DE2600465B2 - Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von Östrogenen - Google Patents
Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von ÖstrogenenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von Östrogenen in einer
biologischen Flüssigkeit gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
In »Pharmazie heute«, November 1974, S. 205—208
und »Immunologie Methods in Steriod Determination«, herausgegeben von F. G. Peron und B. V. Caldwell, New
York 1970, S. 161 —166 sind radioimmunologische Bestimmungsverfahren für östrogene beschrieben, bei
denen als markierte Komponente ein Konjugat aus dem betreffenden östrogen und einer durch radioaktives Jod
markierten Substanz, insbesondere einem markierten Protein, verwendet werden. Diese Konjugate sind
müh sam herzustellen. Insbesondere ist die Bindung von Steroiden an vorher jodiertes Histamin nur in sehr
geringem Maßstab möglich und sehr schwierig durchzuführen. Darüber hinaus ist die Lebensdauer der
jodierten Steroid-Protein-Konjugate sehr gering und beträgt z. B. nur 1 bis 2 Wochen. Außerdem sind diese
Konjugate häufig immunologisch nur noch wenig reaktionsfähig.
Bei einem weiteren bekannten Verfahren wird zur Überwindung der obenerwähnten Schwierigkeiten
Tritium anstelle von radioaktivem Jod zur Markierung verwendet, östriol liegt in Körperflüssigkeiten in Form
eines Gemisches der nicht-konjugierten Form mit Konjugaten vor, von denen die wichtigsten östriol-3-hemisulfat,
östriol-16-glucuronid und östriol-3-hemisulfat-16-glucuronid
sind. Da es im allgemeinen erwünscht ist, das gesamte östriol zu bestimmen und nicht nur das
freie, umfaßt das bekannte radioimmunologische Bestimmungsverfahren folgende Stufen
a) Saure Hydrolyse der biologischen Flüssigkeit zur Aufspaltung der östriolkonjugate
b) Extraktion des gesamten (freien) östriols in ein organisches Lösungsmittel und chi omatographisehe
Reinigung.
c) Sättigungsanalyse des östriols nach Entfernung des
organischen Lösungsmittels, mit Hilfe eines mit Tritium markierten östrenderivates, das mit dem
östriol um die Reaktion mit dem spezifischen
ι ο Reagenz konkurrieren solL
Dieses Verfahren besitzt zwei hauptsächliche Nachteile. Erstens ist Tritium ein /J-Strahler und wesentlich
schwieriger nachzuweisen und zu messen als ein y-Strahler wie J-125. Zweitens ist die Extraktion mit
organischen Lösungsmitteln und Chromatographie eine mühsame und zeitraubende Operation, die nicht in
Betracht kommt, wenn mehr als einige wenige Proben bestimmt werden sollen. Aufgrund dieser Nachteile
wird Östriol in Krankenhäusern nicht durch Sättigungsanalyse bestimmt, sondern durch den Kober-Farb-Test
bei dem es ungünstigerweise erforderlich ist, den Urin
des Patienten über einen Zeitraum von 24 Stunden zu sammeln.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von
östrogenen zu entwickeln, bei dem eine markierte Substanz angewandt wird, die leicht nachzuweisen,
einfach herzustellen und über längere Zeit stabil ist sowie eine gute immunologische Reaktionsfähigkeit
besitzt
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 dadurch gelöst, daß man
als Radio-Jod-Derivat 2-Jod-, 4-Jod- und/oder 2,4-Dijod-Derivate eines östrogens verwendet.
In verschiedenen Vorveröffentlichungen wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß eine derartige
Markierung des Steroidkerns nicht möglich ist bzw. ein solches Produkt nicht für immunologische Bestimmungen
angewandt werden kann, da das Steroid durch Kernsubstitution mit dem im Verhältnis zum Steroidkern
außerordentlich großen Jodatom seine immunologische Reaktionsfähigkeit verlieren würde (s. zum
Beispiel Immunological Methods in Steroid Determination a.a.O; P.W. Nars und W.M. Hunter, Journal of
Endocrinology S. 1 Zeilen 2—4; A. PaIa, M. Ermine und G. Benagiano, Journal of Steroid Biochemistry, 1974, Bd.
5, Nr. 4, S. 306-307 und S. L. Jeffcoate, Pathologie Biologie 1975, Bd. 23, Nr. 10, S. 903-905).
Überraschenderweise hat es sich nun gezeigt, daß ein derartiger Reaktivitätsverlust nicht auftritt, sondern daß
im Gegenteil die radioaktiv jodierten östrogenderivate eine hohe immunologische Reaktionsfähigkeit besitzen,
eine wesentlich bessere Stabilität als die Konjugate mit markierten Proteinen (bis zu etwa 6 Monaten verglichen
mit 1 bis 2 Wochen für die Steroid-Protein-Konjugate) und daß sie eine radioimmunologische Bestimmung von
östrogenen auf einfache und zuverlässige und gut reproduzierbare Weise ermöglichen.
bo östrogene, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden können sind
östriol (E3)
östron (Ei)
östradiol (E2)
östetrol (E4)
und deren Derivate z. B. das 16-Glucuronid-Derivat.
Bei den erfindungsgemäß anzuwendenden 2-Jod-, 4-Jod- und 2,4-Di-jod-Derivaten der östrogene liegt ein
hoher Anteil des Jods als radioaktives Jod-Isotop J-131
oder insbesondere J-125 vor.
Diese Verbindungen können durch bekannte Reaktionen hergestellt werden. Die östrogene können direkt
jodiert werden mit Hilfe von J-125 und Chloramin-T ohne daß sie vorher mit einer anderen Substanz ein
Konjugat bilden müssen. So werden z. B. Na · J-125 und
Chloramin-T in äthanolischer Lösung zu dem östrogen zugegeben und vermischt Nach Zugabe von Natriummetabisulfit
wird das jodierte Östrogenderivat in ein organisches Lösungsmittel extrahiert und chromatographisch
gereinigt
Es ist bevorzugt, daß konjugiertes östrogen z. B.
östriol, in biologischen Flüssigkeiten durch Hydrolyse
mit Hilfe von Enzymen hydrolysiert wird anstatt mit Säure. Die enzymatische Hydrolyse von Östriolkonjugaten
ist bekannt und die beiden erforderlichen Enzyme, Glucuronidase und Arylsulfatase sind beide im Handel
erhältlich. Ein großer Vorteil der enzymatischen Hydrolyse gegenüber der Säurehydrolyse besteht darin,
daß das Hydrolysat für die Bestimmung verwendet werden kann ohne daß eine Lösungsmittelextraktion
des östrogens erforderlich ist
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
30
A) Jodierung von Östriol
Chloramin-T (0,5 mg in 100 μΐ Wasser) wurde unter
Rühren zu einem Gemisch von östriol (50 μg in 400 μΐ
Äthanol) und Na125J (10 mCi in 100 μΐ verdünntem
NaOH zugegeben und das Gemisch weitere 5 Minuten gerührt Dann wurde Natrium-metabisulfit (1,2 mg in
500 μΐ Wasser) zugegeben und das Gemisch 5 Minuten gerührt bevor 1 ml 0,1 mHCl zugegeben wurde. Das
Gemisch wurde dann mit 1 ml Chloroform heftig gerührt. Die wäßrige Schicht wurde von dem organischen
Lösungsmittel abgetrennt und erneut mit einem weiteren ml Chloroform extrahiert. Die zusammengegebenen
Chloroformauszüge wurden unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und der
Rückstand erneut in 50 μΐ Äthanol gelöst. Die Äthanollösung des 125-J-markierten Östriolderivats
wurde durch Chromatographie gereinigt und das Produkt mit Phosphatpuffer, enthaltend Pferdeserum
(10%), Natriumazid (1 mg/ml) und Gelatine (1 mg/ml), verdünnt vor der Anwendung für die radioimmunologische
Bestimmung.
östron, östradiol, östetrol und Östriol-16-(0-D-glucuronid)
wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren jodiert Man erhielt folgende Ergebnisse
Östrogen
Östron
Östradiol
Östetrol
Östriol-16-OS-D-glucuronid)
55,3
44,6
87,8
17,9
44,6
87,8
17,9
B) Radioimmunologische Bestimmung von östriol
Proben von 50 μΐ Standardlösungen von östriol in
Pferdeserum oder die unbekannten Humanserumproben wurden in Plastikröhrchen gegeben. Zu jeden
Röhrchen wurden 200 μΐ einer Enzymlösung (extrahiert von der Schnecke Helix pomatia) in Natriumacetatpuffer,
pH 5, gegeben und der Inhalt der Röhrchen kurz vermischt. Die Röhrchen wurden dann mit Stopfen
verschlossen und in sinem Wasserbad von 370C zwei
Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden zur Wiederholung 50 μΐ Proben von dem hydrolysierten
Serum entnommen und in Plastikröhrchen gegeben. Zu jedem Röhrchen wurden dann 200 μΐ Phosphatpuffer,
enthaltend 10% Pferdeserum, Natriumazid (1 mg/ml), Gelatine (1 mg/ml) und das, wie oben beschrieben, mit
125J-markierte östriolderivat (ungefähr 0,3μΟ/ΐηΙ)
gegeben. Volumina von 200 μΐ des Phosphatpuffers, enthaltend Pferdeserum, Natriumazid und Gelatine und
eine Verdünnung von Antiserum, das gebildet worden war gegen östriol, das mit Albumin konjugiert war,
wurden in jedes Röhrchen gegeben und der Inhalt der Röhrchen vermischt Die Röhrchen wurden ungefähr 30
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und 500 μΐ einer Ammoniumsulfatlösung (5,4 g in 10 ml
Wasser) in jedes Röhrchen gegeben. Nach dem Vermischen wurden die Röhrchen zentrifugiert, die
überstehende Flüssigkeit abgesaugt und die Niederschläge in den Röhrchen mit Hilfe eines y-Zählers
untersucht.
| Standard-Kurven | Gesamtimpulse pro 100 s |
% gebunden Vergl. |
50ngE3 | 100ngE3 | 200ngE3 | 350ngE3 | 500ngE, |
| Antiserum | 111,169 111,169 |
68,2 69,8 |
57,2 55,2 |
47,3 47,3 |
32,6 33,0 |
23,0 21,4 |
17,5 17,3 |
| A B |
Beispiel 2 Radioimmunologische Bestimmung von östron
östron wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen
Verfahrens bestimmt, wobei jedoch das Antiserum gebildet worden war durch Immunisierung mit (a)
Österon-6-carbomethoxy-oxim-thyroglobulin (Miles-Yeda)
und (b) einem Östron-Derivat das in 6-Stellung
gekuppelt war (The John Radcliffe Hospital, Oxford).
| 5 | 26 00 | 465 | 6 | Ing Österon | |
| 15,4 | |||||
| Standard-K urven | Verdünnung des | % gebunden | 11,2 | ||
| Antiserum | Antiserums | Gesamtimpulse | Alter der | Vergl. | |
| wie geliefert | pro 100 s | Markierung | 40,1 | ||
| Miles-Yeda | 1/32 000 | 10 700 | 23 Tage | 44,7 | |
| J. Radcliffe Hosp. | 19 300 | 30 Tase | |||
Beispiel 3 Radioimmunologische Bestimmung von Östradiol
östradiol wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei jedoch das
angewandte Antiserum gebildet worden war durch Immunisieren mit
Standard-Kurven
(a) östradiol-6-carbomethoxyoxim-BSA (Miles-Yeda) und
(b) einem Östradiol-Derivat das in 6-Stellung gekuppelt
war (The John Radcliffe Hospital, Oxford).
Antiserum
Verdünnung des
Antiserums
Antiserums
Gesamtimpulse
pro 100 s
pro 100 s
Alter der
Markierung
Markierung
% gebunden
Vergl.
Vergl.
IngE,
2ngE,
| Miles-Yeda | wie geliefert | 8 100 | 23 Tage | 26,9 | 4,0 | - |
| J. Radcliffe | 1/3200 | 14 000 | 30 Tage | 51,5 | 3,0 | 0,5 |
| J. Radcliffe | 1/640 | 140 000 | 31 Tage | 79,6 | 32,7 | 13,1 |
Beispiel 4 Radioimmunologische Bestimmung von Östetrol
östetrol wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei ein Antiserum
verwendet wurde, das gebildet worden war durch Immunisierung mit östriol-6-carbomethoxyoxim-BSA
J5 als spezifisches Reagenz, da ein Antiserum zu Östetro!
nicht verfügbar war.
Standard-Kurven: Gesamtimpulse 132 800 pro 100 s (Alter der Markierung 7 Tage)
Antiserum
Verdünnung des Antiserums
% Bindung
Vergleich
Vergleich
% Bindung in
Gegenwart von
20ngE4
Gegenwart von
20ngE4
A
B
B
1/100
1/100
1/100
11,0
8,1
8,1
Beispiel 5 Analyseneinheit zur radioimmunologischen Bestimmung von östriol (E3)
Die Analysenpackung umfaßt folgendes:
a) 5 Ampullen mit gefriergetrocknetem E3 in Pferdeserum, das beim Rekonstituieren Standardlösungen
der folgenden ungefähren Konzentrationen ergibt: 0,30,80,200 und 400 ng/ml.
1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung
1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung
von J-E3 in Phosphatpuffer (0,3 μ Ci/ml).
c) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 6,5 ml Enzymlösung
zur Hydrolyse von östriolkonjugaten.
d) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung
eines Anti-Östriolserums.
e) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 16 g Ammoniumsulfat (fest).
f) 30 Polystyrol-Röhrchen 55 χ 12 mm (Fassungsvermögen ungefähr 5 ml) zur Verwendung bei der
Enzymhydrolyse,
g) 1 Reagenzglasständer aus Polystyrol,
h) Anleitung zur Durchführung des Verfahrens nach Beispiel 1.
h) Anleitung zur Durchführung des Verfahrens nach Beispiel 1.
Claims (6)
1. Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von östrogenen in einer biologischen
Flüssigkeit, durch Konkurrenzreaktion zwischen dem Ostrogen und einem Radio-Jod-Derivat davon
um ein spezifisches Binde-Reagens für das Östrogen; Abtrennung des gebundenen östrogens und Radio-Jod-Östrogens
von dem nicht-gebundenen östrogen und Radio-Jod-Östrogen und Messung der gebundenen
und/oder ungebundenen Fraktionen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Radio-Jod-Derivat
2-Jod-, 4 Jod- und/oder 2,4-Di-jod- Derivate eines östrogens verwendet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Durchführung der Konkurrenzreaktion
in der Probe vorhandene konjugierte Östrogene hydrolisiert
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Hydrolyse enzymatisch durchführt
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Binde-Reagens
einen Antikörper für das nachzuweisende östrogen verwendet
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Binde-Reagens
einen gegen östrogen-6-carboxymethyloxim-BSA gerichteten Antikörper verwendet
6. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5 zur Bestimmung von östriol.
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