DE2837087A1

DE2837087A1 - Digoxigeninderivate und ihre verwendung im radioimmunassay

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Publication number: DE2837087A1
Application number: DE19782837087
Authority: DE
Inventors: Jack Bernstein; Ravi K Varma; Berthold R Vogt; Frank L Weisenborn
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1977-09-01
Filing date: 1978-08-24
Publication date: 1979-03-15
Also published as: IT7850893A0; JPS5448753A; GB2003480A; NL7808649A; GB2003480B; CA1119163A; FR2401936A1

Description

, _ 2837Ό8V

u.Z.: M 845

Case: Τ-829 836-S

E.R. SQUIBB & SONS, INC.,
Princeton, N.J., V.St.A.
10

" Digoxigeninderivate und ihre Verwendung im Radioimmunassay "

R.S.' Yalow und S.A. Berson haben in dem Buch "In Vitro Procedures With Radioisotopes In Medicine", International Atomic Energy Agency, Wien, 1970, S. 455, das Prinzip des Radioimmunassays folgendermaßen definiert:

Ein unmarkiertes Antigen in einer unbekannten Probe konkurriert mit einem radioaktiv markierten Antigen (Tracer) bei der Bindung an einen Antikörper und vermindert dadurch die Bindung des markierten Antigens. Das Ausmaß der kompetitiven Hemmung, das bei der unbekannten Probe beobachtet wird, wird verglichen mit dem Ergebnis einer bekannten Standardlösung, und danach wird die Antigenkonzentration der unbekannten Substanz bestimmt.

Der Radioimmunassay erfordert einen spezifischen Antikörper, ein radioaktiv markiertes Antigen, eine reine Probe des zu bestimmenden Antigens als Standard und Einrichtungen zur Trennung von Antikörper-gebundenem Antigen von freiem Antigen. Der Radioimmunassay folgt dem Grundprinzip der Sättigungsanalyse, d.h. der Konkurrenz zwischen markiertem und unmarkiertem Antigen, um eine begrenzte Anzahl von Bindungsplätzen des Antikörpers.

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Beim Zusammenbringen eines markierten Antigens mit einem nicht-markierten Antigen und einem Antikörper stehen die Menge des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens und die Menge des restlichen (freien) markierten Antigens in direkter Beziehung zur Mengendes vorhandenen nicht-markierten Antigens, wenn eine bestimmte Menge Antikörper vorliegt. Somit kann bei Verwendung einer konstanten Menge Antikörper und markiertem Antigen und bei Verwendung bekannter Konzentrationen an nicht-markiertem Antigen eine Eichkurve gezeichnet werden, in der die Antigenkonzentration gegen die Menge des gebundenen markierten Antigens oder gegen die Menge des freien markierten Antigens oder gegen ein Verhältnis der beiden Messungen aufgetragen ist. Die Antxgenkonzentratxon in einer unbekannten Probe kann

1^' aus der Eichkurve durch Bestimmung des gebundenen oder freien markierten Antigens oder einem Verhältnis der .beiden Messungen abgelesen werden, wenn die unbekannte Probe mit der zur Herstellung der Eichkurve verwendeten Menge an markiertem Antigen und Antikörper vermischt wird. Bei sämtlichen Methoden des Radioimmunassay's ist es erforderlich, den Antigen-Antikörper-Komplex vom freien radioaktiv markierten Antikörper bzw. Tracer abzutrennen. Zu diesem Zweck wurden die verschiedensten Trennmethoden entwickelt, beispielsweise die Elektrophorese, Chromatographie, Ionenaus-

^ tausch, Adsorption an mit Dextran beschichteter Holzkohle, Talcum oder Cellulose. Ferner ist eine Anzahl von Methoden bekannt, bei denen der Antikörper an eine feste Phase gebunden wird.

Der Ausdruck "Antigen" umfaßt im Radioimmunassay auch Substanzen mit beschränkter Immunogenität. Bei der Bestimmung derartiger Substanzen kann die Substanz mit einem immunogenen Träger, gewöhnlich einem Protein, gekoppelt werden, um ihre Immunogenität zu erhöhen. Eine nxcht-immunogene Substanz, die Immunogenität annimmt, wenn sie an einen Träger gebunden ist, wird als Hapten bezeichnet.

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Die Hauptindikation für Herzglykoside wie Digoxin ist die manifeste myokardiale Insuffizienz. Am besten spricht die Insuffizienz bei linksventrikulärer Druck- und Volumenüberlastung an, z.B. bei Hypertonie, Aortenvitien, Ventrikelseptumdefekten. Bei rechtsventrikulärer Druck- und Volumenüberlastung, beim akuten und chronischen ßor pulmonale " darf eine Therapie nur mit kleinen Dosen gut steuerbarer Glykoside unter vorsichtiger Dosissteigerung begonnen werden, um eine akute Druckerhöhung in den Pulmonalarterien und Überfüllung der Lungengefäße zu vermeiden. Bei Angina pectoris ist eine Glykosid-Medikation bei vergrößertem Herzen und Tendenz zu erhöhten enddiastolischen Ventrikeldruckwerten indiziert, da sowohl eine Abnahme der Wandspannung als auch eine Verlängerung der Diastole die Durchblutung Endocartna-Myokardschichten fördert.

Wichtige Indikationen betreffen die Therapie von Herzrhythmusstörungen mit Herzglykosiden. Für die Bestimmung der Plasmaspiegel von Herzglykosiden steht seit einigen Jahren der Radioimmunassay zur Verfügung. Wegen der Schwierigkeiten der Nachweismethoden ist jedoch heute noch in den seltensten Fällen möglich, eine Glykosid-Therapie anhand von Blutspiegelmessungen zu kontrollieren.

Bei der Entwicklung eines Radioimmunassays für Digoxin steht die Herstellung eines radioaktiv markierten Antigens im Vordergrund. Als Radioisotope kommen unter anderem

14 125 1^1 14

Tritium, C, J und ^lJlj in Frage. Tritium und ' _c erfordern die Messung der ß-Strahlung im Flüssigkeits-Szintillationszähler. Dies erfordert eine aufwendige und kostspielige Probenvorbereitung. J und J sind deshalb bevorzugt. Aus bekannten Gründen, beispielsweise der Halbwertszeit, der Strahlungsgefahr und der Zählausbeute,

125
ist das Radioisotop J besonders bevorzugt.

Digoxin läßt sich nicht unmittelbar mit dem Radioisotopjod jodieren. Es ist deshalb erforderlich, ein Digoxin-

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20 25 30

Ί derivat zu verwenden, das sich leicht jodieren läßt. Die Wahl bzw. Entwicklung derartiger Derivate hängt vor allem von der Affinität des Derivats für die Digoxinantikörper ab. Die Affinität des Derivats für die Antikörper soll natürlich möglichst nahe bei der Affinität des Digoxins für die Digoxinantikörper liegen.

In der US-PS 3 855 208 sind bestimmte Digoxigeninderivate beschrieben, die nach Markierung mit einem Radioisotop als Tracer im Radioimmunassay für Digoxin verwendet werden können. Unter den Digoxigeninderivaten befinden sich Verbindungen der allgemeinen Formel

15

OH

in der R eine Hydroxyl- oder Acetyloxygruppe und R, ein a Jd

Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet. Die Gruppe B wird ganz allgemein als ein Diacylrest einer Dicarbonsäure bezeichnet, wobei die Carboxylgruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen stehen, beispielsweise die Succinyl-, Maleyl-, Fumaryl- oder o-Phthaloylgruppe. Bevorzugt ist die Succiny!gruppe.

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2 83 7 08 Τ«

In der BE-PS 839 606 sind unter anderem folgende Haptene beschrieben, die radioaktiv markiert als Tracer im Radxoimmunassay für Digoxin verwendet werden können: 3-Succinyldigoxigenin-L-tiyrosin,
S-Succinyldigitoxigenxn-L-tyrosin,
3-Adipyldigoxigenin-Ii-tyrosin,
3-Adipyldxgitoxxgenin-L-tyrosin,
S-Carbodigoxigenin-glycyl-L-tyrosxn und S-Carbodigitoxigenin-glycyl-L-tyrosin.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Digoxigeninderivate zu schaffen, die sich leicht radioaktiv markieren lassen, die eine starke Affinität für die Antikörper von Digoxin aufweisen und sich als Tracer im Radioimmunassay zur Bestimmung von Digoxin in Körperflüssigkeiten eignen,. Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können aus einem Digoxigeninderivat der allgemeinen Formel II

{ID

HO.

und einem Carbonsäureanhydrid der allgemeinen Formel III

ca,-

(III)

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hergestellt werden. Der Rest R₁ bedeutet einen Älkanoylrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Acetylgruppe. X bedeutet eine Methylengruppe oder ein Sauerstoffatom.

Digoxigenin-12-acetat, die bevorzugte Ausgangsverbindung, die unter die allgemeine Formel II fällt, Glutarsäureanhydrid und Diglykolsäureanhydrid sind bekannte Verbindungen. Die anderen Digoxigeninderivate der allgemeinen Formel II mit einer geschützten Hydroxylgruppe in der 12-Stellung können analog dem Verfahren zur Herstellung von Digoxigenin-12-acetat hergestellt werden.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel II können mit den ¹⁵. Verbindungen der allgemeinen Formel III in Gegenwart einer organischen Base zu den Verbindungen der allgemeinen Formel IV

(iv)

ο " a

O=C-CH₂-X-CH₂-C-OH

umgesetzt werden. Beispiele für verwendbare organische Basen sind stickstoffhaltige heterocyclische Basen, wie Pyridin, und tertiäre Amine, wie Triäthylamin. Die umsetzung wird vorzugsweise bei erhöhter Temperatur durchgeführt.

Die Umsetzung der Digoxigeninderivate der allgemeinen Formel IV mit einem Ester von L-Tyrosin, vorzugsweise L-Tyrosinmethy!ester, oder einem Salz des Tyrosinesters mit einer Säure liefert eine Verbindung der allgemeinen Formel V

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OH

ι ^Η S S

O=C-CH₀-X-CH₉-C-NH-CH-C-OCH₃

(V)

Die Umsetzung kann in einem inerten organischen Lösungsmittel unter wasserfreien Bedingungen in Gegenwart einer organischen Base und in Gegenwart eines Acylierungsmittels, wie Pivaloylchlorid, Chlorameisensäureisobutylester oder N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-i,2-dihydrochinolin, durchgeführt werden. Die Reaktxonstemperatur liegt im Bereich von etwa -10 bis -15⁰C. Durch Verseifung der Verbindungen der allgemeinen Formel V werden die entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel I erhalten.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können mit einem

125 131 125

Radioisotop, vorzugsweise J oder J, insbesondere J, in an sich bekannter Weise radioaktiv markiert werden. Es wird ein radioaktiv markiertes Hapten der allgemeinen Formel" VI

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- ΙΟ -.0

p—r

O=C-CH₀-X-CH₀-C-NH-CH-C-OH 2 2

(VI)

erhalten. Der Stern (*) in der Formel VI zeigt die Markierung mit einem Radioisotop. Ein Beispiel für die bekannten Verfahren ist das Verfahren von Hunter und Greenwood, Nature, Bd. 194 (1962), S. 495. Die markierten Verbindungen der allgemeinen Formel VI sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die markierten Verbindungen der allgemeinen Formel VI können als Tracer im üblichen Radioimmunassay eingesetzt werden. Derartige Verfahren sind beispielsweise beschrieben von B.M. Jaffe u. H.R. Behrmann,

, "Methods of Hormone Radioimmunoassay",

Academic Press, New York, 1974, und S.A. Berson u. Mitarb. "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology", Bd. 3, Steroid Hormones, North Holland Publ. Comp., Amsterdam, 1975.

Die radioaktiv markierten Verbindungen der Erfindung sind besonders geeignet als Reagentien in dem automatisierten Radioimmunassay, der in der US-PS 4 022 577 beschrieben ist.

•Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispieli

(3ß,5ß, 12ß) -S-ZS-ZZL-i-Carboxy^- (4-hydroxyphenyl) -äthyl/-amincL7-1 ,S-dioxopentyloxy/-^, 14-dihydroxycard-20 (22)-enolid

A) (3ß,5ß,12ß)-12- (Acetyloxy)-3-(4-carboxy-i-oxo-butoxy)-14-hydroxycard-2Q(22)-enolid

Eine Lösung von 303 mg Digoxigenin^-12-acetat und 285 mg destilliertem Glutarsäureanhydrid in 5,0 ml wasserfreiem Pyridin wird 7 Stunden in einem ölbad auf 125 bis 130⁰C erhitzt. Danach wird die erhaltene Lösung abgekühlt, in kal-

-(O te lOprozentige Salzsäure gegossen und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (350 mg) wird der präparativen Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten und mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (95 : 5) als Laufmittel unterworfen. Es werden 282 mg der Titelverbindung vom F. 93 bis 96⁰C erhalten.

B) (3ß,5ß,12ß)-12- (Äcetyloxy)-14-hydroxy-3-//"5-/Zi -/"(4-

hydroxyphenyl)-methyl7-2-methoxy-2-oxoäthyl7-amino7-1,5- dioxopentyl7-oxy7-card-20(22)-enolid

Eine Lösung von 220 mg (3ß,5ß,12ß)-12-(Äcetyloxy)-3- (4-carboxy-1-oxo-butoxy)-14-hydroxycard-20(22)-enolid in wasserfreiem Dichlormethan, das 0,04 ml Triäthylamin und 0,052 ml Pivaloylchlorid enthält, wird auf -10 bis -15⁰C abgekühlt. Sodann wird die erhaltene Lösung mit einer Lösung von 88 mg L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid in einem auf" -15⁰C vorgekühlten Gemisch von 0,072 ml Tri-n-butylamin und 2,0 ml Pyridin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten bei -10 bis -15°C und weitere 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch mit kaltem Wasser versetzt, mit 6 η Salzsäure angesäuert und mit Dichlormethan extrahiert. Der Dichlormethanextrakt wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, eingedampft und der Rückstand (342 mg) der präparativen Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten mit einem Gemisch von

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Chloroform und Methanol (90 : 10) unterworfen. Es wird die Titelverbindung vom F. 116 bis 120⁰C erhalten.

C) (3ß,5ß,12ß)-3-/5-/7L-1-Carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl7-amino_7-1 ,5-dioxopentyloxy7-12 ,14-dihydroxycard-20 (22) - enolid

Eine Lösung von 100 mg (3ß,5ß,12ß)-12-(Acetyloxy)-14-hydroxy-3-/Z5-/7/l -/T(4-hydroxyphenyl) -methyl/^-methoxy^-oxoäthyl/-amino_/-1,5-dioxopentyl7-oxy/-card-20(22)-enolid in 10 ml Methanol und 6 ml Wasser wird 3 1/2 Stunden bei Raumtemperatur mit 10 ml einer 3prozentigen Kaliumcarbonatlösung gerührt. Danach v/ird das Reaktionsgemisch mit 10prozentiger Salzsäure angesäuert, das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird einmal mit einer geringen Menge Kochsalzlösung gewaschen, sodann getrocknet und eingedampft. Es hinterbleiben 89 mg einer Schmiere. Das Produkt wird an einer 1,0 mm dicken Kies-elgelplatte mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (3:1) als Entwicklungslösungsmittel der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Es werden 48 mg der Titelverbindung vom F. 208 bis 215⁰C und 21 mg des 12-Acetats erhalten.

Beispiel 2

(3ß,5ß,12ß) -Z-CLCLl-β -Carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)-äthyüjaminQ7-2-oxoäthoxy7-acetyl7-oxyJ-12,14-dihydroxycard-20 (22)-enolid

A) (3ß ,5ß, 12ß) -12- (Acetyloxy) -3-/7T(carboxymethoxy) -acetyl/-oxyJ-14-hydroxycard-20(22)-enolid Ein Gemisch von 800 mg Digoxigenin-12-acetat und 624 mg Diglykolsäureanhydrid in 25 ml wasserfreiem Pyridin wird 7 Stunden unter Ausschluß von Feuchtigkeit unter Rückfluß erhitzt. Danach wird das Reaktionsgemisch abgekühlt, auf die Hälfte seines ursprünglichen Volumens eingedampft und mit einer Lösung von 5,3 g Kaliumcarbonat in 122 ml Wasser versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten gerührt und

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sodann mit 6 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 bis 4 angesäuert. Die entstehende Fällung wird abfiltriert, mit 10- ml . kaltem Wasser gewaschen und 2 Stunden bei 50°C getrocknet.

Es werden 1,2 g eines Rohprodukts erhalten. 5

Das Rohprodukt wird an 5 präparativen Kieselgelplatten chromatographiert. Als Entwicklungslösungsmittel wird ein Gemisch von Chloroform und Methanol (3:1) verwendet. Die Bande mit dem gewünschten Produkt wird abgeschabt und viermal mit jeweils 300 ml eines 1 : 1-Gemisches von Chloroform und Methanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Es hinterbleiben 1,016 g der Titelverbindung. Nach Umkristallisation einer geringen Menge aus wäßrigem Methanol werden flockige weiße Kristalle vom P. 200 bis 201⁰C erhalten.

B) (3ß , 5ß, 12ß) -12- (Acetyloxy) -14-hydroxy-3-/ZZ"2-/Zi ~/*(4-hydroxyphenyl) -methyl/^-methoxy—2-oxoäthyl7-amino7-2-oxoäthoxy7-acetyl7-oxy_7card-20 (22) -enolid Eine Lösung von 700 mg (3ß,5ß,1 2ß) -12- (Acetyloxy) -3-/Z"(carbomethoxy)-acetyl7-oxy/-14-hydroxycard-20(22)-enolid in 12,6 ml Methylenchlorid wird mit 0,163 ml Pivaloylchlorid und 0,126 ml Triäthylamin versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf -5 bis 0°C abgekühlt, mit einer auf -5 bis 0°C abgekühlten Lösung von 276 mg L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid und 0,224 ml Tri-n-butylamin in 6,27 ml Pyridin versetzt und 10 Minuten gerührt. Sodann wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 2 1/2 Stunden gerührt. .

^O Danach wird das Reaktionsgemisch mit 6 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 bis 5 angesäuert und dreimal mit jeweils 50 ml M'.ethylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte werden vereinigt, mit 50 ml Iprozentiger Natriumbicarbonatlösung und 50 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat

^ÜO getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Es hinterbleiben 1,0T g Rohprodukt. Das Rohprodukt wird zwei-

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·- 14 -

mal an Kieselgelplatten der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die Platten werden mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (9 : 1) eluiert. Die Bande mit dem Produkt wird zweimal mit jeweils 300 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol (9 : 1), sowie dreimal mit jeweils 300 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol (5:1) extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Es werden 714 mg der Titelverbindung als amorpher Feststoff vom F.121 bis 125°C erhalten.

C) (3ß,5ß,12ß)-3-/7ΖΖ2-/Ί-Carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)- äthyl7-amihoJ^-2-oxoäthoxy7-acetyl7-oxy7-12 ,14-dihydrooxycard-20 (22) -'enolid

Eine Lösung von 100 mg (3ß,5ß,12ß)-12-(Acetyloxy)-14-hydroxy-3-/7"/2-/7i -/"(4-hydroxyphenyl) -methyl7-2-methoxy-2- . oxoäthylj^?-aminq7-2-oxoäthoxy_7-acetyl7-oxy7-card-20 (22) enolid in 10 ml Methanol wird auf 10⁰C abgekühlt und mit einer Lösung von 77,4 mg Kaliumcarbonat in 2,2 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 10 bis 15⁰C gerührt, sodann mit 1 η Salzsäure' angesäuert und dreimal mit jeweils 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylaeetatextrakte werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Es hinterbleiben 100 mg Rohprodukt.

Das Rohprodukt wird der präparativen Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (3 : 1) unterworfen. Die Produktbande wird dreimal mit jeweils 100 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol (4 :1) extrahiert. Der Extrakt wird eingedampft. Es werden 19 mg der Titelverbindung vom F. 138 bis 145⁰C erhalten.

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ORIGINAL INSPECTED

t Beispiel 3

Markierung von (3 ß, 5 ß, 12S) - 3-/5-/"/L-1-carboxy-2- (4-hydroxyphenyl) -äthyl7~aiaino7-1 ,5-dioxopentyloxy7-12 , 1 4-dihydroxycard- 20(22)-enolid mit radioaktivem Jod

125 10 ml (etwa 6 mCi) einer wäßrigen Lösung von Natrium J werden in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 10 ml (1 mg/ml) einer Lösung von (3ß,5ß,12ß)-3-/5-/ZL-1-Carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl7-aminq7-1,5-dioxopentyloxy7-12,14-dihydroxycard-20(22)-enolid in Methanol enthält. Das Ge-

-IO faß wird mit einem Stopfen verschlossen und durch den Stopfen werden 25 ml (2 mg/ml in 0,5 m. Phosphatpuff er,. pH 7,5) einer Chloramin-T-Lösung injiziert. Der Gefäßinhalt wird gut gemischt und 5 Minuten stehengelassen. Sodann werden durch den Stopfen 20 ml (3 mg/ml in 0,5 m Phosphat puff er, pH 7,5) einer Lösung von Natriummetabisulfit injiziert, um die Reaktion abzubrechen.

Das Reaktionsgemisch wird auf eine mit 20 ml Sephadex G-10 gefüllte Säule gegeben und mit 0,05 m Trisacetatpuffer> pH 6,5, eluiert. Mittels eines FraktionenSammlers werden pro Röhrchen 30 Tropfen aufgefangen. Freies Jod tritt aus der Säule beim Röhrchen Nr. 20 aus. Das jodierte Produkt tritt in den Fraktionen 40 bis 70 aus.

Beispiel 4 Markierung von (3ß ,5ß, 12ß) -3-ff££2-jQ] -Carboxy-2- (4-hydroxyphenyl)—athylj-aminoj^-oxoathoxyy-acetylj-oxyj-i2,14- dihydroxycard-20(22)-enolid mit radioaktivem Jod

125 10 ml (etwa 6 mCi) einer wäßrigen Lösung von Natrium J werden in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 10 ml (1 mg/ml) einer Lösung von (3ß,5ß,12ß)-3-/Z"ZZ2-Z^:l-carboxy-2- (4-hydroxyphenyl) -athylZ-aminoy^-oxoathoxyj-acetylJ-oxyy-12,14-dihydroxycard-20(22)-enolid in Methanol enthält. Das Gefäß wird mit einem Stopfen verschlossen, und durch den Stopfen werden 25 ml (2 mg/ml in 0,5 m Phosphatpuffer, pH 7,5) einer Chloramin-T-Lösung injiziert. Der Gefäßin-.

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1 halt wird gut gemischt und 5 Minuten stehengelassen. Sodann werden durch den Stopfen 20 ml (3 mg/ml 0,5 m Phosphatpuffer, pH 7,5) einer Lösung von Natriummetabisulfit injiziert, um die Reaktion abzubrechen.

5 '-

Das Reaktionsgemisch wird auf eine mit 20 ml Sephadex G-10 gefüllte Säule gegeben und mit 0,05 m Trisacetatpuffer, pH 6,5, eluiert. Mittels eines Fraktionensammlers werden pro Röhrchen 30 Tropfen aufgefangen. Freies Jod tritt aus 10 der Säule beim Röhrchen Nr. 20 aus. Das jodierte Produkt tritt bei den Röhrchen Nr. 40 bis 70 aus.

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Claims

VOSSlUS · VOSSIUS · HILTL · TAUCHNEP · HEUNEMANN

PATE.N"." AiM WALTE

SIEBERTSTRASSE 4 ■ SOOO MÖNCHEN 86 . PHONE: (O89) 47 4-O75 '

CABLE: B EN ZO LPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 4-53 VOPAT D

u.Z.: M 845 (Vo/kä) Case: T-829 836-S

E-R. SQUIBB & SONS, INC. Princeton, N.J., V.St.A.

·" Digoxigeninderivate und ihre Verwendung im Radioimmunassay "

Priorität: 1. 9. 1977,V.St.A., Nr. 829

Patentansprüche

1.) Digoxigeninderivate der allgemeinen Formel I

O=C-CH₂-X-CH₂-C-NH-CH-C-OH

(D

in der X eine Methylengruppe oder ein Sauerstoffatom bedeutet

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Γ ~

1 2. Digoxigeninderivate nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der der Benzolkern der Seitenkette radioaktiv markiert ist.

5 3. Digoxigeninderivate nach Anspruch 2 der allgemeinen

125 Formel I, wobei das Radioisotop J oder J ist.

4. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 2 als Tracer im Radioimmunassay. 10

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