DE2814776C3 - Neue östradiolderivate und diagnostisches Mittel - Google Patents
Neue östradiolderivate und diagnostisches MittelInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue östradiolderivate und ein
diagnostisches Mittel. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind für die Durchführung eines Radioimmunoassays
brauchbar.
Die neuen erfindungsgemäßen östradiolderivate entsprechen der allgemeinen Formel (I):
OH
HO
NOCH2COR
worm R für einen radiojodierten Tyrosinrest, einen radiojodierten Tyrosinniedrigalkylesterrest, dessen Niedrigalkylrest
1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen kann, einen Tyrosinrest oder einen Tyrosinniedrigalkylesterrest,
dessen Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen kann, steht. Erfindungsgemäß kann eine Radioinimunoassay-Methode
(nachfolgend RIA bezeichnet) zur Bestimmung von östradiol unter Verwendung der
Verbindung der Formel I, in der R für einen radiojodierten Tyrosinrest steht, als Tracer, durchgeführt
werden.
1969 wurde von G.E. Abraham zum ersten Mal
Östradiol im Serum mit einer RIA Methode unter Verwendung eines Tritium-markierten östradiols als
Tracer bestimmt (J. CHn. Endocrinol. Metab. Band 29, Seite 866 [1969]). Seit dieser Zeit wurden Untersuchungen
angestellt, um eine RIA-Methode unter Verwendung eines radiojodierten Tracers zu finden, der
einfacher als ein Tritium-markierter Tracer gehandhabt werden kann.
Bisher wurden als Antigen zur Bildung von Antikörpern in Säugern verschiedene Typen von
ίο Konjugaten aus Östradiol mit Rinderserumalbumin
(nachfolgend BSA bezeichnet) verwendet. Zu Beispielen hierzu gehören östradiol-17 0-BSA (B. G. England et al.
J. CHn Endocrinol. Metab. Band 38, S.42-50[1974] und
östradiol-e-iO-carboxymethylJ-oxim-BSA-Konjugat
[nachstehend als Ε,-6-CMO · BSA bezeichnet; E. H. D. Cameron et al. Journal of Steroid Biochemistry, Band 5, Seiten 749-756 [1974]). Von diesen Antigenen kann man vorzugsweise Ei-6-CMO ■ BSA verwenden, da die spezifischen Gruppen frei bleiben (A. E Kellie et al. Steroid Immunoassay, Seiten 35 — 60, herausgegeben von E. H. D. Cameron et al, Alpha Omega Publishing Ltd, Cardiff, Wales, U. K. [1975]).
[nachstehend als Ε,-6-CMO · BSA bezeichnet; E. H. D. Cameron et al. Journal of Steroid Biochemistry, Band 5, Seiten 749-756 [1974]). Von diesen Antigenen kann man vorzugsweise Ei-6-CMO ■ BSA verwenden, da die spezifischen Gruppen frei bleiben (A. E Kellie et al. Steroid Immunoassay, Seiten 35 — 60, herausgegeben von E. H. D. Cameron et al, Alpha Omega Publishing Ltd, Cardiff, Wales, U. K. [1975]).
Es wurde auch von einigen Radioliganden zur Verwendung als Tracer berichtet, beispielsweise von
östradiol-17 /?-hemisuccinyl-radiojodiertem Histamin,
östradiol-3-hemisuccinyl-radiojodiertern Histamin oder
Östradiol-6-(O-caiboxymethyI)-oxim-radiojodiertem
Histamin (England et al. und Cameron et al. loc. cit). Bei der Herstellung eines Jodhistamin-Tracers gelang es jedoch nicht, eine ausreichende Markierungsausbeute zu erreichen. Eine niedrige Radioaktivität eines Tracers zur Verwendung beim RIA ist nicht wünschenswert Zu dem Zeitpunkt, zu dem das östradiol-Histamin-Konjugat markiert wird, neigen die Radiojodatome dazu, am
Histamin (England et al. und Cameron et al. loc. cit). Bei der Herstellung eines Jodhistamin-Tracers gelang es jedoch nicht, eine ausreichende Markierungsausbeute zu erreichen. Eine niedrige Radioaktivität eines Tracers zur Verwendung beim RIA ist nicht wünschenswert Zu dem Zeitpunkt, zu dem das östradiol-Histamin-Konjugat markiert wird, neigen die Radiojodatome dazu, am
}5 Α-Ring des östradiols Substitutionen einzugehen, was
zu einer unerwünschten Beeinflussung der Spezifität des Tracers führt. Es gibt auch einen Vorschlag, radiojodiertes
östradiol-menschliches Serumalbumin als Tracer zu verwenden, jedoch erweist es skJ>
aufgrund seiner geringen Empfindlichkeit nicht als brauchbar (R. Edwards et al. International Atomic Energy Agency
[IAEA-SM-177/25], Seiten 31 -40).
Unter diesen Umständen werden derzeit die RIA's von östradiol lediglich unter Verwendung eines
4■> Tritium-markierten Tracers durchgeführt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Tracer zu schaffen.
Da Tyrosinmethylester (nachfolgend TME bezeichnet) -Derivate des östradiols' nicht beschrieben sind,
jo wurde der östradiol-6-(0-carboxymethyl)-oxim-tyrosinmethylester
(nachfolgend als E2-6-CMO · TME bezeichnet)
hergestellt. Die Eigenschaften seines radiojodierten Derivats wurden untersucht. Es wurde überraschend
festgestellt, daß der radiojodierte östradiol-6-(O-carboxymethyl)-oxim-tyrosinmethylester
(nachfolgend E2-6-CMO · TME-*J bezeichnet) mit Serumextrakten,
die vom Antikörper des Östradiois verschieden sind, nicht-spezifische Bindungen bildet. Nach ausführlichen
Untersuchungen wurde überraschenderweise auch als neues Phänomen festgestellt, daß zwischen östradiol-6-(0-carboxymethyl)-oxim-radiojodiertcm
Tyrosin (nachfolgend E2-6-CMO ■ T'r'J bezeichnet) und Serumextrakt
nur in geringem Maße Bindungen gebildet werden, und daß der Radioligand spezifisch mit dem
durch E2-6-CMO ■ BSA hervorgerufenen Antikörper
reagiert. Dies ergibt sich aus dem nachfolgenden
Experiment.
Man extrahiert menschliche Serumoroben (0.1 ml und
0,2 ml) mit Diäthyläther. Nach dem Entfernen des
Äthers durch Eindampfen löst man den Rückstand in 0,5 ml Phosphatpuffer. Man gibt ungefähr 0,02 μ Ci an
Erö-CMO - TME-125J zur obigen Lösung, sowie 0,5 ml
Phosphatpuffer als Kontrolle zu. Nach dem Inkubieren bei Raumtemperatur während 60 bis 90 Minuten gibt
man zur Mischung Anti-Kaninchen-Gammaglobulin-
Ziegenserum (zweiter Antikörper) zu. Man läßt die
erhaltene Mischung über Nacht bei 4°C stehen und
zählt dann nach der Abtrennung die Radioaktivität der Präzipita'.e (Zählung A). Hiervon getrennt gibt man
ungefähr 0,02 μ Ci an Ej-6-CMO · T-133J und Er6-CMO
· TME-125J jeweils in ein Reagenzglas und zählt
die Radioaktivität (Zählung B).
Man berechnet das Verhältnis »nicht-spezifisch gebunden« aus der nachfolgenden Gleichung. Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Verhältnis nichtspezifisch gebunden ("■
Tabelle
Zählung A
Zahluna B
Zahluna B
Verhältnis nichtspezifisch gebunden (%)
Ε,-6-CMC
-TME-125J
Ε,-6-CMO
T-125J
T-125J
Phosphatpufler (Kontrolle) 443 1,90
Extrakt aus 0,1 ml Serum 18,73 1,37
Extrakt aus 0,2 ml Serum 41,90 U57
Aus den Werten ergibt sich, daß das E2-6-CMO · TME-125J mit einigen Serumkomponenten vie!
Präzipitat bildet, während die Menge an nicht-spezifisch gebundenem Er6-CMO · T-125J mit Serumkomponen- jo
ten in der gleichen Größenordnung wie bei der Kontrolle liegt, was vernachlässigbar ist Die Werte
zeigen, daß der neue erfindungsgemäße radiojodierte
Tracer mit freiem Tyrosin zur Verwendung beim RIA zur Bestimmung von östradiol im Serum äußerst
geeignet ist
Zur Herstellung des neuen erfindungsgemäßen Tracers können verschiedene Wege eingeschlagen
werden. Diese sind nachstehend schematisch aufgeführt:
E2-O-CMO
E2-O-CMO-TME
E2-O-CMOTME-4J E2-6—CMO T
E2- 6—CMO-T- *J
T-* J
In dem obigen Schema steht T für den Tyrosinrest. *'
bedeutet radioaktives Jod Die anderen Abkürzungen besitzen die vorstehend erläuterten Bedeutungen.
Einige Ausführungsformen zur Herstellung des neuen
erfindungsgemäßen Tracers sind nachstehend beschrieben.
Das in der zuletztgenannten Druckschrift beschriebene Ausgangsmaterial wird mit einem Tyrosinniedrigalkylester Umgesetzt. Hierbei wendet man eine allgemeine Arbeitsweise zur Bildung einer Säureamidbindung ~>~>
an. In Bc'rächt kommt hier beispielsweise die gemischte
Anhydriclmethode, die beispielsweise in J. Biol. Chem.
Band 232, Seite 713 (1957) und ibidem, Band 234, Seite 1090 (1(^59) beschrieben ist Man kann auch die
Carbodiihiid-Methode anwenden, Diese ist beispiels- wi
weise in Steroid Immunoassay, Seite 33 ff., loc. cit.
beschrieben. Ebenfalls in Betracht kommt auch die Methode c\e'\ aktivierten Esters. Dann wird das
TyrosinalkyleMerderivat hydrolysiert. Das erhaltene E;-6-CMO ■ T kann in bekannter Weise radiojodiert tr>
werden. Hier/u kann man beispielsweise die Chloramin-T-Methode anwenden (Nature Band 194, Seite 494
[1962]), wobei man den gewünschten Tracer erhall.
Bei einem anderen Herstellungsweg wird E2-6-CMO · TME mit radioaktivem Jod markiert, und das
radiojodierte Produkt wird dann hydrolysiert, wobei man E2-6-CMO · T-*J erhält. Man kann den erfindungsgemäßen
Tracer auch herstellen, indem man E2-CMO mit radiojodiertem Tyrosin konjugiert, wie dies im
obigen Schema gezeigt ist. Als radioaktives Jod kann mar 121J und 131J verwenden, jedoch ist wegen seiner
Halbwertzeit das 125J besonders brauchbar.
Andere durch die allgemeine Formel dargestellte Substanzen, wie beispielsweise E2-6-CMO ■ TME, dereri
radiojodierte Verbindung und E2-6-COM · T sind als Zwischenprodukte zur Herstellung des gewünschten
Tracers brauchbar. Was die zuvor genannten Esterreste anbetrifft, so kann man auch andere niedrige Alkylgruppen,
beispielsweise die Äthylgruppe, verwenden. Üblichere '-ist· gebraucht man die Methylgruppe.
Zur Bestimmung von östradiol im Serum kann man eine bekannte Arbeitsvorschrift des RIA anwenden,
beispielsweise Absorptionsmethoden unter Verwendung von Dextran-überzogener Aktivkohle, Florisil.
lonenaustauscherharzen u. dgl., sowie nicht-spezifische Präzipitationsmethoden (oder Gammaglobulin-Präzipi-
tationsmethoden) unter Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat. Polyäthylenglycol. Äthanol u.dgl.,
Festphasenmethoden, doppelte Antikörper-Methoden u. dgl., wie dies beispielsweise in Anal. Lett. 5, 757(1972).
ibidem. 5, 767 (1972), im Journal of Analytical Endocrinology and Metabolism 35. 219 (ll)72) von G. E.
Abraham »Radioimmuroassay of Plasma Steroid Hormones« in Modem Methods of Steroid Analysis.
Kapitel 21, Academic Press, New York und London (1973), The Japanese Journal of Nuclear Medicine 12.
123(1975). in Clinica Chimica Acta. 66. 319- 330 (1976).
in Clinical and Crinology (Tokyo) 24, 339 (1976), in
Steroid Immunoassay E. H. D. Cameron. Ed. Alpha Omega Publishing Ltd., Cardiff, Wales U.K. (1975),
beschrieben ist. Beispielsweise löst man einen Ätherextrakt aus dem Serum oder dem entfetteten Serum in
Phosphatpuffer und führt die Untersuchung durch. Daneben bereitet man Standardlösungen durch Auflösen
von östradiol in Phosphatpuffer. Man gibt zu jeder der Proben und Standardlösungen eine geeignete
Menge des Tracers und des Antiserums auf Östradiol. Anschließend inkubiert man die Mischungen bei
Raumtemperatur 60 bis 90 Minuten lang, oder bei 35 bis 40°C 15 Minuten lang. Dann gibt man den zweiten
Antikörper zur Mischung zu und läßt bei 4°C über Nacht stehen. Anschließend wird bei 2000 G 15 Minuten
lang zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Die Radioaktivität der Präzipitate einer
jeden Probe oder einer jeden Standardlösung wird gezählt. Man zeichnet die Standardkurve und kann die
Menge an östradiol in den Proben aus der Kurve ablesen.
Als Antiserum ist Anti-E.j-6-CMO · BSA bevorzugt.
Es kann in Tieren verschiedener Spezies, wie Ratten, Meerschweinchen. Ziegen oder Schafen gebildet werden.
Die übliche Methode zur Bildung von Antikörpern ist hier anwendbar. Die Methode ist beispielsweise in
Steroids. Band 23. Seite 49 (1974) oder in Steroid Immunoassay. Seite 87, 1975) oder in anderen
vorstehend erwähnten Publikationen beschrieben. In einigen Fällen ist der zv/eite Antikörper im Handel
ernaitncn. t.r kann je nacn der Art aes ersten
Antikörpers gewählt werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Herstellungsweisen des neuen erfindungsgemäßen
Tracers, des Antikörpers und der Bestimmung des Östradiols im Serum.
B e i s ρ i e I 1
Man löst 36 mg Ej-CMO in 1.7 ml Dioxan. Zur Lösung
gibt man 50 μΐ Tri-n-butylamin. Nach Zugabe von 13 μΐ
Isobutylchlorcarbonat rührt man die Mischung 15 Minuten lang bei einer Temperatur unterhalb von 10°C.
Zur erhaltenen Mischung gibt man 3 ml Dioxanlösung des 1-Tyrosinmethylesters (6,7 mg/ml) zu und rührt die
Mischung eine Stunde lang. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen gibt man 10 ml
0,1 n-Chlorwasserstoffsäure zu. Dann wird die Mischung mit 10 ml Äthylacetat extrahiert Man entfernt to
das Lösungsmittel durch Eindampfen und löst den Rückstand in einer kleinen Menge Methanol und führt
eine Dünnschichtchromatographie auf Silicagel durch, wobei man mit einer Mischung aus Äthylacetat. Benzol,
Äthanol und Essigsäure (30:30:10:03 Volumina) t>5
entwickelt. Die Substanz entwickelt bei einem Rf von 0,55. Sie wird gesammelt und mit Äthanol extrahiert.
Nach dem Entfernen des Äthanols durch Eindampfen erhält man 26 mg E2-6-CMO · TME in Form eines
weißen bis blaß gelben Pulvers.
Man löst 5 μg E2-CMO · TME in 10 μΙ 0,45 m
Phosphatpuffer (pH 7,2) auf. Nach Zugabe von 2.5 bis 4,OmCi Na'"J und 100 (ig Chloramin T wird die
Reaktion ungefähr eine Minute lang durchgeführt und dann durch Zugabe von 100 \ig Natriummetabisulfit
unterbrochen. Das Produkt (E2-O-CMOTME-12M)
wird auf Silicagel dünnschich(Chromatographien, wobei man mit demselben I^ösungsmittelsystem wie in
Beispiel 1 entwickelt. Die Substanz entwickelt bei einem Rf von 0,6. Man sammelt sie und extrahiert mit Äthanol.
Das Äthanol wird durch Eindampfen entfernt und der Rückstand wird in 03 ml I n-Natriumhydroxyd gelöst.
Man hydrolysiert den Ester 15 Minuten lang hpi
Raumtemperatur. Nach Zugabe von 03 ml 2n-Phos·
phorsäure wird das erhaltene E2-6CMO - T-125J mit
Diethylether extrahiert. Die Hauptmenge des Lösungsmittels wird verdampft und der Rückstand wird auf
Silicagel dünnschichtchromatogrrphiert, wobei man mit
demselben Lösungsmittelsystcm wie zuvor entwickelt. Die Substanz mit Rf 0,2 wird gesammelt und mit
Äthanol extrahiert Dann verdampft man das Äthanol. Der Rückstand wird in 0,01 -m Phosphatpuffer (pH 7,2)
aufgelöst und zur Verwendung beim RIA gelagert. Man erhält 1 bis 1,5 mCi Ej-6-CMO · T-'"J mit 350 bis
500 mCi/mg spezifischer Aktivität
Man löst 5 μg E2-6-CMO · TME in 0,3 ml 1 n-Natriumhydroxid
auf. Die Hydrolyse wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei man E2-6-CMO
· T erhält Nach Zusatz von 03 ml 2 n-Phosphorsäure wird das Produkt mit Diethylether extrahiert.
Nach dem Entfernen der Hauptmenge des Lösungsmittels durch Verdampfen wird der Rückstand auf dieselbe
Weise wie in Beispiel 1 beschrieben dünnschichtchromatographiert
Die bei Rf 0,6 entwickelte Substanz wird gesammelt und mit Äthanol extrahiert Dann entfernt
man das Äthanol durch Verdampfen. Nach der Zugabe von 10 μΙ 0,45-m Phosphatpuffer (pH 72), 2,5 bis 4,0 mCi
Na123J und ICK^g Chloramin T wird die Reaktion
ungefähr 1 Minute lang durchgeführt und durch Zugabe von 100 μg Natriummetabisulfit unterbrochen. Die
Dünnschichtchromatographie auf Silicagel wi: J auf dieselbe Weise wie zuvor durchgeführt. Dann sammelt
man die Substanz mit Rf 0,2 und extrahiert mit Äthanol. Das Äthanol wird durch Eindampfen entfernt Der
erhaltene Radiologand wird in 0,01 -m Phosphatpuffer (pH 72) gelöst und zur Verwendung beim RIA gelagert.
Man erhält 1,5 bis 3 mCi E2-6-CMO - T-1^J mit
350 - 500 mCi/mg spezifischer Aktivität
Zu einer Lösung von 5 ug Tyrosin, gelöst in 10 μΙ
0,45 m Phosphatpuffer (pH 72) gibt man 2,5 bis 4,0 mCi Na125J und ΙΟΟμβ Chloramin T zu. Man führt die
Reaktion 1 Minute lang durch und unierbricht dann durch Zugabe von 100μ£ Natriummetabisulfit Man
erhält radiojodiertes Tyrosin (T-125J).
Man vereinigt Dioxanlösungen von ΙΟμΙ E2-CMO
(I mg/ml). 5 μΙ Tri-n-butylamin (I ng/ml) und 5 μΙ
Isobutylchlorcarbonal (0,5 μΙ/ml) und führt die Reaktion
3 Minuten lang bei einer Temperatur unterhalb von 10cC durch. Zur Reaktionsmischung gibt man das wie
zuvor beschrieben erhaltene T-125J und führt die
Reaktion 15 Minuten lang durch, wobei man ErCMO · T-'r>) erhält. Man extrahiert das Produkt mit
AtK. acetal und führt auf dieselbe Weise wie in Beispiel I beschrieben eine Dünnschichtchromatographie
durch. Die bei Rf 0,2 entwickelte Substanz wird gesammelt und mit Äthanol extrahiert. Man entfernt das
Äthanol durch Eindampfen und löst den erhaltenen Radioliganden in 0,01-rrr Phosphatpufferlösung (pH 7,2)
auf und lagert zur späteren Verwendung beim RIA. Man erhält 0.3 bis 0,8 mCi E2-O-CMO-T-1^J mit
350-500 mCi/mg spezifischer Aktivität.
Beispiel 5
(Antikörperbildung)
(Antikörperbildung)
Man löst 140 mg BSA in 2 ml destilliertem Wasser und gibt zur Lösung 0,144 ml I n-Natriumhydroxyd zu.
Nachdem Abkühlen auf 00C gibt man zur Reaktionsmischung
2,5 ml Tetrahydrofuran und lagert die Mischung (Lösung A) bei 0 bis 4nC.
Man löst 43 mg E2-6-CMO in 2 ml Tetrahydrofuran. Nach Zugabe von 31,5 μΙ Tri-n-butylamin wird die
Mischung auf 0°C abgekühlt. Zur Mischung gibt man 16,6 μΙ Isobutylchlorcarbonat und führt die Reaktion 30
Minuten lang bei 00C durch (Lösung B).
N .an gibt Lösung B zur Lösung A und läßt 4 Stunden
reagieren, wobei man den pH mit 1 n-Natriumhydroxyd auf einen Wert zwischen 6,4 und 6,8 einstellt. Die
erhaltene Lösung wird gegen fließendes Wasser dialysiert, wobei man E2-6-CMO ■ BSA erhält.
Man löst in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung 500 μg des wie zuvor beschrieben erhaltenen BSA-Konjugats.
Die Lösung wird mit einem gleichen Volumen vollständigem Freudschem Adjuvans emulgiert und
intradermal oder subcutan an vielen Stellen (40 bis 50 Stellen) einem Kaninchen injiziert. Einen Monat nach
der Injektion wird eine narhfnlgpnHo A'jifriichürigsirr.p
fung auf dieselbe Weise durchgeführt, und 10 bis 14 Tage nach der Auffrischungsimpfung wird Blut aus der
Ohrvene entnommen. Man trennt das Serum durch Fraktionieren ab und erhält das Antiserum.
Beispiel 6
(RIA von Östradiol)
(RIA von Östradiol)
Aus 5 — 120 μΙ der Serumprobe extrahiert man das
östradiol mit Diethylether. Nach der Entfernung des Äthers wird der Rückstand in 0,5 ml 0,01 -m Phosphatpuffer
(pH 7,2) gelöst und mit ungefähr 0,02 \iC\ Tracer
(E2-6-CMO-T-'"J) und 0,1 ml in Beispiel 5 erhaltenem
Rattenantiserum (auf ungefähr 20 000 verdünnt) ver-
1» mischt. Man inkubiert die Mischung ungefähr 15 Minuten lang bei 35 bis 400C. Zur Mischung gibt man
0.1 ml Antikaninchen-Gammaglobulin-Ziegenserum (zweiter Antikörper, auf ungefähr 7 verdünnt) zu und
läßt die Mischung bei 4°C über Nacht stehen. Es
π entstehen weiße Präzipitate. Diese werden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 2000G unter Entfernung
der überstehenden Flüssigkeit entfernt. Man zählt die Radioaktivität der Präzipitate und liest die Menge an
Östradiol aus der Standardkurve ab.
-ν» F i g. 1 zeigt die Standardkurve von östradiol. Die
Mengen an östradiol in der Serumprobe sind in F i g. 2 dargestellt.
y, Aus 5 — 500 μΙ Serumprobe extrahiert man das
Östradiol mit Diäthyläther. Nach dem Entfernen des Äthers gibt man 0,4 ml 50%iges Methanol und 1 ml
η-Hexan zum Rückstand. Man rührt die Mischung heftig und entfernt die n-Hexanschicht durch Absaugen. Dann
in gibt man weitere 2 ml η-Hexan zur erhaltenen Mischung
zu und entfernt die n-Hexanschicht wiederum durch Absaugen. Nach dem Entfernen des Methanols durch
Eindampfen gibt man 0,5 ml 0,01-m Phosphatpuffer (pH 7,2), ungefähr 0,02 u.Ci des Tracers (E2-6-CMO · T-
ji 125J) und 0,1ml Kaninchenantiserum, in Beispiel 5
hergestellt (auf ungefähr 20 000 verdünnt) zum Rückstand und inkubiert die Mischung 1 Stunde bei
Raumtemperatur oder 15 Minuten bei 35 bis 40°C. Zur erhaltenen Mischung gibt man 1 ml Antikaninchen-
4(i Gammaglobulin-Ziegenserum (zweiter Antikörper, auf
ungefähr 7 verdünnt) zu und läßt die Mischung bei 4°C
werden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 2000G gesammelt. Ihre Radioaktivität wird bestimmt. Die
4) Mengen an Östradiol in den Serumproben werden aus
der Standardkurve abgelesen und in F i g. 3 aufgetragen.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
Claims (6)
- Patentansprüche:l.östradiolderivate der allgemeinen Formel I:
OHHONOCH1CORworin R für einen Tyrosinrest, einen Tyrosinniedrigalkylesterrest, dessen Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, einen radiojodierten Tyrosinrest oder einen radiojodierten Tyrosinniedrigalkylesterrest, dessen Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, steht. - 2. östradiol-6-(O-carboxymethyl)-oxim-radiojodiertes Tyrosin.
- 3. östradiol-6-(0-carboxymethyl)-oxim-radiojodierter Tyrosinniedrigalkylester, dessen Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist.
- 't.Östradiol-e-iO-carboxymethylJ-oxim-tyrosin.
- 5. Östradiol-6-(0-carboxymethyl)-oxim-tyrosinniedrigalkylester, dessen Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist.
- 6. DiagnojMsches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung nach Anspruch 2 in einem üblichen Träger, gegebenenfalls zusammen mit anderen Adjuvantien, enthalt.
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1978
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