyššie pH, teplotu a molámy pomer proteín: reakčné činidlo a taktiež dlhší čas reakcie, aby bol dosiahnutý požadovaný rozsah konjugácie (pozri tabuľky 1 a 2).
Oddelenie modifikovaného a voľného GCSF muteínu z reakčnej zmesi
Typický elučný profil je ukázaný na obrázku 4. Okrem katiónovej výmennej chromatografie môžu byť vyžadované ďalšie kroky, ako je chromatografia na základe prestupovania gélom, aby boli odstránené stopy kontaminujúcich látok a endotoxínu a uskutočnená výmena pufŕa v konečnom produkte na uloženie. Boli vypracované účinné separačné metódy pomocou katiónovej výmeny pre rozsah 30 mg konjugátu, buď SP A (amidového) s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov a uretánového s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov. Týmto postupom sú získané takmer kvantitatívne výťažky.
Percentuálne zloženie a hmotnosť PEG
Výsledky zisťovania percentuálneho zloženia a hmotnosti PEG sú súhrnne uvedené v tabuľke 2. Podľa našich skúseností, v prípade konjugátov s vysokou molekulovou hmotnosťou (napr. 20 000 daltonov SPA diPEG a 12 000 daltonov GABA), určovanie percenta druhov PEG v reakčnej zmesi, založené na elektroforetickej pohyblivosti, nie je veľmi spoľahlivé. Na zistenie hmotnosti PEG a určenie vysokej molekulovej
SK 286898 Β6 hmotnosti a vysoko substituovaných PEG konjugátov sú potrebné kombinácie analýz SDS-PAGE, SP-HPLC a MALDI-TOF MS. Ale monopegylované konjugáty a konjugáty PEG, odvodené od reakčných PEG činidiel s nízkou molekulovou hmotnosťou (napr. 5 000 daltonov), môžu byť určené celkom presne podľa ich SDSPAGE profilov.
Hladiny endotoxínu
Pomocou metódy LAL bolo detekované < 1 EU/mg endotoxínu vo všetkých PEG konjugátoch, okrem jedného, odvodeného pomocou uretánového reakčného činidla. V tomto PEG konjugáte bol endotoxín detekovaný iba po zriedenie. Bolo potvrdené, že toto nie je spôsobené kontamináciou počas riedenia a preto nejaký neznámy materiál v tejto vzorke mohol, pri vyššej koncentrácii proteínu, spôsobovať inhibíciu v LAL teste. Po zriedení vzorky a tým aj zriedení inhibujúceho materiálu, bol pozorovaný pozitívny výsledok na endotoxín.
Biologická aktivita
In vitro a in vivo biologické aktivity všetkých PEG konjugátov GCSF muteínu sú uvedené v tabuľke 2. Všeobecne bol pozorovaný inverzný vzťah medzi in vitro aktivitou a stupňom substitúcie a taktiež molekulovou hmotnosťou PEG. Na rozdiel od tohto je so zvyšujúcou molekulovou hmotnosťou substituovaného PEG pozorované zvýšenie in vivo aktivity. Tento jav je taktiež pozorovaný inými autormi (Satako-lshikawa, a kol., Celí Struct. Funct. 17(3) : 157-60, 1992). Je vyslovený predpoklad, že chemické pripojenie molekúl PEG k polypeptidovej kostre GCSF muteínu spôsobuje nejaké konformačné zmeny, ktoré záporne ovplyvňujú interakcie receptor/ligand a tým znižujú väzbovú afinitu. Ďalej relatívne krátky čas inkubácie pri in vitro teste pravdepodobne nepostačuje na dosiahnutie vrcholu aktivity. Na druhej strane in vivo test na myšiach je oveľa dlhší (dni) a je ukončený niekoľko dní po injekcii lieku. Tento dlhší inkubačný čas, spojený s predĺženým polčasom pretrvania PEG-GCSF muteínu v krvnom obehu, kompenzujú akúkoľvek stratu väzbovej aktivity, spôsobenú pegyláciou. Konečným výsledkom je dosiahnutie maxima biologickej aktivity in vivo. Inou hypotézou je, že PEG-GCSF muteín pôsobí, keď je podaný injekčné myši, ako prekurzor lieku. Za takejto situácie je PEG zložka PEG-GCSF muteínu nejakým spôsobom odštiepovaná, čo má za následok trvalé uvoľňovanie malých množstiev voľného GCSF muteínu, čím sa vysvetľuje udržiavanie a zvyšovanie in vivo aktivity. Ale hypotéza liekového prekurzora nevysvetľuje základnú úroveň aktivity in vivo, 7 dní po podaní pôvodnej dávky. Mechanizmus liekového prekurzora je nepravdepodobný, pretože amidová väzba medzi proteínom a PEG je stabilná a nie je možné ľahko ju rozštiepiť.
Medzi 15 študovanými PEG konjugátmi GCSF muteínu boli in vivo aktivity P-12GA-1, SPA s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov, uretánového s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov a uretánového s molekulovou hmotnosťou 36 000 daltonov výrazne vyššie ako pri zostávajúcich preparátoch (pozri obrázok 4 a tabuľku 2).
Všeobecne je možné povedať, že je pozorovaný priamy vzťah medzi molekulovou hmotnosťou molekuly PEG a zvýšenou aktivitou in vivo. Toto je zobrazené na obrázku 5, kde je zvýšenie počtu PMN vyjadrené ako funkcia celkovej hmotnosti PEG konjugátov, viazaných pomocou amidu (SPA) a PEG konjugátov viazaných pomocou linkera odvodeného od močoviny.
Výber a charakteristiky PEG konjugátov GCSF muteínu
Po starostlivom zhodnotení chemického princípu konjugácie, biologických vlastností a liečivých vlastností v 15 PEG konjugátoch, boli tri z nich vybrané na ďalšie hodnotenie, a to: (1) P-12GA-1, (2) SPA s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov a (3) uretánový s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov. Pomocou SPA odvodené mono, di a triPEG konjugáty s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov, prítomné v SP-purifikovanej reakčnej zmesi, boli hodnotené vzájomným porovnávaním a ukázalo sa, že všetky tri udržiavali vysokú aktivitu granulocytov pri samiciach myšieho kmeňa C57BL/6J počas 5 dní po jednej dávke
25,2 pg (tabuľka 3 a obrázok 4). Naopak, na udržanie podobnej aktivity boli nutné každodenné dávky nemodifikovaného GCSF muteínu (údaje nie sú ukázané). Vo všetkých prípadoch okrem dvoch (SPA s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov a P-12GA-1) sa in vivo aktivita vrátila na normálnu úroveň na siedmy deň po počiatočnej dávke podanej myši (obrázok 6). Tak SPA konjugát s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov, ako i konjugát P-12GA-1 mali zvýšenú aktivitu pri nižšom dávkovaní 8,4 pg a vrátili sa do normálnej úrovne na siedmy deň po počiatočnej dávke (pozri tabuľka 3). Údaje o percentuálnom zložení (tabuľka 3) ukazujú, že prípravky tak SPA konjugátu s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov, ako konjugátu P-12GA-1 obsahujúci približne 50 % diméru a zvyšných 50 % je rozdelených medzi monomér a trimér. Uretánové reakčné činidlo s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov produkuje pri použitých reakčných podmienkach (pozri tabuľka 3) prevažne mono-PEG deriváty. In vitro aktivita všetkých hodnotených PEG konjugátov, vrátane prevládajúceho monomémeho uretánového derivátu, sleduje všeobecnú nepriamu úmernosť k stupňu substitúcie a teda rovnako k molekulovej hmotnosti PEG. In vivo biologická aktivita hodnotených
SK 286898 Β6
PEG konjugátov mala priamu úmernosť k molekulovej hmotnosti PEG v celom hodnotenom rozsahu molekulových hmotností (obrázok 5).
Závery
Medzi skúšanými 15 PEG konjugátmi GCSF muteínu mali dobré profily in vivo aktivity P-12GA-1, SPA s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov a uretánový s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov. Najlepšie všeobecné vlastnosti, vrátane hospodárnosti produkcie, mal PEG-GCSF muteín s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov.
Tabuľka 1
Reakčné podmienky použité na prípravu rôznych PEG konjugátov
Molekulová hmotnosť Chemický typ Reakčné podmienky
pH Teplota Doba Pomer
5000 močovina 10 teplota miestnosti 1 hodina 1.100
5000 amid 7,3 teplota miestnosti 4 hodiny 1:30
10 000 močovina 10 teplota miestnosti 1 hodina 1:100
10 000 amid 7,3 teplota miestnosti 4 hodiny 1:30
10 000 uretán 10 4°C 1 hodina 1:30
15 000 amid 7,3 teplota miestností 4 hodiny 1:30
20 000 amid 7,3 teplota miestnosti 4 hodiny 1:30
20 000 sulfanyluretán 8 teplota miestnosti 17 hodín 1:30
20 000 uretán 10 4’C 1 hodina 1:30
25 000 močovina 10 teplota miestnosti 1 hodina 1:100
36 000 _ uretán 8 4°C 6 hodín 1:3 i
Tabuľka 2
Zloženie, hmotnosť PEG a údaje o biologickej aktivite rôznych konjugátov PEG-GCSF muteínu
Aktivity
Typ linkeru mono ·% zloženie ai tri oligo • Hmotnosť pridaného PEG M-NFS-60 WBC PMN ; (% kontroly)
Am.d
5000 17.3 22,3 51,3 9.1 12 600“ 9% 22,48 536*40
3' 5000 0 0 0 100 20 000 5% 18,65 539+23 :
IS! 10 000 9.8 63 27,2 0 21 700“ 11% 20,48 632+82
.a· 10 000 10 11 53 26 29 500 4% 20,13 701+92 í
b -5 000 13,7 61,2 25,1 0 31 710 6% 26,68 751+115
c 20 000 27,6 49,5 22,9 0 38100·* 5% 29,23 977+120
Močovina
ta) 5000 29 19 23 23 11 350 40% 12,78 254+27
ta) 10 000 29 19 23 23 22 800 42% 14,4 364+50
tb'25 000 24,7 15,4 41,6 18.7 63 775 6% 27.78 716+87 i
Uretán
iD) 10 000 15,8 12,8 36.5 35 29 050 10% 19,9 412+88
ic> 20 000 81,8 4 14,2 0 28 800·“ 7% 25,83 656+52
<31 36 000 50 50 0 0 54 000 15% 25,05 888+132
s-ľanyluretán
tb) 20 000 70,8 12 17,3 0 28 440 20% 21,85 494+71
3A5A
b> 5000 43.4 54.3 2,3 0 18100 11% 29 598*117
,0' 12 000 36 47 17 0 4© 500“ 3% 30,03 886+120
% zloženia a hmotnosť pridaného PEG sú vypočítané na základe denzitometrických meraní SDS-PAGE gélov, zafarbených modridlom Coomassie (*) alebo pomocou MALDI-TOF hmotnostnej analýzy (**) (a) (b) (c) každý predstavuje samostatný biologický test; sú uvedené rôzne údaje o PMN z 5. dňa
Tabuľka 3
Zloženie, hmotnosť, pegylované miesta a údaje o biologickej aktivite troch hlavných
Aktivity I
Ja ’% zloženie PEG mono di tri oltgo Hmotnosť PEG M-NFS- 60 WBC PMN (% kontroly)
(daltonú)
5. deň 7. deň 5. deň 7. deň
Nosič ^kontrola) 8,75 8,97 100 100
ND 26 jedna injekcii25,2 pg 8,05 6.1 86 76
2S injekcia 25.2 P9 denné 26,5 24,58 1182 906
Dávka
8.4 pg 25,2 pg 8,4 pg 25,2 pg 8,4 pg 25,2 pg 8,4 pg 25,2 pg
12 000 36.0 47.0 17.0 0.0 46,5 3% 22,75 30,03 10,7 24,1 701 1064 140 556
GA3A
20 000 27.6 49,5 22,9 0.0 38,1 5% 13,58 21,63 7,5 15,45 519 978 103 447
SrA
|
20 000 81.8 4,0 14,2 0,0 28,8 7% 8,35 17,43 6,76 7,93 222 729 74 119
uretan — —I
Samiciam myšieho kmeňa C57BL/6J bolo podávané 8,4 alebo 25,2 buď ND-28 denne, alebo jedna dávka PEG konjugátu. Na piaty a siedmy deň od začiatočnej dávky boli odobrané vzorky žilovej krvi a bola uskutočnená diferenciálna analýza leukocytov.
♦ Na základe denzitometrických meraní SDS-PAGE farbenej modridlom Coomassie ** Určované pomocou MALDITOF MS
Príklad 2 : Príprava PEG s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov konjugovaného s rhG-CSF muteínom
Modifikácia G-CSF muteínu pomocou metoxy-PEG sukcínimidylpropiónovej kyseliny (SPA) bola uskutočnená nasledujúcim spôsobom. Reakčné činidlo PEG bolo rozpustené v destilovanej vode na koncentráciu ~200 mg/ml a pridané do roztoku G-CSF muteínu (~ mg/ml) v molámom pomere od 4 : 1 až 6 : 1 (nadbytok reakčného činidla). Reakcia sa uskutočňovala pri 4 až 8 °C počas 20 hodín pri pH ~7,5. Na konci reakcie bola pridaná ľadová kyselina octová, ktorá reakciu ukončila. Pegylovaný GCSF muteín (taktiež označovaný ako PEGG) bol potom vyčistený od zostatkového nemodifikovaného muteínu, nadbytku reakčného činidla PEG a iných nečistôt a zložiek pufra, prítomných počas modifikácie. Spolu s pegylovaným proteínom ako vedľajšie produkty vznikajú N-hydroxysukcínimid a polyetylénglykolkarboxylová kyselina.
PEGG bol vyčistený pomocou katiónovej výmennej chromatografie, po ktorej nasledovala ultrafiltrácia. Stĺpec pre katiónovú výmennú chromatografiu bol navrstvený a premytý v 20 mM octanu sodnom, pH 4,0. Elúcia pomocou lineárneho gradientu chloridu sodného oddelila PEGG od všetkých iných zložiek v reakčnej zmesi. Následne bola použitá ultrafiltrácia/diafiltrácia na skoncentrovanie PEGG na koncentráciu ~4,0 mg/ml a výmenu pufra za 20 mM octan sodný, 50 mM chlorid sodný, pH 6,0.
Päť pegylačných a purifikačných cyklov, uskutočnených v uvedených podmienkach, bolo analyzovaných pomocou katiónovej výmennej chromatografie a ukázalo sa, že pegylačná reakcia G-CSF muteínu je reprodukovateľná. Ukázalo sa, že pegylačná reakcia je reprodukovateľná až do množstva 2,5 g na reakciu (konečný výťažok PEGG), za nasledujúcich optimálnych podmienok: pomer SPA-PEG s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov : muteínu 4 až 6:1; pH -7,5, 4 °C, 20 hodín. Bolo zistené, že priemerné percentuálne zloženie zmesí PEGG bolo 21,7 % mono-PEGG (% RSD=16,6), 60,3 % di-PEGG (% RSD=6,6), 15,1 % tri-PEGG (% RSD=4,0) a 2,9 % tetra-PEGG (% RSD=26,1), ako je ukázané v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Relatívne percentuálne zloženie mono, di, tri a tetra-PEGG v piatich PEGG syntézach a purifikačných cykloch, zisťované analýzou pomocou výmeny katiónov
Číslo syntézy Mono-PEGG (%RSD, päť meraní) Di-PEGG (%lTri-PEGG (% I Tetra-PEGG RSD, pat'RSD, pat’i (% RSD, päť
meraní) meraní) meraní)
1 21,9% (8,0) 60,3 % (2,2) 15,1 % (2,2) 2,7 % (4.7)
2 27,5% (2,3) 54,4% (1,0) 15,7 % (0,8) 2,4 % (1,2)
3 18,2% (7,1) 65,5 % (0,6) 14,3 % (6,6) 2,0 % (9.3)
4 21,7% (2,7) 60,1 %(1,0) 14,8 % (0,5) 3,5 % (0.9)
5 19,2% (1,8) 61,3% (0,9) 15,7 % (3,7) 3,8 % (4,5)
Priemerné zloženie 21,7%(16,6) 60,3 % (6,6) 15,1 %(4,0) 2,9% (26,1)
Príklad 3 : Mobilizácia kmeňových buniek periférnej krvi
Boli vyvinuté techniky, ako mobilizovať tak primitívne kmeňové bunky, ako aktívne prekurzory z kostnej drene a zvýšiť počet cirkulujúcich zárodkových buniek v periférnej krvi. Tieto stimulované bunky môžu byť schopné sprostredkovať včasné aj trvalé prijatie sa štiepu po smrteľnom ožiarení a transplantátov kostnej drene alebo kmeňových buniek. Neben, S. Marcus, K. a Mauch P.: Mobilizácia subpopulácií krvných kmeňových a zárodkových buniek kostnej drene do krvi po cyklofosfamide a/alebo faktora stimulujúceho kolónie granulocytov. Blood 81: 1960 (1993). Doplňovanie kmeňových buniek periférnej krvi (PBSC) môže pomôcť skrátiť zotavenie krvitvorby pacientov, ktorým bolo chemoterapiou spôsobené nedostatočné vyvinutie kostnej drene alebo tých pacientov, ktorí prekonali iný typ odstránenia kostnej drene. Roberts, A.W. a Metcalf D.: Faktor stimulujúci kolónie granulocytov indukuje selektívne zvýšenie počtu zárodkových buniek v periférnej krvi myší. Experimental Hematology 22: 1156 (1994). Na stimulovanie mobilizácie boli použité tak rastové faktory, ako chemoterapeutické lieky. Bodine, D.: Mobilizácia kmeňových buniek periférnej krvi: : tam kde je dym, je i oheň ? Experimental Hematology 23: 293 (1995). Po stimulovaní PBSC boli mobilizované bunky odobraté oddelením leukocytov od krvi a udržiavané v zmrazenom stave dovtedy, pokiaľ budú potrebné. Terajšie klinické protokoly požadujú opakované odbery koncentrátov PBSC oddelením leukocytov od krvi, po štandardnej chemoterapii vysokými dávkami (CHT) a opakované denné dávkovanie kontinuálnou infúziou s rastovými faktormi, niekedy trvajúce dva týždne alebo dlhšie. Brugger, W., Bross, K., Frisch, J. Dem, P. Mertelmann, R. a Kanz, L.: Mobilizácia zárodkových buniek periférnej krvi opakovaným podávaním interleukínu-3 a faktora stimulujúceho kolónie granulocytov-makrofágov po polychemoterapii etoposidom, ifosfamidom a cis-platinou. Blood 79: 1193 (1992). Štúdie opísané ďalej boli uskutočnené s dvoma myšími modelmi mobilizácie PBSC, prvý model sú normálne myši a ako druhý bol použitý myší chemoterapeutický model. Pokusy ukázali, v zhode s týmto vynálezom (PEGG), zvýšenú účinnosť pegylovaného G-CSF muteínu v porovnaní s NEUPOGÉNOM (G-CSF), pri ovplyvňovaní mobilizácie kmeňových buniek. Bola taktiež potvrdená prednosť pegylovaného muteínu v tom, že je významne znížené a oveľa účinnejšie dávkovanie.
Tieto štúdie hodnotili zvýšenú schopnosť mobilizovaných nezrelých myších PBSC, stimulovaných in vitro pomocou mnohých rastových faktorov, sedemdňovým testom kolónií na agare. Ďalej, okrem schopnosti vytvárať kolónie, bol zisťovaný v krvi všetkých myší kompletný hematologický profil a boli hodnotené absolútne počty neutrofilov (ANC). Taktiež boli určované hladiny G-CSF v sére. Po optimalizácii testu bolo urobených niekoľko časových pokusov, kedy boli hodnotené vysoké a nízke dávky G-CSF. Pokusné modely zahrnovali G-CSF a cyklofosfamidom Cytoxanom-indukovanú mobilizáciu a taktiež kombináciu liečenia pomocou tak CHT, ako cytokínu.
Materiál a metódy
Vo všetkých týchto pokusoch boli použité samice myšieho kmeňa BL/6J staré 6 až 10 týždňov, kúpené od The Jackson Laboratory. Myšiam bolo v deň -1 intraperitoneálne podané buď 200 mg/kg Cytoxanu, alebo samotný nosič, t. j. fosforečnanom puftovaný fyziologický roztok (PBS). V deň 0 bolo zvieratám podané podkožné 0,1 ml buď Neupogenu (GCSF), PEGG (pomocou SPA s molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov pegylovaný muteín, šarža #P20W3), alebo nosič PBS, obsahujúci 1 % normálne myšie sérum. Myši, ktorým bol podaný Neupogen, dostávali denne injekcie s rovnakou dávkou, zatiaľ čo všetky ostatné myši dostávali nosič. V deň zabitia bola myšiam pri anestézii odobratá žilná krv z dutiny za očnicou do skúmaviek obsahujúcich EDTA. V každej skupine bol malý objem spojenej celej krvi pridaný k trom paralelným, 35 mm2 tkanivovým miskám, obsahujúcim 1 000 U/ml rekombinantného myšieho (rm) interleukmu-3, 100 ng/ml rekombinatného myšieho faktora kmeňových buniek a 1 000 U/ml rekombinatného myšieho interleukínu-6 v celkovom objeme 1 ml média RPMI1640, doplneného 15 % fetálneho hovädzieho séra a 0,35 % agaru Difco. Kultúry na tuhom agare boli inkubované počas 1 týždňa pri 37 °C vo vlhkej atmosfére vzduchu s 5 % COj. Kolónie boli počítané pomocou pitevného stereomikroskopu.
Výsledky : V prvej uvedenej štúdii dostávali normálne myši denne injekcie 25 pg/myš Neupogenu v dňoch 0 až 5 alebo 1 injekciu 25 pg/myš PEGG v deň 0. Myši boli utratené v dňoch 3 až 7. Ako je vidieť na obrázku 7, mobilizácia predstavovaná vytváraním kolónií bola zreteľne zvýšená v dňoch 3 a 4 pri myšiach, ktorým bol injekčné podávaný Neupogén, ale začala sa na 5. deň postupne vracať na pôvodnú úroveň (cez injekciu Neupogénu na 5. deň). Na druhej strane myši, ktorým bol podaný PEGG, mali oveľa vyšší počet kolónií a na tejto hladine sa udržali počas 7. dňa.
V chemoterapeutickom modeli bol získaný podobný typ výsledku. Myši v CHT skupinách dostali injekciu Cytoxanu v deň -1. Niektoré myši potom dostávali v nasledujúcich dňoch iba nosič, zatiaľ čo iné dostávali kombinované liečenie buď denné injekcie Neupogénu v dňoch 0 až 5, alebo jednu injekciu PEGG v deň 0. Obrázok 8 ukazuje, že vrcholné hodnoty boli pri myšiach liečených Cytoxanom dosiahnuté na 4. deň a potom v nasledujúcich dňoch nastal postupný návrat na základnú úroveň. Tak skupina s Neupogénom, ako skupina s PEGG, dosiahli vrcholné hodnoty na 5. deň a mali veľmi zvýšené počty kolónií. Ale úroveň v skupine Cytoxan + PEGG zostala počas 6. a 7. dňa veľmi významne zvýšená v porovnaní s úrovňou skupiny Cytoxan + + Neupogén. Obrázok 9 ukazuje synergický účinok kombinovaného liečenia v porovnaní s liečením pomocou samotného Cytoxanu alebo G-CSF.
Druhá štúdia je ukázaná na obrázkoch 10 a 11. Normálne myši, dostávajúce denne injekcie nižšej dávky Neupogénu (3 pg/myš) počas 10 po sebe nasledujúcich dní, mali iba relatívne nízku hladinu mobilizácie počas testovaného časového obdobia. Zvieratá, ktorým bola injekčné podaná jedna dávka PEGG (3 pg/myš), vykazovala na 4. deň približne 5x vyšší počet mobilizovaných zárodočných buniek v periférnom obehu, hoci výsledkom bolo jednorazové zvýšenie, ktoré v podstate počas šiestich dní pominulo.
Myšiam, ktorým bol injekčné podávaný Cytoxan, jedna dávka PBSC (3 pg/myš) indukovala asi zodpovedajúce množstvo mobilizovaných PBSC ako Neupogén (30 pg/myš), podávaný injekčné v 10 dňových dávkach 3 pg/deň (obrázok 11). Obidve skupiny mali najvyššiu mobilizáciu zárodočných buniek na piaty deň a veľkosť vrcholných hodnôt bola totožná. Jediný rozdiel sa zdal byť v trochu dlhšie doznievajúcom účinku Neupogénu. Počty kolónií v CHT myšom modeli boli 4 až lOx vyššie ako ich počty v normálnom myšom modeli.
Tieto pokusy ukazujú dve rôzne potenciálne výhody pegylovaného muteínu pred Neupogénom Po prvé je zrejmá vyššia účinnosť PEGG v porovnaní s Neupogénom v schopnosti indukovať mobilizáciu PBSC a to tak pri normálnych, ako pri myšiach liečených chemoterapiou. Po druhé bolo ukázané, že pegylovaný muteín je pri myšiach účinnejší ako Neupogén a je možné použiť účinnejší dávkovací režim so zníženými dávkami, ako tie, ktoré sú bežne používané pri klinických produktoch.

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fyziologicky aktívny konjugát všeobecného vzorca (I)
    RO(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH· (I), t ý m, že Rje metyl.
    t ý m , že n je 450 až 490.
    t ý m, že m je celé číslo od 1 do 4. tým, že m je 2.
    t ý m, že faktorom stimulujúcim kolónie granus a s a s a s a s a vyznačujúci sa tým, že G je faktor stimulujúci kolónie granulocytov bez svojej amínovej skupiny alebo skupín, ktoré vytvárajú amidovú väzbu s polyetylénglykolovou zložkou v konjugáte; Rje nižší alkyl, ktorý má 1 až 6 atómov uhlíka; n je celé číslo od 240 do 550 a m je celé číslo od 1 do 5.
  2. 2. Konjugát podľa nároku 1,vyznačuj úci
  3. 3. Konjugát podľa nároku 2, vyznačuj úci
  4. 4. Konjugát podľa nároku 2, vyznačujúci
  5. 5. Konjugát podľa nároku 2, vyznačujúci
  6. 6. Konjugát podľa nároku 1, vyznačujúci locytov je GCSF muteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1.
    Ί. Konjugát podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že n je 450 až 490.
  7. 8. Konjugát podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že m je celé číslo od 1 do 4.
  8. 9. Konjugát podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že m je 2.
  9. 10. Konjugát podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov je GCSF muteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1.
  10. 11. Konjugát podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že má dlhší polčas cirkulovania v krvnom obehu a vyššiu in vivo aktivitu stimulovania granulocytov ako zodpovedajúci nekonjugovaný faktor stimulujúci kolónie granulocytov.
  11. 12. Konjugát podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov je GCSF muteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1.
  12. 13. Fyziologický aktívny konjugát všeobecného vzorca (I)
    O
    II
    RO(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH (i), vyznačujúci sa tým, že R je metyl; n je celé číslo od 450 do 4 900; m je 2 a G je GCSF muteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1 bez svojich amínových skupín, ktoré vytvárajú amidovú väzbu s polyetylénglykolovou zložkou v konjugáte.
  13. 14. Prostriedok obsahujúci fyziologicky aktívne konjugáty všeobecného vzorca (I)
    O
    Γ ll 1
    RO(CH2CH2O)nCH2CH2-C-NH-m
    G (i), vyznačujúci sa tým,žeGv každom z konjugátov je faktor stimulujúci kolónie granulocytov bez svojej aminovej skupiny alebo skupín, ktoré vytvárajú amidovú väzbu s polyetylénglykolovou zložkou v konjugátoch; R je v každom z konjugátov nezávisle nižší alkyl, ktorý obsahuje 1 až 6 atómov uhlíka; n je v každom z konjugátov nezávisle celé číslo od 420 do 550; v každom z konjugátov je m nezávisle celé číslo od 1 do 4; percento konjugátov, kde m je 1, je od 18 do 25 %; percento konjugátov, kde m je 2, je od 50 do 66 %; percento konjugátov, kde m je 3, je od 12 do 16 % percent a percento konjugátov, kde m je 4, je až 5 %.
  14. 15. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci tyl.
  15. 16. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci rovnaké.
  16. 17. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci
  17. 18. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci rom stimulujúcim kolónie granulocytov GCSF mutem, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1.
  18. 19. Prostriedok obsahujúci fyziologicky aktívne konjugáty všeobecného vzorca (I) tým,žeRjev každom z konjugátov metým,ženaRsúv každom z konjugátov t ý m , že n je 450 až 490.
    t ý m , že v každom z konjugátov je faktovyznačujúci sa tým, že R je metyl; n je v každom z konjugátov rovnaké a je to celé číslo od 450 do 490; G je GCSF muteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1 bez svojich amínových skupín, ktoré vytvárajú amidovú väzbu s polyetylénglykolovou zložkou v konjugáte; v každom z konjugátov je m nezávisle celé číslo od 1 do 4; percento konjugátov, kde m je 1, je od 18 do 25 %; percento konjugátov, kde m je 2, je od 50 do 66 %; percento konjugátov, kde m je 3, je od 12 do 16 % a percento konjugátov, kde m je 4, je až 5 %.
  19. 20. Spôsob prípravy konjugátu PEG-GCSF, ktorý má dlhší polčas cirkulovania v obehu a vyššiu in vivo aktivitu stimulovania granulocytov ako zodpovedajúci nekonjugovaný GCSF, vyznačujúci sa t ý m, že pozostáva z kovalentného pripojenia reakčného činidla všeobecného vzorca (II) (H), kde Rje nižší alkyl, ktorý má 1 až 6 atómov uhlíka, ku GCSF a vytvoreniu konjugátu.
  20. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že GCSF je GCSF muteín, ktorý má sekvenciu uvedenú na obrázku 1.
SK1035-2001A 1999-01-29 2000-01-19 Fyziologicky aktívny konjugát, prostriedok a spôsob prípravy SK286898B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11791799P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US2000/001264 WO2000044785A1 (en) 1999-01-29 2000-01-19 Gcsf conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK10352001A3 SK10352001A3 (sk) 2002-06-04
SK286898B6 true SK286898B6 (sk) 2009-07-06

Family

ID=22375505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1035-2001A SK286898B6 (sk) 1999-01-29 2000-01-19 Fyziologicky aktívny konjugát, prostriedok a spôsob prípravy

Country Status (26)

Country Link
US (4) US20030130193A1 (sk)
EP (1) EP1157037B1 (sk)
JP (1) JP2002540065A (sk)
KR (1) KR100689212B1 (sk)
CN (1) CN1376164A (sk)
AT (1) ATE246202T1 (sk)
AU (1) AU2618500A (sk)
BG (1) BG65213B1 (sk)
BR (1) BR0007781A (sk)
CA (1) CA2361766C (sk)
CZ (1) CZ300546B6 (sk)
DE (1) DE60004172T2 (sk)
DK (1) DK1157037T3 (sk)
EA (2) EA200400067A1 (sk)
ES (1) ES2204509T3 (sk)
HK (1) HK1049673A1 (sk)
HU (1) HU228488B1 (sk)
IL (1) IL144361A0 (sk)
MX (1) MXPA01007609A (sk)
NO (1) NO331787B1 (sk)
NZ (1) NZ513113A (sk)
PT (1) PT1157037E (sk)
RS (1) RS50928B (sk)
SK (1) SK286898B6 (sk)
WO (1) WO2000044785A1 (sk)
ZA (1) ZA200105932B (sk)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2204509T3 (es) * 1999-01-29 2004-05-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de gcsf.
US6831158B2 (en) 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
AU2001290312A1 (en) 2000-10-16 2002-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
DK1578771T3 (da) * 2001-10-10 2013-06-10 Novo Nordisk As Remodellering og glycokonjugering af peptider
EP2322229B1 (en) * 2001-10-10 2016-12-21 Novo Nordisk A/S Remodeling and glycoconjugation of Factor IX
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
CN1608079A (zh) * 2001-11-20 2005-04-20 法玛西雅公司 化学修饰的人生长激素缀合物
EP1526872A1 (en) 2002-07-24 2005-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives
US7695723B2 (en) 2002-12-31 2010-04-13 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7785601B2 (en) 2002-12-31 2010-08-31 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
EP1667706A4 (en) * 2003-08-22 2009-06-24 Queensland Inst Med Res G-CSF DERIVATIVE FOR INDUCING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
US20060174362A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-03 Origen Therapeutics, Inc. Long-term culture of avian primordial germ cells (PGCs)
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
MX2007015156A (es) 2005-06-01 2008-02-15 Maxygen Holdings Ltd Polipeptidos g-csf pegilados y metodos para la produccion de los mismos.
BRPI0611872B8 (pt) 2005-06-16 2021-05-25 Nektar Therapeutics reagente polimérico, conjugado, método para preparação de um conjugado e composição farmacêutica
CN101257926A (zh) * 2005-08-04 2008-09-03 尼克塔治疗亚拉巴马公司 G-csf部分与聚合物的轭合物
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
JP2007112924A (ja) * 2005-10-21 2007-05-10 National Institute For Materials Science 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CN101002943B (zh) * 2006-01-17 2012-02-01 中国科学院过程工程研究所 支链peg-gcsf和peg-gmcsf结合物及其制备方法
US20080274958A1 (en) 2006-07-21 2008-11-06 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
ITMI20061624A1 (it) 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
US20100316631A1 (en) * 2006-10-19 2010-12-16 The Uab Research Foundation Water Soluble Curcumin-Based Compounds
KR101079993B1 (ko) * 2006-11-17 2011-11-04 동아제약주식회사 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
JP2008125952A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 National Institute For Materials Science 複合架橋体
CN101245109B (zh) * 2007-02-12 2011-12-14 杭州九源基因工程有限公司 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法
NZ580030A (en) 2007-04-03 2012-06-29 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
AR067537A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CN101352573B (zh) * 2007-07-27 2011-02-09 杭州九源基因工程有限公司 聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体
US8629104B2 (en) 2008-02-18 2014-01-14 Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. G-CSF and water-soluble polymer conjugate
KR101582841B1 (ko) 2008-02-27 2016-01-11 노보 노르디스크 에이/에스 콘쥬게이트된 인자 ｖｉｉｉ 분자
RU2409669C9 (ru) 2008-08-18 2012-05-27 ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами
CA2736141C (en) 2008-09-23 2018-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
US9587006B2 (en) 2010-02-11 2017-03-07 Hoffmann-La Roche Inc. IGF-I poly (ethylene glycol) conjugates
JP5735650B2 (ja) 2010-09-14 2015-06-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｐｅｇ化エリスロポエチンを精製するための方法
US8889630B2 (en) 2011-12-23 2014-11-18 Carlos Lopez Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor
KR20220158870A (ko) 2016-07-15 2022-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법
RU2020113060A (ru) 2017-10-11 2021-11-12 Эланко Юс Инк. Варианты свиного g-csf и их применение
SG11202005952TA (en) 2017-12-29 2020-07-29 Hoffmann La Roche Process for providing pegylated protein composition
WO2019129876A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
WO2019129877A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1609546A (en) * 1925-11-19 1926-12-07 Petroleum Rectifying Co Process of separating water from emulsions
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
DE3380726D1 (en) * 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4514497B1 (en) * 1983-12-30 1998-02-24 Novagene Inc Modified live pseudorabies viruses
JPS61227526A (ja) * 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
US5532341A (en) * 1985-03-28 1996-07-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5194592A (en) * 1986-12-23 1993-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6166183A (en) * 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5372808A (en) * 1990-10-17 1994-12-13 Amgen Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
KR0176625B1 (ko) * 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
ES2204509T3 (es) * 1999-01-29 2004-05-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de gcsf.

Also Published As

Publication number Publication date
CZ300546B6 (cs) 2009-06-10
CN1376164A (zh) 2002-10-23
ZA200105932B (en) 2002-10-18
DE60004172D1 (de) 2003-09-04
EP1157037B1 (en) 2003-07-30
ATE246202T1 (de) 2003-08-15
HU228488B1 (en) 2013-03-28
PL363117A1 (en) 2004-11-15
DE60004172T2 (de) 2004-04-22
HUP0203652A3 (en) 2005-01-28
BG105851A (en) 2002-06-28
YU54301A (sh) 2003-10-31
AU2618500A (en) 2000-08-18
CZ20012654A3 (cs) 2002-05-15
DK1157037T3 (da) 2003-11-24
US20070219356A1 (en) 2007-09-20
HK1049673A1 (zh) 2003-05-23
EA200400067A1 (ru) 2004-04-29
IL144361A0 (en) 2002-05-23
CA2361766C (en) 2011-12-06
CA2361766A1 (en) 2000-08-03
WO2000044785A1 (en) 2000-08-03
PT1157037E (pt) 2003-12-31
MXPA01007609A (es) 2003-06-24
EA200100838A1 (ru) 2002-04-25
NO20013700L (no) 2001-09-25
BG65213B1 (bg) 2007-07-31
KR100689212B1 (ko) 2007-03-09
NZ513113A (en) 2004-03-26
NO331787B1 (no) 2012-04-02
BR0007781A (pt) 2002-02-05
EP1157037A1 (en) 2001-11-28
EA004685B1 (ru) 2004-06-24
US20050196378A1 (en) 2005-09-08
KR20020007296A (ko) 2002-01-26
US20030130193A1 (en) 2003-07-10
SK10352001A3 (sk) 2002-06-04
HUP0203652A2 (hu) 2003-03-28
ES2204509T3 (es) 2004-05-01
RS50928B (sr) 2010-08-31
US20080287659A1 (en) 2008-11-20
JP2002540065A (ja) 2002-11-26
NO20013700D0 (no) 2001-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK286898B6 (sk) Fyziologicky aktívny konjugát, prostriedok a spôsob prípravy
JP2989002B2 (ja) 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
JP3747070B2 (ja) 改良型インターフェロン−ポリマーコンジュゲート
EP0862455B1 (en) Interferon-polymer conjugates and process for preparing the same
US7893019B2 (en) G-CSF site-specific mono-conjugates
JP5334347B2 (ja) 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法
US20040030101A1 (en) Interferon conjugates
WO2006094530A1 (en) Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
JP2008543304A (ja) ヒト顆粒球コロニー刺激因子イソ型（ＨｕｍａｎＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒＩｓｏｆｏｒｍｓ）
EP1834963A1 (en) Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
US8629104B2 (en) G-CSF and water-soluble polymer conjugate
AU2004233543B2 (en) GCSF Conjugates
US20040204566A1 (en) Chemically-modified G-CSF
EP1369429A1 (en) GCSF conjugates
EP1869079A2 (en) Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
KR20180017104A (ko) Peg화된 과립세포 콜로니 자극 인자(gcsf)
PL203462B1 (pl) Fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF
KR20130137966A (ko) 생체적합성 고분자가 접합된 단백질 및 이의 제조방법
MX2007015893A (en) Human granulocyte-colony stimulating factor isoforms

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20200119