CN112400801B - 一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents

一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用，所述构建方法包括：将溶有4‑硝基喹啉‑1‑氧化物的二氯甲烷溶液涂抹于动物喉部粘膜，得到所述喉癌前病变动物模型。采用4NQO联合二氯甲烷起到协同致癌作用，能够明显缩短单药制模成功所需要的时间；该模型与人类患者类似，其喉部粘膜发白，表面出现刺状突起，或喉粘膜表面出现斑块和浅表溃疡，和患者的表现高度相似，具有很好的临床症状模拟性；其次，4NQO能够直接溶解于二氯甲烷中，增加其溶解度和稳定性；且制得的混合液具有一定的粘滞性，其涂抹于喉部粘膜时能更好地接触并附着于喉黏膜，明显延长致癌物对喉黏膜的刺激时间；该构建方法不会诱发胃肠道肿瘤，减少干扰因素。

Description

一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用，尤其涉及一种很好地模拟人类喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用。
背景技术
癌症的发生、发展、浸润及转移等是一个非常复杂的过程，喉癌亦是如此，涉及多个基因、多种因素的参与，是癌基因的激活、凋亡基因的失控、抑癌基因的失活等多方面因素相互作用的结果。喉癌的早期发现，早期诊断在喉肿瘤的治疗中尤其关键，我们要了解喉癌的发病进程，对癌前病变状态及早干预，也是重要的治疗方法之一。在喉癌前病变到喉癌的过程中，不同的癌前病变组织具有不同的恶变几率，Hojeslet等的研究表明，低度非典型增生有7.8％发生恶变，中重度非典型增生有55.6％发生恶变，喉癌前病变可有多种形式，有国外学者根据喉癌前病变的肉眼观将其分为三型：一型，成人型慢性肥厚性喉炎；二型，喉角化病(细胞无异型性，细胞有异型性，原位癌)；三型，喉乳头状瘤。国内定义的喉癌前病变包括：喉角化病、喉黏膜白斑病、喉厚皮病、成人喉乳头状瘤、慢性肥厚性喉炎。
喉癌的发生过程是由喉正常细胞到癌前病变再到喉癌发生的过程，喉癌前病变如果祛除诱发因素，或者给予合适的治疗，是可以逆转的，因此，有必要针对喉癌前病变实施有效的诊断及治疗。例如CN104706648A公开了芍药内酯苷或其药学上可接受的盐、对映体或外消旋混合物在制备预防和/或治疗喉癌的药物中的用途，体内外实验证明，所述芍药内酯苷具有确切的抗肿瘤活性，有望开发出抗肿瘤新药，为临床治疗肿瘤提供新的选择。例如CN1493250公开了一种内窥镜诊断癌前病变的装置，包括光源，光路系统，内窥镜及电路系统，医生能多渠道的并迅速地查找到癌前病变的部位又能及时查准癌前病变的分级，提高了对癌前病变的查全率和查准率，从而降低了癌病的发病率和死亡率。
为了能更好地开发喉癌前病变有效的诊断及治疗方式，需要开发用于喉癌前病变的机理研究与治疗方法研究的生物样本，也就需要合适的动物模型。癌前病变作为喉癌发生的必经阶段，其动物模型的建立能够为探讨喉癌发病原因和机制及二级预防提供实验平台。但目前关于喉癌癌前病变动物模型的研究较少，尚没有成功的喉癌癌前病变动物模型。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用，尤其提供一种很好地模拟人类喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种喉癌前病变动物模型的构建方法，所述构建方法包括：将溶有4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液涂抹于动物喉部粘膜，得到所述喉癌前病变动物模型。
本发明所涉及的喉癌前病变动物模型构建方法采用4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)联合二氯甲烷起到协同致癌作用，能够明显缩短单药制模成功所需要的时间；该模型与人类患者类似，其喉部粘膜发白，白色样变范围逐渐扩大，表面出现刺状突起，或喉粘膜表面出现斑块和浅表溃疡，和患者的表现高度相似，具有很好的临床症状模拟性；其次，4NQO能够直接溶解于二氯甲烷中，增加其溶解度和稳定性；且制得的混合液具有一定的粘滞性，其涂抹于喉部粘膜时能更好地接触并附着于喉黏膜，明显延长致癌物对喉黏膜的刺激时间；涂抹法相比于饮水法更加直接有效，且不会诱发胃肠道肿瘤，减少干扰因素。
优选地，所述动物选自大鼠或小鼠。
优选地，所述大鼠包括SD大鼠、Wistar大鼠或Lewis大鼠。
优选地，所述小鼠包括C57BL/6小鼠或Balb/c小鼠。
优选地，所述动物选自Wistar大鼠，周龄为7-14周龄，例如7周龄、8周龄、9周龄、10周龄、11周龄、12周龄、13周龄或14周龄等。
所述Wistar大鼠的周龄优选为7-14周是因为，若周龄超过14周则喉癌前病变程度减轻，若周龄小于7周则个体差异较大。
优选地，所述4-硝基喹啉-1-氧化物在所述二氯甲烷溶液中的质量百分含量为0.5-2％，例如0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述溶有4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液的涂抹频率为每1-3 天(每1天、每2天、每3天等)涂抹1次，每次涂抹时间为1-2min，例如1min、 1.2min、1.5min、1.8min或2min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的涂抹方式为：枪状镊夹持绿豆大小棉团插入4-硝基喹啉-1- 氧化物的二氯甲烷溶液内，全部沾湿后经大鼠口腔，咽后壁，到达喉部。涂抹喉部1-2分钟。
优选地，所述溶有4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液的涂抹周期为15-25 周，例如15周、18周、20周、22周或25周等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述4-硝基喹啉-1-氧化物在所述二氯甲烷溶液中的质量百分含量特定选择为0.5-2％，且涂抹频率为每1-3天涂抹1次，每次涂抹时间为1-2min，涂抹周期为15-25周，构建得到的动物模型的喉癌前病变程度比较适中，既具有明显的喉癌前病变症状，例如喉部粘膜发白，白色样变范围逐渐扩大，表面出现刺状突起，或喉粘膜表面出现斑块和浅表溃疡，也能在药物的治疗下逐渐好转。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的喉癌前病变动物模型的构建方法获得的喉癌前病变动物模型。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的喉癌前病变动物模型在筛选喉癌前病变治疗候选药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的喉癌前病变动物模型构建方法采用4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)联合二氯甲烷起到协同致癌作用，能够明显缩短单药制模成功所需要的时间；该模型与人类患者类似，其喉部粘膜发白，白色样变范围逐渐扩大，表面出现刺状突起，或喉粘膜表面出现斑块和浅表溃疡，和患者的表现高度相似，具有很好的临床症状模拟性；其次，4NQO能够直接溶解于二氯甲烷中，增加其溶解度和稳定性；且制得的混合液具有一定的粘滞性，其涂抹于喉部粘膜时能更好地接触并附着于喉黏膜，明显延长致癌物对喉黏膜的刺激时间；涂抹法相比于饮水法更加直接有效，且不会诱发胃肠道肿瘤，减少干扰因素。
附图说明
图1是确定经口涂抹的入喉深度的操作示意图(A为确定经口涂抹的入喉深度处，B为量取过程示意图)；
图2是模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图一；
图3是模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图二；
图4是模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图三；
图5是模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图四；
图6是模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图五；
图7是模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图六；
图8是对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、12、20周时钳取的病变组织的HE染色图(A-D依次为对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、12、20 周时钳取的病变组织的HE染色图)；
图9是对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、12、20周时钳取的病变组织的KI67免疫组化检测图(A-D依次为对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、 12、20周时钳取的病变组织的KI67免疫组化检测图)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中涉及的10周龄雄性Wistar大鼠来源于天津医科大学第二医院动物实验中心，体质量约200-250g，室温18-25℃，湿度40％-50％，以标准固体饲料喂养。24h自然光暗循环。
下述实施例中涉及的4NQO购自于美国Sigma公司，用二氯甲烷配制成体积分数为1％的溶液，置4℃冰箱避光保存。
实施例1
本实施例构建一种喉癌前病变动物模型，方法如下：
首先量取Wistar大鼠门齿至双侧声带和会厌根部的距离，确定经口涂抹的入喉深度，平均约12mm，操作过程如图1的A和B所示。
然后将36只10周龄雄性Wistar大鼠按照体重平均分为2组，分别为对照组和模型组，每组18只。使用体积分数为1％的4NQO二氯甲烷混合溶液涂抹模型组Wistar大鼠喉部黏膜，两天涂抹1次，每次每只大鼠涂抹时间为1.5分钟，共20周。对照组Wistar大鼠使用生理盐水涂抹喉部黏膜，两天涂抹1次，每次每只大鼠涂抹时间为1.5分钟，共20周。涂抹具体为：枪状镊加持绿豆大小棉团插入4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液内，全部沾湿后经大鼠口腔，咽后壁，到达喉部。涂抹喉部1.5分钟。
评价试验：
(1)造模过程中每4周观察并记录大鼠食量、饮水量及体重的变化；
(2)每4周用内镜观察并记录1次喉黏膜形态变化，照相并记录；
(3)分别在第4、12、20周时钳取大鼠病变组织送病理检查，制成组织学切片，进行HE染色和KI67免疫组化检测，显微镜下观察。
结果如下：
(1)造模过程中大鼠食量、饮水量及体重的变化情况如表1所示(数据以平均值±标准偏差的方式呈现)：
表1
Figure BDA0002820721910000061
Figure BDA0002820721910000071
由表1数据可知：模型组大鼠在食量，饮水量，体重三个方面均明显低于对照组，差异均具有显著性，尤其是第十二周开始，差异显著性最大。说明模型组大鼠喉部疾患严重，影响进食，饮水，影响体重。
(2)模型组大鼠喉部在16周时用内镜观察图如图2-7所示，由图可知：可见喉部(会厌)有白色不规则米粒样组织生长，喉部会厌的溃烂，以及声带局部增厚，白斑形成。造模成功。
(3)对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、12、20周时钳取的病变组织的HE染色图如图8所示(A-D依次为对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、 12、20周时钳取的病变组织的HE染色图)，由图可知：对照组大鼠表现为正常喉粘膜，B表现为轻度不典型增生，C表现为中度不典型增生，D表现为重度不典型增生。造模成功。
(4)对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、12、20周时钳取的病变组织的KI67免疫组化检测图如图9所示(A-D依次为对照组大鼠以及模型组大鼠分别在第4、12、20周时钳取的病变组织的KI67免疫组化检测图)，由图可知：A 表现为正常喉粘膜，B表现为轻度不典型增生，C表现为中度不典型增生，D表现为重度不典型增生。造模成功。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种喉癌前病变动物模型及其构建方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (8)

1.一种喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将溶有4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液涂抹于动物喉部粘膜，得到所述喉癌前病变动物模型；所述4-硝基喹啉-1-氧化物在所述二氯甲烷溶液中的质量百分含量为0.5-2％。
2.如权利要求1所述的喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物选自大鼠或小鼠。
3.如权利要求2所述的喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述大鼠包括SD大鼠、Wistar大鼠或Lewis大鼠。
4.如权利要求2所述的喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠包括C57BL/6小鼠或Balb/c小鼠。
5.如权利要求1所述的喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物选自Wistar大鼠，周龄为7-14周龄。
6.如权利要求1所述的喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述溶有4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液的涂抹频率为每1-3天涂抹1次，每次涂抹时间为1-2min。
7.如权利要求1所述的喉癌前病变动物模型的构建方法，其特征在于，所述溶有4-硝基喹啉-1-氧化物的二氯甲烷溶液的涂抹周期为15-25周。
8.如权利要求1-7中任一项所述的喉癌前病变动物模型的构建方法在筛选喉癌前病变治疗候选药物中的应用。
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