ES2606034T3 - IL-10 pegilada para uso en el tratamiento de linfoma - Google Patents

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Abstract

Una interleuquina 10 pegilada (PEG-IL-10) para uso en tratar un sujeto que padece linfoma.

Description

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DESCRIPCION
IL-10 pegilada para uso en el tratamiento de linfoma Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a interleuquina 10 pegilada (PEG-IL-10) para uso en el tratamiento de linfoma. Antecedentes de la invencion
Los canceres y tumores se pueden controlar o erradicar por el sistema inmunitario. El sistema inmunitario incluye varios tipos de celulas linfoides y mieloides, por ejemplo, monocitos, macrofagos, celulas dendnticas (CD), eosinofilos, celulas T, celulas B y neutrofilos. Estas celulas linfoides y mieloides producen protemas de senalizacion secretadas conocidas como citoquinas. Las citoquinas incluyen, por ejemplo, interleuquina-10 (IL-10), interferon gamma (IFNy), IL-12 e IL-23. La respuesta inmunitaria incluye inflamacion, es decir, la acumulacion de celulas inmunitarias sistemicamente o en una localizacion particular del cuerpo. En respuesta a un agente infeccioso o sustancia exogena, las celulas inmunitarias secretan citoquinas que, a su vez, modulan la proliferacion, desarrollo, diferenciacion o migracion de las celulas inmunitarias. La respuesta inmunitaria excesiva puede producir consecuencias patologicas, tal como trastornos autoinmunitarios, mientras que la respuesta inmunitaria alterada puede producir cancer. La respuesta antitumoral por el sistema inmunitario incluye inmunidad innata, por ejemplo, mediada por macrofagos, celulas NK, y neutrofilos, e inmunidad adaptativa, por ejemplo, mediada por celulas presentadoras de antfgeno (CPA), celulas T, y celulas B (vease, por ejemplo, Abbas, et al. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Filadelfia, PA; Oppenheim y Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian y Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson y Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350).
Se han usado metodos de modular la respuesta inmunitaria en el tratamiento de canceres, por ejemplo, melanoma. Estos metodos incluyen el tratamiento o bien con citoquinas tal como IL-2, IL-10, IL-12, factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa), IFNy, factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF) y factor de crecimiento transformante (TGF), o con antagonistas de citoquinas (por ejemplo, anticuerpos). La interleuquina-10 se caracterizo primero como un factor inhibidor de la smtesis de citoquinas (CSIF; vease, por ejemplo, Fiorentino, et al (1989) J. Exp. Med. 170:2081-2095). IL-10 es una citoquina pleotropica producida por celulas T, celulas B, monocitos, que puede funcionar tanto como un inmunosupresor y como un inmunoestimulante (vease, por ejemplo, Groux, et al. (1998) J. Immunol. 160:3188-3193; y Hagenbaugh, et al. (1997) J Exp. Med. 185:2101-2110).
Modelos animales sugieren que IL-10 puede inducir la activacion de celulas NK y facilitar la destruccion de celulas diana de una manera dependiente de la dosis (vease, por ejemplo, Zheng, et al. (1996) J. Exp. Med. 184:579-584; Kundu, et al. (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88:536-541). Estudios adicionales indican que la presencia de IL-10 en el microentorno del tumor se correlaciona con mejor supervivencia del paciente (vease, por ejemplo, Lu, et al. (2004) J. Clin, Oncol. 22:4575-4583).
Desgraciadamente, la semivida en suero para IL-10 es relativamente corta, es decir, 2-6 horas (vease, por ejemplo, Smith et al. (1996) Cellular Immunol. 173:207-214). La presente invencion aborda este problema proporcionando metodos de usar una forma manipulada de IL-10, por ejemplo, una IL-10 pegilada, para tratar el cancer. Ademas de una semivida mas larga en suero, la forma pegilada de IL-10 mostro sorprendentemente actividad destructora de tumores aumentada, por ejemplo, mediante reclutamiento aumentado de celulas T CD8+ al sitio del tumor, cuando se compara con IL-10 no pegilada.
Compendio de la invencion
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que IL-10 pegilada es un modulador mejorado del crecimiento tumoral.
En particular, la presente invencion proporciona lo siguiente:
1. Una interleuquina 10 pegilada (PEG-IL-10) para uso en tratar un sujeto que padece linfoma.
2. Uso de una PEG-IL-10 para la fabricacion de un medicamento parara tratar un sujeto que padece linfoma.
3. PEG-IL-10 para uso del punto 1 o el uso del punto 2, en donde la PEG-IL-10 se coadministra con al menos un agente quimioterapeutico.
4. PEG-IL-10 para uso del punto 3 o el uso del punto 3, en donde el agente quimioterapeutico es al menos uno de los agentes quimioterapeuticos seleccionados del grupo que consiste en temozolomida en un intervalo de dosis de 5 mg a 250 mg, gemcitabina en un intervalo de dosis de 200 mg a 1 g, doxorrubicina en un intervalo de dosis de 1 mg/m2 a 50 mg/m2 e interferon alfa en un intervalo de dosis de 1 pg/kg a 300 pg/kg.
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5. PEG-IL-10 para uso de cualquiera de los puntos 1, 3 y 4 o el uso de cualquiera de los puntos 2 a 4, en donde el sujeto es humano.
6. PEG-IL-10 para uso del punto 5 o el uso del punto 5, en donde la PEG-IL-10 es PEG-IL-10 humana (PEG-hlL- 10).
7. PEG-IL-10 para uso del punto 5 o 6 o el uso del punto 5 o 6, en donde la PEG-IL-10 comprende una molecula de PEG que tiene un peso molecular de 5 kDa a 50 kDa.
8. PEG-IL-10 para uso de cualquiera de los puntos 1 y 5 a 7 o el uso de cualquiera de los puntos 2 y 5 a 7, en donde la pEg-IL-10 comprende un enlazador metoxi-PEG-aldehndo (PALD-PEG).
9. PEG-IL-10 para uso del punto 8 o el uso del punto 8, en donde el enlazador PALD-PEG comprende una molecula de PEG que tiene un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 5 kDa, 12 kDa o 20 kDa.
Se divulga un metodo de inhibir o reducir el crecimiento de un tumor o cancer que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad eficaz de una interleuquina-10 pegilada (PEG-IL-10). La PEG-IL-10 puede ser mono-PEG- IL-10. La PEG-IL-10 puede comprender un enlazador SC-PEG-12K. La PEG-IL-10 puede comprender un enlazador metoxi-PEG-aldehndo (PALD-PEG). El enlazador PALD-PEG puede comprender una molecula de PEG que tiene un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 5 kDa, 12 kDa o 20 kDa. La PEG-IL-10 puede inhibir el crecimiento del tumor o cancer o la PEG-IL-10 reduce el tamano del tumor o cancer. La PEG-IL-10 puede aumentar la infiltracion de celulas T CD8+ en el tumor cuando se compara con IL-10 no pegilada.
PEG-IL-10 puede aumentar la expresion de al menos una citoquina inflamatoria, que se puede seleccionar del grupo que consiste en IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 y ligando de RANK (rAnK-L). La PEG-IL-10 se puede coadministrar con al menos un agente quimioterapeutico. El agente quimioterapeutico puede ser al menos uno de los agentes quimioterapeuticos de la tabla 16. El tumor o cancer se puede seleccionar del grupo que consiste en cancer de colon, cancer ovarico, cancer de mama, melanoma, cancer de pulmon, glioblastoma y leucemia.
La presente divulgacion describe un metodo de tratar un sujeto que padece un cancer o tumor que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de PEG-IL-10. La PEG-iL-10 puede ser mono-PEG-IL-10. La PeG-IL-10 puede comprender un enlazador SC-PEG-12K. La PEG-IL-10 puede comprender un enlazador metoxi-PEG-aldehndo (PALD-PEG) que puede tener un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 5 kDa, 12 kDa o 20 kDa. La PEG-IL-10 puede inhibir el crecimiento del cancer o tumor o puede reducir el tamano del tumor o cancer. La PEG-IL-10 puede aumentar la infiltracion de celulas T CD8+ en el tumor cuando se compara con IL-10 no pegilada. PEG-IL-10 puede aumentar la expresion de al menos una citoquina inflamatoria. La citoquina inflamatoria se puede seleccionar del grupo que consiste en IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L.
La PEG-IL-10 se puede coadministrar con al menos un agente quimioterapeutico. El agente quimioterapeutico puede ser al menos uno de los agentes quimioterapeuticos de la tabla 16. PEG-IL-10 puede reducir la metastasis de un cancer o tumor. El tumor o cancer se puede seleccionar del grupo que consiste en cancer de colon, cancer ovarico, cancer de mama, cancer de pulmon, melanoma, glioblastoma y leucemia. El sujeto que se trata puede ser humano y la pEG-IL-10 puede ser PEG-IL-10 humana (PEG-hIL-10).
Descripcion detallada
Como se usa en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como “un”, “una”, “el” y “la”, incluyen sus correspondientes referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa.
I. Definiciones
“Activacion”, “estimulacion” y “tratamiento”, como se aplica a celulas o a receptores, pueden tener el mismo significado, por ejemplo, activacion, estimulacion o tratamiento de una celula o receptor con un ligando, a menos que se indique de otra manera por el contexto o explfcitamente. “Ligando” puede ser ligandos naturales o sinteticos, por ejemplo, citoquinas, variantes de citoquinas, analogos, mutemas y composiciones de union derivadas de anticuerpos. “Ligando” puede ser moleculas pequenas, por ejemplo, peptidomimeticos de citoquinas y peptidomimeticos de anticuerpos. “Activacion” se puede referir a activacion celular regulada por mecanismos internos, asf como por factores externos o medioambientales. “Respuesta”, por ejemplo, de una celula, tejido, organo u organismo puede ser un cambio en comportamiento bioqmmico o fisiologico, por ejemplo, concentracion, densidad, adhesion, o migracion en un compartimento biologico, tasa de expresion genica, o estado de diferenciacion, donde el cambio se correlaciona con activacion, estimulacion, o tratamiento, o con mecanismos internos tal como programacion genetica.
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“Actividad” de una molecula puede describir o referirse a la union de la molecula a un ligando o un receptor, a actividad catalftica, a la capacidad de estimular expresion genica o senalizacion, diferenciacion o maduracion celular; a actividad antigenica o a la modulacion de actividades de otras moleculas. “Actividad” de una molecula tambien se puede referir a actividad en modular o mantener interacciones celula a celula, por ejemplo, adhesion, o actividad en mantener una estructura de una celula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. “Actividad” tambien puede significar actividad espedfica, por ejemplo, [actividad catalttica]/[mg de protema] o [actividad inmunologica]/[mg de protema] o concentracion en un compartimento biologico. “Actividad proliferativa” puede ser una actividad que fomenta, que es necesaria para, o que esta espedficamente asociada con, por ejemplo, division celular normal, asf como cancer, tumores, displasia, transformacion celular, metastasis y angiogenesis.
“Administracion” y “tratamiento”, como se aplica a un animal, ser humano, sujeto experimental, celula, tejido, organo o fluido biologico, se refiere a contacto de un agente farmaceutico, terapeutico, diagnostico, compuesto o composicion exogena al animal, ser humano, sujeto, celula, tejido, organo o fluido biologico. “Administracion” y “tratamiento” se puede referir, por ejemplo, a metodos terapeuticos, placebo, farmacocineticos, diagnosticos, de investigacion y experimentales. “Tratamiento de una celula” puede ser el contacto de un reactivo con la celula, asf como el contacto de un reactivo con un fluido, donde el fluido esta en contacto con la celula. “Administracion” y “tratamiento” tambien significa tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una celula, por un reactivo, composicion diagnostica, de union, o por otra celula. “Tratamiento” como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigacion, se refiere a tratamiento terapeutico, medidas profilacticas o preventivas, para aplicaciones de investigacion y diagnosticas. “Tratamiento” como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigacion, o celula, tejido u organo puede ser el contacto de PEG-IL-10 con un sujeto humano o animal, una celula, tejido, compartimento fisiologico o fluido fisiologico. “Tratamiento de una celula” tambien pueden ser situaciones donde PEG-IL-10 se pone en contacto con el receptor de IL-10 (heterodfmero o IL-10R1 e IL-10R2), por ejemplo, en la fase fluida o fase coloidal, asf como situaciones donde un agonista o antagonista de IL-10 se pone en contacto con un fluido, por ejemplo, donde el fluido esta en contacto con una celula o receptor, pero donde no se ha demostrado que el agonista o antagonista entre en contacto directamente con la celula o receptor.
“Caquexia” es un smdrome consuntivo que implica la perdida de musculo (atrofia muscular) y grasa, resultante de un trastorno en el metabolismo. La caquexia se produce en varios canceres (“caquexia por cancer”), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), insuficiencia organica avanzada, y SIDA. La caquexia por cancer se caracteriza por, por ejemplo, marcada perdida de peso, anorexia, astenia y anemia. La anorexia es un trastorno resultante de la perdida de motivacion para comer, por ejemplo, aversion a la comida (vease, por ejemplo, MacDonald, et al. (2003) J. Am. Coll. Surg. 197:143-361; Rubin (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5384-5389; Tisdale (2002) Nature Reviews Cancer 2:862-871; Argiles, et al. (2003) Drug Discovery Today 8:838-844; Lelli, et al. (2003) J. Chemother. 15:220-225; Argiles, et al. (2003) Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 6:401-406).
“Variantes conservadoramente modificadas de PEG-IL-10” se aplica a secuencias tanto de aminoacidos como de acido nucleico. Con respecto a secuencias de acido nucleico particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a esos acidos nucleicos que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas o, donde el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a secuencias de acido nucleico esencialmente identicas. Debido a la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos puede codificar cualquier protema determinada.
Respecto a las secuencias de aminoacidos, el experto en la materia reconocera que una sustitucion individual a una secuencia de acido nucleico, peptido, polipeptido o protema que sustituye un aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos en la secuencia codificada para un aminoacido conservado es una “variante conservadoramente modificada”. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares se conocen bien en la tecnica. Un ejemplo de una sustitucion conservadora es el intercambio de un aminoacido en uno de los siguientes grupos por otro aminoacido del mismo grupo (patente en EE UU No. 5.767.063 concedida a Lee, et al.; Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132):
(1) Hidrofobicos: norleucina, Ile, Val, Leu, Phe, Cys o Met;
(2) Hidrofflicos neutros: Cys, Ser, Thr,
(3) Acidos: Asp, Glu;
(4) Basicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Residuos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro;
(6) Aromaticos: Trp, Tyr, Phe;
(7) Aminoacidos pequenos: Gly, Ala, Ser.
“Cantidad eficaz” puede ser una cantidad suficiente para aliviar o prevenir un smtoma o signo de la afeccion medica. Cantidad eficaz tambien significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnostico. Una cantidad eficaz para un paciente o sujeto veterinario particular puede variar dependiendo de factores tales como la afeccion que se trata, la salud global del paciente, el metodo, dosis y via de administracion y la gravedad de los efectos secundarios (vease, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.888.530 concedida a Netti et al.). Una cantidad eficaz puede ser la dosis maxima o protocolo de dosis que evita efectos secundarios significativos o efectos toxicos. El efecto producira una mejora de una medida o parametro diagnostico en al menos el 5%, habitualmente en al menos el 10%, mas
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habitualmente al menos el 20%, lo mas habitualmente al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90%, donde se define el 100% como el parametro diagnostico mostrado por un sujeto normal (vease, por ejemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU). Una cantidad eficaz de PEG-IL-10 sena una cantidad suficiente para reducir un volumen tumoral, inhibir el crecimiento del tumor, prevenir metastasis, o aumentar la infiltracion de celulas T CD8+ en el sitio del tumor.
“Exogeno” se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, celula o cuerpo humano, dependiendo del contexto. “Endogeno” se refiere a sustancias que se producen en una celula, organismo, o cuerpo humano, dependiendo del contexto.
“Afeccion inmunitaria” o “trastorno inmunitario” puede ser, por ejemplo, inflamacion patologica, un trastorno inflamatorio, y un trastorno o enfermedad autoinmunitaria. “Afeccion inmunitaria” tambien se refiere a infecciones, infecciones persistentes, y afecciones proliferativas, tal como cancer, tumores, y angiogenesis, incluyendo infecciones, tumores y canceres que resisten la erradicacion por el sistema inmunitario. “Estado canceroso” incluye, por ejemplo, cancer, celulas cancerosas, tumores, angiogenesis y estados precancerosos tal como displasia.
“Inhibidores” y “antagonistas” o “activadores” y “agonistas” se refiere a moleculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, por ejemplo, para la activacion de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, gen, celula, tejido u organo. Un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando, o una celula, es una molecula que altera una actividad del gen, receptor, ligando, o celula, donde la actividad se puede activar, inhibir o alterar en sus propiedades reguladoras. El modulador puede actuar solo, o puede usar un cofactor, por ejemplo, una protema, ion metalico, o molecula pequena. Los inhibidores son compuestos que disminuyen, bloquean, previenen, retrasan la activacion, inactivan, desensibilizan, o regulan por disminucion, por ejemplo, un gen, protema, ligando, receptor o celula. Los activadores son compuestos que aumentan, activan, facilitan, potencian la activacion, sensibilizan, o regulan por aumento, por ejemplo, un gen, protema, ligando, receptor, o celula. Un inhibidor tambien se puede definir como una composicion que reduce, bloquea, o inactiva una actividad constitutiva. Un “agonista” es un compuesto que interacciona con una diana para producir o fomentar un aumento en la activacion de la diana. Un “antagonista” es un compuesto que se opone a las acciones de un agonista. Un antagonista previene, reduce, inhibe, o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista tambien puede prevenir, inhibir o reducir la actividad constitutiva de una diana, por ejemplo, un receptor diana, incluso donde no hay agonista identificado.
Para examinar el grado de inhibicion, por ejemplo, se tratan muestras o ensayos que comprenden una, por ejemplo, protema, gen, celula u organismo determinado, con un potencial activador o inhibidor y se comparan con muestras control sin el inhibidor. A las muestras control, es decir, sin tratar con el antagonista, se les asigna un valor de actividad relativa del 100%. Se logra inhibicion cuando el valor de actividad relativo al control es aproximadamente el 90% o menos, tfpicamente el 85% o menos, mas tfpicamente el 80% o menos, lo mas tfpicamente el 75% o menos, generalmente el 70% o menos, mas generalmente el 65% o menos, lo mas generalmente el 60% o menos, tfpicamente el 55% o menos, habitualmente el 50% o menos, mas habitualmente el 45% o menos, lo mas habitualmente el 40% o menos, el 35% o menos, el 30% o menos, el 25% o menos, o menos del 25%. La activacion se alcanza cuando el valor de actividad relativo al control es aproximadamente el 110%, generalmente al menos el 120%, mas generalmente el menos el 140%, mas generalmente al menos el 160%, con frecuencia al menos el 180%, con mas frecuencia al menos 2 veces, con la mayor frecuencia al menos 2,5 veces, habitualmente al menos 5 veces, mas habitualmente al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 40 veces o mas de 40 veces mayor.
Los criterios de valoracion en activacion o inhibicion se pueden seguir como sigue. La activacion, inhibicion y respuesta al tratamiento, por ejemplo, de una celula, fluido fisiologico, tejido, organo y sujeto animal o humano, se pueden seguir por un criterio de valoracion. El criterio de valoracion puede comprender un cantidad o porcentaje determinado de, por ejemplo, un indicio de inflamacion, oncogenicidad, o desgranulacion o secrecion de una celula, tal como la liberacion de una citoquina, oxfgeno toxico, o una proteasa. El criterio de valoracion puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de flujo o transporte de un ion; migracion celular; adhesion celular; proliferacion celular; potencial para metastasis; diferenciacion celular; y cambio en fenotipo, por ejemplo, cambio en la expresion de un gene relacionado con inflamacion, apoptosis, transformacion, ciclo celular o metastasis (vease, por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev, Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).
Un criterio de valoracion de inhibicion generalmente es el 75% del control o menos, el 50% del control o menos, el 25% del control o menos, o el 10% del control o menos. Generalmente, un criterio de valoracion de activacion es al menos el 150% del control, al menos dos veces el control, al menos cuatro veces el control, o al menos 10 veces el control.
Una composicion que esta “marcada” es detectable, sea directa o indirectamente, por metodos espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, isotopicos o qmmicos. Por ejemplo, los marcadores utiles incluyen 32P,
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P, S, C, H, I, isotopos estables, colorantes fluorescentes, reactivos densos a los electrones, sustratos, etiquetas epftopos, o enzimas, por ejemplo, como se usan en enzimoinmunoanalisis de adsorcion o fluorettes (vease, por ejemplo, Rozinov y Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728).
“Ligando” se refiere, por ejemplo, a una molecula pequena, peptido, polipeptido y molecula asociada a la membrana o unida a la membrana, o complejo de las mismas, que puede actuar como un agonista o antagonista de un receptor. “Ligando” tambien puede ser un agente que no sea un agonista o antagonista, sino que se puede unir al receptor sin influir significativamente sus propiedades biologicas, por ejemplo, senalizacion o adhesion. Ademas, “ligando” incluye un ligando unido a la membrana que se ha cambiado, por ejemplo, por metodos qmmicos o recombinantes, a una version soluble del ligando unido a la membrana. Por convencion, donde un ligando esta unido a la membrana en una primera celula, el receptor habitualmente se produce en una segunda celula. La segunda celula puede tener la misma identidad o una diferente que la primera celula. Un ligando o receptor puede ser enteramente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, nucleo, o algun otro compartimento intracelular. El ligando o receptor puede cambiar su localizacion, por ejemplo, de un compartimento intracelular a la cara externa de la membrana plasmatica. El complejo de un ligando y receptor se denomina un “complejo ligando receptor”. Donde un ligando y receptor estan implicados en una ruta de senalizacion, el ligando se produce en una posicion anterior y el receptor se produce en una posicion posterior de la ruta de senalizacion.
Se divulgan “moleculas pequenas” para el tratamiento de fisiologfa y trastornos de tumores y canceres. Se define “molecula pequena” como una molecula con un peso molecular que es menor de 10 kD, tipicamente menor de 2 kD, o menor de 1 kD. Las moleculas pequenas incluyen, pero no estan limitadas a, moleculas inorganicas, moleculas organicas, moleculas organicas que contienen un componente inorganico, moleculas que comprenden un atomo radiactivo, moleculas sinteticas, mimeticos de peptidos, y mimeticos de anticuerpos. Como agente terapeutico, una molecula pequena puede ser mas permeable a celulas, menos susceptible a degradacion, y menos apta para provocar una respuesta inmunitaria que las moleculas grandes. Se describen moleculas pequenas, tal como peptidomimeticos de anticuerpos y citoquinas, asf como toxinas de molecula pequena (vease, por ejemplo, Casset, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato y Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; Patente en EE UU No. 6.326.482 concedida a Stewart, et al.).
Un “agente quimioterapeutico” es un compuesto qmmico util en el tratamiento de cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tal como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tal como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamima mostazas de nitrogeno tal como clorambucilo, clomafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxido de mecloretamina clorhidrato, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamide, mostaza de uracilo; nitrosureas tal como carmustina, cloroziatocina, fotemustina, loniustina, nimustina, ranimustina; antibioticos tal como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxombicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tal como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgenos tal como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-suprarrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reaprovisionador de acido folico tal como acido frolmico; aceglatona; aldofosfamida glucosido; acido aminolevulmico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; acido podofilmico; 2-etilhidrazida; procarbacina; PSK®.; razoxano; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL® Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tal como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); acido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Tambien se incluyen en esta definicion agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion de hormonas sobre tumores tal como antiestrogenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imizadoles que inhiben aromatasa, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrogenos tal como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolido, y goserelina; y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
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Se une “espedficamente” o “selectivamente”, cuando se refiere a un ligando/receptor, anticuerpo/antfgeno, u otro par de union, indica una reaccion de union que es determinante de la presencia de la protema en una poblacion heterogenea de protemas y otros agentes biologicos. Por tanto, en las condiciones designadas, un ligando espedfico se une a un receptor particular y no se une en una cantidad significativa a otras protemas presentes en la muestra. El anticuerpo, o composicion de union derivada del sitio de union al antfgeno de un anticuerpo, del metodo descrito en el presente documento se une a su antfgeno, o una variante o mutema del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, al menos diez veces mayor, al menos 20 veces mayor, o al menos 100 veces mayor que la afinidad con cualquier otro anticuerpo, o composicion de union derivada del mismo. El anticuerpo tendra una afinidad que es mayor de aproximadamente 109 litros/mol, como se determina, por ejemplo, por analisis de Scatchard (Munsen, et at (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).
“Interleuquina-10” o “IL-10”, como se usa en el presente documento, sea conjugada a un polietilenglicol, o en una forma no conjugada, es una protema que comprende dos subunidades unidas de forma no covalente para formar un homodfmero. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otra manera “interleuquina-10” e “IL-10” se puede referir a IL-10 humana o de raton (No. de acceso a GenBank NP_000563; M37897; o documento US 6.217.857) que tambien se denominan “hIL-10” o “mIL-10”.
“IL-10 pegilada” o “PEG-IL-10” es una molecula de IL-10 que tiene una o mas moleculas de polietilenglicol unidas covalentemente a uno o mas residuos de aminoacidos de la protema IL-10 a traves de un enlazador, de modo que la union es estable. Los terminos “IL-10 monopegilada” y “mono-PEG-IL-10”, significan que una molecula de polietilenglicol esta covalentemente unida a un unico residuo de aminoacido en una subunidad del dfmero de IL-10 a traves de un enlazador. El peso molecular medio de la fraccion de PEG es preferiblemente entre 5.000 y aproximadamente 50.000 dalton. El metodo o sitio de union de PEG a IL-10 no es cntico, pero la pegilacion no altera, o solo altera mmimamente, la actividad de la molecula biologicamente activa. El aumento en la semivida puede ser mayor que cualquier disminucion en la actividad biologica. Para PEG-IL-10, la actividad biologica se mide tipicamente evaluando los niveles de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNFa, IFNy) en el suero de sujetos provocados con un antfgeno bacteriano (lipopolisacarido, LPS) y tratados con PEG-IL-10, como se describe en el documento US 7.052.686.
Como se usa en el presente documento, “semivida en suero”, abreviado “ty2”, significa semivida de eliminacion, es decir, el tiempo en que la concentracion en suero de un agente ha alcanzado la mitad de su valor inicial o maximo. El termino “semivida en suero aumentada” usado en el presente documento en referencia a un agente sintetico significa que el agente sintetico se depura a una velocidad menor que el agente no sintetico endogeno o la version recombinantemente producida del mismo.
II. General
La presente divulgacion describe metodos de tratar trastornos proliferativos, por ejemplo, cancer, tumores, etc., con IL-10 pegilada. IL-10 induce la actividad citotoxica de celulas T CD8, produccion de anticuerpos de celulas B y suprime la actividad de macrofagos e inflamacion fomentada por tumores (vease, Chen y Zlotnik (1991) J. Immunol. 147:528-534; Groux, et al. (1999) J. Immunol. 162:1723-1729; y Bergman, et al. (1996) J. Immunol. 157:231-238). La regulacion de celulas CD8 es dependiente de la dosis, en donde dosis mayores inducen respuestas citotoxicas mas fuertes, sin embargo, la utilidad de hIL-10 recombinante esta limitada por su corta semivida. PEG-IL-10 mostro una propiedad inesperada de aumentar la infiltracion de celulas T CD8+ a un tumor, asf como aumentar la expresion de citoquinas inflamatorias que desempenan un papel en la inmunidad tumoral. El tratamiento con PEG-IL-10, por tanto, debe proporcionar una mejora significativa para el tratamiento de tumores.
III. Polietilenglicol (“PEG”)
El polietilenglicol (“PEG”) es una fraccion qmmica que se ha usado en la preparacion de productos proteicos terapeuticos. El verbo “pegilar” significa unir al menos una molecula de PEG a otra molecula, por ejemplo, una protema terapeutica. Por ejemplo, Adagen, una formulacion pegilada de adenosina desaminasa, esta aprobada para tratar enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave; la superoxido dismutasa pegilada ha estado en ensayos clmicos para tratar lesion en la cabeza; el alfa interferon pegilado se ha probado en ensayos clmicos de fase I para tratar hepatitis; se describe que la glucocerebrosidasa pegilada y la hemoglobina pegilada han estado en ensayos preclmicos. Se ha mostrado que la union de polietilenglicol protege contra la proteolisis (vease, por ejemplo, Sada, et al., (1991) J. Fermentation Bioengineering 71:137-139).
En su forma mas comun, PEG es un polieter lineal o ramificado terminado con grupos hidroxilo y que tiene la estructura general:
HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
Para acoplar PEG a una molecula (polipeptidos, polisacaridos, polinucleotidos, y moleculas organicas pequenas) es necesario activar el PEG preparando un derivado del PEG que tiene un grupo funcional en uno o ambos extremos.
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La ruta mas comun para la conjugacion de PEG de protemas ha sido activar el PEG con grupos funcionales adecuados para reaccion con lisina y grupos aminoacidos N-terminales. En particular, los grupos reactivos mas comunes implicados en el acoplamiento de PEG a polipeptidos son los grupos alfa o epsilon amino de lisina.
La reaccion de un enlazador de pegilacion con una protema produce la union de la fraccion PEG predominantemente en los siguientes sitios: el grupo alfa amino en el extremo N de la protema, el grupo epsilon amino en la cadena lateral de residuos de lisina, y el grupo imidazol en la cadena lateral de residuos de histidina. Puesto que la mayona de protemas recombinantes poseen un unico grupo alfa y un numero de grupos epsilon amino e imidazol, se pueden generar numerosos isomeros posicionales dependiendo de la qmmica del enlazador.
Dos monometoxi PEG (mPEG) activados de primera generacion ampliamente usados eran carbonato de succinimidilo PEG (SC-pEg; vease, por ejemplo, Zalipsky, et al. (1992) Biotechnol. Appl. Biochem 15:100-114; y Miron y Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4:568-569) y carbonato de benzotriazol PEg (BTC-PEG; vease, por ejemplo, Dolence, et al. Patente en EE UU No. 5.650.234), que reaccionan preferentemente con residuos de lisina para formar un enlace carbamato, pero tambien se sabe que reaccionan con residuos de histidina y tirosina. Se ha mostrado que el enlace a residuos de histidina en IFNa es un enlace imidazolcarbamato hidroltticamente inestable (Vease, por ejemplo, Lee y McNemar, Patente en EE UU No. 5.985.263).
La segunda generacion de tecnologfa de PEGilacion se ha disenado para evitar estos enlaces inestables, asf como la falta de selectividad en reactividad con residuos. El uso de un enlazador PEG-aldetudo se dirige a un unico sitio en el extremo N de un polipeptido mediante aminacion reductora. IL-10 se puede pegilar usando diferentes tipos de enlazadores y pH para llegar a varias formas de una molecula pegilada (veanse, por ejemplo, los documentos US 5.252.714, US 5.643.575, US 5.919.455, US 5.932.462, US 5.985.263, US 7.052.686).
IV. Actividad biologica de PEG-IL-10
IL-10 humana induce el rapido desarrollo de anticuerpos neutralizantes cuando se administra a ratones inmunocompetentes. Para evitar este tipo de neutralizacion, se dio administracion subcutanea de PEG-hIL-10 a ratones deficientes en celulas B, es decir, ratones incapaces de montar una respuesta de anticuerpos. Tumores singenicos bien establecidos en estos ratones inmunodeficientes o bien se retrasaron significativamente en crecimiento o se rechazaron por completo por PEG-hIL-10. La restriccion o inhibicion del crecimiento tumoral dependfa de celulas T tanto cD4 como CD8. Tras la eliminacion de las celulas CD8, el efecto inhibidor de PEG-hIL- 10 se anulaba por completo. Por tanto, PEG-hIL-10 induce respuestas citotoxicas mediadas por CD8.
El analisis adicional del tejido tumoral mostro que PEG-IL-10 aumento la infiltracion de celulas T CD8+ en el tumor a un nivel mayor que el de IL-10 no pegilada. El nivel de expresion de citoquinas inflamatorias por las celulas T CD8 infiltrantes tambien era mayor con tratamiento con PEG-IL-10 comparado con tratamiento con IL-10 no pegilada. El tratamiento de pacientes con tumores con PEG-IL-10 debe inducir una respuesta antitumoral significativa y conferir un beneficio terapeutico significativo.
Una protema IL-10 usada en la presente divulgacion contiene una secuencia de aminoacidos que comparte una homologfa observada de al menos el 75%, al menos el 85%, o al menos el 90% o mas, por ejemplo, al menos el 95%, con la secuencia de una protema IL-10 madura, es decir, que carece de cualquier secuencia lfder. Vease, por ejemplo, la patente en EE uU No. 6.217.857. La homologfa de la secuencia de aminoacidos, o identidad de secuencia, se determina optimizando coincidencias de residuos y, si es necesario, introduciendo huecos segun se requiera. Se pretende que las secuencias de aminoacidos homologas tfpicamente incluyan variaciones alelicas naturales, polimorficas e interespecies en cada secuencia respectiva. Las protemas o peptidos homologos tfpicos tendran desde el 25-100% de homologfa (si se pueden introducir huecos) al 50-100% de homologfa (si se incluyen sustituciones conservadoras) con la secuencia de aminoacidos del polipeptido IL-10. Vease, Needleham et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Sankoff et al. en Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, 1983, Addison-Wesley, Reading, Mass.; y los paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, Calif., y the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wis.
La fraccion de IL-10 en los conjugados PEG-IL-10 puede estar glucosilada o puede estar modificada con mutemas no glucosiladas u otros analogos, incluyendo la protema BCRF1 (IL-10 vmca del virus de Epstein Barr). Se pueden hacer modificaciones de las secuencias que codifican IL-10 usando una variedad de tecnicas, por ejemplo, mutagenesis dirigida [Gillman et al., Gene 8:81-97 (1979); Roberts et al., Nature 328:731-734 (1987)], y se pueden evaluar por cribado de rutina en un ensayo adecuado para actividad de IL-10. Las protemas IL-10 modificadas, por ejemplo, variantes, pueden variar de la secuencia natural a nivel de la estructura primaria. Tales modificaciones se pueden hacer por inserciones, sustituciones, deleciones y fusiones de aminoacidos. Las variantes de IL-10 se pueden preparar con varios objetivos en mente, incluyendo aumentar la semivida en suero, reducir una respuesta inmunitaria contra IL-10, facilitar la purificacion o preparacion, disminuir la conversion de IL-10 en sus subunidades monomericas, mejorar la eficacia terapeutica, y disminuir la gravedad o aparicion de efectos secundarios durante el uso terapeutico. Las variantes de secuencia de aminoacidos habitualmente son variantes predeterminadas no encontradas en la naturaleza, aunque otras pueden ser variantes postraduccionales, por ejemplo, variantes glucosiladas. Cualquier variante de IL-10 se puede usar en esta divulgacion siempre que retenga un nivel adecuado
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de actividad IL-10. En el contexto tumoral, actividad IL-10 adecuada sena, por ejemplo, infiltrado de celulas T CD8+ en sitios tumorales, expresion de citoquinas inflamatorias tal como IFNy, IL-4, IL-6, IL-10, y RANK-L, de estas celulas que se infiltran, niveles aumentados de TNFa o IFNy en muestras biologicas.
La IL-10 usada en esta invencion puede derivar de un mairnfero, por ejemplo, ser humano o raton. Se prefiere IL-10 humana (hIL-10) para el tratamiento de seres humanos en necesidad de tratamiento con IL-10. La IL-10 descrita en el presente documento puede ser una IL-10 recombinante. Se pueden encontrar metodos que describen la preparacion de IL-10 humana y de raton en la patente en EE UU No. 5.231.012. Tambien se incluyen variantes naturales o conservadoramente sustituidas de IL-10 humana y de raton. IL-10 puede ser de origen vmco. La clonacion y expresion de una IL-10 vmca del virus de Epstein Barr (Protema BCRF1) se divulga en Moore et al., Science 248:1230 (1990).
Se puede obtener IL-10 de un numero de maneras usando metodos estandar conocidos en la tecnica, por ejemplo, aislada y purificada de medio de cultivo de celulas activadas capaces de secretar la protema (por ejemplo, celulas T), sintetizada qmmicamente o tecnicas recombinantes (vease, por ejemplo, Merrifield, Science 233:341-47 (1986); Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, 1989, LR.L. Press, Oxford; patente en EE UU No. 5.231.012 que ensena metodos para la produccion de protemas que tienen actividad IL-10, incluyendo tecnicas recombinantes y otras sinteticas). La protema IL-10 se puede obtener de acidos nucleicos que codifican el polipeptido IL-10 usando tecnicas recombinantes. La IL-10 humana recombinante esta tambien comercialmente disponible, por ejemplo, de Pepro Tech. Inc., Rocky Hill, N.J.
Se puede hacer PEG-IL-10 usando metodos bien conocidos en la tecnica. Se puede sintetizar polietilenglicol (PEG) como se describe, por ejemplo, en Lundblad, R.L. et al. (1988) Chemical Reagents for Protein Modification CRC Press, Inc., vol. 1, pp. 105-125. Se puede conjugar PEG a IL-10 mediante el uso de un enlazador como se ha descrito anteriormente. En ciertas formas de realizacion, la PEG-IL-10 usada en la invencion es una mono-PEG-IL- 10 en la que de una a nueve moleculas de PEG estan covalentemente unidas a traves de un enlazador al grupo alfa amino del residuo de aminoacido en el extremo N de una subunidad del dfmero de IL-10.
IV. Composiciones terapeuticas, metodos
Se puede formular PEG-IL-10 en una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de la IL-10 y un soporte farmaceutico. Una “cantidad terapeuticamente eficaz” es una cantidad suficiente para proporcionar el resultado terapeutico deseado. Preferiblemente, tal cantidad tiene efectos secundarios negativos mmimos. La cantidad de PEG-IL-10 administrada para tratar una afeccion tratable con IL-10 se basa en la actividad IL-10 de la protema conjugada, que se puede determinar por ensayos de actividad de IL-10 conocidos en la tecnica. La cantidad terapeuticamente eficaz para un paciente particular en necesidad de tal tratamiento se puede determinar considerando varios factores, tal como la afeccion tratada, la salud global del paciente, el metodo de administracion y/o la gravedad de los efectos secundarios. En el contexto de un tumor, la actividad IL-10 adecuada sena, por ejemplo, infiltrado de celulas T CD8+ en sitios tumorales, expresion de citoquinas inflamatorias tal como IFNy, iL-4, iL-6, IL-10, y RANK-L, de estas celulas que se infiltran, niveles aumentados de TNFa o IFNy en muestras biologicas.
La cantidad terapeuticamente eficaz de IL-10 pegilada puede variar desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 100 |jg de protema por kg de peso corporal al dfa. La cantidad de IL-10 pegilada puede variar desde aproximadamente 0,1 a 20 jg de protema por kg de peso corporal al dfa, desde aproximadamente 0,5 a 10 jg de protema por kg de peso corporal al dfa, o desde aproximadamente 1 a 4 jg de protema por kg de peso corporal al dfa. Se pueden emplear programas de administracion menos frecuentes usando la PEG-IL-10 de la invencion puesto que esta forma conjugada actua durante mas tiempo que IL-10. La IL-10 pegilada se formula en forma purificada y sustancialmente libre de agregados y otras protemas. PEG-IL-10 se puede administrar por infusion continua de modo que se administre una cantidad en el intervalo de aproximadamente 50 a 800 jg de protema al dfa (es decir, aproximadamente de 1 a 16 jg de protema por kg de peso corporal al dfa de PEG-IL-10). La velocidad de infusion diaria se puede variar basado en el seguimiento de los efectos secundarios y recuentos de celulas sangumeas.
Para preparar composiciones farmaceuticas que contienen mono-PEG-IL-10, una cantidad terapeuticamente eficaz de PEG-IL-10 se mezcla con un soporte o excipiente farmaceuticamente aceptable. El soporte o excipiente puede ser inerte. Un soporte farmaceutico puede ser cualquier sustancia compatible, no toxica adecuada para administrar las composiciones de IL-10 a un paciente. Los ejemplos de soportes adecuados incluyen solucion salina normal, solucion de Ringer, solucion de dextrosa y solucion de Hank. Tambien se pueden usar soportes no acuosos tal como aceites no volatiles y oleato de etilo. Un soporte puede ser dextrosa al 5%/solucion salina. El soporte puede contener cantidades minoritarias de aditivos tal como sustancias que aumentan la isotonicidad y estabilidad qmmica, por ejemplo, tampones y conservantes, vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Las formulaciones de agentes terapeuticos y diagnosticos se pueden preparar mezclando con soportes, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables en la forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, papillas, soluciones o suspensiones acuosas (vease, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy,
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Lippincott, Williams, and Wilkins, Nueva York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY).
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar por via oral o inyectar en el cuerpo. Las formulaciones para uso oral tambien pueden incluir compuestos para proteger ademas la IL-10 de proteasas en el aparato digestivo. Las inyecciones habitualmente son intramusculares, subcutaneas, intradermicas o intravenosas. Alternativamente, se podna usar inyeccion intraarticular u otras rutas en circunstancias apropiadas.
Cuando se administra por via parenteral, IL-10 pegilada se puede formular en una forma inyectable de dosis unitaria (solucion, suspension, emulsion) en asociacion con un soporte farmaceutico. Vease, por ejemplo, Avis et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, N.Y. (1993); Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y. (1990); y Lieberman et al., eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y. (1990). Alternativamente, las composiciones descritas en el presente documento se pueden introducir en el cuerpo de un paciente por un sistema de administracion de farmacos implantable o inyectable, por ejemplo, Urquhart et al. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199-236, (1984); Lewis, ed., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals Plenum Press, Nueva York (1981); y patentes en EE UU No. 3.773.919; 3.270.960. La IL-10 pegilada se puede administrar en vehmulos acuosos tal como agua, solucion salina o vehmulos tamponados con o sin varios aditivos y/o agentes diluyentes.
Una cantidad eficaz para un paciente puede variar dependiendo de factores tales como la afeccion que se trata, la salud global del paciente, la via metodo y dosis de administracion y la gravedad de los efectos secundarios (vease, por ejemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU).
Sujetos veterinarios, experimentales o de experimentacion tfpicos incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, cobayas, caballos y seres humanos.
La determinacion de la dosis apropiada la hace el medico, por ejemplo, usando parametros o factores que se sabe o sospecha en la tecnica que afectan al tratamiento o predichos que afectan al tratamiento. Generalmente, la dosis empieza con una cantidad algo menor que la dosis optima y se aumenta por pequenos incrementos despues de ello hasta que se alcanza el efecto deseado u optimo relativo a cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnosticas importantes incluyen esas de smtomas de, por ejemplo, la inflamacion o nivel de citoquinas inflamatorias producidas.
Un agente biologico que se puede usar deriva de la misma especie que el animal diana para el tratamiento, minimizando de esta manera una respuesta humoral al reactivo. Los metodos para la coadministracion o tratamiento con un segundo agente terapeutico, por ejemplo, una citoquina, esteroide, agente quimioterapeutico, antibiotico o radiacion se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, Nueva York, NY; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA). Una cantidad eficaz del agente terapeutico disminuira los smtomas, por ejemplo, tamano tumoral o inhibicion de crecimiento tumoral, tfpicamente en al menos el 10%; habitualmente en al menos el 20%; al menos aproximadamente el 30%; al menos el 40%, o en al menos el 50%.
VI. Usos
Tambien se divulga en el presente documento PEG-IL-10 para uso en el tratamiento de una afeccion o trastorno proliferativo, por ejemplo, cancer del utero, cervix, mama, prostata, testmulos, pene, aparato digestivo, por ejemplo, esofago, orofaringe, estomago, intestinos delgado o grueso, colon o recto, rinon, celula renal, vejiga, hueso, medula osea, piel, cabeza o cuello, piel, hngado, vesmula biliar, corazon, pulmon, pancreas, glandula salivar, glandula suprarrenal, tiroides, cerebro, por ejemplo, gliomas, ganglios, sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periferico (SNP), y sistema inmunitario, por ejemplo, bazo o timo. La presente divulgacion describe metodos de tratar, por ejemplo, tumores inmunogenicos, tumores no inmunogenicos, tumores durmientes, canceres inducidos por virus, por ejemplo, canceres de celulas epiteliales, canceres de celulas endoteliales, carcinomas de celulas escamosas, papilomavirus. adenocarcinomas, linfomas, carcinomas, melanomas, leucemias, mielomas, sarcomas, teratocarcinomas, canceres inducidos qmmicamente, metastasis y angiogenesis. Tambien se divulga reducir la tolerancia a un antfgeno de celula tumoral o celula cancerosa, por ejemplo, modulando la actividad de una celula T reguladora (Treg) y o una celula T CD8 (vease, por ejemplo, Ramirez-Montagut, et al. (2003) Oncogene 22:31803187; Sawaya, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:1501-1509; Farrar, et al. (1999) J. Immunol. 162:2842-2849; Le, et al. (2001) J. Immunol. 167:6765-6772; Cannistra y Niloff (1996) New Engl. J. Med 334:1030-1038; Osborne (1998) New Engl. J. Med. 339:1609-1618; Lynch y Chapelle (2003) New Engl. J. Med. 348:919-932; Enzinger y Mayer (2003) New Engl. J. Med 349:2241-2252; Forastiere, et al. (2001) New Engl. J. Med. 345:1890-1900; Izbicki, et al.
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(1997) New Engl. J. Med. 337:1188-1194; Holland, et al. (eds.) (1996) Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer, 4a ed., Academic Press, San Diego, CA).
Tambien se divulgan metodos para tratar una afeccion proliferativa, cancer, tumor o estado precanceroso tal como displasia, con PEG-IL-10 y al menos un agente terapeutico o diagnostico adicional. El agente terapeutico adicional puede ser, por ejemplo, una citoquina o antagonista de citoquina, tal como IL-12, interferon alfa, o anti-receptor del factor de crecimiento epidermico, doxorrubicina, epirrubicina, un anti-folato, por ejemplo, metotrexato o fluorouracilo, irinotecano, ciclofosfamida, radioterapia, terapia hormonal o antihormonal, por ejemplo, androgeno, estrogeno, antiestrogeno, flutamida, o dietilestilbestrol, cirugfa, tamoxifeno, ifosfamida, mitolactol, un agente alquilante, por ejemplo, melfalan o cisplatino, etoposido, vinorrelbina, vinblastina, vindesina, un glucocorticoide, un antagonista del receptor de histamina, un inhibidor de angiogenesis, radiacion, un sensibilizador de radiacion, antraciclina, alcaloide vinca, taxano, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel; un inhibidor del ciclo celular, por ejemplo, un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, un anticuerpo monoclonal contra otro antfgeno tumoral, un complejo de anticuerpo monoclonal y toxina, un adyuvante de celulas T, trasplante de medula osea, o celulas presentadoras de antfgeno, por ejemplo, terapia con celulas dendnticas. Se pueden proporcionar vacunas, por ejemplo, como una protema soluble o como un acido nucleico que codifica la protema (vease, por ejemplo, Le, et al., anteriormente; Greco y Zellefsky (eds.) (2000) Radiotherapy of Prostate Cancer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro y Recht (2001) New Engl. J. Med. 344:1997-2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339:974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med. 331:996-1004; Naylor y Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3:1205-1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350:351-360; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783792; Kudelka, et al. (1998) New Engl. J. Med. 338:991-992; van Netten, et al. (1996) New Engl. J. Med. 334:920921).
Tambien se divulgan metodos de tratar hematopoyesis extramedularmente (EMH) de cancer. EMH se describe (vease, por ejemplo, Rao, et al. (2003) Leuk. Lymphoma 44:715-718; Lane, et at (2002) J. Cutan. Pathol. 29:608612).
Ejemplos
I. Metodos generales
Se describen metodos estandar en biologfa molecular (Maniatis, et a/. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Tambien aparecen metodos estandar en Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonacion en celulas bacterianas y mutagenesis de ADN (Vol. 1), clonacion en celulas de mairnferos y levaduras (Vol. 2), glucoconjugados y expresion de protemas (Vol. 3), y bioinformatica (Vol. 4).
Se describen metodos para la purificacion de protemas incluyendo inmunoprecipitacion, cromatograffa, electroforesis, centrifugacion y cristalizacion (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se describen analisis qmmico, modificacion qmmica, modificacion postraduccional, produccion de protemas de fusion, glucosilacion de protemas (vease, por ejemplo, Coligan, et al.
(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma- Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech
(2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Se describe la produccion, purificacion, y fragmentacion de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, anteriormente,). Estan disponibles tecnicas estandar para la caracterizacion de interacciones ligando/receptor (vease, por ejemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York). Se describen metodos para hacer PEG-IL-10, por ejemplo, en la patente en EE UU No. 7.052.686.
Estan disponibles metodos para citometna de flujo, incluyendo separacion celular activada por fluorescencia (FACS) (vease, por ejemplo, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Estan disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar acidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de acido nucleico, polipeptidos y anticuerpos, para uso, por ejemplo, como reactivos diagnosticos (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
Se describen metodos estandar de histologfa del sistema inmunitario (vease, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, nY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY).
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Se describen metodos para el tratamiento y diagnostico de cancer (vease, por ejemplo, Alison (ed.) (2001) The Cancer Handbook, Grove's Dictionaries, Inc., St. Louis, MO; Oldham (ed.) (1998) Principles of Cancer Biotherapy, 3a ed., Kluwer Academic Publ., Hingham, MA; Thompson, et al. (eds.) (2001) Textbook of Melanoma, Martin Dunitz, Ltd., Londres, RU; Devita, et al. (eds.) (2001) Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6a ed., Lippincott, Phila, PA; Holland, et al. (eds.) (2000) Holland-Frei Cancer Medicine, BC Decker, Phila., PA; Garrett y Sell (eds.) (1995) Cellular Cancer Markers, Humana Press, Totowa, NJ; MacKie (1996) Skin Cancer, 2a ed., Mosby, St. Louis; Moertel (1994) New Engl. J. Med. 330:1136-1142; Engleman (2003) Semin. Oncol. 30(3 Supl. 8):23-29; Mohr, et a/. (2003) Onkologie 26:227-233).
Estan disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigenicos, secuencias lfder, plegamiento de protemas, dominios funcionales, sitios de glucosilacion, y alineamientos de secuencia (vease, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, mD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).
II. IL-10 pegilada
IL-10 se dializo frente a fosfato de sodio 10 mM pH 7,0, NaCl 100 mM. La IL-10 dializada se diluyo 3,2 veces a una concentracion de 4 mg/ml usando el tampon de dialisis. Antes de la adicion del enlazador, SC-PEG-12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, IL), se anadio 1 volumen de tetraborato de Na 100 mM a pH 9,1 en 9 volumenes de IL-10 diluida para subir el pH de la solucion de IL-10 a 8,6. El enlazador SC-PEG-12K se disolvio en el tampon de dialisis y se anadio el volumen apropiado de la solucion de enlazador (de 1,8 a 3,6 moles de enlazador por mol de IL-10) en la solucion de IL-10 diluida para empezar la reaccion de pegilacion. La reaccion se llevo a cabo a 5°C para controlar la velocidad de la reaccion. La solucion de reaccion se agito suavemente durante la reaccion de pegilacion. Cuando el rendimiento de mono-PEG-IL-10 determinado por HPLC de exclusion molecular (SE-HPLC) estaba proximo al 40%, la reaccion se paro anadiendo solucion de glicina 1 M a una concentracion final de 30 mM. El pH de la solucion de reaccion se ajusto lentamente a 7,0 usando una solucion de HCl y la reaccion se filtro a traves de 0,2 micrometros y se almaceno a -80°C.
Alternativamente, se prepara mono-PEG-IL-10 usando metoxi-PEG-aldetndo (PALD-PEG) como enlazador (Inhale Therapeutics Systems Inc., Huntsville, Alabama). PALD-PEG puede tener pesos moleculares de 5 kDa, 12 kDa, o 20 kDa. IL-10 se dializa y diluye como se ha descrito anteriormente, excepto que el pH del tampon de reaccion es entre 6,3 y 7,5. Se anade el enlazador PALD-PEG activado a la mezcla de reaccion en una proporcion molar de 1:1. Se anade cianoborohidruro acuoso a la mezcla de reaccion a una concentracion final de 0,5 a 0,75 mM. La reaccion se lleva a cabo a temperatura ambiente (18-25°C) durante 15-20 horas con agitacion suave. La reaccion se extingue con glicina 1 M. Se analizan los rendimientos por SE-HPLC. Se separa mono-PEG-IL-10 de IL-10 sin reaccionar, enlazador de PEG y di-PEG-IL-10 por cromatograffa de filtracion en gel y se caracteriza por rp-HPLC y bioensayo (por ejemplo, estimulacion de celulas o lmeas celulares que responden a IL-10).
III. Modelos tumorales
Se inyectaron celulas tumorales de raton singenicas por via subcutanea o intradermica a 104, 105 o 106 celulas por inoculacion de tumor. Se usaron modelos de carcinoma mamario Ep2, carcinoma de colon CT26, carcinoma escamoso de la piel PDV6 y carcinoma de mama 4T1 (vease, por ejemplo, Langowski et al. (2006) Nature 442:461465). Se usaron ratones Balb/C inmunocompetentes o Balb/C deficientes en celulas B. Se administro PEG-mIL-10 a los ratones inmunocompetentes, mientras que se uso el tratamiento con PEG-hIL-10 en ratones deficientes en celulas B. Se dejo que los tumores alcanzaran un tamano de 100-250 mm3 antes de empezar el tratamiento. Se administro IL-10, PEG-mIL-10, PEG-hIL-10 o tampon control por via subcutanea en un sitio distante de la implantacion del tumor. El crecimiento tumoral tfpicamente se siguio dos veces a la semana usando compases calibradores electronicos.
IV. Analisis tumoral
Se recogieron tejidos tumorales y organos linfaticos en varios puntos finales para medir expresion de ARNm para un numero de marcadores inflamatorios y para realizar inmunohistoqmmica para varios marcadores celulares inflamatorios. Los tejidos se congelaron rapidamente en nitrogeno lfquido y se almacenaron a -80°C. El crecimiento tumoral primario tfpicamente se siguio dos veces a la semana usando compases calibradores electronicos. El volumen del tumor se calculo usando la formula (anchura2 x longitud/2) donde la longitud es la dimension mas larga. Se dejo que los tumores alcanzaran un tamano de 90-250 mm3 antes de empezar el tratamiento.
V. Administracion de IL-10 y/o PEG-IL-10
Se administro mIL-10 o PEG-mIL-10 a los ratones inmunocompetentes mientras que se uso tratamiento con PEG- hIL-10 en los ratones deficientes en celulas B. Se administro mIL-10, PEG-mIL-10, PEG-hIL-10 o veldculo control por via subcutanea en un sitio distante de la implantacion del tumor. La PEG-mIL-10 usada en estos estudios se preparo con el enlazador SC-PEG-12K. Las actividades biologicas de mIL-10 y PEG-mIL-10 se evaluaron mediante 5 la aplicacion de un bioensayo de proliferacion a corto plazo que utiliza MC/9, una lmea de celulas cebadas de raton que expresa receptores de IL-10 endogenos (R1 y R2). Las celulas MC/9 proliferan en respuesta a coestimulacion con mIL-4 y mIL-10 (las MC/9 no proliferan con solo mIL-4 o mIL-10). La proliferacion se midio por medios colorimetricos usando azul alamar, un colorante indicador de crecimiento basado en la deteccion de actividad metabolica. La actividad biologica de mIL-10 recombinante o pegilada se evaluo por el valor CE50, o la 10 concentracion de protema a la que se observa la estimulacion semimaxima en una curva de dosis y respuesta (tabla 1):
Tabla 1: Bioensayo de proliferacion de MC/9 para la evaluacion de bioactividad de reactivos mIL-10 y PEG-mIL-10 usados en estos estudios 15
Protema
CE50 (ng/ml) en ensayo en MC/9
mIL-10
0,5711
PEG-mIL-10
4,039
Basado en el bioensayo en MC/9, la actividad espedfica de la mIL-10 pegilada usada en los experimentos es aproximadamente 7 veces menor que la actividad de la mIL-10 usada (tabla 1).
20 Se administro PEG-mIL-10 cada dos dfas a ratones que teman tumores de cancer de mama Ep2. El tratamiento era eficaz en reducir el tamano del tumor e inducir rechazos tumorales.
Tabla 2: PEG mIL-10 reduce el tamano tumoral (mm3) en modelo de cancer de mama Ep2 en ratones Balb/C
Dfas tras la inoculacion
11 15 18 21 25 27 33
Control
300 450 500 750 1300 1500 2700
PEG-mIL-10
300 400 310 280 250 50 0
25 El tratamiento con PEG-mIL-10 tambien fue eficaz en reducir el tamano tumoral en modelos tumorales en ratones inmunocompetentes singenicos de PDV6, CT-26 y 4T1 (veanse las tablas 3, 4 y 5).
Tabla 3: Estudio 04-M52 338: PEG mIL-10 empezando el dfa 36 despues del implante reduce el tamano tumoral (mm3) de PDV6 en ratones C57B/6 ___________________________________________________________
Dfas tras la inoculacion
36 38 42 44 46 48 52
Control
200 255 290 380 395 420 485
PEG-mIL-10
210 265 200 190 155 110 55
30
Tabla 4: PEG mIL-10 empezando el dfa 7 despues del implante reduce el tamano tumoral relativo a veldculo control de tumores CT26 (mm3) ratones BALB/c____________________________________________________________
Dfas tras la inoculacion
10 15 17 20 22 24
Control
155 424 791 1274 1737 2170
PEG-mIL-10
136 212 291 336 450 455
Tabla 5: IL-10 y PEG mIL-10 reducen el tamano tumoral (mm3) de carcinoma de mama 4T1
Dfas de tratamiento
20 24 29 33
Control
200 410 584 1000
PEG-mIL-10
200 320 560 350
IL-10
200 290 575 400
35
Tabla 6: Estudio 05-M52-496. 2 semanas de tratamiento con mIL-10 y mPEG IL-10 empezando 19 dfas despues del implante reduce el tamano tumoral (mm3) de carcinoma de mama 4T1.__________________________________
Dfas tras el implante
20 24 29 33
PBS
200 410 584 1000
PEG-mIL-10
200 320 560 350
mIL-10
200 290 575 400
VI. Estudios de titulacion de la dosis 40
En estudios de titulacion de la dosis, se recogieron sangrados de la vena de la cola de ratones representativos de cada grupo en los tiempos correspondientes a los niveles de dosis pico y mrnimos esperados. Se ensayo el suero recogido para concentraciones de mIL-10 usando la plataforma Meso Scale Discovery que se basa en tecnologfa de multimatrrices; una combinacion de deteccion de electroquimioluminiscencia y matrices estampadas. Se uso una 45 prueba de la t de Student para datos independientes bilateral para comparar el volumen tumoral medio de ratones
tratados con mIL-10 o PEG-mIL-10 agrupados por concentraciones en suero de mIL-10 con el volumen tumoral medio de su grupo de vehuculo control correspondiente. Se uso una correccion de Welch cuando dos grupos teman varianza desigual (p<0,05 de la prueba F).
5 Las titulaciones de dosis de PEG-mIL-10 y mIL-10 en ratones que tienen carcinoma de mama 4T1 muestran que el control del tumor primario y metastasis pulmonares son de dosis valorables tanto con mIL-10 como PEG-mIL-10. A cualquier dosis determinada PEG-mIL-10 es mas eficaz que mIL-10 (Tabla 7). El tratamiento de dos veces al dfa se empezo el dfa 17 despues del implante, cuando los volumenes tumorales medios eran 84-90 mm3. Los grupos de tratamiento consistfan en 14 ratones por grupo mientras que los grupos control teman 8 ratones en cada grupo. Los 10 tampones Tris y Hepes fueron los controles para mIL-10 y PEG mIL-10, respectivamente.
Tabla 7: Estudio 06-M175-1103. mIL-10 y PEG-mIL-10 reducen el tamano del tumor primario (mm3) de carcinoma de mama 4T1 en ratones BALB/c de una manera dependiente de la dosis. ________________________________
Dfas tras el implante
17 21 24 27 30 34 38 42
Tris veimculo control
90 184 288 448 560 861 1126 1248
Hepes vehfculo control
90 215 344 476 658 940 1261 1520
PEG-mIL-10 (0,5 mg/kg)
86 107 117 129 150 165 204 195
PEG-mIL-10 (0,1 mg/kg)
84 112 142 152 224 256 286 356
PEG-mIL-10 (0,01 mg/kg)
85 140 200 240 288 462 627 773
PEG-mIL-10 (0,001 mg/kg)
88 168 239 262 373 532 729 942
mIL-10 (1,0 mg/kg)
85 117 168 207 256 350 446 497
mIL-10 (0,1 mg/kg)
84 136 180 251 337 424 641 704
mIL-10 (0,01 mg/kg)
86 121 165 231 331 436 631 809
15 Las titulaciones de dosis de PEG-mIL-10 y mIL-10 en ratones que tienen carcinoma de celulas escamosas PDV6 muestran que el control del tumor primario es de dosis valorable tanto con mIL-10 como PEG-mIL-10, aunque a cualquier dosis determinada PEG-mIL-10 es mas eficaz que mIL-10 (Tabla 8). El tratamiento de PEG-mIL-10 de alta dosis produjo una regresion tumoral de casi el 100% y posterior resistencia a la reexposicion (Tabla 9). Se empezo el tratamiento de dos veces al dfa el dfa 23 despues del implante, cuando los volumenes tumorales medios eran 20 107-109 mm3 y siguio hasta el dfa 55 para todos los grupos tratados con mIL-10 y el grupo tratado con PEG m-IL10
0,01 mg/kg. El tratamiento con PEG -mIL-10 0,1 mg/kg se paro el dfa 48 cuando se vio regresion tumoral del 100% mientras que los grupos restantes se trataron hasta el dfa 51. Los grupos de tratamiento consistfan en 10 ratones por grupo mientras que cada vehfculo control contema 6 ratones. El tampon Tris y el tampon Hepes fueron el velmculo control para mIL-10 y PEG mIL-10, respectivamente. El reimplante se hizo 85 dfas despues del implante 25 primario y 4 semanas despues del ultimo tratamiento con PEG-mIL-10. Hubo 10 ratones por grupo.
Tabla 8: Estudio 06-M52-1106. mIL-10 y PEG-mIL-10 reducen el tamano del tumor (mm3) de carcinoma de celulas escamosas PDV6 en ratones C57Bl6/J de una manera dependiente de la dosis. ________________________
Dfas tras el implante
23 27 30 33 36 40 43 47 51 55
Tris vehfculo control
111 179 232 318 412 493 635 848 958
Hepes vehfculo control
107 210 293 433 541 653 712 761 986
PEG-mIL-10 (0,1 mg/kg)
108 99 55 31 17 11 3 1 1 1
PEG-mIL-10 (0,01 mg/kg)
107 131 92 97 95 114 119 123 183 228
PEG-mIL-10 (0,001 mg/kg)
109 191 191 241 327 455 535
mIL-10 (1,0 mg/kg)
107 129 144 143 124 87 51 36 52 75
mIL-10 (0,1 mg/kg)
107 85 85 88 117 121 130 143 182 217
mIL-10 (0,01 mg/kg)
107 120 150 146 196 244 262 263 249 250
30 Tabla 9: Estudio 06-M52-1106. Ratones C57Bl/6J que habfan depurado tumores de carcinoma de celulas escamosas PDV6 despues de 3 semanas de tratamiento con PEG-mIL-10 son resistentes al reimplante en ausencia de tratamiento adicional
Dfas tras el implante
0 16 21 28 36 49 % de ratones que son positivos para el tumor
Vehfculo control
0 113 145 188 418 761 100
PEG-mIL-10 (0,1 mg/kg)
0 0,3 0 7 16 47 10
VII. Estudios de metastasis pulmonar 35
Las metastasis pulmonares en el modelo de carcinoma de mama 4T1, o bien se cuantificaron macroscopicamente despues de la extirpacion del pulmon (tabla 10) o contando las colonias metastasicas del pulmon despues de cultivo (tabla 11) como se describe en Current Protocols in Immunology (Seccion 20.2.4) John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999). Brevemente, los pulmones recogidos de un raton que tiene el tumor 4T1 se cortaron y 40 digirieron con una mezcla de colagenasa/elastasa seguido por cultivo en un ensayo de dilucion limitante, en medio que contema 6-tioguanina. Solo las celulas de 4T1 son resistentes a 6-tioguanina y se pueden cuantificar contando el numero de colonias despues de 10-14 dfas de cultivo. El tratamiento de dos veces al dfa se empezo el dfa 17
despues del implante, cuando los volumenes tumorales medios eran 84-90 mm3. Los tampones Tris y Hepes fueron los controles para mIL-10 y PEG mIL-10, respectivamente. Las metastasis pulmonares se midieron como el numero de colonias metastasicas cultivadas por pulmon.
5 Tabla 10: Estudio 05-M52-496. 2 semanas de tratamiento con mIL-10 y PEG-mIL-10 empezando 19 dfas despues del implante reduce las metastasis de carcinoma de mama 4T1 (medido como el numero de metastasis pulmonares por raton)__________________________________________________________________________________
Metastasis pulmonar 33 dfas despues de la inoculacion
Vehuculo control mIL-10 PEG-mIL-10
Raton #1
7 0 0
Raton #2
7 0 0
Raton #3
7 0 0
Raton #4
8 0 0
Raton #5
20 4 0
10
Tabla 11: Estudio 06-M175-1103. mIL-10 y PEG-mIL-10 reducen las metastasis pulmonares de carcinoma de mama
Raton
Metastasis pulmonares 42-45 despues del implante
Colonias por pulmon (x 103)
Tampon Tris vehuculo control
Tampon Hepes vehuculo control mIL-10 1,0 mg/kg mIL-10 0,1 mg/kg mIL-10 0,01 mg/kg PEG- mIL-10 0,5 mg/kg PEG- mIL-10 0,1 mg/kg PEG- mIL-10 0,01 mg/kg PEG- mIL-10 0,001 mg/kg
1
362 481 76 116 1064 7,1 89 0,43 366
2
2,12 533 20 5,6 150 1,0 0,7 234 212
3
152 264 28,1 8,1 67,4 0,4 0,01 377 0,6
4
0,4 218 1,2 137 18 1,5 223 315 586
5
1000 517 45,7 257 77 0,3 0,07 0,54 486
6
474 93 21,7 2,72 1,2 0,02 10,1 1,67 844
7
524 1000 4,4 364 285 0 7,6 68 6,5
8
1000 1026 128,6 772 9,7 0,002 1,85 27 265
9
13,3 348 878 0,3 0,01 139 338
10
51,2 204 45 0,03 0,01 177 824
11
9,4 49 56 0,01 2,68 597 263
12
0,1 635 17,1 240 0,01 7,4
13
5,1 19,7 1014 0,02 2,94 0,01
14
0,02 750 72,2 0,01 0,01 0,01
Mediana
418,0 499,0 16,7 170,5 69,8 0,17 1,28 47,5 338,0
media
502,0 579,0 28,9 262,0 268,2 17,9 24,1 138,9 381,0
D.E.
519,0 467,0 36,5 276,9 397,1 64,0 61,8 183,7 284,0
Administrar PEG-mIL-10 o IL-10 a ratones que tienen carcinoma de mama 4T1 reduce la tasa de metastasis y aumenta la infiltracion de celulas T CD8 y la expresion de citoquinas inmunoestimuladoras, medido por RT-PCR cuantitativa (Tablas 12 y 13). El numero de celulas T CD8+ infiltrantes se conto de secciones representativas de 15 varios tumores tenidos por inmunohistoqmmica para el marcador de superficie CD8 y se verifico por tincion con anticuerpos anti-CD3 y anti-TCRap.
Tabla 12: IL-10 y PEG-mIL-10 inducen infiltracion de celulas T CD8+ en carcinoma 4T1
Control IL-10 PEG-IL-10
Numero medio de celulas CD8+/campo
6,4 25,8 39,2
20 PEG-mIL-10 es mas eficaz que IL-10 en la induccion de citoquinas inflamatorias. Se extrajo el ARN total de muestras tumorales homogenizadas y se hizo transcripcion inversa como se ha descrito previamente (vease, por ejemplo, Homey, et al. (2000) J. Immunol. 164:3465-3470). El ADN complementario se analizo cuantitativamente para expresion de citoquinas por el ensayo de PCR 5'-nucleasa fluorogenico (vease, por ejemplo, Holland, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280). Se midieron continuamente productos de PCR espedficos por medio 25 de un sistema de deteccion de secuencia ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) durante 40 ciclos. Los valores se normalizaron respecto a ubiquitina. Los datos transformados logantmicamente se sometieron a analisis estadfstico de Kruskal-Wallis (metodo de la mediana). El nivel de expresion (transformado logantmicamente) corresponde a la cantidad de citoquina inflamatoria expresada en la muestra tumoral, de modo que cuanto mayor sea el nivel de expresion (transformado logantmicamente), mayor la cantidad de citoquina inflamatoria expresada en la muestra 30 tumoral.
Tabla 13: PEG-mIL-10 administrada induce niveles sostenidos de citoquinas inflamatorias en carcinoma 4T1 24 h despues de la administracion de la dosis
5
10
15
20
25
30
35
40
Citoquina
control IL-10 PEG-mIL-10
IFNy
36,04 68,51 98,96
IL-4
7,77 13,13 40,32
IL-6
43,64 50,59 111,98
IL-10
9,94 41,62 106,16
ligando de RANK
19,14 36,13 46,08
V. Eliminacion de celulas inmunitarias
Se eliminaron las celulas T CD4+ y CD8+ por eliminacion mediada por anticuerpo. Se inyectaron 250 ug de anticuerpos espedficos para CD4 o CD8 semanalmente para este fin. Las eliminaciones de celulas se verificaron usando analisis por FACS e IHC.
La eliminacion de celulas T CD4+ en ratones BALB/c deficientes en celulas B (C.129-Igh-6tm/Cgn) con anticuerpos de CD4 inhibe la funcion de PEG-hIL-10 sobre tumores (Tabla 14).
Tabla 14: El tratamiento con PEG-hIL-10 empezando 8 dfas despues del implante tumoral fracasa para reducir el tamano del tumor (mm3) de carcinoma de colon CT-26 despues de eliminacion de CD4 en ratones BALB/c deficientes en celulas B (C.129-Igh-6tm/Cgn)
Dfas despues del implante
8 10 13 19 27
PBS
173 322 391 841 1979
PEG-hIL-10
184 276 251 602 1332
La eliminacion de celulas T CD8 inhibe completamente el efecto de PEG mIL-10 sobre tumor singenico (Tabla 15).
Tabla 15: El tratamiento con PEG-hIL-10 empezando 8 dfas despues del implante tumoral fracasa para reducir el tamano del tumor (mm3) de carcinoma de colon CT-26 despues de eliminacion de CD8 en ratones BALB/c deficientes en celulas B
Dfas despues del implante
8 10 13 19 27
PBS
151 335 584 1434 2746
PEG-hIL-10
226 575 1047 2449 4799
VI. Terapias de combinacion
Se administra PEG-IL-10 en combinacion con agentes quimioterapeuticos conocidos antes de, al mismo tiempo que, o posterior a la administracion de PEG-IL-10. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos e intervalos de dosis se proporcionan en la tabla 16.
Tabla 16: Intervalos de dosis de agentes quimioterapeuticos
Agente quimioterapeutico
Intervalo de dosis
Temozolomida
5 mg-250 mg
Gemcitabina
200 mg-1 g
Doxorrubicina
1 mg/m2-50 mg/m2
Interferon alfa
1 ug/kg-300 ug/kg
La coadministracion de PEG-IL-10 puede permitir el uso de dosis menores, menos toxicas de los agentes quimioterapeuticos, evitando de esta manera efectos secundarios conocidos.
La presente divulgacion tambien se refiere a los siguientes puntos:
1. Un metodo de inhibir o reducir el crecimiento de un tumor o cancer que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad eficaz de una interleuquina-10 pegilada (PEG-IL-10).
2. El metodo del punto 1, en donde la PEG-IL-10 comprende un enlazador metoxi-PEG-aldefndo (PALD-PEG).
3. El metodo del punto 1, en donde la PEG-IL-10 inhibe el crecimiento del tumor o cancer.
4. El metodo del punto 1, en donde la PEG-IL-10 reduce el tamano del tumor o cancer.
5. El metodo del punto 1, en donde la PEG-IL-10 aumenta la infiltracion de celulas T CD8+ en el tumor cuando se
compara con iL-10 no pegilada.
6. El metodo del punto 1, en donde la PEG-IL-10 aumenta la expresion de la menos una citoquina inflamatoria.
5
10
15
20
25
30
35
40
7. El metodo del punto 6, en donde la citoquina inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 y ligando de RANK (RANK-L).
8. El metodo del punto 1, en donde la PEG-IL-10 se coadministra con al menos un agente quimioterapeutico.
9. El metodo del punto 8, en donde el agente quimioterapeutico es al menos uno de los agentes quimioterapeuticos de la tabla 16.
10. El metodo del punto 1, en donde el tumor o cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de colon, cancer ovarico, cancer de mama, melanoma, cancer de pulmon, glioblastoma, y leucemia.
11. Un metodo de tratar a un sujeto que padece un cancer o tumor que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de PEG-IL-10.
12. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 comprende un enlazador metoxi-PEG-aldehndo (PALD-PEG).
13. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 inhibe el crecimiento del cancer o tumor.
14. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 reduce el tamano del cancer o tumor.
15. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 aumenta la infiltracion de celulas T CD8+ en el tumor cuando se compara con IL-10 no pegilada.
16. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 aumenta la expresion de la menos una citoquina inflamatoria.
17. El metodo del punto 16, en donde la citoquina inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en IFNy, IL-4,
IL-6, IL-10 y RANK-L.
18. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 se coadministra con al menos un agente quimioterapeutico.
19. El metodo del punto 18, en donde el agente quimioterapeutico es al menos uno de los agentes quimioterapeuticos de la tabla 16.
20. El metodo del punto 11, en donde la PEG-IL-10 reduce la metastasis de un cancer o tumor.
21. El metodo del punto 11, en donde el tumor o cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de colon, cancer ovarico, cancer de mama, cancer de pulmon, melanoma, glioblastoma, y leucemia.
22. El metodo del punto 11, en donde el sujeto es humano.
23. El metodo del punto 22, en donde la PEG-IL-10 es PEG-IL-10 humana (PEG-hIL-10).

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una interleuquina 10 pegilada (PEG-IL-10) para uso en tratar un sujeto que padece linfoma.
    5 2. Uso de una PEG-IL-10 para la fabricacion de un medicamento para tratar un sujeto que padece linfoma.
  2. 3. PEG-IL-10 para uso de la reivindicacion 1 o el uso de la reivindicacion 2, en donde la PEG-IL-10 se
    coadministra con al menos un agente quimioterapeutico.
    10 4. PEG-IL-10 para uso de la reivindicacion 3 o el uso de la reivindicacion 3, en donde el agente
    quimioterapeutico es al menos uno de los agentes quimioterapeuticos seleccionados del grupo que consiste en temozolomida en un intervalo de dosis de 5 mg a 250 mg, gemcitabina en un intervalo de dosis de 200 mg a 1 g, doxorrubicina en un intervalo de dosis de 1 mg/m2 a 50 mg/m2 e interferon alfa en un intervalo de dosis de 1 |jg/kg a 300 jg/kg.
    15
  3. 5. PEG-IL-10 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el sujeto es humano.
  4. 6. PEG-IL-10 para uso de la reivindicacion 5 o el uso de la reivindicacion 5, en donde la PEG-IL-10 es PEG-IL-
    20 10 humana (PEG-hIL-10).
  5. 7. PEG-IL-10 para uso de la reivindicacion 5 o 6 o el uso de la reivindicacion 5 o 6, en donde la PEG-IL-10 comprende una molecula de PEG que tiene un peso molecular de 5 kDa a 50 kDa.
    25 8. PEG-IL-10 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 7 o el uso de las reivindicaciones 2 y 5 a 7,
    en donde la PEG-IL10 comprende un enlazador metoxi-PEG-aldefndo (PALD-PEG).
  6. 9. PEG-IL-10 para uso de la reivindicacion 8 o el uso de la reivindicacion 8, en donde el enlazador PALD-PEG comprende una molecula de PEG que tiene un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 5 kDa,
    30 12 kDa o 20 kDa.
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