JP5666523B2 - 癌を処置するためのペグ化ｉｌ−１０の使用 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳類サイトカイン分子および関連試薬の使用に関する。特に、本発明は、増殖性疾患の処置において使用できる、化学修飾された哺乳類サイトカインタンパク質類の同定に関する。

発明の背景
癌および腫瘍は、免疫系により制御または根絶されうる。免疫系は、数種類のリンパ細胞および骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球を含む。これらのリンパおよび骨髄細胞は、サイトカイン類として知られる、分泌シグナリングタンパク質類を生産する。サイトカイン類には、例えばインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２３が含まれる。免疫反応には、炎症、すなわち全身または体の特定の場所における免疫細胞の蓄積が含まれる。感染性因子または異物に応答して、免疫細胞がサイトカインを分泌し、このサイトカインが、免疫細胞増殖、成長、分化、または移動を調節する。過剰の免疫反応は、自己免疫不全等の病理的帰結をもたらしうるが、免疫反応障害は、癌をもたらしうる。免疫系による抗腫瘍反応には、例えばマクロファージ、ＮＫ細胞、および好中球によって媒介されるような先天免疫と、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔ細胞、およびＢ細胞によって媒介されるような適応免疫とが含まれる（例えば、Ａｂｂａｓ等（編）（２０００）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，ペンシルベニア州フィラデルフィア；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ａｎｄ Ｆｅｌｄｍａｎｎ（編）（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ；非特許文献１；非特許文献２を参照）。

免疫反応を調節する方法が、癌、例えば黒色腫の処置において用いられている。これらの方法には、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）、ＩＦＮγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等のサイトカインによるか、サイトカインアンタゴニスト（例えば抗体）による処置が含まれる。インターロイキン−１０は、サイトカイン合成阻止因子として最初に特徴づけされた（ＣＳＩＦ；例えば、非特許文献３を参照）。ＩＬ−１０は、免疫抑制剤および免疫促進剤の両方として機能できる、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球により生産される多面的サイトカインである（例えば、非特許文献４；および非特許文献５を参照）。

動物モデルから、ＩＬ−１０が、用量依存的様式で、ＮＫ細胞活性化を誘導し、標的細胞破壊を促進しうることが示唆される（例えば、非特許文献６；非特許文献７）。さらなる研究により、腫瘍微小環境におけるＩＬ−１０の存在が、患者生存率の改善と相関することが示される（例えば、非特許文献８を参照）。

残念ながら、ＩＬ−１０は、血中半減期が比較的短く、２〜６時間である（例えば、非特許文献９を参照）。本発明は、癌を処置するための、改変された形のＩＬ−１０、例えばペグ化されたＩＬ−１０を使用する方法を提供することにより、この問題に対処する。非ペグ化ＩＬ−１０と比較して、ペグ化された形のＩＬ−１０には、血中半減期の延長に加えて、驚くべきことに、例えば腫瘍部位へのＣＤ８＋Ｔ細胞の動員増加による、殺腫瘍活性の増加がみられた。

ｖｏｎ Ａｎｄｒｉａｎ ａｎｄ Ｍａｃｋａｙ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０００）３４３：１０２０−１０３４ Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００１）３４５：３４０−３５０ Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８９）１７０：２０８１−２０９５ Ｇｒｏｕｘ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：３１８８−３１９３ Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８５：２１０１−２１１０ Ｚｈｅｎｇ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８４：５７９−５８４ Ｋｕｎｄｕ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（１９９６）８８：５３６−５４１ Ｌｕ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００４）２２：４５７５−４５８３ Ｓｍｉｔｈ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１７３：２０７−２１４

本発明は、ペグ化ＩＬ−１０が改良された腫瘍成長モジュレータである、という発見に基づく。本発明は、腫瘍を有効な量のペグ化インターロイキン−１０（ＰＥＧ−ＩＬ−１０）に接触させるステップを含む、腫瘍または癌の増殖を阻害または減少させる方法を提供する。一実施形態においては、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０である。ＰＥＧ−ＩＬ−１０には、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーが含まれる。代替的実施形態においては、ＰＥＧ−ＩＬ−１０には、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）リンカーが含まれる。ある実施形態においては、ＰＡＬＤ−ＰＥＧリンカーには、５ＫＤａ、１２ＫＤａ、または２０ＫＤａからなる群より選択される分子量を有するＰＥＧ分子が含まれる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、腫瘍または癌の増殖を阻害し、またはＰＥＧ−ＩＬ−１０が、腫瘍または癌のサイズを減少させる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、非ペグ化ＩＬ−１０と比較して、腫瘍内へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させる。別の実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−リガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）からなる群より選択されうる、少なくとも一つの炎症性サイトカインの発現を増加させる。ある実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、少なくとも一つの化学療法剤と共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）される。化学療法剤は、表１６の化学療法剤の少なくとも１つでありうる。ある実施形態では、腫瘍または癌は、大腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、および白血病からなる群より選択される。

本発明は、有効な量のＰＥＧ−ＩＬ−１０を対象に投与するステップを含む、癌または腫瘍を患う対象を処置する方法を含む。一実施形態においては、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０である。ＰＥＧ−ＩＬ−１０には、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーが含まれる。別の実施形態においては、ＰＥＧ−ＩＬ−１０には、５ＫＤａ、１２ＫＤａ、または２０ＫＤａからなる群より選択される分子量を有しうる、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）リンカーが含まれる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、癌または腫瘍の増殖を阻害し、または腫瘍または癌のサイズを減少させる。非ペグ化ＩＬ−１０と比較して、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させる。別の実施形態においては、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、少なくとも一つの炎症性サイトカインの発現を増加させる。炎症性サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−Ｌからなる群より選択される。ある実施形態においては、ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、少なくとも一つの化学療法剤と共投与される。化学療法剤は、表１６の化学療法剤の少なくとも１つでありうる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、癌または腫瘍の転移を減少させる。さらなる実施形態においては、腫瘍または癌は、大腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、黒色腫、神経膠芽腫、および白血病からなる群より選択される。ある実施形態においては、処置対象はヒトであり、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、ヒトＰＥＧ−ＩＬ−１０（ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０）である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
腫瘍または癌の増殖を阻害または減少する方法であり、この腫瘍を、有効な量のペグ化インターロイキン１０（ＰＥＧ−ＩＬ−１０）に接触させるステップを含む、方法。
（項目２）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）リンカーを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、上記腫瘍または癌の増殖を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、上記腫瘍または癌のサイズを減少させる、項目１に記載の方法。
（項目５）
非ペグ化ＩＬ−１０と比較して、ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、上記腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させる、項目１に記載の方法。
（項目６）
ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、少なくとも一つの炎症性サイトカインの発現を増加させる、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記炎症性サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−リガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）からなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、少なくとも一つの化学療法剤と共投与される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記化学療法剤が、表１６の化学療法剤の少なくとも１つである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記腫瘍または癌が、大腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、および白血病からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
癌または腫瘍を患う対象を治療する方法であり、有効な量のＰＥＧ−ＩＬ−１０を、この対象に投与するステップを含む、方法。
（項目１２）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）リンカーを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、上記癌または腫瘍の増殖を阻害する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、上記腫瘍または癌のサイズを減少させる、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
非ペグ化ＩＬ−１０と比較して、ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、上記腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させる、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、少なくとも一つの炎症性サイトカインの発現を増加させる、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
上記炎症性サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−Ｌからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、少なくとも一つの化学療法剤と共投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
上記化学療法剤が、表１６の化学療法剤の少なくとも１つである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、癌または腫瘍の転移を減少させる、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
上記腫瘍または癌が、大腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、黒色腫、神経膠芽腫、および白血病からなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
上記対象が、ヒトである、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
上記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、ヒトＰＥＧ−ＩＬ−１０（ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０）である、項目２２に記載の方法。

詳細な説明
添付の特許請求の範囲を含めた本明細書で使用される、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等の言葉の単数形には、文脈から逆が明らかでない限り、それらの複数形を含む。本明細書の全ての引用文献は、個々の刊行物、特許出願、または特許が参照により本明細書に組み込まれるものと特に個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｉ．定義
細胞またはレセプターに使用されるところの、「活性化」、「刺激」、および「処置」は、文脈上または明示的に示されない限り、同じ意味、例えばリガンドによる細胞またはレセプターの活性化、刺激、または処置の意味を有する。「リガンド」には、自然および合成のリガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、アナログ、変異タンパク質、および抗体由来の結合組成物を含む。「リガンド」には、小分子、例えばサイトカインのペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）および抗体のペプチド模倣物も含む。「活性化」は、内部機構ならびに外部または環境因子により制御される細胞活性化をいい得る。例えば細胞、組織、臓器、または有機体等の「反応」には、生化学的または生理的挙動、例えば生物コンパートメント内の濃度、密度、接着、または移動、遺伝子発現率、または分化状態の変化を含み、変化は、活性化、刺激、または処置、または遺伝的プログラミング等の内部機構と相関する。

分子の「活性」は、分子のリガンドまたはレセプターに対する結合、触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナリング、分化、または成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節等を記載するか、またはいい得る。分子の「活性」は、活性細胞間相互作用、例えば接着を調節または維持する活性、または細胞の構造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する活性も意味しうる。「活性」は、比活性、例えば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物コンパートメント内の濃度等も意味しうる。「増殖活性」には、例えば、正常な細胞分裂、ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞形質転換、転移、および血管形成を促進するか、それらに必要であるか、それらに特に関連する、活性を含む。

動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または生物流体に使用されるところの、「投与」および「処置」とは、外来性の医薬品、治療剤、診断剤、化合物、または組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または生物流体への接触をいう。「投与」および「処置」は、例えば治療、プラセボ、薬物動態学的、診断、研究、および実験法をさしうる。「細胞の処置」には、細胞に対する試薬の接触、ならびに、細胞と接触する流体に対する試薬の接触を含む。「投与」および「処置」は、例えば細胞の、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞による、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの処置も意味する。ヒト、獣医学的、または研究対象に使用されるところの、「処置」とは、治療的処置、防止または予防法、研究および診断のための適用をいう。ヒト、獣医学的、または研究対象、または細胞、組織、または臓器に使用されるところの、「処置」には、ヒトまたは動物対象、細胞、組織、生理的コンパートメント、または生理流体に対する、ＰＥＧ−ＩＬ−１０の接触が含まれる。「細胞の処置」には、ＰＥＧ−ＩＬ−１０がＩＬ−１０レセプター（ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２のヘテロ二量体）に、例えば流体またはコロイド相において接触する状況、ならびに、例えば流体が細胞またはレセプターと接触するが、アゴニストまたはアンタゴニストが細胞またはレセプターに直接接触することが示されていない場合などに、ＩＬ−１０アゴニストまたはアンタゴニストが流体に接触する状況も含まれる。

「悪液質」は、代謝の障害から生じる筋肉（筋肉消耗）および脂肪の減少を伴う、消耗症候群である。悪液質は、様々な癌（「癌悪液質」）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、進行した臓器不全、およびＡＩＤＳで生じる。癌悪液質は、例えば顕著な体重減少、食欲不振、無力症、および貧血により特徴づけられる。食欲不振は、食物嫌悪など、食欲の欠如から生じる障害である（例えば、ＭａｃＤｏｎａｌｄ等（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｓｕｒｇ．１９７：１４３−１６１；Ｒｕｂｉｎ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５３８４−５３８９；Ｔｉｓｄａｌｅ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ２：８６２−８７１；Ａｒｇｉｌｅｓ等（２００３）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ８：８３８−８４４；Ｌｅｌｌｉ等（２００３）Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１５：２２０−２２５；Ａｒｇｉｌｅｓ等（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ ６：４０１−４０６を参照）。

「ＰＥＧ−ＩＬ−１０の保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の核酸配列をさす。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードしうる。

アミノ酸配列については、技術者は、コードされた配列のアミノ酸またはわずかな比率のアミノ酸を保存されたアミノ酸に置換する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換が、「保存的に修飾された変異体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。保存的置換の例は、以下の群の一つにおけるアミノ酸の、同じ群の別のアミノ酸との交換である。（Ｌｅｅ等に対する米国特許第５，７６７，０６３号；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）：
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ，またはＭｅｔ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ；
（７）小アミノ酸：Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ。

「有効な量」は、医学的状態の症状または兆候を改善または防止するために十分な量を含む。有効な量は、診断を可能にするかまたは促進するために十分な量も意味する。特定の患者または獣医学的対象に対する有効な量は、治療される状態、患者の全体的な健康状態、投与の方法経路および用量および副作用の重症度等の要因により変動しうる（例えば、Ｎｅｔｔｉ等に対する米国特許第５，８８８，５３０号を参照）。有効な量は、有意な副作用または毒作用を回避する、最大用量または投与プロトコルでありうる。効果により、１００％を健常人にみられる診断パラメータとして定義して、少なくとも５％、通常は少なくとも１０％、より通常は少なくとも２０％、最も通常は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、より理想的には少なくとも８０％、最も理想的には少なくとも９０％の、診断尺度またはパラメータの改善がもたらされる（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ等（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，フロリダ州ボカラトン；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，ロンドン、ＵＫを参照）。ＰＥＧ−ＩＬ−１０の有効な量は、腫瘍容積を減らし、腫瘍成長を阻害し、転移を防止し、または腫瘍部位へのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤増加させるのに十分な量である。

「外因性」とは、文脈に応じて、有機体、細胞、または人体の外で生産される物質をいう。「内因性」は、文脈に応じて、細胞、有機体、または人体の中で生産される物質をいう。

「免疫状態」または「免疫不全」は、例えば病的炎症、炎症性疾患、および自己免疫疾患または障害を含む。「免疫状態」には、免疫系による根絶（ｉｒｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）に抵抗する感染、腫瘍、および癌を含む、感染、持続性感染、および癌、腫瘍、および血管形成等の増殖状態もいう。「癌性の状態」には、例えば癌、癌細胞、腫瘍、血管形成、および異形成等の前癌性状態が含まれる。

「阻害剤」および「アンタゴニスト」、または「活性化剤」および「アゴニスト」は、例えばリガンド、レセプター、補助因子、遺伝子、細胞、組織、または臓器の、例えば活性化のための、阻害または活性化分子をそれぞれ意味する。例えば遺伝子、レセプター、リガンド、または細胞のモジュレータは、遺伝子、レセプター、リガンド、または細胞の活性を変更する分子であり、活性が、活性化、阻害、またはその調節特性において変更されうる。モジュレータは、単独で作用するか、補助因子、例えばタンパク質、金属イオン、または小分子を使用しうる。阻害剤は、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、レセプター、または細胞の活性化を減少させ、遮断し、防止し、遅延させ、不活性化し、感度を減じ、ダウンレギュレートする化合物である。活性化剤は、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、レセプター、または細胞の活性化を増加、活性化、促進、増強し、感度を高め、またはアップレギュレートする化合物である。阻害剤は、構成的活性を減少、遮断、または不活性化する組成物として定義することもできる。「アゴニスト」は、標的と相互作用して、標的の活性化の増加を引き起こし、または促進する、化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止、減少、阻害、または中和する。アンタゴニストは、同定されるアゴニストがない場合にも、標的、例えば標的レセプターの構成的活性を防止、阻害、または減少させることができる。

阻害の程度を検査するため、例えば、所与の、例えばタンパク質、遺伝子、細胞、または有機体を含む試料またはアッセイが、潜在的な活性化剤または阻害剤で処理され、阻害剤を伴わないコントロール試料と比較される。コントロール試料、すなわちアンタゴニストで処理されないものには、１００％の相対的活性値が割り当てられる。コントロールに対する活性値が、約９０％以下、典型的に８５％以下、より典型的に８０％以下、最も典型的に７５％以下、一般には７０％以下、より一般には６５％以下、最も一般には６０％以下、典型的に５５％以下、通常は５０％以下、より通常は４５％以下、最も通常は４０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２５％以下、および最も好ましくは２５％未満であるときに、阻害が達成される。コントロールに対する活性値が、約１１０％、一般には少なくとも１２０％、より一般には少なくとも１４０％、さらに一般的には少なくとも１６０％、多くの場合には少なくとも１８０％、より多くの場合には少なくとも２倍、最も多くの場合には少なくとも２．５倍、通常は少なくとも５倍、より通常は少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも４０倍、最も好ましくは４０倍以上高いときに、活性化が達成される。

活性化または阻害のエンドポイントは、以下の通りにモニタされうる。例えば細胞、生理流体、組織、臓器、および動物またはヒト対象の活性化、阻害および処置に対する反応を、エンドポイントによりモニタできる。エンドポイントは、所定の量または割合の、サイトカイン、毒性酸素、またはプロテアーゼの放出等の、例えば炎症、腫瘍原性、または細胞脱顆粒または分泌の指標を含みうる。エンドポイントには、例えば、所定量のイオン流出または輸送；細胞移動；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化、例えば炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期、または転移に関連する遺伝子の発現の変化が含まれうる（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ（２０００）Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３０：１４５−１５８；ＨｏｏｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：９１−１００；Ｔｉｍｍｅ等（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：２５１−２６１；ＲｏｂｂｉｎｓおよびＩｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．８６：１４６７−１４９５；ＧｒａｄｙおよびＭａｒｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１−１２８；Ｂａｕｅｒ等（２００１）Ｇｌｉａ ３６：２３５−２４３；ＳｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃおよびＳａｔｏｈ（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１０：１１３−１２６を参照）。

阻害のエンドポイントは、一般にコントロールの７５％以下、好ましくはコントロールの５０％以下、より好ましくはコントロールの２５％以下、もっとも好ましくはコントロールの１０％以下である。一般に、活性化のエンドポイントは、コントロールの少なくとも１５０％、好ましくはコントロールの少なくとも二倍、より好ましくはコントロールの少なくとも四倍、最も好ましくはコントロールの少なくとも１０倍である。

「標識された」組成物は、直接または間接的に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、同位体的、化学的方法により検出可能である。例えば、有用な標識には、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^３Ｈ、^１２５Ｉ、安定同位体、蛍光染料、高電子密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ）、基質、エピトープタグ、または酵素、例えば酵素結合イムノアッセイにおいて用いられるようなもの、またはｆｌｕｏｒｅｔｔｅｓが含まれる（例えば、ＲｏｚｉｎｏｖおよびＮｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照）。

「リガンド」は、例えば、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる、小分子、ペプチド、ポリペプチド、および膜関連または膜結合型分子、またはその複合体をさす。「リガンド」には、アゴニストまたはアンタゴニストでないが、その生物学的性質、例えばシグナリングまたは接着に大きな影響を与えずにレセプターに結合しうる因子も含まれる。さらに、「リガンド」には、例えば化学的または組換え法により、膜結合型リガンドの可溶形態に変更された膜結合型リガンドが含まれる。慣例によって、リガンドが第一細胞の膜に結合する場合には、レセプターは通常第二細胞にある。第二細胞は、第一細胞と同じまたは異なる正体を有しうる。リガンドまたはレセプターは完全に細胞内でありうる、すなわちサイトソル、核、または他の細胞内コンパートメントに存在しうる。リガンドまたはレセプターは、その位置を、例えば細胞内コンパートメントから形質膜の表面へと変更しうる。リガンドおよびレセプターの複合体は、「リガンドレセプター複合体」と称される。リガンドおよびレセプターがシグナリング経路に関わる場合においては、リガンドが上流の位置にあり、レセプターがシグナリング経路の下流の位置にある。

「小分子」が、生理機能および腫瘍および癌疾患の治療のために提供される。「小分子」は、分子量が１０ｋＤ未満、典型的に２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子として定義される。小分子には、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣物、および抗体模倣物が含まれるが、これに限られない。治療としては、小分子は、大きな分子より細胞に浸透しやすく、劣化しにくく、免疫反応を誘発しにくい。抗体およびサイトカインのペプチド模倣物等の小分子、ならびに小分子毒素が記載される（例えば、Ｃａｓｓｅｔ等（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７：１９８−２０５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｌｉ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２５１−１２５６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ等（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：４１１−４２０；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ等（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．８：２１８５−２１９９；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ等（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６５２−６５６；ＳａｔｏおよびＳｏｎｅ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１：６０３−６０８；Ｓｔｅｗａｒｔ等に対する米国特許第６，３２６，４８２号を参照）。

「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスフォスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポサルファン等のアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）を含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、チオランブシル（ｃｈｉｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）等のニトロソウレア類（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；アクラシノマイシン類（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン類（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン等の抗生物質類；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗−代謝産物類；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸アナログ類；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリンアナログ類；アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン、５−ＦＵ等のピリミジンアナログ類；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎類（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）等の葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ニュージャージー州プリンストン）およびドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチン等のプラチナアナログ類；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）；カペシタビン；および、以上のいずれかの薬理学上許容可能な塩類、酸類または誘導体類が含まれる。例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；およびフルタミド、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド、およびゴセレリン等の抗アンドロゲン；および以上のいずれかの薬理学上許容可能な塩類、酸類または誘導体類等の、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も、この定義に含まれる。

リガンド／レセプター、抗体／抗原、または他の結合対についていう場合の「特異的に」または「選択的に」は、タンパク質および他の生物学製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の雑多な集団におけるそのタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定の条件の下では、特異的リガンドは、特定のレセプターと結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に、有意な量で結合することはない。意図される方法における、抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物は、その他の抗体またはこれに由来する結合組成物との親和性よりも少なくとも二倍高い、好ましくは少なくとも十倍高い、より好ましくは少なくとも二十倍高い、最も好ましくは少なくとも百倍高い親和性で、その抗原またはその変異体または変異タンパク質に結合する。好ましい実施形態においては、抗体は、例えばスキャッチャード分析で決定されるところにより、約１０^９リットル／モルより高い親和性を有する（Ｍｕｎｓｅｎ等（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。

本明細書で使用される「インターロイキン−１０」または「ＩＬ−１０」は、ポリエチレングリコールに結合されているか非結合形態であるかを問わず、非共有結合によりホモ二量体を形成する二つのサブユニットを含むタンパク質である。本明細書で使用されるところでは、特に明記しない限り、「インターロイキン−１０」および「ＩＬ−１０」は、「ｈＩＬ−１０」または「ｍＩＬ−１０」とも呼ばれるヒトまたはマウスＩＬ−１０をさしうる（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿０００５６３；Ｍ３７８９７；または米国特許第６，２１７，８５７号）。

「ペグ化ＩＬ−１０」または「ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、結合が安定するように、リンカーを介してＩＬ−１０タンパク質の一つまたは二つ以上のアミノ酸残基に共有結合した一つ以上のポリエチレングリコール分子を有する、ＩＬ−１０分子である。用語「モノペグ化ＩＬ−１０」および「モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、一つのポリエチレングリコール分子が、リンカーを介してＩＬ−１０二量体の一つのサブユニット上の単一のアミノ酸残基に共有結合していることを意味する。ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００〜約５０，０００ダルトンの間であるのが好ましい。ＩＬ−１０に対するＰＥＧ結合の方法または部位は重要でないが、ペグ化により生物活性分子の活性が変更されないか、または変更が最小限であることが好ましい。半減期の増加が、生物活性の任意の減少より大きいことが好ましい。ＰＥＧ−ＩＬ−１０については、米国特許第７，０５２，６８６号明細書に記載されるように、細菌性抗原（リポ多糖、ＬＰＳ）に侵され、ＰＥＧ−ＩＬ−１０により治療される対象の、血清中の炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦα、ＩＦＮγ）のレベルを評価することにより、生物活性が測定されるのが典型的である。

本明細書で使用されるところの、「ｔ_１／２」と略記される「血中半減期」は、排出半減期、すなわち、因子の血清濃度が、最初の値または最大値の半分に達した時間を意味する。本明細書において合成因子に関して用いられるところの、用語「血中半減期の増加」は、合成因子が、非合成、内因性因子、またはその組み換え生産された形態よりも遅い速度で排出されることを意味する。

ＩＩ．一般
本発明は、増殖性疾患、例えば癌、腫瘍等を、ペグ化ＩＬ−１０で治療する方法を提供する。ＩＬ−１０は、ＣＤ８Ｔ−細胞の細胞毒性活性、Ｂ細胞の抗体産生を誘導し、マクロファージ活性および腫瘍促進性炎症を抑制する（ＣｈｅｎおよびＺｌｏｔｎｉｋ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：５２８−５３４；Ｇｒｏｕｘ等（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１７２３−１７２９；およびＢｅｒｇｍａｎ等（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２３１−２３８を参照）。ＣＤ８細胞の調節は、用量に依存し、高用量は、より強い細胞障害反応を誘導するが、組換えｈＩＬ−１０の有用性は、半減期が短いことにより制限される。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、腫瘍免疫に関与する炎症性サイトカインの発現を増加させるだけでなく、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増やすという、予想外の特性を示した。したがって、ＰＥＧ−ＩＬ−１０による治療は、腫瘍治療に大きな前進をもたらすはずである。

ＩＩＩ．ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）
ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、治療用タンパク質製品の調製において使用されている、化学部分である。「ペグ化する」という動詞は、少なくとも一つのＰＥＧ分子を別の分子、例えば治療用タンパク質に付着させることを意味する。例えば、アデノシンデアミナーゼのペグ化製剤であるＡｄａｇｅｎは、重症複合免疫不全症の治療に承認されており；ペグ化スーパーオキシドジスムターゼは、頭部外傷の治療の臨床試験がなされおり；ペグ化アルファインターフェロンは、肝炎治療のための第一相臨床試験でテストされており；ペグ化グルコセレブロシダーゼおよびペグ化ヘモグロビンは、前臨床試験が報告されている。ポリエチレングリコールの付着が、タンパク質分解から保護することが示されている（例えば、Ｓａｄａ等（１９９１）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７１：１３７−１３９を参照）。

もっとも一般的な形においては、ＰＥＧは、ヒドロキシル基で終了し、以下の一般的構造を有する線状または分枝ポリエーテルである：
ＨＯ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ
ＰＥＧを分子（ポリペプチド類、多糖類、ポリヌクレオチド類、および小有機分子）に連結するためには、一方または両方の末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を調製することにより、ＰＥＧを活性化することが必要である。タンパク質のＰＥＧ結合の最も一般的な経路は、リジンおよびＮ末端アミノ酸基との反応に適する官能基により、ＰＥＧを活性化することである。特に、ポリペプチド類へのＰＥＧの結合に関するもっとも一般的な反応基は、リジンのアルファまたはイプシロンアミノ基である。

ペグ化リンカーとタンパク質の反応により、主に以下の部位における、ＰＥＧ部分の付着が生じる：タンパク質のＮ末端のアルファアミノ基、リジン残基の側鎖上のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基。ほとんどの組換え型タンパク質は、単一のアルファおよび多数のイプシロンアミノおよびイミダズロー（ｉｍｉｄａｚｌｏｅ）基を有するため、リンカー化学に応じて多数の位置異性体が生成されうる。

広く使用される二つの第一世代活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、リジン残基と優先的に反応してカルバメート結合を形成するが、ヒスチジンおよびチロシン残基と反応することも知られている、スクシンイムジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｄｙｌ）カルボナートＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ；例えばＺａｌｉｐｓｋｙ等（１９９２）Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：１００−１１４；およびＭｉｒｏｎおよびＷｉｌｃｈｅｃｋ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：５６８−５６９を参照）およびベンゾトリアゾールカルボネートＰＥＧ（ＢＴＣ−ＰＥＧ；例えばＤｏｌｅｎｃｅ等、米国特許第５，６５０，２３４号を参照）であった。ＩＦＮα上のヒスチジン残基に対する結合は、加水分解的に不安定なイミダゾールカルバメート結合であることが示されている（例えばＬｅｅおよびＭｃＮｅｍａｒ、米国特許第５，９８５，２６３号を参照）。

第二世代ＰＥＧ化技術は、これらの不安定結合のみならず、残基反応性における選択性の欠如を回避するように設計されている。ＰＥＧ−アルデヒドリンカーの使用は、還元的アミノ化によりポリペプチドのＮ末端上の単一部位を標的とする。様々なタイプのリンカーおよびｐＨを用いてＩＬ−１０がペグ化されることにより、様々な形のペグ化分子に到達しうる（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号、５，６４３，５７５号、５，９１９，４５５号、５，９３２，４６２号、５，９８５，２６３号、７，０５２，６８６号を参照）。

ＩＶ． ＰＥＧ−ＩＬ−１０の生物活性
ヒトＩＬ−１０は、免疫正常マウスに投与されると、中和抗体の迅速な発生を誘導する。この種の中和を回避するために、Ｂ細胞欠損マウス、すなわち抗体反応を高められないマウスに、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０の皮下投与が行われた。これらの免疫不全マウスにおける安定した同系腫瘍は、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０により増殖が有意に遅延するか、完全に拒絶された。腫瘍成長制限または阻害は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ−細胞の両方に依存した。ＣＤ８細胞が枯渇すると、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０の阻害作用は完全に抑制された。したがって、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０は、ＣＤ８媒介性の細胞障害反応を誘導する。

腫瘍組織のさらなる分析により、ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、非ペグ化ＩＬ−１０を上回るレベルで、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させることが示された。浸潤ＣＤ８細胞による炎症性サイトカイン発現のレベルも、非ペグ化ＩＬ−１０治療と比較して、ＰＥＧ−ＩＬ−１０治療で高かった。ＰＥＧ−ＩＬ−１０による腫瘍患者の治療は、有意な抗腫瘍反応を誘導し、有意な治療効果をもたらすはずである。

本発明において使用されるＩＬ−１０タンパク質は、成熟ＩＬ−１０タンパク質の配列、すなわちあらゆるリーダー配列を欠く配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、および最も好ましくは少なくとも９０％以上、例えば少なくとも９５％の相同性を有することが観察されるアミノ酸配列を含む。例えば、米国特許第６，２１７，８５７号を参照。アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、残基のマッチを最適化することにより、および必要に応じて、必要なギャップを導入することにより決定される。相同のアミノ酸配列は、各々の配列における自然の対立遺伝子変異、多型変異および、種間変異を含むことが、通常意図される。典型的な相同タンパク質またはペプチドは、ＩＬ−１０ポリペプチドのアミノ酸配列と、２５〜１００％の相同性（ギャップが導入されうる場合）から、５０〜１００％の相同性（保存的置換が含まれる場合）までを有する。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｓａｎｋｏｆｆ等、Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｓ，ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，１９８３，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｍａｓｓ．；およびＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，カリフォルニア州マウンテンビュウ、およびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン州マディソンからのソフトウェアパッケージを参照。

ＰＥＧ−ＩＬ−１０結合体におけるＩＬ−１０部分は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化変異タンパク質またはＢＣＲＦ１（エプスタインバーウイルスｖｉｒａｌ ＩＬ−１０）タンパク質を含む他のアナログにより修飾されうる。ＩＬ−１０をコードする配列の修飾は、様々な技術、例えば部位特異的変異誘発等を用いて行われ［Ｇｉｌｌｍａｎ等、Ｇｅｎｅ ８：８１−９７（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４（１９８７）］、ＩＬ−１０活性の適切なアッセイにおける通常のスクリーニングにより、評価されうる。修飾ＩＬ−１０タンパク質、例えば変異体は、一次構造レベルで天然の配列から異なりうる。このような修飾は、アミノ酸挿入、置換、欠失および融合により行われうる。ＩＬ−１０変異体は、血中半減期の増加、ＩＬ−１０に対する免疫反応の減少、精製または調製の促進、ＩＬ−１０の単量体サブユニットへの転換の減少、治療効力の改善、治療での使用の間の副作用の重症度または発生の減少を含む、様々な目的を念頭に調製されうる。アミノ酸配列変異体は通常、自然に見られない所定の変異体であるが、その他は翻訳後変異体、例えばグリコシル化変異体でありうる。ＩＬ−１０の任意の変異体が、ＩＬ−１０活性の適切なレベルを保持することを条件として、本発明で使用されうる。腫瘍の場合には、適切なＩＬ−１０活性は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍部位を浸潤し、これらの浸潤細胞からのＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−Ｌ等の炎症性サイトカインの発現、生体試料におけるＴＮＦαまたはＩＦＮγのレベル増加がある。

本発明で使用されるＩＬ−１０は、哺乳類、例えばヒトまたはマウスに由来しうる。ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）は、ＩＬ−１０治療を必要とするヒトの治療に好ましい。本発明で使用されるＩＬ−１０は、組換えＩＬ−１０であるのが好ましい。ヒトおよびマウスＩＬ−１０の調製を説明する方法は、米国特許第５，２３１，０１２号明細書に見られる。ヒトおよびマウスＩＬ−１０の、天然または保存的に置換された変異体も含まれる。本発明の別の実施形態においては、ＩＬ−１０は、ウイルス起源でありうる。エプスタインバーウイルスからのｖｉｒａｌ ＩＬ−１０（ＢＣＲＦ１タンパク質）のクローニングおよび発現が、Ｍｏｏｒｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１２３０（１９９０）に開示される。

ＩＬ−１０は、例えば、タンパク質（例えばＴ細胞）を分泌可能な活性化細胞の培地からの単離および精製、化学的合成、または組換え技術など、当技術分野で周知の標準的な技術を使用した多数の方法で得られる（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４１−４７（１９８６）；Ａｔｈｅｒｔｏｎ等、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９８９，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；組換えおよび他の合成技術を含む、ＩＬ−１０活性を有するタンパク質産生のための方法を教示する米国特許第５，２３１，０１２号を参照）。ＩＬ−１０タンパク質は、組換え技術を用いて、ＩＬ−１０ポリペプチドをコードする核酸から得られるのが好ましい。組換え型ヒトＩＬ−１０は、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ロッキーヒル等から市販もされている。

ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、当該分野において周知の技術を使用して作製されうる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、例えばＬｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．等（１９８８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、第１巻、ｐｐ．１０５−１２５に説明されるように合成されうる。上述のように、リンカーを用いることによりＰＥＧがＩＬ−１０に結合されうる。ある実施形態では、本発明で使用されるＰＥＧ−ＩＬ−１０は、１〜９のＰＥＧ分子がリンカーを介してＩＬ−１０二量体の一つのサブユニットのＮ末端のアミノ酸残基のアルファアミノ基に共有結合する、モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０である。

ＩＶ．治療組成物、方法。

ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、治療有効量のＩＬ−１０と薬学的な担体とを含む医薬品組成物に製剤されうる。「治療有効量」は、所望の治療結果を提供するのに十分な量である。このような量は、負の副作用が最小限であることが好ましい。ＩＬ−１０により治療可能な状態を治療するために投与されるＰＥＧ−ＩＬ−１０の量は、複合タンパク質のＩＬ−１０活性に基づき、それは従来技術において公知のＩＬ−１０活性アッセイで決定されうる。このような治療を必要とする特定の患者に対する治療有効量は、治療される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、副作用の重症度等の様々な要因を考慮することにより決定されうる。腫瘍の場合には、適切なＩＬ−１０活性は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍部位を浸潤し、これらの浸潤細胞からのＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−Ｌ等の炎症性サイトカインの発現、生体試料におけるＴＮＦαまたはＩＦＮγのレベルの増加である。

ペグ化ＩＬ−１０の治療有効量は、１日につき体重１ｋｇあたり約０．０１〜約１００μｇのタンパク質の範囲でありうる。ペグ化ＩＬ−１０の量は、１日につき体重１ｋｇあたり約０．１〜２０μｇのタンパク質であるのが好ましく、１日につき体重１ｋｇあたり約０．５〜１０μｇのタンパク質であるのがより好ましく、１日につき体重１ｋｇあたり約１〜４μｇのタンパク質の範囲であるのが最も好ましい。本発明のＰＥＧ−ＩＬ−１０を使用すると、この結合形態はＩＬ−１０より作用が長いため、より頻度の低い投与計画が用いられうる。ペグ化ＩＬ−１０は、精製された形で調製され、凝集物および他のタンパク質を実質的に含まない。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、１日につき約５０〜８００μｇの範囲の量のタンパク質（すなわち、１日のＰＥＧ−ＩＬ−１０につき体重１ｋｇあたり約１〜１６μｇのタンパク質）が送達されるように、持続注入により投与されるのが好ましい。毎日の注入速度は、副作用および血球数のモニタリングに基づいて変更されうる。

モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０を含む薬学的組成物を調製するために、治療有効量のＰＥＧ−ＩＬ−１０が、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と混合される。担体または賦形剤は、不活性であるのが好ましい。薬学的な担体は、本発明のＩＬ−１０組成物を患者に送達するために適切な、任意の適合性のある無毒性物質でありうる。好適な担体の例には、通常の生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液が含まれる。不揮発性油およびオレイン酸エチル等の、非水性担体が使用されてもよい。好ましい担体は、５％デキストロース／生理食塩水である。担体は、等張性および化学的安定性を増強する物質等の少量の添加物、例えば緩衝剤および保存剤を含みうる。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン（１９８４）を参照。例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液等の形で、生理的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより、治療および診断用薬剤の製剤が調製されうる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ等（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州ニューヨーク；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク；Ａｖｉｓ等（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ニューヨーク；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ等（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ等（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ニューヨーク；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ＴｏｘｉｃｉｔｙおよびＳａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨークを参照）。

本発明の組成物は、経口投与され、または体内に注射されうる。経口的使用のための製剤は、胃腸管内のプロテアーゼからＩＬ−１０をさらに保護するための、化合物も含みうる。注射は、通常筋肉内、皮下、皮内、または静脈内である。あるいは、関節内注射または他の経路が、適切な状況において使用されうる。

非経口的に投与される場合には、ペグ化ＩＬ−１０は、薬学的な担体とともに、単位用量の注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルション）に製剤されるのが好ましい。例えば、Ａｖｉｓ等編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，ニューヨーク（１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ等編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，ニューヨーク（１９９０）；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎ等編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，ニューヨーク（１９９０）を参照。あるいは、本発明の組成物は、例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ等．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６，（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ，編、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号；３，２７０，９６０号等のような移植可能または注射可能な薬物送達システムによって、患者の体に導入されうる。ペグ化ＩＬ−１０は、例えば様々な添加剤および／または希釈剤を伴うか伴わない水、生理食塩水または緩衝化ビヒクル等の水性ビヒクルで投与されうる。

特定の患者に対する有効量は、治療される状態、患者の全体的な健康、投与の方法経路および用量、および副作用の重症度等の要因によって変化し得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ等（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，フロリダ州ボカラトン；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，ロンドン、ＵＫを参照）。

典型的な獣医学的対象、実験対象、または研究対象には、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウマ、およびヒトが含まれる。

適切な用量の決定は、例えば、従来技術において治療に影響すると公知または考えられる、または治療に影響すると予測されるパラメータまたは要因を用いて、臨床医により行われる。一般に用量は、適量よりやや少ない量で開始し、任意の負の副作用に対して所望または最適な効果が達成されるまで少しずつ増加させていく。重要な診断尺度には、例えば、炎症または生成される炎症性サイトカインのレベルの症状の尺度が含まれる。使用される生物学製剤は、治療標的とされる動物と同じ種から得られ、これにより試薬に対する液性応答反応が最小限にされることが好ましい。共投与の方法または第二治療剤、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線による治療の方法は、公知技術である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ等（編）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ニューヨーク州ニューヨーク；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ペンシルベニア州フィラデルフィア；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ペンシルベニア州フィラデルフィアを参照）。有効な量の治療剤は、症状、例えば腫瘍サイズまたは腫瘍成長の阻害を、典型的に少なくとも１０％；通常は少なくとも２０％；好ましくは少なくとも約３０％；より好ましくは少なくとも４０％、および最も好ましくは少なくとも５０％減少させる。

ＶＩ．使用
本発明は、増殖状態または疾患、例えば子宮、頸部、乳房、前立腺、精巣、陰茎、胃腸管、例えば食道、口腔咽頭部、胃、小腸または大腸、結腸、または直腸、腎臓、腎臓細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭部または頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、例えば神経膠腫、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）、および免疫系、例えば脾臓または胸腺の癌を治療する方法を提供する。本発明は、例えば免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠中腫瘍、ウイルス誘導性癌、例えば上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌、乳頭しゅウイルス、腺癌、リンパ腫、癌腫、黒色腫、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形癌、化学的に誘導された癌、転移、および血管形成を治療する方法を提供する。本発明は、例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはＣＤ８ Ｔ細胞の活性を調節することにより、腫瘍細胞または癌細胞抗原に対する寛容を抑制することも意図する（例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔ等（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：３１８０−３１８７；Ｓａｗａｙａ等（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：１５０１−１５０９；Ｆａｒｒａｒ等（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８４２−２８４９；Ｌｅ等（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：６７６５−６７７２；ＣａｎｎｉｓｔｒａおよびＮｉｌｏｆｆ（１９９６）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１０３０−１０３８；Ｏｓｂｏｒｎｅ（１９９８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１６０９−１６１８；ＬｙｎｃｈおよびＣｈａｐｅｌｌｅ（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：９１９−９３２；ＥｎｚｉｎｇｅｒおよびＭａｙｅｒ（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：２２４１−２２５２；Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅ等（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：１８９０−１９００；Ｉｚｂｉｃｋｉ等（１９９７）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１１８８−１１９４；Ｈｏｌｌａｎｄ等（編）（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，第４版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴを参照）。

いくつかの実施形態においては、本発明は、ＰＥＧ−ＩＬ−１０および少なくとも一つの追加的な治療または診断用薬剤により、増殖状態、癌、腫瘍、または異形成等の前癌状態を治療する方法を提供する。追加的な治療用薬剤は、例えば、ＩＬ−１２、インターフェロンアルファ、または抗表皮成長因子レセプター等のサイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、ドキソルビシン、エピルビシン、抗葉酸剤、例えばメトトレキセートまたはフルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）、イリノテカン、シクロホスファミド、放射線療法、ホルモンまたは抗ホルモン療法、例えばアンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、フルタミド、またはジエチルスチルベストロール、手術、タモキシフェン、イフォスファミド、ミトラクトール、アルキル化剤、例えばメルファランまたはシスプラチン、エトポシド、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、グルココルチコイド、ヒスタミンレセプターアンタゴニスト、血管形成阻害剤、放射線、放射線増感剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、細胞周期阻害剤、例えばサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、別の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体および毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞、例えば樹状細胞療法でありうる。ワクチンは、例えば可溶タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸として、提供されうる（例えば、Ｌｅ等、上記；ＧｒｅｃｏおよびＺｅｌｌｅｆｓｋｙ（編）（２０００）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；ＳｈａｐｉｒｏおよびＲｅｃｈｔ（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１９９７−２００８；Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ（１９９８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：９７４−９８４；Ｃａｔａｌｏｎａ（１９９４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：９９６−１００４；ＮａｙｌｏｒおよびＨａｄｄｅｎ（２００３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：１２０５−１２１５；Ｔｈｅ Ｉｎｔ．Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｉａｌ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ（２００４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：３５１−３６０；Ｓｌａｍｏｎ等（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｋｕｄｅｌｋａ等（１９９８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：９９１−９９２；ｖａｎ Ｎｅｔｔｅｎ等（１９９６）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：９２０−９２１）。

癌の骨髄外造血（ＥＭＨ）を治療する方法も、提供される。ＥＭＨが記載される（例えば、Ｒａｏ等（２００３）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ４４：７１５−７１８；Ｌａｎｅ等（２００２）Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２９：６０８−６１２を参照）。

本発明の広い範囲は、本発明を特定の実施例に制限するものではない以下の実施例に関連して、最もよく理解される。

本明細書における全ての引用文献は、各々の刊行物または特許出願が特に個々に参照により本明細書に組み込まれるものと示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

当業者には当然のことながら、本発明の多くの修正変更が、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われうる。本明細書に説明される特定の実施形態は、単なる例として提供されるものであり、本発明は、添付の請求の範囲中の用語、ならびにかかる請求の範囲が与えられた等価物の完全な範囲により制限されるものである。本発明は、本明細書に例として示された特定の実施形態により制限されるものではない。

Ｉ． 一般的方法
分子生物学の標準的方法が記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２１７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）。Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１−４巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク州ニューヨークにも標準的方法がみられ、ここでは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（第１巻）、哺乳類細胞および酵母のクローニング（第２巻）、複合多糖およびタンパク質発現（第３巻）、および生物情報科学（第４巻）を説明する。

免疫沈降、クロマトグラフィ、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含む、タンパク質精製の方法が記載される（Ｃｏｌｉｇａｎ等（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載される（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ等（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク、ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ミズーリ州セントルイス；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載される（Ｃｏｌｉｇａｎ等（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，上記）。リガンド／レセプター相互作用を特徴付けするための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ等（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ニューヨークを参照）。ＰＥＧ−ＩＬ−１０をつくる方法が、例えば米国特許第７，０５２，６８６号に記載される。

蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリの方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓ等（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニュージャージー州ホーボーケン；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第２版；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ニュージャージー州ホーボーケン；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニュージャージー州ホーボーケンを参照）。例えば診断試薬として使用するための、核酸プライマおよびプローブを含む核酸を修飾するための適切な蛍光試薬、ポリペプチド、および抗体が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，オレゴン州ユージーン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，ミズーリ州セントルイス）。

免疫系の標準的な組織学的方法が説明される（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ニューヨーク州ニューヨーク；Ｈｉａｔｔ等（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア；Ｌｏｕｉｓ等（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：ＴｅｘｔおよびＡｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ニューヨーク州ニューヨークを参照）。

癌の治療および診断の方法が記載される（例えば、Ａｌｉｓｏｎ（編）（２００１）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｇｒｏｖｅ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ミズーリ州セントルイス；Ｏｌｄｈａｍ（編）（１９９８）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，第３版，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．，マサチューセッツ州ヒンガム；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（編）（２００１）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ，Ｌｔｄ．，ロンドン、ＵＫ；Ｄｅｖｉｔａ等（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第６版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ペンシルベニア州フィラデルフィア；Ｈｏｌｌａｎｄ等（編）（２０００）Ｈｏｌｌａｎｄ−Ｆｒｅｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＢＣ Ｄｅｃｋｅｒ，ペンシルベニア州フィラデルフィア；ＧａｒｒｅｔｔおよびＳｅｌｌ（編）（１９９５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州トトワ；ＭａｃＫｉｅ（１９９６）Ｓｋｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，第２版，モスビー、セントルイス；Ｍｏｅｒｔｅｌ（１９９４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１１３６−１１４２；Ｅｎｇｌｅｍａｎ（２００３）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０（３ Ｓｕｐｐｌ．８）：２３−２９；Ｍｏｈｒ等（２００３）Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ２６：２２７−２３３を参照）。

例えば抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質の折畳み、機能的ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，メリーランド州ベテスダ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，ネバダ州クリスタルベイ）；Ｍｅｎｎｅ等（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅ等（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎ等（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照）。

ＩＩ． ペグ化ＩＬ−１０
ＩＬ−１０を、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌに対し透析した。透析したＩＬ−１０を、透析緩衝液を用いて３．２倍に希釈し、４ｍｇ／ｍＬの濃度にした。リンカー（ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，イリノイ州メイウッド））の添加の前に、、１容積のｐＨ９．１の１００ｍＭのテトラホウ酸Ｎａを、９容積の希釈ＩＬ−１０に加え、ＩＬ−１０溶液のｐＨを８．６に上昇させた。ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを、透析緩衝液に溶解し、適切な容積のリンカー溶液（１モルのＩＬ−１０につき１．８〜３．６モルのリンカー）を、ペグ化反応を開始するために希釈ＩＬ−１０溶液に加えた。反応の速度（ｒｅａｔｅ）を制御するために、反応を５℃で行った。反応溶液を、ペグ化反応の間に穏やかに攪拌した。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定されるところのモノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０収率が、４０％に近くなったときに、３０ｍＭの最終濃度まで１Ｍグリシン溶液を加えることにより、反応を停止させた。反応溶液のｐＨを、ＨＣｌ溶液を用いて７．０にゆっくり調節し、反応物を０．２ミクロンでろ過し、−８０℃で貯蔵した。

あるいは、モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０を、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）をリンカーとして使用して調製する（Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，アラバマ州ハンツヴィル）。ＰＡＬＤ−ＰＥＧは、５ＫＤａ、１２ＫＤａ、または２０ＫＤａの分子量を有しうる。ＩＬ−１０を、上記の通りに透析および希釈するが、反応緩衝液のｐＨは、６．３〜７．５の間である。活性化されたＰＡＬＤ−ＰＥＧリンカーを、１：１のモル比で反応緩衝液に加える。水性シアノホウ水素化ナトリウムを、反応混合物に０．５〜０．７５ｍＭの最終濃度まで加える。穏やかな撹拌を伴って１５〜２０時間室温（１８〜２５℃）で反応を行う。反応物を、１Ｍグリシンによりクエンチする。収率が、ＳＥ−ＨＰＬＣにより分析される。モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、ゲル濾過クロマトグラフィにより、未反応のＩＬ−１０、ＰＥＧリンカー、およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０から分離され、ｒｐ−ＨＰＬＣおよびバイオアッセイ（例えば、ＩＬ−１０反応性細胞または細胞株の刺激）により特徴づけされる。

ＩＩＩ． 腫瘍モデル：
同系マウス腫瘍細胞を、腫瘍接種あたり１０^４、１０^５または１０^６細胞で、皮下または皮内注射した。Ｅｐ２乳癌（ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＣＴ２６結腸癌、皮膚のＰＤＶ６扁平上皮癌および４Ｔ１乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）モデルを用いた（例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ等（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４２：４６１−４６５を参照）。免疫正常Ｂａｌｂ／ＣマウスまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いた。ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０を免疫正常マウスに投与し、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０治療を、Ｂ細胞欠損マウスに用いた。治療開始前に、腫瘍を１００〜２５０ｍｍ^３のサイズにした。ＩＬ−１０、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０、または緩衝液コントロールを、腫瘍移植から離れた部位で皮下投与した。電子キャリパーを使用して、典型的に毎週二回、腫瘍成長がモニタされた。

ＩＶ． 腫瘍分析：
多数の炎症性マーカーのｍＲＮＡ発現を測定し、いくつかの炎症細胞マーカーの免疫組織化学法を行うために、腫瘍組織およびリンパ器官を様々なエンドポイントで採取した。組織を、液体窒素中で急冷凍し、−８０℃で貯蔵した。電子キャリパーを使用して、典型的に毎週二回、原発腫瘍成長をモニタした。腫瘍容積を、長さを長いほうの寸法とする式（幅^２×長さ／２）を使用して計算した。治療開始前に、腫瘍を９０〜２５０ｍｍ^３のサイズにした。

Ｖ． ＩＬ−１０および／またはＰＥＧ−ＩＬ−１０の投与
ｍＩＬ−１０またはＰＥＧ−ｍＩＬ−１０を、免疫正常マウスに投与し、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０治療を、Ｂ細胞欠損マウスに使用した。ｍＩＬ−１０、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０、またはビヒクルコントロールを、腫瘍移植から離れた部位に皮下投与した。これらの研究において使用されるＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーにより調製された。ｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０の生物活性を、内因性ｍＩＬ−１０レセプター（Ｒ１およびＲ２）を発現するマウスマスト細胞株ＭＣ／９を利用した、短期増殖バイオアッセイを適用することにより評価した。ＭＣ／９細胞は、ｍＩＬ−４およびｍＩＬ−１０による同時刺激に応答して増殖する（ＭＣ／９は、ｍＩＬ−４またはｍＩＬ−１０だけでは増殖しない）。代謝活性の検出に基づく増殖指示色素Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いた比色手段を用いて、増殖を測定した。組換えまたはペグ化ｍＩＬ−１０の生物活性を、ＥＣ５０値、または用量反応曲線で最大値の半分の刺激が観察されるタンパク質濃度により評価した（表１）。

表１：これらの研究において使用されるｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ１０試薬の生理活性の評価のためのＭＣ／９増殖バイオアッセイ

ＭＣ／９バイオアッセイにもとづいて、実験で使用されるペグ化ｍＩＬ−１０の比活性は、使用したｍＩＬ−１０の活性の約７分の１である（表１）。

ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０を、１日おきに、Ｅｐ２乳癌腫瘍をもつマウスに投与した。治療は、腫瘍のサイズを減少させ、腫瘍拒絶を誘導する効果があった。

表２：ＰＥＧｍＩＬ−１０はＢａｌｂ／ＣマウスのＥｐ２乳癌モデルにおいて腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を減少させる。

ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０による治療も、ＰＤＶ６、ＣＴ−２６、および４Ｔ１の同系免疫正常マウス腫瘍モデルにおいて、腫瘍サイズを減少させる効果があった（表３、４、および５を参照）。

表３：研究０４−Ｍ５２ ３３８：移植後３６日に開始するＰＥＧｍＩＬ−１０は、Ｃ５７Ｂ／６マウスにおけるＰＤＶ６腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を減少させる。

表４：移植後７日に開始するＰＥＧｍＩＬ−１０は、ビヒクルコントロールに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６腫瘍の腫瘍サイズを減少させる（ｍｍ^３）。

表５：ＩＬ−１０およびＰＥＧｍＩＬ−１０は、４Ｔ１乳癌の腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を減少させる。

表６：研究０５−Ｍ５２−４９６。移植後１９日に開始するｍＩＬ−１０およびｍＰＥＧ ＩＬ−１０による２週間の治療は、４Ｔ１乳癌の腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を減少させる。

ＶＩ． 用量漸増研究
用量漸増においては、研究用尾静脈血液を、予想ピークおよびトラフ用量レベルに対応する時間に、各群の代表マウスから集めた。マルチアレイ技術；電気化学ルミネセンス検出およびパターン化アレイの組み合わせに基づくＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームを用いて、採取された血清のｍＩＬ−１０濃度をアッセイした。両側不対スチューデントｔ検定を用いて、血清ｍＩＬ−１０濃度によって分類されたｍＩＬ−１０またはＰＥＧ−ｍＩＬ−１０で治療されたマウスの平均腫瘍容積を、それらの対応するビヒクルコントロールの平均腫瘍容積と比較した。二つの群が不等分散を有する場合（Ｆ検定よりｐ＜０．０５）には、Ｗｅｌｃｈ補正を用いた。

４Ｔ１乳癌をもつマウスにおける、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０およびｍＩＬ−１０の用量漸増は、原発腫瘍および肺転位の制御については、ｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０の両方が用量滴定可能（ｄｏｓｅ ｔｉｔｒａｔａｂｌｅ）であることを示す。任意の所与の用量において、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、ｍＩＬ−１０より有効である（表７）。毎日二回の治療を、平均腫瘍容積が８４〜９０ｍｍ^３となった移植後１７日目に開始した。治療群は、群あたり１４匹のマウスをからなり、コントロール群は、各群に８匹のマウスを含んだ。ＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓ緩衝液は、それぞれｍＩＬ−１０およびＰＥＧｍＩＬ−１０のコントロールであった。

表７：研究０６−Ｍ１７５−１１０３。ｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１乳癌の原発腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を、用量依存的様式で減少させる。

ＰＤＶ６扁平上皮癌をもつマウスにおけるＰＥＧ−ｍＩＬ−１０およびｍＩＬ−１０の用量漸増は、原発腫瘍の制御については、ｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０の両方が用量滴定可能であるが、任意の所与の用量において、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０のほうがｍＩＬ−１０より有効であることを示す（表８）。高用量ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０治療により、１００％に近い腫瘍退縮および再度の投与（ｒｅ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対するその後の抵抗が生じた（表９）。毎日二回の治療を、平均腫瘍容積が１０７〜１０９ｍｍ^３となった移植後２３日目に開始し、全てのｍＩＬ１０治療群および０．０１ｍｇ／ｋｇ ＰＥＧｍＩＬ−１０治療群に対して５５日目まで続けた。０．１ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−ｍＩＬ−１０治療は、１００％の腫瘍退縮が認められた４８日目に止められ、残りの群は５１日目まで治療された。治療群には、群あたり１０匹のマウスからなり、各ビヒクルコントロールには６匹のマウスが含まれた。Ｔｒｉｓ緩衝液およびＨｅｐｅｓ緩衝液が、それぞれｍＩＬ−１０およびＰＥＧｍＩＬ−１０のビヒクルコントロールであった。最初の移植の８５日後および最後のＰＥＧ−ｍＩＬ１０治療の４週間後に、再移植が行われた。群につき１０匹のマウスが含まれた。

表８：研究０６−Ｍ５２−１１０６。ｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、Ｃ５７Ｂ１６／ＪマウスにおけるＰＤＶ６扁平上皮癌の腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を用量依存的様式で減少させる。

表９：研究０６−Ｍ５２−１１０６。３週間のＰＥＧ−ｍＩＬ−１０治療後にＰＤＶ６扁平上皮癌腫瘍が除去されたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、追加的治療の非存在下で再移植に抵抗性である。

ＶＩＩ． 肺転位研究
４Ｔ１乳癌モデルにおける肺転位を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｅｃｔｉｏｎ ２０．２．４）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）に記載されるように、肺切除後に巨視的にか（表１０）、または培養後に肺転移コロニーを計数することのいずれかによって（表１１）定量化した。簡潔にいうと、４Ｔ１腫瘍マウスから採取された肺を刻み、コラゲナーゼ／エラスターゼカクテルにより消化した後、限界希釈アッセイにおいて６−チオグアニンを含む培地で培養された。４Ｔ１細胞だけを、６−チオグアニン耐性があり、培養の１０〜１４日後にコロニー数を計数することにより定量化することができる。毎日二回の治療が、平均腫瘍体積が８４〜９０ｍｍ^３となった移植後１７日目に開始された。ＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓ緩衝液を、それぞれｍＩＬ−１０およびＰＥＧ ｍＩＬ−１０のコントロールとした。肺転位が、肺あたりに培養された転移コロニー数として測定された。

表１０：研究０５−Ｍ５２−４９６。移植１９日後に開始するｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０による２週間の治療は、４Ｔ１乳癌の転移を減らす（マウスあたりの肺転位数として測定）

表１１：研究０６−Ｍ１７５−１１０３。ｍＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１乳癌の肺転位を用量依存的様式で減少させる。

４Ｔ１乳癌マウスに対するＰＥＧ−ｍＩＬ−１０またはＩＬ−１０の投与は、転移率を減少させ、ＣＤ８Ｔ細胞浸潤および免疫刺激性のサイトカインの発現を増加させることが、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定される（表１２および１３）。浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、免疫組織化学によりＣＤ８表面マーカーを染色した腫瘍の代表的な切片から計数され、抗−ＣＤ３および抗−ＴＣＲαβ抗体で染色することにより実証された。

表１２：ＩＬ−１０およびＰＥＧ ｍＩＬ−１０は、４Ｔ１癌腫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を誘導する

ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、炎症性サイトカインの誘導においてＩＬ−１０より有効である。均質化腫瘍サンプルからの全ＲＮＡを抽出し、以前に説明されるように逆転写した（例えば、Ｈｏｍｅｙ等（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３４６５−３４７０を参照）。蛍光発生（ｆｌｕｏｒｇｅｎｉｃ）５’−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイにより、サイトカイン発現につき、相補ＤＮＡを定量分析した（例えば、Ｈｏｌｌａｎｄ等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７２７６−７２８０を参照）。特異的ＰＣＲ産物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、４０サイクルの間持続的に測定した。値を、ユビキチンに正規化した。対数変換されたデータを、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ統計分析に供した（メジアン法）。発現レベル（対数変換）が高いほど、腫瘍サンプルに発現される炎症性サイトカインの量が多いように、発現レベル（対数変換）が、腫瘍サンプルに発現される炎症性サイトカインの量に対応する。

表１３：投与されたＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、用量投与の２４ｈ後の４Ｔ１癌腫における炎症性サイトカインのレベルの持続を誘導する。

Ｖ． 免疫細胞の枯渇
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗体を介した除去により枯渇させた。２５０ｕｇのＣＤ４またはＣＤ８特異的抗体を、この目的で毎週注射した。ＦＡＣＳおよびＩＨＣ分析を用いて、細胞枯渇を実証した。

ＣＤ４抗体によるＢ細胞欠損ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ．１２９−Ｉｇｈ−６^{ｔｍ１Ｃｇｎ}）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇により、腫瘍に対するＰＥＧ−ｈＩＬ−１０機能が阻害される（表１４）。

表１４：腫瘍移植８日後に開始するＰＥＧ−ｈＩＬ−１０治療は、Ｂ細胞欠損ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ．１２９−Ｉｇｈ−６^{ｔｍ１Ｃｇｎ}）において、ＣＤ４枯渇後にＣＴ−２６結腸癌の腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を減少できない。

ＣＤ８Ｔ細胞の枯渇は、同系腫瘍に対するＰＥＧ ｍＩＬ−１０の効果を完全に阻害する（表１５）。

表１５：腫瘍移植後８日に開始するＰＥＧ−ｈＩＬ−１０治療は、Ｂ細胞欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＣＤ８枯渇後にＣＴ−２６結腸癌の腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を減少できない。

ＶＩ． 併用療法
ＰＥＧ−ＩＬ−１０を、公知の化学療法剤と組み合わせて投与する。化学療法剤は、ＰＥＧ−ＩＬ−１０投与の前、同時、またはその後に投与され得る。化学療法剤および用量範囲の例が、表１６に提供される。

表１６：化学療法剤の用量範囲

ＰＥＧ−ＩＬ−１０の併用投与により、より低く、毒性が少ない化学療法剤の用量を用いることが可能になるため、公知の副作用を回避しうる。

本明細書の全ての引用文献は、個々の刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み込まれるものと特に個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

当業者には当然のことながら、本発明の多くの修正変更が、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われうる。本明細書に説明される特定の実施形態は、単なる例として提供されるものであり、本発明は、添付の請求の範囲中の用語、ならびにかかる請求の範囲が与えられた等価物の完全な範囲により制限されるものである。本発明は、本明細書に例として示された特定の実施形態により制限されるものではない。

Claims (9)

1. 腫瘍または癌の増殖を阻害または減少するための組成物であって、有効な量のペグ化インターロイキン１０（ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を含み、ここで、前記腫瘍または癌が固形である組成物。
2. 前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）リンカーを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 少なくとも一つの化学療法剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. 前記化学療法剤が、テモゾロミド、ゲムシタビン、ドキソルビシンまたはインターフェロン−αの少なくとも１つである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、ヒトＰＥＧ−ＩＬ−１０（ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０）である、請求項５に記載の組成物。
7. 前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）リンカーを含む、請求項６に記載の組成物。
8. 少なくとも一つの化学療法剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
9. 前記化学療法剤が、テモゾロミド、ゲムシタビン、ドキソルビシンまたはインターフェロン−αの少なくとも１つである、請求項８に記載の組成物。