DE2724762B2

DE2724762B2 - Cortisolderivate und radioimmunologisches Verfahrens

Info

Publication number: DE2724762B2
Application number: DE2724762A
Authority: DE
Inventors: Masaharu Kojima; Nobushiko Urawa Saitama Nakazawa; Hiroshi Kashiwa Chiba Ogawa; Hisao Sone; Seiji Tokio Tachibana
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Priority date: 1976-06-01
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1981-01-22
Also published as: JPS52148061A; SE430894B; JPS5835520B2; SE7706335L; DE2724762C3; US4277460A; MX4971E; US4190593A; DE2724762A1; CA1073898A; FR2364454A1; YU135277A; FR2364454B1

Description

,-OH

OCOCH₂CH₂CO-BSa

Man nimmt an, daß sich dieser Antigentyp hervorragend für die Bildung des speziellen Antikörpers eignet, da sämtliche funktioneilen Gruppen von Cortisol (die Hydroxylgruppen in 11/9,17«- und 21-Stellung sowie die Oxogruppen in 3- und 20-Stellung) unverändert blieben.

Andererseils eignet sich mit Tritium(³H) markiertes Cortisol in immunologischer Hinsicht hervorragend als Tracer für den Radioimmunoassay. Die Synthese dieses Tracers verläuft jedoch sehr kompliziert, und seine Bestimmung durch Zählung der Radioaktivität soll mit

Hilfe eines Flussigkeits-Scintillationszählers durchgeführt werden. Daher weist dieser Tracer nur eine schlechte klinische Verwendbarkeit auf.

Die Erfinder haben nun bereits vorgeschlagen, die

r—OH

HO

CH₂-

OCOCH₂CH₂CONHCHCOOCh₃

Als die Erfinder jedoch versuchten, diesen Tracer beim Radioimmunoassay einzusetzen, lieS sich die korrekte Standardkurve nicht erzielen. Aufgrund weiterer Forschungsarbeiten wurde gefunden, daß die von Cortisol verschiedene immunologische Eigenschaft des Tracers durch die Ungenauigkeit der Standardkurve verursacht wird. Durch die Immunisierung mit Cortisolfwi-O-HemisuccLnat-BSA-Konjugat werden nämlich zwei verschiedene Antikörper gebildet, d. h. ein Antikörper zum Cortisol und ein Antike per zum Cortisol-6a-0-Hemisuccinat (Antikörper zur Brücke) (die Hemisuccinyloxygruppe in den Formeln A oder B wird als »Brücke« bezeichnet). Während die Immunreaktion des Cortisols lediglich mit dem Antikörper zum Cortisol erfolgt, kann der Tracer, d. h. radiojodiertes Cortisol-6a-O-HS-TME, sowohl mit dem Antikörper zum Cortisol als auch mit dem Antikörper zur Brücke i^r> (Anti-Cortisol-eet-O-Hemisuccinat) reagieren. Die Standardkurve von Cortisol zeigt daher den Gesamtwert der Cortisolmenge und des Ausmaßes der sich ergebenden Immunreaktion zwischen dem Tracer und dem Antikörper zur Brücke an. Diese Beziehung ist aus den F i g. 2 *o und 3 ersichtlich, bezüglich welcher mit Tritium markiertes Cortisol bzw. Cortisol-6«-O-HS-TME-^I25J als Tracer verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung sind neue Cortisolderivate der allgemeinen Formel

— OH

konjugierte Verbindung von Coitisol-ÖÄ-O-Hemisuccinat mit Tyrosmmethylester (Cortisol-6«-O-HS-TME; Formel B) herzustellen und zur Bildung eines Tracers mit Radiojod zu markieren:

HO

= O

c-OH

SCH₂COR

in der R einen radiojodierten Tyrosin-nieder-alkylesterrest, radiojodierten Tyraminrest, radiojodierten Histaminrest oder radiojodierten 7-Aminoheptanoyltyrosinnieder-alkylesterrest bedeutet, sowie Verbindungen der vorstehenden Formel, in der R eine Hydroxylgruppe, einen Tyrosin-nieder-alkylesterrest, Tyraminrest, Hist aminrest, /-Aminoheptanoyltyrosin-nieder-alkylesterrest, Serumalbumin, y-GlobuIin oder ein Polypeptid bedeutet.

(B)

Die erfindungsgemäßen Cortisolderivate eignen sich als Antigene oder Tracer für den Radioimmunoassay von Cortisol.

Die folgenden Verbindungen seien insbesondere aufgeführt:

öa-Carboxymethylthiocortisol, eÄ-Carboxymethylthiocortisol-Tyrosinmethyl-

ester, radiojodiertereoc-Carboxymethylthiocortisol-

Tyrosinmethylester, radiojodiertes oa-Carboxymethylthiocortisol-

Tyramin, radiojodiertes («x-Carboxymethylthiocortisol-

Histamin, radiojodiertereat-Carboxymethylthiocortisol-

7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester, ear-Carboxymethylthiocortisol-Rinderserum-

albumin-Konjugat

Gegenstand der Erfindung ist auch ein radioimmunologisches Verfahren (Radioimmunoassay) zur Bestimmung von Cortisol unter Verwendung eines markierten Cortisols als Tracer und eines durch Immunisierung mit einem Cortisol-Träger-Konjugat erzeugten Antikörpers, wobei der Tracer und das Cortisol-Träger-Konjugat den markierten Teil bzw. Träger in 6<x-Stellung von Cortisol aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Tracer und ein Cortisol-Träger-Konjugat mit unterschiedlicher Brücke verwendet

Nach einer Ausführungsform der Erfindung besteht die Radioimmunoassay-Methode zur Bestimmung von Cortisol darin, daß man

(a) immunologisch einen Antikörper zu Cortisol erzeugt, indem man ein Cortisol-Carrier-Konjugat der Formel

55

60

-

Brücke — R

worin R ein Protein oder ein Polypeptid darstellt und die Brücke eine -S-CH^-CO- oder

- OCO - CH₂ - CH₂ - CO-Gruppe darstellt, einem Wirtsorganismus injiziert, der diesen Antikörper erzeugt,

(b) den gemäß (a) erhaltenen Antikörper und eine radioaktive Cortisol-Tracerverbindung der vorstehenden Formel, worin R einen radiojodierten Tyrosin-nieder-alkylesterrest, einen radiojodierten Tyraminrest, einen radiojodierten Histaminrest oder einen radicjodierten 7-Aminoheptanoyltyrosin-nieder-alkylrest darstellt und die Brücke für die Gruppe

-S-CH₂-CO- oder -OCO-CH₂-CH₂-CO-

steht, zu einer cortisoihaitigen Probe gibt,

(c) die gemäß (b) erhaltene Mischung inkubiert,

(d) antikörper-gebundenen Tracer von freiem Tracer abtrennt und

(e) die Radioaktivität dieser antikörper-gebundenen Tracerverbindung oder der freien Tracerverbindung mißt;

wobei die Brücke in dem Cortisol-Carrier-Konjugat verschieden ist von der Brücke in der radioaktiven Cortisol-Tracer-Verbindung.

F i g. 1 zeigt das IR-Spektrum von öac-Carboxymethylthiocortisol, während die F i g. 2 bis 8 Standardkurven des Radioimmunoassays wiedergeben.

Zur Durchführung des Radioimmunoassays von Cortisol unter Verwendung von Antigenen mit unterschiedlichem Brückenteil werden erfindungsgemäß 6«-Carboxymethylthiocortisol und dessen Derivate zur Verfügung gestellt, welche eine neue Carboxymethylthiobrücke enthalten und die nachstehende allgemeine Formel C besitzen:

,-OH

IO

15

20

25 HO

= O

,-OH

SCH₂COR

in der R eine Hydroxylgruppe, einen jodierten Tyrosin-Ci — Cs-alkylester-, jodierten Tyramin-, jodierten Histamin- oder jodierten 7-Aminoheptanoyltyrosin-Ci — Cs-alkylesterrest oder einen Träger, wie ein Protein, beispielsweise Serumalbumin, y-Globulin, oder Thyroglobulin, oder ein Polypeptid, beispielsweise Polylysin, darstellt. Geeignete Alkylreste sind beispielsweise der Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, tert-Butyl- und Pentylrest

Von diesen Verbindungen kann 6«-Carboxymethylthiocortisol (CortisoI-öa-CMT) aus einer bekannten Verbindung nach folgender Gleichung hergestellt werden:

(D

Ο—ι

SCH₂COOH

SCH₂COOCH₂CH₂Oh

(ffl)

OV)

ο—,

HO

SCH₂COOH SCH₂COOH

(V)

Vl)

Gemäß obigem Reaktionsschema wird insbesondere eine bekannte Verbindung, 17«,20,20,21-Bis-methylendioxy-4-pregnen-3,l 1-dion (I), das gemäß den Angaben in J. Am. Chem. Soc. 81, 1235 (1959), ibid 82, 178 (1960) hergestellt werden kann, mit N-Bromsuccinimid in einer etwa äquimolaren Menge [d. h. Verbindung (I) zu N-Bromsuccinimid= 1 g : 0,45 bis 0,6 g] in etwa 40 bis etwa 60 ml trockenem Benzol umgesetzt, wobei die Mischung etwa 7 bis 10 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt wird. Dabei erhält man 6-Brom-17«,20,20,21-Bis- _Jo methylendioxy-4-pregnen-3,l 1-dion (11). Dann wird das 6-Bromsteroid (II) mit Thioglykolsäure im Molverhältnis 1 : 2 vermischt, d. h. bezogen auf Verbindung (II) liegt die doppelte molare Menge Thioglykolsäure vor, und zur erhaltenen Mischung gibt man etwa 90 bis etwa j₅ 140mi alkalisches Methanol. Anschließend wird etwa 3,5 bis 4,5 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, wobei man die Verbindung (III) erhält Etwa 5,3 g der 3,11-Dioxo-Verbindung (III) werden mit etwa 200 bis etwa 30OmI trockenem Benzol, etwa 30 bis 50 ml Äthylenglykol und etwa 90 bis etwa 130 mg p-Toluolsulfonsäure [etwa '/20 der Menge der Verbindung (HI)] vermischt und diese Mischung wird etwa 18 bis etwa 26 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, wobei man 33-Äthylendioxy-bis-methylendioxy-6«-(2-hydroxyäthoxy)-carbonylmethylthio-4-pregnen-ll-on (IV) erhält Anschließend wird die 11-Oxo-Verbindung (IV) mit etwa 8 bis etwa 10 ml einer 10%igen wäßrigen K.2CO3-Lösung und mit etwa 80 bis etwa 120 ml Methanol vermischt und das ganze wird bei Raumtem- so peratur (etwa 20 bis 30⁰C) etwa 26 bis etwa 38 Stunden lang gerührt Man engt das so erhaltene Hydrolysat ein, löst den Rückstand in etwa 15 bis etwa 25 ml Wasser, gibt zu dieser Lösung etwa 35 bis etwa 45 nil Tetrahydrofuran und etwa 3 bis etwa 5 g Natriumborhydrid, kocht die erhaltene Mischung etwa 6 bis etwa 10 Stunden lang unter Rückfluß, gibt nochmals 1 bis etwa 2 g Natriumborhydrid hinzu und erhitzt anschließend nochmals etwa 12 bis etwa 18 Stunden lang unter Rückfluß, schließlich gibt man nochmals etwa 0,5 bis eo etwa 1,5 g Natriumborhydrid hinzu, um die Reduktion der Verbindung (IV) zu erreichen. Man erhält

33-Äthylendioxy-17oc^O,20,21-bis-methylendioxy-6«- carboxymethylthio-4-pregnen-llß-oI (V). Die Schutzgruppen der Verbindung (V) können beispielsweise durch Hydrolyse entfernt werden, wobei man 6<x-Carboxymethylthiocortisol (VI) erhält Die Hydrolyse kann so durchgeführt werden, daß man z.B. eine 50%ige wäßrige Essigsäurelösung tropfenweise zu etwa 300 mg· Verbindung (V) gibt, bis sie sich vollständig aufgelöst hat, anschließend wird die erhaltene Lösung etwa 10 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt

Da die Verbindung (VI) eine Carboxylgruppe aufweist, können verschiedene Verbindungen mit einer Aminogruppe über eine Amidbindung mit ihr verknüpft werden. Beispiele für diese Verbindungen mit einer Aminogruppe sind Tyrosin, Tyramin, Histamin, 7-Aminoheptanoyltyrosin (diese Verbindungen weisen einen jodierbaren Phenyl- oder Imidazolkern auf), Proteine, wie Rinderserumalbumin (BSA), Kaninchenserumalbumin (RSA), y-Globulin oder Polypeptide, wie Polylysin. Die erhaltenen Verbindungen mit Proteinen oder Polypeptiden (hier als !Conjugate bezeichnet) zur Immunisierung von Warmblütern unter Bildung von Antikörpern verwendet werden. Die !Conjugate mit einer einen Phenyl- oder Imidazolkern aufweisenden Verbindung können mit radioaktivem Jod markiert werden (der markierte Tyrosinmethylester-, Tyramin-, Histamin- oder 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylesterteil wird als markierter Teil bezeichnet). Die markierte Verbindung kann als Tracer beim Radioimmunoassay verwendet werden. Die obige Verknüpfung kann mit Hilfe einer bekannten Reaktion zur Herstellung einer Amidbindung, z. B. der gemischten Anhydrid-Methode erreicht werden, vgl. z. B. J. of BioL Chem. 232, S. 713 (1957), ibid. 234, S. 1090 (1959); S. Lieberman et al.: »Proceedings of Progress in Hormone Research 165 (1959); Canad. ]. Biochem. and Physiol. 39, S. 967 (1961); Steroids 24, S. 477 (1974). Die Carboxylgruppe von z. B. Tyrosin wird dabei vorzugsweise mit einem Alkylrest geschätzt Der Verknüpfungsprozeß wird wie folgt am Beispiel von Tyrosinmethylester erläutert Man löst 6dt-Carboxymethylthiocortisol (VI), ein organisches Amin, z. B. N-Butylamin, Triethylamin, etc. und Isobutylchlorcarbonat in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran, Dioxan etc, in einem Molverhältnis von 1 zu etwa OJB bis etwa 1,2 zu etwa 0,7 bis etwa 1,1 und läßt die Lösung bei etwa — 10⁰C bis etwa 10° C etwa 2 bis etwa 5 Minuten lang stehen, wobei sich ein Anhydrid der Verbindung der Formel (Vl) bildet Dann gibt man Tyrosinmethylester zur Lösung, in einem Molverhältnis von 1 zu etwa 0,9 bis etwa iß, bezogen auf Verbindung (VI). Diese Mischung laßt man bei etwa 4 bis'etwa 20⁰C etwa 5 bis etwa 30Minuten lang stehen, dabei bildet sich ein Konjugat (XI). Formelmäßig läßt sich dies wie folgt darstellen:

HO

V-OH

SCH₂COOH NH₂CHCOOCHj (VI) (ΥΠ)

CH₂ SCH₂CONHCHCOOCh₃

(Xl)

Ganz analog zum obigen Reaktionsschema können Tyramin (VIII), Histamin (IX), 7-Aminoheptanoyltyrosin-methylester (X) und ähnliche Verbindungen oder Reste, die keinen Protein- oder Polypeptidrest darstellen, mit der Verbindung (VI) zu einem Konjugat verknüpft werden. Proteinreste, wie BSA, und Polypeptide, wie Polylysin, können in ganz analoger Weise mit

NH₂CH₂CH₂

OH

Verbindung (VI) zu einem Konjugat verknüpft werden, wobei im Unterschied zur oben beschriebenen Verfahrensweise das gebildete Anhydrid und das Protein oder Polypeptid in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 8,5 bis etwa 9,5 gelöst und bei etwa 4° C etwa 30 Minuten bis etwa 2 Stunden lang umgesetzt werden.

(VIII)

(IX)

CH₂-V^ V-OH NH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CONHCHCOOCh₃ (X)

Die Markierung des eine Phenyl- oder Imidazolgruppe aufweisenden Konjugats, wie jenes der Formel (XI), kann nach herkömmlichen Methoden, z. B. nach dem Verfahren von Hunter und Greenwood (Nature, Band 194, 1962, Seite 494) durchgeführt werden. Als radioaktives Jod wird ein geeignetes Radioisotop (wie ^12>J oder ¹³¹J) unter Berücksichtigung der Halbwertszeit ausgewählt. Man kann dabei folgendermaßen arbeiten: 0,1 bis 5 μg Antigen, 20 bis 50 μΐ Phosphatpuffer (1/30-0,2 Mol, pH 6,5-8), 03 bis 2 Millicurie Na^J und 5 bis 50 μg (d h. etwa 10 μΐ) Chloramin-T werden miteinander vermischt und bei Raumtemperatur 10 Sekunden bis 1 Minute lang umgesetzt Anschließend gibt man die etwa 2- bis 4fache Gewichtsmenge Natrium-metabhmlnt, bezogen auf Chloramin-T, zur Reaktionsmischung und läßt diese 30 Sekunden bis 2 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren, wobei man das markierte Konjugat erhält Da für den Radioimmunoassay nur eine sehr geringe Menge des Tracers benötigt wird, kann man diesen nach einer anderen Methode herstellen, obwohl es nachteilig ist, die Synthese im großen Maßstab vorzunehmen. Tyrosinmethylester, Tyramin, Histamin oder 7-Aminoheptanoyltyrosimnethylester werden beispielsweise zunächst mit radioaktivem Jod markiert, um den »markierten Teil« zu erzeugen. Der »markierte Teil« wird dann mit dem Steroid der Formel (VI) umgesetzt Die Markierung von Tyrosinmethylester, Tyramin, Histamin oder 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester kann nach der vorstehend beschriebenen Methode erfolgen. Die Tracer oder Zwischenprodukte können leicht nach bekannten Methoden, wie durch Chromatographie, beispielsweise Dünnschichtchromatographie (wenn eine geringe Produktmenge gereinigt werden soll) unter Verwendung von Kieselgel, gereinigt werden. Die mit radioaktivem Jod markierten Substanzen besitzen dieselben Eigenschaften wie die entsprechenden nicht-markierten Verbindungen (natürlich mit Ausnahme der Radioaktivität). Die Tracer und Zwi schenprodukte können leicht durch Dünnschicht chromatographie identifiziert werden. Gewöhnlich verwendet man zur Bestimmung der radioaktiven Substanzen ein Dünnschichtprüfgerät. Die nachstehenden Beispiele sollen das Verfahren zur Herstellung der Tracer und ihrer Zwischenprodukte näher erläutern.

Beispiel 1

(a) Man löst 1 g Uot^O^O^l-Bis-methylendioxy-^ pregnen-3,11-dion (I) in 50 ml wasserfreiem Benzol.

Nach Zugabe von 0,53 g N-Bromsuccinimid wird

das Gemisch 8,5 Stunden unter Rückfluß gekocht

Anschließend destilliert man das Lösungsmittel im Vakuum ab und unterwirft den Rückstand der Chromatographie an neutralem Aluminiumoxyd

unter Elution mit Benzol/Chloroform (4:1). Dabei erhält man 0,85 g der öligen rohen Verbindung (TI).

Die nach weiterer mehrmaliger Reinigung der

Verbindung erhaltenen Kristalle werden aus Aceton/Petroläther umkrisrallisiert. Dabei werden hellgelbe Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 173 bis 173,5° C erhalten.

Analyse für C₂₃H₂₉O₆Br:
Ber.: C 57,49, H 6,08%,
gef.: C 57,52, H 6,17%;

[«] ? +11,1° (C= 0,24, Chloroform);

IRv^'cm-¹: 1710,1675(C = O),

1100,945 945(C-O-C).

(b) Man löst 23 g der rohen Verbindung (II) in alkalischem Methanol (0,8 g KOH wurden in 115 ml Methanol gelöst). Man versetzt die Lösung tropfenweise mit 0,71 ml Thioglykolsäure, kocht das erhaltene Gemisch 4 Stunden unter Rückfluß und dampft anschließend im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit 85 ml Wasser versetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 1 mit 10%iger wäßriger Salzsäure wird das Gemisch mit Methylacetat extrahiert Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen. Dann extrahiert man mit 0,1-n wäßrigen Natriumbicarbonat, wäscht den Extrakt mit Äthylacetat, stellt die wäßrige, alkalische Lösung mit 10%iger Salzsäure auf pH 1 ein. Der entstehende Niederschlag wird mit Äthylacetat extrahiert und der Extrakt über Natriumsulfat getrocknet Nach Abdestillation des Lösungsmittels im Vakuum erhält man 1,2 g der öligen Verbindung (III). Die Verbindung wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel unter Elution mit Chloroform/Methanol (98 :2) gereinigt und aus Diäthyläther umkristallisiert Man erhält farblose Plättchen mit einem Schmelzpunkt von 223 bis 225°C.

Analyse für C₂SH₃₂O₈S:
Ber.: C 60,96, H 6,55%,
gef.: C 60,94, H 6,60%;

NMR (CDCl₃) 0:0,84 (3H, s, 18-CH₃),
1,46 (3H, s, 19-CH₃),
3,42(2H₁S₁-S-CH₂-),
3,72 (IH, d.d, j =4 Hz, 16 Hz, 160-H);

IR ν ST cm-': 1710,1680(C=O),

1100,950(C-O-C).

Die Stellung der Carboxymethylthiogruppe bezüglich der «-Bindung wird anhand des NMR-Spektrums bestimmt

(c) Man löst 53 g der rohen Verbindung (IH) in 250 ml wasserfreiem Benzol und versetzt die Lösung mit 40 ml Äthylenglykol und 110 mg p-Toluolsulfonsäure. Das Gemisch wird bei angeschlossenem Wasserabscheider 22 Stunden unter Rückfluß gekocht Nach der Umsetzung wird die Benzolschicht abgetrennt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet Anschließend destilliert man das Lösungsmittel ab, wobei man 3,4 g der öligen Verbindung (IV) erhält

S cm-': 3520-P-H),

1745,1720(C=O),

1280(CO-O),

1100,950(C-O-C)

Massenspektrum m/e: 580 (M+), 535 (M+- 45).

(d) Man löst 0,9 g der rohen Verbindung (IV) in 100 ml Methanol. Nach Zugabe von 9 ml 10%igem Kaliumcarbonat wird das Gemisch 32,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Anschließend destilliert

-, man das Lösungsmittel im Vakuum ab, löst den

Rückstand in 20 ml Wasser und wäscht 3mal mit Diäthyläther. Die wäßrige Lösung wird mit 40 ml Tetrahydrofuran und sodann 4 g Natriumborhydrid versetzt Man kocht das Gemisch unter Rückfluß,

ι α wobei man nach 8 bzw. 15 Stunden 1,5 g bzw. 1 g

Natriumborhydrid zusetzt Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Tetrahydrofuran im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird zur Zersetzung des Natriumborhydrids unter Eiskühlung portionsweise mit 50 ml 20%iger wäßriger Essigsäure versetzt. Dann extrahiert man das Gemisch mit Chloroform, wäscht den Extrakt mehrmals mit Wasser und trocknet ihn über Natriumsulfat Nach der Vakuumabdestillation des Lösungsmittels erhält man 300 mg der öligen Verbindung (V).

! R ν ST cm -': 3545 (O - H),
1725(C=O),
1100,950(C-O-C).

Man löst 300 mg der ungereinigten Verbindung in 50%iger Essigsäure (die zur Entfernung von gelöstem O₂ mit Stickstoffgas vorbehandelt wurde) und kocht die Lösung 9 Stunden im Stickstoffstrom unter Rückfluß. Anschließend dampft man das Lösungsmittel ab und unterwirft den Rückstand der Kieselgel-Chromatographie unter Elution mit Benzol/Methanol (9:1). Dabei erhält man 21 mg

1ίβ,ί7ct£l -Trihydroxy-eo.-carboxymethylthio^- pregnen-3,20-dion (VI) in Form farbloser Nadeln.

Analyse für C₂₃H₃₂O₇S:
Ber.: C 61,04, H 7.13%,
gef.: C 61,41, H 7,48%;

IRvST cm-': 3440(0-H),

1720,1680(C=O)

Beispiel 2

(a) 30 μΐ m/30 wäßrige Phosphatpufferlösung werden mit etwa 1 μg Tyrosinmethylester, Tyramin, Histamin bzw. 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester versetzt Die Gemische werden jeweils mit etwa 1 mCi radioaktivem Natriumjodid (Na¹²⁵J) und 10 μg Chloramin-T versetzt Man führt die Reaktion während 30 bis 60 Sekunden durch und versetzt das Gemisch mit 20 μg Natriummetabisul-Fit

(b) Man versetzt 10 u.g eflc-Carboxymethylthiocortisol (VI) mit 5μg einer Tetrahydrofuranlösung mit einem Gehalt von 5nl Tri-n-butylamin, 20 μΐ Tetrahydrofuran und 5 μΐ einer Tetrahydrofuranlösung mit einem Gehalt von £5 nl Chlorkohlensäureisobutylester. Das Gemisch wird dann 3 Minuten unter Wirbelvermischung gerührt

(c) Die gemäß (a) und (b) erhaltenen Reaktionsgemische werden vereinigt und 15 Minuten unter Wirbelvermischung gerührt Das Reaktionsgemisch oder dessen Äthylacetatextrakt wird zur Reinigung der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das heißt, man trägt das Reaktionsgemisch oder dessen Extrakt punktförmig auf eine Kieselplatte (6 χ 20 cm) auf. Nach Trocknung im Stickstoffstrom entwickelt man mit Äthvlacetat/Metha-

noI/Wasser (85:15:1) (für die jodierten Histaminderivate) oder Chloroform/Methanol/Wasser (9:1 :0,1) (für die übrigen Verbindungen, wie den jodierten Tyrosinmethylester, das jod-erte Tyramin oder den jodierten 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester). Die erhaltenen Flecke werden jeweils isoliert und mit Methanol extrahiert Die Extrakte werden jeweils zur Trockne eingedampft und die

Tabelle

Rückstände jeweils in einer Pufferlösung gelöst, welche dann beim Radioimmunoassay eingesetzt wird.

Die erzeugten Tracer und Zwischenprodukte werden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel bestimmt; ihre Rr- Werte sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich.

	Rn	Rr₂	Rb
TME-¹²⁵J		0,24 bis 0,28
Tym-^l25J		etwa 0
IUm-¹²⁵J	0	0 bis 0,03
7-AH - TME-¹³⁵J		etwa 0
C-CMT	0,19 bis 0,22	etwa 0,92
C-CMT - TME-¹²⁵J		etwa 0,30	0,10
C-CMT · Ty m-¹²⁵J		0,22 jis 0,34
C-CMT · HJm-¹²⁵J	0,60 bis 0,63	etwa 0,10
C-CMT · 7-AH · TME-¹²⁵J		etwa 0,19
Na¹²⁵J	0,39 bis 0,44
C-HS · TME-¹²⁵J			0,13 bis 0,16

In der Tabelle sind Rn, Rf 2 und Rf3 die erzielten Werte bei Entwicklung mit Äthylacetat/Methanol/Wasser (85 :15 :1), Chloroform/Äthylacetat/Methanol/ Wasser (5:5:1:0,1) bzw. Chloroform/Methanol/Wasser (9 :1 :0,l). Die Abkürzungen in der Tabelle haben folgende Bedeutungen:

C-CMT: 6-Carboxymethylthiocortisol TME: Tyrosinmethylester Tym: Tyramin Him: Histamin

7-AH: 7-Aminoheptanoyl

C-HS: Cortisol-6«-O-hemisuccinat

Die Erzeugung des Antikörpers zu Cortisol kann nach einer bekannten Methode erfolgen, vgl. z. B. Steroids 23, S. 49 (1974), ibid. 23, S. 203 (1974). Man emulgiert beispielsweise ein Cortisol-Träger-wKonjugat« (1 mg) in komplettem Freund-Adjuvans (1:1) und injiziert die Emulsion Warmblütern, wie Kaninchen, Ziegen, Schafen oder Meerschweinchen. Die Auffrischungs- bzw. Booster-Injektionen (04 mg) werden in 1 monatigen Abständen während 5 bis 6 Monaten durchgeführt Anschließend entnimmt man den Tieren Blutproben und fraktioniert das daraus gewonnene Serum mit Ammoniumsulfat, um eine IgG-Fraktior; zu gewinnen. Die IgG-Fraktion wird gegen 0,002-m Natriumchloridlösung dialysiert und als Antikörper für den Radioimmunoassay verwendet

Der Radioimmunoassay von Cortisol unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Antikörpers und Tracers kann nach einem herkömmlichen Verfahren, z. B. Adsorbens-Methoden, wobei Aktivkohle, Florisil, Ionenaustauscherharze und dergleichen, unspezifische Ausfällungsmethoden (oder y-Globulin-Ausfällung) unter Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat, Polyäthylenglykol, Äthanol und dergleichen, Festphasen-Methoden, »double antibodv«-Methoden etc..

durchgeführt werden. Derartige Methoden sind z. B. in den auf Spalte 1 der vorliegenden Beschreibung zuerst genannten Literaturstellen beschrieben, vgl. aber auch

r, S. G. Hillier und K. Griffith: Steroid Immunoassay, E. H. D. Cameron, Ed. Alpha Omega Publishing Ltd., Cardiff, Wales GB (1975). Beispielsweise werden der verdünnte Antikörper (IgG-Fraktion) in Boratpufferlösung, der Tracer (10000 bis 20000cpm) und die Standardlösung (oder die Probe) 60 Minuten bei 4° C inkubiert Das erhaltene Gemisch wird mit dextranbeschichteter Aktivkohle (Holzkohle) (1 ml) versetzt Das Gemisch wird dann unter Wirbelvermischung gerührt 10 Minuten bei 4° C stehengelassen und danach 20 Minuten

■15 bei 2000 g zentrifugiert Man saugt den Überstand ab und bestimmt die Radioaktivität des Rückstandes auf übliche Weise, z. B. mit einem Szintillationszähler.

Einige erhaltene Standardkurven sind aus den F i g. 2 bis 8 ersichtlich, wobei Anti-Cortisol-6<x-0-HS-BSA als

so Antikörper verwendet wurde.

Aus den Figuren geht folgendes hervor: Wenn der Tracer dieselbe Brücke wie das Cortisol-BSA-Konjugat (O-Hemisuccinylgruppe) aufweist fällt die Standardkurve von Cortisol oder Cortisol-6«-CMT nicht genügend ab. Eine Erklärung für diese Tatsache kann in folgendem bestehen. Selbst wenn ein hoher Überschuß (bezogen auf den Tracer) der Standardverbindung (Cortisol oder Cortisol-fa-CMT) zur Umsetzung gebracht wird, ist der Tracer immer noch mit dem Antikörper (der als der

bo Antikörper zur Brücke angesehen wird) verbunden, und das Präzipitat weist eine beträchtliche Radioaktivität auf (in 3: die Kurve von Cortisol und Cortisol-6«-CMT; in Fig.5: die Kurve von Cortisol-6«-HS-TME-^l25J). Wenn der Tracer dagegen eine andere Brücke

b5 (Carboxymethylgruppe) als das Cortisol-BSA-Konjugat aufweist fällt die Standardkurve bei der hohen Dosis der Standardverbindung genügend ab. Die Einführung einer unterschiedlichen Brücke in den Tracer bewirkt

somit, daß die Standardkurve empfindlicher wird.

Bei der erläuterten Ausführungsform wird Cortisol-61%-O-Hemisuccinat-BSA-Konjiigat als Antigen für die Antikörpererzeugung verwendet 6a-Carboxymethylthiocortisol-BSA-iConjugat kann jedoch ebenso gut als Antigen für die Antikörperbildung eingesetzt werden. In

diesem Falle soll der Tracer eine andere Brücke, z. B. eine Hemisuccinyloxygruppe, aufweisen.

Die in den Beispielen und in der Beschreibung angegebenen Lösungsmittelverhältnisse sind Volumenverhältnisse.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Cortisolderivate der allgemeinen Formel

SCH₂COR

in der R einen radiojodierten Tyrosin-nieder-alkylesterrest, radiojodierten Tyraminrest, radiojodierten Histaminrest oder radiojodierten 7-Aininoheptanoyltyrosin-nieder-alkylesterrest bedeutet.

2. Verbindungen der allgemeinen Formel des Anspruchs 1, in der R eine Hydroxylgruppe, einen Tyrosin-nieder-alkylesterrest, Tyraminrest, Histaminrest, 7-Aminoheptanoyltyrosin-nieder-alkylesterrest, Serumalbumin, y-GlobuIin oder ein PoIypeptid bedeutet

3. Radioimmunologisches Verfahren (Radioimmunoassay) zur Bestimmung von Cortisol unter Verwendung eines markierten Cortisols als Tracer und eines durch Immunisierung mit einem Cortisol-

Träger-Konjugat erzeugten Antikörpers, wobei der

Tracer und das Cortisol-Träger-Konjugat den

markierten Teil bzw. Träger in (»«-Stellung von

Cortisol aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß

ma»i einen Tracer und ein Cortisol-Träger-Konjugat mit unterschiedlicher Brücke verwendet

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brücke des markierten Cortisols bzw. Cortisol-Träger-Konjugats eine Carboxymethylthio- bzw. Hemisuccinyloxygruppe verwendet

Cortisol (1 l/M 7«^1 -Trihydroxy^-pregnen-S^O-dion) ist ein im Serum und Harn enthaltenes Steroid. Für die Bestimmung dieses Steroids wurden bereits mehrere radioimmunologische Methoden (Radioimmunoassay) vorgeschlagen, vgl. z. B. AnaL Lett 5, S. 757 (1972), ibid. 5, S. 767 (1972); J. of Analytical Endocrinology and Metabolism 35, S. 219 (1972); G. E Abraham: Radioimmunoassay of Plasma Steroid Hormones in »Modem Methods of Steroid Analysis«, Kapitel 21, Academic Press, New York and London (1973); Clinica Chimica Acta 66, S. 319-330 (1976), The Japanese J. of

HO

Nuclear Medicine 12, S. 123 (1975), Clinical Endocrinology X (Tokio) 24, S. 339 (1976). Bei der 94. Tagung der Japanischen Pharmazeutischen Gesellschaft (Sendai, 1974) schlugen Tsuji et al. vor, einen Antikörper gegen Cortisol durch Injektion eines neuen Cortisol-Protein-Konjugats, d. h. Cortisol-ea-O-Hemisuccinat-BSA-Konjugat (Cortisol-6«-O-HS-BSA; Formel A) bei Kanin- chen zu erzeugen, dieser Vorschlag ist in einer Arbeit von T. Nishina, A. Tsuji und D. K. Fukushima in Steroids 24(6), S. 861 (1974) beschrieben: