TW202408466A - 透過抑制癌症幹細胞生長及調降wnt傳遞路徑治療癌症之方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種藉由抑制類癌症幹細胞的生長及調降WNT傳遞路徑來治療個體體內的癌症或對抗癌藥物具有抗藥性的癌症之方法。本發明還提供一種用於治療癌症或對抗癌藥物具有抗藥性的癌症之組合或醫藥組合物。

Description

透過抑制癌症幹細胞生長及調降WNT傳遞路徑治療癌症之方法

本發明涉及一種藉由抑制類癌症幹細胞的生長及調降WNT傳遞路徑來治療癌症之方法。

癌症幹細胞（Cancer stem cells，CSCs）為具有自我更新能力及超多能性的癌細胞亞群。癌症幹細胞（CSCs）參與腫瘤發展、細胞增殖及轉移，且為腫瘤發生、轉移以及對化療與放療產生抗性的關鍵「種子」[1, 3-5]。這些過程受到涉及癌症幹性及球體形成的幾個關鍵轉錄因子的調節，例如OCT4、Nanog、SOX2、KLF4，以及MYC。此外，許多訊息傳遞路徑，例如WNT與Notch傳遞路徑，也有助於癌症幹性的發展[6-10]。

WNT訊息傳遞路徑涉及細胞增殖、存活，以及進展，並影響生理及病理條件下幹細胞的自我更新[11, 12]。WNT傳遞路徑活化後，未磷酸化的β-連環蛋白易位至細胞核中，隨後觸發TCF/LEF調節的下游基因（例如，CCND1、MYC，以及CD44）的轉錄。透過維持癌症幹性，WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑的失調與腫瘤發生及進展密切相關[13]。最近的研究重點著重在以WNT訊息傳遞路徑為標靶的藥物在單一或聯合療法中用於癌症治療的治療潛力[14]。

伊立替康（Irinotecan，IRN）為一種拓撲異構酶I抑制劑，對實體瘤（如轉移性大腸直腸癌與肺癌）具有抗癌活性[15-17]。伊立替康（IRN）在復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌（recurrent or metastatic head and neck squamous cell carcinoma，R/M HNSCC）中顯現出一些臨床上的益處[18-20]。伊立替康（IRN）為一種前驅藥，可藉由羧酸酯酶（carboxylesterase，CES）1或2轉化為活性代謝物SN-38 [17]。在癌症基因體圖譜（TCGA，The Cancer Genome Atlas）的頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）隊列中，發現羧酸酯酶1基因（ CES1）是一種頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的不良預後標記物[21]。羧酸酯酶1（CES1）在預後不良的患者中表現上調，可作為以伊立替康（IRN）治療的一個好的治療標的[16,17,21]。以伊立替康（IRN）單一治療以及伊立替康（IRN）與其他化療藥物的聯合療法已被證明可改善癌症患者的治療反應[19,20,22]。根據美國國家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI），生存率是指研究或治療組中被診斷患有或開始治療某種疾病（例如，癌症）後一段時間內仍存活的人數的百分比。伊立替康（IRN）與順鉑的組合在第II期臨床試驗中顯現出協同抗癌作用[19]，順鉑/替加氟尿嘧啶（tegafur-uracil，UFUR）/伊立替康三重聯合療法在復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌（R/M HNSCC）患者中顯示出中等反應[18]。這種療法的毒性對患者而言是可被忍受的，且患者的生活品質得到改善[18]。然而，伊立替康（IRN）也會引起副作用，例如腹瀉以及嗜中性白血球低下症，這些副作用可透過優化治療劑量或增加標的特異性來解決。

去氫表雄固酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）為一種內源性類固醇前體激素。在人體中，去氫表雄固酮（DHEA）在大腦、腎上腺皮質、性腺，以及胃腸道中產生[25]，並以硫酸化（去氫表雄固酮硫酸鹽（DHEA-S））的形式儲存[26]。去氫表雄固酮（DHEA）以及去氫表雄固酮硫酸鹽（DHEA-S）都是人體血清中最豐富的類固醇，也是雌激素及雄激素等性激素的前驅物。最近，去氫表雄固酮（DHEA）已被報導具有多種有益效果，如抗肥胖、低血糖、抗動脈粥狀硬化、抗衰老，以及增強記憶等效果[27-29]。此外，去氫表雄固酮（DHEA）在體外及體內對多種癌症類型具有抗癌作用，包括乳癌[30-32]、肝癌[27]、骨髓瘤[33]、白血病[34]、結腸腺癌[35]、胰腺癌[36]，以及子宮頸癌[37]。在乳癌中，去氫表雄固酮（DHEA）抑制細胞增殖及轉移過程，例如遷移、侵襲以及上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT），並減小球體大小[30-32]。此外，在人類球體間質幹細胞中，去氫表雄固酮（DHEA）抑制幹細胞基因表現[38]，這表示去氫表雄固酮（DHEA）可能具有抑制癌症幹細胞（CSCs）的能力。然而，去氫表雄固酮（DHEA）對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC），特別是類癌症幹細胞特徵的影響仍不清楚。於本文中，本案發明人研究了去氫表雄固酮（DHEA）的抗腫瘤及抗幹性的潛在效果，以及其與伊立替康（IRN）聯合使用對抗頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的功效。

需要開發一種藉由抑制癌症幹細胞（CSCs）生長及調降WNT傳遞路徑來治療癌症的新策略。

本案發明人意外地發現去氫表雄固酮（DHEA）或其與一化療藥物的組合具有抗腫瘤及抗幹性的效果，特別是在治療癌症，包括頭頸癌，如頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）、肺癌，如非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），以及大腸直腸癌（colorectal cancer，CRC），或一具有抗藥性的癌症。

於一方面，本發明提供一種去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物在製備治療一對抗癌藥物具有抗藥性的具有高度表現的CES1/2細胞的癌症的藥物中之用途；其中該癌症係選自由頭頸癌、肺癌以及大腸直腸癌（CRC）所組成之群組。

於本發明之一實施例中，該頭頸癌為一頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）。

於本發明之一實施例中，該肺癌為一非小細胞肺癌（NSCLC）。

本發明發現去氫表雄固酮（DHEA）對非小細胞肺癌（NSCLC）中的KRAS突變體以及PTEN野生型細胞更敏感。

本發明發現去氫表雄固酮（DHEA）對大腸直腸癌（CRC）細胞中的TP53野生型或G6PD缺陷突變體更敏感。

於另一方面，本發明提供一種用於治療一具有高度表現的CES1/2細胞的癌症之組合或醫藥組合物，包含一治療有效量的一化療藥物以及去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物，其提供提升癌細胞對該化療藥物的敏感性的效果。

於又一方面，本發明提供一種用於治療一對抗癌藥物具有抗藥性的具有高度表現的CES1/2細胞的癌症之組合或醫藥組合物，包含一治療有效量的一化療藥物以及去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物，其提供提升癌細胞對該化療藥物的敏感性的效果。

於本發明之一具體實施例中，該非小細胞肺癌（NSCLC）為KRAS突變體以及PTEN野生型細胞。

於本發明之一具體實施例中，該大腸直腸癌（CRC）為TP53野生型或G6PD缺陷突變體。

於又一方面，本發明提供一種治療個體體內癌症之方法，例如頭頸癌（例如，頭頸鱗狀細胞癌（HNSCCs））、肺癌（例如，非小細胞肺癌（NSCLC））以及大腸直腸癌（CRC），包括對該個體施用一治療有效量的去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物，以及一醫藥上可接受的載體。

於本發明之一具體實施例中，一種用於治療個體體內的一非小細胞肺癌（NSCLC）或一對抗癌藥物具有抗藥性的非小細胞肺癌（NSCLC）之方法，包括提供一來自該個體的癌細胞樣品以確定該非小細胞肺癌（NSCLC）為KRAS突變體或PTEN野生型細胞，若該癌細胞為KRAS突變體或PTEN野生型細胞，則對該個體施用一治療有效量的去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物與一化療藥物的組合，以及一醫藥上可接受的載體。

於本發明之另一具體實施例中，一種用於治療一個體體內的一大腸直腸癌（CRC）或一對抗癌藥物具有抗藥性的大腸直腸癌（CRC）之方法，包括提供一來自該個體的癌細胞樣品以確定該癌細胞為TP53野生型或G6PD缺陷突變體，若該癌細胞為TP53野生型或G6PD缺陷突變體，則對該個體施用一治療有效量的去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物與一醫藥上可接受的載體。

於本發明之另一具體實施例中，一種用於治療一個體體內的頭頸鱗狀細胞癌（HNSCCs）或一對抗癌藥物具有抗藥性的頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）之方法，包括對該個體施用一化療藥物與去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物的組合，以及一醫藥上可接受的載體。

於本發明之一實施例中，該抗癌藥物為一化療藥物，例如伊立替康（IRN）、順鉑，以及培美曲塞（pemetrexed）。

實施例中說明了在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）原位以及皮下異種移植小鼠模型以及非小細胞肺癌（NSCLC）皮下異種移植小鼠模型中的體內研究去氫表雄固酮（DHEA）的作用。已證實去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）的組合可減少原位及皮下異種移植小鼠模型中的體內腫瘤的生長。

本發明證實去氫表雄固酮（DHEA）透過調降WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑而具有抑制類癌症幹細胞生長的功效，其中磺胺羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）分析以及球體形成分析分別用於檢查細胞活性以及類癌症幹細胞表型。藉由RT-qPCR以及西方墨點分析法檢測幹性相關因子的表現。本發明顯示去氫表雄固酮（DHEA）降低頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的細胞活性，抑制球體形成，並抑制癌症幹細胞標記物例如BMI-1以及Nestin的表現。

本發明並確定去氫表雄固酮（DHEA）抑制幹性相關途徑的轉錄活性。應用螢光素酶報導基因分析來評估幹性相關途徑的轉錄潛力。藉由β-連環蛋白核轉位、RT-qPCR，以及西方墨點分析法檢測WNT訊息傳遞路徑的改變。在WNT傳遞路徑中，去氫表雄固酮（DHEA）減少了活性形式的β-連環蛋白的核轉位，並減少了下游標的CCND1以及CD44的蛋白表現。

根據本發明，去氫表雄固酮（DHEA）提供了增強癌細胞對化療藥物的敏感性的功效，如藉由降低細胞活性、球體形成、幹性標記物的表現，以及WNT傳遞路徑的活化。

本發明之特徵及優點對於本領域技術人員而言是顯而易見的。儘管本領域技術人員可做出多種改變，但是這些改變仍在本發明之範圍內。

本發明之上述內容將結合以下實施例的具體實施例進一步說明。但不應理解為本發明之內容僅局限於以下實施例，所有基於本發明上述內容的發明均屬於本發明之範圍。

除非另有定義，本文中使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同含義。

如本文所用，除非上下文另有明確說明，單數形式「一」、「一個」以及「該」包括複數指示物。因此，例如，提及「一個樣品」包括多個這樣的樣品以及本領域技術人員已知的其等同物。

本發明顯示去氫表雄固酮（DHEA）藉由體外調降WNT傳遞路徑發揮抗癌作用，特別是對於類癌症幹細胞的抑制作用，並降低體內致瘤性。此外，去氫表雄固酮（DHEA）還可增強化療藥物（如伊立替康（IRN））對癌症的治療效果。聯合治療在皮下及原位小鼠模型中皆顯現出增強的抑制腫瘤生長作用。這些結果強調需要進行更深入的研究，以了解去氫表雄固酮（DHEA）以及伊立替康（IRN）協同效應相關的潛在機制。本發明為癌症患者提供了一種新穎且有希望的治療策略。

頭頸鱗狀細胞癌（HNSCCs）

頭頸鱗狀細胞癌（HNSCCs）為一組由口腔、口咽、喉或下嚥黏膜轉化細胞產生的惡性腫瘤。頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）為全球第六大常見癌症。每年診斷出約650,000例新的頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）病例，約佔所有癌症相關死亡的5% [1, 2]。頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的標準治療包括手術、放療、化療以及這些方式的組合。然而，由於抗藥性、腫瘤轉移，以及復發等原因，頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）患者的生存率仍然較低[3]。因此，了解局部復發、轉移以及抗藥的機制極其重要，這可能可以顯著改善頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）患者的治療結果。

非小細胞肺癌（NSCLC）

肺癌為全世界（包括台灣）癌症相關死亡的主要原因。肺癌大致可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）以及非小細胞肺癌（NSCLC），其中非小細胞肺癌（NSCLC）佔肺癌病例的80%。非小細胞肺癌（NSCLC）為除了小細胞肺癌（SCLC）之外的任何類型的上皮性肺癌。最常見的非小細胞肺癌（NSCLC）類型為鱗狀細胞癌、大細胞癌，以及腺癌，但還有其他幾種發生頻率較低的類型，且所有類型都可能出現不尋常的組織學變異。非小細胞肺癌（NSCLC）通常對化療及放療的敏感性低於小細胞肺癌（SCLC）。患有可切除疾病的患者可藉由手術或手術後化療治癒。儘管在診斷及治療方面已有進步，但肺癌的總體5年生存率仍然很低，生存率不到15%。化療及放療等傳統療法通常對肺癌患者的效果令人無法滿意，而抗藥性是臨床上尚未被解決的一個問題。

大腸直腸癌（CRC）

大腸直腸癌（CRC）亦稱為腸癌、大腸癌或直腸癌，是從大腸或直腸（大腸的一部分）發展而來的癌症。大腸直腸癌為全球第四大最常被診斷出來的癌症，也是癌症相關死亡的主要原因。晚期大腸直腸癌（CRC）的標準治療包括基於5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）以及奧沙利鉑的化療方案。然而，持續存在的化療抗藥性是治療大腸直腸癌的重大挑戰，第四期大腸直腸癌的5年生存率較低，僅為12%。因此，迫切需要藉由解決並克服抗藥性來提高大腸直腸癌患者的生存結果。

癌症幹細胞（CSCs）

癌症幹細胞（CSCs）為具有自我更新能力以及超多能性的癌細胞亞群。癌症幹細胞（CSCs）參與腫瘤發生、細胞增殖，以及轉移，為腫瘤發生、轉移以及化療與放療抗藥性的關鍵「種子」[1, 3-5]。這些過程受到涉及癌症幹性以及球體形成的幾個關鍵轉錄因子的調節，例如OCT4、Nanog、SOX2、KLF4，以及MYC。此外，許多訊息傳遞路徑，例如WNT以及Notch傳遞路徑，也有助於癌症幹性的發展[6-10]。

WNT訊息傳遞路徑

WNT訊息傳遞路徑參與細胞增殖、存活，以及進展，並影響生理及病理條件下幹細胞的自我更新[11, 12]。WNT傳遞路徑活化後，未磷酸化的β-連環蛋白易位至細胞核中，隨後觸發TCF/LEF調節的下游基因（例如 CCND1、 MYC以及 CD44）的轉錄。透過維持癌症幹性，WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑的失調與腫瘤的發生及進展密切相關[13]。最近的研究著重於以WNT訊息傳遞路徑為標靶的藥物在單一或聯合療法中用於治療癌症的潛力[14]。

伊立替康（IRN）

伊立替康（Irinotecan，IRN）為一種拓撲異構酶I抑制劑，對實體瘤（如轉移性大腸直腸癌與肺癌）具有抗癌活性。伊立替康（IRN）在復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌（R/M HNSCC）中顯現出一些臨床上的益處[15-17]。伊立替康（IRN）為一種前驅藥，可藉由羧酸酯酶（CES）1或2轉化為活性代謝物SN-38 。在癌症基因體圖譜（TCGA）的頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）隊列中，發現羧酸酯酶1基因（ CES1）是一種頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的不良預後標記物[18]。羧酸酯酶1（CES1）在預後不良的患者中表現上調，可作為以伊立替康（IRN）治療的一個好的治療標的。以伊立替康（IRN）單一治療以及伊立替康（IRN）與其他化療藥物的聯合療法已被證明可改善癌症患者的治療反應。在復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌（R/M HNSCC）患者中，伊立替康（IRN）的總體緩解率為21.2%，而1年生存率為30.2%。對伊立替康（IRN）的反應及其毒性副作用呈現出劑量依賴性的趨勢[19]。此外，伊立替康（IRN）與順鉑的組合在第II期臨床試驗中顯現出協同抗癌作用[20]，順鉑/替加氟/尿嘧啶/伊立替康三重聯合療法在復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌（R/M HNSCC）患者中顯示出中等反應[16]。這種療法的毒性對患者而言是可被忍受的，且患者的生活品質得到改善[16]。然而，伊立替康（IRN）也會引起副作用，例如腹瀉以及嗜中性白血球低下症，這些副作用可透過優化治療劑量或增加標的特異性來解決。

去氫表雄固酮（DHEA）

去氫表雄固酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）為一種內源性類固醇前體激素。在人體中，去氫表雄固酮（DHEA）在大腦、腎上腺皮質、性腺，以及胃腸道中產生[21]，並以硫酸化（去氫表雄固酮硫酸鹽（DHEA-S））的形式儲存[22]。去氫表雄固酮（DHEA）以及去氫表雄固酮硫酸鹽（DHEA-S）都是年輕時人體血清中最豐富的類固醇，也是雌激素及雄激素等性激素的前驅物。去氫表雄固酮（DHEA）已被作為膳食補充劑，據報導具有多種有益作用，如抗肥胖、低血糖、抗動脈粥狀硬化、抗衰老，以及增強記憶力[23-25]。

於本發明中，發現去氫表雄固酮（DHEA）藉由調降WNT訊息傳遞路徑而表現出對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞的抗癌以及類癌症幹細胞特徵（參見圖1及圖2）。在藥物聯合治療策略中，去氫表雄固酮（DHEA）加上伊立替康（IRN）藉由進一步降低細胞活性、抑制類癌症幹細胞特徵、抑制體外WNT訊息傳遞路徑發揮協同作用（見圖3）。此外，聯合治療在皮下及原位小鼠模型中顯現出更好的抗腫瘤生長效果（見圖4及圖5）。

此外，本發明還確定去氫表雄固酮（DHEA）對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的活性具有抑制作用，並對正常人類口腔纖維母細胞（HOF）的毒性較小（參見圖1A及1B）。因此，去氫表雄固酮（DHEA）具有開發作為抗癌藥物的潛力，因為它對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）以及癌症幹性具有作用。

除了抑制癌症幹性之外，本發明還發現去氫表雄固酮（DHEA）減小了乳癌的球體尺寸。去氫表雄固酮（DHEA）對癌症幹性相關事件的影響及其潛在機制從未被研究過，且是在本發明中首次公開的。根據本發明實施例的結果，去氫表雄固酮（DHEA）抑制頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的癌症幹性特性，包括減少球體大小以及降低幹性相關轉錄因子（例如WNT（TCF/LEF）、Nanog以及OCT4）的轉錄活性。OCT4以及Nanog為超多能轉錄因子，有助於維持幹性及癌症進展[49, 50]。儘管以去氫表雄固酮（DHEA）處理後，OCT4以及Nanog的表現略有下降，但去氫表雄固酮（DHEA）顯著降低了這些基因的轉錄活性，表示去氫表雄固酮（DHEA）具有抑制癌症幹細胞（CSCs）潛力的能力（見圖1C-1G）。

據此，本發明提供一種克服癌症化療無效的新策略，其以促進癌症幹性的關鍵訊息傳遞路徑為標靶。已知WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑調節大腸癌[51]以及乳癌[52]中癌症幹細胞（CSCs）的維持與自我更新，且相較於正常的類幹細胞，乳腺癌症幹細胞（CSCs）的活化顯著較高[53]。WNT訊息傳遞路徑的異常活化已在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）以及癌症幹細胞（CSCs）中得到證實[54]。WNT配體與WNT受體的結合活化了WNT途徑，穩定且非磷酸化的β-連環蛋白積累並易位至細胞核中，並與TCF/LEF轉錄因子結合。接著，轉錄因子的活化啟動下游目標基因的表現。因此，阻斷WNT傳遞路徑中的關鍵因素β-連環蛋白可能是一種抑制WNT傳遞路徑的有效策略[55]。多項研究已經開發出WNT傳遞路徑抑制劑，包括針對β-連環蛋白的轉錄活性以及β-連環蛋白的目標基因[14]。然而，在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）患者的臨床試驗中，WNT974（一種阻斷WNT配體分泌的Porcupine酶（PORCN）抑制劑）是唯一使用的藥物[14, 56]。這些發現顯示，以WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑為標靶是一種具有潛力的治療頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的策略。去氫表雄固酮（DHEA）藉由調降細胞核中的活性β-連環蛋白而抑制WNT訊息傳遞路徑，進而降低下游目標基因的轉錄活性，例如頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中的 CD44以及 CCND1（圖2）。本發明首次揭示了去氫表雄固酮（DHEA）對癌症、特別是頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中WNT傳遞路徑內的β-連環蛋白的作用機制。

已知癌症幹細胞（CSCs）的化療抗藥性會導致癌症治療失敗以及腫瘤復發。本發明顯示去氫表雄固酮（DHEA）藉由調降頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中的WNT傳遞路徑來抑制類癌症幹細胞性狀。另外，於本發明中，去氫表雄固酮（DHEA）被用於與其他抗癌藥物一起聯合治療。結果發現，CAL 27球體中的 CES1/2（編碼參與生成伊立替康（IRN）活性形式的酶）的mRNA含量高於其親本細胞（圖3A），這表示這些球體可能因為他們的羧酸酯酶（CESs）含量較高而較其親本細胞對伊立替康（IRN）更為敏感。本發明得出以下結論，去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）的組合對細胞活性發揮協同作用，且如透過計算CI指數所揭示，發現最佳劑量為50 μM去氫表雄固酮（DHEA）加上10 μM伊立替康（IRN）（圖3B及圖3C）。還檢查了其他與去氫表雄固酮（DHEA）聯合使用的化療藥物，但抗癌效果小於伊立替康（IRN）（圖中未顯示）。此外，相較於單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）或伊立替康（IRN），聯合治療進一步調降了頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞中的球體大小、幹性相關蛋白的表現，以及WNT傳遞路徑（圖3）。

此外，去氫表雄固酮（DHEA）治療與伊立替康（IRN）治療相結合，在皮下及原位口腔癌模型中顯現出對腫瘤生長的抑制作用（圖4及圖5）。儘管本案發明人使用一般皮下頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）小鼠模型而非經典的基於癌症幹細胞的動物模型，透過連續稀釋接種來研究去氫表雄固酮（DHEA）及/或伊立替康（IRN）對腫瘤抑制的作用。然而，Shrivastava等人觀察到CAL 27細胞佔親本細胞總數約1.6%的癌症幹細胞（CSC）群體[59]。在本案發明人的皮下體內模型中，接種大約48,000個癌症幹細胞（CSCs）。該細胞亞群可能模擬癌症幹細胞（CSCs）腫瘤發生及進展的能力，並提供去氫表雄固酮（DHEA）對癌症幹細胞（CSCs）潛力的抑制作用的初步結果。此外，在本案發明人的研究中，根據美國食品暨藥物管理局以及Chen等人研究的公式所計算出的體表面積，將小鼠給藥劑量10 mg/kg去氫表雄固酮（DHEA）換算為人體等效劑量（50 mg/kg）[60]。此外，如本發明所示，沒有觀察到小鼠體重的異常變化或其他副作用，表示該劑量是可耐受的。此外，去氫表雄固酮（DHEA）對小鼠的急性口服毒性（致死劑量，LD50）＞ 10,000 mg/kg，進一步支持去氫表雄固酮（DHEA）不存在急性毒性。儘管需要進一步闡明去氫表雄固酮（DHEA）調節伊立替康（IRN）的抗癌作用的根本機制，但本發明中呈現的體外及體內數據支持該組合對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的協同作用。

以下實施例是為了更清楚地展示本發明的上述及其他技術內容、特徵及效果。由於本文所公開的內容應當是本領域技術人員容易理解且能夠實現的，所以所附申請專利範圍應當涵蓋不背離本發明構思的所有等同變化或修改。

實施例

1. 方法

細胞株與細胞培養

人類頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞株CAL 27獲自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，美國），HSC-3與SAS獲自日本研究生物資源細胞庫保藏中心（Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank，JCRB，日本）。人類口腔纖維母細胞（HOF）獲自ScienCell Research公司（美國）。慢病毒包裝細胞株人類胚胎腎細胞（human embryonic kidney，HEK）-293T亦獲自ATCC。所有細胞株皆依照製造商的說明在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，美國）、1% L-麩醯胺酸（Gibco公司，美國），以及抗生素（青黴素及鏈黴素；Gibco公司，美國）的標準培養基中培養，並保持在37°C、5% CO ₂的潮濕環境中。

化學化合物

將反式去氫表雄固酮（DHEA）（Sigma公司，型號D4000）溶解於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，並在體外藥物處理過程中將其維持在含有1% DMSO的培養基中，去氫表雄固酮（DHEA）的濃度為0 - 400 µM。用於體外研究的伊立替康（IRN）購自Sigma公司（型號I1406），並以0 - 10 µM的濃度處理細胞。施用於動物的Campto®（鹽酸伊立替康三水合物）購自輝瑞公司。針對體內實驗，藉由腹膜內（IP）注射分別給予10 mg/kg的去氫表雄固酮（DHEA）以及50 mg/kg的Campto®。進一步的細節描述於圖例中。本研究中使用的化合物及試劑列於表1。在藥物處理期間，對照組（載體）維持在含有1% DMSO的培養基中，這與以去氫表雄固酮（DHEA）處理的條件相同。

磺胺羅丹明B（SRB）分析法

將細胞以2000個細胞/孔接種於96孔微孔盤中。在藥物處理所需時間後，將細胞以10%三氯乙酸（w/v）於4°C下固定1小時，以水洗滌並風乾。使用磺胺羅丹明B（SRB）溶液（1%乙酸中含有0.4% [w/v]）對細胞進行染色1小時，然後使用1%乙酸洗滌並去除多餘的染料。添加20 mM Tris-base後，於540 nm波長處測量蛋白質結合染料的光密度（optical density，OD）以獲得吸光度。以對照組將細胞活性進行標準化，並使用GraphPad Prism 7軟體計算IC50。協同效應評估由CompuSyn軟體（https://www.combosyn.com/）根據使用者說明進行。由此產生的Chou-Talalay組合指數（combination index，CI）定理為藥物組合中的加成效應（CI = 1）、協同作用（CI ＜ 1），以及拮抗作用（CI ＞ 1）提供了定量定義（39）。 表 1 化學品、試劑、套組以及構築體

化學品	公司	型號
反式 - 去氫表雄固酮（DHEA）	Sigma	D4000
伊立替康	Sigma	I1406
三氯乙酸	Sigma	T8657
磺基羅丹明B（SRB）	Sigma	S1402
鹼性纖維母細胞生長因子	PeproTech	100-18B
表皮生長因子	PeproTech	AF-100-15
50倍B27添加劑	Gibco	17504044
Immobilon西方墨點法化學發光辣根過氧化物酶基質	Millipore	WBKLS0500
聚凝胺	Sigma	H9268
嘌呤黴素	Invitrogen	A1113803
ONE-Glo螢光素酶分析系統	Promega	E6120
布拉德福蛋白質定量分析	Bio-Rad	5000006
SuperScript III套組	Invitrogen	18080051
TRIzol TM試劑	Invitrogen	15596026
構築體	公司	型號
pGreenFire1-TCF/LEF（EF1α-puro）慢病毒載體	System Biosciences	TR013PA-P
pGreenFire1-Nanog（EF1α-puro）慢病毒載體	System Biosciences	TR019PA-P
pGreenFire1-Oct4（EF1α-puro）慢病毒載體	System Biosciences	TR039PA-P
pGreenFire1-Notch（EF1α-puro）慢病毒載體	System Biosciences	TR020PA-P

球體形成分析

如前所述進行球體形成分析[40]。簡言之，將細胞與補充有20 ng/ml bFGF（PeproTech公司，型號100-18B）、EGF（PeproTech公司，型號AF-100-15）以及1倍B27補充劑（Gibco公司，型號17504044）的無血清培養基一起在5% CO ₂、37°C的加濕培養箱中培養。然後將細胞與藥物在超低附著6孔盤（Corning公司）中以5000個細胞/孔的密度共同培養。使用相差顯微鏡（Leica公司）捕獲球體的影像，並使用ImageJ軟體確定球體的大小。為了量化球體大小，本案發明人使用ImageJ軟體中的「分析」以及「設置比例」根據圖片中的比例尺繪製了一條線並設置為已知距離。然後，本案發明人畫出與每個球體相等的線，然後從ImageJ軟體進行「測量」。最後，將測量長度的結果進一步用於統計分析。

核萃取物的分離

使用快速、高效且實用（rapid efficient and practical，REAP）方法從細胞中分離出細胞核以及細胞質萃取物[41]。簡言之，藥物處理後，以冷磷酸鹽緩衝鹽水（phosphate buffered saline，PBS）刮擦細胞並懸浮於冰冷的0.1% NP-40中。移液及離心後，將一半上清液轉移至新試管中，並以4X SDS樣品緩衝液稀釋，即為細胞質部分。剩餘的細胞沉澱物以冰冷的0.1% NP-40清洗兩次，並以稀釋在0.1% NP-40中的1X SDS樣品緩衝液重新懸浮，這構成了核部分。為了檢測級分中的蛋白質表現，對每次處理的細胞質級分以及核級分進行西方墨點分析，如2.6節中所述。以a-微管蛋白為細胞質對照；核纖層蛋白A/C作為核級分對照。

西方墨點分析

藥物處理後，裂解細胞，並使用Bradford分析法（Thermo公司）測量蛋白質濃度。藉由10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白質裂解物（30 μg），然後電轉移至0.45 μM聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（Millipore公司）。以含有Tween-20的Tris緩衝鹽水（TBST）中的5%牛奶進行阻隔1小時後，將膜與一級抗體於4°C下作用過夜，然後與相應的二級抗體作用1小時。使用Immobilon Western化學發光HRP基質（Millipore公司，型號WBKLS0500）將表現訊號可視化，並使用Fujifilm LAS4000發光影像分析系統進行檢測。使用ImageJ軟體定量蛋白質含量，並以內部對照（β-肌動蛋白）將表現量進行標準化。本研究中使用的抗體列於表2中。

建立穩定的細胞以及報導基因分析

pGreenFire TCF/LEF（T細胞因子/淋巴增強因子）、Nanog、OCT4，以及Notch1報導子慢病毒載體係購自System Biosciences公司。偽報導病毒的製備如本案發明人之前的研究中所述[42]。簡言之，將HEK293T細胞與報導子慢病毒載體以及包裝質體MD2G及pCMV-dR8.91（RNAiCore公司，台灣）共轉染。轉染48小時後，收集病毒上清液並與聚凝胺（Sigma公司）一起添加至目標細胞的培養基中。為了獲得穩定的細胞株，以嘌呤黴素（1 mg/mL，Invitrogen公司）篩選目標細胞48小時。為了評估去氫表雄固酮（DHEA）對TCF/LEF、Nanog、OCT4以及Notch1調節的轉錄作用的影響，以藥物處理該些穩定細胞，然後使用ONE-Glo螢光素酶測定系統（Promega公司）測量啟動子的活性。 表 2 抗體列表

標的	公司	型號	分子量（ kDa ）	稀釋 /2Ab
BMI-1	Novus Biologicals	NBP1-33748	43.41	1:1000R
Nanog	Cell Signaling Technology	CST#4903	42	1:1000R
OCT4	Abcam	Ab19857	43	1:1000R
巢蛋白	Boster	M00806	177	1:1000M
β-連環蛋白	Cell Signaling Technology	CST#9562	92	1:1000R
非磷酸β-連環蛋白（絲胺酸33/37/蘇胺酸41）	Cell Signaling Technology	CST#8814	92	1:1000R
CCND1	Boster	M00149-1	30	1:1000R
CD44	Boster	M00052-1	82	1:1000R
c-MYC	Cell Signaling Technology	CST#5605	57	1:1000R
β-肌動蛋白	Sigma	A5316	42	1:5000M
α-微管蛋白	Sigma	035M4878V	52	1:5000M
核纖層蛋白A/C	Boster	M00438	74, 63	1:1000R
PCNA	Gene Tex	100539	*IHC	1:500
Ki67	Dako	M7240	*IHC	1:150
縮寫：2Ab，次級抗體；R，兔；M，小鼠。*IHC：以免役組織化學染色法進行抗體染色。

反轉錄與即時PCR（real-time PCR，RT-qPCR）分析

使用TRIzol方法（Invitrogen公司，型號15596026）從細胞中萃取總RNA。使用SuperScript III套組（Invitrogen）並以總RNA（2 mg）作為模板進行反轉錄。使用Omics Green qPCR Master Mix以及Gunster MB-P08A 8條PCR反應管（鋼士特生物科技股份有限公司，台灣）對cDNA進行RT-qPCR，三重複。所用之引子列於表3中。以StepOne™即時PCR系統中的GAPDH表現對測試樣品進行標準化後，使用比較Ct方法獲得相對表現量。 表 3 引子序列

基因	引子序列（ 5’ - 3’ ）	基因	引子序列（ 5’ - 3’ ）
ALDH1A3-F627-47	ACCTCTCACCGCCCTTTATCT	GAPDH-R	GAAGATGG GATGGGATTTC
ALDH1A3-R767-46	GTGAAGGCGATCTTGTTGATCT	KLF4-F1549-68	ACCCTGGGTCTTGAGGAAGT
BMI1-F	TGGAGAAGGAATGGTCCACTTC	KLF4-R1706-85	GGCATGAGCTCTTGGTAATGGA
BMI1-R	GTGAGGAAACTGTGGATGAGGA	MYC-F1057-76	TCTCCGTCCTCGGATTCTCT
CCND1-F	GACCTTCGTTGCCCTCTGT	MYC-R1179-58	TTCTTGTTCCTCCTCAGAGTCG
CCND1-R	TGAGGCGGTAGTAGGACAGG	NANOG-F611-31	ACCTCAGCTACAAACAGGTGA
CES1-F	ACCCCTGAGGTTTACTCCACC	NANOG-R717-98	CTTCTGCGTCACACCATTGC
CES1-R	TGCACATAGGAGGGTACGAGG	OCT4-F1232F53	GGGGTTCTATTTGGGAAGGTAT
CES2-F	CATGGCTTCCTTGTATGATGGT	OCT4-R1358-39	TGTTGTCAGCTTCCTCCACC
CES2-R	CTCCAAAGTGGGCGATATTCTG	SOX2-F1103-23	TACAGCATGTCCTACTCGCAG
GAPDH-F	GAAGGTGAAGGTCGGAGT	SOX2-R1212-92	GAGGAAGAGGTAACCACAGGG

體內實驗

所有動物實驗均嚴格按照美國國家衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）實驗動物護理暨使用指南進行。動物實驗方案經中央研究院動物護理暨使用機構委員會（台灣台北；方案編號：ASIACUC-R19-07-1329）核准。所有實驗均使用5-6週齡的雄性NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl（Nod-SCID）小鼠。為了評估體內致瘤性及抗幹性能力，將重新懸浮於PBS中的3×10 ⁶個CAL 27細胞或1000個FACS分選的CD44 ⁺/CD133 ⁺CAL 27類幹細胞皮下接種至小鼠右側脅腹。針對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）原位模型[43]，將重新懸浮於PBS中的CAL 27螢光素酶表現細胞（5 × 10 ⁵個）注射至小鼠的頰黏膜下層中。使用IVIS影像系統（Caliper Life Sciences公司）對體內腫瘤進行成像，並測量螢光素酶表現的訊號強度。每週兩次以腹腔注射進行給藥。每週測量一次腫瘤生長與體重。為了確定攜帶CAL 27類幹細胞的小鼠模型的腫瘤形成頻率，在標準去氫表雄固酮（DHEA）處理方案八週後藉由驗屍檢查形成的腫瘤。

蘇木精與伊紅（H&E）以及免疫組織化學（IHC）染色及分析

以甲醛固定腫瘤切片並以石蠟包埋切片。使用Discovery XT自動免疫染色儀（Ventana Medical System公司）進行蘇木精與伊紅（H&E）或免疫組織化學（IHC）染色。在脫蠟、去除石蠟、復水後，使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復。對切片進行PCNA（GTX型號100539，1:500，GeneTex，公司，美國）以及Ki67（Dako公司，型號M7240，1:150，DAKO/Agilent公司，聖塔克拉克市，加州，美國）免疫染色，然後以蘇木精複染。

統計分析

所有統計分析皆使用Prism 7 軟體（GraphPad Software公司，拉霍亞市，加州，美國）進行學生氏單尾t檢驗。數據以獨立實驗的平均值 ± 標準差（SD）或平均值標準誤差（SEM）形式呈現。統計顯著性設定為 p＜ 0.05。

II. 結果

1. 去氫表雄固酮（DHEA）具有抗癌作用並抑制頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞的幹性潛能

為了檢查去氫表雄固酮（DHEA）對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞活性的影響，分別以不同劑量的去氫表雄固酮（DHEA）處理頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞株（包括CAL 27、SAS以及HSC-3）24、48以及72小時。去氫表雄固酮（DHEA）以時間及劑量依賴性方式顯著抑制細胞活性（圖1A）。處理72小時後，CAL 27細胞的去氫表雄固酮（DHEA）半數最大抑制濃度（IC50）為192.2 ± 28.4 μM，SAS細胞為292.9 ± 43.9 μM，HSC-3細胞為211.5 ± 13.5 μM。此外，本案發明人還檢查了去氫表雄固酮（DHEA）對正常人類口腔纖維母細胞（HOF）的影響。如圖1B所示，相較於頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞株（CAL27以及SAS細胞），人類口腔纖維母細胞（HOF）在暴露於200 mM去氫表雄固酮（DHEA）72小時後，其細胞活性顯現出較低的毒性及抑制作用。人類口腔纖維母細胞（HOF）的活性下降了20%，SAS細胞的活性下降了32%，而CAL 27細胞的活性下降了50%。先前的一項研究顯示，去氫表雄固酮（DHEA）會降低人類球體間質幹細胞中幹細胞基因的表現[38]。因此，為了檢查去氫表雄固酮（DHEA）對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）幹細胞潛能的作用，在球體形成分析中，將CAL 27細胞以及SAS細胞與0、100以及200 mM的去氫表雄固酮（DHEA）一起作用20天。去氫表雄固酮（DHEA）顯著抑制了兩種頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞株的球體大小（圖1C）。此外，在CAL 27以及SAS親本細胞（圖1D）以及球狀細胞（圖1E）中處理6小時後，去氫表雄固酮（DHEA）還降低了幹性相關的mRNA含量，包括ALDH1A3、BMI-1、KLF4，以及SOX2。去氫表雄固酮（DHEA）處理導致BMI-1以及Nestin蛋白表現略有減少，但不影響OCT4以及Nanog的表現（圖1F）。為了進一步檢查幹性相關轉錄因子的轉錄活性，本案發明人使用了WNT（TCF/LEF）、Nanog、OCT4，以及Notch1反應要件報導基因檢測。儘管去氫表雄固酮（DHEA）僅略微降低了OCT4以及Nanog的蛋白含量，但頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞中的OCT4以及Nanog（幹性轉錄因子）的轉錄活性顯著降低（圖1G）。總而言之，這些結果顯示去氫表雄固酮（DHEA）抑制頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞活性以及癌症幹性潛力，包括球體大小以及幹性標記物的表現。

2. 去氫表雄固酮（DHEA）藉由減少活性β-連環蛋白的核轉位來抑制WNT傳遞路徑的活性

在人類上皮癌中，例如頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）或大腸直腸癌，WNT訊息傳遞路徑對於腫瘤的發生及進展極其重要[44, 45]。為了進一步研究去氫表雄固酮（DHEA）對β-連環蛋白的影響，以去氫表雄固酮（DHEA）處理頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞株的WNT傳遞路徑的關鍵訊息傳遞因子，然後進行核萃取分析。如圖2A所示，去氫表雄固酮（DHEA）處理抑制活性（非磷酸化）β-連環蛋白的核轉位，進而阻止CCND1、CD44以及c-MYC等下游效應子（圖2B及2C）。總而言之，這些結果顯示去氫表雄固酮（DHEA）調降WNT轉錄活性，進而抑制頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）幹性的潛力。

3. 頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）類幹細胞增強伊立替康（IRN）活性轉換酶CES1/2的表現

伊立替康（IRN）為一種拓撲異構酶I抑制劑，是目前用於治療大腸直腸癌的化療藥物[46]。此外，伊立替康（IRN）已與其他化療藥物一起用於頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）患者的單一及聯合治療，且患者反應顯現出改善[18, 20]。給藥後，伊立替康（IRN）在患者體內被CES1/2酶轉化為其活性形式SN-38 [47]。最近的研究顯示，羧酸酯酶（CES）的活性及表現與伊立替康（IRN）在肺癌細胞株[17, 48]以及實體瘤[49-51]中的功效相關。此外，Shaojun等人的研究顯示，在轉移性大腸直腸癌患者中，羧酸酯酶2（CES2）的高度表現與較佳的伊立替康（IRN）治療效果相關，這表示羧酸酯酶2（CES2）可能在伊立替康（IRN）敏感性中發揮重要作用。因此，評估羧酸酯酶1/2（CES1/2）的表現可能為以伊立替康（IRN）為基礎的療法的反應提供初步的臨床證據[16]。有趣的是，相較於親本細胞，CAL 27球體顯現出更高的CES1/2 mRNA含量（圖3A）。此外，抑制WNT訊息傳遞路徑可減少類癌症幹細胞特徵，並增加癌細胞對化療（包括伊立替康）的敏感性[52, 53]。本案發明人的研究結果顯示，去氫表雄固酮（DHEA）對WNT訊息傳遞路徑具有抑制作用（圖1F及2）。因此，本案發明人試圖確定去氫表雄固酮（DHEA）是否會使頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）癌症幹細胞（CSCs）對伊立替康（IRN）敏感。

4. 去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）顯現出增強的抗癌及抗幹性潛力的效果，並進一步調降頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞中的WNT傳遞路徑

為了評估去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的作用，使用磺胺羅丹明B（SRB）分析檢查細胞活性，並使用CompuSyn軟體藉由組合指數（CI）計算評估協同效應[39]。在CAL 27與HSC-3細胞中，相較於單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）或伊立替康（IRN），去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）處理72小時後可進一步抑制細胞活性，且CI指數顯現出協同效應（CI值＜1）（圖3B、3C及圖6B、6C）。去氫表雄固酮（DHEA）（50 μM）、伊立替康（IRN）（10 μM）以及聯合治療後，CAL 27細胞的活性分別為84.1%、35.9%以及24.0%。該劑量組合顯現出最佳的協同作用（CI 值 = 0.48），並用於在CAL 27細胞中進行後續實驗。此外，在CAL 27以及SAS細胞中測試了其他化療藥物與去氫表雄固酮（DHEA）的組合（圖7）。去氫表雄固酮（DHEA）聯合吉西他濱、多西紫杉醇或甲胺蝶呤的聯合治療顯現出協同作用，但效果不如去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）。在這些化療藥物中，以多西紫杉醇或吉西他濱作為單一化療藥物對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）進行治療獲得相當的效果。因此，本案發明人沒有進一步研究聯合使用以增強對細胞的毒性。因此，選擇伊立替康（IRN）作為與去氫表雄固酮（DHEA）的聯合化療藥物進行進一步研究。在球體形成分析中，相較於單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）或伊立替康（IRN），該組合顯著減小了CAL 27球體尺寸（圖3D）。此外，聯合治療對幹性標記物的表現顯現出更大的抑制作用，包括BMI-1、OCT4，以及Nanog（圖3E）。值得注意的是，在WNT途徑中，聯合治療進一步降低了活性非磷酸化β-連環蛋白以及下游目標的表現，例如全細胞裂解物中的CCND1以及CD44（圖3F）。這些數據證實，相較於單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）或伊立替康（IRN），去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）聯合治療在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞中發揮更好的抗癌及抑制類幹細胞性狀的作用。

5. 去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）在皮下頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）小鼠模型中顯現出比伊立替康（IRN）單藥治療更佳的抗腫瘤效果

為了進一步研究去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）在體內對抗頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的作用，將CAL 27細胞皮下注射至免疫缺陷小鼠的脅腹中以建立異種移植模型。藉由腹腔注射給予去氫表雄固酮（DHEA）（10 mg/kg/每週兩次）及/或伊立替康（IRN）（50 mg/kg/每週一次）（圖4A）。相較於單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）或伊立替康（IRN），聯合治療對腫瘤尺寸及重量的抑制效果優於對照組（圖4B、4C、4E）。有趣的是，聯合治療減輕了伊立替康引起的體重減輕，顯示去氫表雄固酮（DHEA）可以減少伊立替康（IRN）的副作用（圖4D）。在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）異種移植物的蘇木精及伊紅（H&E）染色中（圖4F），單獨以伊立替康（IRN）治療組以及聯合治療組的腫瘤尺寸小於載劑對照組或單獨以去氫表雄固酮（DHEA）治療組的腫瘤尺寸。如圖4G所示，相較於以單一藥物治療的小鼠，聯合治療的小鼠表現出較低的增殖標記物PCNA以及Ki67的表現百分比。總而言之，去氫表雄固酮（DHEA）增強了以伊立替康調節的抗癌作用，並進一步降低了體內致瘤性。

6. 在原位小鼠模型中，去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）比伊立替康（IRN）單藥治療具有更佳的抗腫瘤效果

為了進一步評估去氫表雄固酮（DHEA）在原位口腔癌模型中的效果，將表現螢光素酶（Luc）的CAL 27細胞接種至免疫缺陷小鼠的頰黏膜下層。對小鼠進行腹腔注射藥物，每週一次使用IVIS光譜系統測量生物發光訊號以評估腫瘤生長率。單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）治療對原位口腔癌模型中的腫瘤生長抑制沒有顯著效果（圖8）。CD44 + / CD133 + CAL 27幹細胞的體內模型顯示，去氫表雄固酮（DHEA）治療比對照組更能降低HNC幹細胞的腫瘤形成頻率（表4）。為了進一步研究去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）在原位口腔癌模型中的作用，將小鼠分為三組進行不同的治療：載劑、伊立替康（IRN）（50 mg/kg，每週一次），以及去氫表雄固酮（DHEA）（10 mg/kg/每週一次）聯合伊立替康（圖5A）。如圖5B、C所示，相較於單獨使用載劑或伊立替康（IRN），去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）導致小鼠頰側位點的原位頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）異種移植物生物發光訊號顯著減少。總而言之，這些結果顯示，相較於單一療法，去氫表雄固酮（DHEA）聯合伊立替康（IRN）在口腔癌原位小鼠模型中表現出增強的抗腫瘤作用。 表 4. 以去氫表雄固酮（ DHEA ）處理後 CAL 27 類幹細胞的體內腫瘤形成頻率。

處理	腫瘤形成頻率
對照	8/10
去氫表雄固酮（DHEA）10 mg/kg	4/9

去氫表雄固酮（DHEA）顯現出抗癌作用並抑制非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的幹性潛能

有鑑於去氫表雄固酮（DHEA）在抗癌能力中的重要性，有必要探索比去氫表雄固酮（DHEA）表現出更優異功效的類似物。為了解決這個問題，本案發明人利用八種非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株（A549、A549-ON、CL141、H441、CL152、HCC827、CL97以及H1975）作為藥物篩選的細胞模型。本案發明人採用七種去氫表雄固酮（DHEA）代謝物（其結構與去氫表雄固酮（DHEA）相似，但在一兩個官能基上略有修改）來評估它們對這些非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的毒性（圖9）。研究結果顯示，相較於其他類似物（如順式去氫表雄固酮、7-氧代去氫表雄固酮、順式R-去氫表雄固酮、反式R-去氫表雄固酮，以及去氫表雄固酮硫酸鹽），去氫表雄固酮（DHEA）以及4-去氫表雄固酮（4-DHEA）在A549-ON以及鱗狀非小細胞肺癌細胞CL152中表現出更強的毒性作用。接著，本案發明人研究這些類似物是否具有增強的抗癌症幹細胞（CSC）活性。為了評估這些藥物對癌症幹細胞（CSCs）的效果，本案發明人採用了一種被廣泛接受的模型，稱為腫瘤球體分析。非小細胞肺癌（NSCLC）細胞，特別是CL141以及CL97細胞，在超低附著盤中培養，並以不同濃度的藥物處理7天（圖10）。從類癌症幹細胞（CSCs）球體分析中獲得的結果顯示，相較於所有其他去氫表雄固酮（DHEA）類似物，去氫表雄固酮（DHEA）表現出優異的抗癌症幹細胞活性。相較於僅以載劑處理的對照組，以去氫表雄固酮（DHEA）處理導致CL141以及CL97細胞形成的球體數量顯著減少了80-90%（圖10）。此外，本案發明人還進行實驗以評估六種化療藥物與去氫表雄固酮（DHEA）聯合使用的效果，結果總結於圖11。攜帶KRAS突變以及帶有野生型PTEN基因型的細胞似乎對藥物組合表現出更高的敏感性。反之，具有野生型KRAS以及PTEN缺失基因型的細胞對藥物組合的抗藥性增加。隨後，本案發明人評估了去氫表雄固酮（DHEA）的體內抗腫瘤功效。為了建立腫瘤，以100萬個細胞的濃度將人類肺癌細胞株NCI-H441（獲自ATCC）皮下注射至NOD/SCID小鼠（4-6週齡）的右側腹中。以5 mg/kg的劑量將測試藥物（去氫表雄固酮（DHEA）以及培美曲塞（Alimta））以腹腔注射方式給藥，每週注射5天。結果顯示，相較於培美曲塞（Alimta），單獨使用去氫表雄固酮（DHEA）表現出更優異的抗腫瘤作用，且不會引起體重任何顯著變化，這表示每天以5 mg/kg劑量的去氫表雄固酮（DHEA）治療不會導致不良的副作用（圖12）。

去氫表雄固酮（DHEA）顯現出抗癌作用並抑制大腸直腸癌（CRC）細胞的幹性潛能

為了進一步研究去氫表雄固酮（DHEA）的抗癌潛力，本案發明人對大腸直腸癌（CRC）細胞進行了實驗，以評估去氫表雄固酮（DHEA）對抗大腸直腸癌（CRC）的功效。本案發明人的研究結果顯示，去氫表雄固酮（DHEA）的IC50值範圍為100 μM至400 μM，相較於其他細胞，RKO以及HCT116細胞在48小時時間點表現出最低的IC50值，分別為117 μM以及138 μM（圖13A）。此外，去氫表雄固酮（DHEA）證明能夠抑制大多數測試細胞中的TCF/LEF報導基因活性，這表示去氫表雄固酮（DHEA）還可抑制大腸直腸癌（CRC）細胞中的WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑（圖13B）。為了驗證在調節去氫表雄固酮（DHEA）毒性中G6PD以及P53參與的狀態，本案發明人在HCT116細胞中進行P53基因敲除，無論是否敲除G6PD。有趣的是，比較HCT116-p53野生型細胞與HCT116-p53基因敲除細胞，發現P53的敲除降低了細胞對去氫表雄固酮（DHEA）處理的敏感性（圖14A）。此外，G6PD的敲除似乎增強了細胞對去氫表雄固酮（DHEA）處理的敏感性（圖14A）。此外，數據還顯示，去氫表雄固酮（DHEA）可藉由獨立於p53及G6PD的途徑誘導HCT116細胞中p21的表現程度（圖14B）。總體而言，這些發現顯示，去氫表雄固酮（DHEA）可能藉由刺激大腸直腸癌（CRC）細胞中p21的表現來影響大腸直腸癌（CRC）的生長。此外，本案發明人使用DLD-1 5-FU抗藥性（DLD-1R）細胞進行類癌症幹細胞（CSCs）球體形成分析，檢驗去氫表雄固酮（DHEA）克服大腸直腸癌（CRC）細胞抗藥性的能力。結果顯示，相較於DLD-1細胞，DLD-1R細胞表現出更高的幹性能力。然而，去氫表雄固酮（DHEA）有效抑制DLD-1以及DLD-1R細胞中的球體形成（圖15）。有趣的是，聯合給予去氫表雄固酮（DHEA）導致腫瘤重量的進一步減少。此外，FOLFOX或FOLFIRI治療有助於恢復由CT-26腫瘤負荷引起的體重減輕並改善握力。值得注意的是，共同施用去氫表雄固酮（DHEA）部分增強了這些效果，特別是在FOLFOX治療下，如圖16A及16B所示。本案發明人還證明標準大腸直腸癌（CRC）治療（例如FOLFOX或FOLFIRI）對CT26腫瘤生長的抑制作用，如圖16C所示。

III. 結論

總而言之，本發明指出去氫表雄固酮（DHEA）藉由體外調降WNT傳遞路徑發揮抗癌作用，特別是關於類癌症幹細胞的抑制作用，並降低體內致瘤性。此外，去氫表雄固酮（DHEA）增強了伊立替康（IRN）對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞的治療效果。聯合治療在皮下及原位小鼠模型中均顯現出增強的腫瘤生長抑制作用。這些結果突顯了去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）的協同效應。本案發明人的研究結果為頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）、非小細胞肺癌（NSCLC）以及大腸直腸癌（CRC）的患者提供了一種新穎且有潛力的治療策略。此外，當去氫表雄固酮（DHEA）單獨使用或與伊立替康（IRN）聯合使用時，高度表現羧酸酯酶1/2（CES1/2）的細胞對去氫表雄固酮（DHEA）的治療更敏感。KRAS突變以及PTEN野生型的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞對去氫表雄固酮（DHEA）與化療藥物的聯合治療更敏感。最後，TP53野生型或G6PD缺陷（突變或調降）的大腸直腸癌（CRC）細胞對去氫表雄固酮（DHEA）的治療更敏感。總體而言，這些基於精準醫學針對各種癌症的去氫表雄固酮（DHEA）治療方案為癌症患者提供治療的選擇策略。 參考文獻 1. Peitzsch C, et al. Cancer Stem Cells in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma: Identification, Characterization and Clinical Implications. Cancers (Basel) (2019) 11(5). doi: 10.3390/cancers11050616 2. Bray F, et al. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin (2018) 68(6):394-424. doi: 10.3322/caac.21492 3. Chinn SB, et al. 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無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述概述以及本發明的以下詳細描述。為了說明本發明之目的，附圖中顯示目前較佳的實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所示之精確設置及手段。

於圖式中：

圖1說明了去氫表雄固酮（DHEA）在減少頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞球體大小、幹性標記物表現以及相關蛋白轉錄活性方面的抗癌作用；其中（A）以0、50、100、200，以及400 μM的去氫表雄固酮（DHEA）處理頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞24、48，以及72小時。以磺胺羅丹明B（SRB）分析測定細胞活性。（B）以0及200 μM去氫表雄固酮（DHEA）處理頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞以及人類口腔纖維母細胞（human oral fibroblast，HOF）72小時。以磺胺羅丹明B（SRB）分析測定細胞活性。（C）顯示CAL 27以及SAS細胞與0、100，以及200 μM的去氫表雄固酮（DHEA）作用20天後的球體形成分析結果。比例尺：200 µm。（D-E）RT-qPCR結果顯示以200 µM的去氫表雄固酮（DHEA）處理6小時後，CAL 27以及SAS親本細胞（D）以及球體（E）中幹性標記的mRNA含量。（F）西方墨點分析顯示以去氫表雄固酮（DHEA）處理72小時後CAL 27以及SAS細胞中幹性標記物的表現。以β-肌動蛋白作為內部對照。左圖顯示三個獨立實驗的代表性西方墨點分析結果。右側的柱狀圖代表三個獨立實驗的定量。（G）螢光素酶報導基因檢測顯示以200 μM的去氫表雄固酮（DHEA）處理24小時後，CAL 27以及SAS細胞中幹性相關標記物的轉錄活性，包括TCF/LEF（WNT）、Nanog、OCT4，以及Notch1。數據代表來自三個獨立實驗的平均值 ± 標準差（standard deviation，SD）。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，使用t檢驗與對照（僅1% DMSO）進行比較。

圖2說明藉由以去氫表雄固酮（DHEA）處理來調降頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞中的WNT傳遞路徑；其中（A）核萃取物的西方墨點分析結果顯示以200 μM的去氫表雄固酮（DHEA）處理24小時對CAL 27以及SAS細胞中活性β-連環蛋白的影響。以α-微管蛋白作為細胞質對照；核纖層蛋白A/C作為核分級對照。以α-微管蛋白或核纖層蛋白A/C對活性β-連環蛋白進行標準化。（B-C）RT-qPCR（B）以及西方墨點分析（C）所示為去氫表雄固酮（DHEA）對CAL 27以及SAS細胞中WNT傳遞路徑下游基因mRNA以及蛋白質表現的影響。左圖所示為三個獨立實驗的代表性西方墨點分析結果。右側的柱狀圖代表三個獨立實驗的定量。數據代表來自三個獨立實驗的平均值 ± 標準差（SD）。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，使用t檢驗與對照（僅1% DMSO）進行比較。

圖3說明去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）組合協同降低細胞活性以及幹細胞性，並進一步調降CAL 27細胞中的WNT傳遞路徑；其中（A）RT-qPCR結果顯示CAL 27球體與親本細胞中的伊立替康（IRN）代謝酶的mRNA含量。CES1/2：羧酸酯酶1/2。（B）單獨以去氫表雄固酮（DHEA）（0、50，以及100 μM）、伊立替康（IRN）（0、0.5、1、5，以及10 μM）或兩者之組合處理CAL 27細胞72小時，並以磺胺羅丹明B（SRB）分析測定細胞活性。數據代表來自三個獨立實驗的平均值 ± 標準差（SD）。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，使用t檢驗與相同濃度的去氫表雄固酮（DHEA）進行比較。# p＜ 0.05；## p＜ 0.01；### p＜ 0.001，使用t檢驗與相同濃度的伊立替康（IRN）進行比較。（C）（B）中各種處理後的CI指數。CI ＞ 1，拮抗作用；CI = 1，加成性；CI ＜ 1，協同作用。（D）所示為CAL 27細胞與去氫表雄固酮（DHEA）（50 μM）及/或伊立替康（IRN）（10 μM）共培養後的球體形成分析結果。比例尺：200 µm。（E-F）西方墨點分析顯示DHEA及/或IRN處理24小時後CAL 27中幹性標記物（E）以及WNT傳遞路徑相關因子（F）的蛋白質表現。左圖所示為三個獨立實驗的代表性西方墨點分析結果。右側的柱狀圖代表三個獨立實驗的定量。數據代表來自三個獨立實驗的平均值 ± 標準差（SD）。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，使用t檢驗。所有的處理均維持在相同百分比的DMSO中。CT：對照；DH：去氫表雄固酮；IRN：伊立替康。

圖4說明去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）組合在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）皮下小鼠模型中顯現出增強的抗腫瘤作用；其中（A）所示為實驗時程與給藥的流程圖。將CAL 27細胞皮下注射至小鼠體內，然後藉由腹腔注射以去氫表雄固酮（DHEA）（10 mg/kg/每週兩次）以及伊立替康（IRN）（50 mg/kg/每週一次）進行處理。每週測量一次腫瘤尺寸及體重。（B-E）載劑處理組與藥物處理組中攜帶CAL 27腫瘤小鼠的腫瘤尺寸（B）、腫瘤重量（C）、體重（D），以及腫瘤外觀（E）。（F）載劑與藥物處理後小鼠腫瘤以蘇木精及伊紅（Hematoxylin and eosin，H&E）染色結果。（G）經過各種處理後，小鼠腫瘤中PCNA（上排）以及Ki67（下排）的免疫組織化學（IHC）染色結果。數據代表平均值 ± SEM（n = 5/每組）。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，n.s.，無顯著差異，使用t檢驗進行相互比較。IRN，伊立替康。

圖5說明去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）組合進一步減少頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）原位小鼠模型中的腫瘤生長；其中（A）所示為實驗時程與給藥的流程圖。將具有螢光素酶表現的CAL 27細胞（CAL 27-Luc）注射至小鼠的頰黏膜下層中。腹膜內（intraperitoneally，IP）注射去氫表雄固酮（DHEA）（10 mg/kg/每週一次）以及伊立替康（IRN）（50 mg/kg/每週一次）。每週測量一次腫瘤生長（使用IVIS光譜影像系統透過生物發光訊號測量）以及體重。（B-D）各種治療後原位小鼠模型的生物發光影像（B）、光子計數定量（C），以及體重（D）。數據代表平均值 ± SEM（n = 5/每組）。n.s.，無顯著差異；* p＜ 0.05；** p＜ 0.01，使用t檢驗進行相互比較。

圖6說明去氫表雄固酮（DHEA）與伊立替康（IRN）組合對HSC-3細胞的細胞活性表現出協同抑制作用；其中（A）以0、50、100、200，以及400 μM的去氫表雄固酮（DHEA）處理HSC-3細胞24、48以及72小時。藉由磺胺羅丹明B（SRB）分析測定細胞活性。數據代表來自三個獨立實驗的平均值 ± 標準差（SD）。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，使用t檢驗與對照（僅1% DMSO）進行比較。（B）單獨以去氫表雄固酮（DHEA）（0、50，以及100 μM）或單獨以伊立替康（IRN）（0、0.5、1、5，以及10 μM），或兩者的組合處理HSC-3細胞72小時，並藉由磺胺羅丹明B（SRB）分析測定細胞活性 。數據代表來自三個獨立實驗的平均值 ± SD。* p＜ 0.05；** p＜ 0.01；*** p＜ 0.001，使用t檢驗與相同濃度的去氫表雄固酮（DHEA）進行比較。# p＜ 0.05；## p＜ 0.01；### p＜ 0.001，使用t檢驗與相同濃度的伊立替康（IRN）進行比較。（C）（A）中提到的各種處理後細胞的CI指數。CI ＞ 1，拮抗作用；CI = 1，加成性；CI ＜ 1，協同作用。所有的處理均維持在相同百分比的DMSO中。

圖7說明去氫表雄固酮（DHEA）聯合其他化療藥物對HNC細胞活性的影響；其中以化療藥物處理CAL 27細胞（左排）以及SAS細胞（右排），化療藥物包括吉西他濱（A）、多西紫杉醇（B），以及甲胺蝶呤（C）進行單藥治療，或與去氫表雄固酮（DHEA）聯合治療72小時，並藉由SRB法測定細胞活性。數據以單一實驗的平均值 ± 標準差表示。CI指數（下圖）：CI ＞ 1，拮抗作用；CI = 1，加成性；CI ＜ 1，協同作用。GEM：吉西他濱；DOC：多西紫杉醇；MTX：甲胺蝶呤。

圖8說明去氫表雄固酮（DHEA）在HNC原位模型中對腫瘤生長沒有表現出明顯的影響；其中（A）實驗時程與給藥流程圖。將具有GFP/螢光素酶表現的CAL 27細胞（CAL 27-GL）注射至小鼠的頰黏膜下層中。腹腔注射去氫表雄固酮（DHEA）（10 mg/kg/每週一次）。每週測量一次腫瘤生長（使用IVIS 光譜系統測量生物發光訊號）以及體重。（B-D）各種治療後原位模型中的生物發光影像（B）、光子計數定量（C）以及體重（D）。數據代表平均值 ± SEM（n = 5/每組）。n.s.，無顯著差異；* p＜ 0.05；** p＜ 0.01，使用t檢驗進行比較。

圖9說明去氫表雄固酮（DHEA）及其類似物對非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株的IC50。以不同種類的去氫表雄固酮（DHEA）類似物或濃度增加的去氫表雄固酮（DHEA）處理非小細胞肺癌（NSCLC）細胞，並藉由磺胺羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）分析法測定細胞毒性。

圖10說明去氫表雄固酮（DHEA）具有抗癌症幹細胞活性。針對初級球體形成分析，將（A）CL141細胞以及（B）CL97細胞解離，並以10,000個細胞/孔的密度接種於24孔超低附著盤中，盤內含有包含1% N2補充劑、EGF（20 ng/mL）以及bFGF（20 ng/mL）的DMEM/F12培養基，並且與指定的去氫表雄固酮（DHEA）及其類似物一起培養7天，並藉由顯微鏡計數球體數量。

圖11說明去氫表雄固酮（DHEA）以及化療藥劑組合針對肺癌或卵巢癌細胞株的協同細胞毒性作用之總結。在藥物治療前24小時，將各種NSCLC細胞以3x10 ⁴個/mL的密度接種至96孔盤中。增加藥物濃度以獲得最佳的毒殺癌症的條件，並藉由阿拉瑪藍（Alamar blue）分析法測量細胞活性。然後，藉由CompuSyn軟體中的等輻射線圖分析，應用這些數據來計算組合指數（combination index，CI）。+：輕度協同效應；++：協同效應；-：無協同效應。

圖12說明去氫表雄固酮（DHEA）在體內對肺癌具有腫瘤抑制作用。每天以去氫表雄固酮（DHEA）以及Alimta（培美曲塞）分別施用至NOD-SCID小鼠體內（每種化合物5 mg/kg）。（A）每週測量腫瘤尺寸，（B）還監測體重以檢查是否有任何副作用。

圖13說明去氫表雄固酮（DHEA）對大腸直腸癌（CRC）細胞株的抗腫瘤作用。（A）去氫表雄固酮（DHEA）對大腸直腸癌（CRC）細胞株的IC50。以濃度逐漸增加的去氫表雄固酮（DHEA）處理大腸直腸癌（CRC）細胞，並藉由磺胺羅丹明B（SRB）分析測定細胞毒性。（B）以TOP/FOP螢光素酶分析檢查去氫表雄固酮（DHEA）抑制大腸直腸癌（CRC）細胞中β-連環蛋白-TCF/LEF轉錄活性的能力。

圖14說明去氫表雄固酮（DHEA）的抗大腸直腸癌（CRC）作用並不依賴p53以及G6PD。（A）如表中所示，在有或沒有p53基因敲除（knockout，KO）及/或G6PD基因敲低（knockdown，KD）條件下測定去氫表雄固酮（DHEA）對HCT116細胞的IC50。以濃度不斷增加的去氫表雄固酮（DHEA）處理HCT116細胞，並使用磺胺羅丹明B（SRB）分析評估細胞毒性。（B）西方墨點分析數據顯示去氫表雄固酮（DHEA）藉由獨立於p53以及G6PD的途徑誘導p21的表現。

圖15說明去氫表雄固酮（DHEA）有效減少DLD-1以及DLD-1 5-FU抗性（DLD-1R）細胞的類癌症幹細胞（類CSC）球體形成。

圖16說明去氫表雄固酮（DHEA）治療可減輕攜帶CT-26腫瘤的小鼠的惡病質狀況。與去氫表雄固酮（DHEA）的聯合施用似乎部分增強了接受FOLFOX治療的小鼠的（A）體重以及（B）握力的改善。（C）與去氫表雄固酮（DHEA）共同施用部分增強了化療（特別是FOLFOX以及FOLFIRI）對CT-26腫瘤生長的抑制作用。

無

Claims (10)

1. 一種去氫表雄固酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）或其衍生物或代謝物在製備治療一具有高度表現的CES1/2細胞的癌症的藥物中之用途；其中該癌症係選自由頭頸癌、肺癌以及大腸直腸癌（colorectal cancer，CRC）所組成之群組。
2. 一種去氫表雄固酮（DHEA）或其衍生物或代謝物在製備治療一對抗癌藥物具有抗藥性的具有高度表現的CES1/2細胞的癌症的藥物中之用途；其中該癌症係選自由頭頸癌、肺癌以及大腸直腸癌（CRC）所組成之群組。
3. 根據請求項1或2所述之用途，其中該頭頸癌為一頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）。
4. 根據請求項1或2所述之用途，其中該肺癌為一非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）。
5. 根據請求項2所述之用途，其中該抗癌藥物為一化療藥物。
6. 根據請求項5所述之用途，其中該去氫表雄固酮（DHEA）與該化療藥物組合施用。
7. 根據請求項1或2所述之用途，其中該非小細胞肺癌（NSCLC）中的KRAS突變體以及PTEN野生型細胞對去氫表雄固酮（DHEA）更敏感。
8. 根據請求項2所述之用途，其中該大腸直腸癌（CRC）細胞中的TP53野生型或G6PD缺陷突變體對去氫表雄固酮（DHEA）更敏感。
9. 根據請求項1或2所述之用途，其中該去氫表雄固酮（DHEA）提供一抑制類癌症幹細胞生長的功效。
10. 根據請求項1或2所述之用途，其中該去氫表雄固酮（DHEA）藉由調降WNT/β-連環蛋白訊息傳遞路徑來提供一抑制類癌症幹細胞生長的功效。