DE69126816T2

DE69126816T2 - Metallkomplexe, die Addukte von Säure und Dioximliganden enthalten, zur Markierung von Proteinen und anderen Amin enthaltenden Verbindungen

Info

Publication number: DE69126816T2
Application number: DE69126816T
Authority: DE
Inventors: Karen E Linder; Adrian D Nunn; Kondareddiar Ramalingam
Original assignee: Bracco International BV
Current assignee: Bracco International BV
Priority date: 1990-04-13
Filing date: 1991-04-15
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2011-04-16
Also published as: US5183653A; CA2039218A1; EP0452858B1; CA2039218C; EP0452858A2; GR3024598T3; ATE155474T1; EP0452858A3; JPH05320182A; DK0452858T3; DE69126816D1; ES2103755T3; JP2933740B2

Description

Die Erfindung betrifft Metallkomplexe von Borsäureaddukten an Dioxim-Liganden, die zur Markierung von Proteinen und anderen aminhaltigen Verbindungen geeignet sind.
Die Dokumente EP-A-199 260 und 311 891 offenbaren Verbindungen der Formel XM[R&sub1;C(NOH)-CR&sub2;(NOH)]&sub3;B-R&sub3;, in der X ein Anion ist; M ist ein Markierungsmetall, nämlich Tc oder Re; R&sub1; und T&sub2; und R&sub2; bedeuten H, Halogene, aliphatische, aromatische oder heterocyclische Substituenten; B ist Bor; und R&sub3; kann HO-, Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Alkoxy-, HOOC-Alkyl-, HOOC- Alkenyl-, HO-Alkyl-, HO-Alkenyl-, Alkoxyalkyl-, Alkoxyalkenyl-, Halogenalkyl-, Halogenalkenyl-, Aryl-, Arylalkyl-, R&sub4;R&sub5;N-Alkylsein, wobei R&sub4; und R&sub5; H oder Alkyl sind oder zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen Heterocyclus bilden.
Das gemäß Artikel 54(3-4) EPC zitierte Dokument EP-A-441 491 offenbart Verbindungen der Formel XM[R&sub1;C(NOH)-CR&sub2;(NOH)&sub3;B-(A&sub1;)pR&sub3;, in der X, M, R&sub1; und R&sub2; wie in den zuvor genannten Dokumenten definiert sind, während R&sub3; eine biochemisch aktive Gruppe darstellt oder enthält (Seite 3, Zeile 27), die unter Hypoxy-vermittelnden Nitroheterocyclen; Amphetaminen; Steroiden, z.B. Östrogen oder Östradiol; Zuckern; Fettsäuren; Barbituraten; Sulfonamiden; Monoaminoxidasesubstraten und -inhibitoren; antihypertonischen Mitteln; Substraten für Muscarin-Rezeptoren und Substraten für Dopamin-Rezeptoren ausgewählt sind. Biochemisch aktive Gruppen werden weiterhin auf Seite 4, Zeile 24 des Zitats als "Moleküle mit einer Affinität für einen spezifischen Rezeptor" definiert.
A&sub1; ist eine Bindung oder eine Spacer-Gruppe (p ist eine ganze Zahl von 0 bis etwa 100), die eine lineare oder verzweigte Kette bilden kann, und die A&sub1; sind unter -CHR&sub4;-, -CR&sub4;R&sub5;-, -CH=CH-, -CH=CR&sub4;-, -CR&sub4;=CR&sub5;-, -C C-, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Arylen, Heterocyclo, -O-, -S-, -CO-, -CS-, -NH-, -CH=N-, -CR&sub4;=N-, -NR&sub4;-, Alkylen, Oxaalkylen, Hydroxyalkylen, Hydroxyalkoxyalkylen, Alkenylen, Arylalkylen, Alkylamido, Arylalkylamido, Alkylaminoalkylen, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-, -CH&sub2;-CH=CH-CH&sub2;-, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-; -Ph-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub2;-, -(CH&sub2;)&sub2;O-, -CH&sub2;CH(OH)CH&sub2;OCH&sub2;-, -CH&sub2;CO-NH-CH&sub2;-Ph-, -(A&sub3;-O-A&sub3;')- und -(A&sub3;-NH-A&sub3;') ausgewählt, wobei A&sub3; und A&sub3;' die gleiche oder verschiedene Alkylgruppen sind und R&sub4; und R&sub5; unabhängig unter Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Aryl, 5- oder 6-gliedrigen N- und CO-haltigen Heterocyclen, Halogen, -OH oder Alkyl-OH ausgewählt sind.
Die Metallkomplexe von Borsäure-Addukten an Dioxim-Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die Formel II auf
II XM[R&sub1;C(NOH)-CR&sub2;(NOH)&sub3;B-(A&sub1;)p-E
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, in der:
M ein Isotop des Technetiums oder Rheniums ist;
X ein Anion ist und R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander H, Halogen, Alkyl, Aryl oder ein 5- oder 6-gliedriger N-, S- oder O-haltiger Heterocyclus sind, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen -(CR&sub8;R&sub9;)n- sind, wobei n = 3, 4, 5 oder 6 und R&sub8; und R&sub9; jeweils unabhängig voneinander H oder Alkyl sind;
B Bor ist; (A&sub1;) ein chemischer Rest ist, der die durch "E" repräsentierte Gruppe vom Rest des Komplexes II distanziert oder auf andere Weise isoliert, p 0 oder eine ganze Zahl bis zu 100, vorzugsweise 1 bis 20 ist; und
E eine Gruppe der Formel
ist, in der R&sub3; eine mit Aminen und Proteinen reaktionsfähige Funktion ausgewählt unter -NCS, -NCO, -O-Tosyl, -O-Mesityl oder derivatisierten Acylhalogeniden, aktivierten Estern und N-Hydroxysuccinimid ist; und R&sub4; H oder eine die Löslichkeit in Wasser erhöhende Funktion ausgewählt unter -OH, -COOH, -SO&sub3;H, Alkylsulfonaten, -SO&sub2;NH&sub2;, -Alk-COOH, -Alk-OH ist. Die Isothiacyanatgruppe -N=C=S ist bevorzugt.
R&sub4; kann ortho-, meta- oder paraständig zu R&sub3; sein. Vorzugsweise befindet sich R&sub4; sowohl in Beziehung zu R&sub3; als auch der Spacer-Gruppe (A&sub1;)p in einer Metaposition.
In den Borderivaten gemäß Formel II kann (A&sub1;) jede chemische Gruppe sein, welche die durch "E" dargestellte Gruppe vom Rest des Komplexes der Formel II distanzieren oder auf andere Weise isolieren kann.
Beispielsweise sind, wenn p eine ganze Zahl größer als 0 ist, A&sub1; oder die verschiedenen A&sub1;-Einheiten, die eine gerade oder verzweigte Kette bilden, unabhängig unter Alkylen- Alkenylen, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Oxaalkylen, Hydroxyalkylen, Carboxyalkylen, Alkylenamido, Alkylensulfonato, Arylen, Arylalkylen, Heterocyclo, -CH&sub2;-, -CHR&sub6;-, -CR&sub6;R&sub1;&sub0;-, -CH=CH-, -CH=CR&sub1;&sub1;-, -CR&sub6;=CR&sub1;&sub2;-, C C-; -O-, -S-, -CO-, -HC=N-, -CR&sub6;=N-, oder -NR&sub6;- ausgewählt, wobei R&sub6;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub2; unabhängig unter Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Aryl, 5- oder 6-gliedrigen N-haltigen heterocyclischen Resten, Halogen, -OH oder Hydroxyalkyl ausgewählt sind.
In den Komplexen gemäß der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Gruppen für -(A&sub1;)p- Alkylen, Arylen, Oxaalkylen, Hydroxyalkylen, Hydroxyalkylenoxy, Carboxyalkylen, Arylalkylen, Arylalkylamido, Alkylamido und Alkylsulfonato.
Die am meisten bevorzugten borhaltigen Reste sind Verbindungen gemäß der Formel
in der p 0 oder 1 ist, und R&sub4; Wasserstoff oder eine die Löslichkeit in Wasser erhöhende Funktion wie -COOH, Carboxylalkyl, Hydroxyalkyl, -SO&sub3;H, Alkylsulfonat, Sulfonamid oder Hydroxyl ist.
Der Begriff Anion bezieht sich auf jede chemische Entität, welche eine negative Ladung trägt. Beispielhafte Gruppen sind Cl&supmin;, Br&supmin;, F&supmin;, I&supmin;, HO&supmin;, RS&supmin;, S=C=N&supmin;, und N C-S&supmin;. Die bevorzugten anionischen Gruppen sind Cl&supmin; und HO&supmin;.
Unten werden Definitionen für die zur Beschreibung der Komplexe der Erfindung verwendeten Begriffe angeführt. Diese Definitionen gelten für die Begriffe, wie sie in der ganzen Beschreibung verwendet werden (wenn sie nicht in bestimmten Fällen anders beschränkt sind), entweder individuell oder als Teil einer größeren Gruppe.
Der Begriff "Alkyl" bezieht sich sowohl auf Gruppen mit gerader als auch verzweigter Kette. Gruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen sind bevorzugt.
Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf Phenyl und substituiertes Phenyl. Bevorzugt sind Phenyl und Phenyl, das mit 1, 2 oder 3 Alkyl-, Halogenalkyl-, Dialkylaminoalkyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl-, Halogen-, Hydroxy- oder Formylgrupen substituiert ist.
Der Ausdruck "5- oder 6-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus" bezieht sich auf alle 5- oder 6-gliedrigen Ringe, die mindestens ein Stickstoffatom enthalten. Beispielhafte aliphatische Gruppen sind Dehydroderivate von Verbindungen mit der Formel
in der m 0 oder 1 und A Sauerstoff, Schwefel, N-R&sub1;&sub3; oder CH- R&sub1;&sub4; ist, wobei R&sub1;&sub3; Alkyl, Aryl oder Arylalkyl und R&sub1;&sub4; Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Arylalkyl ist. Der Ausdruck "5- oder 6-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus" umfaßt auch aromatische Gruppen. Beispielhafte heteroaromatische Gruppen sind Pyrrolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Pyrazolyl, Pyridinyl und Pyrimidinyl-Gruppen. Die obigen Gruppen können über ein Heteroatom oder ein Kohlenstoff-5-Atom gebunden sein.
Der Ausdruck "5- oder 6-gliedriger stickstoff- oder sauerstoffhaltiger Heterocyclus" betrifft alle 5- und 6-gliedrigen Ringe, die mindestens ein Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff- Atom enthalten. Beispielhaft sind die oben unter der Definition des Begriffs "5- oder 6-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus" beschriebenen Gruppen. Zusätzliche beispielhafte Gruppen sind 1,4-Dioxanyl, Furanyl und Thiophenyl.
Es sollte klar gestellt werden, daß die verschiedenen Gruppen in (A&sub1;)p oder R&sub1; und R&sub2; der vicinalen Dioxime keine funktionellen Gruppen enthalten sollten, die mit den R&sub3;-Gruppen der Bor- Derivate gemäß Formel IV reagieren.
Die Herstellung der Technetiumkomplexe gemäß der Erfindung kann am besten unter Verwendung von Technetium-99m in Form des Pertechnetations erfolgen. Das Pertechnetation kann durch kommerziell erhältlichen Technitium-99m-Ausgangselement-Folgeproduktgeneratoren (parentdaughter generators) erhalten werden. Solches Technetium liegt in der Oxidationsstufe +7 vor. Die Erzeugung des Pertechnetations unter Verwendung dieses Generatortyps ist allgemein bekannt und genauer in den Dokumenten US- A-3,369,121 und 3,920,995 beschrieben. Diese Generatoren werden gewöhnlich mit Salzlösung eluiert, und das Pertechnetation wird als Natriumsalz erhalten.
Die Herstellung von Komplexen gemäß der Erfindung, bei denen M ein Isotop des Rheniums ist, kann am besten unter Verwendung einer Quelle für Rhenium in der Oxidationsstufe +3, +4, +5 oder +7 erfolgen. Beispiele für Verbindungen, in denen Rhenium in der Oxidationsstufe +3 vorliegt, sind ReCl&sub3;(CH&sub3;CN)(PPh&sub3;)&sub2; und [Re&sub2;Cl&sub8;](NBu&sub4;)&sub2;, wobei Ph = Phenyl und Bu = Butyl ist. Re(IV) ist als K&sub2;ReCl&sub6; und Re(VII) als NH&sub4;ReO&sub4; oder KReO&sub4; erhältlich. Re(V) ist als [ReOCl&sub4;](NBU&sub4;) und [ReOCl&sub4;](AsPh&sub4;) und als ReOCl&sub3;(PPh&sub3;)&sub2; und als ReO&sub2;(Pyridin)&sub4;&spplus; erhältlich. Andere, dem Fachmann bekannte Re(III)-, Re(IV)-, Re(V)- oder Re(VII)-Reagenzien können ebenfalls verwendet werden.
Zur Herstellung der Komplexe der Erfindung ist eine Quelle eines Metallions, wie oben beschrieben, erforderlich, welche mit einer Quelle eines Anions, einem Borsäure-Derivat mit der Formel VII (OH)&sub2;B(A&sub1;)p-E und einem Dioxim der Formel HO-N=CR&sub1;-CR&sub2;=N-OH oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon kombiniert wird.
Alternativ können die Komplexe der Erfindung hergestellt werden, indem ein Borsäure-Derivat gemäß Formel VII mit einer Verbindung der Formel XM[R&sub1;C(NOH)CR&sub2;(NOH)]&sub3; umgesetzt wird. Die US 4,714,605 offenbart eine Verbindung MX(Dioxim)&sub3;, in der M Technetium ist.
Komplexe der Formel MX(Dioxim)&sub3;, in der M ein Isotop des Rheniums ist, können durch Kombinieren einer Quelle für Re(III), wie ReCl&sub3;(CH&sub3;CN)(PPh&sub3;)&sub2; oder [Re&sub2;Cl&sub8;](NBu&sub4;)&sub2;, mit einem Dioxim der Formel HO-N=CR&sub1;-CR&sub2;=N-OH und einer Quelle für ein Anion X hergestellt werden. Die Bildung des Komplexes ReX(Dioxim)&sub3; erfolgt, wenn die Mischung des Re(III)-Ausgangsmaterials, der Anionquelle und des Dioxim-Liganden für etwa 2 bis 30 Minuten bei einem pH von etwa 1 bis etwa 4 auf 25 bis 100ºC erhitzt wird.
Wenn die Komplexe gemäß Formel II aus Pertechnetat oder Perrhenat hergestellt werden, kann die Quelle für die Aniongruppe Wasser oder jede Verbindung oder jedes Salz sein, das unter Freisetzung eines geeigneten Anions dissoziiert. Beispielhafte Verbindungen umfassen NaCl, NaBr und thiolhaltige Verbindungen.
Die Bildung der Komplexe der Formel II erfolgt, wenn die Mischung aus Metallion, Anionenquelle, Borsäure-Derivat und Dioxim für etwa 2 bis etwa 30 Minuten auf etwa 25ºC bis etwa 100ºC erhitzt wird. Die bevorzugte Temperatur beträgt etwa 50ºC bis etwa 100ºC, und die bevorzugte Erhitzungszeit beträgt etwa 2 Minuten bis etwa 15 Minuten. Der optimale pH für die obige Reaktion beträgt etwa 1 bis etwa 4.
Wenn die Quelle für Technetium oder Rhenium Pertechnetat oder Perrhenat oder ein anderes Ausgangsmaterial in einer Oxidationsstufe von höher als +3 ist, sollte die Reaktionsmischung auch ein Reduktionsmittel enthalten. Zinnionen sind das bevorzugte Reduktionsmittel und können in Form eines Zinnsalzes wie einem Zinnhalogenid (z.B. Zinnchlorid oder Zinnfluorid) eingesetzt werden. Das Reduktionsmittel sollte in einer Konzentration von etwa 1,5 Mikromolar bis 6,6 Millimolar vorhanden sein.
Verschiedene Komplexbildner (im Stand der Technik auch als Chelatbildner bezeichnet) können als Teil der Komplexierungsreaktion eingesetzt werden. Der Komplexbildner sollte natürlich pharmazeutisch verträglich sein. Beispielhafte Komplexbildner sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethlylenglykolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Zitronensäure, Weinsäure, Malonsäure etc.
Die Mischung der Komplexierungsreaktion kann auch einen Beschleuniger (Katalysator) enthalten, der zur Verbesserung der radiochemischen Reinheit (d.h. der Prozente der Radioaktivität, die in der gewünschten chemischen Form vorliegen) des Produkts dient. Beispielhafte Beschleuniger sind die α-Hydroxycarbonsäuren, wie Zitronensäure, Weinsäure und Malonsäure. Es wurde gefunden, daß eine Kombination aus DTPA und Zitronensäure bevorzugt ist.
Da es notwendig ist, die Komplexe der Erfindung am oder nahe des Verwendungsortes herzustellen, ist ein Kit, das alle Komponenten, bis auf die Quelle des Technetiums oder Rheniums, zur Herstellung der Borsäure-Addukte der Metalldioxim-Komplexe gemäß Formel I enthält, integraler Teil dieser Erfindung. Solch ein Kit enthält eine Quelle für ein Anion, ein Borsäure-Derivat gemäß Formel VIII
(oder Verbindungen, die in situ zu einem solchen Derivat reagieren können), oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, ein Dioxim gemäß der Formel HO-N=CR&sub1;-CR&sub2;=N-OH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und ein Reduktionsmittel. Der Kit kann wahlweise einen oder mehrere Komplexbildner, Beschleuniger, Solubilisierungsmittel und/oder andere Komponenten enthalten, die zur Gewährleistung einer hohen radiochemischen Reinheit erforderlich sind.
Ein Multigefäßkit kann ebenfalls zur Herstellung der Komplexde dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Gefäß des Kits eine Anionenquelle, einen Dioxim-Liganden gemäß Formel HO-N=CR&sub1;-CR&sub2;=N-OH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, ein Reduktionsmittel und gegebenenfalls Komplexbildner enthalten. Es wird eine Quelle für Technetium oder Rhenium zu dem Kit gegeben, welcher dann erhitzt wird, um das intermediäre MX(dioxim)&sub3; der Formel XMXM[R&sub1;C(NOH)-CR&sub2;(NOH)]&sub3; (M = Tc, Re) zu bilden. Das intermediäre Produkt aus diesem Kit wird dann zu einem zweiten Gefäß gegeben, das ein Borsäure-Derivat gemäß Formel VIII (oder eine Verbindung, die in situ zu einem solchen Derivat reagieren kann) enthält.
Die Kits dieser Erfindung können in wäßrigen Lösungen formuliert werden. Zur Verbesserung der Stabilität des Kits und um die radiochemische Reinheit der markierten Produkte zu optimieren, sollte der pH des Kits unter Verwendung einer pharmazeutisch verträglichen Säure oder Base (z.B. Salzsäure oder Natriumhydroxid) so eingestellt werden, daß er in den Bereich von etwa 1,0 bis 4,0 fällt. Vorzugsweise beträgt der pH des Kits etwa 2,0. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß der Kit in lyophilisierter Form vorliegt. Während "nasse" Kits (d.h. Kits, welche alle Komponenten in Lösung enthalten) verwendet werden können, sind sie nicht so effektiv wie die entsprechenden lyophilisierten Kits.
Die Verbindungen der Formel VIII, in der R&sub3; NCS ist, sind neu und bilden einen integralen Teil der Erfindung. Diese Borsäuren der Formel VIII oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, sind bifunktionelle Reagenzien, die mit den obigen Kitbestandteilen reagieren, um die Komplexe der Formel II zu bilden. Die reaktive Gruppe R&sub3; reagiert mit Proteinen oder mit anderen aminhaltigen Verbindungen, entweder vor oder nach Reaktion mit dem Metall M.
Beim Arbeiten mit dem &sup9;&sup9;Technetiumisotop wurde die Struktur eines Komplexes der Erfindung untersucht, und es wird angenommen, daß sie wie folgt aussieht:
Das Kuppeln des Metallkomplexes der Formel II an Proteine, wie monoclonale und polyclonale Antikörper, Polypeptide, wie Albumin, Insulin, Hemoglobin und Fibrinogen, Hormone, wie Angiotensin, Adrenalin, und aminhaltige Steorid-Derivate, Aminosäuren, wie Glycin und Cystein, Wirkstoffe, wie Penicillamin, und Alkaloide oder andere aminhaltige Verbindungen, wie Enzyme und ganze Zellen, findet durch Reaktion der Gruppe R&sub3; des Bor-Derivats mit primären oder sekundären Aminen des Proteins oder der anderen aminhaltigen Verbindungen statt. Wenn R&sub3; eine Isothiocyanatogruppe (-N=C=S) ist, ist die resultierende Thioharnstoffbindung chemisch sehr stabil. Es wird somit eine stabile kovalente Bindung gebildet, die den Metalldioxim-Komplex der Formel II an das Protein oder die andere aminhaltige Substanz bindet. Ein Beispiel dieser Reaktion ist unten gezeigt.
DMG = Dimethylglyoxim
Es ist auch möglich, Komplexe zu bilden, in denen die Gruppe E des Borrestes anfänglich keine reaktive Funktionalität aufweist. Dieser Komplex kann dann nach der Bildung des Komplexkerns in eine andere reaktivere Verbindung II überführt werden, die eine reaktive Gruppe E enthält. Zum Beispiel können Verbindungen, die einen Borrest wie B-Ph-CH&sub2;OH enthalten, nach der Bildung in aktive Verbindungen, z.B. B-Ph-CH&sub2;OTs (Ts = Tosyl), überführt werden.
Die aktivierte Verbindung kann dann zur Reaktion mit Proteinen verwendet werden.
Durch diese Erfindung werden radioaktiv markierte Antikörper und Antikörper-Fragmente vorgestellt, die entweder zur Diagnose oder bei der Radiotherapie brauchbar sind. Antikörper-Fragmente umfassen Fab, F(ab')&sub2; und Fab'. Diese werden von S.W. Burchiel et al., "Immunopharmokinetics of Radiolabeled Antibodies and their Fragments", Kapitel 13 in "Tumor Imaging, The Radiochemical Detection of Cancer", S.W. Burchiel and B.A. Rhodes (Herausgeber), Masson Publishing Inc. (1982) beschrieben. Die Anwendungen dieser radioaktiv markierten Antikörper und Antikörper-Fragmente umfassen die Detektion von Blutgerinseln und die Diagnose und Behandlung von Krebs. Substrate, wie Wirkstoffe, Proteine und Hormone, die unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens radioaktiv markiert wurden, können verwendet werden, um diagnostische anatomische Bilder des Organsystems, Bilder der Organfunktion, Sonden für biochemische Prozesse und die Diagnose und Behandlung von Krebs zur Verfügung zu stellen.
Wie im Beispielteil genauer beschrieben wird, wurde gezeigt, daß bestimmte Antikörper und Antikörper-Fragmente, die auf die oben beschriebene Weise markiert wurden, ihre biologische Aktivität beibehalten und damit in der Lage sind, sich vorzugsweise in Tumoren zu konzentrieren, die Antigene exprimieren, die durch einen spezifischen Antikörper erkannt werden. Aufgrund dieser bevorzugten Konzentration der radioaktiv markierten Materialien in Tumoren, sind die auf die in der Erfindung beschriebenen Weise markierten Antikörper und Antikörper-Fragmente zur Diagnose und Therapie von Krebs geeignet. Das Antikörper-Borsäure Metalldioximkomplex-Konjugat reagiert relativ schlecht mit Gewebe, das nicht mit den Tumoren oder Krebs assoziiert ist.
Entweder die Komplexe der Erfindung oder die Proteine oder Antikörper, die mit den Komplexen der Erfindung markiert sind, können einem Wirt durch intravenöse Bolusinjektion oder intraperitoneal verabreicht werden. Die Größe des Wirts und das verwendete bildgebende System bestimmen die Menge der zur Herstellung diagnostischer Bilder notwendigen Radioaktivitätsmenge. Bei einem menschlichen Wirt liegt die injizierte Radioaktivitätsmenge gewöhnlich im Bereich von 5 bis 20 Millicurie an Technetium-99m.
Das obige Verfahren zur Verabreichung ist auch anwendbar, wenn die erfindungsgemäßen Komplexe selbst oder an Antikörper oder Proteine gekoppelt bei der Radiotherapie verwendet werden. Die Radioaktivitätsmenge zur Radiotherapie eines menschlichen Wirts liegt im Bereich von etwa 10 bis 30 Millicurie.
Die folgenden Beispiele sind spezifische Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiel 1

m-Isothiocyanatophenylborsäure

Eine gekühlte (0ºC) Lösung von 3-Aminophenylborsäure (2,24 g, 0,013 mol) in Aceton (5 ml) wird tropfenweise über einen Zeitraum von 0,5 Stunden mit einer Lösung von Thiophosgen (1 ml, 0,013 mol) in Chloroform (5 ml) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde für 1 Stunde bei 0ºC und für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer abgedampt und der Rückstand mit Ether versetzt und filtriert, um das Triethylamin-Hydrochlorid zu entfernen. Die Etherlösung wurde zu einem braunen Öl eingedampft. Dieses wurde an Kieselgel (30 g) unter Verwendung von Aceton-Chloroform (7:3) als Elutionsmittel chromatographiert. Die das Produkt enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und zu einem leicht braunen Feststoff eingedampft. Der Feststoff wurde aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert. Smp. 166-67ºC, Analyse ber. für
C&sub7;H&sub6;NSBO&sub2;.0,25 H&sub2;O: C, 46,00; H, 3,59; N, 7,67; S, 17,54. Gefunden: C, 46,17; H, 3,48; N, 7,59; S, 17,71.

Beispiel 2

3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure

Beispiel 2A

m-Tolylborsäure

Magnesium (4,0 g, 0,17 mol) in Ether (50 ml) wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 3 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre tropfenweise mit einer Lösung von m-Bromtoluol (25 g, 0,146 mol) in Ether (200 ml) versetzt. Nach der Zugabe wurde die Reaktionsmischung für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Grignard-Reagens wurde bei -78ºC über einen Zeitraum vom 4 Stunden langsam zu einer Lösung von Trimethylborat (15,6 g, 17 ml, 0,15 mol) in Ether (500 ml) gegeben und für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 30% Schwefelsäure (50 ml) hydrolysiert. Die Etherschicht wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen (3 x 250 ml) und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer entfernt und der erhaltene Rückstand aus Wasser umkristallisiert. Smp. 160-161 ºC.

Beispiel 2B

m-Carboxyphenylborsäure

Zu einer Lösung von m-Tolylborsäure (8,0 g, 0,059 mol) in 10% Natriumhydroxid (250 ml) wurde Kaliumpermanganat (20 g) in kleinen Portionen gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 48 Stunden gerührt. Das ausgefallene Magnesiumdioxid wurde abfiltriert und das Filtrat mit 20% Schwefelsäure angesäuert und gekühlt. Der sich bildende weiße Niederschlag wurde abfiltriert und aus Wasser umkristallisiert. Smp. 250- 52ºC.

Beispiel 2C

3-Nitro-5-carboxyphenylborsäure

Eine gerührte Aufschlämmung von m-Carboxyphenylborsäure (5 g, 0,03 mol) in konzentrierter Schwefelsäure (15 ml) wurde mit rauchender Salpetersgure (15 ml, d = 1,54) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 45 Minuten gerührt und auf Eis (150 g) gegossen. Die gebildete Nitrosäure wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Smp 235-37ºC.

Beispiel 2D

3-Amino-5-carboxyphenylborsäure

Eine Lösung von 3-Nitro-5-carboxyphenylborsäure (3,3 g, 0,016 mol) in absolutem Ethanol (75 ml) wurde in Gegenwart von Raney-Nickel (1 g) bei 50 lbs pro inch für 4 Stunden in einem Parr-Schüttler hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel an einem Rotationsverdampfer entfernt. Der erhaltene Feststoff wurde aus Wasser umkristallisiert. Smp. 210-12ºC.

Beispiel 2E

3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure

Eine Lösung von 3-Amino-5-carboxyphenylborsäure (150 mg, 0,08 mmol) in 3 N HCl (3 ml) wurde tropfenweise mit Thiophosgen (92 mg, 0,08 mmol) in 3 N HCl (3 ml) versetzt und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur gerührt. Ein weißer Feststoff bildete sich nach 20 Minuten. Dieser wurde aus Hexan/Ethylacetat umkristallisiert. Smp. > 350ºC. Analyse ber. für C&sub8;H&sub6;NO&sub4;BS 3 H&sub2;O. C, 42,06; H, 2,91; N, 6,13. Gefunden: C, 42,51; H, 2,87; N, 5,68.

Beispiel 3

99mTc(chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor

Eine gefriergetrocknete Mischung von 2,0 mg Dimethylglyoxim, 100 mg Natriumchlorid, 18 mg Zitronensäure, 1 mg Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 50 mg γ-Cyclodextrin und 50 µg Zinnchlorid in einem silikonisiertem 5 ml Serumgefäß wurde mit 3,0 mg 3-Isothiocyanatophenylborsäure in 50 µl Methanol versetzt.
Natriumpertechnetat in physiologischer Salzlösung (1,0 ml) wurde zu dem Gefäß gegeben, welches dann für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt wurde. Die Ausbeute an Tc (Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3- isothiocyanatophenyl)bor, bestimmt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), betrug 35 bis 40%. Proben dieses Komplexes coeluierten von Lichrosorb HPLC-Säulen mit authentischen Proben von &sup9;&sup9;Tc (Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor, das wie unten beschrieben hergestellt wurde.

Beispiel 3A

&sup9;&sup9;Tc(chlor) (dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor

Eine Lösung enthaltend &sup9;&sup9;Tc(Dimethylglyoxim)&sub3; (µ-OH)(SnCl&sub3;) 3H&sub2;O (97 mg, 0,138 mmol), 3-Isothiocyanatophenylborsäure (32 mg, 0,18 mmol), Ethanol (10 ml) und 1M HCl (2ml) wurde in einem kleinen Becherglas für 1 Stunde an der Luft vorsichtig gekocht. Der resultierende rot-orange Niederschlag (60% Ausbeute) wurde aus einer warmen CH&sub2;Cl&sub2;/EtOH-Mischung (1:5) umkristallisiert. Kristalle mit ausreichender Qualität für die Röntgenstrukturanalyse wurden innerhalb eines Tages gebildet. Analyse (ber.) für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub4;N&sub7;O&sub6;BClSTc: C, 36,36 (36,59); H 3,80 (3,89); N, 15,88 (15,72). Das Molekülion MH&spplus; wurde bei der Massenspektroskopie bei m/z = 624 beobachtet. Die Retentionszeit auf einer Licrosorb HPLC-Säule betrug 8,4 Minuten (75/25 ACN/0,1M NH&sub4;OAc pH 4,6, 1,5 ml/min.). Eine Röntgenstrukturanalyse dieses Komplexes bestätigte die Struktur.

Beispiel 4

99mTc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor

Dem Verfahren von Beispiel 3 folgend, wobei jedoch 3-Isothiocyanatophenylborsäure durch 3,0 mg 3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure ersetzt wurden, wurden 35 bis 40% des Titelkomplexes erhalten. Proben dieses Komplexes coeluierten von einer Nucleosil HPLC-Säule mit authentischen Proben von &sup9;&sup9;Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor, das wie unten in 4A beschrieben hergestellt wurde.

Beispiel 4A

&sup9;&sup9;Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor

Der Komplex Tc(chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;[TcCl(DMG&sub3;)] (23,8 mg, 0,049 mmol) in 3 ml CH&sub3;CN wurde mit drei Tropfen 1M HCl und 11,5 mg (0,051 mmol) 3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren für 15 Minuten auf 50ºC erhitzt. Sie wurde dann mit einem gleichen Volumen 1M HCl behandelt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Der resultierende rot-orange Niederschlag wurde aus CH&sub3;CN/1M HCl umkristallisiert, um analytisch reine Nadeln zu ergeben (75,5% Ausbeute), isoliert als das 1,5 H&sub2;O-Hydrat. Analyse (ber.) für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub4;N&sub7;BClO&sub8;STc 1,5 H&sub2;O: C, 34,76 (34,57); H, 3,90 (3,92); N, 13,90 (14,11). Retentionszeit = 2,85 Minuten, Nucleosil HPLC- Säule (65/35 ACN/0,1M Zitronensäure, 1,5 ml/min).

Beispiel 5

99mTc(chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor

Eine gefriergetrocknete Mischung aus 1,5 mg 1,2-Cyclohexandiondioxim, 100 mg Natriumchlorid, 9 mg Zitronensäure, 2 mg Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 50 mg γ-Cyclodextrin und 50 µg Zinnchlorid in einem silikonisierten 5 ml Serumgefäß wurde mit 2,4 mg 3-Isothiocyanatophenylborsäure in 50 µl Ethanol versetzt.
Natriumpertechnetat in physiologischer Salzlösung (1,0 ml) wurde zu dem Gefäß gegeben, welches dann für 15 Minuten auf 100 ºC erhitzt wurde. Die durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmte Ausbeute an Tc (Chlor) (1,2-Cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor betrug 33%. Proben dieses Komplexes coeluieren von Licrosorb HPLC-Säulen mit authentischen Proben eines &sup9;&sup9;Tc-Standards, hergestellt wie in 5A unten beschrieben.

Beispiel 5A

&sup9;&sup9;Tc(chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor

Eine Lösung enthaltend &sup9;&sup9;Tc(1,2-Cyclohexandiondioxim)&sub3;(µ- OH)SnCl&sub3; 3H&sub2;O (77 mg, 0,095 mmol), 3-Isothiocyantophenylborsäure (22 mg, 0,12 mmol), Ethanol (10 ml) und 1M HCl (2ml) wurde in einem Becherglas für 1 Stunde an der Luft gekocht. Während dieser Zeit reduzierte sich das Volumen der Lösung auf 2 ml und orange Kristalle des Produkts fielen aus (66% Ausbeute). Das Produkt wurde an einer Kieselgelsäule gereinigt, Elution mit 5% ACN/95% CH&sub2;Cl&sub2; ergab nach Abdampfen des Lösungsmittels ein analytisch reines Produkt. Analyse (ber.) für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub0;N&sub7;BClO&sub6;STc: C, 42,65 (42,78); H, 4,44 (4,31); N, 14,26 (13,87). Proben dieses Komplexes eluierten von Licrosorb HPLC-Säulen bei einer Retentionszeit von 8 Minuten (90/10 ACN/0,1M NH&sub4;OAc pH 4,6, 1,5 ml/min).

Beispiel 6

&sup9;&sup9;Tc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5- carboxyphenyl)bor

Dem Verfahren von Beispiel 5 folgend, wobei jedoch die 3- Isothiocyanatophenylborsäure durch 3 mg 3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure ersetzt wurde, wurden 35% des Titelkomplexes erhalten. Proben dieses Komplexes eluierten von Nucleosil HPLC- Säulen bei einer Retentionszeit, die mit der eines &sup9;&sup9;Tc-Standards des Titelkomplexes identisch war, der wie in Beispiel 11A beschrieben, hergestellt wurde.

Beispiel 7

99mTc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;

Dem Verfahren von Beispiel 3 folgend, wobei jedoch die Borsäure vollständig weggelassen und der Kit für 2,5 Minuten auf 100ºC erhitzt wurde, wurde der Komplex 99mTC(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3; in 76% Ausbeute hergestellt.

Beispiel 8

99mTc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor

99mTc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;, hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde mit 3,0 mg 3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure in 50 µl Ethanol versetzt. Die Mischung wurde für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt, was die Titelverbindung in 62% Ausbeute ergab. Proben dieses Komplexes koeluierten von Nucleosil HPLC-Säulen bei einer Retentionszeit, die mit der eines authentischen &sup9;&sup9;Tc-Standards des Komplexes identisch war, der wie in Beispiel 4A beschrieben hergestellt wurde.

Beispiel 9

99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;

Dem Verfahren von Beispiel 5 folgend, wobei jedoch die Borsäure vollständig weggelassen wurde, wurde 99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3; in 92% Ausbeute erhalten.

Beispiel 10

99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor

99mTc(Chlor)1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;, hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben, wurde mit 2,4 mg 3-Isothiocyanatophenylborsäure in 50 µl Ethanol versetzt. Die Mischung wurde für 15 Minuten auf 100ºC erhitzt. Die Ausbeute des auf diesem Wege hergestellten Titelkomplexes betrug 48,5%. Proben des Komplexes coeluierten von Licrosorb HPLC-Säulen bei einer Retentionszeit, die zu der eines authentischen &sup9;&sup9;Tc-Standards identisch war, der wie in Beispiel 5A beschrieben, hergestellt wurde.

Beispiel 11

99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor

Eine Probe von 99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3; wurde wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellt. Der Komplex wurde isoliert und die Kitbestandteile durch Reinigen an Hamilton PRP- 1-Harz wie im folgenden beschrieben entfernt. Die Kitbestandteile wurden in ein Nadelansatzstück aufgezogen, das das Harz enthielt, und dann mit 1 ml Salzlösung, 1 ml 25/75 EtOH/Salzlösung, 1 ml H&sub2;O und 1 ml EtOH gespült.
Ein 0,5 ml Anteil der Ethanolfraktion, der gereinigtes 99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3; enthielt, wurde in ein Gefäß gegeben, das 1,5 mg 3-Isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor und 50 µl 1N HCl enthielt. Der Kit wurde für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt. Das Verfahren ergab den Titelkomplex in 81,7% Ausbeute. Proben dieses Komplexes coeulierten von HPLC-Säulen bei der Retentionszeit eines authentischen &sup9;&sup9;Tc-Standards des Komplexes, der wie im folgenden Beispiel 11A beschrieben hergestellt wurde.

Beispiel 11A

&sup9;&sup9;Tc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor

4,0 mg &sup9;&sup9;Tc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;, gelöst in 3 ml ACN wurde mit 1,5 mg 3-Isothiocyanato-5-carboxyphenylborsäure und drei Tropfen 3M HCl versetzt. Die Lösung wurde vorsichtig für 20 Minuten erhitzt. Der Komplex &sup9;&sup9;Tc(Chlor)(1,2-cyclohexandion)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor wurde in quantitativer Ausbeute gebildet. Proben dieses Komplexes ergaben ein starkes Molekülionensignal MH&spplus; bei der Massenspektroskopie bei Beschuß mit schnellen Atomen (fast atom bombardment mass spectroscopy) und wiesen eine Retentionszeit von 8,0 Minuten an Nucleosil HPLC-Säulen auf (ACN/0,1M Zitronensäure 60/40, 1,5 ml/min).

Beispiel 12

Markieren von Glycin mit 99mTc(Chlor(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-BPITC

Eine Lösung von 99mTc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-BPITC), herstellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde durch Adsorption an Reverse-Phase-Harz (wie in Beispiel 11) gereinigt. Nach dem Waschen des Harzes mit 50% Ethanol/50% normaler Salzlösung, um Verunreinigungen und überschüssige Borsäure zu entfernen, wurde der gewünschte Komplex mit Ethanol von dem Harz eluiert. Ein 200 µl Anteil der Ethanol- Lösung wurde mit 200 µl Glycin gemischt (20 mg/ml in 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 9,0). Die Mischung wurde bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert. Die Analyse der Reaktion durch HPLC zeigte, daß das gesamte Ausgangsmaterial nach dieser Zeit verschwunden war. Die durch HPLC bestimmte Ausbeute an Tc markiertem Glycin (Tc-DMG-BPTIC-Glycin) betrug 88%.

Beispiel 13

Markieren von Polylysin mit 99mTc-DMG-BPITC

Eine Probe von Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-BPITC), hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben und gereinigt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Komplex wurde in 5 µl DMSO wieder gelöst und 10 µl dieser DMSO-Lösung zu 100 µl 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,0 gegeben, der 0,5 mg Polylysin enthielt (durchschnittliches Molekulargewicht = 102.000). Nach Inkubation bei 37ºC für 2 Stunden betrug die durch HPLC an einer Pinkerton ISRP-Säule ermittelte Ausbeute an Tc-markiertem Polylysin (Tc-DMG-BPITC-Polylysin) 36%.

Beispiel 14

Markieren von Maus-IgG mit 99mTc-DMG-BPITC

Eine Probe von Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-BPITC), hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben und gereinigt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Komplex wurde in 50 µl DMSO wieder gelöst und 10 µl dieser DSMO-Lösung zu 100 µl 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,5 gegeben, der 0,5 mg Maus-IgG enthielt. Nach Inkubation bei 37ºC für 2,5 Stunden betrug die durch HPLC an einer Pinkerton ISRP-Säule bestimmte Ausbeute an Tc-markiertem Maus IgG 34%.

Beispiel 15

Markieren des monoklonalen Antikörpers B72.3 mit 99mTc-DMG-BPITC

Eine Probe Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-BPITC), hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben und gereinigt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Komplex wurde in 50 µl DMSO wieder gelöst und 10 µl dieser DSMO-Lösung zu 100 µl 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,5 gegeben, der 1,0 mg Antikörper B72.3 enthielt. Der Antikörper wird von D. Colcher et al. Nucl. Med. Biol., Vol 14 (3), S. 251-262 (1987) beschrieben. Nach Inkubation bei 37ºC für 2,0 Stunden betrug die durch HPLC an einer ISRP-TSK-Säule ermittelte Ausbeute an Tc-markiertem B72.3 10%.

Beispiel 16

Markieren des monoklonalen Antikörpers B72.3 mit 99mTc-DMG-NCS-COOH

Eine Probe Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-carboxy-5-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-NCS-COOH), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und gereinigt wie in Beispiel 14 beschrieben, wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedamft. Der Komplex wurde in 100 µl 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,5 wieder gelöst, der 1,0 mg B72.3 enthielt. Nach Inkubation bei 37ºC für 2,0 Stunden betrug die durch HPLC an einer ISRP-TSK-Säule ermittelte Ausbeute an Tc-markiertem B72.3 34%.

Beispiel 17

Affinitätschromatographie des mit 99mTc-DMG-NCS-COOH markierten monoklonalen Antikörpers B72.3

Eine Probe von 99mTechnetium-markiertem B72.3, hergestellt wie in Beispiel 16 beschrieben, wurde von überschüssigem Markierungsreagens durch Passage durch eine ISRP- und TSK-Säule gereinigt, die in Serie verbunden waren. Ein Anteil des gereinigten Antikörpers (etwa 50 000 cpm/128 ng Protein) wurde auf eine TAG- 72-Affinitätssäule gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde mit PBS-Puffer gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein zu eluieren. Der aktive markierte Antikörper wurde dann mit 6M Guanidin von der Säule eluiert. Die Immunoreaktivität des Antikörpers, ausgedrückt in Prozent, ist als [(mit Guanidin eluierte Aktivität in cpm/von der Säule eluierte Gesamtaktivität in cpm)x100] definiert. Es wurde eine Immunoreaktivität von 72% beobachtet. Eine Probe von B72.3, die zum Vergleich durch Standardmethoden mit ¹²&sup5;Iod markiert worden war, wies eine unter Verwendung einer TAG-72-Affinitätssäule bestimmte Immunoreaktivität von 55-60% auf.

Beispiel 18

Bioverteilung von 99mTc-markiertem B72.3 in Tumor-tragenden Mäusen

Tumor-tragende Nacktmäuse (GW39 Tumorlinie) wurden mit 10-20 µCi Tc-markiertem B72.3 injiziert, der wie in Beispiel 16 hergestellt und wie in Beispiel 17 durch HPLC gereinigt wurde. Die Tiere wurden nach 2 oder 24 Stunden getötet (n = 5 Tiere für jeden Zeitpunkt), die interessierenden Organe herausgeschnitten und deren Radioaktivität gemessen. Zum Vergleich wurde ¹³¹Iodmarkierter B72.3 in einen Kontrollsatz Tumor-tragender Mäuse injiziert. Die Daten aus diesem Experiment (beigefügt als Tabelle 1) zeigen die spezifische Lokalisation sowohl der Iod- als auch der Tc-markierten B72.3 in den Tumoren.

Beispiel 19

Markieren des monoklonalen Antikörpers NP-4 mit 99mTc-DMG-NCS-COOH

Eine Probe Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-carboxy-5-isothiocyanantophenyl)bor (Tc-DMG-NCS-COOH), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und gereinigt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Komplex wurde in 100 µl 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,5 wieder gelöst, der 1,0 mg NP-4 (CMMI, Newark, New Jersey) enthielt. Nach Inkubation bei 37ºC für 2 Stunden betrug die durch HPLC an einer ISRP-TSK-Säule bestimmte Ausbeute 40%.

Beispiel 20

Affinitätschromatographie des mit 99mTc-DMG-NCS-COOH markierten NP-4-Antikörpers

Eine Probe von 99mTechnetium-markierten NP-4, hergestellt wie in Beispiel 19 beschrieben, wurde von überschüssigem Markierungsreagens durch Passage durch eine ISRP-TSK-HPLC-Säule gereinigt. Ein Anteil des gereinigten Antikörpers (etwa 50 000 cpm/128 ng Protein wurde auf eine Anti-CEA-Affinitätssäule gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde mit PBS- Puffer gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein zu eluieren. Der aktive markierte Antikörper wurde dann mit 6M Guanidin von der Säule eluiert. Die Immunoreaktivität des Antikörpers, ausgedrückt als Prozent, ist als [(mit Guanidin eluierte Aktivität in cpm/von der Säule eluierte Gesamtaktivität in cpm)x100] definiert. Es wurde eine Immunoreaktivität von 95,8% beobachtet.

Beispiel 21

Bioverteilung von 99mTc-markiertem NP-4 in Tumortragenden Mäusen

Tumor-tragende Nacktmäuse (GW39 Zumorlinie) wurden mit 50 µCi Tc-markiertem NP-4 injiziert, der wie in Beispiel 19 beschrieben hergestellt und wie in Beispiel 20 beschrieben gereinigt wurde. Die Tiere wurden nach 2 oder 24 Stunden getötet (n = 6 Tiere für jeden Zeitpunkt), die interessierenden Organe herausgeschnitten und deren Radioaktivität gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments (beigefügt als Tabelle 2) zeigen eine spezifische Lokalisation des 99m-Tc-markierten NP-4 in den Tumoren. Nach 24 Stunden wurde ein Durchschnitt von 16,56% der injizierten Dosis pro Gramm Tumor beobachtet.

Beispiel 22

Markieren des monoklonalen Antikörper F(ab')&sub2;-Fragments von NP-4 mit 99mTc-DMG-NCS-COOH

Eine Probe Tc(Chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-carboxy-5-isothiocyanatophenyl)bor (Tc-DMG-NCS-COOH), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und gereinigt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurde mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Komplex wurde in 100 µl 0,1M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,5 wieder gelöst, der 1,0 mg des F(ab')&sub2;-Fragments von NP-4 enthielt (CMMI, Newark, New Jersey). Nach Inkubation bei 37ºC für 2,0 Stunden betrug die durch HPLC an einer ISRP-TSK-Säule ermittelte Ausbeute an Tc-markiertem NP4-F(ab')&sub2; 15,2%

Beispiel 23

Affinitätschromatographie des 99mTc-DMG-NCS-COOH-markierten monoklonalen Antikörper F(ab')&sub2;-Fragments von NP-4

Eine Probe 99mTechnetium-markierten NP-4-F(ab')&sub2;, hergestellt wie in Beispiel 22 beschrieben, wurde von überschüssigem Markierungsreagens durch Passage durch eine ISRP-TSK-HPLC-Säule gereinigt. Ein Anteil des gereinigten Antikörpers (etwa 30 000 cpm/100 ng Protein) wurde auf eine Anti-CEA-Affinitätssäule gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wurde dann mit PBS-Puffer gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein zu eluieren. Das aktive markierte Antikörper-Fragment wurde dann mit 6M Guanidin von der Säule eluiert. Die Immunoreaktivität des Antikörpers, ausgedrückt als Prozent, ist als [(mit Guanidin eluierte Aktivität in cpm/von der Säule eluierte Gesamtaktivität in cpm)x100] definiert. Es wurde eine durchschnittliche Immunoreaktivität von 94% beobachtet.

Beispiel 24

Bioverteilung des 99mTc-markierten NP-4 F(AB')&sub2;-Fragments in Tumor-tragenden Mäusen

Tumor-tragende Nacktmäuse (GW39 Tumorlinie) wurden mit 20-30 µCi des Tc-markierten F(ab')&sub2;-Fragments von NP-4 injiziert, das wie in Beispiel 22 beschrieben hergestellt und wie in Beispiel 23 beschrieben durch HPLC gereinigt wurde. Die Tiere wurden nach 2 oder 24 Stunden (n = 6 Tiere pro Zeitpunkt) getötet, die interessierenden Organe herausgeschnitten und deren Radioaktivität gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments (beigefügt als Tabelle 3) zeigen eine spezifische Lokalisation des 99mTc-markierten NP-4 F(ab')&sub2;-Fragements in den Tumoren. Nach 24 Stunden wurde ein Mittelwert von 10,5% der injizierten Dosis pro Gramm Tumor beobachtet.

Beispiel 25

Markieren des monoklonalen Antikörpers B72.3 mit Tc(Chlor)(1,2cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyphenyl)bor

Eine Probe 99mTc(Chlor)(1,2-cyclohexandiondioxim)&sub3;(3-isothiocyanato-5-carboxyxphenyl)bor wurde wie in Beispiel 12 beschrieben hergestellt, mit normaler Salzlösung auf 2 ml verdünnt, wie in Beispiel 12 beschrieben gereinigt und mit einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Komplex wurde in 100 µl 0,1M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH von 9,5 wieder gelöst, der 1,0 mg des monoklonalen Antikörpers B72.3 enthielt. Nach Inkubation bei 37ºC für 2 Stunden betrug die durch HPLC an einer ISRP- TSK-Säule ermittelte Ausbeute an 99mTc-markiertem B72.3 7,4%. Tabelle 1 Vergleich der Bioverteilung von 99mTc- und ¹³¹I-markiertem B72.3 in Tumor-tragenden (GW39) Nacktmäusen. Tabelle 2 Bioverteilung von ganzen 99mTc-NP-4-Antikörpern in Tumor-tragenden (GW39) Nacktmäusen Tabelle 3 Bioverteilung von 99mTc-NP-4 F(ab')&sub2; in Tumor-tragenden (GW39) Nacktmäusen

Claims

1. Metallkomplexe von Borsäure-Addukten an Dioximliganden, geeignet als Protein- und Aminmarkierungsmittel, mit der Formel

II XM[R&sub1;C(NOH)-CR&sub2;(NOH)&sub3;B- (A&sub1;)pE

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, in der:

M ein Isotop des Technetiums oder Rheniums ist;

X ein Anion und R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander H, Halogen, Alkyl, Aryl oder ein 5- oder 6-gliedriger N-, S- oder O-haltiger Heterozyklus sind, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen -(CR&sub8;R&sub9;)n- sind, wobei n = 3, 4, 5 oder 6 und R&sub8; und R&sub9; jeweils unabhängig voneinander H oder Alkyl sind;

B Bor ist; (A&sub1;) ein chemischer Rest ist, der die durch "E" repräsentierte Gruppe vom Rest des Komplexes II distanziert oder auf andere Weise isoliert, p 0 oder eine ganze Zahl bis zu 100, vorzugsweise 1 bis 20 ist; und

E eine Gruppe der Formel

ist, in der R&sub3; eine mit Aminen und Proteinen reaktionsfähige Funktion ausgewählt unter -NCS, -NCO, -O-Tosyl, -O-Mesityl oder derivatisierten Acylhalogeniden, aktivierten Estern und N-Hydroxysuccinimid ist; und R&sub4; H oder eine die Löslichkeit in Wasser erhöhende Funktion ausgewählt unter -OH, -COOH, -SO&sub3;H, Alkylsulfonaten, -SO&sub2;NH&sub2;, -Alk-COOH, -Alk-OH ist.

2. Komplex gemäß Anspruch 1, bei dem A&sub1; unter Alkylen, Alkenylen, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Oxaalkylen, Hydroxyalkylen, Carboxyalkylen, Alkylenamido, Alkylensulfonato, Arylen, Arylalkylen, Heterocyclo, -CH&sub2;-, -CHR&sub6;-, -CR&sub6;R&sub1;&sub0;-, -CH=CH-, -CH=CR&sub1;&sub1;-, -CR&sub6; =CR&sub1;&sub2;-, -C C-; -O-, -S-, -CO-, -HC=N-, -CR&sub6;=N- oder -NR&sub6;- ausgewählt ist, wobei R&sub6;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub2; unabhängig voneinander unter Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Aryl, 5- oder 6-gliedrigen N-haltigen heterocyclischen Resten, Halogen, -OH oder Hydroxyalkyl ausgewählt sind.

3. Komplex gemäß Anspruch 1, bei dem der borhaltige Rest die Formel VI aufweist

in der p = 0 oder 1 ist.

4. Komplex gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem X Cl&supmin; oder OH&supmin; und der Dioximteil Dimethyl-glyoxim oder ein Dioxim von Ethandion, 1,2-Cyclopentandion oder 1,2-Cyclohexandion ist.

5. Komplex gemäß Anspruch 1, nämlich

Tc- oder Re-(chlor)(1,2-cyclohexandion)&sub3;(3-carboxy-5- isothiocyanatophenylbor);

Tc- oder Re- (chlor)(1,2-cyclohexandion)&sub3;(3-isothiocyanatophenylbor);

Tc- oder Re-(chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-carboxy-5-isothiocyanatophenylbor);

Tc- oder Re-(chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(3-isothiocyanatophenylbor);

Tc- oder Re-(chlor)(dimethylglyoxim)&sub3;(4-isothiocyanatophenylbor).

6. Verfahren zur Herstellung von Komplexen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, umfassend:

a) das Kombinieren einer Tc- oder Re-Quelle, einer Quelle für ein Anion, einer Borsäure gemäß Formel VII (HO)&sub2;B(A&sub1;)p-E, in der A&sub1;, p und E wie in Anspruch 1 definiert sind, und eines Dioxims gemäß der Formel HO-N=CR&sub1;-CR&sub2;=N-OH, in R&sub1; und R&sub2; wie in Anspruch 1 definiert sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon; oder

b) das Reagieren der vorgenannten Borsäure VII mit einer Dioximverbindung XM[R&sub1;C(NOH)-CR&sub2;(NOH)]&sub3;, in der X, R&sub1;, R&sub2; und M wie in Anspruch 1 definiert sind.

7. Borsäureverbindung gemäß Formel VIII

in der A&sub1;, p, R&sub3; und R&sub4; wie in den vorherigen Ansprüchen definiert sind.

8. Borsäureverbindung gemäß Anspruch 7, nämlich 3-Isothiocyanatophenylborsäure, 4-Isothiocyanatophenylborsäure oder 3- Carboxy-5-isothiocyanatophenylborsäure.

9. Kit zur Markierung mit 99mTc oder Isotopen Re enthaltend

(i) eine Anionenquelle, z.B. Cl&supmin;;

(ii) eine Borsäureverbindung gemäß Formel VIII

in der A&sub1; unter Alkylen, Alkenylen, Cycloalkylen, Cycloalkenylen, Oxaalkylen, Hydroxyalkylen, Carboxyalkylen, Alkylenamido, Alkylensulfonato, Arylen, Arylalkylen, Heterocyclo, -CH&sub2;-, -CHR&sub6;-, -CR&sub6;R&sub1;&sub0;-, -CH=CH-, -CH=CR&sub1;&sub1;-, -CR&sub6;=CR&sub1;&sub2;-, C C-; -O-, -S-, -CO-, -HC=N-, -CR&sub6;=N- oder -NR&sub6;- ausgewählt ist, wobei R&sub6;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub2; unabhängig voneinander unter Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Aryl, 5- oder 6-gliedrigen N-haltigen heterocyclischen Resten, Halogen, -OH oder Hydroxyalkyl ausgewählt ist;

p 0 bis 100 ist, R&sub3; eine funktionelle Gruppe ist, die unter NCS, -NCO, -O-Tosyl, -O-Mesityl oder derivatisierten Acylhalogeniden, aktivierten Estern oder N-Hydroxysuccinimid ausgewählt ist; und R&sub4; H oder eine die Löslichkeit in Wasser erhöhende Funktion ausgewählt unter -OH, -COOH, -SO&sub3;H, Alkylsulfonaten,SO&sub2;NH&sub2;, -Alk-COOH, -Alk- OH ist;

(iii) ein vic Dioxim HO-N=CR&sub1;-CR&sub2;=N-OH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, bei dem R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander H, Halogen, Alkyl, Aryl oder ein 5- oder 6-gliedriger N-, Soder O-haltiger Heterocyklus sind, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen (CR&sub8;R&sub9;)n- sind, wobei n = 3, 4, 5 oder 6 und R&sub8; und R&sub9; jeweils unabhängig voneinander H oder Alkyl sind; und

(iv) gegebenenfalls ein Reduktionsmittel.

10. Kit gemäß Anspruch 7, in dem das Dioxim 1,2-Cyclohexandiondioxim oder 2,3-Butandion-dioxim; und die Borsäure 3-Carboxy-5-isothiocyanatophenylborsäure oder 3-Isothiocyanatophenylborsäure ist.

11. Konjugat, gebildet durch die Reaktion eines Metall/Dioxim/Borkomplexes gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 und aminhaltigen Verbindungen, bei dem die aminhaltigen Verbindungen unter Proteinen, z.B. Fibrin, Fibrinogen und Lipoprotein mit geringer Dichte, Polypeptiden, Hormomen, aminhaltigen Steroiden, Aminosäuren oder aminhaltigen Wirkstoffen und Verbindungen ausgewählt ist.

12. Konjugat gemäß Anspruch 11, bei dem die Polypeptide Antikörper, z.B. monoklonale, oder Antikörperfragmente, z.B. Fab, sind.

13. Antikörper-Metall/Dioxim/Bor-Komplex-Konjugat gemäß Anspruch 12, das für eine Krebszielstelle immunoreaktiv und immunospezifisch ist.

14. Zusammensetzung zur Diagnose oder pharmazeutischen Behandlung von Krebs, enthaltend einen Metall/Dioxim/Bor-Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.