DE2526984C3 - Digoxin- und Digitoxinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Bestimmung von Digoxin und Digitoxin - Google Patents

Description

-NH · CHY · (CH₂)_mQ
Yein Wasserstoffatom oder die Gruppe -COOR²,

•\/· oder *CH

OH NH CH

m=0, 1, Z 3,4 oder 5, R² ein Wasserstoffatom, eine Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet und Q mit ¹²³J an einer oder mehreren der angegebenen Stellen markiert oder nicht-markiert ist und eine der folgenden Formeln besitzt:

N oaer HO

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Digoxin oder Digitoxin zu dem Dialdehyd oxidiert,

b) den Dialdehyd mit O-Carboxymethoxylamin der Formel NH₂ · 0(CH₂)COOH unter Bildung des Di-O-carboxymethyloxiderivats umsetzt, gegebenenfalls

c) das entstandene Oximderivat unter Bildung einer Peptidbindung in Gegenwart eines N₁N'-

substituierten Carbodiimids mit einem Amin der Formel NH₂ · CHY · (CH₂JmQ, in der Y, m und Q die oben angegebene Bedeutung haben, unter Bildung eines Aminkonjugates, umsetzt, und gegebenenfalls
d) dieses Aminkonjugat radioaktiv jodiert.

3. Verwendung eines radioaktiv-markierten Digoxins oder Digiioxins nach Anspruch 1 für radioaktive Konkurrenzreaktiof:en zur Bestimmung von Digoxin oder Digitoxin.

Die Herzglycoside (Digoxin und Digitoxin) werden verbreitet zur Therapie bestimmter Störungen des Herzrhythmus angewandt. Die Dosis muß sorgfältig überwacht werden, da Mengen über denjenigen, die eine optimale therapeutische Wirkung ergeben, stark toxisch sein können. Es hat sich gezeigt, daß die genaue Messung der Herzglycoside in Serum oder Plasma am günstigsten durch radiochemische Bestimmungen durchgeführt wird. Smith et al. (New England Jorunal of Medicine Bd. 281, Seiten 1212-1216 (1969) haben ein Verfahren zur Bestimmung von Digoxingehalten in Serum mit Hilfe von ³H-Digoxin angegeben. Durch die Anwendung jodierter Herzglycoside werden jedoch die Probleme vermieden, die bei der Flüssigkeits-Szintillationszählung von ^JH-Verbindungen auftreten. Außerdem erfordert die verhältnismäßig geringe spezifische Aktivität von ³H=Herzglycosiden große Probenvolumi· na und längere Zählzeiten, um die erforderliche Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Untersuchung zu erreichen.

b', In den DE-OS 21 42 421, 21 42 422 und 23 31 922 sind Derivate von verschiedenen Herzglycosiden beschrieben, die radioaktiv markiert sein können und daher zur Bestimmung der entsprechenden Glycoside angewandt

werden können. Diese Derivate, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden können, besitzen jeweils nur einen phenolischen Rest, der mit radioaktivem Jod markiert werden kann.

Es ist Aulgabe der vorliegenden Erfindung, Derivate von Herzglycosiden sowie Verfahren zu deren Herstellung zu entwickeln, bei denen es möglich ist, eine größere Menge radioaktives Jod¹³⁵ in das Molekül einzuführen, um eine höhere Zählrate je Molekül bei der radioimmunologischen Bestimmung zu erzielen. Dadurch würde sich die Reproduzierbarkeit der Zählung in einer gegebenen Zählzeit erhöhen. Darüber hinaus könnte mit derartigen Verbindungen eine längere brauchbare Lebenszeit der radioaktiv markierten Substanzen erreicht werden. ·

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Verbindungen der Formel

(V)

in der Z=NO(CH₂) -CO-R' bedeutet, X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R¹ eine Hydroxygruppe oder eine Gruppe -NH · CHY · (CH₂)_mQ, Y ein Wasserstoffatom oder die Gruppe -COOR², m=0, 1, 2, 3, 4 oder 5, JV ein Wasserstoffatom, eine Methyl-

oder

*CH

oder Äthylgruppe bedeutet und Q mit ¹³⁵J an einer oder mehreren der angegebenen Stellen markiert oder nicht-markiert ist und eine der folgenden Formeln besitzt:

oder HO

NH

und das Symbol * die mögliche Stellung angibt, in der die Verbindung durch ein oder mehrere radioaktive Jodatome markiert sein kann.

Wenn X eine Hydroxylgruppe ist, sind die Verbindungen Derivate von Digoxin und wenn X ein Wasserstoffatom ist handelt es sich um Derivate von Digitoxin.

Wenn R eine Hydroxygruppe ist, sind die Verbindungen neue Zwischenprodukte zur Herstellung der gewünschten radiojodierten Derivate. Sie können hergestellt werden, indem man

a) Digoxin oder Digitoxin zu dem Dialdehyd oxidiert, zum Beispiel mit Hilfe von Natriumperjodat und

b) den Dialdehyd mit O-Carboxymethoxylamin der

Formel NH₂ · 0(CH₂) - COOH unter Bildung des Di-O-carboxymethyloximderivats umsetzt.

Das entstehende Oximderivat kann umgesetzt werden unter Bildung einer Peptidbindung mit irgendeinem von vielen Aminen einschließlich Aminosäuren. Wenn das Amin einen Phenol- oder Imidazolring besitzt, kann

->o das Produkt leicht radiojodiert werden, zum Beispiel mit Hilfe von Natriumjodid und Chloramin-T, um das gewünschte markierte Derivat von Digoxin oder Digitoxin zu erhalten. Vorausgesetzt, daß es einen Phenol- oder Imidazolring besitzt, ist die Art des Amins

-,5 erfindungsgemäß nicht kritisch. Zum Beispiel kann eines der folgenden Amine angewandt werden:

Histamin

Histidin

llistidin-äthyl-ester

-H 1

-COOH I

-COOCjM₅ I

CH

NH CII

Fortsei/ting

Tyrosin — COOH

Tyrosin-methyl-ester —COOCH₃

-(4-Hydroxyphenyl )-äihylumin — H

Die Reaktion kann durch das folgende Schema verdeutlicht werden, wobei D Digoxigenin(oder Digitoxigeninjdidigitoxosid bedeutet.

CH

CH₃

mit radioaktivem Jod markiertes
Kcnjugat

Reaktion 4

Die einzelnen Reaktionen des bevorzugten erfin- 60 Oxidation üblicherweise in Wasser durchgeführt, sie

dungsgemäßen Verfahrens laufen folgendermaßen ab: läuft jedoch auch leicht in wäßrigen Äthanol- oder

_R . wäßrigen Dioxanlösungen ab. wenn wasserunlösliche

Verbindungen oxidiert werden sollen. Die Reaktion

Die Oxidation von Digoxin (oder Digitoxin) zu dem wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt

Dialdehyd wird mit Natriumperjodat durchgeführt. Das ^ und kann unter Lichteinwirkung durchgeführt werden.

Reagens spaltet 1,2-Glykole und ein Molekül Perjodat Im Falle von Difoxin (oder Digitoxin) ist die Reaktion

wird für jedes Paar benachbarter Alkoholgruppen innerhalb von 30 min unter diesen Bedingungen

verbraucht. In der Kohlenhydratchemie wird die vollständig abgelaufen. Es wird angenommen, daß das

Produkt der Oxidation der Dialdehyd ist. obwohl es in Lösung der Dialdehyd im Gleichgewicht mit dem Analogie mit den Arbeiten von Guthrie und Honeyman Hemialdal vorliegt: (J. Chem. Soc. 2319 [1959]) auch möglich ist. daß in

Cl
Il j.

v/l

-(K

CII,
C

Der Dialdehyd wird mit Äthylacetat extrahiert und das Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt, wobei ein weißer Rückstand verbleibt.

Reaktion 2

Der Didluchyu WiTu fioriuCiTifCri ίτϊϊΐ *.^ CsriyGxyrrictn oxylamin unter Bildung des DiO-carboxymethyloxims {möglicherweise zusammen mit etwas Monooxim).

Oxime werden üblicherweise hergestellt durch Erwärmen der Carbonylverbindung in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung mit einer wäßrigen Lösung, die hergestellt worden ist aus Hydroxylamin oder einem Derivat davon und einem Moläquivalent Natriumhydroxid. Natriumcarbonat oder Natriumacetat. Unter diesen Bedingungen scheidet sich oft das Oxim ab. Wahlweise wird die Oximinierung in Gegenwart von mehr als zwei Mol wäßrigem Alkali durchgeführt. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß der Dialdehvd in schwachem Alkali bei Raumtemperatur sehr instabil ist. Zum Beispiel wird der Dialdehyd in wäßrigen Äthanollösungen, die mit Kaliumcarbonat auf einem pH-Wert von 9 gebracht worden sind, quantitativ zu einer Verbindung umgewandelt, die einen niedrigeren Rr-Wert besitzt (Dünnschichtchromatographie auf Silicagel in CHCh : Methanol 9:1). die keine reaktionsfähige Carbonylgruppe mehr enthält (das heißt, die kein Oxim mehr bildet). Daher ist es zur Bildung des Oxims '.on Digoxin oder Digitoxindialdehyd im allgemeinen bevorzugt bei einem pH-Wert unter 9 zu arbeiten.

Im allgemeinen hängt die Ausbeute an dem Oximderivat eines Steroids ab von dem Ausgangsmolverhältni? von O-Carboxymethyloxim zu Steroid. Es konnten Reaktionsausbeuten von nahezu 100% mit emem Molverhältnis von ungefähr 5 erzielt werden.

Reaktion 3

Diese Stufe umfaßt die Bildung einer Peptidbindung zwischen Carbonsäuregruppen des O-Carboxymethyloxims und den Aminogruppen des oben erwähnten Amins oder Aminsäurerestes. Eine leichte Herstellung eines Peptidderivats kann erreicht werden durch Einwirkung von einem Äquivalent eines N,N"-substituierten Carbodiimids auf eine Lösung, enthaltend ein Äquivalent einer Aminoverbindung oder ein Äquivalent einer Carbonsäure. Wenn das Säuresalz der Aminosäure angewandt wird, wird außerdem ein Äquivalent einer tertiären Base zugesetzt Die Reaktion läuft unter Bildung eines Äquivalents eines N'.N'-disubstituierten Harnstoffderivates ab, das aus der Lösung ausfallen kann oder nicht ausfällt je nach der Art des angewandten N.N'-disubstituierten Carbodiimids und der Art des für die Reaktion angewandten Lösungsmittels. Die Bildung der Peptidbindung wird üblicherweise bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 28^CC ^XO —C

/
HO

durchgeführt und zwar in einem inerten organischen ι", Lösungsmittel, obwohl wäßrige Gemische ebenfalls angewandt werden können.

Bei der üblichen Herstellung wird Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensationsmittel angewandt, obwohl verschiedene der neuerer! Carbodiimide Hj** t^rtiärp j» oder quaternäre Aminsubstituenten enthalten, ebenfalls angewandt werden können, wie l-Cyclohexyl-3-(morpholinyläthylj-carbodiimid, sein Metho-p-toluolsulfonat-Derivat und l-Äthyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.

Reaktion 4

Das Radiojodierungsverfahren beruht auf einem Verfahr!·.; ähnlich dem von Greenwood. Hunter und Glover. Biochemical Journal 89 114 [1963]) beschriebein nen.

Die Oxidation des Na¹²M wird mit Chloromin T erreicht. Die Menge von Chlorotnin T muß ausreichen, um die geringe Menge Reduktionsmittel zu neutralisieren, die in dem Na¹²⁵J vorhanden ist sowie das J- zu π oxidieren. Die Jodierung wird im allgemeinen in einem geringen Volumen (ungefähr 0.2 ml Endvolumen) 0.1 bis 0.5 m Borat- oder Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 8,5 bei 0 bis 28" C durchgeführt. Man läßt die Reaktion 1 bis 10 min ablaufen und gibt jo anschließend einen Überschuß an Natriummetabisulfit zu, um die Reaktion abzubrechen.

Das J'²⁵-Antigen wird nach der Jodierung gereinigt, um freies Jod und andere Reaktionspartner zu entfernen. Die Reinigung kann durch lonenaustauscher-4Ί Gel-Filtration mit Hilfe eines Molekularsiebes wie Sephadex G 25 und/oder Dünnschichtchromatographie über Silicagel durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Durchführung einer radioimmunologischen Konkur-3(i renzbestimmung von Digoxin oder Digitoxin. wobei man

a) das Digoxin oder Digitoxin mit einer Standardmenge radioaktivmarkiertem Digoxin oder Digitoxin um die Reaktion mit einem spezifischen Reagens dafür in Konkurrenz treten läßt, das in einer Standardmenge vorhanden ist die nicht ausreicht, um die gesamte markierte und nicht-markierte Verbindung zu binden;

en b) die gebundene Verbindung von der nicht-gebundenen abtrennt und

c) den Anteil der Radioaktivität in der gebundenen und/oder der nicht-gebundenen Verbindung bestimmt Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet daß man als radioaktivmarkiertes Digoxin oder Digitoxin ein Aminkonjugat eines Digoxin- oder Digitoxindialdehyd-bis-O-carboxyalkyloxims wie oben angegeben verwendet

Die Hrfindung wird durch die folgenden Heispiele näher erläutert:

Beispiel 1
Herstellung von Digoxin-TMF. markiert mit ^ι:ί|

Da sich Digoxin und Digitoxin nur durch eine OH-Gruppe an dem C12-Atom des Steroidteils des Nf Jeküls unterscheiden, erscheint es nicht erforderlich, zusätzlich ein Beispiel für die Herstellung von markiertem Digitoxin anzugeben. Tyrosinmeihylester-(TMF.)-Konjugate von Digoxindialcehyd-nis-O-carboxymethyloxim und Digitoxindin Idchyd-bis-O-carboxy methyloxini wurden lecloch hergestellt. Die von einer Probe des zuletzt genannten Derivates erhaltenen NMR-Daten. die die allgemeine Struktur dieser Verbindungen bestätigen, sind unten angegeben.

218 mg Digoxin wurden in I 2 ml siedendem 78'Voigem ■Vhanol gelöst. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur itugcMiiin Uhu ii-t rng ιTi a! r ;;;m pe r jog;; ; :r, ; :;;! Wasser zugegeben. Die Lösung wurde JO min bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend 0,3 ml Athylenglykol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein kleines Volumen (ungefähr 5 ml) eingedampft und mit Wasser auf 15 ml ergänzt. Die Lösung wurde dreimal mit 15 ml Äthylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Schichten erneut mit Wasser gewaschen. Der Auszug wurde nahezu zur Trockne im Rotationsverdampfer bei 30^cC eingedampft und schließlich nach Zugabe von Diethylether vollständig zur Trockne gebracht, wobei ein weißer Feststoff entstand. Das ! ,odukt wurde durch Dünnschichtchromatographie über Silicagel entwickelt mit Chloroform : Methanol 9 : 1 (System A) analysiert. Die Verbindung wurde (durch Verbrennen) mit Schwefelsäure sichtbar gemacht. Es wurde ein einziger Punkt mit einem Ri-Wert von 0.54 beobachtet.

273 mg Carboxymethoxylamin-hemihydrochlorid und 250 mg Natriumacetat wurden in 1.2 ml destilliertem Wasser gelöst. 196 mg mit Perjodat gespaltenes Digoxin in 7,6 ml Äthanol wurden zu dieser Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde I π unter Rückfluß erhitzt und dann auf ungefähr 0,5 ml eingeengt. Das Volumen wurde mit Waser auf 5 ml gebracht und die Lösung viermal mit 5 ml Äthjlacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden wieder mit Wasser gewaschen. Der Auszug wurde bei 30⁰C nahezu zur Trockne eingedampft und schließlich nach Zugabe von Diethylether vollständig zur Trockne gebracht. Die Analyse des Reaktionsproduktes durch Dünnschichtchromatographie über Silicagel und Entwicke. ι mit dem System A zeigte eine vollständige Umsetzung des Dialdehyds unter Bildung eines Produktes das am Ausgangspunkt blieb. Das Oxim besaß einen Rf-Wert von 0,16 nach der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel. entwickelt mit Chloroform : Aceton : Essigsäure 7:2:1.

180 mg des Di-carboxymethyloxims wurden in einem Gemisch von 3,6 ml Dioxan und 036 ml Wasser gelöst das 91 mg TME-Hydrochlorid, 81 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 75 mg Tri-n-butylamin enthielt. Die Lösung wurde 24 h auf 4⁰C gehalten. Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel in System A zeigte sich ein Hauptprodukt mit einem Rf-Wert von 058 (Digoxin besaß einen R_F-Wert von 039 in diesem System) das sowohl durch (Verbrennen mit) Schwefelsäure als auch durch Farbreaktionen mit Eisen(III)-chlorid sichtbar gemacht wurde.

Nach prä'parativer Diinnschichtehromatographie auf 1.0 mm Silicagelplatten. die mit System A entwickelt wurden, wurde der Anteil entsprechend dem TM F.-Derivat mit Äthylacetai extrahiert. Das Lösungsmittel wurde bei 30"C abgedampft. Der amorphe Rückstand erwies sich bei der Dünnschichtchromatographir (Silicagelplatten, Lösungsmittel Methanol !Chloroform, h : 94 [Volumen]) als homogen.

Das NMR-Spektrum des Digitoxinkonjugates zeigte zum Beispiel, daß das Verhältnis von Tyrosinmethylester :Cardenolid in diesen Konjugaten 2 betrug. Das NMR-Spektrum wurde bei einer Frequenz b^i !00 MII/ in CDCIi aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen und Flächeninhalte (integration) stehen in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur (IV in Schema I). Das Verhältnis der Flächeninhalte für die aromatischen Protonen zu denjenigen der olefinischen Protonen (genin) zeigen, daß zwei Tyrosinmethslester reste nro Molekül vorhanden sind

l'roionen	Chemische Verschie	1	Dublett
	bung beobachtet (<>l *	Duhlett
Aromatisch	6.89	Singulctt
Aromatisch	(1.70	Singulett
L ac ton	5.86	Singulett
Methylester	3,74	Singulett
Methylester	3.72
Anguliires CH ;	0,87 und 0.l>l

*i ppm bezogen auf Tetramethylsilan ;ils innerer Standard.

Die Radiojodierung des TME-Konjugates von üigoxin wurde durchgeführt mit trägerfreiem Na'-'^s| in wäßrig-äthanolischer Lösung, enthaltend Chloromin-T. Der pH-Wert der Lösung betrug ungefähr 7.5. Die Reaktionszeit variierte von 1 bis 10 min. Nach Zugabe von überschüssigem Natriumetabisulfit wurde das Reaktionsgemisch auf 0.25 Silicagelplatten in System A Chromatographien. Die radioaktiven Anteile wurden mit Äthylacetat oder Äthanol extrahiert. Das radiojodierte TME-Konjugat wurde bei -20⁰C in 50%ij,em Äthanol aufbewahrt vor der Anwendung als markiertes ' Antigen bei der radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin.

Beispiel 2
Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

Die Bestimmung wurde in Polystyrol- oder Glasrohren unter Anwendung der folgenden Reagentien durchgeführt:

i) 0,05 m Kaliumphosphat-Pu^ffer pH 7.4, enthaltend 0.15 m Natriumchlorid, 0,5% Rinderserumalbumin und 0,01 % Thiomersal. Alle im folgenden angegebenen Reagenzien mit Ausnahme von iv) und v) wurden mit diesem Puffer verdünnt:

ii) Antiserum (Kaninchen) für Digoxin mit einer Verdünnung daß ungefähr 60% des zugegebenen radioaktiven Digoxins gebunden werden;

iii) Digoxintyrosinmethylester-Konjugat markiert mit ¹²⁵J in einer Konzentration von ungefähr 2 ng/ml (zufriedenstellende Bestimmungskurven wurden mit dieser Lösung noch nach 28tägiger Lagerung bei 37° C erhalten);

iv) normales menschliches Serum (digoxinfrei, Null-Standard);

Il

ν) Standard-digoxin in normalem menschlichen Serum in Konzentrationen von 0.5. 1.0, 2.0. 4.0 und 8.0 ng/ml;

vi) Aktivkohle, suspendiert in Phosphat-Puffer, wie oben angegeben;

vii) menschliches Serum, enthaltend unbekannte Konzentrationen an Digoxin.

Die Bestimmung wurde folgendermaßen durchge führt:

Es wurden doppelte Röhrchen vorbereitet für Gesamtproben, Blindproben (die kein Antiserum enthielten), die Standards und Proben des unbekannten Serum. 0.1 ml des Null-Standards wurde in alle Gläschen gegeben. 1.1 ml des Phosphatpuffers wurde zu den Gesamtbestimmungen und 0.1 ml zu der Blindprobe gegeben. 0.1 ml des radioaktivmarkierten Digoxins wurden in alle Gläschen gegeben und anschließend 0.1 ml der Standards und unbekannten Proben in die entsprechenden Gläschen. 0,1 ml Antiserum wurde in alle Gläschen gegeben mit Ausnahme der Gesamtbestimmungen und Blindproben. Alle Gläschen wurden mit Hilft eines Wirbel-Mischers gemischt und JO min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde 1 ml der Aktivkohle-Suspension (magnetisch gerührt) zu allen Gläschen gegeben mit Ausnahme der Gesamtbestim-

mungen. Der Inhalt der Gläschen wurde mit Hilfe eines Wirbel-Mischers vermischt und die Gläschen "> min stehengelassen. A'r'e Gläschen wurden anschließend mil 2000 g 5 min zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten in Polystyrolröhrchen abgegossen. Die Radioaktivität des gebundenen Anteils in der überstehenden Flüssigkeit wurde in einem bekannten -/-Zählrohr gemessen.

Für die Standards erhielt man die folgenden Ergebnisse:

Digovin Konzen	'. K.iriHKiMmtiit
tration (ημ/ml ι	gehunilcn
0	H)
0.5	48
1.0	40
2.0	M).5

8.0

Aus diesen Figuren kann eine Eiehkurve abgeleitet werden, von der die Digoxin-Konzen;r;;tion d :r unbekannten Probe leicht abgelesen werden kann.

Claims (1)

1. Pulentansprüche: Digoxin- bzw. Digitoxinderivate der allgemeinen Formel

   OH

   in der Z = NO(CH₂) -CO-R' bedeutet, X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R¹ eine Hydroxygruppe oder eine Gruppe