DE2720809A1

DE2720809A1 - Radioimmunoassay-reagens und dessen verwendung in einem radioimmunoassay- verfahren

Info

Publication number: DE2720809A1
Application number: DE19772720809
Authority: DE
Inventors: William S Knight; Alan J Polito
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-05-10
Filing date: 1977-05-09
Publication date: 1977-12-01
Also published as: IT1085538B; BE854398A; JPS52136158A; NL7704846A; FR2397426A1; AU2467477A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. Curt Wallach Dipi.-lng. Günther Koch 6 Dipl.-Phys. Dr.TkvoJHaüpach Dipl.-Ing. Raine

D -8000 München 2 ■ Kaufingerstraße 8 · Telefon (0 89) 24 02 75 · Telex 5 29 513 wakai d

Datum: 9. Mai 1977

Unser ZeIdMn:

Bezeichnung: Radioimmunoassay-Reagens und dessen

Verwendung in einem Radioimmunoassay-Verfahren

Anmelder: Beekman Instruments. Inc.

Fullerton, Californien 9263W.St.A.

Vertreter gem„ § 16

PatG Walletch, C, Dipl.-Ing.; Koch, G._f Dipl.-

Ing·; Haibach, T., Dipl.-Phys.Dr.rer.nat.;

Feldkamp R., Dipl.-Ing.; Pat.-Anwälte,

8000 München

Erfinder: Alan J. Politο

2849 Boa Vista Dr.,

Costa Mesa, Californien/USA

Biochemiker

William S. Knight

1600 Del Mar Ave.,

Lagtina Beach, Calif ornien/USA

Biochemiker

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- si -

2720009

Die Erfindung betrifft ein neues Radioimmunoassay-Reagens sowie dessen Verwendung in einem Radioiramunoassay-Verfahr en zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Steroids; die Erfindung betrifft insbesondere eine Imidazolgruppe enthaltende Steroidderivate, die radioaktiv markiert sind, die in Radioimmunoassay (RIA)-Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von analogen, nicht-markierten, nicht-derivatisierten Steroiden verwendet werden können.

125
Die Verwendung von «T-Tracern in Steroid-Immunoassays hat bestimmte Vorteile im Vergleich zu tritiierten Tracern. Abgesehen von dem offensichtlichen Vorteil der höheren spezifischen Aktivität des radiaktiven Jods gegenüber Tritium führen

125

diese ^J-Tracer auch zu einem einfacheren und billigeren Zählsystem (Gamma-Zählung im Gegensatz zur Flüssigkeitsszintil-

1?5 lat ions zäh lung) ο Zur Herstellung von tT-Markierungen, die sich in Steroid-Radioimmunoassay (RIA)-Verfahren eignen, sind bereits zwei Verfahren vorgeschlagen worden. Ein Verfahren besteht darin, daß man Tyrosyl-methylester (TME)-Derivate von Steroiden verwendet, die leicht jodiert werden können (vgl. U. Barbieri, A. Massaglia, M. Zannino und U. Rosa, "J. of Ohromat.", 69, 151 (1972), und A.R. Midgley, G.D. Niswender, V.L. Gay und L.E. Reichert, "Recent Progr. Hormone", 27« 325 (1971)). Ein zweites Verfahren besteht darin, daß man kodierte Steroid-Protein-Bestandteile verwendet, die zur Herstellung von Antiseren verwendet worden sind, und daß man diese kodierten Steroid-Protein-Konjugate als Tracer verwendet (vgl. A.R. Midgley et al., supra, und S.L. Jeffcoate, E.D. Gilby und R. Edwards,"Clinica Chemica Acta", 42, 343 (1973)). A. Massaglia, U. Barbieri und C. Siri-Üpathum berichten in "International J. of Applied Radiation and Isotopes", 24, 4-55 (1973)» über die Synthese, Reinigung und Jodierung von

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Cortisol-21-hemisuccinyl-TME- und Cortisol-3-(0-carboxymethyl)oxim-TME-Derivaten.In dem gleichen Jahr haben R. Mavano, G. Dotti und P. Grosso in "Clinica Chemica Acta", fj7, 167 (1973), auch über die Verwendung von mit ^J markiertem Cortisol-21-hemisuccinyl-TME als Tracer in dem Konkurrenzbindungs-Protein-Assay unter Verwendung von trans-Cortin als Bindungsmittel berichtet. Da die Jodierung eines Östradiol-TME-Derivats zu einer Jodsubstitution in dem A-Ring und infolgedessen zu einem Verlust an Immunoreaktivität des Tracers führt (vgl. P.W. Nars und W. M. Hunter, "J. Endocr.", J2, XLVII (1973), und E.D. Gilby, S.L. Jeffcoate und R. Edwards, "J. Endocr.", j>8, XX (1973)), wurde Histamin zuerst jodiert und anschließend unter Anwendung einer gemischten Anhydrid-Synthese an ein östradiol-6-(0-carboxymethyl)oximhapten gekoppelt (vgl. B.F. Erlinger, F. Borek, F.M. Beiser und S. Lieberman, "J. Biol. Chem.", 228, 713 (1957)). Das gleiche gemischte Anhydrid-Syntheseverfahren ist auch bereits zur Herstellung von östradiol-6-(0-carboxymethyl)oxim- «Γ- tyramin-Tracern (vgl. P. Linberg und L.E. Edquist, "Clinica Chemica Acta", 53, 169 (197*0) und von Progesteron-3-(0-carboxymethyl)-oxim- ^J-histamin-Tracern (vgl. J.J. Scarisbrick und E.H.D. Cameron, "J. of Steroid Biochem.", 6, 51 (1975)) für die Verwendung in RIA angewendet worden.

Es wurde nun gefunden, daß anders als bei Tyrosinderivaten, die einen Tracer liefern, der eine geringere Affinität gegenüber den Antiseren aufweist als das nicht-markierte Steroid und auch eine hohe Anzahl von unspezifischen Hintergrund-Zählern in Polystyrol- und Polypropylen-Ampullen, insbesondere in Gegenwart von in der Natur vorkommenden Serumbestandteilen, ergibt, mit Histaminderivaten von Steroiden diese Probleme gelindert werden können und damit markierte Haptene hergestellt werden können, die für die Verwendung in RIA viel besser geeignet sind.

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-έ-

Gegenstand der Erfindung sind noue Radioimmunoassay-Reaf;erifcien mit der folgenden Strukturformel

*HC = C - X- ^Y I I
N

CH

worin der Stern (*) die radioaktive Markierung anzeigt, X irgendeine geeignete Brücke und Y ein Steroid bedeutet. Diene stellen ausgezeichnete Radioimmunoansay-Reagentien für lie Verwendung in Radioimmunoassay-Verfahren dar, weil sich iiese Reagentien spezifisch nur an die gewünschten Antikörper binden, ohne sich unspezifisch an andere Substanzen (?..?·. Proteine in einem Plasma oder Serum eines Patienten und an die Oberflächen von Reaktionsgefäßen) zu binden.

1?^r-> Zu beispielhaften radioaktiven Markierungen gehören "'J und ^J J. Die Radioimmunoaonay-Reagentien der Erfindung sind vor-

125
zugsweise mit .T radiaktiv markiert.

Zu Beispielen für Brücken, die in den erfindungspjemäßen Radioimmunoassay-Reagentien verwendet werden können, gehören (O-Carboxymethyl)hydroxylamin-Brücken (vgl. B.P. F,rl^,np;er, F. Dorek, S.M. Beiser und S. Lieberman, "J. Biol. Chem.", 228, 713 (1957)), eine Bernsteinsäureanhydrid-Brücke (vgl. G.E. Abraham, P.K. Grover, VT.D. Ode 11 und W. Daughaday, "Principles of Competitive Protein Binding Assays", J.P. Lippincott, Philadelphia, Penna., Seite 140 (1971)) und Thioäther-Brücken (vgl. A. V/einstein, H.R. Lindner, A. Friedlander und S. Bauminger, "Steroids", 20 (6), 789 (1972)). 7/enn es erwünscht ist, Histamin über eine Brücke an die 3-Stellung des Steroidringes zu binden, in dem an die 3-Stellung eine Ketogruppe gebunden ist, handelt es sich bei der

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ORIGINAL INSPECTED

Brücke vorzugsweise um eine (O-Carboxymethyl)oxim-Brücke.

Y kann irgendein beliebiges Steroid sein. Die Steroide der Wahl für die erfindungsgemäße Verwendung sind Coxtiaol (Hydrocortison) und Aldosteron. Die mit Histamin hergestellten Steroidderivate werden nicht unspezifisch an andere Substanzen (z.B. Proteine in einem Plasma oder Serum eines Patienten und die Oberflächen von Reaktionagefäßen) gebunden, sie gehen aber spezifische Bindungen mit den gewünschten Antikörpern ein.

In der US-Patentanmeldung Nr. 540 809 ist angegeben, daß angenommen wird, daß die Abnahme der unspezifischen Bindung bei einem Imidazolessigsäurederivat im Vergleich zu einem entsprechenden Digoxinderivat der p-Hydroxypheny!propionsäure auf die polare Natur der Imidazolgruppe im Vergleich zu den unpolaren Eigenschaften der Phenylgruppe zurückzuführen ist. Im Hinblick auf diese Theorie ist es deshalb verständlich, daß die Eigenschaften des Steroids, das über irgendeine geeignete Brücke an einen die Imidazolgruppe enthaltenden Rest (z.B. Imidazolessigsäure, Histamin und dgl.) gebunden ist, unwesentlich ist, da die niedrigen Blindprobenwerte und die geringe Störung durch Albumin bei diesen eineImidazolgruppe enthaltenden Steroidderivaten allein auf die Anwesenheit dieser Imidazolgruppe zurückzuführen ist.

Die den Gegenstand der Erfindung bildenden Radioimmunoassay-Reagentien können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden (vgl. G.E. Abraham, "Acta Endocrinologica", Ergänzungsband 183, Seiten 11 bis 14 (1974)).

Das einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildende Radioimmunoassay (RIA)-Verfahren umfaßt die Anwendung irgendeiner an sich bereits bekannten Radioimmunoassay-Methode, das durchgeführt wird unter Verwendung der erfindungsgemäßen neuen,

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- ιό -

eine radioaktiv markierte Imidazolgruppe enthaltenden Steroidderivate. Eine allgemeine Beschreibung von Radioimmunoassay-Verfahren ist zu finden in C^ö. Skelley, L.P. Brown und P.K. Besen, "Radioimmunoassay", "Clinical Chemistry", Band 19, Nr. 2, 146 bis 186 (1973).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne Jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Herstellung von Cortis£l^3-oxim

41,54 mg Cortisol, 21,17 mg Carboxymethylamin und 4^,43 mg Natriumacetat wurden in 10,0 ml trockenem Methanol gelöst und die Reaktion wurde über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Zwei 20 cm χ 20 cm große präparative H.F.-Dünnschicht-Platten (2 mm, E. Merck, Darmstadt, BRD) wurden jeweils mit einem Streifen aus 420 ml der Reaktionsmischung versehen und in einer Benzol/Methanol (60/40)-Lösung entwickelt. Das Lösunprsmittelsystem trennte das Cortisol-3-oxim (Rj₁ = 0,32) sowohl von dem nicht-umgesetzten Cortisol (Rp = 0,78) als auch von einer geringen Menpre Cortisol-3,20-dioxim. Die das Cortisol-3-oxim enthaltende Bande wurde von der Platte heruntergekratzt und dreimal mit 10 ml Methanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden in einem Schnellverdampfer zur Trockne eingedampft und in 2 ml Methanol wieder aufgelöst. Das zurückbleibende teilchenförmige Material wurde durch Zentrifugieren entfernt und 30 nl der klaren Lösung wurden auf eine 5 cm χ 10 cm große analytische HF-TLC-Platte (0,25 mm)in Form eines Fleckes aufgebracht und in dem gleichen Löeungsmittelsystem entwickelt. Es trat eine einzige Bande auf, die mit dem Tetrazoliumblau-Reagens einen positiven Test ergab (vgl. J.K. McKenzie und J.A. Clements, "J. Clin Endocrinol. Metab.", ^8, 622 (1974)). Dieses Ergebnis zeigt das Vorhandensein einer C-20-Ketogruppe an. Schließlich wurde eine Ausbeute

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y\ -12

von 27,8 mg (67 %) Cortisol-3-oxim durch Ultraviolettspektroskopie ermittelt.

Beispiel 2

Herstellung von Cartisol-5-oxim-histamin

HO

1,3 ml einer Methanollösung, die 6,37 mg/ml Cortisol-3-oxim enthielt, wurde unter Stickstoff in einem 2 ml-Reaktionsgefäß, das mit mit einer Schraubkappe versehen war, zur Trockne eingedampft. Nach der Zugabe von 300 11I trockenem Dioxan wurde das Gefäß in einem Eis/Wasser-Bad von 1O°C 10 bis 15 Minuten lang abgekühlt. Es wurden 10 ul Tributylamin zu 50 ul trockenem Dioxan zugegeben und nach dem Mischen wurden 30 ill der dabei erhaltenen Lösung unter Mischen zu der Cortisol-3-oxim-Lösung zugegeben. Nachdem diese Reaktionsmischung auf 10 C abgekühlt worden war, wurden 30 jul einer Lösung, die in 100 jul trockenem Dioxan 10 ill Isobutylchlorformiat enthielt,

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zugegeben. Nach der Zugabe des Isobutylchlorformiats wurde die Reaktionsmischung 20 bis 25 Minuten lang bei 1O°C gerührt.

Während der oben angegebenen Reaktionsperiode wurden 11 mg Histamin in einem Gemisch aus 200 M1 Dioxan, 200 iil Wasser und 20 iil einer 0,5 π Natriumhydroxidlösung gelöst. Diese Histaminlösung wurde ebenfalls auf 10 C abgekühlt und nach der oben angegebenen Reaktionsdauer von 20 bis 25 Minuten wurde sie zu der Lösung zugegeben, die das IsobutylformiatgemischteAnhydrid von Cortisol-3-oxim enthielt, Biese Stufe wurde 3 Stunden lang bei 1O°C ablaufen gelassen und dann wurde die Temperatur langsam auf Raumtemperatur gebracht, indem man das Reaktionsgefäß über Nacht in einem Eis/Wasser-Bad beließ.

Am nächsten Tag. wurde die Reaktionsmischung in Form eines Streifens auf zwei 20 cm χ 20 cm große analytische H.F.-TLC-Platten (0,25 ml) aufgebracht und die Platten wurden in einer Chloroform/Methanol/Wasser (18/4/2)-Lösung entwickelt. Dieses System trennte sowohl das nicht-umgesetzte Histamin (R_p = 0,33) als auch das Oortisol-3-oxim (Rj₁ = 0,075) von dem Cortisol-3-oxim-histamin-Derivat (Rj₁ a 0,17)· Das Histamin und die Histamin-Cortisol-Verbindung konnten beide durch eine Reaktion mit dem Pauley-Heagens sichtbar gemacht werden (vgl. CW. Easley, "Biochem. Biophys. Acta", 107, 386 (1965)), während das nicht-umgesetzte Cortisol und die Histamin-Cortisol-Verbindung beide durch Reaktion mit dem Tetrazoliumblau-Reagens identifiziert wurden. 'Die Ultravioltt-Spektroskopie des gereinigten Cortisol-3-oxim-histamin-Derivats in Methanol ergab eine Ausbeute von 0,65 mg (7»8 %).

Beispiel 3

Jodi^rungsverfahren

20 xil (0,1 UgAiI) Cortisol-3-oxim-histaminderivat in trockenem Methanol, 50 ul Wasser, 20 ill eines 0,5 M Natriumphosphat-

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puffers mit einem pH-Wert von 7,4-, 10 ul Na¹²^J ( 2 Millicurie) und 20 ul Chloramin-T (50 mg/ml in einem 0,5 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7»4) wurden miteinander gemischt und 2 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ul NatriummetabisuIfit (5 mg/ml in einem 0,5 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7»4·) beendet. Die Reaktionsmischung wurde in Form eines Fleckes auf eine 5 cm χ 20 cm große analytische HF-TLC-Platte aufgebracht und in einer Chloroform/-Methanol/Wasser (18/4/2)-Lösung entwickelt. Die das mit

«J monomarkierte Cortisol-3-oxim-histamin-Derivat enthaltende

Bande wurde durch Radioautographie ermittelt (Rj, « 0,53). Das Material wurde in 4 ml trockenes Methanol extrahiert und zu 76 ml einer 0,1 #igen Essigsäure/Wasser-Lösung verdünnt. Bei einer durchschnittlichen Jodierung erhielt man etwa 800 Millicurie markiertes Hapten (Ausbeute 40 %).

Jodierte Aldosteron-3-oxim-histamin-Derivate können nach einem Verfahren hergestellt werden, das analog zu dem in den obigen Beispielen 1 bis 3 angegebenen Verfahren ist.

Beispiel 4

1.) Markiere zwanzig (20) Röhrchen in doppelter Ausführung

wie folgt: T.C, Blindprobe, B_Q, A bis F und GS (Kontrollserum) . Markiere zwei (2) Röhrchen in doppelter Ausfertigung für jede Patientenserumprobe;

2.) gib 200 ul steriles destilliertes Wasser zu den Blindprobenröhrchen zu;

3.) gib 20^1 Puffer zu den B_Q-Röhrchen zu;

4.) gib 20 ill der Standardlösungen A bis F zu den geeigneten Röhrchen zu,

5.) gib 20 ul des Kontrollserums zu den CS-Röhrchen zu,

6.) gib 20 ul jedes Patientenserums zu den geeigneten Röhrchen

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125
7.) gib 400 ill der ^wJ-Cortisol-Ausfällungsantikörper-Mischung zu allen Röhrchen zu; mische durch Durchwirbeln unmittelbar vor der Verwendung die Mischung 5 bis 10 Sekunden lang, verschließe die T.C.-Röhrchen und stelle sie beiseite,

8.) gibt 200 ill verdünntes Cortisol-Sntiserum zu allen Röhrchen mit Ausnahme der T. C- und Blindprobenrohrchen zu, verschließe alle Röhrchen und mische durch langsames Verquirlen oder mäßiges Durchwirbeln;

9.) inkubiere 2 Stunden lang bei 37°C (mit Ausnahme der T.C-R. öhrchen),

10·.) gib 1 ml einer kalten Kochsalzlösung (2 bis 8⁰G) zu jedem Röhrchen (mit Ausnahme der T.C.-Röhrchen) zu und verschließe die Röhrchen;

11.) zentrifugiere sofort alle Röhrchen (mit Ausnahme der T.C-Röhrchen) 15 Minuten lang bei mindestens 1S00 g;

12.) dekantiere vorsichtig jedes Röhrchen (mit Ausnahme der T.C.-Röhrchen) und verwerfe die überstehende Flüssigkeit; tupfe vorsichtig die restliche überstehende Flüssigkeit, die nach dem Dekantieren den oberen Rand des Röhrchens benetzt, vorsichtig mit einem absorbierenden Papier mit einer Kunststoffunterlage auf, verschließe alle Röhrchen;

13.) zähle alle Röhrchen aus einschließlich der T.C.-Röhrchen für eine Zeitspanne, die vernünftige Auszählstatistiken für jedes Röhrchen ergibt (z.B. ergeben 10 000 Zähler 26 Zählfehler von 2 %), diese Zeitspanne sollte zwischen 1 und 10 Minuten liegen.

Das vorstehende Protokoll ist in der nachfolgenden Tabelle I tabellarisch zusammengestellt.

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Tabelle I

Probe

destilliertes Wasser

(pi)

T.C. 0

Blindprobe

D₀ 0

A (1 με/dl) 0

B (2 με/dl) 0

C (5 με/dl) 0

D (10 με/dl) 0

E (20 με/dl) 0

F (50 ug/dl) 0

Kontrollserum _t 0 Patientenprobe 1 ο

-2 0

Standard oder tisol-Aus-Puffer Probe fällunpsanti-

körper.-Jüiachung

verdünnte? Anticortisol

(μΐ)

20-Λ

20-B

20-C

20-D

20-E

20-F

20-CS

400 400 400 400 400 400 400 400 400 400

20-Probe 400 20-Probe 400

200

und dgl.

- -ιέ -

Ein analoges Protokoll kann in einem RIA-Verfahren für Aldosteron angewendet werden.

Zur Erstellung von Standardkurven und zur Ermittlung der Konzentration des Serumbestandteils werden verschiedene Verfahren angewendet. Zu den angewendeten Verfahren gehören: B/T oder B/B wird aufgetragen gegen die Konzentration oder gegen den Logarithmus (log) der Konzentration; T/B wird aufgetragen gegen die Konzentration oder logit B/B wird aufgetragen gegen log Konzentration, Das Verfahren, bei dem B/T gegen log Konzentration aufgetragen wird, ist das folgende:

1.) Man verwendet die nachfolgend angegebene Formel zur Berechnung der Menge des markierten Cortisols, das in Abwesenheit eines unmarkierten Cortisols an das Anticortisol gebunden ist:

B—Zähler - Blindprobe

ο ~ T.C.-Zähler - Blindprobe B sollte zwischen 4-0 und 60 % liegen;

2.) es wird die Menge des an Anticortisol gebundenen markierten Cortisols in Standard- und Patientenproben-Ampullen wie folgt bestimmt:

q/j> B-Zähler für die Standard- oder Patientenprobe -

^%B " Blindprobe

T.C.-Zähler - Blindprobe ^uu

3.) die % B-Werte der Standardproben werden gegen ug/dl Cortisol auf zweifach-cyclischem halblogarithmischem Diagrammpapier mit ug/dl Cortisol auf der log-Skala aufgetragen;

4-.) die Konzentrationen des Cortisols in der Patientenprobe und in dem Kontrollserum werden aus der Standardkurve ermittelt.

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-V-

Die bei dem Verfahren des Beispiels 4 erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle II angegeben. Diese Daten können, wie oben angegeben, in Form eines Diagramms aufgetragen werden, wodurch man eine Standardkurve erstellen kann.

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O co cn cn

	%B	Tabelle il
Standard- oder Kontrollseren	52.0	konzentration (/ig/dl)
^Bo	54.8	0
B O	48.1	0
A	49. 3	1.0
Ά	44.5	1.0
B	44. 3	2.0
B	36.2	2.0
C	36.1	5.0
C	24.8	5.0
D	26.2	10.0
D	17.9	10.0
E	18.1	20.0
E	9.5	20.0
F	9.3	50.0
F	17.0	50.0
Beckman CS	17.0
Beckman CS	23.0
Ortho I	24.4
Ortho I

Konzentration, extrapoliert aus der Standardkurve

23.4 + 0.1

23.5 +_ 0. 1 13.2 J₁ 0. 7 11.9 + 0.7

O OO O

In der vorstehenden Tabelle II sind auch die RIA-Ergebnisse aufgezählt, die bei Verwendung der Beckman- und Ortho I-Kontrollseren erhalten wurden.

Wie im Falle von Digoxin mildem die jodierten Steroidderivate der Formel I, z.B. jodierte Cortisol- und Aldosteronderivate, die eine Imidazolgruppe enthalten, die verschiedenen Probleme, die mit den bisher bekannten Steroidderivaten auftreten, wie z.B. die niedrigere Affinität gegenüber den Antiseren als das unmarkierte Steroid, die hohe Anzahl der unspezifischen Hintergrund-Zähler in den Reaktionsgefäßen und dgl.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassay-Verfahren selbstverständlich, daß die Erfindung keineswegs darauf beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

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Claims

Patentansprüche

/ Iy Radioimmunoassay-Reagens, durch die Strukturformel

gekennzeichnet

O CH ₂OH Il I HC
^s. I C - O HO T 1 ^H3^CY
ι L 1

O - CH- -

oder

HO

CH₂OH

C OH

O - CH, - C - NH - CH₀ - C = CZ

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ORIGINAL INSPECTED

2770009

worin Z eine radioaktive Markierung bedeutet.
2. Radioimmunoassay-Reagens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Strukturformel

HO

worin Z die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.
3. Radioimmunoassay-Reagens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Strukturformel

CH₂OH

_0H

N
I CH₂ - C
Ii - NH - CH₂ - C
I = CZ
I I
O - O HN
\
TT I
N
J

7098U/0866

worin Z die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung h^t.
4-, Radioimmunoassay-Reagens nach den Ansnrüchen Ί bin 5,

12S dadurch gekennzeichnet, daß Z -J bedeutete
5. Radioimmunoassay-Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Steroids aus der Gruppe Cortisol und Aldosteron, dadurch gekennzeichnet, daß es unter Verwendung einen Radioimmunoassay-Reagens der nachfolgend angegebenen Strukturformel durchgeführt wird

CH₂ - C - NH - CH -

HC

709848/0866 BAD ORIGINAL

CH₂OH

OH

O - CH„ -

C
Μ - NH -CH₂ - C ■ I ■
O i
HN \ HC

worin Z eine radioaktive Markierung bedeutet.
6. Radioimmunoassay-Verfahren nach Anspruch 5 zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Cortisol, dadurch gekennzeichnet, daß es unter Verwendung des Radioimmunoassay-Reagens der nachfolgend angegebenen Strukturformel durchgeführt wird

C = O

HO

O - CH₂ - C

-NH-

CH, - C = CZ HN N

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worin Z die in Anspruch 5 angegebene Bedeutung hat.
7· Radioimmunoassay-Verfahren nach Anspruch 5 zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Aldosteron, dadurch gekennzeichnet, daß θθ unter Verwendung des Radioimmunoassay-Rea[-ens der nachfolgend angegebenen Strukturformel durchgeführt wird

CH₂OH

- O

worin Z die in Anspruch 5 angegebene Bedeutung hat.
8. Radioimmunoassay-Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß es unter Verwendung des darin angegebenen Radioimmunoassay-Reagens durchgeführt wird, worin Z °J bedeutet.

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