DE2724762A1

DE2724762A1 - Radioimmunologische bestimmung von cortisol und dafuer geeignete cortisolderivate

Info

Publication number: DE2724762A1
Application number: DE19772724762
Authority: DE
Inventors: Masaharu Kojima; Nobushiko Nakazawa; Hiroshi Ogawa; Hisao Sone; Seiji Tachibana
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Priority date: 1976-06-01
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1977-12-15
Also published as: YU135277A; SE7706335L; FR2364454A1; JPS5835520B2; MX4971E; CA1073898A; DE2724762C3; US4277460A; FR2364454B1; US4190593A; JPS52148061A; SE430894B; DE2724762B2

Description

PATENTANWÄLTE DR.-ING. WOLFRAM BUNTE *" DR. WERNER KINZEBACH

D-eOOO mOnCHIN 4O. BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF <O88> 37 69 83 · TELCX S21S2Oa ISAIt D POSTANSCHRIFT: D-SOOO MÜNCHEN 43. POSTFACH 7SO

München, 1. Juni 1977 M/18 163

DAIICHI RADIOISOTOPE LABORATORIES, LTD. No. 10-5, Nihonbashi 3-chome

Tokio / Japan

Radioimmunologische Bestimmung von Cortisol und dafür geeignete Cortisolderivate

Cortisol (llß,17o(,21-Tri hydroxy-4-pregnen-3,20-dion) ist ein im Serum und Harn enthaltenes Steroid. Für die Bestimmung dieses Steroids wurden bereits mehrere radioimmunologische Methoden (Radioimmunoassay) vorgeschlagen, vgl. z.B. Anal.Lett. 5, S.757 (1972), ibid. 5, S.767 (1972); J. of Analytical Endocrinology and Metabolism 35, S.219 (1972); G.E.Abraham: Radioimmunoassay of Plasma Steroid Hormones in "Modem Methods of Steroid Analysis", Kapitel 21, Academic Press, New York and London (1973); Clinica Chimica Acta £6, S.319-330 (1976), The Japanese J. of Nuclear Medicine j_2» S.123 (1975), Clinical Endocrinology X (Tokio) 24., S.339 (1976). Bei der 94. Tagung der Japanischen Pharmazeutischen Gesellschaft (Sendai, 1974) schlugen Tsuji et al. vor, einen Antikörper gegen Cortisol durcf Injektion eines neuen Cortisol-Protein-Konjugats, d.h. Cortisol-6*-0-Hemisuccinat-BSA-Konjugat (Cortisol-6^-0-HS-BSA; Formel A) bei Kaninchen zu erzeugen, dieser Vorschlag ist in einer Arbeit von T.Nishina, A.Tsuji und D.K.Fukushima in Steroids 2A^ (6), S.861 (1974) beschrieben:

M/18 163

27247P2

HO

(A)

OCOCH₂Ch₂CO-BSA

Man nimmt an, daß sich dieser Antigentyp hervorragend für die i Bildung des speziellen Antikörpers eignet, da sämtliche funk- i tionellen Gruppen von Cortisol (die Hydroxylgruppen in llß.lfr- und 21-Stellung sowie die Oxogruppen in 3- und 20-Stellung) unverändert blieben. I

Andererseits eignet sich mit Tritium( H) markiertes Cortisol in immunologischer Hinsicht hervorragend als Tracer für den Radioimmunoassay. Die Synthese dieses Tracers verläuf.t jedoch [ sehr kompliziert, und seine Bestimmung durch Zählung der ^: Radioaktivität soll mit Hilfe eines Flüssigkeits-Scintil1ations Zählers durchgeführt werden. Daher weist dieser Tracer nur eine schlechte klinische Verwendbarkeit auf.

Die Erfinder haben nun bereits vorgeschlagen, die konjugierte Verbindung von Cortisol-6«-0-Hemisuccinat mit Tyrosinmethylester (Cortisol-6tf-0-HS-TME; Formel B) herzustellen und zur Bildung eines Tracers mit Radiojod zu markieren:

ms 163 ' ²⁷²^62

OCOCH₂CH₂CONHCHCOOCh₃

Als die Erfinder jedoch versuchten, diesen Tracer beim I Radioimmunoassay einzusetzen, ließ sich die korrekte Standardkurve nicht erzielen. Aufgrund weiterer Forschungsarbeiten wurde gefunden, daß die von Cortisol verschiedene immunologische Eigenschaft des Tracers durch die Ungenauigkeit der Standardkurve verursacht wird. Durch die Immunisierung mit Cortisol-Gtf-O-Hemisuccinat-BSA-Konjugat werden nämlich zwei j verschiedene Antikörper gebildet, d.h. ein Antikörper zum ^! Cortisol und ein Antikörper zum Cortisol-öa-O-Hemisijccinat (Antikörper zur Brücke) (die Hemisuccinyloxygruppe in den ι Formeln A oder B wird als "Brücke" bezeichnet). Während die Immunreaktion des Cortisols lediglich mit dem Antikörper zum , Cortisol erfolgt, kann der Tracer, d.h. radiojodiertes Cortisol-öoi-O-HS-TME, sowohl mit dem Antikörper zum Cortisol als auch mit dem Antikörper zur Brücke (Anti -Cortisol -6<x-0-Hemisuccinat) reagieren. Die Standardkurve von Cortisol zeigt daher den Gesamtwert der Cortisolmenge und des Ausmaßes der sich ergebenden Immunreaktion zwischen dem Tracer und dem ; Antikörper zur Brücke an. Diese Beziehung ist aus den Figuren:

2 und 3 ersichtlich, bezüglich welcher mit Tritium markiertes

nc Cortisol bzw. Cortisol-öci-O-HS-TME- J als Tracer verwen- ₍

det werden.

! 709850/1062

m/18 163 - Je -

Gegenstand der Erfindung ist ein neues radioimmunologisches Bestimmungsverfahren (Radioimmunoassay) für Cortisol. Ferner betrifft die Erfindung neue Cortisolderivate, die sich als Antigene oder Tracer für den Radioimmunoassay von Cortisol eignen. Im besonderen betrifft die Erfindung einen Radioimmunoassay, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der Tracer (markiertes Antigen) und das Antigen für die Immunisierung (Cortisol-Träger-Konjugat) in einer Kombination mit verschie- ι denen Brückenteilen verwendet werden. I

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft dem- ! gemäß eine Radioimmunoassay-Methode zur Bestimmung von Cortisol, die dadurch gekennzeichnet ist, daß man i

(a) immunologisch einen Antikörper zu Cortisol erzeugt, indem man ein Cortisol-Carrier-Konjugat der Formel

^H0

Brücke-R

worin R ein Protein oder ein Polypeptid darstellt und die Brücke eine -S-CH₂-CO- oder -OCO-CH₂-CH₂-CO-GrUpPe darstellt, einem Wirtsorganismus injiziert, der diesen Antikörper erzeugt,

(b) den gemäß (a) erhaltenen Antikörper und eine radioaktive Cortisol-Tracerverbindung der vorstehenden Formel ,

709850/1062

m/18 163 - ζ -

i worin R einen radiojodierten Tyrosin-niedrig-alkyl ester-I rest, einen radiojodierten Tyraminrest, einen radio- j i jodierten Histaminrest oder einen radiojodierten 7-Aminoj- \ heptanoyltyrosin-niedrig-alkylrest darstellt und die

Brücke für die Gruppe -S-CH₂-CO- oder -OCO-CH₂-CH₂-CO-

steht,

zu einer cortisolhaitigen Probe gibt,

(c) die gemäß (b) erhaltene Mischung inkubiert,

(d) antikörper-gebundenen Tracer von freiem Tracer abtrennt und

ι ι

(e) die Radioaktivität dieser antikörper-gebundenen Tracer-¹ verbindung oder der freien Tracerverbindung mißt;

wobei die Brücke in dem Cortisol-Carrier-Konjugat verschieden . ι ist von der Brücke in der radioaktiven Cortisol-Traoer-Verbin-I dung. I

j I

ι Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ! i schafft eine Cortisolverbindung der Formel: !

HO

S-CH₂-CO-R

worin R eine Hydroxygruppe, einen Tyrosin-niedrig-alkylester- ; rest, einen Tyraminrest, einen Histaminrest, einen 7-Amino- '■ heptanoyltyrosin-niedrig-alkylesterrest, einen radiojodierten ;

709850/1062

Tyrosin-niedrig-alkylesterrest, einen radiojodierten Tyraminrest, einen radiojodierten Histaminrest, einen radiojodierten 7-Aminoheptanoyltyrosin-niedrig-alkylesterrest, Serumalbumin, y-Globulin oder ein Polypeptid darstellt.

Figur 1 zeigt das IR-Spektrum von 6«-Carboxymethylthiocortisol, während die Figuren 2 bis 8 Standardkurven des Radioimmunoassays wiedergeben.

Zur Durchführung des Radioimmunoassays von Cortisol unter Verwendung von Antigenen mit unterschiedlichem Brückenteil haben die Erfinder 6<y-Carboxymethyl thiocortisol und dessen Derivate zur Verfügung gestellt, welche eine neue Carboxymethyithiobrücke enthalten und die nachstehende allgemeine Formel C besitzen:

HO

(C)

SCH₂COR

in der R eine Hydroxylgruppe, einen jodierten Tyrosin-C,-Cgalkylester-, jodierten Tyramin-, jodierten Histamin- oder j jodierten 7-Aminoheptanoyl tyrosin-C,-C,--al kyl esterrest oder einen Träger, wie ein Protein, z.B. Serumalbumin, f-Globulin, ' Thyroglobulin etc., oder ein Polypeptid, z.B. Polylysin, dar- ' !stellt. Geeignete Alkylreste sind z.B. der Methyl-, Äthyl-, \ Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, tert.-Butyl- und Pentylrest

etc.

709850/1062

M/18 163

272^762

Von diesen Verbindungen kann 6<*-Carboxymethyl thiocortisol (Cortisol-ötf-CMT) aus einer bekannten Verbindung nach folgender Gleichung hergestellt werden:

SCH₂COOH

0 1

IV

SCH₂COOCH₂CH₂Oh

VI

SCH₂COOH

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2 7 τ ' 7 r Μ/18 163 -Jt- ' ' ~^r

Gemäß obigem Reaktionsschema wird insbesondere eine bekannte Verbindung, 17o<,20,20,21-Bis-methylendioxy-4-pregnen-3,ll-dion j (I), das gemäß den Angaben in J. Am. Chem.Soc. 8_1, 1235 (1959), · ibid 82^_t 178 (1960) hergestellt werden kann, mit N-Bromsucci n- | imid in einer etwa äquimolaren Menge (d.h. Verbindung (I): j N-Bromsuccinimid = 1 g : 0,45 bis 0,6 g) in etwa 40 bis etwa 60 ml trockenem Benzol umgesetzt, wobei die Mischung etwa 7 ; bis 10 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt wird. Dabei erhält ι man 6-Brom-17o< ,20,20 ,21-Bi s-methyl endi oxy-4-pregnen-3 ,11-dion ^! (II). Dann wird das 6-Bromsteroid (II) mit Thioglykolsäure im Molverhältnis 1:2 vermischt, d.h. bezogen auf Verbindung II liegt die doppelte molare Menge Thioglykolsäure vor, und zur erhaltenen Mischung gibt man etwa 90 bis etwa 140 ml alkalisches Methanol. Anschließend wird etwa 3,5 bis 4,5 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, wobei man die Verbindung (III) erhält. Etwa 5,3 g der 3,11-Dioxo-Verbindung (III) werden mit etwa 200 bis etwa 300 ml trockenem Benzol, etwa 30 bis 50 ml Äthylenglykol und etwa 90 bis etwa 130 mg p-Toluolsulfonsäure (etwa 1/20 der Menge der Verbindung (III) vermischt und diese Mischung wird etwa 18 bis etwa 26 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, wobei man 3,3-Äthylendioxy-bis-methylendioxy-6a-(2-hydroxyäthoxy)-carbonylmethylthio-4-pregnen-ll-on (IV) erhält. Anschließend wird die 11-Oxo-Verbindung (IV) mit etwa 8 bis etwa 10 ml einer 10 %-igen wäßrigen K^CO-j-Lösung und mit etwa 80 bis etwa 120 ml Methanol vermischt und das ganze wird bei Raumtemperatur (etwa 20 bis 3O⁰C) etwa 26 bis etwa 38 Stunden lang gerührt. Man engt das so erhaltene Hydrolysat ein, löst den Rückstand in etwa 15 bis etwa 25 ml Wasser, gibt zu dieser Lösung etwa 35 bis etwa 45 ml Tetrahydrofuran und etwa 3 bis etwa 5 g Natriumborhydrid, kocht die erhaltene Mischung etwa 6 bis etwa 10 Stunden lang unter Rückfluß, gibt nochmals 1 bis etwa 2 g Natriumborhydrid hinzu und erhitzt anschließend nochmals etwa 12 bis etwa 18 Stunden lang unter Rückfluß, schließlich gibt man nochmals etwa 0,5 bis etwa 1,5 g Natriumborhydrid hinzu,

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um die Reduktion der Verbindung (IV) zu erreichen. Man erhält

: methylthio-4-pregnen-llß-ol (V). Die Schutzgruppen der Verbindung (V) können beispielsweise durch Hydrolyse entfernt

ι werden, wobei man 6(/-Carboxymethyl thiocortisol (VI) erhält.

j Die Hydrolyse kann so durchgeführt werden, daß man z.B. eine 50 %-ige wäßrige Essigsäurelösung tropfenweise zu etwa 300 mg Verbindung (V) gibt, bis sie sich vollständig aufgelöst hat, anschließend wird die erhaltene Lösung etwa 10 Stunden lang

^; unter Rückfluß erhitzt. '

ι :

! Da die Verbindung (VI) eine Carboxylgruppe aufweist, können ' ι verschiedene Verbindungen mit einer Aminogruppe über eine ;

Amidbindung mit ihr verknüpft werden. Beispiele für diese

j Verbindungen mit einer Aminogruppe sind Tyrosin, Tyramin, ' j Histamin, 7-Aminoheptanoyltyrosin (diese Verbindungen weisen

\ einen jodierbaren Phenyl- oder Imidazolkern auf), Proteine, j i wie Rinderserumalbumin (BSA), Kaninchenserumalbumin (RSA), j !^-Globulin oder Polypeptide, wie Polylysin. Die erhaltenen j

Verbindungen (hier als "Konjugate" bezeichnet) mit Proteinen

oder Polypeptiden können zur Immunisierung von Warmblütern

unter Bildung von Antikörpern verwendet werden. Die "Konjugate" mit einer einen Phenyl- oder Imidazolkern aufweisenden Verbin- \ dung können mit radioaktivem Jod markiert werden (der markier-'

! te Tyrosinmethylester-, Tyramin-, Histamin- oder 7-Amino- j ; heptanoyltyrosinmethylestertei1 wird als "markierter Teil" I j bezeichnet). Die markierte Verbindung kann als Tracer beim j

Radioimmunoassay verwendet werden. Die obige Verknüpfung kann j

ι mit Hilfe einer bekannten Reaktion zur Herstellung einer Amid- j

I bindung, z.B. der gemischten Anhydrid-Methode erreicht werden, \

: vgl. z.B. J.of Biol. Chem. 232, S.713 (1957), ibid. 234, S.1090; (1959); S. Lieberman et al: "Proceedings of Progress in Hormone

Research 165 (1959); Canad. J. Biochem. and Physiol. 39, S.967

(1961); Steroids 24_, S.477 (1974). Die Carboxylgruppe von z.B. '

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M/18 163

•Hf -

11

I Z μ ■ ^!; /

Tyrosin wird dabei vorzugsweise mit einem Alkylrest geschützt Der Verknüpfungsprozeß wird wie folgt am Beispiel von Tyrosin-? methylester erläutert. Man löst 6^-Carboxymethylthiocortisol I (VI), ein organisches Amin, z.B. N-Butylamin, Triäthylamin, j etc. und Isobutyl-chlorcarbonat in einem organischen Lösungsmittel, z.B. Tetrahydrofuran, Dioxan etc., in einem Mol verhältnis von 1 : etwa 0,8 bis etwa 1,2 : etwa 0,7 bis etwa 1,1 und läßt die Lösung bei etwa -1O⁰C bis etwa 1O⁰C etwa 2 bis etwa 5 Minuten lang stehen, wobei sich ein Anhydrid der Verbindung der Formel (VI) bildet. Dann gibt man Tyrosinmethylester zur Lösung, in einem Molverhältnis von 1 : etwa 0,9 bis etwa 1,3, bezogen auf Verbindung (VI). Diese Mischung läßt man bei etwa 4 bis etwa 2O⁰C etwa 5 bis etwa 30 Minuten lang stehen, dabei bildet sich ein Konjugat (XI). Formelmäßig läßt sich dies wie folgt darstellen:

SCH₂CONHCHCOOCh₃

NH₂CHCOOCH₃ VII

XI

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ι μ/18 163 - yc - 2724/6

Ganz analog zum obigen Reaktionsschema können Tyramin (VIII), Histamin (IX), 7-Aminoheptanoyltyrosin-methylester (X) und ähnliche Verbindungen oder Reste, die keinen Protein- oder Polypeptidrest darstellen, mit der Verbindung (VI) zu einem Konjugat verknüpft werden. Proteinreste, wie BSA, und Polypeptide, wie Polylysin, können in ganz analoger Weise mit Verbindung (VI) zu einem Konjugat verknüpft werden, wobei im Unterschied zur oben beschriebenen Verfahrensweise das gebildete Anhydrid und das Protein oder Polypeptid in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 8,5 bis etwa 9,5 gelöst und bei etwa 4°i

werden.

etwa 4 C etwa 30 Minuten bis etwa 2 Stunden lang umgesetzt

(VIII)

NH₂CH₂CH₂-< || (IX)

N H

NH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CONHCHCOOCh₃ (X)

Die Markierung des eine Phenyl- oder Imidazolgruppe aufweisen- ! den "Konjugats", wie jenes der Formel (XI), kann nach her- ' kömmlichen Methoden, z.B. nach dem Verfahren von Hunter und j Greenwood (Nature, Band 194, 1962, Seite 494) durchgeführt | werden. Als radioaktives Jod wird ein geeignetes Radioisotop j (wie J oder J) unter Berücksichtigung der Halbwertszeit ί

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M/18 163

27?A 7R

ausgewählt. Man kann dabei folgendermaßen arbeiten: 0,1 bis 5 pg Antigen, 20 bis 50 μΐ Phosphatpuffer (1/30 - 0,2 Mol, pH 6,5 - 8), 0,5 bis 2 Millicurie Na¹²⁵J und 5 bis 50 >ig (d.h etwa 10 jjI ) Chloramin-T werden miteinander vermischt und bei Raumtemperatur 10 Sekunden bis 1 Minute lang umgesetzt. Anschließend gibt man die etwa 2- bis 4-fache Gewichtsmenge Natrium-metabisulfit, bezogen auf Chloramin-T, zur Reaktionsmischung und läßt diese 30 Sekunden bis 2 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren, wobei man das markierte Konjugat erhält. Da für den Radioimmunoassay nur eine sehr geringe Menge des Tracers benötigt wird, kann man diesen nach einer anderen Methode herstellen, obwohl es nachteilig ist, die Synthese im großen Maßstab vorzunehmen. Tyrosinmethylester, Tyramin, Histamin oder 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester werden beispielsweise zunächst mit radioaktivem Jod markiert, um den "markierten Teil" zu erzeugen. Der "markierte Teil" wird dann mit dem Steroid der Formel (VI) umgesetzt. Die Markierung von Tyrosinmethylester , Tyramin, Histamiη'oder 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester kann nach der vorstehend beschriebenen Methode erfolgen. Die Tracer oder Zwischenprodukte können leicht nach bekannten Methoden, wie durch Chromatographie, beispielsweise Dünnschichtchromatographie (wenn eine geringe Produktmenge gereinigt werden soll) unter Verwendung von Kieselgel, gereinigt werden. Die mit radioaktivem Jod markierten Substanzen besitzen dieselben Eigenschaften wie die entsprechenden nicht-markierten Verbindungen (natürlich mit Ausnahme der Radioaktivität). Die Tracer und Zwischenprodukte können leicht durch Dünnschichtchromatographie identifiziert werden. Gewöhnlich verwendet man zur Bestimmung der radioaktiven Substanzen ein Dünnschichtprüfgerät.

Die nachstehenden Beispiele sollen das Verfahren zur Herstellung der Tracer und ihrer Zwischenprodukte näher erläutern.

98 50/1^6-2

Beispiel 1

(a) Man löst 1 g 17or,2O,2O,21-Bis-methyl endioxy-4-pregnen-3,ll-| dion (I) in 50 ml wasserfreiem Benzol. Nach Zugabe von 0,53 g N-Bromsuccinimid wird das Gemisch 8,5 Stunden unter Rückfluß gekocht. Anschließend destilliert man das Lösungsmittel im Vakuum ab und unterwirft den Rückstand der Chromatographie an neutralem Aluminiumoxyd unter Elution mit Benzol/ChIoroform (4:1). Dabei erhält man 0,85 g der öligen rohen Verbindung (II). Die nach weiterer mehrmaliger Reinigung der Verbindung erhaltenen Kristalle werden aus Aceton/Petroläther umkristallisiert. Dabei werden hellgelbe Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 173 bis 173,5⁰C erhalten.

Anal	yse	für C	23 2	9 6 ^r"	6	H	%
				C	6	,08	%
		Ber. :	57	.49		.17
		Gef.:	57	.52

11,1° (c = 0,24, Chloroform)

cm"¹: 1710, 1675(C=O), 1100, 945(C-O-C) ^!

Πια Χ

(b) Man löst 2,3 g der rohen Verbindung (II) in alkalischem

Methanol (0,8 g KOH wurden in 115 ml Methanol gelöst). j Man versetzt die Lösung tropfenweise mit 0,71 ml Thio- : glykolsäure, kocht das erhaltene Gemisch 4 Stunden unter : Rückfluß und dampft anschließend im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit 85 ml Wasser versetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 1 mit 10 %-iger wäßriger Salzsäure wird das Ge misch mit Methylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen. Dann extrahiert man mit 0,1 η wäßrigen Natrium-

bicarbonat, wäscht den Extrakt mit Äthylacetat, stellt die wäßrige, alkalische Lösung mit 10 %-iger Salzsäure auf pH 1 ein. Der entstehende Niederschlag wird mit Äthylacetat extrahiert und der Extrakt über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdesti1lation des Lösungsmittels im Vakuum erhält man 1,2 g der öligen Verbindung (III). j Die Verbindung wird durch Säulenchromatographie an Kiesel-: gel unter Elution mit Chloroform/Methanol (98:2) gereinigtj und das Diethylether umkristallisiert. Man erhält färb- ί lose Plättchen mit einem Schmelzpunkt von 223 bis 225⁰C.

Analyse	für C₂	5^H32°	8^{S :}	6	H
			C	6	,55
	Ber. :	60	.96		,60
	Gef.:	60	.94

NMR(CDCI₃)/: 0,84(3H,s,18-CH₃), 1_t46(3H,s,19-CH₃),

3,42(2H₁S₁-S-CH₂-), 3 ,72(IH ,d.d. , j = 4Hz , 16Hz , 16B-H)

IRvJEll"¹ cm'¹: 1710, 1680(C=O), 1100, 950(C-O-C)

Ml O X

Die Stellung der Carboxymethylthiogruppe bezüglich der
α-Bindung wird anhand des NMR-Spektrums bestimmt.

(c) Man löst 5,3 g der rohen Verbindung (III) in 250 ml wasserfreiem Benzol und versetzt die Lösung mit 40 ml Äthylenglykol und 110 mg p-Toluolsulfonsäure. Das Gemisch wird
bei angeschlossenem Wasserabscheider 22 Stunden unter
Rückfluß gekocht. Nach der Umsetzung wird die Benzol- ι schicht abgetrennt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Anschließend destilliert man das Lösungsmittel ab, wobei man 3,4 g der öligen Verbindung (IV) erhält. ;

21?Ll Γ °

ir

_IRv;iFi1m _cm-l_; 3520(0-H), 1745, 1720(C = O), 1280(CO-O),

ΠΙ α X

1100, 950(C-O-C)
Massenspektrum m/β: 580(M^f) , 535;^Μ+-45).

(d) Man löst 0,9 g der rohen Ve'-b ndi 3 ( Ϊ V^N in 100 ml Me i>unol . Nach Zugabe von 9 ml 10 'i-^e," Kaliumcarbonat wiru das Gemisch 32,5 Stunden be"> Raj~*emoeratu^r gerühmt. A--schließend destilliert man das '.^;~ s 'jng^^i tte' im Vakuum ab, löst den Rückstand in 20 ml W-sse-" und wascht 3nal mit Di äthyl ä ther. Die wäßrige Lösung «nrd mit 40 m¹ Tetrahydrofuran und sodann 4 g Natriurnborhydrid versetzt. Man kocht das Gemisch unter Rückfluß, wobei man nach 8 bzw. 15 Stunden 1,5 g bzw. 1 g Natriumborhydrid zusetzt. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Tetrahydrofuran im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird zur Zersetzung des Natriumborhydr"ds unter Eiskühlung portionsweise mit 50 ml 20 %-iger wäßriger Essigsäure versetzt. Dann extrahiert man das Gemisch mit Chloroform, wäscht den Extrakt mehrmals mit Wasser und trocknet ihn über Natriumsulfat. Nach der Vakuumabdesti11 ation des Lösungsmittels erhält man 300 mg der öligen Verbindung (V).

^^{m cm}"^{1: 3545}(°"^H)' 1725(C = O), 1100, 950(C-O-C).

Man löst 300 mg der unoereinigten Verbindung in 50 %-iger Essigsäure (die zur Entfernung von gelöstem O2 mit Stickstoffgas vorbehandelt wurde) und kocht die Lösung 9 Stunden im Stickstoffstrom unter RücKfluß. Anschließend dampft man das Lösungsmittel ab und unterwirft den Rückstand der ^: Kieselgel-Chromatographie unter Elution mit Benzol/Methanol (9:1). Dabei erhält iran 21 mg 1 Iß, 17<y,21-Tri hydroxy-6ix-carboxymethy 1 th i o-4-preunen-3 ,20-di on (VI) in Form farbloser Nadeln.

709850/1062
BAD ORIGINAL

27 ^r> ι ⁷^ r- ο

ff

Analyse für C₂₃H₃₂O₇S

C H

Ber.: 61,04 7,13

Gef.: 61,41 7,48

^il"¹ cm"¹: 3440(0-H), 1720, 1680(C = O)

Πι O X

Beispiel

(a) 30 /Ji m/30 wäßrige Phosphatpufferlösung werden mit etwa 1 ug Tyrosinmethy1 ester, Tyramin, Histamin bzw. 7-Amino-

heptanoyityrosinmethyl ester versetzt. Die Gemische werden 1

125 ^: jeweils mit etwa 1 mCi radioaktivem Natriumjodid (Na J) und 10 /jg Chloramin T versetzt. Man führt die Reaktion während 30 bis 60 Sekunden durch und versetzt das Gemisch , mit 20 /jg Natri ummetabi sul f i t.

(b) Man versetzt 10 ]iq 6:X-Carboxymethyl thiocorti sol (VI) mit

5 μg einer Tetrahydrofuranlösung mit einem Gehalt von 5 nl

Tri-η-butyl ami η, 20 γλ Tetrahydrofuran und 5 μΐ einer Tetrahydrofuranlösung mit einem Gehalt von 2,5 nl Chlor- \

kohlensäureisobutylester. Das Gemisch wird dann 3 Minuten I unter WirbelVermischung gerührt.

(c) Die gemäß (a) und (b) erhaltenen Reaktionsgemische werden j vereinigt und 15 Minuten unter WirbelVermischung gerührt. ■ Das Reaktionsgemisch oder dessen Äthylacetatextrakt wird i zur Reinigung der Dünnschichtchromatographie unterworfen. > Das heißt, man trägt das Reaktionsgemisch oder dessen '■ Extrakt punktförmig auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel ^ 60 Fp₅₄; Merck & Co; 6 χ 20 cm) auf. Nach Trocknung im Stickstoffstrom entwickelt man mit Äthylacetat/Methanol/ ! Wasser (85:15:1) (für die jodierten Histaminderivate)

7098 50-/-1-0-6-2 - - ■ - J

M/18 163

if -

Λ*

oder Chloroform/Methanol/Wasser (9:1:0 ,1)(fUr die übrigen Verbindungen, wie den jodierten Tyrosinmethylester, das jodierte Tyramin oder den jodierten 7-Aminoheptanoyltyrosinmethylester). Die erhaltenen Flecke werden jeweils isoliert und mit Methanol extrahiert. Die Extrakte werden jeweils zur Trockne eingedampft und die Rückstände jeweils in einer Pufferlösung gelöst, welche dann beim Radioimmunoassay eingesetzt wird.

Die erzeugten Tracer und Zwischenprodukte werden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Kieselgel 60 Fp54» Merck & Co.) bestimmt; ihre R^-Werte sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich.

TABELLE

	^Rfl	R_f2	>
TME-¹²⁵J Tym-¹²⁵J Him-¹²⁵J 7-AH-TME-⁵J	0	0,24 bis 0,28 etwa 0 0 bis 0,03 etwa 0
C-CMT	0,19 bis 0,22	etwa 0,02
C-CMT-TME-¹²⁵J C-CMT-Tym-¹²⁵J C-CMT-Him-¹²⁵J C-CMT-7-AH-TME-¹²⁵J	0,60 bis 0,63	etwa 0,30 0,22 bis 0,34 etwa 0,10 etwa 0,19	0,10
Na¹²⁵J	0,39 bis 0,44
C-HS-TME-¹²⁵J			0,13 bis 0,16

70-9 8 50/10-6-2-

M/18 163 - IS - 2 7 ? A 7 Π 2

In der Tabelle sind R*ι » Rf? ^un<^ ^f3 ^^{e erz}i^elten Werte bei Entwicklung mit Äthylacetat/Methanol/Wasser (85:15:1), Chloroform/Äthylacetat/Methanol/Wasser (5:5:1:0,1) bzw. Chloroform/Methanol/Wasser (9:1:0,1). Die Abkürzungen in der Tabelle haben folgende Bedeutungen:

6 -Carboxymethylthiocortisol

Tyrosinmethy I ester

Tyramin

Histamin

7-Aminoheptanoyl

Cortisol-606-O-hemisuccinat.

Die Erzeugung des Antikörpers zu Cortisol kann nach einer bekannten Methode erfolgen, vgl. z.B. Steroids 2J3, S.49 (1974) ibid. £3, S.203 (1974). Man emulgiert beispielsweise ein Cortisol-Träger-"Konjugat" (1 mg) in komplettem Freund-Adjuvans (1:1) und injiziert die Emulsion Warmblütern, wie Kaninchen, Ziegen, Schafen oder Meerschweinchen. Die'Auffrischungs- bzw. Booster-Injektionen (0,5 mg) werden in ' 1-monatigen Abständen während 5 bis 6 Monaten durchgeführt. Anschließend entnimmt man den Tieren Blutproben und frak- ·, tioniert das daraus gewonnene Serum mit Ammoniumsulfat, um | eine IgG-Fraktion zu gewinnen. Die IgG-Fraktion wird gegen j 0,002m Natriumchloridlösung dialysiert und als Antikörper ! für den Radioimmunoassay verwendet. I

Der Radioimmunoassay von Cortisol unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Antikörpers und Tracers kann nach ■ einem herkömmlichen Verfahren, z.B. Adsorbens-Methoden, wobei Aktivkohle, Florisil, Ionenaustauscherharze und dergleichen, ' unspezifische Ausfallungsmethoden (oder J^-Gl obul in-Ausf al 1 ung) unter Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat, Polyäthylenglykol, Äthanol und dergleichen, Festphasen-Methoden, "double antibody"-Methoden etc., durchgeführt werden. Derartige Methoden sind z.B. 1n den auf Seite 1 der vorliegenden Beschreibung

zuerst genannten Literaturstellen beschrieben, vgl. aber auch S.G.Hillier und K.Griffith: Steroid Immunoassay, E.H.D.Cameron, Ed. Alpha Omega Publishing Ltd., Cardiff, Wales UK (1975). Beispielsweise werden der verdünnte Antikörper (IgG-Frak- j tion) in Boratpufferlösung, der Tracer (10 000 bis 20 000 cpm) und die Standardlösung (oder die Probe) 60 Minuten bei 4⁰C inkubiert. Das erhaltene Gemisch wird mit dextranbeschichteter Aktivkohle (Holzkohle) (1 ml) ver- ; setzt. Das Gemisch wird dann unter Wirbelvermischung ge- ; rührt, 10 Minuten bei 4⁰C stehengelassen und danach 20 Minu- ' ten bei 2000 g zentrifugiert. Man saugt den überstand ab und bestimmt die Radioaktivität des Rückstands auf übliche Weise, z.B. mit einem Szintillationszähler.

Einige erhaltene Standardkurven sind aus den Figuren 2 bis 8 ; ersichtlich, wobei Anti-Cortisol-6*-0-HS-BSA als Antikörper

verwendet wurde. I

Aus den Figuren geht folgendes hervor: Wenn der Tracer dieselbe Brücke wie das Cortisol-BSA-"Konjugat" (0-Hemisuccinylgruppe) aufweist, fällt die Standardkurve von Cortisol oder Cortisol-6<y-CMT nicht genügend ab. Eine Erklärung für diese Tatsache kann in folgendem bestehen. Selbst wenn ein hoher Oberschuß (bezogen auf den Tracer) der Standardverbindung (Cortisol oder Corti sol-6o^-CMT) zur Umsetzung gebracht wird, ist der Tracer immer noch mit dem Antikörper (der als der Antikörper zur Brücke angesehen wird) verbunden, und das Präzipitat weist eine beträchtliche Radioaktivität auf (in

Figur 3: die Kurve von Cortisol und Cortisol -6W-CMT; in Fi-

125 gur 5: die Kurve von Cortisol-by-HS-TME- J). Wenn der Tracer dagegen eine andere Brücke (Carboxymethylgruppe) als das Cortisol-BSA-"Konjugat" aufweist, fällt die Standardkurve bei der hohen Dosis der Standardverbindung genügend ab. Die Einführung einer unterschiedlichen Brücke in den Tracer bewirkt somit, daß die Standardkurve empfindlicher wird.

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Bei der erläuterten Ausführungsform wird Cortisol-6«-0-Hemisuccinat-BSA-"Konjugat" als Antigen für die Antikörpererzeugung verwendet. βιχ-Carboxymethyl thiocorti sol -BSA-"Konjugat" kann jedoch ebenso gut als Antigen für die Antikörperbildung eingesetzt werden. In diesem Falle soll der Tracer eine andere Brücke, z.B. eine Hemisuccinyloxygruppe, aufweisen.

Die in den Beispielen und in der Beschreibung angegebenen j Lösungsmittelverhältnisse sind Volumenverhältnisse.

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Leerseit

Claims

M/18 163 - 2ΐ - L ' I A / ο λ Patentansprüche

1. Radioimmunologisches Verfahren (Radioimmunoassay) zur Bestimmung von Cortisol unter Verwendung eines markierten j Cortisols als Tracer und eines durch Immunisierung mit : einem Cortisol-Träger-Konjugat erzeugten Antikörpers, ! wobei der Tracer und das Cortisol-Träger-Konjugat den I markierten Teil bzw. Träger in 6</-Stel lung von Cortisol ; aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Tracer und ein Cortisol-Träger-Konjugat mit unterschiedlicher Brücke verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brücke eine Hemisuccinyloxy- oder Carboxymethylthiogruppe verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brücke des markierten Cortisols bzw. Cortisol-Träger-Konjugats eine Carboxymethylthio- bzw. Hemisuccinyl· oxygruppe verwendet.

4.7 Verbindungen der allgemeinen Formel

SCH₂COR

709850/1062 ORIGHNAL INSPECTED

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in der R eine Hydroxylgrupp-, einen Tyrosin-nieder-alkylester-, Tyramin-, Histamin-, 7-Aminoheptanoyltyrosin-nieder-al kylester- , radiojodierten Tyrosin-nieder-alkylester-, radiojodierten Tyramin-, radiojodierten Histamin- oder radiojodierten 7-Aminoheptanoyltyrosin-nieder-alkylesterrest, Serumalbumin, y^-Globulin oder ein Polypeptid bedeutet.

5. öof-Carboxymethyl thiocortisol.

6. ötf-Carboxymethylthiocortisol-Tyrosinmethyl ester.

7. Radiojodierter 6y-Carboxymethylthiocortisol'Tyrosinmethyl ester.

8. Radiojodiertes βΑ-Carboxymethylthiocortisol-Tyramin.

9. Radiojodiertes 6rf-Carboxymethylthiocortisol-Histamin.

10. Radiojodierter 6y-Carboxymethylthiocortisol'7-Aminoheptanoyl tyrosinmethylester.

11. ötf-Carboxymethylthiocortisol·Rinderserumalbumi n·Konjugat.

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