DE2142422C3 - Derivate des Digoxigenins, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung zur radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin - Google Patents

Description

	CH, /	I CH,
/V
>/ V H
	H -NH-CCOOR, i
	jT n' H
-NH-C —COOR,
T)
N H

H
— NH- C-COOR,

CH,

N—

N
H

wobei R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist.

2. S-Succinyldigoxigenintyrosin. gegebenenfalls radiojodiert.

3. 3 - Succinyldigoxigenintyrosin - nieder - alkylester, gegebenenfalls radiojodiert.

4. S-Succinyldigoxigenin-L-tyrosin. gegebenenfalls radiojodiert.

5. 3 - Succinyldigoxigenin - L - tyrosin - niederalkylester, gegebenenfalls radiojodiert.

6. Verwendung einer der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei X entweder ein radio-gekennzeichnetes Peptid oder ein radiogekennzeichnetes Aminosäureradikal ist. für die radioimmunologische Bestimmung von Digoxin.

NH

τ-

(ι

OH

H
— NH- C — COOR,

Die Erfindung bezieht sich auf Derivate des Digoxigenins sowie auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der radiologisch gekennzeichneten Derivate des Digoxigenins bei der radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin.

Die Ärzte haben lange nach besseren Methoden gesucht, um die genauen therapeutischen Dosen festzustellen und die Digitalis Toxizität zu diagnostizieren.

Kürzlich haben Smith. Butler und Haber in einem mit »Determination of Therapeutic and Toxic Serum Digoxin Concentrations by Radioimmunoassay« betitelten Aufsatz in New Enuland Journal of Medicine, Vol.281, S. 1212 bis 12Ϊ6 (Ί969Ι. ein Verfahren zur Bestimmung von Serum-Digoxin-Konzenlrationcn unter Verwendung von schweren Wasserstoff enthaltendem Digoxin angegeben. Die Verwendung eines solchen Disioxins bei der Fcststellunii von

Serum-Digoxin in Nanogrammengen bringt die der Hüssi°enSzintillations-Auszählung anhaftenden Nach-

~ · ι. j:„ :_ \/_n-u;_n.j..*..<. «,:! Λ,,- -„!...:. _:..j_: [eile mil SIwIl, Uli. hi »«.itjiixjuiig um uti n.mui iiiLui i-

_en spezifischen Aktivität von im Handel befindlichem, rni't schwerem Wasserstoff versehenem Digoxin. den 5 Einsatz verhältnismäßig großer Probenvolumen und bzw oder erhöhte Auszählzeiten mit sich bringen, um die erforderliche Empfindlichkeit und Genauigkeit -u erreichen. Mit Rücksicht auf die beschränkten Mödichkeiten. die mit schwerem Wasserstoff ver- io schcne Cardenolid-Giykoside für die radioimmunolo"ische Bestimmung bieten, besteht das Bedürfnis na^h anderen radiologisch gekennzeichneten Verbindungen, die wirkungsvoll bei der radioimmunologischen Prüfung von Digoxin im menschlichen Serum is einsesetzt werden können.

Zu diesem Zweck schlag! die Erfindung neue Cardenolide der nachstehenden allgemeinen Strukturformel vor:

O Peptid-Emheiten mit einer radiologisi.hen Kennzeichnung versehen, vorzugsweise radiojodiert
cirid. oder

e) ein Aminosäureradikal, das vorzugsweise eine
der nachfolgenden Strukturformeln besitzt:

H
— NH-C—COOR,

-CH,

R' Γ

/Ja

r τ i

! J

B X

35

«SO

in der R' für -OH oder -OCOCH₃ sieht. B ein Diacylradikal einer Dicarbonsäure. in welcher die Carboxylgruppen an den benachbarten Kohlenstoffatomen substituiert sind, bedeutet, wie z. B. einen Succinyl-. Maleyl-. Fumaryl- oder o-Phlhaloyl-, vorzugsweise jedoch einen Succinyiresl. und X eine der nachfolgenden Bedeutungen haben kann:

45

a) -OH.

b) —OM, worin M ein Alkalimetall, vorzugsweise Natrium, ist.

c) — N—Protein

worin das Prolein im allgemeinen ein menschliches Serum-Albumin. Insulin. Lyso/ym oder ein Rindcr-Scrum-Alhumin. vorzugsweise jedoch ein menschliches Serum-Albumin oder Rinder-Serum-Albumin ist.

dl -N - Peptid
H

worin das Peptid vorzugsweise nicht mehr als 20 Einheiten, vorzugsweise nicht mehr ;iIs (1 Einheiten besitzt, und wenigstens eine der Peptid-Einheiten eine der nachfolgenden Aminosäuren enthält: Tyrosin. 4-Hydroxyphenylglycin. Tryptophan, 5-Hydroxytryptophan und Histidin, wobei gegebenenfalls eine oder mehrere der

OH

H
— NH- C-COOR₂

OH

H
— NH- C — COOR;

HO

H
-NH-C-COOR₂

CH,

N
H

-NH-C-COOR₂

N—

*P

"n

wobei R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe (bis zu 6 Kohlenstoffatomen) bedeutet, wobei die niedere Alkylgruppe vorzugsweise ein Methyl- oder Alhylradikal ist und worin das Aminosäureradikal gegebenenfalls mit einer radiologischen Kennzeichnung versehen ist. vorzugsweise ein oder zwei radioaktive Jodatome aufweist, deren mögliche Positionen durch ein Sternchen angegeben sind. Die vorzugsweise verwendeten Aminosäureradikale leiten sich vom Tyrosin. Histidin und 4-Hydroxyphenylglycin ab. wobei !.-Tyrosin der Vorzug gegeben wird.

Nachstehend ist das Reaktionsschema zur Herftellung der erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivate angegeben, wobei solche Verbindungen als repräsentativ gewählt wurden, in denen die Gruppierung in der vorstehend angegebenen Strukturformel ein Succi-ByI ist:

Stufe 1 Digoxin

(CH₃CO)₂O

Digoxinpentaazetat

Stufe II
H₂SO₄

wasserhaltiges
Methanol

Digoxigenin-12-azetat

O Digoxigenin-)2-azeia!

Digoxigenin-12-azetat-3-hemi:,uccinat

Hierbei sind die Stufen I und 11 aus dem Stand der Technik bekannt, so daß auch das Digoxigenin-12-azctat ebenfalls als bekannt zu gelten hat (siehe /.. B. Elseviers Encyclopedia of Organic Chemistry, Vol. 14, Supplement 1969, S. 4562). Bei dem in der Stufe 111 erhaltenen Produkt handelt es sich jedoch um eine neue Verbindung, weiche unter die oben angegebene Strukturformel fallt, wobei X OH und R' OCOCH., bedeutet.

Das neue Zwischenprodukt Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat kann dann zur Herstellung anderer, neuer, unter die vorliegende Erfindung fallender Verbindungen eingesetzt werden, und zwar nach folgendem Reaktionsschema:

Stufe IV — Kupplung
Protein
Peptid

Digoxigenin-i2-azetal-3-hemisuccinat 4- Aminosäure oder
Aminosäureester

Protein
oder
12-Azetyl-3-succinyldigoxigenin -—

Peptid
oder

— Aminosäure
oder

Aminosäureester

Stufe V Hydrolyse

Protein
oder

Peptid
3-Sucdnvldinoxiücnin

oder

— Aminosäure

— Aminosäureester
Stufe VI ■— Radiojodierung

■— radiojodicrtc Aminosäure
oder
3-Succinyldigoxigcnin

— radiojodierter Aminosäureester oder

— radiojodiertcs Peptid

Bei den Reaktionsprodukten der Stufen IV. V und VJ handelt es sich um neue Verbindungen. Bei dem oben angegebenem Rcaktionsablauf handelt es sich bei der Aminosäure oder dem Aminosäureester, der an das Digoxigenin-^-azctat-S-hcmisuccinat gebunden wird um eine der folgenden Aminosäuren oder ihrer niederen Alkylester: Tyrosin, 4-Hydroxyphenyialanir. Tryptophan, 5-Hydroxytryptophan oder Histidin. Die Radiojodierung wird vorzugsweise mit ^Ι2:Ί durchgeführt. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Jodierung auch mit anderen Jodisotopen, wie beispielsweise ^1M !,durchgeführt werden kann.

Die erlindungsgemäßen 3-Succinyldigoxii:eninderivate können durch Hydrolyse des Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinats erhalten werden, wie nachfolgend noch beschrieben wird.

In der oben angegebenen Rcaktionsfolge können in der Stufe III die Anhydride der Maleinsäure und o-Phthalsäure statt Bernsteinsäureanhydrid verwendet werden, so daß dann Verbindungen erhalten werden, in denen die Gruppierung B der oben angegebenen Strukturformel ein Malcyl- oder ein oPhthaloylrest ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen.

von denen die Gruppierung B der oben angegebenen Strukturformel ein Fumarylrest ist. werden in an sich bekannter Weise durch Isomerisierung von Verbindungen erhalten, in denen die Gruppierung B ein Maleylrest ist.

Die Reaktionsstufen I und Il bei dem oben angegebenen Reaktionsschema sind bekannt, und das hierbei anfallende Reaktionsprodukt Digoxigenin-12-azetat ist ebenfalls bekannt. Dementsprechend ist es für das Verständnis der Erfindung nicht erforderlich.

für diese Reaklionsstufen eine ins einzelne gehende Beschreibung zu geben.

Bei den nachstehenden Temperaturangaben handelt es sich um Celsiusgrade, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.

Stufe III

Die neue Verbindung Digoxigenin-12-azetat-3-hcmisuccinat wird durch Umsetzung von Digoxigenin-12-azetat mil Bernsteinsäureanhydrid in Gegenwart eines geeigneten inerten Lösungsmittels bei einer Temperatur erhalten, die allgemein /wischen etwa 25 und etwa 150. vorzugsweise zwischen etwa 80 und etwa 140 liegt. Als repräsentative Beispiele derartiger inerter Lösungsmittel seien genannt: ein Kohlenwasserstoff wie beispielsweise Benzol, ein Äther wie beispielsweise Diäthyläther. Tetrahydrofuran oder Dioxan. ein Keton wie beispielsweise Azeton oder Melhylälhylketon. ein lister wie beispielsweise Äthyl-

azetat oder Bulyla/ctal. ein halogenierler Kohlenwassersioff wie beispielsweise Chloroform. Methylenchlorid. Tetrachlorkohlenstoff. Dichloroäthan und andere Lösungsmittel, wie beispielsweise Schwefelkohlenstoff. Tetramethylharnsloff. Dimelhylformamid. Dimethylsulfoxid. vorzugsweise in Kombination mit Pyridin. Kollidin. Chinolin und anderen schwachen Basen, um die Bildung von Anhydrocardenoliddcrivatcn zu vermeiden. Pyridin. Kollidin und Chinolin können aber auch für sich allcinc verwendet werden.

Die Verhältnisse /wischen Bernsteinsäureanhydrid und Digoxigenin-12-azciat werden so eingestellt, daß die besten Ergebnisse erhalten werden. Im allgemeinen liegen die Verhältnisse zwischen etwa stöchiometrisehen Anteilen bis etwa zum lOfachen dieser Anteile und vorzugsweise von etwa dem 3fachen bis etwa dem 5fachen der stöchiometrischcn Verhältnisse. Nachdem im Vakuum der größte Teil des Lösungsmittels abgedampft ist. wobei die Temperatur höchstens 60 beträgt, vorzugsweise zwischen 35 und 4O'^J liegt, wird der Rückstand mit Wasser behandelt und der Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid in Gegenwart eines Alkalibikarbonats oder einer vergleichbaren schwachen Base hydrolysiert. Nach Cntternung des nicht umgesetzten Ausgangsmatcrials und der neutralen Verunreinigungen durch Filtration und oder Extraktion mit einem nicht mischbaren Lösungsmittel (/. B. Dichlormcthan. Chloroform. Benzol. Älhyla/elal) wird die wäßrige Phase angesäuert. so da ß annähernd reines Digoxigcnin-12-azetat-3-hemisuccinal erhalten wird, das für die Stufe IV eingesetzt werden kann.

F-S ist selbstverständlich, daß Maleinsäureanhydrid oder Phthalsäureanhydrid an Stelle von Bernsteinsäurcanhydrid verwendet werden können, wobei entweder Digoxigenin-12-azetat-3-hcmimaleat bzw. Digoxigenin-12-azctat-3-hcmiphthalat erhalten wird. Das Digoxigenin-12-azetat-3-liemifurnarat kann in an sich bekannter Weise durch Isomerisierung von Digoxigcnin-l2-azelat-3-hemimaleat hergcstc'',i werden.

Stufe IV

Die Kupplung des Aminosäureesters mit dem Digoxigenin-n-azctat-S-hemisuecinat in Stufe IV kann in der gleichen Weise erfolgen wie die Kupplung des Aminosäureester an 3-o-Succinyldigitoxigenin. so wie es von O 1 i ν e r et al. in der J. Clinical Invesiig.. Vol. 47. 1035 bis 1042 (1968). in Anwendung auf Isobutylchloroformal für die Bildung gemischter Anhydride beschrieben wurde. Es können auch Pivaloylchlorid oder N-ÄthoxycarbonyW-äthoxy-l^-dihydrochinoiin für denselben Zweck eingesetzt werden. Das gemischte Anhydrid kann unter wasserfreien Bedingungen in einem inerten Lösungsmittel wie z. B. Dichloromclhan. Chloroform. Äthylazetat. Dioxan. Tetrahydrofuran. Monoglym. Diglym usw. bei Temperaturen zwischen -10 und 25'. vorzugsweise zwischen -5 und 10' in Gegenwart eines Äquivalents einer organischen Base, wie z. B. Triäthyiamin. Tri- fco n-butylamin. Tri-n-ociylamin. N-Methylmorpholin usw. hergestellt werden. Die Kupplung mit dem zweckentsprechenden Aminosäurealkylester kann in einem wäßrigen Lösungsmittel, beispielsweise in 50%igem Dioxan, ausgeführt werden, so wie es im Stand der Technik beschrieben ist. oder vorzugsweise in den vorerwähnten wasserfreien Lösungsmitteln in Gegenwart eines zusätzlichen Äquivalents an Base.

Es kann auch N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin für die Kupplung der beiden Reaktanten eingesetzt werden, die den vorerwähnten wasserfreien Lösungsmitteln zugegeben wurden; die Temperatur beträgt während einiger Stunden oder so lange, bis die Reaktion beendet ist, 5 bis 30°.

Es besteht auch die Möglichkeit, eine freie Aminosäure an Stelle eines Alkylaminosäureesters an Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat unter Anwendung der oben beschriebenen wasserfreien Bedingungen zu binden.

Bei der Isolierung des gewünschten neutralen Kupplungsproduktes wird so vorgegangen, daß die basischen und sauren Verunreinigungen, einschließlich des nichlumgesetzten Ausgangsmaterials, durch Zusammenbringen der Lösung der Reaktionsmischung in einem nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Dichloromethan, Chloroform, Benzol, Äthylazetat usw., mit verdünnter wäßriger Mineralsäure und mit verdünnter wäßriger Alkalibikarbonatlösung bzw. Alkalikarbonat- oder Alkalihydroxidlösung entfernt werden. Die neutralen Verunreinigungen, vorzugsweise die N-Acyl-aminosäureester, werden anschließend unter Berücksichtigung der Molekulargröße vermittels Gelfiltration und bzw. oder in Ansehung der Polarität vermittels der Kieselsäure-Gel-Chromatographie und bzw. oder präparativer Dünnschichtchromaiographie entfernt. Die Entfernung der neutralen Verunreinigungen ist wünschenswert, jedoch nicht vor der Hydrolyse in der Stufe V wesentlich.

Die Protein- und Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung können auch aus dem erfindungsgemäßen neuen Zwischenprodukt Digoxigenm-12-azetat-3-hemisuccinat nach den von 01 i ν e r et al. in J. Clinical Investig., Vol. 47, S. 1035 bis 1042. für die Kupplung von menschlichem Serum-Albumin und Rinderserum-Albumin an 3-o-Succinyldigitoxigenin (SDG) beschriebenen Verfahren erhalten werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat an Stelle von SDG eingesetzt. Das Peptid (der Ausdruck »Peptid« schließt Polypeptide ein), das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptidderivate eingesetzt wird, besitzt eine oder mehrere Gruppierungen, die jodiert werden können, wie z. B. 4-Hydroxyglycin, Tyrosin, 5-Hydroxytryptophan. Histidin. Als repräsentative Beispiele für derartige Peptide seien genannt:

L-Tyrosyl-L-lysin.

i.-Tyrosyl-L-glutaminsäurc.

L-Tyrosyl-L-tyrosin.

l.-Tryptophyl-L-glutaminsäurc.

L-Tryptophylglycin.

L-Tryptophyl-L-tyrosin,

L-Tryptophyl-L-lys'n,

L-Leucyl-L-tryptophyl-L-methionyl-i.-arginyl-

L-pheüylalanyl-L-alanin.
L-Histidyl-L-alanin,
l.-Histidyl-L-glutaminsäure.
L-Histidyl-L-tyrosin und
Gramicidin.

Es versteht sich, daß die vorerwähnten Peptide an Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat nach den insbesondere von Oliver et al. in Anwendung auf menschliches Serum-Albumin und Rindcrserum-Albumin beschriebenen Verfahren gebunden werden können. Statt dessen können die Peptide mit niederem Molekulargewicht an Digoxigenip-12-azctal-3-hcmi-

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succinat durch die oben für die Bindung einer Aminosäure oder eines Aminosäureesters an Digoxigeninl2-azetat-3-hemisuccinat beschriebenen Verfahren gebunden werden. Es ist klar, daß die vorstehende Beschreibung für die Verfahrensbedingungen für die Stufe IV auch auf Maleat- und Phthaleatdcrivate der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können.

Stufe V

Die Reaktionsstufe V umfaßt die selektive Hydrolyse der 12-Azetatgruppe des Cardenolids oder der Alkylgruppe der Aminosäure-Gruppierung R₂ oder von beiden. Hierbei wird so vorgegangen, daß das Produkt der Stufe IV zusammengebracht wird mit einem Überschuß an Base zwischen etwa 5 und etwa 50 Äquivalenten, vorzugsweise von etwa 10 und etwa 20 Äquivalenten, in Gegenwart von Wasser und oder einem inerten Lösungsmittel. Als Beispiele für die in dieser Stufe verwendeten Basen seien genannt: Triäthylamin. Natriumkarbonat. Kaliumkarbonat. Natriumbikarbonat. Kaliumbikarbonat. Ammoniak od. dgl. Alkalimetallkarbonate. Alkalimetallbikarbonate und Ammoniak werden bevorzugt. Ein vorzugsweise in dieser Stufe verwendetes inertes Lösungsmittel ist ein mit Wasser vermischbares Lösungsmittel, wie z. B. Alkohole wie Methanol. Äthanol. Propanol. sek.-Butanol. tert.-Butanol, Amyl-Alkohol usw.. Ketone wie Azeton. Methyläthylketon usw.. Äther wie Diathyläther. Dioxan oder Tetrahydrofuran und andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid. Dimelhylsulfoxid u. dgl. Sie können miteinander vermischt werden, so daß das Reaktionsmittel oder das Ausgangsmaterial aufgelöst werden. Die Hydrolyse in dieser Stufe erfordert im allgemeinen Wasser. In einigen Fällen kann jedoch die Reaktion über eine Hydrolyse- oder eine Austauschreaktion des Karbonatrests und Wasserstoffatoms des Lösungsmitteis oder Reaktionsmittels laufen.

Die Hydrolyse wird bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 50 . vorzugsweise von etwa 20 bis etwa 25 . während einer Zeitdauer von 5 bis 20 Tagen bei Alkalimetallbikarbonaten oder von 3 bis 48 Stunden bei Alkalikarbonaten und Basen vergleichbarer Basizität durchgerührt werden. Eine begrenzte Wirkung der Alkalibikarbonate auf 3-Succinyldigoxigenin-L-tyrosin-methylester macht die Isolierung der zwe^; teilweise hydrolysierten Produkte S-Succinyl-n-azetyldigoxigenin-L-tyrosin (R' = OCOCH₃. X = Tyrosin. R. = H) und 3-Succinyldigoxigenin-L-tyrosin-meihylester (R'— OH. X = Tyrosin. R₂ = CH₃) in annähernd gleichen Mengen möglich. Die erste Verbindung wird ebenfalls direkt aus Digoxigenin-12-azetat-3-succinat Pivaloyl-Mischanhydrid und L-Tyrosin in wasserfreiem Pyridin in Gegenwart eines Äquivalents Base erhalten.

Dementsprechend führt eine selektive Hydrolyse von Digoxigenin-^-azetaKVhemisuccinat mit einem 20fachen Überschuß an wäßrigem Alkalikarbonat zu der Bildung von Digoxigenin-3-succinat (in der eingangs erwähnten Strukturformel bedeutet R' — OH und X — OH). einem neuen Derivat des Digoxigcnin. das wasserlösliche Alkalimetallsalze bilden kann.

Auf ähnliche Weise bewirkt die Behandlung von Peptid- oder Proteinkonjugaten des Digoxigcnin-12-azetat-3-hemisuccinats, das entsprechend der obenerwähnten Methode von O 1 i ν e r et al. erhallen wurde, mit wäßrigen Alkalibikarbonaten oder Alkalikarbonaten bei einer Temperatur von 5 bis 25 wäh

rend einer Zeitdauer von einigen Tagen bis einigen Stunden eine selektive Entfernung der 12-Acetylgruppe. wodurch die neuen Derivate der vorliegenden Erfindung entstehen, bei denen in der eingangs erwähnten Strukturformel R' eine OH-Gruppe bedeutet und X für eine der Gruppierungen nach (c) und (d) steht Das Hydrolyseprodukt wird durch eine Folge von

Arbeitsstufen aufbereitet, nämlich: Neutralisation Entfernung der neutralen Verunreinigungen. Aus-

ίο fällung durch Ansäuern in den Fällen, in denen X eine Aminosäure oder eine kleine Peptid-GruppierunB bedeutet, präperative Dünnschichtchromatographic oder Gelfiltration.

Bei Derivaten, welche Seitenketten von höhcrem Molekulargewicht, wie solche, welche Polypeptide oder Proteine enthalten, ist eine Dialyse möglich: es kann jedoch gegebenenfalls auch eine Gelfiltration stattfinden. In allen Fällen wird eine vollständige Entfernung der jodierbaren Verunreinigungen voi der Jodierung durchgeführt.

Es versteht sich, daß die obenerwähnten Verfahrensbedindungen für die Stufe V in gleichem Maße auch auf die erfindungsgemäßen Maleyl- und Phthaloylderivate Anwendung finden können.

Stufe VI

Die radiojodierten Derivate können nach einem der nachfolgenden Verfahren hergestellt werden:

1. Chloramin - T - Methode von Hunter
G r e e η w ο ο d. W. M. H u η t e r. F. C. G r c e η -

wood. Nature 194,495 (1962).
2..1OdChIOrUr-MeIhOdC. N. Ce ska. F. Grossmuller. U. Lundkvist. Acta Endocrinologia 64. Ill bis 125 (1970).

3. Isotopenaustauschmethode. R. E. Co un sell. V. V. R a η a d e. P. P ο c h a. R. E. W Hielte W. Diguilio. J. Pharmaccut. Sciences 57. 1657(1968). und

4. Elektrolytische Jodierung. F. Pen nisi. U. Rosa. .!. Nuclear Biol. and Medicine 13. 64 (1964).

Wasserlösliche Substrate, wie ζ. Β. solche, welche solubilisierende Carboxylgruppen oder Peptidgruppcn

in der Gruppierung X enthalten, sind in wäßrigen Medien jodierbar. Die Jodierung von lipophfleri Substraten, wie beispielsweise Alkylester (R₂ = Alkyl erfordert den Einsatz von inerten Lösungsmitteln oder wasserhaltigen Lösungsmitteln, die Wasser und

mit Wasser vermischbare Lösungsmittel wie ζ. Β Methanol. Äthanol. Dioxan. Tetrahydrofuran. Dimethylformamid. Dimethylsulfoxid usw. enthalten Nach der Jodierung wird nichtumgesetztes .Iodid in an sich bekannter Weise entfernt, beispielsweise ver-

mittels Absorption auf einem ionenaustauscherharz Die mitabsorbierten jodierten Cardenolide können dann selektiv mit einem geeigneten omanischen Lösungsmittel eluiert werden. Polypeptide- oder Proteinkonjugate werden, wo es möglich ist. durch

Dialyse gereinigt, woran sich eine Gelfiltration odei Elektrophorese anschließt. In manchen Fällen ist es möglich, das Ausmaß der Dijodierung dadurch zu kontrollieren, daß das Verhältnis von Substrat zu Jod über einen Bereich von 1:1 bis 100: 1 variier!

wird. Wenn X = Tyrosin ist. ergibt ein Verhältnis von 2.5: 1 15 bis 20% dijodiertes Antigen, verslicher mit 5 bis 7% bei einem Verhältnis von 25 :Ί. Die einfach und doppelt gekennzeichneten Derivate mit

niederem Molekulargewicht können in einfacher Weise vermittels priiparaliver Dünnschichtchromatographie oder Kieselsäure-Gcl-Chromatographie voneinander getrennt werden, wobei beide Komponenten mit einer Reinheit von mehr als 95% erhalten werden.

Es versteht sich, daß die oben beschriebenen Verfahrensbedingungen der Stufe Vl in gleicher Weise auf Maleyl- und Phthaloylderivaic der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Min den folgenden Beispielen soll die Erfindung weiter veranschaulicht werden. ohne daß dadurch jedoch die Erfindung in irgendeiner Weise eingeschränkt wird: falls nichts anderes ausdrücklich gesagt ist. handelt es sich bei allen Teilen um Gewichtsteile und allen Temperaluren um Celsiusgrade.

Beispiel 1

A. Eine Mischung von 1.37 g Dioxigcnin-12-azctat, 1.27 g Bernsteinsäureanhydrid und 15 ml Pyridin wird während 7 Stunden unter dem Rückflußkühler behandelt. Die Reaktionsmischung wird mit wäßrigen Lösungen von Natriumkarbonat abgeschreckt und zwecks Entfernung des Pyridins konzentriert. Bei der Ansäuerung fällt 1.55 g rohes Digoxigenin-12-azetal-3-hemisuccinat an.

Bei der Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie und wiederholtes Ausfällen aus Wasser wird reines Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat erhalten; Schmelzpunkt: 135 bis 140 . [„]? + 42 (c· = 0,265. Methanol), log,· 4.21 bei 217 my. (Methanol).

Das obige Verfahren wird auch zur Herstellung von Digoxigenin - 12 - azetat - 3 -hcmimaleat und Digoxigenin-12-azctai-3-hemiphthalat angewandt, wobei das Bernsteinsäureanhydrid durch Maleinsäureanhydrid und o-Phthalsäureanhydrid ersetzt wird.

B. Eine Lösung von 230 mg Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinai in 25 ml Wasser, das 1.20 g Kaliumkarbonat enthält, wird über 46 Stunden bei 25 gehalten. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, wobei das Rohprodukt ausfällt

Bei der Reinigung durch Dünnschichlehromatographieund Kristallisation aus wasserhaltigem Azeton fällt 74 mg Digoxigenin-3-hemisuccinat an. Schmelzpunkt: 21Ϊ bis21 3\ f.i]'_;- -r20°(f = 0.356. Methanoll. log . 4.20 bei 21S mu (Methanol).

Nach diesem Verfahren wird auch Digoxigenin-3-hcmimalcai und Digoxigcnin-3-hemiphthaku hergestellt, wobei als Ausgangsmaterial Digoxigenin-12-azetat-3-hemima!eal bzw. Digoxigenin-12-azetat- so 3-hemiphthalai verwendet wird.

B e i s ρ i e 1 2

A. Eine Mischung von 216 mg Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat. 4 ml Dichloromethan. 0.04 ml Triäthylamin und 0.052 ml Pivalylchlorid wird bei 20 während 15 Minuten gerührt und vor der Zugabe einer abgekühlten (-10 ) Lösung von 88 mg L-fyrosinmethylcsterhydrochlorid. 0.72 ml Tri-n-butylamin und 2 ml Pyridin auf - 10 abgekühlt. Die Mischung wird während 10 Minuten bei - 10 bis -5 und während einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt, mit 6 N-Salzsäure angesäuert und init Dichloromethan extrahiert. Das Extrakt wird mehrmals mit 6s einer l"Oigen wäßrigen Lösung von Natriumbikarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und zu einem gummi- bzw. harzartigen Rückstand eingedampft, der vermittels Dünnschichtchromatographie gereinigt wurde. Der reine ^-Acctyl-S-succinyldigoxigenini-lyrosinmethylesler wird als eine farblose harzartige Masse erhallen: |«]J^J + 42" [c = 0,293. Methanol); loü .· 4.42 bei 222 ηΐμ, 3,34 bei 276 ma (Methanol) und 4.32 bei 221 Γημ. 3,43 bei 294 m.j. (0,1 N-NaOH).

Das obige Verfahren wird wiederholt mit der Maßgabe, daß die Methyl- und Äthylester des Histidins und 4-Hydroxyphenylglycins und der Äthylesler von !.-Tyrosin eingcsctzl werden, wobei die entsprechenden Aminosäureesterderivate anfallen.

B. Eine Mischung von 25 mg rohem 12-Azetoxy-

3 - succinyldigoxigenin -1. - tyrosinmethylcster, 2,5 ml Methanol und 2,5 ml Wasser, das 100 mg Kaliumkarbonat enthält, wird während 3 Stunden auf 25' gehalten. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, das Methanol wird abgedampft. Dann wird mil Äthylazetat extrahiert. Das Extrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird vermittels Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei 4 mg 3-Succiny!digoxigenin-L-tyrosin anfallen. Schmelzpunkt: 165 bis"l 75^J, [.1] +45° (cc = 0,245, Methanol), log * 4,40 bei 222 πΐμ, 329 bei 276 ιημ (Methanol); 4,34 bei 220 m;x. 3.39 bei 294 ηΐμ. (0,1 N-NaOH).

Das obige Verfahren wird auch angewandt für die Hydrolyse der anderen Aminosäureesterderivate, die gemäß dem Verfahren nach Beispiel 2A hergestellt wurden, damit die entsprechenden Aminosäurederivatc erhalten werden.

Beispiel 3

A. Digoxigcnin-n-azetat-S-hemisuccinat wurde mit Rinderserum-Albumin gekuppelt nach der Methode von C) 1 i ν e r et al., J. Clinical lnvestig. 47, 1035 bis 1042 (1968). Das erhaltene azctylierte Konjugat enthält 34 Moleküle Digoxigenin pro Molekül Rinderserum-Albumin, wie sich aus der Bestimmung nach der Schwefelsäuremethode von Butler und Chen (V. P. B u 11 e r. Jr., und J. P. C h c η. Proc. Nat. Acad. Sei. 47. 71 bis 78 [1967]) ergab.

B. Digoxigenin-12-azetat-3-succinat-Rinderserum-Albumin (81 mg). 165 mg Kaliumkarbonat und 3 ml Wasser werden während 3 Stunden auf 23^: gehalten Die Mischung wird mit 0.075 ml Essigsäure neutralisiert und während 4 Tagen bei 5" dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert und die überstehende Schicht lyophilisiert. wobei 65 mg Digoxigenin-3-suc cinyl-Rinderserumverbindung mit 28 Molekülen Di goxigenin pro Molekül Rinderserum-Albumin erhal ten wurden.

Beispiel 4

A. Entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 2 B jedoch unter Austausch des Kaliumkarbonats gegei Kaliumbikarbonat und einem Reaktionsablau*' voi

4 Tagen, werden sowohl 12-Azetyl-3-succinyldigoxi genin-L-tyrosin und 3-Succinyl-digoxigenin-L-tyrosin methylester erhalten. Das obige Verfahren wird aucl für die Hydrolyse der anderen Aminosäureesierderi vate angewandt, welche entsprechend dem Verfahre] nach Beispiel 2A zur Herstellung der entsprechende: Derivate erhalten wurden.

B. Bei Zugabe von einer Mischung von Pivalinsäur und Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat (hergesteli nach Beispiel 2A aus 79 mg Digoxigenin-12-azetai 3-hemisuccinat) zu einer Suspension von 27 mg L-Tyrc sin. 0,038 ml Tri-n-butylamin und 5 ml Pyridii

ι J ■

Umrühren während 16 Stunden bei 25'^J und Isolierung wie im Beispiel 2 B beschrieben, wird 12-Azctyl-3-succinyldigoxigenin-L-tyrosin erhalten, das mit der nach Beispiel 4 A beschriebenen Substanz identisch ist. Das Verfahren nach Beispiel 4 B wird mit 4-Hydroxyphenylglycin und Histidin an Stelle von L-Tyrosin wiederholt, wobei die entsprechenden Aminosäurederivatc erhalten werden.

Beispiel 5

A. Die Jodierung von 10 g 3-Succinyldigoxigenin-L-tyrosin, das nach dem Verfahren des Beispiels 2 B erhalten wurde mit 9 mc ¹²ⁱl,wird bei pH 7.4 nach der Methode von Hunter und Greenwood mit einem Verhältnis von Substrat zu Jod von 2.5: 1 durchgeführt. Nicht umgesetztes Jodid vvsrd beim Durchlauf durch einen quarlernärcs Amin in der Chloridform enthaltenden Ionenaustauscher entfernt. Das mitabsorbiertc Produkt wird cluiert und enthält 4,06 mc ¹²⁵I in zwei jodierten Produkten, nämlich 3-Succinyldigoxigenin-(3-jodo-L-tyrosin '²⁵I) und 3 - Succinyldigoxigenin - (3',5' - dijodo -1. - ty resin ¹²⁵I), die im Verhältnis von 6 : 1 gebildet werden. Die Trennung der beiden Komponenten in einer radiochemischen Reinheit von mehr als 95% erfolgt vermittels Dünnschichtchromatographie.

B. Die Jodierung von 60 g 3-Succinyldigitoxigenin-L-tyrosin mit 6 mc ¹²⁵I mit einem Verhältnis von Substrat zu Jod von 20: 1 ergibt eine Gesamtausbeutc von 4,13 mc¹²⁵1 an dem mono- und dijodiertcn Produkt im Vc: liiltnis von 13:1.

C. Die 3-Succinyl-digoxigcninaminosäureestcr. die nach Beispiel 4A erhalten wurden, werden nach dem von O 1 i ν e r et al. Verfahren radiojodiert.

Das Verfahren nach Beispiel 5A wird mit den anderen Aminosäurederivaten (3-Succinyldigoxigeninhistidin und 3-Succinyldigoxigenin-4-hydroxyphcnylglycin) wiederholt, um die radiojodierttn Derivate herzustellen.

Beispiel 6

A. Eine Mischung von 216 mg Digoxigenin-12-azetat-3-hcmisuccinat, 4 ml Dichloromcthan, 0.04 ml Triüthylamin und 0,052 ml Pivalylchlorid wird bei 20 während 15 Minuten umgerührt und vor der Zugabe einer abgekühlten (- 10°) Lösung von 88 mg Peplid-L-tyrosyl-L-Iysin. 0,072 ml Tri-n-butylamin und 2 ml Dimethylformamid auf — 10' abgekühlt. Die Mischung wird während 10 Minuten bei — 10 bis —5'' und während einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur umgerührt. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt, angesäuert mit 6 N-Salzsäure und mit Äthylazetat extrahiert. Das Extrakt wird mehrmals mit einer 1 %igcn wäßrigen Lösung von Natriumbikarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und bis zu einem harzartigen Rückstand eingedampft, der vermittels Dünnschichichromatographie gereinigt wird, wobei 12 - Acetyl - 3 - succinyldigoxigenin -L- tyrosol -1. - lysin erhalten wird.

B. Eine Mischung von 25 mg des Produkts nach Beispiel 6A. 2.5 ml Methanol und 2,5 ml Wasser, das IOD mg Kaliumbikarbonat enthält, wird während 3 bis 5 Tagen auf 25 gehalten. Die Mischung wird mi; verdünnter Sal/üäure angesäuert, zwecks Entfernung des Methanols eingedampft und mit Äthylazetat extrahiert. Das Extrakt wird mii Wasser gewaschen, gelrocknet und zur Trocknung eingcdanipft. Der Rückstand wird durch Dünnschicht-Chromatographie gereinigt. Dabei wird 3-Succinyldigoxigenin-i.-Iyrosol-i.-lysin erhalten.

C. Das Produkt nach Beispiel 6 B wird nach dem von O 1 i ν e r el al. in dem oben angegebenen Aufsalz beschriebenen Verfahren radiojodiert. wobei radiojodierles 3 - Succinyldigoxigenin -1. - tyrosyl -1 - lysin erhalten wird.

D. Das Produkt nach Beispiel 6A wird ebenfalls radiojodiert nach dem von Oliver el al. bcschriebcnen Verfahren. Dabei wird radiojodierles 12-Acetoxy-3-Succinyldigoxigenin-i.-lyrosyl-i-lysin erhalten. Die Verfahren nach den Beispielen 6 A bis 6 C werden mit folgenden Peptiden wiederholt:

i.-Tyrosyl-L-glutaminsäure.
!..-Tyrosyl-i.-ty rosin,

L-Tryptophyl-L-glutaminsäure.

L-Tryptophylglycin,

i.-Tryptophyl-L-trysin.

L-Tryptophyl-L-lysin.

i.-Leucyl-L-tryptophyl-L-mcthionyl-L-arginyli.-phenylalanyl-L-alanin,

L-Histidyl-i.-alanin.

1 -Histidyl-L-glulaminsäurc.

L-llistidyl-L-tyrosin und
Gramicidin.

Es versteht sich, daß die Verfahren der Beispiele 2. 4. 5 und 6 auch auf die Hemimaleat- und Hemiphthalatderivate anwendbar sind, die nach dem Verfahren des Beispiels 1A erhalten werden. Die Fumarylderivate der Erfindung werden in an sich bekannter Weise aus den Maleylderivaten durch Isomerisierung der Maleinsäure in Fumarsäure erhalten.

Die radiojodierten Derivate der vorliegenden Erfindung, d. h. die radiojodierten Verbindungen der eingangs wiedergegebenen Strukturformel, in der R' für -OH oder -OCOCH₃ und X für eines der Radikale (d) oder (e) steht, können als gekennzeichnetes

Antigen in der radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin eingesetzt werden. Bei einer radioimmunologischen Bestimmung, die hier Anwendung finden kann, kann es sich um eine solche handeln, die eine geringfügige Modifikation der von S m i t h et al.

in New England Journal of Medicin. Vol. 281. S. 1212 bis 1216 (March 27. 1969), für mit schwerem Wasserstoff gekennzeichnetes Digoxin wie folsit beschrieben ist:

Zu 1 ml Serum in Kunststoffteströhrchen. 12 auf 75 mm (Falcon Plastics. Los Angeles. California), werden unter intensivem Mischen 3 ng eines radiojodierten Derivats entsprechend der vorliegenden Erfindung zugesetzt. Daraufhin werden Antidigitoxin-Antikörper in einer Menge zugegeben, die ausreichend ist, um 37 bis 5OVo des radiojodierten Derivats in Abwesenheit einer nicht gekennzeichneten Arznei zu binden. Die Mischung wird dann bei 25 während einer Stunde inkubierl. Ein Vergleich zwischen der radiojodierten Verbindung und dem nicht gekennzeichneten Digitoxin für die Antikörper vermittelt die Menge des Komplexes, welche beim Gleichgewicht vorliegt. Die Abtrennung der freien radiojodierien Verbindung wird durch Anwendung von mit Dextran überzogener Holzkohle entsprechend der von Herbert et al. in ' Clinical Endoer. Vol. 25. 1375 bis I3S4 (19651

beschriebenen Technik erreicht, wobei sich eine selektive Bindung dtr freien gekennzeichneten und nicht gekennzeichneten Verbindung an der überzogenen Holzkohle ergibt, deren Trennung durch Zentrifugieren herbeigeführt wird. Die überstehende Phase wird dekantiert und in einem Gammazähler ausgezählt.

L>ie Immunogene der vorliegenden Erfindung, d. h. die Verbindungen mit der eingangs erwähnten Strukturformel, in der R' Tür —OH und X für ein Proteinkonjugat steht, wie es unter (c) definiert ist, können für die Erzeugung von Antidigoxin-Antikörner nach den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren für die Herstellung von Antidigitoxigenin-Antikörpern aus den Proteinkonjugaten von 3-Succinyldigitoxigenin. wie sie in dem vorerwähnten Aufsatz von 01 i ν e r et al. beschrieben sind, verwendet werden.

Das Digoxigenin-3-succinat in der Form seines Alkalimelallsalzes, insbesondere des Natriumsalzes, kann für dieselben pharmakologischen Zwecke in denselben Mengen wie Digoxigenin eingesetzt werden, mit der Ausnahme, daß das Natriumsalz des Digoxigenin-3-succinats wasserlöslich ist, wodurch die Verbindung als injizierbare Wasserlösung einsetzbar ist. Die korrespondierenden Fumarat-. Maleat- und o-Phthalatderivate können in ähnlicher Weise Anwendung finden.

Die radiojodiericn Derivate der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere für die radioimmnnologische Prüfung von Digoxin in menschlichem Serum. Obgleich die radiojodierten Derivate des Digitoxigcnin bekannt sind, beispielsweise der radiojodierte 3-Succinyl-digitoxigcnin-i,-tyrosin-methylcstcr (vgl. The Journal of Clinical lnvestication. Vol. 47. S. 1035 bis 1042 f 1968]). können diese Derivate nicht für die Messung des Serum-Digoxin-Spiegels wegen der ungünstigen immunologischen Quer-Aklivität verwendet werden.

Die radiojodierten Cardenoüdderivaie der vorliegenden Erfindung stellen eine Verbesserung gegenüber dem mit schweren Wasserstoff behandelten Digoxin dar, das bislang für die radiologische Prüfung von Digoxin verwendet wurde. Die Gründe hierfür oestehen in folgendem:

1. An Stelle der kostspieligen und komplexen Flüssig-Scintillationszähler, die für die Verbindung mit schwerem Wasserstoff benötigt wird, kann ein verhältnismäßig billiger Zähler eingesetzt werden.

2. Es werden keine Scintillationsflüssigkeiten und spezielle Phiolen benötigt.

3. Es entfallen interne und externe Standardisierungen wie bei dem Dijioxin mit schwerem Wasserstoff.

4. Die Zählgenauigkeil ist höher, insbesondere in wäßrigen Medien.

Die radiojodierten Derivate der vorliegenden Erfindung, in denen die Aminosäure-Gruppierung in der

Säureform vorliegt, anstatt in Esterform (R₂ = H), besitzen eine wesentlich höhere Polarität. Löslichkeit und Hydrophilitäi, wodurch diese Derivate bei physiologischen pH-Werten wasserlöslich sind und in wäßrigen Medien jodiert werden können. Sie besitzen

eine Seitenkette, die in etwa hinsichtlich der Polarität vergleichbar ist mit der Tridigitoxose-Gruppierung der natürlichen Cardenolidc. Sie zeigen auch ein höheres Bindungsvermögen an Antikörpern und eine geringere Neigung hinsichtlich der Adsorption auf

lipophilen Oberflächen, wie z. B. Kunststoff-Teströhrchen.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Derivate des Digoxigenins. gekennzeichnet d u r c h die nachfofgende Strukturformel:

OH

3°

in der R' Tür —OH oder -OCOCH₃ steht, B ein Succinyl . Malcyl-, Fumaryl- oder o-Phthaloylrest bedeutet und X eine der nachfolgenden Bedeutungen haben kann:

a) -OH.

b) —OM. worin M ein Alkalimetall ist.

c) —N—Protein

d) — N— Peptid

worin das Peptid nicht mehr als 20 Einheiten und wenigstens eine der Peptid-Einheiten eine der nachfolgenden Aminosäuren enthält: Tyrosin, 4-Hydroxyphenylglycin, Tryptophan. 5-Hydroxytryptophan und Histidin, wobei gegebenenfalls eine oder mehrere der Peptid-Einheiten mit einer radiologischen Kennzeichnung versehen, vorzugsweise radiojodiert sind, oder

e) ein gegebenenfalls mit einer radiologischen Kennzeichnung versehenes Aminosäureradikal, das eine der nachfolgenden Strukturformeln besitzt:

H
-C -COOR,

HO