DE2559624C3 - Reaktive unsymmetrische Dicarbonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Testreagenzien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft reaktive unsymmetrische Dicarbonsäureester, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Reagenzien, die zur Untersuchung von Herzglykosiden (Digitalisglykoside^ geeignet sind.

Bei den Methoden zur Untersuchung von Digitalisglykosiden, insbesondere zur Messung des pharmakologischen Spiegels an solchen Glykosiden, handelt es sich um immunologische Tests in wäßriger oder physiologischer Lösung, z. B. im Plasma, Serum und Urin. Solche Immuntests für die Bestimmung von Digitoxin und Digoxin sind bekannt. So wird nach dem aus G. C. Oliver, B. M. Parker, D. L. Brasfield und C. W. Parker »The Measurement of Digitoxin in Human Serum by Radioimmunoassay«, J. Clin. Investig. 47, 1035 (1968), bekannten Verfahren eine bestimmte Menge eines mittels immunologischer Standardverfahren hergestellten Anfidigitoxinserums mit einer wäßrigen oder physiologischen Lösung, deren Digitoxingehalt bestimmt werden soll, also z. B. mit Testplasma, -serum

5 oder -urin, oder mit einer Siandarddigitoxinlösung jeweils zusammen mit einer konstanten Menge Digitoxigenin umgesetzt, das entweder radioaktiv markiert oder an ein Enzym gebunden ist, und zwar jeweils so, daß die antigenen Eigenschaften unverändert erhalten bleiben. Nach der Inkubation des Gemisches wird das mit dem Antikörper verbundene Digitoxin bzw. Digitoxigenin von freiem Digitoxin bzw. Digitoxigenin abgetrennt und die Radioaktivität oder die Enzymaktivität gemessen. Das Reagens, also das radioaktiv markierte oder an ein Enzym gebundene Digitoxigenin, ist ein mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester kondensiertes 3-O-Succinyl-digitoxigenin, das durch Umsetzung von Digitoxigenin mit Bernsteinsäureanhydrid hergestellt wird.

Aus der DE-OS 21 42422 ist ein analoges, ebenfalls auf Immuntests beruhendes Verfahren zur Bestimmung von Digoxin bekannt, bei dem das entsprechende Reagens aus Digoxigenin, dem 12-Hydroxydigitoxigenin, ebenfalls durch Succinylierung, bei der die OH-Gruppe in 12-Steilung geschützt werden muß, und anschließende Kondensation mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester hergestellt wird. Es ist auch bekannt, das succinylierte Genin zur Antikörperherstellung als Antigen an ein Protein, z. B.

n) an Rinderserumalbumin (RSA), zu binden.

Da der Komplex des Antikörpers mit dem Genin weniger stabil als der entsprechende Komplex mit dem vollständigen Herzglykosid ist, wurde ebenfalls bereits vorgeschlagen, das Herzglykosid über den endständigen

ji Zuckerrest mit einer Aminosäure oder einem Protein zu kondensieren. So ist es aus V. P. Butler und ). P. Chen, Proc. Nat Acad. Sei. U. S, 57, 71 (1966), bekannt, den endständigen Digitoxose-Rest mittels Perjodat zu oxidieren und anschließend mit einem Protein, wie RSA, zum Immunogen zu kondensieren. Aus der DE-OS 23 31 922 ist dasselbe Verfahren, jedoch zur Herstellung jodierbarer Digoxin-Aminosäure- und -Peptidderivate, bekannt.

Da Digoxin gegenüber Säuren und Laugen außerordentlich empfindlich ist, entsteht das Digoxin-Aminosäure- Derivat unter den drastischen Bedingungen des zuletzt genannten Verfahrens nur in einer Ausbeute von 10% d. Th. Derselbe Nachteil einer geringen Ausbeute entsteht auch bei der Umsetzung mit einem Protein, wobei jedoch noch hinzu kommt, daß eine Reinigung des Digoxin-Protein-Derivate nicht mehr, wie im Falle des niedermolekularen Aminosäure-Derivates, möglich ist, so daß das auf diese Weise erhaltene Immunogen noch Nebenprodukte, z. B. isomerisiertes Digoxin, enthält. Ein weiterer Nachteil dieses bekannten Verfahrens zur Herstellung eines Digoxin-Reagenses ist die irreversible Veränderung des endständigen Zuckerrestes im Digoxinmolekül sowie dessen direkte Verknüpfung mit dem Protein oder der Aminosäure.

bo Hierdurch werden die stertschen Verhältnisse innerhalb des Digoxinmoleküls verändert, was wiederum die Genauigkeit des mit diesem Molekül als Reagens durchgeführten Tests beeinflußt, bei dem ja letzten Endes der Antikörperkomplex dieses Moleküls mit dem

b5 Antikörperkomplex des freien Digoxins verglichen wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und Verbindungen zu schaffen,

die es ermöglichen, Digitalisglykoside, ζ. B. Digoxin oder Digitoxin, ohne deren molekulare Struktur zu verändern, über eine »Brücke« mit mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindungen, z.B. Aminen, Aminosäure-Derivaten oder Proteinen, zu kondensieren, also Verbindungen zu schaffen, die zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden geeigent sind.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch reaktive unsymmetrische Dicarbonsäureester dor allgemeinen Formel

R₁O R₂-C-(CH₂),-CO-X

gelöst, in der

Ri eine Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen, R2 und R3 je einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 C-Atomen, X den Cyanomethyloxy-, Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-

pyridiniumoxy-, 2,4-Dinitrophenoxy-, den 2,4,5-Trichlor phenoxy-, Pentachloφhenoxy-, Phenylthio-, p-Nitro- phenoxy-, p-Nitrophenylthio-, den Piperidyl-N-oxy-,

Phthalimid-N-oxy- oder den Benztriazol-N-oxy-Rest

η die Zahl 2,3,4 oder 5

bedeuten.

Die Aufgabe wird ferner gemäß der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung der so charakterisierten erfindungsgemäßen reaktiven Dicarbonsäureester gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Monoorthotrimethyl-, -triäthyl- oder -tripropylester einer Dicarbonsäure mit 4 bis 7 C-Atomen in Form ihres Alkalisalzes in Gegenwart eines Kronenäthers oder Kryptates in einem polaren oder unpolaren aprotischen organischen Lösungsmittel in an sich bekannter Weise mit einer reaktiven, den Rest X enthaltenden Verbindung, z. B. mit Chloracetonitril, einem Hydroxysuccinimidsulfonat, N-Hydroxybenztriazol-tosylat oder -trifluormethylsulfonat oder mit 2,4,5-Trichlorphenylsulfonat umgesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung sind somit z. B. folgende reaktive Dicarbonsäureester der oben genannten allgemeinen Formel:

Glutarsäure-o-orthotrimethylester-w'-hydroxy-

succinimidester, Glutarsäure-to-orthotrimethylester-cü'-cyano-

methylester, Bernsteinsäure-ta-orthotriäthylester-w'-cyano-

methylester, Adipinsäure-o-orthotripropylester-üj'-hydroxy-

succinimidester, _

Bernsteinsäure-co-methylester-w'-cyano-

methylester,

Glutarsäure-w-propylester-ia'-cyanomethylester, Adipinsäure-iB-äthylester-iu'-hydroxy-

succinimidester, Bernsteinsäure-ja-methylester-tu'^AS-trichlor-

phenylester, Bernsteinsäure-iü-orthotriäthylester-co'-benz-

triazol-N-yl-ester, Glutarsäure-w-orthotrimethylester-w'-2,4,5-tri-

chlorphenylester, Glutarsäure-tu-propylester-iu'-benztriazol-

N-yl-ester,

Adipinsäure-ö-orthotriäthylester-6)'-2,4^-tri-

chlorphenylester, Adipinsäure-oj-methylester-w'-benztriazol-

N-yl-ester, Pimelin-ö-orthotrimethylester-ö'-hydroxy-

succinimidester, Pimelinsäure-ta-orthotrimethylester-iu'-cyano-

methylester, Pimelinsäure-cö-orthotriäthylester-iu'^AS-tri-

chlorphenylester, Pimelinsäure-tu-orthotrimethylester-w'-benz-

triazol-N-yl-ester, Pimelinsäure-co-orthotripropylester-io'-cyano-

methylester, Pimelinsäure-a)-methylester-G)'-2,4,5-trichlor-

phenylester.

Die reaktiven Dicarbonsäureester gemäß der Erfindung sind zur Herstellung von Reagenzien zur Untersuchung von Digitalisglykosiden im Rahmen immunologischer Tests der eingangs genannten Gattung hervorragend geeignet Sie lassen sich in üblicher Weise zunächst mit Digoxin oder Digitoxin durch Umsetzung in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure nach Patent 25 37 129 verbinden, wobei Ri gegen den Digoxin- oder Digitoxinrest ausgetauscht wird. Jedes dieser Umsetzungsprodukte kann dann entweder mit einer radioaktiv markierbaren, mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindung, z. B. mit einer mit ¹²⁵J jodierbaren aminogruppenhaltigen Verbindung, wie Tyramin, Histidin, Tyror'n und Tyrosinäthylester, umgesetzt werden, wobei man eine Tracer erhält, oder mit einem biologisch aktiven Protein zur Herstellung von Antikörpern, z. B. mit Rinderserumalbumin. Jedes der nach Patent 25 37 129 erhaltenen Reaktionsprodukte kann schließlich auch mit einem enzymatisch aktiven Protein zu einem Reagenz für den ELISA-Test kondensiert werden. Mit der Erfindung werden also Verbindungen zur Verfügung gestellt, die zur Herstel lung von in ihren chemischen Aufbau gleichartigen Reagenzien geeignet sind, wobei jedoch mit diesen Reagenzien die Messung ganz verschiedener Größen, nämlich der Antikörperaktivität, der Enzymaktivität und der Radioaktivität, ermöglicht wird.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß deren Hydrophilie dem jeweiligen Verwendungszweck durch die Wahl des ω'-Esters, also durch die Wahl zwischen Dicarbonsäureestern der angegebenen allgemeinen Formel, in der X entweder einen Cyanomethyl- oder den Succinimid-N-oxy-, den N-Methylpyridinium-, den 2,4-Dinitrophenoxy-, den 2,4,5-Trichlorphenoxy-, den Pentachlorphenoxy-, den Phenylthio-, den p-Nitrophenoxy-, den p-Nitrophenylthio-, den Piperidyl-N-oxy-, den Phthali mid-N-oxy- oder den Benztriazol-N-oxy-Rest bedeutet, angepaßt werden kann, wobei z. B. die Cyanomethyl ester-Derivate meist hydrophiler als die entsprechenden

Hydroxysuccinimidester-Derivatesind. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbin-

düngen besteht darin, daß die aus den erfindungsgemäßen Verbindungen herstellbaren Digoxin- bzw. Digitoxinester an Trägersubstanzen, z. B. an Molekularsieben, aber auch auf Polystyrol, fixiert und im Rahmen der Λ linitätschromatographie eingesetzt werden können, vor allem an hydrophilen, aminogruppenhaltigen Gelen oder Molekularsieben. Diese gelgebundenen Substanzen dienen als Immunadsorbentien, also zur Reinigung von Antikörpern.

Weiterbildungen des Verfahrens zur Herstellung der reaktiven Dicarbonsäureester gemäß der Erfindung bestehen darin, daß als polares oder unpolares aprotisches organisches Lösungsmittel Benzol oder Chloroform verwendet wird, und darin, daß als Hydroxysuccinimidsulfonat das Methylsulfonat oder das p-Toluolsulfonat des Hydroxysuccinimids verwendet wird.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beispielsbeschreibung und den Ansprüchen.

Als Ausgangsmaterial zur Herstellung der reaktiven Dicarbonsäureester dient ein Monoorthotrimethyl-, -triäthyl- oder -tripropylester einer Dicarbonsäure mit 4 bis 6 C-Atomen in Form ihres Alkalisalzes, z.B. Glutarsäure-monoorthotrimethylester.

Glutarsäure-monoorthotrimethylester wird hergestellt, indem in eine Mischung aus 373 g Cyanobuttersäureäthylester und 12 ml absoL Methanol unter Eiskühlung 10,7 g HCl eingeleitet werden. Nach 5-tätigem Stehen im Kühlschrank kristallisiert Glutarsäure-to-imido-O-methylester-to'-äthylester-hydrochlorid langsam aus. Es wird mit absol. Äther viermal digeriert und unter Luftausschluß abgesaugt und über KOH getrocknet Zu dem so erhaltenen Imidoestersalz wird unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluß ein Überschuß von Methanol gegeben. Zunächst gehen die Kristalle in Lösung, dann, nach 12stündigem Stehen bei Raumtemperatur, beginnt langsam die Ausscheidung von Ammoniumchlorid. Man läßt noch weitere 48 ätdn. stehen und vervollständigt dann die Ausfällung durch Zusatz der dreifachen Menge Äther. Dann wird abfiltriert, eingeengt und in absol. Äther aufgenommen, erneut abfiltriert und wieder eingeengt Der zurückbleibende Glutarsäure-cu-orthotrimethylester-iu'-äthylester wird anschließend destilliert (Kp_o.os = 55 bis 60 Grad C). Die Ausbeute aber diese ersten beiden Stufen beträgt 41%d.Th.

Dieselbe Verbindung, also Glutarsäure-cü-orthotrimethylester-w'-äthylester, erhält man — allerdings in geringerer Ausbeute —, indem in entsprechender Weise ein Überschuß von Methanol zu Glutarsäure-oj-imido-O-methylester-w'-äthylester-tetrafluoroborat gegeben wird, das durch Umsetzung von Glutarsäureäthylesteramid mit Trimethyloxonium-tetrafluoroborat zugänglich ist

Der Glutarsäure-w-orthotrimethylester-Oi'-äthylester wird in 50 ml Aceton gelöst und mit der äquivalenten Menge KOH in 10 ml H₂O versetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Dann wird das Aceton und die Hauptmenge des Wassers abgezogen und mit absol. Methanol versetzt Beim Einengen fällt das Kaliumsalz des Glutarsäure-Monoorthotrimethylesters aus, das am Hochvakuum getrocknet wird und als Ausgangsmaterial zur Hestellung reaktiver Dicarbonsäureester gemäß der Erfindung dient

Beispiel 1

Glutarsäure-w-orthotrimethylester-w'-cyanomethylester

in 20 ml Chloroform werden äquivalente Mengen des Kaliumsalzes des Glutarsäure-monoorthotrimethylesters mit Chloracetonitril und 1 Mol-% 18-Crown-6-(cyclo-hexa-äthylenoxid) versetzt und 8 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt Von ausgefallenem Natri umchlorid wird abgetrennt und die Lösung wird mit Natriumdicarbonat ausgeschüttelt getrocknet und eingeengt Der Cyanomethylester bleibt als farbloses öl zurück. Rt: 0,88 in Benzol/Essigsäureäthylester 1 :1 auf Kiesei geldünnschichtplatten; N =berechnet: 6,06%, gefunden: 5,4%.

Beispiel 2

Glutarsäure-tü-orthotrimethylester-iü'-hydroxysuccinimidester

5,84 g (25,4 mMol) Kaliumsalz des Glutarsäure-monoorthotrimethylesters werden in 20 ml Chloroform aufgenommen und mit 4,9 g (25,4 mMol) Methansulfon säure-N-hydroxysuccinimidester und mit 1 Mol-% le-Crown-e^cyclo-hexa-äthylenoxid) versetzt und 7 Tage bei Raumtemperatur gerührt Dann wird mit 10%iger gesättiger Natriumbicarbonatlösung ausgeschüttelt Die Chloroformphase wird getrocknet und eingeengt; es bleibt ein klares farbloses Ol zurück.

Elementaranalyse:	C	H	N
	49,83 50,64	6,57 6,59	4,84 4,60
Berechnet Gefunden

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Reaktive unsymmetrische Dicarbonsäureester der allgemeinen Formel

R₁O
R₂-C-(CH₂J_n-CO-X

in der

Ri einen Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen,

R2 und R3 je einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 C-Atomen,

X den Cyanomethyloxy-, Succinimid-N-oxy-, N-Methylpyridiniumoxy-, 2,4-Dinitrophenoxy-, den 2,4,5-TrichIorphenoxy-, Pentachlorphenoxy-, Phenylthio-, p-Nitrophenoxy-, p-Nitrophenylthio-, den Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder den Benztriazol-N-oxy-rest und

π die Zahl 2,3,4 oder 5

bedeuten.

2. Verfahren zur Herstellung der reaktiven Dicarbonsäureester gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Monoorthotrimethyl-, -triäthyl- oder -tripropylester einer Dicarbonsäure mit 4 bis 7 C-Atomenin Form ihres Alkalisalzes in Gegenwart eines Kronenäthers oder Kryptates in einem polaren oder unpolaren aprotischen organischen Lösungsmittel in an sich bekannter Weise mit einer reaktiven, den Rest X enthaltenden Verbindung umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als reaktive, den Rest X enthaltende Verbindung Chloracetonitril, ein Hydroxysuccinimidsulfonat, N-Hydroxybenztriazol-tosylat oder -trifluormethylsulfonat oder 2,4,5-TrichIorphenylsulfonat verwendet wird.

4. Verwendung der reaktiven Dicarbonsäureester gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Reagenzien zur Untersuchung von Herzglykosiden (Digitalisglykosiden) in wäßriger oder physiologischer Lösung durch übliche Umsetzung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 zunächst mit Digoxin oder Digitoxin in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure und anschließend mit einer mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindung.