JP2014513103A - 組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】組成物及び方法の提供
【解決手段】ポリエチレングリコール(PEG)を含む組成物が、頭頸部扁平上皮ガン(HNSCC)の予防及び/又は治療のために開示される。PEGの有効量を投与することを含むHNSCCの予防及び/又は治療のための方法もまた開示される。同様に開示されるものは、PEGを使用するEGFRの表面発現を抑制するための方法及び組成物である。
【選択図】図1
【解決手段】ポリエチレングリコール(PEG)を含む組成物が、頭頸部扁平上皮ガン(HNSCC)の予防及び/又は治療のために開示される。PEGの有効量を投与することを含むHNSCCの予防及び/又は治療のための方法もまた開示される。同様に開示されるものは、PEGを使用するEGFRの表面発現を抑制するための方法及び組成物である。
【選択図】図1
Description
本発明は、頭頸部扁平上皮ガン(HNSCC)のような扁平上皮ガンの予防及び/又は治療に使用するための組成物に関する。本発明はまた、そのようなガンを予防及び/又は治療するための方法にも関する。本発明の他の観点、目的及び利点は、以下の記載から明らかとなる。
頭頸部ガンは、2010年、米国において約7900人の死亡を引き起こしたと見積られている(Pfister等;J.Natl,Compr.Canc.Netw.2011年;9巻:596−650頁)。この疾患を進行させる通常の危険因子は、タバコの喫煙又は咀嚼、アルコールの消費、ビンロウの咀嚼及び/又はヒトパピローマウィルス(HPV)の感染を含む。
頭頸部扁平上皮ガンは、米国における全てのガンの約3パーセントの割合を占める。ここで使用される、用語“HNSCC”は、扁平上皮細胞(皮膚、目、種々の内部器官の表面及び中空器官の内層及び幾つかの腺の導管を形成する、薄く、平坦な細胞)に発症するあらゆる頭頸部のガンを含む。
HNSCCは、高い死亡率及び罹患率と関連付けられている。この攻撃性の上皮性悪性腫瘍は、口腔、中咽頭及び咽頭を含む上気道消化管の粘膜内層に影響を及ぼす。
治療処置の後でさえ、患者は、通常、頭頸部位又は肺部位である、進行性の新規な二次ガンの増大した生涯リスクを依然として有する。進行性HNSCCの早期の危険因子は、口腔白板症であるが、一方、生存者の約30%が二次悪性腫瘍を発症する。
“領域ガン化”としても既知である、先行する前ガン状態のガン領域の結果として、原発性ガンの再発を経験していないこれらの患者でさえ、二次悪性腫瘍を発症する高いリスクを有する。
例えば、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)、レチノイン酸、β−カロテンによるHNSCCの化学予防は、今日まで、最小限の効力を提示したが、それは毒性を伴う。豊富な治療選択にも関わらず、HNSCCの5年生存率は、最近の40ないし50年に亘って、大きく進展していない。更に、疾患重症度及びそれに続く根治的外科管理の結果として、HNSCC患者は、容貌、発話、嚥下及び呼吸における衰弱性の変化に起因して生活の質が悪化する。
このように、この疾患の予防及び/又は治療を改善するための要求が依然として存在する。
Pfister等;J.Natl,Compr.Canc.Netw.2011年;9巻:596−650頁
本発明は、少なくとも1部分において、ポリエチレングリコール(PEG)がHNSCCにおいて抗増殖活性を示すことを見出したことに基づく。
本発明に従って、被験者における扁平上皮ガン、特にHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が提供されるが、該方法は、ポリエチレングリコール(PEG)の有効量を被験者に投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明に従って、被験者における扁平上皮ガン、特にHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が提供されるが、該方法は、ポリエチレングリコール(PEG)の有効量を被験者に投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
別の態様において、本発明は、PEGの有効量を被験者に投与することを含む、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法を提供するが、ここで、該方法における使用のために適当なPEGは、好ましくは、約1000ダルトンと20,000ダルトンの間、好ましくは、約2000ダルトンと9,000ダルトンの間、より好ましくは、約3000ダルトンと8,000ダルトンの間、最も好ましくは、約3350、4000又は8,000の平均分子量を有する。
別の態様において、本発明は、本発明の種々の観点及び態様において記載されるHNSCCの予防及び/又は治療における使用のための組成物を提供するが、該組成物は、PEGの有効量を(例えば、唯一の治療効果のある成分として)含む。該組成物は、ここに記載したような平均分子量を有するPEGを含み得る。
1態様において、本発明は、PEGの有効量を前記被験者に局所的に投与することを含む、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
別の態様に従って、本発明は、PEGの有効量を、HNSCCを発症した被験者の領域及び/又は前ガン状態の領域及び/又は口腔白板症に局所領域で投与することを含む、被験者におけるHNSCCの開始及び/又は増殖を減少又は抑制するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
別の態様に従って、本発明は、PEGの有効量を前記被験者に局所領域で投与することを含む、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
別の態様に従って、本発明は、PEGの有効量を前記被験者に局所領域で投与することを含む、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
本発明は更に、HNSCCを発症した被験者における該疾患の予防及び/又は治療における局所領域の使用のための組成物を提供するが、ここで、該組成物はPEGの有効量を含む。
本発明の1態様において、PEGの有効量が1日に1ないし5回、好ましくは、1日に2ないし4回、より好ましくは1日に3回、被験者に投与される、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が更に考慮される。
本発明の1態様において、PEGの有効量が1日に1ないし5回、好ましくは、1日に2ないし4回、より好ましくは1日に3回、被験者に投与される、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が更に考慮される。
1態様において、本発明は、被験者の、唇、口腔(舌、口腔粘膜、歯茎、臼後三角、歯肉、口腔底部、硬口蓋を含む)、唾液腺、鼻腔(鼻咽頭を含む)、副鼻腔、咽頭(舌根、軟口蓋、口蓋弓及び扁桃窩のような中咽頭を含む)、下咽頭(梨状陥凹、咽頭側壁、後咽頭壁、咽頭輪状後部を含む)、及び喉頭(声門上部(例えば、仮声帯、披裂部、喉頭蓋、披裂喉頭蓋襞)、声門、声門下)の1つ以上において、PEGの有効量を前記被験者に投与することを含む、被験者の頭頸部におけるHNSCCの増殖を減少又は抑制するための方法を提供する。
本発明は更に、前記HNSCCが、被験者の、唇、口腔(舌、口腔粘膜、歯茎、臼後三角、歯肉、口腔底部、硬口蓋を含む)、唾液腺、鼻腔(鼻咽頭を含む)、副鼻腔、咽頭(舌根、軟口蓋、口蓋弓及び扁桃窩のような中咽頭を含む)、下咽頭(梨状陥凹、咽頭側壁、後咽頭壁、咽頭輪状後部を含む)、及び喉頭(声門上部(例えば、仮声帯、披裂部、喉頭蓋、披裂喉頭蓋襞)、声門、声門下)の1つ以上に発症している、本発明の種々の観点及び態様に記載される被験者のHNSCCを予防及び/又は治療するための方法を提供す
るが、該方法は前記被験者の発症領域に、PEGの有効量を投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
るが、該方法は前記被験者の発症領域に、PEGの有効量を投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
本発明の好ましい態様は、PEGの有効量を口腔に投与する(例えば、局所領域で投与する)ことを含む、前記HNSCCが、口腔(又はその解剖構造)に発症している被験者のHNSCCを予防及び/又は治療するための方法である。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
更なる態様に従って、本発明は、被験者の頭頸部の扁平上皮細胞における上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)の表面発現及び/又は該受容体のリン酸化を減少又は阻害するための方法を提供するが、該方法は、PEGの有効量を前記被験者に投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
別の態様において、本発明は、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法であって、該方法は1種以上の更なる治療薬の有効量と共にPEGの有効量を前記被験者に共−投与することを含む方法を含む。PEGの有効量を含み、更に1種以上の更なる治療薬を任意に含む、そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明の別の観点において、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法であって、該方法は
(a)抗−EGFR薬(例えば、セツキシマブのような抗−EGFR抗体)のような治療薬の有効量;
(b)PEGの有効量
を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。
(a)抗−EGFR薬(例えば、セツキシマブのような抗−EGFR抗体)のような治療薬の有効量;
(b)PEGの有効量
を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。
本発明のこの観点の幾つかの態様において、段階(a)は段階(b)の前に起きる。本発明のこの観点の他の態様において、段階(a)は段階(b)の後に起きる。本発明のこの観点の更なる態様において、段階(a)と段階(b)は、同時に起きる。
本発明の別の態様において、HNSCCの寛解にある被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法であって、該方法は、PEGの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。該被験者は、一部又は完全寛解であり得る。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明の別の態様において、その疾患の寛解にある被験者におけるHNSCCの再発を改善(例えば予防)するための方法であって、該方法は、PEGの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明の別の態様において、被験者における転移性のHNSCCを予防及び/又は治療するための方法であって、該方法は、PEGの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明の別の態様において、被験者における局所進行性であるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法であって、該方法は、PEGの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明の別の観点において、被験者における扁平上皮ガンを退縮するための方法であっ
て、該方法は、PEGの有効量を投与することを含む方法が提供される。ここに記載されるような、そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。本発明のこの観点の幾つかの態様において、扁平上皮ガンはHNSCCである。好ましくは、扁平上皮ガンはEGFRを過剰発現している。扁平上皮ガンのEGFR発現状態は、ここに記載されるような標準的な方法、技術及びキットに従って決定され得る。
て、該方法は、PEGの有効量を投与することを含む方法が提供される。ここに記載されるような、そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。本発明のこの観点の幾つかの態様において、扁平上皮ガンはHNSCCである。好ましくは、扁平上皮ガンはEGFRを過剰発現している。扁平上皮ガンのEGFR発現状態は、ここに記載されるような標準的な方法、技術及びキットに従って決定され得る。
本発明のこの観点の態様において、方法は更に、(b)扁平上皮ガンを切除すること及び/又は除去すること及び/又は治療剤の有効量を投与することを含む。本発明のこの態様において、段階(b)は、段階(a)の後に起こり得る。扁平上皮ガンを退縮することにより、本発明は、後の治療手段の結果として生じる被験者に対する心的傷害の程度又は治療に関連する有害事象を減少し得る。
本発明の別の観点において、
(a)1つ以上のHNSCCガンを切除すること及び/又は除去すること;
(b)PEGの有効量を被験者に投与すること
を含む被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が提供される。
本発明のこの観点の1態様において、段階(a)は、段階(b)の前に起こる。別の態様において、段階(b)は、段階(a)の前に起こる。
(a)1つ以上のHNSCCガンを切除すること及び/又は除去すること;
(b)PEGの有効量を被験者に投与すること
を含む被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が提供される。
本発明のこの観点の1態様において、段階(a)は、段階(b)の前に起こる。別の態様において、段階(b)は、段階(a)の前に起こる。
本発明は更に、HNSCCの治療及び/又は予防のための薬剤、例えば、ここに記載される組成物の製造におけるPEGの有効量の使用を提供する。
本発明は更に、HNSCCのような扁平上皮ガンを退縮するための薬剤、例えば、ここに記載される組成物の製造におけるPEGの有効量の使用を提供する。
本発明は更に、HNSCCのような扁平上皮ガンを退縮するための薬剤、例えば、ここに記載される組成物の製造におけるPEGの有効量の使用を提供する。
発明の詳細な説明
本発明の組成物
本発明の組成物は、以下に更に詳細に記載されるように、その唯一の治療効果のある成分としてPEGの有効量を含み得るか又は1種以上の治療薬(特に、抗ガン剤)を含み得る。用語“ポリエチレングリコール”(PEG)は、エチレンオキシドのポリマーを言及する、別名、ポリ(オキシエチレン)又はポリ(エチレンオキシド)(PEO)としても既知である。本発明で使用されるポリエチレングリコール(PEG)は、典型的には、一般式、H−(OCH2CH2)nOHを有するが、しかし、末端がキャップされた構造及びエチレンオキシド以外に少量のアルキレンオキシド単位を含むポリオキシエチレンのような他のポリエチレングリコール化合物を使用し得る。
本発明の組成物
本発明の組成物は、以下に更に詳細に記載されるように、その唯一の治療効果のある成分としてPEGの有効量を含み得るか又は1種以上の治療薬(特に、抗ガン剤)を含み得る。用語“ポリエチレングリコール”(PEG)は、エチレンオキシドのポリマーを言及する、別名、ポリ(オキシエチレン)又はポリ(エチレンオキシド)(PEO)としても既知である。本発明で使用されるポリエチレングリコール(PEG)は、典型的には、一般式、H−(OCH2CH2)nOHを有するが、しかし、末端がキャップされた構造及びエチレンオキシド以外に少量のアルキレンオキシド単位を含むポリオキシエチレンのような他のポリエチレングリコール化合物を使用し得る。
本発明の組成物中に使用されるポリエチレングリコール(PEG)は、範囲の下限が、1000、2000、3000、4000、6000からなる群より選択され;及び範囲の上限が、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、15,000、20,000からなる群より、独立して選択されるところの範囲における、平均分子量(例えば、重量平均分子量)を有し得る。好ましい範囲は、下限が3000又は4000であり、上限が5000、6000、7000、8000又は9000から独立して選択されるところの範囲である。
例えば、PEGは、幾つかの国内又は地域の薬局方において規定されるような、PEG3350、PEG4000又はPEG8000であり得る。幾つかの国内又は地域の薬局方において承認されている適当なPEGの更なる例は、マクロゴール類、例えば、マクロゴール3350、マクロゴール4000、マクロゴール8000を含む。好ましくは、PEGは、被験者に局所投与される場合、殆ど全身的に吸収されない。
本発明の組成物は、更に、別の治療薬(以下参照)及び1種以上の添加物のような他の成分を含み得る。添加物の例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウムのような硫酸塩のような1種以上の電解質を含む。1態様において、本発明の組成物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウム及び任意に重炭酸ナトリウムを含む。本発明の組成物は、1種以上の甘味料(例えば、アスパルテーム、アセスルファムカリウム(アセスルファム K)、スクラロース及びサッカリン並びにそれらの組合せ)及び1種以上の香味料(例えば、オレンジ、レモン−ライム、レモン、シトラス、チョコレート、トロピカルフルーツ、アロエ ベラ、茶、ストロベリー、グレープフルーツ、ブラックカラント、パイナップル及びバニラ)を含み得る。組成物は、アスコルビン酸塩及び/又はクエン酸塩を更に含み得る。本発明の組成物は、保存料及び、許容可能なガレノスプラクティス(acceptable galenic practice)として知られ及び呼ばれる、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キャリア、キレート剤及び不活性ガス等他の添加物のような他の添加物を更に含み得る。好ましくは、キャリアは薬学的に許容可能なキャリアである。キャリアは、従来使用される如何なるものでもあり得、PEG及び/又は他の治療薬(存在する場合)との溶解性及び反応性の欠如のような物理化学的考察によってのみ及び投与経路によってのみ限定される。薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に周知であり、容易に入手可能である。該薬学的に許容可能なキャリアが、活性薬剤に対して不活性であるものであり且つ使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
本発明の組成物は、種々の配合物中に存在し得る。例えば、本発明の組成物は、水溶液又は懸濁液(例えば、マウスウォッシュ)、乳濁液、ペースト(例えば、練り歯磨き)、クリーム、バーム(例えば、リップバーム)、軟膏、フォーム、塗剤(paint)、スポンジ、ジェル、チューインガム、噴霧剤、ドロップ(lozenge)、トローチ、シロップ(例えば、増粘シロップ)、リンクタス、スラリー、フィルム(例えば、口腔内崩壊フィルム)、錠剤(例えば、口腔内崩壊錠)、カプセル(例えば、液体ゲルカプセル)、顆粒、カプレット、口腔パッチの形態で調製され得る。本発明の組成物の特に好ましい配合物は、溶液、リンクタス及び塗剤(paint)を含む。
本発明の組成物の使用目的に依存して、ある配合物が特に適切であり得る。例えば、本発明の組成物を唇に投与することを望む場合、該組成物はリップバーム又はクリームとして調製され得る。該組成物を口腔粘膜の領域に投与することを望む場合、マウスウォッシュ、噴霧剤又はドロップが特に適当であり得る。配合物がマウスウォッシュである場合、それは嚥下又は喀出の前にうがいされるか又は口の周りを旋回され得る。本発明の組成物は、特に、鼻腔、口腔又は中咽頭投与のためのエアロゾル配合物として調製され得る。本発明の組成物はまた、ネブライザー又はアトマイザーにおけるような非加圧の配合物としても調製され得る。幾つかの態様において、本発明の組成物は、当業者において周知の配合物形態である、リンクタス配合物であり得る。この形態は、PEGと標的組織(例えば、咽頭及び/又は喉頭粘膜)との間の接触時間の増加を支援し得、また、これらの解剖学的部位におけるHNSCCの予防及び/又は治療において特に適当であり得る。
1態様において、本発明の組成物は、被験者に局所的に投与される。局所投与とは、本発明との関連で、本発明の組成物の被験者の身体の表面への適用を言及する。局所投与は、被験者の内部表面、例えば、口腔粘膜への適用を含む。本発明の組成物は、標的領域(例えば、ガン腫)及びその局所領域中に投与され得る(時々、ここ及び該技術分野において“局所領域投与(locoregional administration)”として言及される)。典型的には、本発明の組成物は、被験者の身体の表面で接近可能であるガン腫、例えば、唇、舌、口腔粘膜(例えば、口腔底部/天井部)、鼻腔、咽頭、喉頭及びそれらの解剖学的部位に発症した表面が露出したHNSCCの領域に適用される。局所投与は、本発明の組成物の経口投与を含み得る。例えば、局所投与は、本発明の組成物を
嚥下することを含み得る。従って、組成物は咽頭を介して胃へ移行するため、本発明の組成物とガン腫(存在する場合)の表面露出領域との間の接触が可能となる。
嚥下することを含み得る。従って、組成物は咽頭を介して胃へ移行するため、本発明の組成物とガン腫(存在する場合)の表面露出領域との間の接触が可能となる。
治療的に用いられるPEGの有効量は、例えば、療法及び治療目的(例えば、予防又は治療又は両方)、投与経路、年齢、体重、治療又は療法を受ける被験者の状態(例えば、被験者の一般状態を決定することによる)、ガン腫(存在する場合)の病期及び/又は悪性度(例えば、TNMスコア)、被験者に対して提供されている、あらゆる予備又は補助療法、並びに、被験者における、本発明の組成物を伴う療法に対する以前の応答(適当ならば)に依存するだろう。PEGの有効量は、少なくとも部分的に、標的組織(例えば、HNSCCガン)のEGFR表面発現における所望の減少により決定され得る。PEGの有効量は、本発明に従って、標的組織において、PEGと接触する前に観察された発現と比べて、少なくとも30%(又はそのくらい)、例えば、少なくとも40%のEGFR発現の減少をもたらし得る。
ガン腫のような標的組織におけるEGFR表面発現の減少は、PEGと標的組織との間の接触時間により影響され得る。一般に、標的組織におけるEGFR表面発現における、より大きな減少は、増加された接触時間で観察され得る。例えば、PEGと標的組織との間の接触時間は、5秒ないし10分、例えば、2ないし3分のような、1ないし5分であり得る。PEGの有効量は、従って、それに応じて漸増し得る。
EGFR減少の程度は、ここの実施例に記載された方法を使用して決定され得る。特に、EGFR減少の程度は、以下に記載されるようなフローサイトメトリーを使用して決定され得る。
標的組織のEGFR発現状態は、標準的な方法及びキット(例えば、EGFR pharmDx(登録商標)、デンマーク国、グロストルップのDako Denmark A/Sより入手可能)を使用して決定され得る。
HNSCCの予防における使用のためのPEGの有効量は、HNSCCの治療における使用のためのPEGの有効量とは異なり得る。1態様において、予防の設定において、治療の設定において典型的に使用されるよりも少ない量のPEGが必要とされる。PEGは既に医療分野において広範に使用され、良好な耐容性を示すため、重篤な有害事象は、低度であると考えられる。本発明は、PEGが濃度依存的な様式でビトロにおけるHNSCC細胞の増殖を阻害することを可能とすることを提示するため、それは、当業者が上記の考察に従ってPEGの有効量を決定する範囲内にある。
本発明の組成物は、PEGの有効量を含み得る。例えば、本発明の水溶液(例えば、マウスウォッシュ)は、7.5%w/v以上(例えば、10%w/v以上)のPEGを含み得る。PEGの有効量を含む本発明の組成物は、1日当たり1回以上、例えば、1日当たり2回、1日当たり3回、4回又は5回投与され得る。本発明の組成物を用いる療法の持続は、部分的に、上記の考察に依存する。そのような考察は、主治医又はヘルスケアの専門家の範囲内にある。
治療薬
PEGの有効量を含む本発明の組成物は、HNSCCの予防及び/又は治療のために1種以上の治療薬と併用して使用し得る。例えば、本発明の組成物は、1種以上の治療薬と共投与され得る。用語“共投与”は、HNSCCを予防及び/又は治療するための、1種以上の治療薬を伴う本発明の組成物の協調投与を意味する。そのような本発明の組成物と1種以上の治療薬との間の協調投与は、同時、逐次又は別個であり得る。
PEGの有効量を含む本発明の組成物は、HNSCCの予防及び/又は治療のために1種以上の治療薬と併用して使用し得る。例えば、本発明の組成物は、1種以上の治療薬と共投与され得る。用語“共投与”は、HNSCCを予防及び/又は治療するための、1種以上の治療薬を伴う本発明の組成物の協調投与を意味する。そのような本発明の組成物と1種以上の治療薬との間の協調投与は、同時、逐次又は別個であり得る。
本発明の組成物と共に使用し得る治療剤の例は、放射線治療及び抗ガン剤を含む。用語“抗ガン剤”は、扁平上皮ガン、特に頭頸部の扁平上皮ガンのようなガン細胞において、ガンの開始及び/又は増殖を阻害及び/又は細胞死(例えば、アポトーシスによる)を促進することが可能な治療剤を意味する。そのような治療剤は、そのような使用のために、国内又は地域の薬局方により承認された治療剤を含む。
抗ガン剤の例は、EGFR発現及び/又は機能を標的とする剤(例えば、EGFRの機能的なシグナル伝達を阻害することによる)を含み、ここでは“抗−EGFR薬”として参照される。抗−EGFR薬の例は、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツマブ(zalutumab)、ニモツズマブのような抗−EGFR抗体を含む。他の抗−EGFR薬は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、BIBW−2992を含む。
抗ガン剤の例は、VEGFR発現及び/又は機能を標的とする剤(“抗−VEGFR薬”)を含む。抗−VEGFR薬の例は、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブを含む。
抗ガン剤の例は、IGF−1R発現及び/又は機能を標的とする剤(“抗−IGF−1R薬”)を含む。抗−IGF−1R薬の例は、フィギツムマブ(figitumumab)及びシクスツムマブ(cixtumumab)を含む。
抗ガン剤の例は、ラパマイシンの哺乳類標的を阻害する剤(“mTOR薬”)を含む。そのようなmTOR薬の例は、テムシロリムス、エベロリムスを含む。
抗ガン剤の更なる例は、シスプラチン及びカルボプラチンのような白金製剤;パクリタキセル及びドセタキセルのようなタキサン類;ペメトレキセドのような葉酸代謝拮抗薬;フルオロウラシル、メトトレキサートを含む。
他の抗ガン剤の例は、ダサチニブ、ロナファルニブ及びボルテゾミブを含む。
他の抗ガン剤の例は、ダサチニブ、ロナファルニブ及びボルテゾミブを含む。
幾つかの態様において、本発明の組成物は、上述のような1種以上の抗ガン剤の有効量と一緒に(例えば、緊密な物理混合物において)PEGの有効量を含む。好ましくは、PEGは、抗ガン剤と結合していない。この明細書の読者は、上述の1種以上の抗ガン剤と一緒のPEGの各組み合わせが本発明の態様として、個別に及び具体的に考慮されると想定し得る。
1種以上の治療薬の有効量が、必ずしもPEGの有効量と同じ質量を必要としないことは明白になる。放射線治療との関連において、用語“有効量”を考慮した場合、適切な用量単位(例えば、グレイ(gy)又はラド)が配備されるべきであることもまた、明白になる。
本発明の他の態様において、任意の使用説明書を伴って、上述したような1種以上の抗ガン剤の少なくとも1つの組成物を伴う本発明の組成物を含むキットが提供される。
治療方法及びそのような方法における使用のための組成物
本発明は、PEGの有効量を投与することを含む、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療する方法を提供する。本発明はまた、被験者におけるHNSCCの予防及び/又は治療における使用のための組成物も提供する。
本発明は、PEGの有効量を投与することを含む、被験者におけるHNSCCを予防及び/又は治療する方法を提供する。本発明はまた、被験者におけるHNSCCの予防及び/又は治療における使用のための組成物も提供する。
本発明の組成物及び治療方法は、特に、表面EGFRが過剰発現したHNSCCのような扁平上皮ガンの治療における使用であり得る。被験者における扁平上皮ガンのEGFRの発現状態は、標準方法及びキット(例えば、EGFR pharmDx(登録商標)、
デンマーク国、グロストラップのDako Denmark A/Sより入手可能)に従って決定し得る。
デンマーク国、グロストラップのDako Denmark A/Sより入手可能)に従って決定し得る。
1態様において、本方法は、HNSCCを予防するためのものである。別の態様において、本方法は、HNSCCを治療するためのものである。更なる態様において、本方法は、HNSCCを予防及び治療するためのものである。
同義語“予防(prophylaxis)”及び“予防すること(preventing)”並びにそれらの文法的変異は、HNSCC(又は、場合により、食道のガンであり得る)の発生を阻害すること及び/又は上皮の前ガン病変(口腔白板病のような)及び/又は早期ガンの後期ガンへの進展を阻害することを意味する。
幾つかの態様において、本発明の予防方法は、HNSCCの陽性診断に先立って行われる。
幾つかの態様において、本発明の予防方法は、HNSCCの陽性診断に先立って行われる。
用語“治療(treat)”及びその文法的変異は、HNSCC(又は、場合により、食道のガンであり得る)の増殖を阻害すること及び/又はHNSCC(又は、場合により、食道のガンであり得る)における細胞死を促進することを意味する。幾つかの態様において、治療は“回復(cure)”を含むが、用語回復は、必ずしも悪性度に関連する健康の完全な復元を意味するものではない。当業者は、治療が様々な程度の治療効果を有し得、また、そのようなものも用語“治療”に含まれると認識する。
本発明は更に、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、HNSCCの寛解にある被験者におけるその疾患を予防するための方法を提供する。寛解は完全又は一部であり得る。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明は更に、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、被験者の局所進行性及び/又は転移性であるHNSCCを治療するための方法を提供する。
本発明の別の態様において、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、進行性HNSCCに対して感受性である被験者のHNSCCを予防及び/又は治療するための方法が提供される。そのような被験者は、タバコ(喫煙及び/又は噛みタバコ)、アルコール過量摂取、ビンロウ噛みの経歴を有する及び/又は同時使用する被験者を含む。そのような被験者は、HPV(特に血清型HPV 16)に感染している及び/又は免疫不全である及び/又は進行性HNSCCの(又はHNSCCにかかりやすい)家族歴又は前歴を有する被験者を含む。本発明は更に、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、HPV陰性である被験者のHNSCCを予防及び/又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
別の態様において、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、口腔白板症及び/又は口腔紅板症を発症している被験者のHNSCCを予防するための方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
別の態様において、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、上気道消化管の上皮に対して前ガン状態の変化を発症している被験者のHNSCCを予防するための方法が提供される。前ガン状態の変化は、“領域ガン化”の結果として生じ得る。領域ガン化は、変形のために上皮を用意する変化(それは、多発性であり得、互いに独立し得る)に上皮が従う過程を言及する。これらの変化は、上皮血管系に対する微妙な変化、上皮に対する細胞形成異常及び他の分子変化において明らかであり得る。この態様は、HNSCCの前歴を有する(又はHNSCCにかかりやすい)被験者のHNSCCの予防において特に適切であり得る。
本発明の別の観点において、被験者におけるHNSCCのような扁平上皮ガンを予防及び/又は治療するための方法であって、該方法は、
(a)前記被験者に放射線治療及び/又は抗ガン剤、例えば、抗−EGFR薬(例えば、セツキシマブのような抗−EGFR抗体)のような治療薬の有効量を投与すること;
(b)前記被験者にPEGの有効量を投与すること
を含むところの方法が提供される。
(a)前記被験者に放射線治療及び/又は抗ガン剤、例えば、抗−EGFR薬(例えば、セツキシマブのような抗−EGFR抗体)のような治療薬の有効量を投与すること;
(b)前記被験者にPEGの有効量を投与すること
を含むところの方法が提供される。
本発明のこの観点の1態様において、段階(b)及び段階(a)は、同時に起こる。別の態様において、段階(b)が、段階(a)の後に起こる。別の態様において段階(b)が、段階(a)の前に起こる。本発明のこの観点の別の態様において、本方法は更に、(c)治療剤、例えば、放射線治療及び/又は抗ガン剤、例えば、抗−EGFR薬(例えば、セツキシマブのような抗−EGFR抗体)の有効量を投与すること;の段階を含む。この態様において、段階(b)は、段階(a)の後で且つ段階(c)の前に起こり得る。従って、PEGの有効量は他の治療剤、特に、放射線及び/又は抗ガン剤を用いる治療のサイクルの間に投与され得る。段階(a)及び段階(c)の治療剤は、必ずしも同じである必要はない。段階(a)及び段階(c)の治療剤が同じである場合、段階(a)及び段階(c)に従う薬量は、必ずしも同じである必要はない。
本発明の別の観点において、PEGの有効量は、HNSCCガンの切除及び/又は除去に関連して被験者のHNSCCを治療するために使用され得る。従って、以下の段階:
(a)少なくとも1つのHNSCCガンを切除すること及び/又は除去すること;
(b)PEGの有効量を投与すること
を含む、被験者のHNSCCを治療するための方法が提供される。
(a)少なくとも1つのHNSCCガンを切除すること及び/又は除去すること;
(b)PEGの有効量を投与すること
を含む、被験者のHNSCCを治療するための方法が提供される。
段階(a)は、段階(b)の前又は段階(b)の後の何れかで起こり得る。本発明のこの観点の幾つかの態様において、更に、ここに記載されるような治療剤の有効量を投与する段階を含む段階(c)が存在し得る。段階(c)は、段階(a)の後で且つ段階(b)の前、後又は同時に起こり得る。
本発明のこの観点の幾つかの態様において、PEGの有効量は、外科的な切除/除去の部位及び局所領域で投与され得る(例えば、局所領域投与)。本発明の幾つかの態様において、PEGの有効量は、HNSCCを発症している疑いがある頭頸部の病変に投与され得る(例えば、局所領域投与)。
本発明は更に、HNSCCの多様な治療のための方法(それは、HNSCCを治療するための少なくとも2種の異なるモダリティ、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法を含む治療である)であって、該方法がPEGの有効量を投与することを含むところの方法を提供する。
別の態様に従って、本発明は、被験者にPEGの有効量を投与することによる、被験者の頭頸部の扁平上皮細胞におけるEGFR発現及び/又はリン酸化を減少又は阻害するための方法を提供する。用量及び使用期間は、希望するEGFR発現又はリン酸化の減少の量に依存する。好ましくは、本発明の態様に従って、PEGは少なくとも1ないし14日間被験者に投与されるが、しかしながら、PEGは、より長い期間、又は扁平上皮細胞組織におけるEGFRの発現及び/又はリン酸化の減少が達成されるまで投与され得る。
本発明の観点に従って、被験者にPEGの有効量を投与することを含む、被験者における食道のガンを予防及び/又は治療するための方法が提供される。そのような方法における使用のための上記したような組成物もまた提供される。
本発明の更なる観点に従って、PEGの有効量を投与することを含む、HNSCCのような扁平上皮ガンを発症している被験者における全身腫瘍組織量(即ち、腫瘍数及び容積)を減少するための方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
本発明の方法で言及する被験者は、あらゆる被験者であり得る。好ましくは、被験者は、哺乳類である。ここで使用されるように、用語“哺乳類”は、マウス及びハムスターのようなネズミ目の哺乳類及びウサギのようなウサギ目の哺乳類を含むがこれらに限定されないあらゆる哺乳類を言及する。哺乳類が、Felines(猫)及びCanines(犬)を含む食肉目からのものであるのが好ましい。哺乳類が、Bovines(牛)及びSwines(豚)を含む偶蹄目又はEquines(馬)を含む奇蹄目からのものであるのがより好ましい。哺乳類が、霊長目、Ceboids(サル)又はSimoids(サル)或いは類人猿(ヒト及びサル)であるのが最も好ましい。特に好ましい哺乳類は、男性のヒトのようなヒトである。
例示
以下の実施例は本発明を更に説明するが、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
動物実験及び腫瘍誘導
全ての動物プロトコルは、ノースショア ユニバーシティー ヘルスシステムの所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use
Committee)により精査されて承認された。
以下の実施例は本発明を更に説明するが、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
動物実験及び腫瘍誘導
全ての動物プロトコルは、ノースショア ユニバーシティー ヘルスシステムの所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use
Committee)により精査されて承認された。
4NQO頭頸部扁平上皮ガンモデル
24匹の雌性のフィッシャーラット(F 344;150−200g;Harlan、インディアナポリス、インディアナ州)を、温度と湿度が調節された環境(25℃、湿度60%及び12時間の光/1日周期)中、1プラスチックケージに3匹で飼育した。16匹の動物は、ラットの餌及び4−ニトロキノリン1−オキシド(4NQO;20ppm;Sigma Chemicals、セントルイス、ミズーリ州)が添加された飲料水が不断利用で提供された。新たに製造された4NQO補強水が、1週間に2回補充された着色(淡い不透明色)ボトルでラットに与えられた。残りの8匹のラットは、清浄な飲料水が提供された(対照群)。14週後、4NQO添加水は、通常の水に置き換えられ、ラットは無作為に2つの治療群に分けられた。第一の群(8ラット)は、口腔内にPEG−8000の日毎の局所適用を受けた。これは、クロテンのブラシを使用してラットの口腔の口腔底部/天井部上に、少なくとも2ないし3分間、生理食塩水中の10%w/vPEGの溶液を塗布することにより達成された(#4)。対照としての機能を果たす、第二の群(8ラット)は、生理食塩水のみが塗布された。この投薬計画(レジュメ)は追加の14週間継続された。ラットは、突出した舌及び口腔におけるあらゆる総計の形態学的変化の存在を周期的に検査された。14週の終わりに、動物は制御されたCO2曝露/両側の開胸術下で安楽死された。解剖で、ラットの舌が切除され、巨視的な腫瘍評価に付された。舌部分が薄く切られ、ホルマリン固定され、パラフィン包埋され、区分され、組織学的及び免疫組織化学的処理に付された。
24匹の雌性のフィッシャーラット(F 344;150−200g;Harlan、インディアナポリス、インディアナ州)を、温度と湿度が調節された環境(25℃、湿度60%及び12時間の光/1日周期)中、1プラスチックケージに3匹で飼育した。16匹の動物は、ラットの餌及び4−ニトロキノリン1−オキシド(4NQO;20ppm;Sigma Chemicals、セントルイス、ミズーリ州)が添加された飲料水が不断利用で提供された。新たに製造された4NQO補強水が、1週間に2回補充された着色(淡い不透明色)ボトルでラットに与えられた。残りの8匹のラットは、清浄な飲料水が提供された(対照群)。14週後、4NQO添加水は、通常の水に置き換えられ、ラットは無作為に2つの治療群に分けられた。第一の群(8ラット)は、口腔内にPEG−8000の日毎の局所適用を受けた。これは、クロテンのブラシを使用してラットの口腔の口腔底部/天井部上に、少なくとも2ないし3分間、生理食塩水中の10%w/vPEGの溶液を塗布することにより達成された(#4)。対照としての機能を果たす、第二の群(8ラット)は、生理食塩水のみが塗布された。この投薬計画(レジュメ)は追加の14週間継続された。ラットは、突出した舌及び口腔におけるあらゆる総計の形態学的変化の存在を周期的に検査された。14週の終わりに、動物は制御されたCO2曝露/両側の開胸術下で安楽死された。解剖で、ラットの舌が切除され、巨視的な腫瘍評価に付された。舌部分が薄く切られ、ホルマリン固定され、パラフィン包埋され、区分され、組織学的及び免疫組織化学的処理に付された。
解剖したラットの舌は、顕性腫瘍の存在のために試験された。各舌における腫瘍(>0.2cm)の総数が数えられ、腫瘍容積(サイズ)が、式、幅×長さ×高さ×π/6に従って測定された(Tomayko M.M.及びReynolds C.P.、Cancer Chemother.Pharmacol.、24巻:148−154頁(1989年))。非病変の舌組織における上皮異型及び異形成の存在のための組織学的評価が、
ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色の後に実施された。
ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色の後に実施された。
頭頸部局所扁平上皮ガンモデル
この異種移植モデルにおいて、局所的な腫瘍の成長を模倣するために、扁平上皮細胞(SCC 25)が、口腔内の解剖学的発生部位の近くに直接移植された。このモデルは、腫瘍成長の退縮におけるPEGの効果を研究することを可能とする。B−細胞欠損無胸腺(nu/nu)マウスは、Charles River(MA)から調達した。SCC−25細胞[DMEM F12媒体50μL中の1×106個の細胞(ATCC)]がマウスの舌上部中に直接注入された。2週間後、腫瘍が出現し始めた場合、マウスを各12匹の動物の2群へ無作為に分け、Q−チップを使用する10%w/vのPEG8000(〜100μL)又はPBSの1日1回の口腔局所適用に付された。マウスは、19ないし20日間で安楽死され、CO2曝露/両側の開胸術下で後処理され、腫瘍が切除され、計量された。腫瘍及び舌組織は、ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色の前に、ホルマリン固定され、パラフィン包埋/装着された。組織病理学的評価が腫瘍の扁平上皮の性質を確認した。同様に評価されたものは、舌部位の免疫染色による増殖マーカーKi−67及びEGFRであった。
この異種移植モデルにおいて、局所的な腫瘍の成長を模倣するために、扁平上皮細胞(SCC 25)が、口腔内の解剖学的発生部位の近くに直接移植された。このモデルは、腫瘍成長の退縮におけるPEGの効果を研究することを可能とする。B−細胞欠損無胸腺(nu/nu)マウスは、Charles River(MA)から調達した。SCC−25細胞[DMEM F12媒体50μL中の1×106個の細胞(ATCC)]がマウスの舌上部中に直接注入された。2週間後、腫瘍が出現し始めた場合、マウスを各12匹の動物の2群へ無作為に分け、Q−チップを使用する10%w/vのPEG8000(〜100μL)又はPBSの1日1回の口腔局所適用に付された。マウスは、19ないし20日間で安楽死され、CO2曝露/両側の開胸術下で後処理され、腫瘍が切除され、計量された。腫瘍及び舌組織は、ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色の前に、ホルマリン固定され、パラフィン包埋/装着された。組織病理学的評価が腫瘍の扁平上皮の性質を確認した。同様に評価されたものは、舌部位の免疫染色による増殖マーカーKi−67及びEGFRであった。
免疫組織化学的(IHC)分析
組織切片は、増殖マーカーKi−67及びEGFRの発現におけるPEG 8000の効果を決定するために、IHC分析に付された。4ミクロンのパラフィン包埋切片がSuperfrost+スライド(Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州)上に装着され、最初に55ないし60℃で1時間焼成することにより脱パラフィン化し、その後、キシレン中で2回の5分間洗浄に付された。組織切片はその後、エタノール洗浄の段階的な系列において水和された。エピトープ賦活化は、組織スライドを、抗原脱マスキング溶液(Vector Laboratories)中で加圧マイクロ波加熱(NordicWare,ミネアポリス、ミネソタ州)に付すことにより達成された。内因性の過酸化物活性は、10分間メタノール中の3%H2O2で処理することによりクエンチされ、非特異的な結合は、室温で2時間5%ウマ血清で組織切片を培養することにより阻止された。切片はその後、一次抗体である抗−Ki−67(RB−9043−P、1:300 Thermo Scientific UK)及び抗−EGFR(SC−03、1:200 Santa Cruz Biotechnology、サンタクルーズ、カルフォルニア州)で4℃で4時間、続いて適当なビオチン化二次抗体で培養された。PBS洗浄を繰り返した後、抗原−抗体複合体は、色原体(chromagen)として3,3‘−ジアミノベンジジン(DAB)(Invitrogen,CA)を使用するVectastatin Elite ABC kit(Vector Laboratories)で検出された。陰性対照のために、切片は一次抗体の非存在下で処理された。標本はギルヘマトキシリン溶液中で対比染色され、飽和炭酸リチウム(1g/100mL)中の20秒間洗浄により青色安定化された。免疫組織化学(IHC)は、治療計画の予備知識を有さない病理学者によりスコア化された。判定量的なスケールが基底扁平上皮細胞の免疫反応性を評価するために使用された。染色の程度は、0,陰性染色;1+,<10%反応性、2+ 10−50%反応性、及び3+ >50%陽性の反応性として、等級化及びスコア化された。
組織切片は、増殖マーカーKi−67及びEGFRの発現におけるPEG 8000の効果を決定するために、IHC分析に付された。4ミクロンのパラフィン包埋切片がSuperfrost+スライド(Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州)上に装着され、最初に55ないし60℃で1時間焼成することにより脱パラフィン化し、その後、キシレン中で2回の5分間洗浄に付された。組織切片はその後、エタノール洗浄の段階的な系列において水和された。エピトープ賦活化は、組織スライドを、抗原脱マスキング溶液(Vector Laboratories)中で加圧マイクロ波加熱(NordicWare,ミネアポリス、ミネソタ州)に付すことにより達成された。内因性の過酸化物活性は、10分間メタノール中の3%H2O2で処理することによりクエンチされ、非特異的な結合は、室温で2時間5%ウマ血清で組織切片を培養することにより阻止された。切片はその後、一次抗体である抗−Ki−67(RB−9043−P、1:300 Thermo Scientific UK)及び抗−EGFR(SC−03、1:200 Santa Cruz Biotechnology、サンタクルーズ、カルフォルニア州)で4℃で4時間、続いて適当なビオチン化二次抗体で培養された。PBS洗浄を繰り返した後、抗原−抗体複合体は、色原体(chromagen)として3,3‘−ジアミノベンジジン(DAB)(Invitrogen,CA)を使用するVectastatin Elite ABC kit(Vector Laboratories)で検出された。陰性対照のために、切片は一次抗体の非存在下で処理された。標本はギルヘマトキシリン溶液中で対比染色され、飽和炭酸リチウム(1g/100mL)中の20秒間洗浄により青色安定化された。免疫組織化学(IHC)は、治療計画の予備知識を有さない病理学者によりスコア化された。判定量的なスケールが基底扁平上皮細胞の免疫反応性を評価するために使用された。染色の程度は、0,陰性染色;1+,<10%反応性、2+ 10−50%反応性、及び3+ >50%陽性の反応性として、等級化及びスコア化された。
細胞培養
SCC−25及びSCC−9細胞(American type Tissue Culture、ロックビル、メリーランド州)は、400ng/mLのヒドロコルチゾン(Sigma/Ardrich)、10%v/vのFBS(ATCC)及び0.5%v/vのPen/Strep(ATCC)が添加されたDMEM/F−12媒体(2.5mM L−グルタミン、15mM HEPES、0.5mM ピルビン酸ナトリウム及び1200mg/L 重炭酸ナトリウムを含む)中で培養された。OKF−6(HPV−)及びH
OK(HPV+)細胞は、ケラチノサイト−SFM媒体(Life Technologies)中で培養された。PEGの効果を評価するために、これらの細胞は、以下の実施例で記載されたように、24時間PEG又はビヒクル(PBS)の種々の配合物で処理された。細胞は、細胞増殖(WST−1)が評価されるか又はウエスタンブロット及び/又はフローサイトメトリー分析に付された。
SCC−25及びSCC−9細胞(American type Tissue Culture、ロックビル、メリーランド州)は、400ng/mLのヒドロコルチゾン(Sigma/Ardrich)、10%v/vのFBS(ATCC)及び0.5%v/vのPen/Strep(ATCC)が添加されたDMEM/F−12媒体(2.5mM L−グルタミン、15mM HEPES、0.5mM ピルビン酸ナトリウム及び1200mg/L 重炭酸ナトリウムを含む)中で培養された。OKF−6(HPV−)及びH
OK(HPV+)細胞は、ケラチノサイト−SFM媒体(Life Technologies)中で培養された。PEGの効果を評価するために、これらの細胞は、以下の実施例で記載されたように、24時間PEG又はビヒクル(PBS)の種々の配合物で処理された。細胞は、細胞増殖(WST−1)が評価されるか又はウエスタンブロット及び/又はフローサイトメトリー分析に付された。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット法が標準的な技術を用いて適用された。即ち、タンパク質30μgは、SDS−PAGEに付され、二フッ化ポリビニリデン膜(Amersham Pharmacia、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に移され、5%ブロット(5%ミルク、TBS緩衝液中の0.05%ツイーン)でブロックされ、及び、増殖細胞核抗原(PCNA、SC−56、1:1000、Santa Cruz Biotechnology)、上皮成長因子受容体(EGFR、SC−03、1:750、Santa Cruz Biotechnology)に対する特異抗体が標準的な技術を用いて調べられた。電子写真は、増強された化学発光(Santa Cruz Biotechnology)で現像された。画像はUVP Bio−imaging Systemsを介して取得され、Labworks 4.6 ソフトウェア(UVP、LLC、アップランド、カルフォルニア州)を用いて解析された。タンパク質負荷における均一性は、抗−β−アクチン(SC−1615 HRP、1:2000 Santa Cruz Biotechnology)で膜を調べた後、正規化することにより達成された。
ウエスタンブロット法が標準的な技術を用いて適用された。即ち、タンパク質30μgは、SDS−PAGEに付され、二フッ化ポリビニリデン膜(Amersham Pharmacia、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に移され、5%ブロット(5%ミルク、TBS緩衝液中の0.05%ツイーン)でブロックされ、及び、増殖細胞核抗原(PCNA、SC−56、1:1000、Santa Cruz Biotechnology)、上皮成長因子受容体(EGFR、SC−03、1:750、Santa Cruz Biotechnology)に対する特異抗体が標準的な技術を用いて調べられた。電子写真は、増強された化学発光(Santa Cruz Biotechnology)で現像された。画像はUVP Bio−imaging Systemsを介して取得され、Labworks 4.6 ソフトウェア(UVP、LLC、アップランド、カルフォルニア州)を用いて解析された。タンパク質負荷における均一性は、抗−β−アクチン(SC−1615 HRP、1:2000 Santa Cruz Biotechnology)で膜を調べた後、正規化することにより達成された。
細胞増殖アッセイ(WST−1)
細胞数は、製造業者の説明書(Roche Diagnostics、インディアナポリス、インディアナ州、米国)に従って、テトラゾリウム塩WST−1(4−[3−(ヨードフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2H−5−テトラゾリオ]−1,3−ベンゼン二硫酸塩)のホルマザンへの開裂を測定することにより評価された。即ち、細胞は、100μLの最終容積において、96−ウェルプレート中で育成され、その後、37℃で30分間、湿度5%のCO2培養器中、10μLのWST−1試薬で培養された。テトラゾリウム塩のホルマザンへの変換は、440nmの吸光度で分光光学的に決定された(Molecular Devices、サニーベール、カルフォルニア州、米国)。
細胞数は、製造業者の説明書(Roche Diagnostics、インディアナポリス、インディアナ州、米国)に従って、テトラゾリウム塩WST−1(4−[3−(ヨードフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2H−5−テトラゾリオ]−1,3−ベンゼン二硫酸塩)のホルマザンへの開裂を測定することにより評価された。即ち、細胞は、100μLの最終容積において、96−ウェルプレート中で育成され、その後、37℃で30分間、湿度5%のCO2培養器中、10μLのWST−1試薬で培養された。テトラゾリウム塩のホルマザンへの変換は、440nmの吸光度で分光光学的に決定された(Molecular Devices、サニーベール、カルフォルニア州、米国)。
フローサイトメトリー分析
以下の技術はPEGで処理されたSCC−25及びSCC−9細胞におけるEGFRの表面発現を測定するために利用された。細胞(60−70%コンフルエント)は上記のようにしてPEGで処理され、その後30分間4%の緩衝化されたホルムアルデヒド中で固定された。細胞はPBS(pH7.4;2%ウシ胎児血清、0.2%ウシ血清アルブミン及び0.02%アジ化ナトリウムを含む)中で2回洗浄され、続いて、室温で1時間、抗−EGFRクローン528(1:200;Dr.H.Bandより快く提供された)で培養された。PBS中で洗浄した後、細胞は、40分間二次抗体Alexa 488 Green Fl1−標識 抗−マウス(SC−120AF 488、1:200、Santa Cruz Biotechnology)で培養された。細胞は、続いてPBS中で洗浄され、フローサイトメトリー分析(Becton Dickinson Labware、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)に付された。
以下の技術はPEGで処理されたSCC−25及びSCC−9細胞におけるEGFRの表面発現を測定するために利用された。細胞(60−70%コンフルエント)は上記のようにしてPEGで処理され、その後30分間4%の緩衝化されたホルムアルデヒド中で固定された。細胞はPBS(pH7.4;2%ウシ胎児血清、0.2%ウシ血清アルブミン及び0.02%アジ化ナトリウムを含む)中で2回洗浄され、続いて、室温で1時間、抗−EGFRクローン528(1:200;Dr.H.Bandより快く提供された)で培養された。PBS中で洗浄した後、細胞は、40分間二次抗体Alexa 488 Green Fl1−標識 抗−マウス(SC−120AF 488、1:200、Santa Cruz Biotechnology)で培養された。細胞は、続いてPBS中で洗浄され、フローサイトメトリー分析(Becton Dickinson Labware、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)に付された。
統計解析
データはスチューデントt-検定により解析され、平均±S.D.又はSEMとして表示された。差異はp<0.05で有意であると考慮された、
データはスチューデントt-検定により解析され、平均±S.D.又はSEMとして表示された。差異はp<0.05で有意であると考慮された、
実施例1
この実施例はPEGがビトロにおいて扁平上皮ガン細胞における細胞増殖を阻害するこ
とを提示する。
HNSCCにおけるPEGの抗増殖活性を提示するために、SCC−25細胞(2,000細胞/ウェル)が96−ウェルプレート中に播種され、その後、異なる濃度のPEG8000[0.62mM(0.5%w/v)ないし12.5mM(10%w/v)]で処理された。24時間後、細胞増殖(細胞数における変化)がWST−1アッセイを用いてアッセイされた。図1に示されるように、SCC−25の細胞増殖において、用量依存的な減少が存在した(+p<0.05、★p<0.001、ビヒクル単独との比較)。成長における最大の減少(43%減少)が10%w/v PEG8000(最大濃度の試験)で得られたため、これをビボ実験のために使用する用量とした。PEGを用いるSCC−25細胞の存在及び前処理は、有意に細胞増殖を減少した。
この実施例はPEGがビトロにおいて扁平上皮ガン細胞における細胞増殖を阻害するこ
とを提示する。
HNSCCにおけるPEGの抗増殖活性を提示するために、SCC−25細胞(2,000細胞/ウェル)が96−ウェルプレート中に播種され、その後、異なる濃度のPEG8000[0.62mM(0.5%w/v)ないし12.5mM(10%w/v)]で処理された。24時間後、細胞増殖(細胞数における変化)がWST−1アッセイを用いてアッセイされた。図1に示されるように、SCC−25の細胞増殖において、用量依存的な減少が存在した(+p<0.05、★p<0.001、ビヒクル単独との比較)。成長における最大の減少(43%減少)が10%w/v PEG8000(最大濃度の試験)で得られたため、これをビボ実験のために使用する用量とした。PEGを用いるSCC−25細胞の存在及び前処理は、有意に細胞増殖を減少した。
実施例2
この実施例は、PEGの異なる配合物が、ビトロにおいてSCC−9及びSCC−25細胞におけるEGFR発現を阻害することを提示する。
これらの研究において、SCC−9及びSCC−25細胞における膜(即ち、表面)EGFR発現の程度におけるPEGの効果が評価された。6つの実験群が設定された。SCC−9及びSCC−25細胞の両方が無処理である対照群、PEG3350の5%w/v溶液で処理されたSCC−9及びSCC−25細胞の群及びPEG8000の5%w/v溶液で処理されたSCC−9及びSCC−25細胞の群。24時間後、細胞はトリプシン処理され、EGFRの膜(即ち、表面)発現のためのフローサイトメトリー分析(Becton Dickinson Labware)に付された。結果は、両PEG群が、SCC−9及びSCC−25細胞の両方において、有意に膜(即ち、表面)EGFR発現の量を減少したことを示した(図2)。
この実施例は、PEGの異なる配合物が、ビトロにおいてSCC−9及びSCC−25細胞におけるEGFR発現を阻害することを提示する。
これらの研究において、SCC−9及びSCC−25細胞における膜(即ち、表面)EGFR発現の程度におけるPEGの効果が評価された。6つの実験群が設定された。SCC−9及びSCC−25細胞の両方が無処理である対照群、PEG3350の5%w/v溶液で処理されたSCC−9及びSCC−25細胞の群及びPEG8000の5%w/v溶液で処理されたSCC−9及びSCC−25細胞の群。24時間後、細胞はトリプシン処理され、EGFRの膜(即ち、表面)発現のためのフローサイトメトリー分析(Becton Dickinson Labware)に付された。結果は、両PEG群が、SCC−9及びSCC−25細胞の両方において、有意に膜(即ち、表面)EGFR発現の量を減少したことを示した(図2)。
実施例3
この実施例は、PG8000の投与が、扁平上皮細胞ガンのラット4NQOモデルにおいて腫瘍進行を阻害することを提示する。
これらの研究に使用した、ラット4NQO−誘発口腔発ガンモデルは、ヒトの頭頸部ガンに、組織病理学的に匹敵する数多くの特徴を有する。飲料水中の4NQOの全身投与による、このモデルは、様々な前ガン性及び腫瘍性の領域を創出し、数多くの化学発ガン抑制研究において使用されてきた。4−NQO処理(飲料水中20ppm)の14週後、ラットは無作為に2群に分けられ、追加の連続する14週の間、(a)ビヒクル(PBS)又は(b)PEG−8000(10%w/v)の何れかの日毎の口腔局所適用(3−4分までの間クロテンのブラシ#4を使用してラットの口腔の口腔底部/天井部に塗布する)を受けた。解剖で、舌全体、咽頭及び食道が除去された。この研究で使用された発ガンの全投薬計画(レジュメ)は、ラットの全体的な健康において衰弱させる効果は全く有さなかった。図3で示されるように、解剖(発ガン処理の終了後14週)で、4NQO処理ラットは、舌を起源とする数多くの大きな形態学的に離散した領域又は腫瘍を示した(p<0.05、対照と比べて)。対照的に、4NQO処理後14週の間のPEG−8000の口腔局所適用に付されたラットは、有意により小さな腫瘍及びより少ない腫瘍数/腫瘍を有するラットを示した(図3B;p<0.01対照と比べて)。解剖における2群を比較する写真が、図4において提供される。PEG8000は、有意に全身腫瘍組織量(腫瘍数及び腫瘍容積の両方)を減少させた。これらの結果は、PEG8000がこのモデルにおけるガンの開始及び/又は進行の遅延において有効であることを意味する。
この実施例は、PG8000の投与が、扁平上皮細胞ガンのラット4NQOモデルにおいて腫瘍進行を阻害することを提示する。
これらの研究に使用した、ラット4NQO−誘発口腔発ガンモデルは、ヒトの頭頸部ガンに、組織病理学的に匹敵する数多くの特徴を有する。飲料水中の4NQOの全身投与による、このモデルは、様々な前ガン性及び腫瘍性の領域を創出し、数多くの化学発ガン抑制研究において使用されてきた。4−NQO処理(飲料水中20ppm)の14週後、ラットは無作為に2群に分けられ、追加の連続する14週の間、(a)ビヒクル(PBS)又は(b)PEG−8000(10%w/v)の何れかの日毎の口腔局所適用(3−4分までの間クロテンのブラシ#4を使用してラットの口腔の口腔底部/天井部に塗布する)を受けた。解剖で、舌全体、咽頭及び食道が除去された。この研究で使用された発ガンの全投薬計画(レジュメ)は、ラットの全体的な健康において衰弱させる効果は全く有さなかった。図3で示されるように、解剖(発ガン処理の終了後14週)で、4NQO処理ラットは、舌を起源とする数多くの大きな形態学的に離散した領域又は腫瘍を示した(p<0.05、対照と比べて)。対照的に、4NQO処理後14週の間のPEG−8000の口腔局所適用に付されたラットは、有意により小さな腫瘍及びより少ない腫瘍数/腫瘍を有するラットを示した(図3B;p<0.01対照と比べて)。解剖における2群を比較する写真が、図4において提供される。PEG8000は、有意に全身腫瘍組織量(腫瘍数及び腫瘍容積の両方)を減少させた。これらの結果は、PEG8000がこのモデルにおけるガンの開始及び/又は進行の遅延において有効であることを意味する。
実施例4
この実施例は、どのようにPEG8000が上皮細胞過剰増殖を阻害するかを表現するものである。
実施例3の4NQO処理ラットからの舌上皮の顕微鏡評価は、少数の軽度から中程度の上皮異形成の局所領域を明らかにした。
更に、以前このモデルで報告したように4NQO処理ラットの舌上皮において正常化された細胞過剰増殖が存在した(図5上パネル)。広範性の細胞増殖の正確な時間的及び空間的な制御は、前ガン性のガン発生の重要な初期の特性であり、よって、PEGの化学発ガン抑制の有効性を評価するための重要な標的であり得る。発ガン性物質で処理されたラットにおけるPEG8000の抗増殖性の役割を理解するために、増殖の明確に定義されたマーカーである、Ki−67の免疫組織化学的発現が試験された。Ki−67で標識された上皮細胞の数(光場当り)は、発ガン性物質の無い対照群と比較して4NQO群において有意に高かった(それぞれ30+8対14+6;p<0.01、データ未提示)。しかしながら、発ガン性物質−開始ラットがPEG8000の局所適用に付された場合、Ki−67陽性ラットの数における有意な減少(17+4対30+8;p<0.01)が観察された(データ未提示)。この研究のために、総計1000の上皮細胞が、400×倍で6ないし7場において評価され、全ての値が標識率のために使用された。発ガン性物質処理群において、対照と比較した場合、重層扁平舌上皮の基底層直上の区画において、細胞のより高いパーセンテージがKi−67陽性であることが観察された。PEG8000処理は、基底層直上の区画におけるKi−67細胞の数を減少する;残りのKi−67細胞は、大半が対照群で見られるような基底層に制限された(図5 下パネル)。これらの結果は、PEGの口腔局所適用が4NQO−誘発の口腔発ガンの間、上皮過剰増殖を阻害することを示す。
この実施例は、どのようにPEG8000が上皮細胞過剰増殖を阻害するかを表現するものである。
実施例3の4NQO処理ラットからの舌上皮の顕微鏡評価は、少数の軽度から中程度の上皮異形成の局所領域を明らかにした。
更に、以前このモデルで報告したように4NQO処理ラットの舌上皮において正常化された細胞過剰増殖が存在した(図5上パネル)。広範性の細胞増殖の正確な時間的及び空間的な制御は、前ガン性のガン発生の重要な初期の特性であり、よって、PEGの化学発ガン抑制の有効性を評価するための重要な標的であり得る。発ガン性物質で処理されたラットにおけるPEG8000の抗増殖性の役割を理解するために、増殖の明確に定義されたマーカーである、Ki−67の免疫組織化学的発現が試験された。Ki−67で標識された上皮細胞の数(光場当り)は、発ガン性物質の無い対照群と比較して4NQO群において有意に高かった(それぞれ30+8対14+6;p<0.01、データ未提示)。しかしながら、発ガン性物質−開始ラットがPEG8000の局所適用に付された場合、Ki−67陽性ラットの数における有意な減少(17+4対30+8;p<0.01)が観察された(データ未提示)。この研究のために、総計1000の上皮細胞が、400×倍で6ないし7場において評価され、全ての値が標識率のために使用された。発ガン性物質処理群において、対照と比較した場合、重層扁平舌上皮の基底層直上の区画において、細胞のより高いパーセンテージがKi−67陽性であることが観察された。PEG8000処理は、基底層直上の区画におけるKi−67細胞の数を減少する;残りのKi−67細胞は、大半が対照群で見られるような基底層に制限された(図5 下パネル)。これらの結果は、PEGの口腔局所適用が4NQO−誘発の口腔発ガンの間、上皮過剰増殖を阻害することを示す。
実施例5
この実施例は、発ガン性物質開始ラットの舌切片において、PG8000がどのようにEGFRを下方制御するかを説明する。
実施例3におけるラットの舌は、切片化され、EGFRに対する抗体で染色され、上記したようなIHC分析に付された。PEG8000を用いる処理は、切片で観察されるようにEGFRの発現を有意に減少した。図6で説明されるように、対照及び4NQO−PEG切片は、EGFR染色を殆ど又は全くされず、一方、4NQO切片は、強くEGFR染色された。この結果は、組織学的に、PEGを用いる処理が、ラット4NQOモデルにおけるEGFR発現を下方制御するように見えることを示す。
この実施例は、発ガン性物質開始ラットの舌切片において、PG8000がどのようにEGFRを下方制御するかを説明する。
実施例3におけるラットの舌は、切片化され、EGFRに対する抗体で染色され、上記したようなIHC分析に付された。PEG8000を用いる処理は、切片で観察されるようにEGFRの発現を有意に減少した。図6で説明されるように、対照及び4NQO−PEG切片は、EGFR染色を殆ど又は全くされず、一方、4NQO切片は、強くEGFR染色された。この結果は、組織学的に、PEGを用いる処理が、ラット4NQOモデルにおけるEGFR発現を下方制御するように見えることを示す。
実施例6
この実施例は、食道腫瘍の進行におけるPEG8000の局所口腔適用の潜在的な化学発ガン抑制効果を説明する。
口腔発ガンにおける局所PEG8000適用の化学発ガン抑制の利点を研究するのに加えて、食道腫瘍の進行に対する2次的な保護もまた提供し得るか否かが評価された。このことは食道内へのPEGの部分的な唾液洗浄に起因して期待され得る。この研究のために、頭頸部ガンの4−NQO(4−ニトロキノリン1−オキシド)ラットモデルが実施例3、4及び5と同じように利用された。このモデルは食道腫瘍を開始するために既知である。食道は気管から非常に注意深く分離され、腫瘍計数に付された。結果は、腫瘍を有するラット当たりの食道腫瘍は4NQO(n=6)における2.2から4NQO−PEG(n=5)群における1.5に減少した(〜32%減少)。結果は統計学的な有意性を支持しなかった(p=0.2397−ウィルコクソン二標本検定;p=0.225−カイ二乗検定)が、PEGと食道の間の接触がより直接的な適応よりはむしろ部分的な唾液洗浄の結果であったところのこの結果は、それにもかかわらず、食道ガンの進行に対するPEGの潜在的な保護効果を提示するものである。
この実施例は、食道腫瘍の進行におけるPEG8000の局所口腔適用の潜在的な化学発ガン抑制効果を説明する。
口腔発ガンにおける局所PEG8000適用の化学発ガン抑制の利点を研究するのに加えて、食道腫瘍の進行に対する2次的な保護もまた提供し得るか否かが評価された。このことは食道内へのPEGの部分的な唾液洗浄に起因して期待され得る。この研究のために、頭頸部ガンの4−NQO(4−ニトロキノリン1−オキシド)ラットモデルが実施例3、4及び5と同じように利用された。このモデルは食道腫瘍を開始するために既知である。食道は気管から非常に注意深く分離され、腫瘍計数に付された。結果は、腫瘍を有するラット当たりの食道腫瘍は4NQO(n=6)における2.2から4NQO−PEG(n=5)群における1.5に減少した(〜32%減少)。結果は統計学的な有意性を支持しなかった(p=0.2397−ウィルコクソン二標本検定;p=0.225−カイ二乗検定)が、PEGと食道の間の接触がより直接的な適応よりはむしろ部分的な唾液洗浄の結果であったところのこの結果は、それにもかかわらず、食道ガンの進行に対するPEGの潜在的な保護効果を提示するものである。
実施例7
この実施例は、SCC 25細胞の細胞増殖及びEGFR発現における異なるPEG配合物の比較効果に関する。
細胞増殖及びEGFR発現における異なるPEG配合物の比較効果を決定するために、扁平上皮ガン細胞(SCC−25)が96ウェルプレート(WST−1アッセイ)又は6
0mmの細胞培養皿(ウエスタンブロット法)の何れかに播種された。細胞はその後、0ないし10%w/vの濃度範囲を使用するPEG3350、PEG4000及びPEG8000で24時間処理された(それぞれ図7、8及び9)。培養は37℃で24時間、湿度5%のCO2培養器中で行われた。細胞増殖(細胞数の変化)は、実施例1に記載したようなWST−1アッセイを使用して又は増殖マーカーである増殖性細胞核抗原(PCNA)のためのウエスタンブロットを介してアッセイされた。EGFR発現もまたウエスタンブロット分析により評価された。結果は、使用された配合物に関係なく、PEGの濃度の増加に伴って細胞増殖及びEGFR発現において直線的な減少を示した。
この実施例は、SCC 25細胞の細胞増殖及びEGFR発現における異なるPEG配合物の比較効果に関する。
細胞増殖及びEGFR発現における異なるPEG配合物の比較効果を決定するために、扁平上皮ガン細胞(SCC−25)が96ウェルプレート(WST−1アッセイ)又は6
0mmの細胞培養皿(ウエスタンブロット法)の何れかに播種された。細胞はその後、0ないし10%w/vの濃度範囲を使用するPEG3350、PEG4000及びPEG8000で24時間処理された(それぞれ図7、8及び9)。培養は37℃で24時間、湿度5%のCO2培養器中で行われた。細胞増殖(細胞数の変化)は、実施例1に記載したようなWST−1アッセイを使用して又は増殖マーカーである増殖性細胞核抗原(PCNA)のためのウエスタンブロットを介してアッセイされた。EGFR発現もまたウエスタンブロット分析により評価された。結果は、使用された配合物に関係なく、PEGの濃度の増加に伴って細胞増殖及びEGFR発現において直線的な減少を示した。
実施例8
この実施例はSCC9細胞のEGFRの表面発現における異なるPEG配合物の効果を説明する。
これらの研究は、扁平上皮ガンSCC−9細胞を使用するEGFRの表面発現における異なるPEG配合物の比較効果を決定するために行われた。SCC−9細胞は、10%w/vPEG(PEG3350、PEG4000及びPEG8000)で24時間処理された。処理後、細胞はトリプシン処理され、EGFRの膜(表面)発現のためにフローサイトメトリー分析に付された。結果は、試験された全てのPEG配合物で処理された細胞のEGFRの表面発現において高度に有意な減少を示した(図10)。これらの結果は更に、PEGの抗−増殖性の性質が、抗−EGFR活性と関連し得るという仮説を支持する。
この実施例はSCC9細胞のEGFRの表面発現における異なるPEG配合物の効果を説明する。
これらの研究は、扁平上皮ガンSCC−9細胞を使用するEGFRの表面発現における異なるPEG配合物の比較効果を決定するために行われた。SCC−9細胞は、10%w/vPEG(PEG3350、PEG4000及びPEG8000)で24時間処理された。処理後、細胞はトリプシン処理され、EGFRの膜(表面)発現のためにフローサイトメトリー分析に付された。結果は、試験された全てのPEG配合物で処理された細胞のEGFRの表面発現において高度に有意な減少を示した(図10)。これらの結果は更に、PEGの抗−増殖性の性質が、抗−EGFR活性と関連し得るという仮説を支持する。
実施例9
この実施例は、病因学的に非均質なHNSCCにおけるPEG8000の効果に関する。
煙草及びアルコール摂取は、HNSCCの進行のための第一危険因子であるものの、危険性の高いヒトパピローマウイルス(HPV)を伴う感染症がHNSCCの別のサブセットの進行に病因的に関連し得ることが近年提示されてきた。、病因学的に非均質な条件におけるPEGの効果を研究するために、異なるHPV状態を有する細胞株を利用してEGFRの下方制御及び細胞増殖におけるPEGの効果が研究された。これらの実験に使用された2種の細胞株は、HPV陰性である前ガン状態のhTERT−不死化細胞[HPV(−)OKF−6;図11]及びE6を発現する前ガン状態のHPVで形質転換された不死化されたヒト口腔ケラチン生成細胞(HOK)[HPV(+)HOK;図12]であった。細胞は24時間PEG8000の異なる濃度で処理され、実施例1及び7で議論されたような異なるバイオマーカー評価に付された。結果は、PEG8000が、HPV(−)細胞において特異的に有意に細胞増殖(WST−1及びPCNA)の減少並びにEGFRの下方制御において有効である(図11)が、しかしHPV(+)細胞においてはそうでない(図12)ことを示す。HPV状態としてのHPV(+)サブセットにおけるEGFRのより低い発現が原因であり得るPEGに対する反応差は、以前にHNSCCにおいてEGFRに対して有意な反比例関係を有することが示されている。HPV(+)被験者の予後がHPV(−)被験者に比してより有利であり得るという示唆する証拠が存在する。これらの結果は、PEGが予後的にあまりよくないHPV(−)被験者のためのより良い戦略を提供し得ることを示す。
この実施例は、病因学的に非均質なHNSCCにおけるPEG8000の効果に関する。
煙草及びアルコール摂取は、HNSCCの進行のための第一危険因子であるものの、危険性の高いヒトパピローマウイルス(HPV)を伴う感染症がHNSCCの別のサブセットの進行に病因的に関連し得ることが近年提示されてきた。、病因学的に非均質な条件におけるPEGの効果を研究するために、異なるHPV状態を有する細胞株を利用してEGFRの下方制御及び細胞増殖におけるPEGの効果が研究された。これらの実験に使用された2種の細胞株は、HPV陰性である前ガン状態のhTERT−不死化細胞[HPV(−)OKF−6;図11]及びE6を発現する前ガン状態のHPVで形質転換された不死化されたヒト口腔ケラチン生成細胞(HOK)[HPV(+)HOK;図12]であった。細胞は24時間PEG8000の異なる濃度で処理され、実施例1及び7で議論されたような異なるバイオマーカー評価に付された。結果は、PEG8000が、HPV(−)細胞において特異的に有意に細胞増殖(WST−1及びPCNA)の減少並びにEGFRの下方制御において有効である(図11)が、しかしHPV(+)細胞においてはそうでない(図12)ことを示す。HPV状態としてのHPV(+)サブセットにおけるEGFRのより低い発現が原因であり得るPEGに対する反応差は、以前にHNSCCにおいてEGFRに対して有意な反比例関係を有することが示されている。HPV(+)被験者の予後がHPV(−)被験者に比してより有利であり得るという示唆する証拠が存在する。これらの結果は、PEGが予後的にあまりよくないHPV(−)被験者のためのより良い戦略を提供し得ることを示す。
実施例10
この実施例は、無胸腺マウスの同所性の腫瘍の進行におけるPEG8000の局所適用の効果に関する。腫瘍成長の阻害におけるPEG8000の効果を研究するために、同所性のモデルが利用されたが、ここで、扁平上皮ガン(SCC−25、約100万個)が無胸腺マウス(免疫不全、B−細胞欠損)の舌領域の近傍に直接移植された。播種2週間後、マウスを無作為に2群に分け(各12マウス)、Q−チップを用いる10%w/vPEG8000又はPBS(ビヒクル)の日毎の口腔局所適用に付された(2−3分)。治療期間の間、PEG8000は、対照と較べて体重において何ら有意な変化を引き起こさな
かった(データ未提示)。解剖(処理後19−20日)において、腫瘍は切除され秤量された。全ての腫瘍のための組織病理は、扁平上皮ガンに陽性であった。結果は、PEG8000適用が対照と比較して腫瘍質量において有意な減少を生じたことを示した(29.8%;p<0.05;図13)。PEGが腫瘍退縮において抗増殖的及び抗−EGFRの役割を有するかどうかを更に理解するために、マーカーKi−67及びEGFRのためのIHCが実施され、PG8000処理群の増殖指標(31.5%;p<0.002)及びEGFR染色(42.4%;p<0.005)の両方において対照に比して有意な減少が観察された(それぞれ図14及び15)。これらの結果は、予防に加えて、PEGが、確立した腫瘍の退縮を引き起こすことができるように見えることを提示する。この効果は、細胞増殖及びEGFR下方制御におけるその全体的な効果に由来し得る。これは、HNSCC治療戦略を更に進展させることにおいて非常に重要なツールを提供する。
この実施例は、無胸腺マウスの同所性の腫瘍の進行におけるPEG8000の局所適用の効果に関する。腫瘍成長の阻害におけるPEG8000の効果を研究するために、同所性のモデルが利用されたが、ここで、扁平上皮ガン(SCC−25、約100万個)が無胸腺マウス(免疫不全、B−細胞欠損)の舌領域の近傍に直接移植された。播種2週間後、マウスを無作為に2群に分け(各12マウス)、Q−チップを用いる10%w/vPEG8000又はPBS(ビヒクル)の日毎の口腔局所適用に付された(2−3分)。治療期間の間、PEG8000は、対照と較べて体重において何ら有意な変化を引き起こさな
かった(データ未提示)。解剖(処理後19−20日)において、腫瘍は切除され秤量された。全ての腫瘍のための組織病理は、扁平上皮ガンに陽性であった。結果は、PEG8000適用が対照と比較して腫瘍質量において有意な減少を生じたことを示した(29.8%;p<0.05;図13)。PEGが腫瘍退縮において抗増殖的及び抗−EGFRの役割を有するかどうかを更に理解するために、マーカーKi−67及びEGFRのためのIHCが実施され、PG8000処理群の増殖指標(31.5%;p<0.002)及びEGFR染色(42.4%;p<0.005)の両方において対照に比して有意な減少が観察された(それぞれ図14及び15)。これらの結果は、予防に加えて、PEGが、確立した腫瘍の退縮を引き起こすことができるように見えることを提示する。この効果は、細胞増殖及びEGFR下方制御におけるその全体的な効果に由来し得る。これは、HNSCC治療戦略を更に進展させることにおいて非常に重要なツールを提供する。
本発明の記載との関連で、用語“a”及び“an”及び“the”及び類似の指示語(特に、以下に示す請求項との関連において)は、ここで他に指示されていないか又は文脈から明確に矛盾していない限り、単数及び複数の両方をカバーするものとと解釈される。用語“含む(comprising)”、“有する(having)”、“含む(including)”及び“含む(containing)”は、他に記載されていない限り、制限が無い用語(即ち、“含むがそれに限定されないこと”を意味する)として解釈される。ここに記載される全ての方法は、ここで他に指示されていないか又は文脈から矛盾していない限り、あらゆる好適な順番で実施することができる。ここで提供されるあらゆる及び全ての実施例又は例示的な言葉(例えば、“のような(such as)”)の使用は、単に本発明を説明することだけを意図し、他に請求されていない限り、本発明の範囲における限定をもたらさない。本明細書中の言葉は全て、本発明の実施に必須なあらゆる非−請求の要素を示唆するものとして解釈されるべきでない。
本発明の好ましい態様は、本発明を実施するために本発明者等に既知の最良の形態を含んで、ここに記載される。それらの好ましい態様の変形物は、以前の記載を読むことで当業者に対して明白となり得る。本発明者等は、適当なものとしてそのような変形物を当業者が利用することを期待し及び本発明者等は、本発明を、ここに特異的に記載されたもの以外として実施することを意図する。従って、この発明は、準拠法により許可されるものとしてここに添付された請求項中に示された主題の全ての変更物及び同等物を含む。更に、それらの全ての可能な変形物における上記の要素のあらゆる組み合わせは、ここで他に指示されていないか又は文脈から明確に矛盾していない限り、本発明に含まれる。
Claims (43)
- ポリエチレングリコール(PEG)の有効量を被験者に投与することを含む、被験者の頭頸部扁平上皮ガン(HNSCC)を予防及び/又は治療する方法。
- 前記PEGは局所的に投与される請求項1記載の方法。
- 前記PEGは標的組織に局所領域で投与される請求項1又は2記載の方法。
- 前記HNSCCは、被験者の、唇、口腔(舌、口腔粘膜、歯茎、臼後三角、歯肉、口腔底部、硬口蓋を含む)、唾液腺、鼻腔(鼻咽頭を含む)、副鼻腔、咽頭(舌根、軟口蓋、口蓋弓及び扁桃窩のような中咽頭を含む)、下咽頭(梨状陥凹、咽頭側壁、後咽頭壁、咽頭輪状後部を含む)、及び喉頭(声門上部(例えば、仮声帯、披裂部、喉頭蓋、披裂喉頭蓋襞)、声門、声門下)の1つ以上に発症したものである請求項1ないし3の何れか1項に記載の方法。
- 前記HNSCCは、前記口腔(又はその解剖構造)に発症したものである請求項4記載の方法。
- 前記被験者は、HNSCCの寛解にある請求項1ないし5の何れか1項に記載の方法。
- 前記寛解は、完全又は一部である請求項6記載の方法。
- 前記方法は、HNSCCの再発を予防するためのものである請求項6又は7記載の方法。
- 前記HNSCCは、局所進行性である請求項1ないし8の何れか1項に記載の方法。
- 前記HNSCCは、転移性である請求項1ないし9の何れか1項に記載の方法。
- 更に、1つ以上のHNSCCガンを切除すること及び/又は除去することを含む請求項1ないし10の何れか1項に記載の方法。
- 以下の段階:
(a)1つ以上のHNSCCガンを切除すること及び/又は除去すること;
(b)PEGの有効量を投与すること
を含む請求項11記載の方法。 - 段階(a)が、段階(b)の前に起こる請求項12記載の方法。
- 段階(b)が、段階(a)の前に起こる請求項12記載の方法。
- 前記PEGは、1種以上の治療薬と共−投与される請求項1ないし14の何れか1項に記載の方法。
- 前記治療剤は、放射線治療及び/又は抗ガン剤である請求項15記載の方法。
- 前記PEGは、前記1種以上の治療薬と同時に投与される請求項15又は16記載の方法。
- 前記PEGは、前記1種以上の治療薬の投与前に投与される請求項15又は16記載の方法。
- 前記PEGは、前記1種以上の治療薬の投与後に投与される請求項15又は16記載の方法。
- 前記PEGは、前記1種以上の治療薬の最初の投与後で且つ前記1種以上の治療薬の2番目の投与前に投与される請求項15又は16記載の方法。
- 前記最初の投与の前記1種以上の治療薬は、前記2番目の投与の前記1種以上の治療薬と同じである請求項20記載の方法。
- 前記最初の投与の前記1種以上の治療薬は、前記2番目の投与の前記1種以上の治療薬と異なる請求項20記載の方法。
- 前記治療薬は、放射線治療である請求項15ないし22の何れか1項に記載の方法。
- 前記治療薬は、抗ガン剤である請求項15ないし22の何れか1項
に記載の方法。 - 前記抗ガン剤は、抗−EGFR薬、抗−VEGFR薬、抗−IGF−1R薬、mTOR薬、白金製剤、タキサン類、葉酸代謝拮抗薬、フルオロウラシル、メトトレキセートからなる群より選択される請求項24記載の方法。
- 前記抗−EGFR薬は、セツキシマブのような抗−EGFR抗体である請求項25記載の方法。
- 前記被験者は、進行性HNSCCに対して感受性である請求項1ないし26の何れか1項に記載の方法。
- 前記感受性の被験者は、タバコ(喫煙及び/又は噛みタバコ)、アルコール過量摂取、ビンロウ噛みの1つ以上の経歴を有する及び/又は1つ以上を同時使用する請求項27記載の方法。
- 前記被験者は、HPVに感染している及び/又は免疫不全である及び/又は進行性HNSCCの家族歴又は前歴を有する請求項27又は28記載の方法。
- 前記患者は、口腔白板症及び/又は口腔紅板症を発症している請求項27ないし29の何れか1項に記載の方法。
- 前記被験者は、哺乳類である請求項1ないし30の何れか1項に記載の方法。
- 前記被験者は、ヒトである請求項31記載の方法。
- 請求項1ないし32の何れか1項に記載の方法における使用のための組成物。
- 前記PEGは、範囲の下限が、1000、2000、3000、4000、6000からなる群より選択され;及び範囲の上限が、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、15,000、20,000からなる群より、独立して選択される範囲における平均分子量(例えば、重量平均分子量)を有する請求項33記載の組成物。
- 前記下限は3000又は4000であり、前記上限は、5000、6000、7000、8000又は9000から独立して選択される請求項34記載の組成物。
- 前記PEGは、3350、4000、8000の重量平均分子量を有する請求項34又は35記載の組成物。
- PEGの有効量を含む請求項33ないし36の何れか1項に記載の組成物。
- PEGが唯一の治療効果のある成分である請求項33ないし36の何れか1項に記載の組成物。
- 請求項25又は26に記載の治療薬の1種以上の有効量を更に含む請求項33ないし37の何れか1項に記載の組成物。
- 少なくとも1種の電解質、1種以上の甘味料、1種以上の香味料、薬学的に許容可能なキャリア、からなる群より選択される少なくとも1種のビヒクルを更に含む請求項33ないし39の何れか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、水性の溶液又は懸濁液(例えば、マウスウォッシュ)、乳液、ペースト(例えば、練り歯磨き)、クリーム、バルム(例えば、リップバーム)、軟膏、フォーム、スポンジ、ゲル、チューインガム、スプレー、ドロップ、トローチ、シロップ(例えば、粘性シロップ)、リンクタス、スラリー、フィルム(例えば、口腔内崩壊フィルム)、錠剤(例えば、口腔内崩壊錠)、カプセル、カプレット、口腔パッチ、顆粒、の形態で調製される請求項33ないし40の何れか1項に記載の組成物。
- HNSCCの予防及び/又は治療のための薬剤の製造におけるPEGの使用。
- 前記薬剤は、請求項33ないし41の何れか1項に記載の組成物である請求項42記載の使用。
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