DE2331922A1 - Reagentien zur untersuchung von herzglykosiden - Google Patents

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF [waohqerboht]

PATENTANWÄLTE 8 MÖNCHEN 80 ■ MAUERK! RCHERSTRASSE 45

Anwaltsakte 23 998. 5. September 1973

WELLCOME FOUNDATION Ltä. London / England

Reagentien zur Untersuchung von Herzglykoslden

Diese Erfindung betrifft Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden (Digitalisglykoside^ in Lösungen, die diese enthalten, die Herstellung dieser Reagentien, ein Verfahren zur Durchführung von Untersuchungen unter Verwendung dieser Reagentien, eine Untersuchungsausrüstung, die zur Durch -

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~- 2 —

führung dieser Untersuchungen geeignet ist und ein Verfahren zur Herstellung einer Untersuchungsausrüstung·

Die vorliegende Erfindung betrifft im besonderen neue Reagentien für die Radio-(Strahlungs-)immunisierungsuntersuchung von Digitalisglykosiden, bei denen eine Hydroxygruppe mit Jedem der beiden benachbarten Ringkohlenstoffatomen in dem endständigen Zuckerrest verbunden ist und sie betrifft im besonderen Reagentien für die Radioimmunountersuchung solcher Glykoside, worin der Aglyconteil des Moleküls von einem Digoxigenin, Digitoxigenin, Gitoxigenin, Ouabagenin oder Periplogenin stammt. Durch die Verwendung der durch die vorliegende Erfindung geschaffenen Reagentien können diese Glykoside sowohl in wäßriger Lösung als auch in Lösung in Körperflüssigkeiten wie Plasma, Serum und Urin bestimmt werden.

Es ist dem Fachmann bekannt, daß das Verfahren der Radioimmun ©untersuchung auf die Bestimmung von Digoxin angewendet werden kann. Bei diesem adapierten Verfahren läßt man eine begrenzte bestimmte Menge von Antidigoxinserum, hergestellt mittels immunologischer Standardverfahren, sich umsetzen mit Testplasma (oder Serum oder Urin) oder einer Standarddigoxinlösung zusammen mit einer konstanten Menge Digoxin, die radioaktiv in einer solchen Weise indiziert (d.h. mit Radioisotopen versetzt) ist, daß die antigenen Eigenschaften des Moleküls im wesentlichen unbeeinflußt blei-

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ben. Nach der Inkubation des Gemischs wird freies Digoxin von dem, das mit dem Antikörper verbunden ist, mittels irgendeinem der verfügbaren Verfahren abgetrennt, die Radioaktivität des einen oder anderen der beiden Fraktionen in einem Radioaktivitätszähler gemessen. Die Bindung des indizierten Digoxins wird fortschreitend dadurch inhibiert, daß man die Mengen des nicht indizierten Digoxin erhöht, wcr-u man rh.:i 7/ettbewerb zwischen den beiden Spezies für die spezifischen Bindungsstellen an dem Antikörper aus Tatst. Die Konzentration des Digoxin in dem unter Versuch stehenden Plasma kann leicht unter Bezugnahme auf eine gleichzeitig hergestellte Standardkurve bestimmt werden.

Dieses in der Literatur beschriebenen Untersuchungsverfahren ging von mit Tritium behandeltem Digoxin als indizierter Verbindung aus, wobei die Nachteile geringer spezifischer Radioaktivität und das Messen der Proben in einem flüssigen Scintillationszähler in Kauf genommen werden mußten.

Eo wurde nunmehr gefunden, daß neue antigen zufriedenstellende Digoxinanaloge , die hohe spezifische Radioaktivität aufweisen und das Messen der Proben mit dem zweckmäßigeren Festkristall-Scintillationszähler zulassen, wobei sie, wenn sie gefriergetrocknet sind, stabil sind, dadurch hergestellt v/erden können, daß man

?i)'Jen endständigen Digitoxosereet von üiyoxin (I) bei den W- um! 1f, »-Stellungen selektiv oxidiert unter Bildung

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- 4 des entsprechenden Aldehyds, 15'.I6^f-Didehydrodigoxin (II),

b) den Dialdehyd (IT) mit dem Stickstoffatom des Tyrosinmethylesters kuppelt unter Bildung der konjugierten Verbindung (III), N-/T-Methoxycarbonyl-2-(4'-hydroxyphenyl)-äth-1-yl7~hexahydro-1.4-(3.5-dihydroxy-2-methyl)-oxazepin-7-yl-3ß-/t)-ß-digitoxosyl-(i —»■ 4)-0-ß-digitoxosyl-(1 —> A)J-12ß.14-dihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid,

c) diese konjugierte Verbindung (III) bei der Kupplungsstelle selektiv reduziert unter Bildung der reduzierten konjugierten Verbindung (IV), N-^/T-(4'-Hydroxyphenyl)-3-hydroxyprop-2-yl7~hexahydro-1.4-(2-methyl)-oxazepin-7-yl-3ß-_i/Ö-ß-digitoxosyl-(i -*· 4)-0-ß-digitoxosyl-( 1 —» 4jf7-12ß.14-dihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid,

d) die reduzierte konjugierte Verbindung (IV) mit J unter Bildung der nachfolgenden Verbindungen jodiert N-/T-(4'-Hydroxy-3'"Z"¹²⁵ £/-j odophenyl)-3-hydroxyprop-2-yl7-hexahydro-1.4-( 2-methyl )-oxazepin-7 -yl-3ß-_i/0-ß-digi'fcoxosyl-(1 —* 4)-0-ß-digitoxosyl-(i —» 4χ7~^12β·14-dihydroxy-5ßcard-20(22)-enolid und

Ν-^/Τ-ί 4 '-Hydroxy-3 *. 5 '-di^~ £7- j odophenyl) -3-hydroxyprop-2-yl7~hexahydro-1.4-(2-methyl)-oxazepin-7-yl-3ß-^-ßdigitoxosyl-(i —> 4)-0-ß-digitoxosyl-(1 —» 4)-12ß.14-dihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid.

Die Stufen a), b) und c) des oben dargestellten Heaktiono— verlaufe sind in der begleitenden schematisciien Zei

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erläutert und es ist aus der vorausgehenden Beschreibung klar, daß während der Jodierungsstufe d) das Radiojodisotop nacheinander in die 2- und 6-Stellungen (im Hinblick auf die Hydroxygruppe) des Phenolteils der reduzierten konjugierten Verbindung (IV) eingeführt wird.

Die selektive Oxidation des endständigen Zuckerrestes kann mittels irgendeinem Mittel bewirkt werden, das herkömmlicherweise zur Spaltung der 1:2-Glykole verwendet wird, wobei jedoch Bleitetraacetat und Perjodsäure und ihre löslichen Salze bevorzugt werden. Die selektive Reduktion der konjugierten Verbindung kann dadurch bewirkt werden, daß man ein dem Fachmann bekanntes Mittel, nämlich Borane, Borhydride und/ oder Aluminiurahydride, beispielsweise Kaliumborhydrid, Natriumborhydrid, Lithiumborhydrid und/oder Lithiumaluminiumhydrid verwendet. Die Jodierung kann mit irgendeinem der bekannten Verfahren vorgenommen werden, wird aber vorzugsweise unter Verwendung einer Modifizierung des bekannten Chloramin-T-Standardverfahrens durchgeführt· Obgleich Jod in den Phenolteil entweder in 2-Stellung oder sowohl in 2-als auch 6-Stellungen im Hinblick auf die Hydroxygruppe eingeführt wird, wurde festgestellt, daß in der Mehrzahl der induzierten reduzierten konjugierten Verbindungen nur ein einziges Jodatom inkorporiert wird.

Ed ist darauf hinzuweisen, daß im Prinzip alle Radioisotopen _T - /123-Γ 124_T 125_T 126_T 128_T 129_T 130_T 131_ΤιιηΛ

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^J J) in die reduzierte konjugierte Verbindung (IV) eingeführt werden können, daß aber wegen der Verfügbarkeit, Halbwertszeit und spezifischen Aktivität, J und ^ J und ins-

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besondere J bevorzugt werden·

Es wurde festgestellt, daß das Digoxin-Ausgangsmaterial (I) durch irgendein Digitalisglykosid, das eine mit jeder der beiden benachbarten Ringkohlenstoffatomen in dem endständigen Zuckerrest verbundene Hydroxygruppe aufweist, ersetzt werden kann und es können daher neue antigen zufriedenstellende, radiojodierte Analogen, die die oben angegebenen Vorteile aufweisen, der Verbindungen der Formel (V) erhalten werden, worin

R⁶ Wasserstoff ist, R^, R⁴, R⁵ und Z² Wasserstoff sind, jeder

1 2
der Reste R und R Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe und

7

wenigstens einer Wasserstoff ist, R' eine Hydroxygruppe, Z

eine -CH R -Gruppe ist, worin R die oben definierte Bedeutung hat und entweder R , R^y und R Wasserstoff sind, R eine Hydroxygruppe a = 0 und b = 0, 1 oder 2 ist oder R , R° und R¹¹ Hydroxygruppen sind, R¹⁰ Wasserstoff, a = 1 und b = 2 ist oder

R eine Hydroxygruppe, R eine Hydroxygruppe ist, beide 1 ?

Reste R und R Wasserstoff sind, einer der Reste Z und Z Wasserstoff und der andere eine -GH₂R -Gruppe ist, worin R die oben definierte Bedeutung hat, a = 0 ist und entweder die Reste R³, R⁴, R⁵ und R¹⁰ Hydroxygruppen, R⁹, Z¹ und R¹¹ Wasserstoff sind und b = 0 ist oder die Reste R³, R⁴, R⁵, "R¹⁰

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2 9 11 7

und Z Wasserstoff, R^ und R Hydroxygruppen sind, R eine Methoxygruppe und b = 1 ist.

Die Verbindungen der Formel (V) werden in der begleitenden Tabelle 1 in Einzelheiten dargestellt, worin Mono- und Didigox, -digitox und -gitox entsprechend die Mono- und Didigitoxoside von Digoxigenin, Digitoxigenin und Gitoxigenin darstellen.

Es wurde weiterhin festgestellt, daß das -Tyrosinmethylesterreagens der oben angegebenen Stufe b) durch irgendein "primäres Aminophenol" ersetzt werden kann, worunter im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Verbindung zu verstehen ist, die sowohl eine primäre Aminogruppe als auch eine Phenolgruppe aufweist. Von solchen Verbindungen werden die der Formel (VI) bevorzugt, worin A eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte, gegebenenfalls substituierte Allcylenkette mit vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform nimmt die Hydroxygruppe in der Verbindung der Formel (VI) die 4-Stellung im Hinblick auf A ein. Als Beispiele für besonders geeignete Verbindungen der Formel (VI) können erwähnt werden: p-Hydroxybenzylamin (worin A = CH₂ ist), Tyrosin (worin A = CH(COOH)CHp ist) und Tyrosinester, beispielsweise Tyrosinalkylester (worin A¹ = CH(COCALK)CH₂ ist), worin die Alkylgrupne *ALK* vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoff atome hat, wie c3or oben angegebene Methylester (worin ALK = CH^ ist).

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Es ist für den Fachmann klar, daß das oben beschriebene Verfahren im allgemeinen für die Herstellung von Derivaten irgendeiner Verbindung anwendbar ist, die ein Ringsystem ist oder ein solches beinhaltet, bei dem eine Hydroxygrupre mit jedem der beiden benachbarten Ringkohlenstoffatome verbunden ist.

Daraus ist zu ersehen, daß die reduzierte konjugierte Verbindung der Formel (IV) und ihre jodierten Derivate, v/ie oben angegeben, nur Beispiele einer neuen ICLasse von Verbindüngen der Formel (VII) sind, worin die Reste R , H , K ,

E⁴, H⁵, R⁶, E⁷, R⁸, Z¹, Z², a und b die in der Formel (V)

1 2 angegebene Bedeutung haben, jeder der Reste X und X ent-

2 weder ein Jodradioisotop oder Wasserstoff ist und A eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte, gegebenenfalls substituierte Alkylenkette mit vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

Die jodierten Verbindungen der Formel (VIT) können aus den entsprechenden nicht jodierten, reduzierten konjugierten Verbindungen in der oben beschriebenen ".Yeise hergestellt werden. Die reduzierten konjugierten Verbindungen selbst können dadurch hergestellt werden, daß man (a) die geeiioiete Verbindung der Formel (V) selektiv oxidiert, (b) das erhaltende Dialdehyd mit der geeigneten Verbindung der Formel (VI) unter Bildung der konjugierten Verbindung kuppelt und (c) die konjugierte Verbindung mittels analoger Verfahren,

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3Q988?/139.1

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wie sie oben "beschrieben wurden, selektiv reduziert.

Die Gruppe A in einer Verbindung der Formel (VII) kann gegebenenfalls mit der Gruppe A der Verbindung der Formel (VI), aus der die Verbindung der Formel (VII) abstammt, identisch sein, wenn Teile der Gruppe A , die unter den Reaktionsbedingungen reaktionsfähig sind, während der selektiven Reduktion (Stufe c)) der (anfangs gebildeten) konjugierten Verbindung, reduziert werden. So ist in dem Schema 1 die Reduktion der Methoxycarbonylgruppe des Tyrosinmethylester-Restes in eine primäre Alkoholgruppe gezeigt.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die neuen Verbindungen der Formel (VII) und die (anfangs gebildeten) neuen konjugierten Verbindungen, von der diese abstammen, zusammen durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellt werden könnet, worin die Reste H¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R^ö, Z¹, Z², a und b die in der Formel (V) definierten Bedeutungen haben, jeder

der Reste Y und Y entweder Wasserstoff oder eine Hydroxy-

1 2 gruppe ist, jeder der Reste X und X entweder Wasserstoff oder ein Jodradioisotop ist und beide Wasserstoff sind, wenn beide Reste Y und Y Hydroxygruppen sind und A eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte, gegebenenfalls substituierte Alkylenkette mit vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

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- ίο -

Die bevorzugten Verbindungen der Formeln (VII) und (VIII) sind solche, worin der Rest R _x Wasserstoff ist und als besonders bevorzugte Untergruppen können solche Verbindungen erwähnt werden, worin (1) R Wasserstoff und b = 2 ist und (2) worin R Wasserstoff, b = 2 und a. = 0 ist.

Die Untersuchung einer Verbindung der Formel (V) (Glykosid) kann zweckmäßigerweise unter Verwendung einer Untersuchungsausrüstung durchgeführt v/erden, die wenigstens vier Gefäße aufweist, nämlich

- ein erstes Gefäß mit einer Pufferlösung,

- ein zweites Gefäß mit einem Gemisch von (a) einem in einer Säuger- oder Vogelspezies gezüchtetes Antiserum gegen das unter Versuch stehende Glykosid und (b) ein in einer zweiten Säuger- oder Vogelspezies gezüchtetes Antiserum, das gegen. die Immunoglobuline der ersten Spezies reaktionsfähig ist,

.- ein drittes Gefäß mit einer Lösung einer Verbindung der Formel (VII) entsprechend dem unter Versuch stehenden Glyko-

1 2

sid, worin wenigstens einer der Reste X und X ein Jodradioisotop ist und

- ein viertes Gefäß mit einer Standardlösung des Glykosids in Serum an einer anderen Säuger- oder Vogelspezies, als der Spezies, in der das gegen das Glykosid reaktionsfähige Antiserum gezüchtet wurde, enthält.

Gegebenenfalls ist der Inhalt von einem oder mehreren der Gefäße in gefriergetrocknetem Zustand und gegebenenfalls

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enthält die Untersuchungsausrüstung zusätzlich zu den oben angegebenen ersten, zweiten und dritben Gefäßen eine Vielzahl von Gefäßen, die jeweils eine Standardlösung des GIykosids in Serum für eine andere Sauger- oder Vogelspezies als der Spezies enthalten, in der das Antiserurn, das gegen das Glykosid reaktionsfähig ist, gezüchtet wurde, wobei die Standardlösungen hinsichtlich der Konzentrationen sich voneinander unterscheiden können.

Zu den Glykosiden der Formel (V), die besonders zweckmäßig unter Verwendung der IMtersuchungsausrüstung, wie oben beschrieben, untersucht werden können, gehören Digoxin, Digitoxin, Gitoxin, Lanatoxid A, Lanatosid B und Lanatosid C (siehe Tabelle 1) und Uhtersuchungsausrüstungen, die von den oben beschriebenen zur Untersuchung dieser Glykoside geeignet sind, sind besonders wertvoll.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher

- Verbindungen der Formel (VIII) und Verfahrend ihrer Hernteilung, wie beschrieben,

- ein Verfahren zur Radioimmunountersuchung einer Verbindung der Formel (V), wozu man (a) ein Gemisch einer Verbindung '!sr Formel (V), ein Antiserum zu der Verbindung der Formel (V) und eine radiojodierte Verbindung der Formel (VII), die 'jor Verbindung der Formel (V) entspricht, umsetzt, (b) die nit dem Antikörper verbundene Reagensfraktion aus einer Nicht-Antilcörper-verbumJcnen Fraktion abtrennt und (c) die Radio-

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aktivität der einen der Fraktionen mißt,

- eine Untersuchungsausrüstung, wie beschrieben, die für die Radioiramunitätsuntersuchung einer Verbindung der Formel (V) geeignet ist und

- ein Verfahren zur Herstellung einer Untersuchungsausrüstung, wie beschrieben, das zur Radioimmunountersuchung einer Verbindung der Formel (V) geeignet ist, wobei die Anordnung Gefäße in Form einer Untersuchungsausrüstung, wie beschrieben, aufweist.

Die folgenden Beispiele dienen zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung, jedoch ausschließlich der Erläuterung, ohne den Erfindungsbereich einzuschränken. Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben. Das Beispiel 1 betrifft die Herstellung, in der voraus beschriebenen Weise, der Digoxin-Tyrosinmethylester-konjugierten Verbindung (III), wie oben angegeben,und die Reduktion dieser Verbindung zu der reduzierten konjugierten Verbindung (IV), wobei die Struktur dieser zuletzt bezeichneten Verbindung mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie bestätigt wurde. Das Beispiel 2 betrifft die Radiojodierung der reduzierten konjugierten Verbindung (IV) unter Bildung der oben angegebenen Derivate. In den Beispielen 3 und 4 ist das als "radioaktives Digoxin" angegebene Reagens dos Verfahrensprodukt von Beispiel 2.

In Beispiel 2 hat das lü.s "Chloramin T" angegebene Reagens die systematische Bezeichnung (N-Calor-n-toluolsulfonamido)-natrium.

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Beispiel 1

Herstellung der (a) Digoxin-tyr.osinmethylester-kon.iugierten Verbindung und (b) der reduzierten konjugierten Verbindung Digoxin (2,5 g) wurde in einem Gemisch von Methanol (150 ml) und Chloroform (50 ml) gelöst. Eine Lösung von Natriumperjodat (25 ml, 10$ Gew./Vol.) wurde unter Rühren während 30 Minuten zugegeben. Nach weiteren 90 Minuten wurde das Gemisch filtriert, V/asser (25 ml) dem Filtrat zugegeben und die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Chloroform ( 5 x 100 ml) extrahiert, die Lösung mit Wasser (50 ml) gewaschen, getrocknet (Magnesiumsulfat) und unter Vakuum konzentriert.

Der Rückstand wurde in Äthanol (30 ml) gelöst, L-Tyrosinmethylester-Hydrochlorid (2,225 g) und Triäthylamin (1,34 ml) zugegeben und das Gemisch eine Stunde gerührt. Äthanol (30 ml) wurde zugegeben und unter Rühren Natriumborhydrid (5,14 g) portionsweise während 10 Minuten eingeführt. Das Rühren wurde zwei Stunden fortgesetzt, dann Eisessig zugegeben, bis keine weitere Bildung von Wasserstoff feststellbar war. Nach Zugabe von Wasser (50 ml) wurde das Äthanol unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit Chloroform (3 x 100 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde nacheinander mit 50 ml Teilen Wasser, 0,5N Salzsäure und Wasser gewaschen, (über Magnesiumsulfat) getrocknet und unter Vakuum unter Bildung eines amorphen Peststoffs konzentriert.

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.- 15 -

Das oben angegebene Produkt wurde mittels Chromatographie auf neutralem Aluminiumoxid mit.dem Lösungsmittelgemisch Methanol!Chloroform (1:9 Vol./Vol.) gereinigt, wobei die Eluate mittels Ultraviolettabsorptionsmessungen überwacht wurden. Die bei 254 mu absorbierenden Fraktionen wurden zusammengegeben und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der amorphe Rückstand wurde mittels DünnschichtChromatographie (Aluminiumoxidplatten} Lösungsmittel: Methanol:Chloroform (2:8 Vol./VOl.), R_f 0,60) homogenisiert und lieferte positive Reaktionen mit Pauly's-Reagens (Tyrosin) und Raymond ^fs-Reagens (Cardenoliden). Die mittels kernmagnetischor Resonanzspektroskopie ermittelte Analyse zeigte, daß das Verhältnis Phenol zu Cardenolid 1:1 war.

Die reduzierte konjugierte Verbindung wird durch die folgenden Angaben gekennzeichnet:

(a) Infrarotspektroskopie

Das Infrarotabsorptionsspektrum der Verbindung (1,48 mg) in einer Kaliumbromidscheibe (16 mm Durchmesser) ist aus der begleitenden Figur 2 zu entnehmen. Die Hauptbanden sind:

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863 Phenyl
1017

1066
1167

1380

1446

1513 Phenyl

1612 Phenyl

Lacton

-C-OH und C-O-C, weitgehend ja.us Kohlehydrat, phenolisches C-OH

1732 )
1776 )

2930

309887/1393 "¹⁶~

(b) Kernmagnetische Resonanzspektroskopie Das kernmagnetisehe Resonanzspektrum wurde bei 100MHz in deutero-Chloroform, das hexadeutero-Dimethylsulfoxid zur Bildung einer klaren Lösung enthielt, aufgenommen. Chemische Umlagerungen, Kupplung und Integration stehen in Übereinstimmung mit der Gesamtstruktur. Integrale Messungen der aromatischen Protonen zu den "olefinischen" Protonen zeigten, daß in Bezug auf Genin 1,006 Tyrosinreste vorlagen.

Protonen Beobachtete chemische Eigenschaften Umlage runden (ppm)

Phenol 6,95 Doublet

Phenol 6,75 Doublet

Lacton 5,95 Singlet

CEL in Winkel- 0,80 und 0,92 Singlet stellung

ppm = Teile pro Million (bezogen auf Tetramethylsilan innerer Standard)

Beispiel 2

Jodierung der Digoxin-T.yrosinmethylester-reduzierten konjugierten Verbindung von Beispiel 1

Zu Natriumiodid ( "⁵J, 2 mc) in Natriumphosphatpuffer (0,51JoI, 25/Al, Pjj 7,5) gab man das reduzierte Konjugat (2,5/Ug) in 1Obigem wäßrigem Äthanol (I2,5yul) und Chloramin T (10yug) in dem gleichen Phosphatpuffer (20yul) zu. Nachdem man das Gemisch 30 Seirunden mit einem kleinen magnetischen Rührwerk gerührt hat, wurde die Reaktion durch Zugabe von Natriummetabisulfit (100 /ag) in Phosphatpuffer, wie vorausgehend angegeben, (20>ul) angehalten. Dimethylformamid (0,¹) ml) und

-17-309887/139 3

entionisiertes Wasser (0,3 ml) wurden dann zugegeben und das Gemisch in eine Kolonne (25 x 15 mm) von Amberlite IRA 400 (Cl-Form), das mit entionisiertem Wasser vorgewaschen war, überführt. Die Kolonne wurde mit TRIS ^/tris-iHydroxymethyl)~aminomethan7-Salzsäurepuffer (Zusammensetzung wie nachfolgend angegeben) (p_H 8,5) eluiert: 1 ml Fraktionen wurden gesammelt, wobei die Hauptmenge der kodierten Derivate in der 3· bis 6. Fraktion auftrat.

Die typischen Ergebnisse zeigen einen 70 bis 85$igen Einbau des Jod in die konjugierte Verbindung.

Der zum Eluieren der Kolonne verwendete Puffer hatte die folgende Zusammensetzung:

TRIS bis 0,1MoI

Natriumchlorid bis 1,0MoI

Tween 20 bis 0,5?£ Gew./Gew.

Natriumazid bis 0,05Jo Gew./Gew.

Konzentrierte Salzsäure bis p^ 8,5.

Beispiel 3 Digoxin-Radioimmunountersuchung

Die Untersuchung wurde in Polystyrol-Untersuchungsröhrchen (α χ 63 mm) unter Verwendung der folgenden Reagentien durchgeführt:

1. Verdünnungspuffer. Phosphat-Kochsalzlösungspuffer (ρττ 7»4)ι deonen Zusammensetzung nachfolgend angegeben ist, wurde

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-₁₈-' 2331322

zur Verdünnung aller Reagentien und Proben verwendet.

1 1 Puffer enthielt:

Natriumdihydrogenphosphatdihydrat 6,24 g

Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure ■ 3,72 g

Rinderserumalbumin 5,0 g

Natriumazid 1,0 g

Natriumchlorid 9,0 g

Nach Auffüllen auf .900 ml mit entionisiertem Wasser wurde der p_H-V7ert auf 7,4 mit 5N Natriumhydroxid eingestellt und Wasser auf 1 1 zugegeben.

2. Antidigoxinserum (Kaninchen) mit einer Verdünnung, die ungefähr 50$ des zugeführten radioaktiven Digoxin ohne das nicht indizierte Digoxin bindet.

3. Radioaktives Digoxin; Digoxin-Tyrosinmethylester, indiziert mit J, Stärke der Arbeitslösung 2 ng/ml.

4. Standard—Digoxin; Stammlösung in Phosphat—Kochsalzpuffer, wie oben angegeben, von 100 ng/ml, verdünnt 1:12,5 unter Bildung zunächst einer Arbeitslösung mit einer Stärke von 8 ng/ml, wonach man die Verdünnungen verdoppelt unter Bildung von 4,0, 2,0, 1,0, 0,5 und 0,25 ng/ml.

5. Normales Pferdeserum

6. Normales Kaninchenserum, verdünnt 1:500

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7. Ausfallungsserum: Eselantiserum zu Kaninchen-gamma-Globulin, Verdünnt 1:20. .

Verfahren

Reagenzgläser mit Blindproben ohne Antiserum wurden angesetzt: mit 0 Standardlösung, Digoxin-Standardlösungen und Plasmaproben. 0,4 ml normales Kaninchenserum (1:500 Verdünnung) wurde jedem Röhrchen, danach 0,1 ml Standard-Digoxinlösung, normales Pferdeserum (nur zu der Kontrolle und den Standardröhrchen), Uhtersuchungsplasma, radioaktive Digoxinlösung und Antidigoxinserura zugegeben. 0,1 ral radioaktive Digoxinlösung wurde allein in Polystyrolröhrchen als Probe für die gesamt zugeführte Radioaktivität pipettiert. Der Inhalt der Röhrchen wurde mittels einem Vortex-Mischer gemischt und die Röhrchen dann 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet. 0,1 ml Ausfällungsserum (1:20 Verdünnung) wurde dann zugegeben, der Inhalt der Röhrchen gemischt und die Röhrchen über Nacht bei 4°C stehen lassen. Nach 20 Minuten Zentrifugieren bei 2 000 g, absaugen der überstehenden Schicht und Zugabe von 1 ml Waschpuffer (mit ähnlicher Zusammensetzung wie der Verdünnungspuffer) erfolgte eine weitere Zentrifugierung und Absaugung. Die Radioaktivität in der Antikörper-gebundenen Fraktion wurde mit einem besonders geeigneten Scintillationsmesser (Well-Typ) gemessen.

Die Konzentration des Digoxin in dem unter Versuch stehenden Plasma wurde in Bezug auf eine Kurve bestimmt, die aus den

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mit den Standard-Digoxinlösungen erhaltenen Ergebnissen aufgestellt wurde.

Beispiel 4 Digoxin-Radioimmunountersuchung

Eine weitere Untersuchung bzw. Bestimmung wurde in Glasröhrchen unter Verwendung der folgenden Reagentien durchgeführt :

1. Waschpuffer; Phosphat-Kochsalzlösungspuffer (-p„ 7>4), wie folgt hergestellt:

Natriumchlorid 9»0 g

Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat 6,2 g

Rinderalbuminpulver 5»0 g

Natriumazid 1,0 g

Entionisiertes Wasser auf 900 ml ρ,, eingestellt auf 7,4 mit Natriumhydroxid

Entionisiertes Wasser auf 1 1

2- Digoxin-Bindungsreagens; ein Gemisch von

(a) Kaninchen-Antidigoxinserum und (b) Eselantiserum zu Kaninchen-gamma-Globulin, wobei das Reagens nach Bedarf aus gefriergetrocknetem Material durch Zugabe von entionisiertem Wasser gebildet wurde.

3. Radioaktives Digoxin; Digoxin-Tyrosinmethylester, indiziert mit J, Stärke der Arbeitslösung 2 ng/ml in Puffer, wie unter 1 oben, hergestellt nach Bedarf aus gefrierge-

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— C. 1 —

trocknetem Material durch Zugabe von entionisiertem Wasser.

4. Standard-Digoxin: Lösungen in Rinderserum mit Konzentrationen von 0, 0,5, 1,0» 2,0, 3,0, 4,0 und 6,0 ng/ml, die Herstellung nach Bedarf aus gefriergetrocknetem Material durch Zugabe von entionisiertem Wasser.

Verfahren

Die Untersuchungsröhrchen wurden in zweifacher Form mit der Zubereitung, wie nachfolgend angegeben, umgesetzt, wobei die Reagentien in der angegebenen Reihenfolge zugegeben wurden:

0 und andere Untersuchungs-Standardlöplasma sungen

St andard-Digoxinlösung

(ml) 0,1

Testplasma (ml) - 0,1

Radioaktive Digoxinlösung

(ml) 0,1 0,1

Digoxin-Bindereagens (ml) 0,1 0,1

Weiterhin wurden 0,1 ml radioaktive Digoxinlösung allein in die zwei Röhrchen als Probe für die Gesamt zugeführte Radioaktivität pipettiert.

!lach Zugabe des letzten Reagens wurde der Inhalt von jedem Röhrchen gemischt, wobei ein Vortex-Mischer verwendet wurde und dann ließ man die Röhrchen 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur otehen. Danach wurde Waschpuffer (1 ml) zu jedem Röhrchen

-22-

309 8 8 2/1393

(einschließlich denen, die nur radioaktive Digoxinlösung enthielten) zugegeben und die Röhrchen und der Inhalt wurde mit 2000 g 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Schicht wurde verv/orfen und die Radioaktivität des Niederschlags (die Antikörper-gebundene Fraktion) unter Verwendung eines besonders geeigneten Kristallscintillationsmessers (V/ell-Typ) bestimmt.

Bei Verwendung dieses Verfahrens wurde die Konzentration des Digoxin in zwei Untersuchungsproben von Plasma in Bezug auf eine Kurve bestimmt, die aus den mit den Standard-Digoxinlösungen erhaltenen Ergebnissen, wie in der begleitenden Figur 1 gezeigt, aufgestellt wurde. Die Konzentration des Digoxin in Probe (A) wurde als 1,2 ng/ml und die in Probe (B) als 3,5 ng/ml bestimmt.

-Patentansprüche-

309882/1393

Claims (1)

Patentansprüche :

1. Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden, gekennzeichnet, durch die allgemeine Formel

(VIII]

Ct C3 . « il «^ I -J -Jj—χ CO B co 309882/1T9T SC CJ
I CJ·—Ις· -J₅Ji- «a
I cc
ca cj \ >-
cj rc
/ CJ-=C ac ι «

r»

-Ik-

jeder der Roste Y und Y Wasserstoff oder""TBiaie Hydroxygruppe ißt,

1 2

jeder der Reste X und X entweder Wasserstoff oder ein Jodradioieotop ist und beide Y/asserstoff sind, wenn Y und Y beide Hydroxygruppen sind,

A eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte, gegebenenfalls ßubßtituiertß Alkylenkötte ist und R⁶ Wasserstoff ist, R , R , R^ und Z Wasserstoff sind, jeder

der Reste R und R entweder Waoserstoff oder eine

gruppe und wenigstens einer Wasserstoff ist, R eine Hydroxy—· gruppe, Z Gins Gruppe -Cikß ist, worin R dieunten ange-

8 11 geben© Bedeutung hat und entweder H und K Waaserctoff sind, a = 0 und b « 0, 1 oder 2 ist, oder B und R Hydroxy gruppen eind, a w 1 und b ** 2 ist oder R eine Hydroxygruppe ist, R eine Ilydrozygruppe ist, bsiöe

12 1 i>

Reste R und K Wasoerstoff eind, einer der Heste Z und 2

Wasserstoff und der andere eine Gruppe -CH₂E ist, worin E die unten definierte Bedeutung hat* β » ο ist und entweder B , R^ und H' Hydroxygruppen, Z und R Wasserstoff sind und b » 0 ist oder iP, R , }P und Z Wasserstoff sind, R eine Hydroxygruppe, R eine Uethoxygruppe und b « 1 ist*

-25-

3098 8 2/1333

2, Verbindung der Formel (VII)

iVIJ)

co

OC

\ Ol

cj ac

worin Jeder dor Heete X¹ und X² ein Jodradioiaotop oder VJauser-

3098&2/1393

-2Jb-

stoff ist, .

A eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte, gegebenenfalls substituierte Alkylenkette ißt und H⁶ Wasserstoff ist, die Reste R^, R^, R^ und Z² Wasserstoff

1 2
sind* jeder der'Reste B¹ und R Wasserstoff oder eine Pfydroxy-

7 gruppe und wenigstens einer Wasserstoff ist, R eine Hydroxygruppe, Z' eine Gruppe -CHoR ist, worin R ' diounten definierte Bedeutung hat und entweder R und H Wasserstoff cind, α β 0 und b * 0_f 1 oder 2 ist, oder R und R Hydroxygruppen sind, a » 1 und b « 2 ist oder R eine Ilydroxygruppe, R eine Ilydroxygruppe ist, beide Reote V^ und R² Wasserstoff sind, einer der Koste Z¹ und Z² Wasserstoff und der andere eine Gruppe -GH₂R ist, worin Ii die unten definierte Bedeutung hat, a » 0 ist und entweder die Reste R , R und R^ Hydroxygruppon, Z* und R Wasserstoff sind und b » 0 ist oder die Reste R^, R*, R^ und Z²

11 7

Wasserstoff sind, H eine Ifydroxygruppa, R' eine IJethoxy- gruppe und b » 1 ist· .

3· Verbindung der Formel (VII) gemäß Anspruch 2 d a - d u r ο η gekonnaeiohnot , daß beide Reste X* und X² Wasserstoff sind*

4· Verbindung der Fortsei (VII) geaäfi Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens

"1 2

einer der Reste X und X ein Jodradioisotop ist·

309Ö82/1393

BADOf^tNAt

- ζψ ~ .

5· Verbindung gemäß Anspruch 4 dadurch g e -

125 /

kean.8oioan.et , daß daa Jodradioisotop »Τ und/

oder ¹^¹J iot·

6· Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 d a ·»

durch. gekennzeichnet» daß A oder A _f je naoh Eigautig, eine Alliylenkette rait 1 bis 6 Kohlenotoffatomen ict· ...

7· Verbindung gemäß einen der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß die -OH-Gruppo in der endständigen Phenylgruppe äie 4-Stellung im Hinblick

auf A oder A% ^e nach Eieaung_r einnimmt.

θ· Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 d a —

6 durch gekennzeichnet, daß E Wasserstoff

, Verbindung gemäß Anspruch 8 dadurch gekenneiohnet , daß b » 2 ist«

• Verbindung gemäß Anopruch 9 dadurch gekonn zeichnet , daß a * 0 ist.

11· Verbindung gemäß einem der Anaprüohe 1 und 6 bia 10 dadurch gekennzeichnet, daß beide HeDt ο Υ und Y H^droxygruppen sind·

30 98fr2/13.9-3·· ""²^

12· Verbindung gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß A -CH₂-, -CH₂(COOH)CH- und/ oder -CH₂(COO.AIiK)CH- ist* worin ALS eine Alkylgruppe mit bis 4 Kohlenstoffatomen iat*

13» Verbindung gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß A -CII₂(CCO. CH₃)GII - ist·

14· H-^T-Methoxycarbonyl-2-(4 '-

hexahydro-1 ♦ 4-( 3 · 5~dihydroxy-2~fflethyl )-oxazepin-7-yl-3 ß digitoxoayl-( 1—> 4)-0-ß-digitoxosyl-( 1 5ß-card-20(22)-enolid·

15· Verbindung geiaäß einem dor Ansprüche 2 biß 10 dadurch g»fceansöichnet,daßA² CH - ist.

16· 2!Tίsyy7 U4-(2-methyl)-oxazepin-7-yl-3ß-i^-ß-^ügitoxosyl-( 1—» 4)-0-ödigitoxoayl-( 1-» 4J7-I2ß· 14-dihydroxy-5ß-card-20( 22)-enolid ·

17. H-2£T-(4 «-Iiydroxy-3 •-_ii

dro-1.4-( 2-methyl )-oxaaepin-7-yl-3ß-^-ß-digit oxo-

~ card-20(22)-enolid«

18· H-a£M4^nydroXy^^f·5

30988.2/1393 -2?-

BAD ÖRtölNAt^c

digitoxosyl-(i—₉ 4)-O-ß-digitQxoeyl-(i—y 4)7-12ß»1 ^-dihydroxy«;? iMjard«20( 22 )-enolid.

19· Verfahren zur Ilerotellung einer Verbindung der Formel (VII) gemäß einem der Ansprüche 2, 5 bis 10, 15, 17 und 18, worin wenigstens einer der Beste X¹ und X ein Jodradioiootop ist, d a d u r ο h, eekennBeiota.net, daß man ein Jodradioieotop in eine Verbindung der Formel (VII)

1 2

Anspruch 2 und worin beide Beste X¹ und X Wasser-»

stoff sind, anstelle von wenigstens ainaa der Koste X und X^ einführt· ■ ^

20_# Verfahren genUß Anspruch 19 dadurch g · -konnaeiohaot _v daß man dio Einführung dadurch bewirkt, daß man die Vorbindung der Formel (VII)₉ worin beide Reste X und X² Waoserstoff sind« mit Radiojodidionen in Gegenwart vonOM!hlor«p»toluol8ttlfonamido)«iiatriua umsetzt·»

21· Verfahren gemäß eine» der Ansprüche 19 und 20 da« d u rc h gekonnaoichnot, daß Ν-/Γ-(4·- llydr oxypheny 1) -3-hydroaty prop-2-y3^-heacahy dr o-1 · 4- (2-ao t hyl) -oxaxepin-7-yl-3ß-^T-ß-Mlißitoxoflyl-( 1—τ 4)-0-8~dl£itoxosyl~ (1—9 4j7-12ß.14-dihydroxy*5C-card-20(22)-enolid radiojodicrt wird unter Bildung einer Verbindung

Τ-»( 4 Mfydroxy-3 •-^^^'••ii odophenyl)-»3-hydroxyprop-2-yl7*·

309882/1395

20(22)-ouolid und/oder

Γ-(4 »-Hydroxy-3^f ·5 *-di^f^{Ί ?}j7""

ioxahydro-1t4"-(2«^oothyl)-oxi»öpin«7-yl-3ß-_l^-ß~dißi·- toxoayl-( 1—» 4)~0~J3~digitoxoeyl-'( 1
card-20(22)-enolid.

22· Vorfahren srur Herat ellung einer Verbindung der Formel (VZI) gemäß einora der Ansprüche 2, 6 bis 1O₉ 12 und 16, wo-

1 2 '

rin beide Heoto X und X ue^oerotoff sind, dadurch gekennzeichnet _t daß can eine Verbindung der Formel (VIII)» wie im Anspruch 1 definiert, worin beide Beete Y und ¥ Hydroxygruppen sind, reduziert·

23· Verfahren gemäß Anspruch 22 dadurch ge« kennaeiohiiöt _t daß nan die Reduktion unter Verwendung einen Heduktionaaittelo, nümlich Kaliumborhydrid, Hatriuaborhydrid₍ Lithiuaborhydrid und/oder Litiiivunaluainiumhydrid, durchfuhrt· ·

24. Verfahren qooüQ einen der Ansprüche 22 und 23 da durch ßekennaoiohnet* daß mim T-(4 ••j

digitoxosyl-( 1-» 4J7-1^2ß· 14-dihydroxy-5ß~oörd-20(22)-enolid durch Beduktion von M-/T-*Iethoxycarbonyl-2«(4^f-"hydroxyphonyl)

·4-(3 •

7531

922

14-clihydroxy-5ß-card-eo(22)-enolid herstellt

25* Verfahren zur Radioijairrunouiiterauchun^ einer Verbindung dor Ponael (V)

(V)

309882/1393

worin

STRa OA ti

R" ffascerotoff iot| die Edste R^, R , R* und Z Wasserstoff sind, jeder dor Hesto R^ und R entweder V/ascerotoff oder eine Hydroxygruppe und yfonigatens einer Wasserstoff ist, TV eine Hydroxygruppen Z* eine Gruppe -CH^R , worin S' dio unten angegebene Bedeutung hat, ist und entweder die Reste Bf R und H ??aseerstoff sind» R eine Hydroxy gruppe, a « 0 und b μ 0_t 1 oder 2 ist oder die Reste R₁ R^ und Ii¹¹ Hydroxygruppen aind, R^ Wasserstoff, a « 1 und b « 2 ist, oder .

TT eine I^ydroxysruppe, R° eine I^fdroxyßruppo ist, boide Reste R und R² Waoeerotoff sind, einer dor Reste S' und Z Weaaerotoff und der andoro eine Gruppe -CBgR ist, worin R die untendefinierte Bedeutung hat, β =* 0 ißt und entweder die Reste R^, R*, E* und H Hydroxygruppen, H^_t Z' und R WosserBtoff oind und b « 0 ist oder die Rests R , R^_t R·^, R und Z liaaseratoff, R^? und R" %droxygritppon sind, R¹ ©ine Eetho^ygruppe und b « 1 ist, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) ein öemisch einer Verbindung der Formal (V), ein Antioerus der Verbindung &&τ Forsel (V) und eins Verbindung der Porcael (VlI) die der Verbindung der Formel (V) entspricht, wie in einoia der Anoprüche 2_t 5 bio 10, 15, 17 und 18 definiert, worin

1 5>

wonißotena einer der Reste Z und X ein Jodradioisotop ist, unoetzt, (b) die Antikörpor-vorbundene Reagenafraktion von der Hicht-AntikUrpor-verbuiidonen Fralction abtrennt und (o) die Radioaktivität von einer der KrcLktioaea odßt·

-33-

9 8 3-2/ 1353

BAD ORiGlNAL

26· Verfahren. gemUß Anspruch 25 daduroh gekennaoiohnet , daß oan suoaoaen nit der Vorbin* dung dor Porael (V), die Verbindung der Formel (VII)₉ ein Antiserusi, dos 'in einer Säugor- oder Vogelnpezioo, die gegen die Verbindung dor Fomel (V) reaktionsfähig ist, und ein Antiaeruia, das in einor zweiten sauger- oder Vo^elspezics, die gegen die Ircounoglobullno der ersten Spezieo reaktionsfähig ist, umsetzt»

27« UaterouchungsausrUstuug, die zur Verwendung beider Hadioiianunountorsuchung einer Verbindung dor Foraol (V)₉ wie in Anspruch 25 definiert, geeignet ist, dadurch g β -k&nnzelchnat § daß Bio wenigqtena vier Gefäße auf «aiöt, nobel in

einem ersten Gafttß eine Pufforlüeung, einem ßwoiton Gefäß ein Ceaioch von (a) oinen Antiaorua_f daa in einer sauger- odor Vogelspozios, die gegen did Verbindung der Foraol (V) reaktionsfähig iot, gezüchtet lot und (b) ein* Anticorun, daa in einer eneiten SUuger- oder Vogelopoziea, die eng** die Inmunoßlobine dor ersten äpeslea reaktionsfähig ist, gezüchtet iot,

einen dritten Gefäß eine Lösung einer Vorbindung der Forraol (VII) ι entsprechend der Verbindung der Formel (V)₉ wie in einen der Ansprüche 2, 5 bis 1O₉ 15, 17 und 18 definiert,

1 2

rrorin wenigstens einer der Reste X¹ und X ein Jodradioisotop ist und -

)09β»2/1393

einocx vierten Gefäß oine Standardlösung der Verbindung der yorool (V) in Serunforn aus einer anderen Säuger- oder Vogelopeaics ala der Gpozioo, in dor das Anticerun» das gegen die Verbindung der Fornel (V) reaktionsfähig ist, gezüchtet wurde» enthalten int, wofcoi der Inhalt von einem oder mehre-» reu dor OofSCo gegebenenfalls in gefriergetrocknetes Zustand sein kann·

28« Verbindung geaäß einer der Formeln (VII) und (VIII) im wesentlichen wie hier und unter besonderem Ilinweia auf die Beispiele 1 und 2 beschrieben»

29« Verfahren im weecnt liehen wie hior für die Herat ellung oinor Verbindung der Porael (VII) unter besonderen Hinweis imf die Beispiele 1 und 2 beachrieben«

30· Verfahren iia wesentlichon nio hier für die Hadioianunoimterauchunß einer Verbindung der Forael (V) unter besonderem Hinweis auf die Beispiele 3 und 4 bcsohrleben·

31· Uitorsuchun^aausrltstungi die für die Verwendung bei dtr RadioiTXTunounterguohung einer Verbindung der Formel (V) geeignet ist, im wesentlichen wie vorausgehend und unter

besonderem HinwoiD auf Beispiel 4 besehrieben«

32· Verfahren nur Herstellung einer üntersuohungsausrUstung» die Verwendung bei der nadioiromunountersuchung einer Verbindung dor Porncl (V) findet» ia wesentlichen wie vorausgehend . unter besonderen Hinweis auf Beispiel 4 beachrieben·

309882/1393

BAD ORIGINAL