DE4325317C2 - Verfahren zur radioaktiven Markierung von Immunglobulinen - Google Patents
Verfahren zur radioaktiven Markierung von ImmunglobulinenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von
Immunglobulinen, insbesondere von monoklonalen Antikörpern, oder
deren Fragmenten mit radioaktiven Nukliden, die in der Medizin,
vorzugsweise in der nuklearmedizinischen Diagnostik und
Therapie, und in der Biochemie einsetzbar sind.
Radioaktiv markierte Immunglobuline besitzen in der Medizin und
in der Biochemie eine wachsende Bedeutung, da sie durch die gute
Detektierbarkeit von Radionukliden und die hohe Spezifität der
Immunglobuline den Nachweis von sehr kleinen Stoffmengen, z. B.
in Radioimmunoassays oder in bildgebenden Verfahren, gestatten.
Weiterhin können sie in der nuklearmedizinischen Therapie für
innere Bestrahlungen, z. B. von Tumoren, eingesetzt werden. Für
den Erfolg der Untersuchungen ist ein Markierungsverfahren
erforderlich, das durch eine schonende Reaktion eine feste
Bindung der radioaktiven Nuklide an den Immunglobulinen
ermöglicht, ohne die Immunreaktivität der Immunglobuline zu
beeinträchtigen.
Es sind verschiedene Markierungsverfahren bekannt, die auf
Kopplungsreaktionen an funktionellen Gruppen der Peptidketten
von Immunglobulinen beruhen. Dabei erfolgt die Umsetzung z. B.
von Aminogruppen des Immunglobulines mit bifunktionellen
Substanzen. Diese Substanzen enthalten das radioaktive Nuklid
oder nehmen es, z. B. durch Komplexierung, bei späterer Zugabe
auf [1-4]. Aufgrund der weitgehend statistischen Verteilung der
Kopplungsstellen über das Immunglobulin-Molekül wird jedoch auch
in den antigenbindenden Regionen der Immunglobuline modifiziert
und dabei die Immunreaktivität verändert.
Bei Verfahren, die auf der Kopplung an Sulfid-Gruppen beruhen,
erfolgt eine Markierung außerhalb der antigenbindenden Regionen.
Für diesen Reaktionsweg müssen jedoch Disulfid-Brücken des
Immunglobulin-Moleküls durch Reduktion gespalten werden (z. B.
DE-PS 29 53 674, [5]), wodurch die Tertiärstruktur des Moleküls
verändert wird. In EP 0397213 wird z. B. die Umsetzung der dann
erhaltenen SH-Gruppen mit Maleimiden beschrieben, del Rosario et
al. [6, 7] beschreiben ein Markierungsverfahren mit Iodacetyl-
Verbindungen nach Spaltung der Disulfidbrücken mit
Dithiothreitol.
Kopplungsverfahren an den Oligosaccharidketten sind für
Markierungen gut geeignet, da bei diesen Verfahren die
Bindungsstelle Immunglobulin/Radionuklid definiert ist und
bekanntermaßen die Oligosaccharide für die Immunreaktivität des
Moleküls geringe Bedeutung besitzen. Bisher bekannte Verfahren
beruhen auf einer Oxidation des Immunglobulins, bei denen OH-
Gruppen der Oligosaccharide zu Aldehydgruppen umgesetzt werden.
Unerwünschte Nebenreaktionen aufgrund der Oxidation sind jedoch
dabei nicht auszuschließen. Van Lenten [8] beschreibt z. B. ein
allgemeines Verfahren zur Oxidation von Glykoproteinen mit
Natriumperiodat, die DE-OS 41 15 038 die Herstellung von
Konjugaten auf diesem Wege. Da Aldehyd-Gruppen in natürlichen
Immunglobulinen nicht vorkommen, lassen sich hier spezifisch
bifunktionelle Komplexbildner anlagern, z. B. Hydrazide
(EP 0247792), [9], [10].
Sialyltransferasen sind in der Lage modifizierte Sialinsäuren
auf Glykoproteine zu übertragen. Zum Studium der Aktivität
dieser Enzyme werden fluoreszeinylierte Sialinsäuren beschrieben
[11-13]. Praktische Bedeutung im Sinne einer Markierung von
Glykoproteinen haben diese Reaktionen bisher nicht erlangt.
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Aufgabe der Erfindung ist es, Immunglobulin schonend und
selektiv zu markieren.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den im Oberbegriff und
im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 genannten Merkmalen
gelöst.
Es sind verschiedene modifizierte CMP-NeuNAc-Derivate genannt,
die sich für das Verfahren eignen. Sie sind entweder bereits
radioaktiv markiert oder in der Lage, Nuklide durch
Komplexierung aufzunehmen.
Durch die Selektivität der Enzyme erfolgt die Bindung an
Oligosaccharidresten mit der Endstruktur βGal-(1-4)-βGlcNAc-,
βGal-(1-3)-βGlcNAc-, βGal-(1-3)-αGlcNAc-, βGal-(1-3)-βGalNAc-
oder αNeuNAc-(2-3)-βGal-(1-3)-αGlcNAc-, so daß eine Veränderung
der antigenbindenden Regionen ausgeschlossen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht im Gegensatz zu
herkömmlichen Verfahren die Markierung von Immunglobulinen unter
besonders schonenden Reaktionsbedingungen, da der Transfer in
wäßrigen Pufferlösungen stattfindet und der Zusatz von
schädigenden Chemikalien wie z. B. Oxidations- oder
Reduktionsmitteln vermieden wird.
Sind die erforderlichen Saccharidstrukturen im Immunglobulin
nicht oder in nicht genügender Menge enthalten, kann entweder
durch Abspaltung von endständig gebundener NeuNAc durch eine
Neuraminidase oder durch Anlagerung von Galaktose aus UDP-
Galaktose mittels Galaktosyltransferase oder durch Kombination
dieser Verfahren die Menge der für die Anlagerung der NeuNAc-
Derivate erforderlichen Saccharidstrukturen erhöht und dadurch
die Markierbarkeit des Immunglobulins verbessert werden.
Die Erfindung wird nachfolgend in mehreren Ausführungsbeispielen
näher beschrieben.
Eine Lösung von 2 µg human-Immunglobulin (IgG) in 2 µl 50 mM
Acetatpuffer pH5,5 wurde mit 0,42 Einheiten immobilisierter
Neuraminidase für 1 h versetzt. Nach 1 h erfolgte die Abtrennung
der Neuraminidase durch Zentrifugation. 1 µg CMP-9-
salizoylamido-NeuNAc wurde mit 131I unter Verwendung von Iodogen
markiert und über High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
auf einer Ionenaustauschersäule abgetrennt. 400 µl der Fraktion,
die das CMP-9-131I-monoiodsalizoylamido-NeuNAc enthält, wurden
mit 400 µl der vorbereiteten human-IgG-Lösung und mit 40 mU
α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach
verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration
unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen.
Dabei wurden nach etwa zweistündiger Reaktionszeit Ausbeuten bis
zu 56,4% für den Transfer der radioaktiven Substanz auf human-
IgG ermittelt.
Human-IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. Für die Umsetzung
mit Iodogen wurde inaktive KI-Lösung zugesetzt und das dann
entstehende CMP-9-131I-diiodsalizoylamido-NeuNAc mit HPLC wie im
Beispiel 1 abgetrennt. 100 µl der Fraktion, die das CMP-9-131I-
diiodsalizoylamido-NeuNAc enthält, wurden mit 50 µl der
vorbereiteten human-IgG-Lösung und mit 20 mU α-2,6-
Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen
Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen
und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Dabei wurden
nach etwa zweistündiger Reaktionszeit Ausbeuten bis zu 41,3%
ermittelt.
4 µg human-IgG wurden mit 0,04 mU Galaktosyltransferase und 50
µg UDP-Galaktose in 2,3 µl Phosphatpuffer pH 8.5 umgesetzt. Nach
1 h erfolgte die Abtrennung des galaktosylierten Human-IgG durch
HPLC über eine Ionenaustauschersäule mit NaCl-Gradienten. 5,4 µg
galaktosyliertes human-IgG in 10 µl reagierten mit 5 µl einer
Lösung, die CMP-9-131I-diiodsalizoylamido-NeuNAc enthielt, und
10 mU α-2,6-Sialyltransferase für 2 h. Nach einer Gelfiltration
wurde eine Markierungsausbeute von 35% ermittelt. Eine
Vergleichsmessung mit nativem human-IgG ergab keine Markierung.
Eine human-IgG-Lösung wurde erst wie in Beispiel 3 galakto
syliert und dann wie in Beispiel 1 desialyliert. Von diesem
vorbehandelten human-IgG reagierten 1,1 µg in 10 µl 50 mM
Phophatpuffer pH 7,0 mit 5 µl einer CMP-9-131I-
diiodsalizoylamido-NeuNAc-Lösung sowie mit 10 mU α-2,3-
Sialyltransferase für 2 h. Nach Auftrennung des Reaktions
gemisches ergab sich eine Markierungsausbeute von 41,4%.
Claims (3)
1. Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen oder deren
Fragmenten mit radioaktiven Nukliden, bei dem das Immunglobulin
mit Cytidin-5'-monophospho-N-Acetylneuraminsäure-Derivaten (CMP-
NeuNAc-Derivate), die an den Positionen 5 und/oder 9 der NeuNAc
modifiziert wurden, durch eine Sialyltransferase umgesetzt wird,
dadurch gekennzeichnet, daß CMP-NeuNAc-Derivate verwendet
werden, bei denen ausgehend von der Struktur
einer oder beide der natürlichen Reste
durch einen oder zwei der folgenden Reste
mit
oder
mit
oder
ersetzt wurden.
einer oder beide der natürlichen Reste
durch einen oder zwei der folgenden Reste
mit
oder
mit
oder
ersetzt wurden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Immunglobulin zuvor mit Neuraminidase versetzt und das nach der
Reaktionszeit abgetrennte Immunglobulin markiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Immunglobulin zuvor mit Uridindiphosphogalaktose und
Galaktosyltransferase versetzt und das nach der Reaktionszeit
abgetrennte Immunglobulin markiert wird.
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