EP0696207A1 - Verwendung von cyclopentadienylcarbonyl-übergangsmetall-carbonsäuren und deren derivaten zur markierung von proteinen - Google Patents

Verwendung von cyclopentadienylcarbonyl-übergangsmetall-carbonsäuren und deren derivaten zur markierung von proteinen

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EP0696207A1
EP0696207A1 EP94915087A EP94915087A EP0696207A1 EP 0696207 A1 EP0696207 A1 EP 0696207A1 EP 94915087 A EP94915087 A EP 94915087A EP 94915087 A EP94915087 A EP 94915087A EP 0696207 A1 EP0696207 A1 EP 0696207A1
Authority
EP
European Patent Office
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acid
group
radioactive
cor
metallocene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP94915087A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Wenzel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Institut fuer Diagnostikforschung GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut fuer Diagnostikforschung GmbH filed Critical Institut fuer Diagnostikforschung GmbH
Publication of EP0696207A1 publication Critical patent/EP0696207A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0474—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group
    • A61K51/0487—Metallocenes, i.e. complexes based on a radioactive metal complexed by two cyclopentadienyl anions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F17/00—Metallocenes

Definitions

  • the invention relates to the subject matter characterized in the claims, that is to say the use of radioactive metallocene carboxylic acids and their derivatives and methods for the radioactive labeling of proteins and other NH-active compounds.
  • the invention further relates to new metallocene carboxylic acids and carboxylic acid derivatives of Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 or Ir-191.
  • Radioactive labeled compounds are widely used in many areas of technology.
  • radioactively labeled substances such as labeled proteins - used for both diagnostic and therapeutic purposes.
  • a known method of labeling proteins is that chelating agents are bound to proteins or oligopeptides in such a way that they do not lose their chelating property if possible.
  • Corresponding chelating agents can be, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • the actual labeling is then carried out by reaction with radioactive ions such as radioactive indium or technetium isotopes.
  • a disadvantage of using chelating agents for binding the radioactive isotopes is that the biological function of the protein can be changed by the chelating agent. In addition, part of the radioisotope that is primarily bound to the protein can be lost again by "re-chelating" by the body's complexing agents. However, the permanent binding of radioisotopes is the decisive prerequisite for radio-immunoassays - here the binding to proteins such as immunoglobulins - or a nuclear medicine application.
  • Protein labeling has also been carried out using iodine-labeled esters of N-hydroxysuccinimide (AEBolton, WM Hunter, Biochem. J., 133, 529, 1973).
  • iodine-labeled esters of N-hydroxysuccinimide AEBolton, WM Hunter, Biochem. J., 133, 529, 1973.
  • radioactive iodine isotopes are poorly suited for use in nuclear medicine for various reasons. Iodine-125 has too low an energy and a too long half-life, iodine-131 leads to a high radiation exposure due to its particle radiation and the iodine-123 is too expensive because its relatively short half-life requires extensive logistics.
  • the structure of the protein can also be partially changed during iodination in such a way that the biological functions of the protein are only partially preserved.
  • Tc-cyclopentydienyl-carbonyl complexes with different side chains are known.
  • the complexes described there are notable for high in vivo stability, so that "re-chelating" by the body's own complexing agents is not observed.
  • the enrichment behavior determined by the side chain is also only slightly influenced by the complexing agent (cyclopentadienyl ring).
  • R 1 , R 2 , R 3 each represent a CO group or together represent a cyclopentadienyl radical which is optionally substituted by R 5 ', R 4 represents a hydrogen atom, a C r C 10 alkyl radical or a group
  • -SR 7 is, with R 7 meaning hydrogen, a C 1 -C 10 alkyl
  • R 8 in the meaning given for R 7 with the exception of hydrogen and a Cj-Ci Q alkyl radical and M is a radioactive metal isotope of an element of atomic numbers 21-29,
  • marker molecules any basic group-carrying molecules, in particular biomolecules - such as proteins, proteohormones or polypeptides - into stable, radioactively labeled substances which are both in the Radioimmune diagnostics as well as in nuclear medicine - for example for the in vivo display of receptors or antibody-binding structures, especially for the localization of tumors - can be used.
  • metallocene carboxylic acids of the formula I are also suitable for introducing positron emitters into proteins.
  • Suitable radicals R 1 , R 2 , R 3 are in each case a carbonyl group or a pentahapto-bonded - if desired R 5 ' substituted - second cyclopentadienyl ring, the carbonyl groups being preferred.
  • the radical R 4 is a -CO-CH 3 group, a straight-chain or branched-chain Cj-CjQ-alkyl radical such as, for example, a methyl, ethyl, propyl, isopropyl, buty-1, isobutyl, tert. -Butyl, isopentyl, neopenty-1, hexyl or in particular a hydrogen atom.
  • Preferred radicals R 5 according to the invention are a -COOH -, a -CO- (CH2) 2-COOH - group, but in particular activated acid groups such as, for example, a -COC1 -, a -CO- (CH 2 ) 2 -CO-R 8 -, a -CO- (CH 2 ) 2 -COOR 8 -, a -CO-OR 8 - or a -CO-R 8 group with R 8 in the meaning of a succinimide or phthalimide radical.
  • activated acid groups such as, for example, a -COC1 -, a -CO- (CH 2 ) 2 -CO-R 8 -, a -CO- (CH 2 ) 2 -COOR 8 -, a -CO-OR 8 - or a -CO-R 8 group with R 8 in the meaning of a succinimide or phthalimide radical.
  • the free carboxylic acid groups can, however, also be activated by other methods known to the person skilled in the art, for example by acid anhydride formation, which takes place with elimination of water by dimerization of two (intermolecular) carboxylic acid groups originating from different molecules.
  • acid anhydride formation which takes place with elimination of water by dimerization of two (intermolecular) carboxylic acid groups originating from different molecules.
  • R 1 , R 2 , R 3 represent a pentahapto-bonded second cyclopentadienyl ring which also contains a carboxylic acid group in the substituent R 5 '
  • the anhydride formation can also take place intramolecularly.
  • the radioactive metal ions M used are preferably Mn-52, Tc-99m, Re-186, Re-188, Fe-52, Ru-95, Ru-97, Ru-103, Ir-191, including in particular Tc-99m, Ru-97 and Re-168.
  • the invention further relates to a method for the radioactive labeling of molecules containing basic groups using complexes of the formula I.
  • the labeling is generally carried out in two stages.
  • the corresponding cyclopentadienl complexes of the formula II are first - analogously to the methods known to the person skilled in the art (see, for example, WO 91/18908 and examples 1-4) - in a metal exchange reaction
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 have the meanings given, but M 1 is a non-radioactive isotope of the elements iron, cobalt or chromium, with metal oxides or metal salts of the desired metal ions of the elements of the atomic numbers 21-29, 31, 42-44, 49 or 57-83 implemented.
  • the radioactive compound of the formula I is generally purified by means of thin layer chromatography or HPLC. The localization of the compounds on the plates and the determination of the yield are carried out via radioactivity measurements.
  • the actual labeling of the desired molecule follows.
  • any substance which can be selected from NH groups such as a protein, a proteohormone or a polypeptide, is reacted with the (the) radioactive metallocene carboxylic acid (derivative) of the formula I, if appropriate with the addition of an activator.
  • the implementation is analogous to the methods described in Analytica Chimica Acta, 1992, 2, 145-159.
  • activators for in situ activation of the carboxylic acid groups are dicyclohexylcarbodiimide (DDC), alkoxyacethylene, isobutylchlorocarbonate, benzotriazol-1-yl-tetramethyluronium tetrafluorate (TBTU). Bodanszky et. al., Principles of peptide synthesis, 1984.
  • the second reaction step takes place quickly and in good radiochemical yields, even at temperatures in the range from 20 to 40 ° C. and is usually carried out in aqueous buffer solutions, so that the conditions for routine use in the clinic are created.
  • marker molecules of the formula I and the method described above are suitable for the radioactive labeling of any NH-active compounds, such as proteins, immunoglobulins, antibodies, in particular antibodies against tumor tissue, Fab fragments,
  • Protein fragments, oligopeptides such as, for example, endothelin or partial endothelin sequences, amino acids, neurotransmitters, proteohormones, biogenic amines such as, for example, serotonin, histamine, ⁇ -aminobutyric acid and derivatives of steroids and estrogenic steroids containing amino groups, amino sugars, ergoline compounds and other dopamine genes.
  • the compounds labeled using the metallocene carboxylic acids and carboxylic acid derivatives of the formula I according to the process mentioned can be used directly in in vivo diagnostics and therapy, the labeled compounds being formulated in a physiologically tolerable manner by the methods customary in galenics. This can e.g. by suspending or dissolving the respective compound in a physiologically compatible suspension medium such as water, electrolyte solutions, etc. respectively.
  • Compounds are generally dosed in amounts of less than 10 ** 10 mol / kg body weight, the exact dose depending on the region of the body being examined but in particular also on the examination method chosen in each case being able to vary widely. Based on an average body weight of 70 kg, the amount of radioactivity for diagnostic applications is between 180 and 1100 MBq, preferably 500-800 MBq per application.
  • the application is usually intravenous, intraarterial, peritoneal or intratumoral, with intravenous application being preferred. Generally 0.1 to 2 ml of the agent in question are administered per test.
  • the choice of the respective radioisotope depends on the desired diagnostic method in which the radioactively labeled NH-active compounds are to be used.
  • the radio isotopes Tc-99m and Ru-97 are used in particular for the SPECT method.
  • Ru-97 has the advantage over the short-lived Tc-99m that (due to its longer half-life of 2.88 days) it is already available as a finished "marker molecule" - for example in the form of the metallocene acid chloride or preferably as the N-succinimide ester. can be delivered to the clinics.
  • the isotopes Re-186 or Re-188 are used in particular for the labeling of proteins for radiation therapy.
  • Metallocenecarboxylic acids labeled with Fe-52, Mn-52 or Ru-95 are suitable for introducing positron emitters into proteins.
  • the invention therefore also relates to new metallocene carboxylic acids and derivatives of the general formula I.
  • R 1 , R 2 , R 3 each represent a CO group or together represent a cyclopentadienyl radical which is optionally substituted by R 5 ' , R 4 represents a hydrogen atom, a C 1 -C 10 -alkyl radical or a group
  • -SR 7 with -R 7 and -R 8 mean a succinimide or phthalimide residue and M is a Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 or a Ir-191 stands.
  • the marker molecules of the formula I are distinguished in particular by the fact that they
  • the method according to the invention is characterized in particular by the fact that the marking step takes place quickly and almost quantitatively under mild conditions.
  • the method is therefore easy to carry out in the clinic on the one hand, but on the other hand it also enables the labeling of molecules, in particular those that are not particularly thermally stable, such as e.g. Proteins. Such molecules would not be radiolabelable using other known methods (see e.g. WO 91/18908).
  • Cyclopentadienylcarbonyl-Technetium compounds are hereinafter referred to as “Cytectrene”.
  • Cyclopentadienylcarbonyl-Re compounds are referred to as “Cyrhetrene” and "Rutheniumdicyclopentadienyl compounds” as “Ruthenocene” designated.
  • Examples 1-4 describe the synthesis of various "marker molecules” used according to the invention
  • Examples 5-7 describe the derivatization (activation) of some “marker molecules” containing carboxylic acid groups
  • Examples 8-13 describe the radioactive labeling of various NH-active compounds.
  • Tc-99m-cytctrenecarboxylic acid 1 mg ferrocenecarboxylic acid and 0.8 mg Mn (CO) 5 Br are mixed with 10-20 MBq Tc-99m pertechnetate in 50 ⁇ l tetrahydrofuran, melted in a glass ampoule under reduced pressure and 1 h at 170 ° C. heated.
  • the contents of the ampoule are applied in a line to an ICW silicone rapid plate F 254 and chromatographed in methylene chloride / methanol (90:10).
  • the cytctrenecarboxylic acid is eluted with 2-3 ml of chloroform / methanol (1: 1) and the eluate is evaporated to dryness under a nitrogen atmosphere.
  • Ru-103-Cl3 melted in 50 ⁇ l dioxane with 3% HC1.
  • the contents of the ampoule are heated to 130 ° C. for 1 h and then applied to thin-layer silica gel plates.
  • the cytctrenecarboxylic acid obtained from Example 2 is taken up in 200 ⁇ l of tetrahydrofuran and reacted at room temperature with 0.25 mg of N-hydroxysuccinimide and 0.5 mg of dicyclohexylcarboxylic acid diimide for 30 minutes with stirring.
  • the cytctrenecarboxylic acid obtained from Example 2 is taken up in 200 ⁇ l of tetrahydrofuran and reacted at room temperature with 0.25 mg of N-hydroxysuccinimide and 0.5 mg of dicyclohexylcarboxylic acid diimide for 30 minutes with stirring.
  • Example 6 Tc-99m-Cytectrenoylpropionsä re-N-succinimide ester 200 ⁇ l eluate of the Tc-99m-Cytectrenoylpropionic acid from Example 3, 4 mg of N-hydroxysuccinimide and 8 mg of dicyclohexylcarboxylic acid diimide are left under repeated shaking at room temperature. After 2 h the N-succinimide ester is obtained by chromatography in 79% yield. The purification is carried out by thin layer chromatography in methylene chloride / methanol (95: 5).
  • the solution of the cytctrenecarboxylic acid N-succirimide ester obtained from Example 5 is concentrated to 10 .mu.l under a nitrogen atmosphere and mixed with 3 .mu.mol glycine - dissolved in 100 .mu.l borate buffer [0.1 molar, pH 8.5]. After stirring for 1 h at room temperature, the product is isolated by chromatography in ethanol and then purified by thin layer chromatography in chloroform acetone / formic acid (75: 20: 5).

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von radioaktiven Metallocen-Carbonsäuren und deren Derivaten der Formel (I), worin R?1, R2, R3 R4 und R5¿ unterschiedliche Bedeutung haben und M für ein radioaktives Metallisotop der Elemente der Ordnungszahlen 21-29, 31, 42-44, 49 oder 57-83 steht, zur radioaktiven Markierung von NH-aktiven Verbindungen, ein Verfahren zur Markierung dieser, sowie neue Metallocen-Carbonsäure-Derivate der Formel (I) mit M in der Bedeutung eines Cr-51-, Mn-52-, Ru-97-, Ru-103-, Re-186-, Re-188-, Ir-191- Isotops.

Description

Verwendung von Cyclopentadienylcarbonyl-Übergangsmetall-Carbonsäuren und deren Derivaten zur Markierung von Proteinen
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, das heißt die Verwendung von radioaktiven Metallocen-Carbonsäuren und deren Derivaten und Verfahren zur radioaktiven Markierung von Proteinen und anderen NH-aktiven Verbindungen. Die Erfindung betrifft weiterhin neue Metallocen-Carbonsäuren und Carbonsäurederivate des Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 oder Ir-191.
Radioaktive markierte Verbindungen finden eine breite Anwendung in vielen Bereichen der Technik. Im Bereich der Medizin werden radioaktiv markierte Substanzen - wie z.B. markierte Proteine - sowohl zu diagnostischen- als auch zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Ein bekanntes Markierungs-Verfahren von Proteinen besteht darin, daß Chelatbildner derart an Proteine oder Oligopeptide gebunden werden, daß sie ihre chelatbildende Eigenschaft möglichst nicht verlieren. Entsprechende Chelatbildner können zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) sein. Durch Umsetzung mit radioaktiven Ionen wie zum Beispiel radioaktiven Indium- oder Technetiumisotopen erfolgt dann die eigentliche Markierung.
Ein Nachteil bei der Verwendung von Chelatbilnern zur Bindung der radioaktiven Isotope ist, daß die biologische Funktion des Proteins durch den Chelatbildner verändert werden kann. Zusätzlich kann durch "Umchelatisierung" durch körpereigene Komplexbildner ein Teil des primär an das Protein gebundenen Radioisotops wieder verlorengehen. Die dauerhafte Bindung von Radioisotopen ist jedoch die entscheidende Vorraussetzung für Radio-Immunoassays - hier die Bindung an Proteine wie zum Beispiel Immunglobuline - oder eine nukleamedizinische Anwendung.
Auch mit Hilfe Iod-markierter Ester von N-Hydroxysuccinimid sind Proteinmarkierungen durchgeführt worden (A.E.Bolton, W.M. Hunter, Biochem. J., 133. 529, 1973). Radioaktive Iodisotope sind aus verschiedenen Gründen für die nuklearmedizinische Anwendung jedoch schlecht geeignet. Iod-125 hat eine zu geringe Energie und zu lange Halbwertszeit, Iod-131 führt durch seine Partikelstrahlung zu einer hohen Strahlenbelastung und das Iod-123 ist zu teuer, da dessen relativ kurze Halbwertszeit eine umfangreiche Logistik erfordert. Des weiteren kann auch bei der Iodierung die Struktur des Proteins teilweise derart verändert werden, daß die biologischen Funktionen des Proteins nur noch zum Teil erhalten sind. Aus WO 91/18908 sind 99 Tc-Cyclopentydienyl-Carbonyl-Komplexe mit verschiedenen Seitenketten bekannt. Die dort beschriebenen Komplexe zeichnen sich durch eine hohe in vivo Stabilität aus, so daß ein "umchelatisieren" durch körpereigene Komplexbildner nicht beobachtet wird. Auch wird das durch die Seitenkette bestimmte Anreicherungsverhalten durch den Komplexbildner (Cyclopentadienylring) nur unwesentlich beeinflußt. Allerdings geht aus dem in der WO 91/18908 offenbarten Herstellungsverfahren hervor, daß für jeden Tc-Komplex (mit spezifischer - der jeweiligen diagnostischen Fragestellung angepaßten - Seitenkette) zunächst der entsprechende Cyclopentadienyl-Eisen-, -Chrom- oder - Cobalt-Komplex synthetisiert bzw. bereitgestellt werden muß, der dann durch Metallaustauschreaktion in den entsprechenden Tc-Komplex überführt wird. Das heißt, jede individuelle 99mχc_verbmdung benötigt eine eigene Vorstufe. Ein weiterer Nachteil des in der WO 91/18908 offenbarten Verfahrens ist es, daß es nicht zur Herstellung von markierten, thermisch instabilen Verbindung geeignet ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein eine Substanzklasse, die eine radioaktive Markierung beliebiger Aminogruppen-haltiger Moleküle, die ein spezifisches in-vivo Anreicherungsverhalten zeigen, erlaubt, sowie ein Verfahren zur Markierung dieser Moleküle bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Metallocen- Carbonsäuren und deren Derivaten von radioaktiven Metallisotopen der allgemeinen Formel I
R
M *
R 2
(D
worin R1, R2, R3 jeweils für eine CO-Gruppe stehen oder gemeinsam ein Cyclopentadienyl- rest bedeuten, der gegebenenfalls durch R5' substituiert ist, R4 für ein Wasserstoffatom, einen Cr C10-Alkylrest oder eine Gruppe
-CO-CH3 steht, R5, R5' unabhängig voneinander für -CO-(CH2)m-COR6, -(CH2)n-COR6, -CH=CH-(CH2)n-COR6 oder -C≡C-(CH2)n-COR6 steht, wobei m für die Ziffern 1 bis 6, n für die Ziffern 0 bis 6, R6 für Chlor, eine Gruppe -NH-NH2, einen Rest -R8, -OR7 oder
-SR7 steht, mit R7 in der Bedeutung von Wasserstoff, einem C1-C10-Alkyl-,
R8 in der für R7 angegebenen Bedeutung mit der Außnahme von Wasserstoff und einem Cj-CiQ-Alkylrest und M ein radioaktives Metallisotop eines Elements der Ordnungszahlen 21-29,
31, 42-44, 49 oder 57-83 bedeutet, gelöst.
Unter Verwendung der Verbindungen der Formel I (nachfolgend auch als "Marker- Moleküle" bezeichnet) gelingt es, beliebige basische Gruppen tragende Moleküle, insbesondere Biomoleküle - wie Proteine, Proteohormone oder Polypeptide - in stabile, radioaktiv markierten Substanzen zu überführen, die sowohl in der Radioimmun-Diagnostik als auch in der Nuklearmedizin - zum Beispiel zur in vivo Darstellung von Rezeptoren oder Antikörper-bindenden Strukturen, besonders zur Lokalisation von Tumoren - eingesetzt werden können.
Darüberhinaus sind die Metallocen-Carbonsäuren der Formel I auch geeignet, Positronenstrahler in Proteine einzuführen.
Als Reste R1, R2, R3 kommen infrage jeweils eine Carbonylgruppe oder ein pentahapto-gebundener - gewünschtenfalls R5' substituierter - zweiter Cyclopentadienylring, wobei die Carbonylgruppen bevorzugt sind. Als Rest R4 kommen infrage eine -CO-CH3 - Gruppe, ein gerad- oder verzweigtkettiger Cj-CjQ-Alkylrest wie z.B. ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Buty-1-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Isopentyl-, Neopenty-1-, Hexylrest oder insbesondere ein Wasserstoffatom.
Erfindungsgemäß bevorzugte Reste R5 sind, eine -COOH -, eine -CO-(CH2)2-COOH - Gruppe, insbesondere aber aktivierte Säuregruppen wie z.B. eine -COC1 -, eine -CO-(CH2)2-CO-R8 -, eine -CO-(CH2)2-COOR8 -, eine -CO-OR8 - oder eine -CO-R8 -Gruppe mit R8 in der Bedeutung eines Succinimid- oder Phtalimid- Restes.
Die Aktivierung der freien Carbonsäuregruppen kann aber auch nach anderen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, so z.B. durch Säureanhydrid-Bildung, die unter Wasserabspaltung durch Dimerisierung zweier - aus unterschiedlichen Molekülen stammenden (intermolekular) - Carbonsäuregruppen, erfolgt. Für den Fall, daß R1, R2, R3 für einen pentahapto-gebundenen zweiten Cyclopentadienylring stehen, der im Substituenten R5' ebenfalls eine Carbonsäuregruppe enthält, kann die Anhydrid-Bildung auch intramolekular erfolgen.
Als radioaktive Metallionen M kommen bevorzugt zum Einsatz Mn-52, Tc-99m, Re-186, Re-188, Fe-52, Ru-95, Ru-97, Ru-103, Ir-191, darunter insbesondere Tc-99m, Ru-97 und Re-168.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur radioaktiven Markierung von basische Gruppen enthaltenden Molekülen unter Verwendung von Komplexen der Formel I. Die Markierung erfolgt in der Regel in zwei Stufen. Im ersten Schritt werden zunächst - in Analogie zu dem Fachmann bekannten Methoden (siehe z.B. WO 91/18908, sowie Beispiele 1-4) - in einer Metallaustauschreaktion die entsprechenden Cyclopentadienlkomplexe der Formel II
worin R1, R2, R3, R4 und R5 die angegebenen Bedeutungen haben, M1 jedoch für ein nicht-radioaktives Isotop der Elemente Eisen, Cobalt oder Chrom steht, mit Metalloxiden bzw. Metallsalzen der gewünschten Metallionen der Elemente der Ordnungszahlen 21-29, 31, 42-44, 49 oder 57-83 umgesetzt.
Die Reinigung der radioaktiven Verbindung der Formel I erfolgt in der Regel mittels Dünnschichtchromatographie oder HPLC. Die Lokalisation der Verbindungen auf den Platten sowie die Ausbeutebestimmungen erfolgen über Radioaktivitätsmessungen.
In Fällen von längerlebigen Isotopen, wie z.B. Ru-97, kann diese Umsetzung bereits außerhalb der Klinik bei einem entsprechenden Radiopharmaka-Hersteller erfolgen. Im Falle von kurzlebigen Isotopen, wie z.B. Tc-99m, wäre diese Umsetzung unmittelbar vor der Applikation durch den behandelnden Arzt durchzuführen, wobei entsprechende Kits (analog zu den in der WO 91/18908 offenbarten) bereitzuhalten wären.
Die entsprechenden Ausgangsverbindungen der Formel II mit M1 in der Bedeutung von Eisen, Cobalt oder Chrom sind zum Teil kommerziell erhältlich oder können wie in M. Tanaka, J. Chromatogr. 292 (1984) 410 oder Gmelin's Handbuch der
Anorganischen Chemie [(Springer Verlag; Achte Auflage) Bände Ferrocen 2-4, 7, und 8 (Teil A)] beschrieben (oder analog zu den dort beschriebenen Verbindungen) leicht hergestellt werden.
Im zweiten Reaktionsschritt schließt sich die eigentliche Markierung des gewünschten Moleküls an. Dabei wird eine beliebig wählbare NH-Gruppen tragendende Substanz wie z.B. ein Protein, ein Proteohormon oder ein Polypeptid mit der (dem) radioaktiven Metallocen Carbonsäure (Derivat) der Formel I, gegebenenfalls unter Zugabe eines Aktivators, umgesetzt. Die Umsetzung erfolgt analog zu den in der Analytica Chimica Acta, 1992, 2 , 145-159 beschrieben Methoden. Als Aktivatoren zur in situ Aktivierung der Carbonsäuregruppen seien beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DDC), Alkoxyacethylen, Iso-butylchlorcarbonat, Benzotriazol-1-yl-tetramethyl-uronium-tetrafluorat (TBTU) genannt. Weitere Aktivatoren werden von Bodanszky et. al., Principles of peptid synthesis, 1984 beschrieben.
Bei Metallocenen bei denen die Carbonsäuregruppen bereits in aktivierter Form z.B. Succinimidester, Ester, Thioester, Amid oder als Anhydrid vorliegen, kann auf eine die Zugabe eines Aktivators verzichtet werden.
Der zweite Reaktionsschritt erfolgt schnell und in guten radiochemischen Ausbeuten, bereits bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 40 °C und wird in der Regel in wäßrigen Pufferlösungen durchgeführt, so daß die Voraussetzungen für eine routinemäßige Anwendung in der Klinik geschaffen sind.
Die beschriebenen "Marker-Moleküle" der Formel I sowie das zuvor beschriebene Verfahren eignen sich zur radioaktiven Markierung beliebiger NH-aktiver Verbindungen, wie zum Beispiel Proteinen, Immunglobulinen, Antikörpern, insbesondere Antikörpern gegen Tumorgewebe, Fab-Fragmenten,
Proteinbruchstücken, Oligopeptiden wie zum Beispiel Endothelin oder Endothelinteilsequenzen, Aminosäuren, Neurotransmittern, Proteohormonen, biogenen Aminen wie zum Beispiel Serotonin, Histamin, γ-Aminobuttersäure sowie Aminogruppen-haltigen Derivaten von Steroiden und östrogenen Steroiden, Aminozuckern, Ergolin und andere dopaminergen Verbindungen.
Die unter Verwendung der Metallocen-Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten der Formel I nach dem genannten Verfahren markierten Verbindungen können direkt in der in vivo Diagnostik und Therapie zur Anwendung kommen, wobei die markierten Verbindungen nach den in der Galenik üblichen Methoden in physiologisch verträglicher Weise formuliert werden. Dies kann z.B. durch Suspendieren oder Lösen der jeweiligen Verbindung in einem physiologisch verträglichen Suspensionsmedium wie Wasser, Elektrolytlösungen u.s.w. erfolgen.
Bei der nuklearmedizinischen in vivo Anwendung werden die markierten
Verbindungen in der Regel in Mengen kleiner als 10**10 mol/kg Körpergewicht dosiert, wobei die genaue Dosis in Abhängigkeit der untersuchten Körperregion aber insbesondere auch der jeweils gewählten Untersuchungsmethode stark variieren kann. Ausgehend von einem mittleren Körpergewicht von 70 kg beträgt die Radioaktivitätsmenge für diagnostische Anwendungen zwischen 180 und 1100 MBq, vorzugsweise 500 - 800 MBq pro Applikation. Die Applikation erfolgt normalerweise intravenös, intraarteriell, peritoneal oder intratumoral, wobei die intravenöse Applikation bevorzugt ist. Pro Untersuchung werden im allgemeinen 0,1 bis 2 ml des betreffenden Mittels verabreicht.
Die Wahl des jeweiligen Radioisotops richtet sich nach der gewünschten diagnostischen Methode, in der die radioaktiv markierte NH-aktive Verbindungen eingesetzt werden soll.
Für das SPECT- Verfahren finden insbesondere die Radioisotope Tc-99m und Ru-97 Verwendung. Ru-97 hat gegenüber dem kurzlebigen Tc-99m den Vorteil, daß es (aufgrund seiner längeren Halbwertszeit von 2,88 Tagen) bereits als fertiges "Marker- Molekül " - zum Beispiel in Form des Metallocen-Säurechlorids oder bevorzugt als N-Succinimidester - in die Kliniken geliefert werden kann.
Die Isotopen Re-186 oder Re-188 finden insbesondere bei der Markierung von Proteinen für die Strahlentherapie Anwendung.
Mit Fe-52, Mn-52 oder Ru-95 markierte Metallocencarbonsäuren sind zur Einführung von Positronenstrahlern in Proteine geeignet.
Einige der erfmdungsgemäß verwendeten Metallocencarbonsäuren und Carbonsäure- Derivate wurden bislang nicht beschrieben. Die Erfindung betrifft daher auch neue Metallocen-Carbonsäuren und Derivate der allgemeinen Formel I
worin R1, R2, R3 jeweils für eine CO-Gruppe stehen oder gemeinsam ein Cyclopentadienyl- rest bedeuten, der gegebenenfalls durch R5' substituiert ist, R4 für ein Wasserstoffatom, einen Cj- C10-Alkylrest oder eine Gruppe
-CO-CH3 steht, R5, R5' unabhängig voneinander für -CO-(CH2)m-COR6, -(CH2)n-COR6, -CH = CH-(CH2)n-COR6 oder -C≡C-(CH2)n-COR6 steht, wobei m für die Ziffern 1 bis 6, n für die Ziffern 0 bis 6, R6 für Chlor, eine Gruppe -NH-NH2, einen Rest -R8, -OR7 oder
-SR7 steht, mit -R7 und -R8 in der Bedeutung eines Succinimid- oder Phtalimidrestes und M für ein Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 oder ein Ir-191 steht.
Die Marker-Moleküle der Formel I zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie
die biologische Aktivität des markierten Moleküls nicht bzw. nur unwesentlich beeinflussen, eine hohe Stabilität in vivo zeigen und eine "Umchelatisierung" nicht eintritt, universell zur Markierung beliebiger NH-Gruppen enthaltender Verbindungen genutzt werden können und daß sie unter milden Reaktionsbedingungen mit NH-Gruppen enthaltenden Verbindungen reagieren.
Das erfmdungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß der Markierungsschritt unter milden Bedingungen schnell und nahezu quantitativ abläuft. Das Verfahren ist daher zum einen leicht in der Klinik durchführbar, ermöglicht aber zum anderen auch die Markierung von - insbesondere thermisch - wenig belastbaren Molekülen wie z.B. Proteinen. Derartige Moleküle wären nach anderen bekannten Verfahren (siehe z.B. WO 91/18908) nicht radioaktiv markierbar.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung des Erfindungsgegenstandes, ohne ihn auf diese beschränken zu wollen.
"Cyclopentadienylcarbonyl-Technetium- Verbindungen" werden im folgenden als "Cytectrene" bezeichnet. "Cyclopentadienylcarbonyl-Re- Verbindungen" werden als "Cyrhetrene" und "Rutheniumdicyclopentadienyl- Verbindungen" als "Ruthenocene" bezeichnet. Beispiele 1- 4 beschreiben die Synthese verschiedener erfindungsgemäß verwendeter "Marker-Moleküle", Beispiele 5 - 7 beschreiben die Derivatisierung (Aktivierung) einiger Carbonsäuregruppen enthaltenden "Marker-Moleküle", Beispiele 8 -13 beschreiben die radioaktive Markierung verschiedener NH-aktiver Verbindungen.
Metallaustauschreaktion
Beispiel 1 Tc-99m Cytectrencarbonsäurechlorid
In eine kleine Glasampulle gibt man 3 mg Ferrocen-carbonsäurechlorid 0,5 mg Mn(CO)5Br sowie 20 μCi radioaktives Tc-99m-Pertechnetat, gelöst in 0,5 ml getrocknetem Methylethylketon. Man schmilzt die Ampulle ab und erhitzt 1 h auf
150°C. Danach trennt man das radioaktive Säurechlorid durch
Dünnschichtchromatographie ab. Elutionsmittel ist Methylenchlorid.
Rp ('Cytectrencarbonsäurechlorid') : 0,72 Rp (Ferrocencarbonsäure : 0,64
Radiochemische Ausbeute: 50%
Beispiel 2 Tc-99m-Cytectrencarbonsäure 1 mg Ferrocencarbonsäure und 0,8 mg Mn(CO)5Br werden mit 10-20 MBq Tc-99m- Pertechnetat in 50μl Tetrahydrofuran gemischt, in einer Glasampulle unter vermindertem Druck eingeschmolzen und 1 h auf 170°C erhitzt. Zur Trennung der Cytectrencarbonsäure von der Resten unumgesetzter Ferrocencarbonsäure wird der Ampulleninhalt strichförmig auf eine ICW-Silicon-Rapid-Platte F 254 aufgetragen und in Methylenchlorid/Methanol (90:10) chromatographiert. Die Cytectrencarbonsäure wird mit 2-3 ml Chloroform/Methanol (1:1) eluiert und das Eluat unter Stickstoffatmosphäre zur Trockene eingeengt. Rp (Cytectrencarbonsäure'): 0,30 Rp (Ferrocencarbonsäure'): 0,64 Radiochemische Ausbeute: 91 %
Beispiel 3 Tc-99m-Cytectren-CO-(CHl)τCOOΗ.
2 mg Ferrocenoylpropionsäure und 0,5 mg Mn(CO)5Br werden in eine kleine Ampulle eingewogen. Dazu gibt man 10 μl Pertechnetatlösung (physiologische NaCl-Lösung) mit 50MBq Tc-99m und spült mit 50 μl Tetrahydrofuran nach. Nach Abschmelzen der Ampulle wird 40 min auf 150°C erhitzt. Die Reinigung erfolgt durch Chromatographie in Cyclohexan/Ether/Eisessig (65:35:5). Die Tc-99m- Cytectrenoylpropionsäure wird mit 1 ml Tetrahydrofuran eluiert. RF (Ferrocenoylpropionsäure . 0,23
RF (Tc-99m-Cytectrenoylpropionsäure') : 0,17 Radiochemische Ausbeute: 79% Beispiel 4 Ru-103-Ruthenocencarbonsäure
In eine Glasampulle werden 2 mg Ferrocencarbonsäure und eine Lösung von 2 MBq
Ru-103-Cl3 in 50 μl Dioxan mit 3% HC1 eingeschmolzen. Der Ampulleninhalt wird 1 h auf 130°C erhitzt und danach auf Kieselgeldünnschichtplatten aufgetragen.
Chromatographie in Methylenchlorid/Methanol (88: 12). Nach der Chromatographie erhält man eine gelbe Bande bei einem Rp = 0,64 und eine nicht gefärbte, UV-aktive Bande bei Rp = 0,56, der die radioaktive Ruthenocencarbonsäure enthält. Dieser radioaktive Peak wird abgeschabt und mit Chloroform/Methanol (1:1) eluiert. Rp (Ferrocencarbonsäure : 0,64 Rp (Ruthenocencarbonsäure'): 0,56 Radiochemische Ausbeute: 65%
Derivatisierung (Aktivierung)
Beispiel 5 Tc-99m-Cytectrencarbonsäure-N-s ccinimidester
Die aus Beispiel 2 erhaltene Cytectrencarbonsäure wird in 200 μl Tetrahydrofuran aufgenommen und bei Raumtemperatur mit 0,25 mg N-Hydroxysuccinimid sowie 0,5 mg Dicyclohexylcarbonsäurediimid 30 min unter Rühren umgesetzt. Die
Reinigung erfolgt durch Dünnschichtchromatographie in Methylenchlorid/Methanol
(98:2).
Rp (N-Succinimidester): 0,57
Radiochemische Ausbeute: 92%
Beispiel 6 Tc-99m-Cytectrenoylpropionsä re-N-succinimidester 200μl Eluat der Tc-99m-Cytectrenoylpropionsäure aus Beispiel 3, 4 mg N-Hydroxysuccinimid und 8 mg Dicyclohexylcarbonsäurediimid werden unter mehrmaligem Schütteln bei Raumtemperatur Stehen gelassen. Nach 2 h wird der N-Succinimidester durch Chromatographie in 79 %iger Ausbeute erhalten. Die Reinigung erfolgt dünnschichtchromatographisch in Methylenchlorid/Methanol (95:5). R-p (N-Succinimidester'): 0,65 Radiochemische Ausbeute: 79% Beispiel 7 Ru-103-Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester Das in Beispiel 4 erhaltene Eluat der radioaktiven Ruthenocencarbonsäure wird zur Trockene eingeengt, mit 5 mg N-Hydroxysuccinimid und 10 mg N,N-Dicyclohexylcarbodiimid in 300 μl Tetrahydrofuran versetzt. Anschließend wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester wird nach Dünnschichtchromatographie in Methylenchlorid/Methanol (88:12) 95 %iger Ausbeute erhalten. Rp (Ruthenocencarbonsäure'): 0,49 Rp (Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester) : 0,82 Radiochemische Ausbeute: 95%
Markierung
Beispiel 8 Tc-99m-Cytectrenoyl-glycin
Die aus Beispiel 5 erhaltene Lösung des Cytectrencarbonsäure-N-succiriimidesters wird unter Stickstoffatmosphäre auf 10 μl eingeengt und mit 3 μmol Glycin - gelöst in 100 μl Boratpuffer [0,1 molar, pH 8,5] -versetzt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Chromatographie in Ethanol isoliert und anschließend dünnschichtchromatographisch in Chloroform Aceton/ Ameisensäure (75:20:5) gereinigt.
Rp (Tc-99m-Cytectrenoyl-glvcin : 0,30 Radiochemische Ausbeute: 82%
Beispiel 9 Tc-99m-Cytectrenoyl-glycin-ethylester
10,93 MBq Tc-99m-Cytectrencarbonsäure hergestellt nach Beispiel 2 werden in 2 ml
Tetrahydrofuran gelöst. Von dieser Lösung werden 0,2 ml entnommen und mit 2 mg
Benzotriazol-l-yl-tetramethyl-uronium-tetrafluorat und 1 ml Diisopropylethylamin versetzt. Nach 5 min Schütteln bei Raumtemperatur wird diese Lösung zugegeben zu 1 mg Glycin-ethylester x HC1 in 0,1 ml Tetrahydrofuran und 2 μl Diisopropylamin. Das
Reaktionsgemisch wird 30 Minuten gerührt. Die Dünnschichtchromatographie erfolgt in Chloroform / Aceton / Ameisensäure (80:2,5:2,5).
R-p(Ferrocencarbonsäure') : 0,39 R-p(Ferrocenovl-Glvcinethvlester'): 0,58
Rp(Tc-99m-Cytectrenoyl-Glvcinethv1ester'): 0,62
Radiochemische Ausbeute an Tc-99m-Cvtectrenoyl-G1vcinethy1estp.r- 98% Beispiel 10 Tc-99m-Cytectrenoyl-N-glucosamin
Zu 9 MBq Tc-99m markierter Cytectrencarbonsäure hergestellt nach Beispiel 2 gibt man 0,76 mg (2 μmol) HBTU, 1 μl Diisopropylamin und 100 μl Methylpyrrolidon. Das Reaktionsgemisch wird 30 min. bei Raumtemperatur gerührt und danach auf 20 cm breite DC-Platten aufgetragen. Im Laufmittel Chloroform/Ethanaol (70:30) erhält man bei einem Rp-Wert 0,40 ein Radioaktivitätsmaximum des gewünschten Glucosaminderivates. Nach Abschaben dieses Rp-Bereiches wird die radioaktive Substanz mit Methanol eluiert. Ein re-chromatographieren in Aceton / Ethanol / Ammoniak (75:20:5) zeigt die radiochemische Reinheit dieser Verbindung. Rp(Cytectrenoyl-N-glucosamiri) : 0,40 Radiochemische Ausbeute: 80%
Beispiel .11 Ru-103-Ruthenocenoyl-gfycin-ethylester
Zu 1 MBq des Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidesters aus Beispiel 7 werden nach Abziehen des Lösungsmittels 1 mg Glycinεthylester und 100 μl Boratpuffer (pH 9) gegeben. Nach 1 h erhält man 69% und nach 2 h 91 % des gewünschten Ruthenocenoyl-glycin-ethylesters. Die Aufreinigung erfolgt durch Dünnschichtchromatographie in Chloroform/Aceton/Ameisensäure (80:2,5:2,5). Rp (Ruthenocenoyl-glycin-ethylester) : 0,43 Rp (Ruthenocencarbonsäure-N-hvdoxysuccinimidester') : 0,56 Radiochemische Ausbeute: 91 %
Beispiel 12 Ru-103-Ruthenocenσyl-heptapeptid
In einem kleinen Glas werden 1 mg Endothelinderivat [Heptapeptid; Gly-His-Leu-Asp- Ue-Ile-Trp-COOH] mit 4,8 KBq Ru-103-Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester (hergestellt nach Beispiel 7) in 100 μl Boratpuffer (pH 9) bei Raumtemperatur gerührt. Nach 90 min wird der Ansatz im Laufmittel Chloroform Methanol/ Ammoniak (50:45:10) Chromatographien:. Radiochemische Ausbeute: 62% Beispiel 13 Tc-99m-Cytectrenoyl-heptapeptid
19 MBq Cytectrencarborisäure-N-succinimidester (hergesellt nach Beispiel 5) in 0,1 ml THF werden mit 1 mg Endothelinderivat [Heptapeptid; Gly-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp- COOH] gelöst in 0,2 ml Borat-Puffer (pH 9) versetzt. Nach 180 min Rühren wird der Ansatz im Laufmittel Essigester/MeOH/NH3 (50:40:10) chromatographiert. Rp Cytectrencarbonsäuresuccinimidester: 0,69 Rg (Cytectrenoyl-Heptapeptidl: 0,33 Radiochemische Ausbeute: 53,6%

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Metallocen-Carbonsäuren und deren Derivaten von radioaktiven Metallisotopen der allgemeinen Formel I
(I)
worin
R1, R2, R3 jeweils für eine CO-Gruppe stehen oder gemeinsam ein Cyclopentadienyl- rest bedeuten, der gegebenenfalls durch R5' substituiert ist,
R4 für ein Wasserstoffatom, einen Cj- C10-Alkylrest oder eine Gruppe -CO-CH3 steht, R5, R5' unabhängig voneinander für -CO-(CH2)m-COR6, -(CH2)n-COR6, -CH=CH-(CH2)n-COR6 oder -C≡C-(CH2)n-COR6 steht, wobei m für die Ziffern 1 bis 6, n für die Ziffern 0 bis 6, R6 für Chlor, eine Gruppe -NH-NH2, einen Rest -R8, -OR7 oder -SR7 steht, mit
R7 in der Bedeutung von Wasserstoff, einem C -CiQ- l yl-,
R8 in der für R7 angegebenen Bedeutung mit der Außnahme von Wasserstoff und einem Cj-Cjn-Alkylrest und M ein radioaktives Metallisotop eines Elements der Ordnungszahlen 21-29,
31, 42-44, 49 oder 57-83 bedeutet, zur radioaktiven Markierung von NH-Gruppen enthaltenden Verbindungen.
2. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Markierung von Proteinen, Immunglobulinen, Antikörpern, Fab-Fragmenten, Proteinbruchstücken, Oligopeptiden, Aminosäuren, Histamin, γ-Aminobuttersäure, Neurotransmittern, Proteohormonen, biogenen Aminen, NH-Gruppen-haltigen Derivaten von Steroiden und östrogenen Steroiden, Aminozuckern, Ergolinen, und dopaminergen Verbindungen.
3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, in denen das radioaktive Metallisotop Mn-52, Tc-99m, Re-186, Re-188, Fe-52, Ru-95, Ru-97, Ru-103, Ir-191 ist.
4. Metallocen-Carbonsäuren und Derivate der allgemeinen Formel I
worin
R1, R2, R3 jeweils für eine CO-Gruppe stehen oder gemeinsam ein Cyclopentadienyl- rest bedeuten, der gegebenenfalls durch R5' substituiert ist, R4 für ein Wasserstoffatom, einen Cr C10-Alkylrest oder eine Gruppe
-CO-CH3 steht, R5, R5' unabhängig voneinander für -CO-(CH2)m-COR6, -(CH2)n-COR6,
-CH=CH-(CH2)n-COR6 oder -C≡C-(CH2)n-COR6 steht, wobei m für die Ziffern 1 bis 6, n für die Ziffern 0 bis 6, R6 für Chlor, eine Gruppe -NH-NH2, einen Rest -R8, -OR7 oder -SR7 steht, mit -R7 und -R8 in der Bedeu ng eines Succinimid- oder Phtalimidrestes und
M für ein Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 oder ein Ir-191 steht.
5. Metallocen-Carbonsäure-Derivat nach Anspruch 4, nämlich Ru-97-Ruthenocencarbonsäurechlorid.
6. Metallocen-Carbonsäure-Derivat' nach Anspruch 4, nämlich Ru-97-Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester.
7. Verfahren zur Herstellung von radioaktiv markierten NH-aktiven, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel I
worin R*, R^, R3, R4 und R--5 die angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls unter Zusatz eines Aktivators, in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer NH-aktiven Substanz bei 20°C - 40°C umgesetzt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7 worin R-5 einen -COC1 -, einen Succinimid- oder einen N-Hydroxysuccinimidrest enthält.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als radioaktives Metallocen-Carbonsäure-Derivat der Formel I Ru-97-Ruthenocencarbonsäure- N-succinimidester, Tc-99m-Cytectrencarbonsäure-N-succinimidester oder ein radioaktiver Cyrhetrencarbonsäure-N-succinimidester verwendet wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als in situ Aktivator Dicyclohexylcarbodumid oder Benzotriazol-1-yl-tetramethyl- uroniumtetrafluorat verwendet wird.
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