DE3882105T2 - Mehrzahnige Chelatbildner, basierend auf der 8-Hydroxychinolin-Einheit. - Google Patents

Mehrzahnige Chelatbildner, basierend auf der 8-Hydroxychinolin-Einheit.

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DE3882105T2 DE88114864T DE3882105T DE3882105T2 DE 3882105 T2 DE3882105 T2 DE 3882105T2 DE 88114864 T DE88114864 T DE 88114864T DE 3882105 T DE3882105 T DE 3882105T DE 3882105 T2 DE3882105 T2 DE 3882105T2
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Description

    Hintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verbindungen, die als Liganden bezeichnet werden und die sich in sehr stabiler Weise an Metalle binden. Speziell betrifft sie Ligänden, die sich mit ausreichender Stabilität an Metalle binden, so daß die erhaltenen Ligand-Metall-Komplexe in vivo intakt bleiben können. Derartige Komplexe finden eine Vielzahl von Anwendungen in der Medizin, wobei von besonderem Interesse für die Erfindung ihre Verwendung für radiopharmazeutische Anwendungen ist, wenn das Metallatom ein Strahlung aussendendes oder absorbierendes Isotop ist. Gemäß bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung bifunktionelle Ligandenmoleküle, die in der Lage sind, Metalle an Substrate, wie Antikörper und andere Proteine zu binden, aufgrund einer spezifischen, mit dem Substrat reaktionsfähigen Gruppe, die einen Phenylring besitzt, der meta- oder para-substituiert ist mit einer mit dem Substrat reaktionsfähigen Gruppe. Antikörper-Metallionen-Konjugate können hergestellt werden zur Verwendung bei diagnostischen in vivo-Abbildungsverfahren sowie für therapeutische Verfahren, wo die Metallionen cytotoxische Strahlung aussenden.
  • Viele Faktoren beeinflussen die Stabilität von Ligand- Metall-Komplexen einschließlich sowohl Charakteristika, die dem Metall selbst innewohnen, als auch Charakteristika, die mit der Molekularstruktur des Ligandenmoleküls zusammenhängen. Die Eigenschaften von Metallatomen sind, während sie in einem weiten Bereich von Metall zu Metall variieren, nicht veränderbar durch vorbestimmte Manipulationen, die die Stabilität des Komplexes erhöhen sollen, mit dem Ergebnis, daß die Ligandenstruktur den Brennpunkt der Bemühungen nach dem Stand der Technik darstellt, um die Stabilität derartiger Komplexe zu maximieren. Ligandenmoleküle, die bekannt sind und für die vorliegende Erfindung relevant, sind typischerweise organische Moleküle mit verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht (100 bis 2000 Dalton), die entweder natürlich vorkommende Verbindungen oder synthetische Materialien für vorbestimmte Merkmale sein können.
  • Bestimmte Merkmals- bzw. Designkriterien zur Herstellung von geeigneten synthetischen Liganden sind bekannt. Die Art der chemischen Bindung, die gebildet wird zwischen einem Liganden und einem Metall, kann so gesehen werden, daß sie ein (Donator) Elektronenpaar in dem Ligandenmolekül besitzt oder als Molekularorbitalbezeichnung, als ein Molekularorbital, das gebildet wird durch Kombination eines aufgefüllten Orbitals auf dem Liganden mit einem leeren Orbital an dem Metallatom. Derartige Atome in dem Ligandenmolekül, die direkt an der Bildung einer chemischen Verbindung mit dem Metallatom beteiligt sind, sind solche, die als Donoratome bezeichnet werden und diese umfassen allgemein Elemente der Gruppen V und VI des Periodensystems, wobei Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und Arsen die am häufigsten angewandten sind.
  • Ein wichtiges Kriterium zur Herstellung der synthetischen Ligandenmoleküle beruht auf der Feststellung, daß die Stabilität des Metallkomplexes, der mit einem Liganden gebildet worden ist, der zwei Donoratome im gleichen Molekül enthält, im allgemeinen größer ist als diejenige eines entsprechenden Komplexes, der mit zwei getrennten Ligandenmolekülen gebildet worden ist, von denen jedes nur ein einziges Donoratom enthält, obwohl die Donoratome in beiden Fällen die gleichen sind. Ein zweites wichtiges Kriterium beruht auf der Begrenzung, daß die Stereochemie des Ligandenmoleküls so sein muß, daß sie es ermöglicht, daß beide Donoratome an das gleiche Metallatom gebunden werden, ohne daß es zu schweren sterischen Hinderungen im Aufbau des Ligandenmoleküls kommt.
  • Ligandenmoleküle, die zwei oder mehr Donoratome enthalten, die in der Lage sind, mit einem einzigen Metallatom Bindungen einzugehen, werden als Chelatierungsmittel oder Chelatoren bezeichnet und die entsprechenden Metallkomplexe heißen Chelate. Das zugrundeliegende thermodynamische Phänomen, das für die erhöhte Stabilität verantwortlich ist, die erzielt wird, wenn zwei oder mehr Donoratome in dem gleichen Ligandenmolekül vorhanden sind, wird als Chelateffekt bezeichnet, wie es im Detail beschrieben ist in F.A. Cotton und G. Wilkinson, Advanced Inorganic Chemistry, 4. Aufl., S. 71-73, veröffentlicht 1980. Die Anzahl von Donoratomen, die in einem bestimmten Chelator vorhanden ist, wird als Zahnigkeit dieses Chelators bezeichnet. Liganden, die zwei Donorstellen besitzen, werden zweizahnig genannt, solche mit drei Donorstellen, dreizahnig usw. Obwohl das obige Beispiel den Fall eines zweizahnigen Liganden verwendet, um den Chelateffekt zu erläutern, tritt der Effekt auch bei Liganden mit höherer Zahnigkeit auf bis zu dem Punkt, an dem die Zahnigkeit des Chelators die maximale Koordinationszahl erreicht, die von dem speziellen Metallatom erreichbar ist.
  • Die maximale Koordinationszahl eines Metallatoms ist eine dem Atom innewohnende Eigenschaft, die zusammenhängt mit der Anzahl von freien Orbitalen, die das Atom besitzt,und daher der Anzahl von chemischen Bindungen, die es bilden kann. Für ein bestimmtes Metallatom in einer bestimmten Oxidationsstufe ist die maximale Koordinationszahl weitgehend unveränderlich und kann in der Regel nicht verändert werden durch Veränderung der Art der Liganden. Wenn alle verfügbaren leeren Orbitale ausgenutzt wurden zur Bildung von Bindungen mit Donoratomen in den oder dem Liganden, wird das Metallatom als koordinativ gesättigt bezeichnet. Im allgemeinen ist die maximale Stabilität eines Metallkomplexes dann erreicht, wenn der Komplex gebildet worden ist unter Verwendung eines mehrzahnigen Chelators, dessen Zahnigkeit ausreicht, um das Metallatom koordinativ abzusättigen. Es ist daher ein Ziel der Erfindung, mehrzahnige Chelatoren zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, koordinativ abgesättigte Komplexe von radiopharmazeutisch nützlichen Metallen zu bilden.
  • Eine koordinative Sättigung der meisten Metalle der ersten und zweiten Reihe der Übergangsmetalle und der Metalle der Gruppe IIIb, die erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind, wird im allgemeinen bei einer Koordinationszahl von sechs erreicht. Versuche, Chelatoren zu entwickeln, die maximal stabile Komplexe mit diesen Metallen bilden, haben sich daher auf die Entwicklung von Liganden konzentriert, die sechs Donoratome enthalten. Von besonderem Interesse war die Entwicklung von sechszahnigen Chelatoren, die hoch stabile Komplexe mit dem biologisch wichtigen Metall Eisen III bilden. Diese Versuche haben häufig eine biomimetische Annäherung umfaßt, da die stabilsten Eisen III-Komplexe, die zur Zeit bekannt sind, solche sind, die von natürlich vorkommenden Chelatoren gebildet werden, die erzeugt werden von einer Vielzahl von Mikroorganismen als Teil ihres Mechanismus zur Aufnahme von Eisen aus der Umgebung. Derartige Chelatoren werden als Siderophore bezeichnet, wobei der stabilste aller bekannten Metallkomplexe der Eisen III-Komplex eines, Enterobactin genannten, Siderophors ist mit der Struktur:
  • Die Bildungskonstante des Eisen-Enterobactin-Komplexes ist 10&sup5;², wie berichtet wird von Harris et al., J. Amer. Chem. Soc., 101, 6097 (1979). Enterobactin bindet an Eisen über sechs phenolische Sauerstoffatome, die in den drei Catechineinheiten vorhanden sind. Die Gesamtchelatstruktur besteht somit aus drei identischen zweizahnigen Bindungseinheiten, wobei jede Einheit die Struktur umfaßt:
  • Der Rest des Moleküls dient als Netzwerk, das die drei zweizahnigen Catechineinheiten in eine solche Stellung bringt, daß alle drei stereochemisch in der Lage sind, mit einem einzigen Eisenzentralatom Bindungen einzugehen.
  • Ein zweiter wirksamer Siderophor, der klinisch verwendet wird, um die Eisenausscheidung einzuleiten, wird Desferrioxamin B bezeichnet und hat die Struktur
  • Dieser Chelator bindet Eisen durch eine Reihe von sechs Sauerstoffatomen, die an drei zweizahnigen Hydroxamatbindungseinheiten vorhanden sind, wobei jede Einheit die folgende Struktur besitzt:
  • Wie im Falle von Enterobactin dient der Rest des Moleküls als Netzwerk, das eine ausreichende sterische Flexibilität besitzt, um es zu ermöglichen, daß alle drei zweizahnigen Hydroxamateinheiten sich an das gleiche Eisenatom binden.
  • Versuche, die oben angegebene Siderophorstrukturen nachzuahmen, haben sich auf die Herstellung von Verbindungen konzentriert unter Verwendung synthetischer Netzwerke, um die natürlichen Catechinat- und Hydroxamateinheiten zur Bildung von sechszahnigen Chelaten entsprechend zu positionieren.
  • Harris et al. beschreiben eine Synthetische sechszahnige Chelatierungsverbindung 1,3,5-N,N',N"-Tris(2,3-dihydroxybenzoyl)triamomethyl-benzol (MECAM), bei der drei Catechineinheiten an eine Benzolhaupteinheit gebunden sind.
  • Jain et al., J. Amer. Chem. Soc., 89, 724 (1967) und J. Amer. Chem. Soc., 90, 519 (1968) beschreiben die Verwendung des dreigabeligen Tetramin-tris-(2-aminoethyl)amin (TREN) als vierzahnigen Chelator für Metalle, wie Kupfer und Zink.
  • Rodgers et al., Inorg. Chem., 26, 1622 (1987) und die dort angegebenen Literaturstellen beschreiben die Synthese einer Anzahl von sechszahnigen Tricatechinanalogen von Enterobactin einschließlich einem, bei dem TREN als "Rückgrat" verwendet wird. Die Verbindungen bilden sehr stabile Komplexe mit Eisen.
  • Weitl et al., US-PS 4 181 654, 4 309 305 und 4 543 213 beschreiben Verbindungen, umfassend vier 2,3-Dihydroxybenzoesäureamid (Catechin)-Einheiten, die um ein zyklisches oder lineares Azaalkan-Netzwerk angeordnet sind. Die Dihydroxybenzoylgruppen können gegebenenfalls substituiert sein mit einer Nitrogruppe, einer Sulfonatgruppe oder einem pharmazeutisch annehmbaren Sulfonatsalz. Es wird angegeben, daß die Verbindungen besonders geeignet sind zum Maskieren von Actinid (IV)-Ionen durch Bildung von achtzahnigen Komplexen. Weitl et al., US-PS 4 442 305, beziehen sich auf Polybenzamidverbindungen mit niedrigerer Zahnigkeit, umfassend zwei 2,3-Dihydroxybenzoylgruppen, die an ein Azaalkangerüst gebunden sind. Es heißt auch, daß derartige vierzahnige Verbindungen geeignet sind zum Maskieren von Actinid (IV)-Ionen sowohl bei in vivo- als auch in vitro-Verfahren.
  • Von Interesse für die vorliegende Erfindung ist der Stand der Technik bezüglich Chelatierungsmitteln unter Verwendung von anderen Atomen als Sauerstoff als Elektronendonoren. Die Polyaminopolycarboxylat-Chelatoren, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), die bekannt sind und stabile Komplexe mit einem weiten Bereich von Metallen bilden, haben einen Großteil ihrer Nützlichkeit aufgrund der Tatsache, daß sie eine Kombination sowohl von Sauerstoff- als auch Stickstoffdonoren bilden. Die Synthese von bifunktionellen DTPA- und EDTA-Analogen ist bekannt. Sundberg et al., J. Med. Chem., 17, 1304 (1974) beschreiben die Synthese van bifunktionellen EDTA-Derivaten, die gekennzeichnet sind durch die Bindung von einzigartigen, mit einem Proteinsubstrat reaktionsfähigen Funktionen, wie mit Protein reaktionsfähigen Paraaminophenylsubstituenten an einem Methylenkohlenstoff des Polyaminrückgrats.
  • Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind Offenbarungen in bezug auf 8-Mydroxychinolin, das auch als Oxin bekannt ist, eine zweizahnige Bindungseinheit, enthaltend sowohl ein Sauerstoffdonoratom als auch ein Stickstoffdonoratom, und das die unten gezeigte Struktur besitzt, wenn es an ein Metallatom M gebunden ist.
  • Wie es bekannt ist, bildet 8-Hydroxychinolin Komplexe mit einem weiten Bereich von Metallen und ist bekannt zur Verwendung bei der Extraktion von verschiedenen Metallionen aus Lösungen. S. Plueddemann, US-PS 4 421 654, und Scher, US-PS 4 500 494, die eine Vielfalt von substituierten Oxinen beschreiben. Es ist bekannt, daß 8-Hydroxychinolin besonders geeignet ist zum Komplexieren von Metallen der Gruppe IIIb. Die letzteren sind von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung, da die schwereren Elemente der Gruppe IIIb verbreitete Anwendung in der Nuclearmedizin finden, besonders die γ-emittierenden Isotope Gallium-67, Indium-111 und Thallium-201 und das Positronen emittierende Metall Gallium-68. McAfee et al., J. Nucl. Med., 17, 480 (1976) beschreiben die Markierung von Blutzellen mit 8-Hydroxychinolinkomplexen von Indium-111 und Technetium-99m. Moerlein et al., Int. J. Nucl. Med. Biol., 8, 277 (1981) beschreiben verschiedene lineare und verzweigte 2,3-Dihydroxybenzoylamidanaloge von Enterobactin und ihre Verwendung sowohl mit Gallium als auch mit Indium als Radiopharmazeutika. Die Literaturstelle beschreibt auch die Verwendung von mit Indium-111 markiertem 8-Hydroxychinolin. Loberg et al., US-PS 4 017 596, beschreibt die Verwendung von Chelaten von Kobalt-57, Gallium-67, Gallium-68, Technetium-99m, Indium-111 und Indium-113m mit 8-Hydroxychinolin als radiopharmazeutische externe Abbildungsmittel Goedemans et al., EP-A-83 129 beschreibt Antikörper und Antikörperfragmente, die durch bifunktionelle Chelatierungsmittel einschließlich 8-Hydroxychinolin markiert sind. Die Chelatierungsmittel dieser Druckschrift bilden Komplexe, bei denen drei 8-Hydroxychinolinliganden an jedes Metallatom gebunden sind.
  • Während die Tris(8-hydroxychinolin)komplexe zufriedenstellend sind für die oben angegebenen Anwendungen, sind sie von begrenzter Nützlichkeit als Radiopharmazeutika für in vivo-Anwendungen, da der zweizahnige 8-Hydroxychinolinligand eine Bildungskonstante für zum Beispiel Gallium von nur 1014,5 besitzt, während diejenige des Serumproteintransferrins 1023,7 beträgt. Folglich würden derartige Komplexe, wenn sie einmal im Blutstrom sind, dazu neigen, aufzubrechen und das radioaktive Metall an Transferrin abzugeben, was zu unerwünscht hohen und bleibenden Bluthintergrundgehalten an Radioaktivität führt.
  • Hata et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 45, 477 (1972) beschreiben Azomethyl- und Azomethinderivate von 8-Hydroxychinolin- 2-carbaldehyd. Ein Derivat ist N,N'-Bis(8-hydroxy-2-chinolylmethyl)ethylendiamin, umfassend zwei 8-Hydroxychinolin-Chelatierungseinheiten, die an ein Ethylendiamingitter gebunden sind. Die Literaturstelle schlägt vor, daß der vierzahnige Chelator stabilere Metallkomplexe bilden kann als Oxin aufgrund seiner höheren Basizität.
  • Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind Veröffentlichungen, die die Verwendung von Protein/Metallionen-Konjugaten für diagnostische und therapeutische Zwecke beschreiben. Gansow et al., US-PS 4 454 106, beschreiben die Verwendung von Konjugaten aus monoklonalem Antikörper und Metallion für in vivo und in vitro diagnostische Radioabbildungsverfahren. Goldenberg et al., N. Eng. LT. Med., 298, 1384-88 (1978) beschreiben diagnostische Abbildungsversuche, bei denen Antikörper zu dem bekannten tumor-assiziierten Antigen karzinoembryonitisches Antigen (CEA) mit ¹³¹Jod markiert und an Krebspatienten injiziert werden. Nach 48 Stunden werden die Patienten mit einer Gammascintillationskamera abgetastet und Tumoren durch das Gammaemissionsmuster lokalisiert.
  • Andere Forscher beschreiben die therapeutische Verwendung von Antikörper/Metallionen-Konjugaten für die Abgabe von cytotoxischen Radioisotopen an Tumorstellen in vivo. Order et al., Int. LT. Radiation Oncology Biol. Phys., 12, 277-81 (1986) beschreiben die Behandlung von hepatozellulärem Krebs (Leberkrebs) mit Antiferritin polyklonalen Antikörpern, mit denen &sup9;&sup0;Yttrium chelatisiert ist. Buchsbaum et al., Int. J. Nucl. Med. Biol., Bd. 12, Nr. 2, S. 79-82 (1985) beschreiben die Radiomarkierung von monoklonalen Antikörpern zu CEA mit &sup8;&sup8;Yttrium und regen die Möglichkeit der Lokalisierung und Behandlung von colorektalen Krebsen damit an. Nicoletti beschreibt in der EP-A-174 853, veröffentlicht am 19. März 1986, Konjugate, umfassend Metallionen und Antikörperfragmente. Nach dieser Offenbarung werden monoklonale Antikörper der Untergruppe IgG enzymatisch behandelt, um das Fc-Fragment zu entfernen und reduktiv die Disulfidbindung zu spalten, die die schweren Ketten des Antikörpers verbindet. Das Fab'-Fragment wird dann mit einem Chelatierungsmittel verbunden, das an ein Radionuclidmetallion gebunden ist; für diagnostische oder therapeutische in vivo-Anwendungen. Ebenfalls von Interesse für die vorliegende Anmeldung ist die Offenbarung von Wang et al., J. Nucl. Med., 28, 723 (1987), die sich auf einen bifunktionellen zweizahnigen Chelator bezieht, der abgeleitet ist von dem natürlich vorkommenden 8-Hydroxychinolinderivat, Xanthurensäure. Dieser Chelator besitzt die Struktur:
  • Die Carbonsäure wird in einen N-Hydroxysuccinimidylester umgewandelt, der mit den Seitenkettenaminogruppen von Proteinen reagiert, um den zweizahnigen Chelator an das Substrat zu binden. Die Stabilität einer einzigen zweizahnigen Einheit ist leicht unzureichend für in vivo-Anwendungen und die Verwendung eines Komplexes, enthaltend drei aktive Xanthurensäureesterliganden, würde vermutlich zu schädlichen Vernetzungsreaktionen zwischen Proteinen und einer damit einhergehenden Denaturierung des proteinsubstrats führen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, gekennzeichnet durch die Struktur:
  • in der D ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
  • - - und -CH&sub2;-
  • wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halogen, C&sub1;-C&sub3;- Alkyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat und Sulfonat-trialkylammoniumsalzen, Phenol, Phosphat, C&sub1;-C&sub3;-Carbonsäure, Carboxamid, Sulfonamid, Phosphonsäure und Sulfat, wobei n 3 oder 4 ist und wobei A ein lineares, cyclisches oder dreigabeliges Tri- oder Tetraamin ist, wobei die Aminstickstoffatome verbunden sind durch Alkan, Cycloalkan oder in Orthostellung substituierte Ringsubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amingruppen, wobei die Aminstickstoffatome so angeordnet sind, daß alle auftretenden Oxineinheiten in der Lage sind, ein einziges Metallzentralatom zu binden, wobei A gegebenenfalls an dem Methylenkohlenstoff substituiert sein kann durch die Gruppe
  • wobei X meta oder para steht und Nitro oder eine mit einem Substrat reaktionsfähige Gruppe ist und wobei m = 0 bis 10 ist.
  • Ebenfalls von der Erfindung geliefert werden bifunktionelle Chelatierungsmittel, gekennzeichnet durch die Struktur
  • wobei m 0 bis 10 ist,
  • wobei p 0 oder 1 ist,
  • wobei g 0 oder 1 ist,
  • wobei r 0 oder 1 ist,
  • wobei s 2, 3 oder 4 ist,
  • wobei t 2, 3 oder 4 ist,
  • wobei u 0, 1, 2 oder 3 ist,
  • wobei v 0, 1, 2 oder 3 ist und
  • wobei u + v 1, 2 oder 3 sind und
  • wobei S&sub1;, S&sub2;, S&sub3;, S&sub4;, S&sub5; und S&sub6; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
  • -H
  • -OH
  • -CH&sub2;CO&sub2;H
  • -CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H
  • - - S&sub7;
  • wobei y 1 bis etwa 5 ist,
  • und S&sub7; Aryl oder C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl ist,
  • und aromatische Metallbindungseinheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
  • wobei S&sub8; und S&sub9; gleich oder verschieden sind und C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl oder Aryl bedeuten, wobei X meta oder para steht und Nitro oder eine mit dem Substrat reaktionsfähige Gruppe ist.
  • Während die vorliegende Erfindung zahlreiche Chelatierungsmittel unterschiedlicher Größe, Form und Zahnigkeit liefert, gibt es kein einzelnes bevorzugtes Chelatierungsmittel nach der Erfindung. Bevorzugte Verbindungen variieren je nach der spezifischen Art des zu bindenden Metallions.
  • Die zweizahnigen Chelatierungsmittel nach der Erfindung sind geeignet zum Binden von Metallen einschließlich radioaktiven Metallionen an eine Vielzahl von Substratmolekülen einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Proteine, Glycoproteine, Peptide, Poly(aminosäuren), Lipide, Kohlenhydrate, Polysaccharide, Nucleoside, Nucleotide, Nucleinsäuren, Arzneimittel (Drogen), Inhibitoren und intakte Zellen.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Antikörperkonjugate und Antikörper-Metallionen-Konjugate geliefert, umfassend die bifunktionellen Chelatierungsmittel. Außerdem liefert die Erfindung zusätzlich diagnostische in vivo-Abbildungsverfahren unter Verwendung von Strahlung aussendenden und Strahlung absorbierenden Metallionen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden therapeutische Verfahren zur Verfügung gestellt zur Behandlung von Zuständep wie Krebs, wobei cytotoxische Strahlung aussendende Nuclide an Antitumor-assoziierte Antigenantikörper gebunden werden durch die erfindungsgemäßen Chelatierungsmittel. Die Antikörper-Radionuclid-Konjugate nach der Erfindung werden dann in einen Patienten eingeführt und die cytotoxischen Radionuclide werden selektiv auf Zellen gerichtet, die das Tumor-assoziierte Antigen enthalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch geeignet für therapeutische in vivo-Methoden, wo es erwünscht ist, Metallionen zu entfernen, insbesondere radioaktive Metallionen aus dem Körper wie in Fällen, wo Patienten radioaktiver Kontamination ausgesetzt waren.
    • Detaillierte Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft mehrzahnige Chelatoren auf der Basis der 8-Hydroxychinolineinheit. Derartige Chelatoren können substituiert sein und von verschiedenen Formen und können bifunktionell sein, umfassend neben der Chelatierungsgruppe eine mit dem Substrat reaktive Gruppe, umfassend eine mit dem Substrat reaktive Einheit. Derartige bifunktionelle Verbindungen, die kovalent an Antikörper, andere Proteine und ähnliches gebunden werden können, sind besonders geeignet für in vivo diagnostische und therapeutische Verfahren.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch bifunktionelle mehrzahnige Chelatoren auf der Basis des dreigabeligen Tetraamins Tris-(2-aminoethyl)amin (TREN). Das Tetraamin kann substituiert sein an einem Methylenkohlenstoffatom mit einer mit dem Substrat reaktionsfähigen Gruppe der Formel
  • in der X Nitro oder eine mit dem Substrat reaktionsfähige Gruppe ist und wobei m 0 bis 10 ist.
  • Das Ausgangstetraamin kann selbst als vierzahniger Chelator für Metalle, wie Kupfer und Zink, dienen, wie es beschrieben wird von Jain et al., J. Amer. Chem. Soc., 89, 724 (1967) und J. Amer. Chem. Soc., 90, 519 (1968). Bifunktionelle Analoge von TREN können kovalent über die mit dem Substrat reaktionsfähige Gruppe an Substrate einschließlich Antikörpern und anderen Proteinen gebunden werden.
  • Bifunktionelle Chelatierungsmittel mit höherer Zahnigkeit können erhalten werden durch weitere Derivatisierung des TREN- Skeletts. Beispiele für Verbindungen, die abgeleitet sind von dem monofunktionellen TREN-Skelett, umfassen Imine, die gebildet worden sind durch Schiff'sche Basenkondensation von TREN mit Salicylaldehyd oder Pyridin-2-carboxaldehyd, wie es beschrieben ist von Sim et al., Inorg. Chem., 17, 1288 (1978) bzw. Wilson et al., J. Amer. Chem. Soc., 90, 6041 (1968). Als ein anderes Beispiel können Amide gebildet werden durch Acylierung der primären Amine mit Chelatierungseinheiten nach den Verfahren von Rodgers et al., Inorg. Chem., 26, 1622 (1987). Eine breite Vielfalt von Metall bindenden Einheiten kann an den TREN-Armen substituiert sein. Derartige Metall bindende Einheiten umfassen Wasserstoff- Hydroxy-, Carboxymethyl-, Carboxyethyl- und Hydroxamatgruppen sowie aromatische und heterocyclische Metall bindende Einheiten. Derartige aromatische und heterocyclische Metall bindende Einheiten können unsubstituiert sein oder können, wie 8-Hydroxychinolin, substituiert sein durch verschiedene Substituenten, wie Hydroxy und Sulfonat an entsprechenden Ringstellungen. Die Arme des TREN- Moleküls können verlängert sein, so daß jeder Arm so viele wie vier Methylenkohlenstoffatome umfaßt, obwohl aufgrund der Bindungsstabilität es im allgemeinen bevorzugt ist, daß nur zwei oder drei Methylenkohlenstoffatome in jedem Arm vorhanden sind.
  • Während sogar bestimmte Substituenten und Gruppen der Chelatierungsverbindung nach der Erfindung allgemein bevorzugt sind, variieren die speziellen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen weit, entsprechend der Art des Substrats und des zu bindenden Metallions. Trotzdem können bestimmte allgemeine Prinzipien angewandt werden, um die erfindungsgemäßen Verbindungen für spezielle Anwendungsgebiete "maßzuschneidern". Zum Beispiel besitzen bestimmte Metallionen, wie Ionen der Actiniden- und Lanthanidenreihe der Metalle große Radien und bevorzugen hohe Koordinationszahlen. Bevorzugte Chelatierungsmittel zum Binden mit derartigen Ionen sind größere Verbindungen mit erhöhter Zahnigkeit. Als ein weiteres Beispiel kann die genaue Stellung von speziellen Aminosäureresten in der Struktur eines Proteins (an oder nahe der aktiven Stelle eines Enzyms oder an oder nahe der Erkennungsstelle eines Antikörpers) die Auswahl einer alternativen, mit dem Substrat reaktionsfähigen Einheit an einem Chelatierungsmittel erforderlich machen.
  • Die meisten Metallionen von Interesse besitzen die Koordinationszahl sechs oder darunter und werden daher angemessen gebunden durch sechszahnige Verbindungen nach der Erfindung (wobei n 3 ist). Trotzdem können einige Metallionen eine höhere Koordinationszahl besitzen einschließlich Indium, das eine Koordinationszahl von 7 und Yttrium, das eine Koordinationszahl von 8 besitzen kann, mit dem Ergebnis, daß eine achtzahnige Chelatorverbindung (bei der n 4 ist) besonders vorteilhaft sein kann. Es ist jedoch unklar, ob Verbindungen mit höherer Zahnigkeit (bei denen n 5 oder mehr ist) gemäß der Lehre der Erfindung einen besonderen Vorteil ergeben würden aufgrund der sterischen Begrenzung bezüglich der Positionierung von fünf oder mehr Oxinsubstituenten um ein Metallion. Derartige sterische Begrenzungen sind von Bedeutung für die achtzahnigen Verbindungen nach der Erfindung und können die Substitution der Oxinringe solcher Verbindungen begrenzen. Trotzdem wird in Betracht gezogen, daß spezielle Vorteile erzielt werden können durch Verbinden von zwei oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen in einer solchen Weise, daß die erhaltene Makrostruktur in der Lage ist, mit zwei oder mehr Metallionen gleichzeitig Bindungen einzugehen.
  • Die Chinolinverbindungen nach der vorliegenden Erfindung verwenden vorzugsweise 8-Hydroxychinolinbindungsfunktionalitäten. Es wird nichtsdestotrotz in Betracht gezogen, daß 8-Mercaptochinolinanaloge ebenfalls geeignet sein können zur Verwendung nach der Erfindung. Während die Stickstoff- und Sauerstoff- (oder Schwefel)-atome an der Oxineinheit die Metallbindungsfunktion ausüben, können die anderen Teile des Doppelringes substituiert sein. Eine derartige Substitution beeinflußt im allgemeinen die Metallbindungseigenschaften der Verbindungen nicht nachteilig, vorausgesetzt, daß sie nicht sterisch die Bindung stört. Die Substitution beeinflußt jedoch Eigenschaften, wie Löslichkeit, die kritisch ist sowie die Nützlichkeit der Verbindungen für verschiedene Anwendungsgebiete. Unsubstituierte Verbindungen nach der Erfindung neigen dazu, eine geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen zu besitzen. Es ist daher bevorzugt, daß die Oxineinheit mit hydrophilen Gruppen substituiert ist, wie Sulfonat, die die Löslichkeit der Verbindungen einfach verbessern. In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen sind R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; vorzugsweise so ausgewählt, daß mindestens einer der Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Sulfonat ist und an der 4- oder insbesondere 5-Stellung des Oxinringes substituiert ist.
  • Das "Rückgrat" A der Verbindungen ist ein lineares, cyclisches oder dreigabeliges Tri- oder Tetraamin, wobei die Aminstickstoffatome durch Alkan-, Cycloalkan- oder ortho-substituierte Phenylringsubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Aminogruppen miteinander verbunden sind, wobei die Aminstickstoffatome so angeordnet sind, daß alle auftretenden Oxineinheiten in der Lage sind, mit einem einzigen Metallzentrum Bindungen einzugehen. Die Rückgratstruktur ist durch die sterischen und thermodynamischen Bedingungen auf solche Polyamine beschränkt mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amingruppen. Kleinere Rückgratverbindungen neigen dazu, daß sie sterisch begrenzt sind und so nicht in der Lage, die Oxineinheiten zum Binden mit einem Metallzentralatom in die entsprechende Stellung zu bringen. Rückgratverbindungen mit mehr als 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amingruppen neigen dazu, geringe Metallbindungswirkungen zu besitzen als Folge des hohen Maßes an Unordnung (Entropie), was sich in langen Oxinarmen manifestiert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen somit vorzugsweise Aminstickstoffatome, die durch Alkansubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen zwischen Amingruppen verbunden sind. Drei besonders bevorzugte Rückgratstrukturen sind die Reste von Diethylentriamin, 1,4,7- Triazacyclononan und Tris-(2-aminoethyl)amin (TREN):
  • Besonders bevorzugte Verbindungen nach der Erfindung umfassen:
    • Mit Substrat reaktionsfähige Einheiten
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gegebenenfalls mit Substrat reaktionsfähige Gruppen der Formel enthalten:
  • wobei m 0 bis 10 und vorzugsweise 1 ist. Wenn X Nitro ist, ist es verständlich, daß eine weitere Umwandlung in eine mit dem Substrat reaktionsfähige Einheit vor der Reaktion mit einem Substrat erforderlich ist. Bevorzugte mit Substrat reaktionsfähige Einheiten für X umfassen solche, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
  • -NH&sub2; (AMINO)
  • -NN&spplus; (DIAZONIUM)
  • -NCS (ISOTHIOCYANAT)
  • -NCO (ISOCYANAT)
  • -NHNH&sub2; (HYDRAZIN)
  • -NHCONHNH&sub2; (SEMICARBAZID)
  • -NHCSNHNH&sub2; (THIOSEMICARBAZID)
  • -NHCOCH&sub2;Cl (CHLORACETAMID)
  • -NHCOCH&sub2;Br (BROMACETAMID)
  • -NHCOCH&sub2;I (JODACETAMID)
  • -N&sub3; (AZID)
  • -CO&sub2;H (CARBOXYLAT)
  • -NHCONH(CH&sub2;)wNH&sub2; (AMINOALKYLHARNSTOFF)
  • -NHCSNH(CH&sub2;)wNH&sub2; (AMINOALKYLTHIOHARNSTOFF)
  • -NHCONH(CH&sub2;)wCO&sub2;H (CARBOXYALKYLHARNSTOFF)
  • NHCSNH(CH&sub2;)wCO&sub2;H (CARBOXYALKYLTHIOHARNSTOFF) (MALEINIMID) (HALOTRIAZIN) (META-(DIHYDROXYBORYL)PHENYLTHIOHARNSTOFF)
  • wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br und F;
  • wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, F, OH und OCH&sub3; und
  • wobei w 1 bis 10 ist.
  • Besonders bevorzugte mit Substrat reaktionsfähige Einheiten umfassen solche, bei denen X in para-Stellung substituiert ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -NH&sub2;, -NCS, -NHCOCH&sub2;Br und -NHCSNH(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2;. Wo es erwünscht ist, eine direkte Bindung mit der Aminosäureseitenkette eines Proteinsubstrats zu verhindern, umfassen bevorzugte, mit dem Substrat reaktionsfähige Einheiten solche, die in der Lage sind zu einer Reaktion mit Glycosylierung, die bei einigen Proteinen vorhanden ist. Da eine derartige Glycosylierung im allgemeinen inert ist, muß häufig ein Derivat gebildet werden oder sie muß oxidiert werden, um ihre Reaktionsfähigkeit zu erhöhen. Mit Substrat reaktionsfähige Einheiten, die für die Verwendung bei der Bindung mit glycosylierten Proteinen bevorzugt sind, umfassen -NHNH&sub2; und -NHCSNHNH&sub2;.
    • Metallionen
  • Metallionen, die erfindungsgemäß chelatiert werden können, umfassen Gammastrahlungsisotope, die geeignet sind für die diagnostische Scintigraphie. ¹¹¹Indium mit einer Halbwertszeit von 2,8 Tagen ist besonders geeignet, während andere geeignete Gammastrahler &sup6;&sup7;Gallium, &sup6;&sup8;Gallium und 99mTechnetium umfassen. Erfindungsgemäße Materialien können chelatiert werden mit Betastrahlung aussendenden Verbindungen, die geeignete cytotoxische Mittel für die Radiotherapie sind. Derartige Strahler umfassen Isotope, wie &sup4;&sup6;Scandium, &sup4;&sup7;Scandium, &sup4;&sup8;Scandium, &sup6;&sup7;Kupfer, &sup7;²Gallium, &sup7;³Gallium, &sup9;&sup0;Yttrium, &sup9;&sup7;Ruthenium, ¹&sup0;&sup0;Palladium, 101mRhodium, ¹&sup0;&sup9;Palladium, ¹&sup5;³Samarium, ¹&sup8;&sup6;Rhenium, ¹&sup8;&sup8;Rhenium, ¹&sup8;&sup9;Rhenium, ¹&sup9;&sup8;Gold, ²¹²Radium und ²¹²Blei.
  • Die Chelatierungsmittel nach der Erfindung können auch verwendet werden, um Alphastrahlung aussendende Materialien zu binden, wie ²¹²Wismut, Positronenemitter, wie &sup6;&sup8;Gallium und &sup8;&sup9;Zirkonium, fluoreszierende Elemente der Lanthanreihe, wie Terbium und Europium, und der Übergangsmetallreihe, wie Ruthenium und paramagnetische Materialien, wie Gadolinium und Eisen.
    • Komplexbildung von Metallionen
  • Verfahren zur Bildung von Chelatierungsmittel/Metallionen- Konjugaten sind dem Fachmann bekannt. Komplexe von Chelatierungsmittel und Metallionen können allgemein gebildet werden durch Inkubieren des Chelatierungsmittel /Substrat-Konjugats mit einem Metallion in einer gepufferten Lösung, in der das Konjugat physiologisch stabil ist. Geeignete Puffer umfassen solche mit schwachen Metallbindungseigenschaften, wie Citrat, Acetat oder Glycin. Entsprechende Konzentrationen, Temperaturen und pH-Werte können vom Fachmann ausgewählt werden, um sicherzustellen, daß Metallionen mit der Funktionalität des Chelatierungsmittels Bindungen eingehen und nicht schwache Metallbindungsstellen auf den Substraten. Es ist besonders erwünscht, daß alle Lösungen frei von Metallverunreinigungen gehalten werden. Nach der Inkubation während eines entsprechenden Zeitraums können nicht gebundene Metallionen soweit erforderlich von dem Substrat/Chelatierungsmittel/Metallionen-Konjugat durch ein Verfahren, wie Gelfiltration, abgetrennt werden.
    • Mit dem Substrat reaktionsfähige Funktionalitäten
  • Die mit dem Substrat reaktionsfähigen Einheiten nach der vorliegenden Erfindung umfassen solche Einheiten, die in der Lage sind, eine spezifische Bindungsreaktion einzugehen mit mindestens einer Funktionalität, die in einem Substratmolekül vorhanden ist, das ein biologisch aktives Substrat sein kann. Wenn das Substrat ein Protein ist, können solche Einheiten reaktionsfähig sein mit Gruppen der Seitenkette von Aminosäuren, die die Polypeptidhauptkette bilden. Derartige Gruppen der Seitenkette umfassen die Carboxylgruppen von Aspartinsäure und Glutaminsäureresten, die Aminogruppen von Lysinresten, die aromatischen Gruppen von Tyrosin und Histidin und die Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten.
  • Carboxylseitengruppen, die von einem Substrat, wie einer Polypeptidhauptkette, geliefert werden, können umgesetzt werden mit Gruppen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit reaktionsfähigen Gruppen gegenüber Aminsubstrat mit Hilfe einer Reaktion mit einem löslichen Carbodiimid. Aminonebengruppen, die von einem Substrat geliefert werden, können umgesetzt werden mit den Isothiocyanat-, Isocyanat- oder Halogentriazinderivaten nach der Erfindung, um eine Bindung des Chelators mit dem Polypeptid zu erzielen. Wahlweise können Aminoseitengruppen auf dem Substrat verbunden werden mit erfindungsgemäßen Verbindungen, die mit einem Aminsubstrat reaktionsfähige Gruppen enthalten, mit Hilfe von bifunktionellen Mitteln, wie Dialdehyden und Imidoestern. Aromatische Gruppen, die durch ein Substrat geliefert werden, können an das Chelatierungsmittel nach der Erfindung über das Diazoniumderivat gekuppelt werden. Sulfhydrylgruppen an den Substratmolekülen können umgesetzt werden mit Maleinimiden oder mit reaktionsfähigen Gruppen gegenüber einem Halogenalkylsubstrat, wie Jodacetamid. Freie Sulfhydrylgruppen, die für derartige Reaktionen geeignet sind, können gebildet werden aus den Disulfidbindungen von Proteinimmunoglobulinen oder können durch chemische Derivatbildung eingeführt werden. Die Verbindung von freien Sulfhydrylgruppen, die in dem intra-schweren-Kettenbereich von Immunoglobulinen gebildet werden, stören die Antigenbindungsstellen des Immunoglobulins nicht, aber können den Antikörper unfähig machen, das Komplement zu aktivieren.
  • Wenn das Substrat ein glycosyliertes Protein ist, besteht eine Alternative zur Bildung einer Bindung an die erfindungsgemässen Verbindungen über die Polypeptidhauptkette darin, eine kovalente Bindung mit den Kohlenhydratseitenketten des Glycoproteins zu bilden, nach Verfahren, wie denjenigen von Rodwell et al., US- PS 4 671 958. So können die Kohlenhydratseitenketten von Antikörpern selektiv oxidiert werden, um Aldehyde zu bilden, die dann entweder mit reaktionsfähigen Amingruppen des Substrats unter Bildung einer Schiff'schen Base oder mit reaktionsfähigen Hydrazin-, Semicarbazid- oder Thiosemicarbazidgruppen des Substrats unter Bildung des entsprechenden Hydrazins, Semicarbazons oder Thiosemicarbazons Bindungen ergeben. Diese gleichen Verfahren können auch angewandt werden, um die bifunktionellen Chelatoren nach der Erfindung an Nicht-Proteinsubstrate, wie Kohlenhydrate und Polysaccharide, zu binden.
  • Eine alternative reaktionsfähige Gruppe des Substrats, die geeignet ist für Bindungen mit Kohlenhydraten und Polysacchariden, ohne daß die vorherige Oxidation erforderlich ist, ist die Dihydroxyborylgruppe, wie sie in den meta-(Dihydroxyboryl)phenylthioharnstoffderivaten nach der Erfindung vorhanden ist. Diese Gruppe ist reaktionsfähig mit Substraten enthaltend ein 1,2-cis-Diol, unter Bildung eines 5-gliedrigen cyclischen Boratesters und ist somit geeignet zur Verwendung mit solchen Kohlenhydraten, Polysacchariden und Glycoproteinen, die diese Gruppe enthalten. Die Dihydroxyborylderivate können auch angewandt werden, um die Chelatoren nach der Erfindung an Ribonucleoside, Ribonucleotide und Ribonucleinsäuren zu binden, da Ribose eine 1,2-cis-Diolgruppe in 2',3'-Stellung enthält, wie angegeben von Rosenberg et al., Biochemistry, 11, 3623-28 (1972). Desoxyribonucleotide und DNA- Substrate können nicht auf diese Weise an die erfindungsgemäßen Chelatoren gebunden werden, da die 3'-Hydroxylgruppe fehlt. Die zuletzt genannten Substrate können jedoch mit Isothiocyanatderivaten der Chelatoren konjugiert werden, indem zunächst ein Allylaminderivat des Desoxyribonucleotids gebildet wird, wie es angegeben ist von Engelhardt et al., EP-A-97 373.
  • Wenn das mit den Chelatoren nach der Erfindung zu verbindende Substrat eine intakte Zelle ist, können entweder mit Polypeptid reaktive oder mit Kohlenhydrat reaktive Einheiten angewandt werden. Hwang und Wase, Biochim. Biophys. Acta, 512, 54-71 (1978) beschreiben die Verwendung des Diazoniumderivats des bifunktionellen EDTA-Chelators nach Sundberg et al., J. Med. Chem., 17, 1304 (1974), um Erythrocyten und (Blut)plättchen mit Indium- 111 zu markieren. Die Dihydroxyboryleinheit ist reaktionsfähig mit einer Vielfalt von Bakterien, Viren und Mikroorganismen, s. Zittle, Advan. Enzyme., 12, 493 (1951) und Burnett et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 96, 157-62 (1980).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen mit Substrat reaktive Einheiten Amino (-NH&sub2;), Diazonium (-NN&spplus;), Isothiocyanat (-NCS), Isocyanat (-NCO), Hydrazin (-NHNH&sub2;), Semicarbazid (-NHCONHNH&sub2;), Thiosemicarbazid (-NHCSNHNH&sub2;), Halogenacetamid (-NHCOCH&sub2;X) einschließlich Chlor-, Brom- und Jodacetamid, Azid (-N&sub3;), Carboxylat (-CO&sub2;H), Aminoalkylharnstoff (-NHCONH(CH&sub2;)wNH&sub2;), Aminoalkylthioharnstoff (-NHCSNH(CH&sub2;)wNH&sub2;), Carboxyalkylharnstoff (-NHCONH(CH&sub2;)wCO&sub2;H) und Carboxyalkylthioharnstoff (-NHCSNH(CH&sub2;)w- CO&sub2;H) , wobei w 1 bis 10 ist, Maleinimid, Halogentriazin einschließlich Chlor-, Brom- und Jodtriazin, und meta-(Dihydroxyboryl)phenylthioharnstoff (-NHCSNHC&sub6;H&sub4;B(OH)&sub2;). Andere reaktive Einheiten, die geeignet sein können zur Bindung der Chelatierungsmittel an Substrate, umfassen Disulfide, Nitrene, Sulfonamide, Carbodiimide, Sulfonylchloride, Benzimidate, -COCH&sub3; und -SO&sub3;H. Die bevorzugte mit Substrat reaktive Einheit für eine spezielle Anwendung nach der Erfindung wird bestimmt durch die Art des Substrats und durch seine Möglichkeit, biologische Aktivität als Folge der Bildung einer bestimmten Bindung zu verlieren. Per definitionem umfaßt die Bildung irgend einer Bindung eine chemische Umwandlung der mit dem Substrat reaktiven Einheit X in die konjugierte Form dieser Einheit (im folgenden der "Rest" von X).
  • Die reaktiven Einheiten nach der Erfindung sind in meta- oder vorzugsweise in para-Stellung an der Phenylgruppe angeordnet, die über eine aliphatische Abstandsgruppe mit dem Chelatierungsgitter nach der Erfindung verbunden ist. Die Abstandsgruppe kann aus 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen bestehen und kann lineares oder verzweigtes Alkyl oder substituiertes Alkyl sein mit der Maßgabe, daß eine solche Verzweigung oder solche Substituenten die Metallbindungsstellen oder mit Substrat reaktiven Gruppen nicht stören. Lineare Alkylbindungsgruppen sind trotzdem bevorzugt, wobei C&sub1;-Alkylbindungsgruppen besonders bevorzugt sind.
    • Substrate, die erfindungsgemäß geeignet sind
  • Substratmoleküle, die mit den Chelatierungsmitteln nach der vorliegenden Erfindung umgesetzt werden können, umfassen Proteine, Glycoproteine, Peptide, Polyaminosäuren, Lipide, Kohlenhydrate, Polysaccharide, Nucleoside, Nucleotide, Nucleinsäuren, Arzneimittel bzw. Drogen, Inhibitoren oder intakte Zellen. Geeignete Proteine umfassen Immunoglobuline, Antigene, Enzyme, Komponenten des Koagulations/Antikoagulationssystems im Blut und verschiedene biochemisch aktive Moleküle und Rezeptoren. Derartige Proteine können zum Beispiel abgeleitet sein von genetisch manipulierten Zellen. Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die bifunktionellen Chelatierungsmittel angewandt werden, um verschiedene Arten von Antikörpern einschließlich IgA, IgD, IgE, IgG und IgM zu binden. Die Antikörper können gegen eine Vielfalt von antigenen Determinanten gebildet worden sein einschließlich solchen, die mit Tumoren, Histokompatibilität und anderen Zelloberflächenantigenen, Bakterien, Pilzen, Viren, Enzymen, Toxinen, Arzneimitteln bzw. Drogen und anderen biologisch aktiven Molekülen verbunden sind. Antigene, die mit Tumoren verbunden sind, für die Antikörper spezifisch reaktiv sein können, umfassen solche Antigene, wie sie beschrieben sind von Zalcberg und McKenzie in LT. Clin. Oncology, Bd. 3, S. 876-82 (1985) und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, carcinoembryonisches Antigen (CEA), Mucine, wie TAG-72, Humanmilchfettglobulantigene und Rezeptoren, wie die IL-2- und Transferrinrezeptoren. Derartige Antikörper können monoclonal oder polyclonal sein oder gebildet worden sein durch Rekombinationsverfahren, wie sie beschrieben sind von Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-55 (1984).
  • Fragmente von Antikörpermolekülen können auch gebunden werden, einschließlich Halbantikörpermolekülen und Fab, Fab' oder F(ab')2-Fragmenten. Nicolotti, EP-A-174 853, veröffentlicht am 19. März 1986, auf die hier verwiesen wird, beschreibt Verfahren, durch die vollständige Antikörper behandelt werden, um eine stellungsspezifische Spaltung der beiden schweren Ketten durchzuführen unter Entfernung des Fc-Anteils der Carboxyl-terminierten Enden der schweren Ketten.
  • Substrate werden umgesetzt mit den mit Substrat reaktiven Einheiten der Chelatierungsmittel nach den oben beschriebenen Verfahren. Jedes Substrat kann durch mehr als ein Chelatierungsmittel je nach Wunsch gebunden werden. Die maximale Wirkung der Substitution auf einem Substrat, wie einem Protein, ist jedoch begrenzt durch die Art der Glycosylierung an dem Protein oder die Anzahl und Lage der reaktionsfähigen Aminosäureseitenketten an dem Molekül. Wenn es wie bei Antikörpern erwünscht ist, daß das konjugierte Protein seine biologische Aktivität behält, ist das Ausmaß der Substitution entsprechend der Art und Stellung der Targetglycosylierung oder Aminosäurereste in der primären sowie in der tertiären Sequenz des Proteins begrenzt und dem Grad der Beteiligung an den Antigenbindungsstellen.
  • Andere nach der Erfindung in Frage kommende Substrate umfassen Polysaccharidmatrices, die, wenn sie mit Chelatoren Derivate bilden, Mittel zur Extraktion von Metallen aus Metallproteinen und anderen metallhaltigen Substraten ergeben, sowie für die Affinitätschromatographie von Proteinen nach den Verfahren von Porath und Olin, Biochemistry, 22, 1621-30 (1983). Nucleinsäuren, die an die Chelatoren nach dieser Erfindung gebunden sind, können angewandt werden, um eine etwaige Nucleinsäurehybridisierungsreaktion zu überwachen, wie es beschrieben ist von Engelhardt et al., EP-A-97 373. Bifunktionelle Chelatoren, die mit Arzneimitteln bzw. Drogen verbunden sind, können angewandt werden, um die Aufnahme dieses Arzneimittels im Gewebe zu verfolgen, wie es beispielhaft angegeben ist durch die Verwendung des antibiotischen Arzneimittels Bleomycin, das verbunden ist mit dem bifunktionellen EDTA-Derivat nach Sundberg et al., J. Med. Chem., 17, 1304 (1974) als Mittel zur Abbildung von Tumoren, s. DeRiemer et al., LT. Med. Chem., 22, 1019-23 (1979); Goodwin et al., J. Nucl. Med., 22, 787-92 (1981). Intakte Zellen, wie Erythrocyten und Blutplättchen, wurden mit radioisotopen Metallen markiert durch Bindung mit bifunktionellen Chelatoren, wie beschrieben von Hwang und Wase, Biochim. Biophys. Acta, 512, 54-71 (1978), und derartige markierte Zellen können angewandt werden, um Bereiche einer abnormen Ansammlung im Körper nachzuweisen. Die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an niedermolekulare Substanzen, die selbst einer spezifischen Bindungsreaktion mit einem makromolekularen biologischen Molekül unterliegen, kommen auch in Betracht. Haner et al., Arch. Biochem. Biophys., 231, 477-86 (1984) beschreiben Verfahren zur Bindung von EDTA an p-Aminobenzamidin, einem spezifischen Inhibitor für Trypsin, der sich stark an die aktiven Stellen bindet, und eine Affinitätsmarkierung bildet zur Untersuchung dieser Stelle. Schultz und Dervan, J. Amer. Chem. Soc., 105, 7748-50 (1983) beschreiben die sequenzspezifische Doppelstrangspaltung von DNA durch Eisenkomplexe von Konjugaten, die gebildet worden sind durch Binden von EDTA an Distamycin, einem N-Methylpyrroltripeptid, das sich an DNA in seguenzspezifischer Weise bindet.
  • Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Synthese von verschiedenen Chelatierungsmitteln nach der Erfindung. Die Beispiele 1 bis 5 beschreiben die Synthese von 2-Carboxy-8-hydroxychinolin und dessen sulfonisiertem Analogem 2-Carboxy-5-sulfonato-8-hydroxychinolin, die verwendet werden zur Herstellung von mehrzahnigen Chelatierungsverbindungen nach der Erfindung.
  • Die Beispiele 6 bis 8 beschreiben die Synthese von verschiedenen sechszahnigen Chelatierungsmitteln nach der vorliegenden Erfindung. Beispiel 6 beschreibt die Synthese von Tris-N-(2- aminoethyl-[8-hydroxychinolin-2-carboxamido])-amin, einem dreigabeligen Chelatierungsmittel. Beispiel 7 beschreibt die Synthese von N,N',N"-Tris(hydroxychinolin-2-carboxamido)-1,4,7-triazacyclononan, einem cyclischen sechszahnigen Chelatierungsmittel. Beispiel 8 beschreibt die Synthese von N¹,N&sup4;,N&sup7;(Tris-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido))diethylentriamin, einem linearen sechszahnigen Chelatierungsmittel nach der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiele 9 bis 13 beschreiben die Synthese eines bifunktionellen TREN-Moleküls, wobei Beispiel 13 die Synthese von N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]diethylentriamin-tetrahydrochlorid-salz beschreibt, das das Tetrahydrochloridsalz von bifunktionellem TREN ist. Das bifunktionelle TREN-Molekül des Beispiels 13 kann selbst angewandt werden als ein bifunktionelles Chelatierungsmittel oder es kann mit verschiedenen Chelatierungseinheiten modifiziert werden, um andere Chelatierungsmittel zu bilden.
  • Die Beispiele 14 bis 16 beschreiben die Synthese von verschiedenen bifunktionellen Analogen des dreigabeligen sechszahnigen Chelatierungsmittels nach Beispiel 6. Die bifunktionellen Analogen werden hergestellt aus dem Tetrahydrochloridsalz von bifunktionellem TREN, das entsprechend Beispiel 13 hergestellt worden ist. Solche bifunktionelle Chelatierungsmittel sind in der Lage, ein Metallion an reaktive Stellen zu binden einschließlich Antikörper und andere Proteine. Beispiel 14 beschreibt die Synthese von N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]tris-N-(8- hydroxychinolin-2-carboxamido)diethylentriamin. Beispiel 15 beschreibt die Synthese von N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-aminobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)diethylentriamin-dihydrochloridsalz durch Umwandlung der Nitroeinheit des Beispiels 14 in eine mit einem Substrat reaktive Aminogruppe. Beispiel 16 beschreibt die Synthese von N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-isothiocyanatobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)diethylentriaminhydrochloridsalz durch Umwandlung der Aminoeinheit des Beispiels 15 in eine mit Substrat reaktionsfähige Isothiocyanatgruppe.
  • Beispiel 17 beschreibt die Synthese von Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin-5-sulfanato-2-carboxamido])amin, einem sulfonierten Analogen des dreigabeligen sechszahnigen Chelatierungsmittels nach Beispiel 6. Beispiel 18 beschreibt die Synthese eines Indiumkomplexes von Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin- 2-carboxamido]amin, dem Chelatierungsmittel nach Beispiel 6. Beispiel 19 beschreibt die Herstellung von Konjugaten zwischen dem bifunktionellen Chelatierungsmittel nach Beispiel 16 und einem monoclonalen Antikörper. Beispiel 20 beschreibt die Herstellung von radioaktiven Metallionenkomplexen von Indium-111 mit den Antikörperkonjugaten nach Beispiel 19.
    • Beispiel 1 8-Hydroxychinolin-N-oxid
  • In diesem Beispiel wurde 8-Hydroxychinolin-N-oxid hergestellt aus 8-Hydroxychinolin. Eine gerührte Lösung von 8-Hydroxychinolin (25,00 g, 172,2 mMol) in 550 ml CHCl&sub3; wurde auf 0ºC gekühlt und 3-Chlorperoxybenzoesäure (40,00 g, 80 % technisch rein x 0,231 mMol = 0,185 mMol) wurde langsam innerhalb von 3 Minuten zugegeben. Die Lösung wurde auf 0ºC gehalten und 3 Stunden gerührt. Während dieser Zeit fiel das 3-Chlorbenzoesäurenebenprodukt aus. Die 3-Chlorbenzoesäure wurde abfiltriert und das orangefarbene Filtrat zur Trockne eingeengt und der verbleibende Feststoff mit 2 % NH&sub4;OH (2 x 200 ml) verrieben. Der Feststoff wurde auf einer Fritte isoliert und mit H&sub2;O gewaschen. Der Feststoff wurde im Vakuum getrocknet und zweimal aus 10:1 Hexan-Aceton umkristallisiert und ergab 8-Hydroxychinolin-N-oxid als hellgelbe Nadeln, Fp. 138-39ºC (21,36 g, 132,7 mMol, 77 % Ausbeute). ¹H NMR (CDCl&sub3;, TMS interner Standard), δ 7,05 (d, J = 7,5 Hz, 1 H); 7,22 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 7,25 (t, J = 7,5 Hz, 1 H) , 7,48 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,79 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8,25 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), kein Phenol-Proton zu sehen. ¹³C NMR, δ 114,67, 116,65, 120,26, 129,54, 130,40, 132,08, 134,34, 153,79. MS für C&sub9;H&sub7;O&sub2;N = 161,16 g/Mol, m/e 161 (M&spplus;, Grundpeak), 116, 89, 63. IR 2248 m, 1560 s, 1530 m, 1470 m, 1280 s, 1189 m, 1156 m, 1049 m, 816 s.
    • Beispiel 2 8-Hydroxychinolin-N-methoxy-methyl-sulfat
  • In diesem Beispiel wurde 8-Hydroxychinolin-N-methoxymethylsulfat hergestellt nach einem Verfahren, bei dem eine Suspension von 8-Hydroxychinolin-N-oxid, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war (37,9 g, 229,6 mMol), in 750 ml CCl&sub4; unter Rühren unter einer Argonatmosphäre zum Sieden unter Rückfluß gebracht wurde. Als die Lösung Rückflußtemperatur erreichte war alles 8-Hydroxychinolin in Lösung gegangen und bildete eine gelbe homogene Lösung. Wenn das Gemisch nicht homogen war, wurde weiteres CCl&sub4; zugegeben. Dimethylsulfat (66,65 g, 528,4 mMol) wurde zu der unter Rückfluß siedenden Lösung zugegeben und 8 Stunden unter Rückfluß gerührt. Mit fortschreitender Reaktion schwamm das Produkt an die Oberfläche des Reaktionsgemisches auf. Die Reaktion wurde abgebrochen, als sich kein weiteres Material von dem Gemisch abtrennte. Das Reaktionsgemisch konnte sich auf Raumtemperatur abkühlen und die CCl&sub4;-Phase wurde abdekantiert. Der verbleibende dunkelrote, teerartige Rest wurde mit trockenem Diethylether gewaschen und 48 Stunden im Vakuum getrocknet und ergab 8-Hydroxychinolin-N-methoxymethylsulfat als mikrokristallinen, tief orangefarbenen Feststoff (58,91 g, 89 % Ausbeute). Dieses Produkt war extrem hydroskopisch und es wurde daher keine weitere Reinigung versucht. ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard) δ 3,45 (s, 3 H), 4,46 (s, 3H), 7,67 (d, J = 9,00 Hz, 1 H), 7,89 (t, J = 9,00 Hz, 1 H), 7,94 (d, J = 6,00 Hz, 1 H), 8,14 (t, J = 6,00 Hz, 1 H), 9,24 (d, J = 9,00 Hz, 1 H), 9,76 (d, J = 6,00 Hz, 1 H). MS für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;O&sub2;N&spplus;SO&sub4;CH&sub3; = 287.28 g/Mol, positives Bombardement mit schnellen Atomen) (M&spplus;, Grundpeak Stammkation), 176, 190, 226, 256, 270, 289.
    • Beispiel 3 2-Cyano-8-hydroxychinolin
  • In diesem Beispiel wurde 2-Cyano-8-hydroxychinolin nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Natriumcyanid (30,11 g, 614,5 mMol) wurde in 150 ml H&sub2;O gelöst und in einem Eis/NaCl-Bad auf 0ºC gekühlt. Nach Beispiel 3 hergestelltes 8-Hydroxychinolin- N-methoxymethylsulfat (58,91 g, 205,1 mMol) wurde in 250 ml H&sub2;O gelöst und durch Schwere über ein PS-Filterpapier filtriert. Die 8-Hydroxychinolin-N-methoxymethylsulfatlösung wurde dann zu der bei 0ºC gerührten Cyanidlösung im Verlauf von 2 Stunden zugegeben. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit konzentrierter Essigsäure auf 4,5 verringert. Das führte dazu, daß das gewünschte Material als grauer Feststoff ausfiel. Das Material wurde über eine grobe Fritte isoliert, gut mit H&sub2;O gewaschen und 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Das Material wurde zweimal aus 10:1 Hexan-Aceton umkristallisiert und ergab 2-Cyano-8-hydroxychinolin (25,00 g, 146,9 mMol, 72 % Ausbeute) als hellbraune Nadeln, Fp. 132-43ºC. ¹H NMR (CDCl&sub3;, TMS interner Standard), δ 7,28 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 7,41 (d, J = 7,0 Hz, 1 H), 7,63 (t, J = 6,0 Hz, 1 JH), 7,71 (d, J = 7,0 Hz, 1 H), 7,9 (s, 1 H), 8,30 (d, J = 8,0 Hz, 1 H). MS für C&sub1;&sub0;H&sub6;O&sub2;N = 170,17 g/Mol, m/e 171 (M&spplus;H, Grundpeak), 162, 146, 188 (M&spplus;+NH&sub3;).
    • Beispiel 4 2-Carboxy-8-hydroxychinolin
  • 2-Cyano-8-hydroxychinolin, hergestellt nach Beispiel 3 (25,00 g, 146,9 mMol), wurde unter Rühren zu einer Lösung von 3 N NaOH (45,01 g in 375 ml H&sub2;O) zugegeben. Die Lösung wurde 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt, die Reaktion abgebrochen, wenn die Base am oberen Ende des Rückflußkühlers durch pH-Papier nicht mehr nachweisbar war und das Reaktionsgemisch konnte sich auf Raumtemperatur abkühlen. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit 5 N HCl auf 4,5 herabgesetzt. Das gewünschte Produkt wurde dann in 2 l Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatlösung wurde zur Trockne eingedampft und in 2 g-Fraktionen in 200 ml Methanol aufgenommen und auf eine Sephadex LH-20-Säule (750 g Elution mit Methanol) zur weiteren Reinigung aufgebracht. Die Hauptfraktion wurde aus der Säule isoliert und aus H&sub2;O umkristallisiert und ergab 2-Carboxy-8-hydroxychinolin (20,10 g, 106,3 mMol, 72 % Ausbeute) als leuchtend gelbe Kristalle, Fp. 215-216ºC. ¹H NMR (d6-DMSO, TMS interner Standard), δ 7,25 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 7,54 (d, J = 7,50 Hz, 1 H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 8,18 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 8,58 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 10,23 (breit s, 1 H). ¹³C NMR, δ 111,98, 117,56, 119,92, 129,89, 130,42, 136,43, 138,29, 144,23, 153,80, 165,10. MS für C&sub1;&sub0;H&sub7;O&sub3;N = 189,17 g/Mol, m/e (M&spplus;H, Grundpeak), 190, 172, 162, 143, 116, 104, 89.
    • Beispiel 5 2-Carboxy-5-sulfonato-8-hydroxychinolin
  • 2-Carboxy-8-hydroxychinolin, das entsprechend Beispiel 4 hergestellt worden war (1,00 g, 5,3 mMol), wurde in 20 ml konz. H&sub2;-SO&sub4; gelöst und unter Rühren 4,5 Stunden auf 100ºC erhitzt. Das Gemisch konnte sich auf Raumtemperatur abkühlen und wurde 48 Stunden stehengelassen, um die Reaktion langsam zu vervollständigen. Zu der Lösung wurden langsam 150 ml H&sub2;O zugegeben und das erhaltene Gemisch auf 5ºC gekühlt. Während der nächsten 48 Stunden kristallisierte das gewünschte Material aus der Lösung aus und ergab 2-Carboxy-5-sulfonato-8-hydroxychinolin als dunkelorange-farbene, haarartige Kristalle (0,99 g, 3,7 mMol, 70 % Ausbeute), Fp.> 350ºC. ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard),δ 7,11 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 8,01 )d, J = 7,5 HZ, 1 H), 8,22 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 9,42 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), keine phenolischen Carbon- und Sulfonsäure- Protonen zu sehen. ¹³C NMR, δ 110,02, 120,02, 126,64, 128,82, 135,22, 136,68, 138,52, 144,09, 154,52, 165,33. MS für C&sub1;&sub0;H&sub7;O&sub6;NS = 269,23 g/Mol, m/e (M&spplus;H Stammionenpeak) 270, 226, 190, 146, 130. Beispiel 6
    • Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin-2-carboxamido])amin
  • 2-Carboxy-8-hydroxychinolin, das entsprechend Beispiel 4 hergestellt worden war (1,00 g, 5,3 mMol), wurde in 100 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren N-Hydroxysuccinimid (0,66 g, 5,7 mMol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,16 g, 5,7 mMol) gegeben. Das Reaktionsgefäß wurde mit seinem Septum dicht verschlossen und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene 1,3-Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde durch Filtrieren von der Lösung entfernt. Zu der erhaltenen gelben Lösung wurde Tris-(2-aminoethyl)amin (0,25 g, 1,8 mMol) (TREN) durch das Septum zugegeben und die Lösung 48 Stunden gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingeengt und in 400 ml Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatphase wurde mit H&sub2;O (1 l) gewaschen, bis kein weiteres N-Hydroxysuccinimid durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden konnte (Kieselsäure, 90:10 CH&sub2;Cl&sub2;:CH&sub3;OH). Die organische Phase wurde über Mg-SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wurde in 175 ml CH 3OH gelöst und auf eine 750 g Sephadex LH-20-Säule aufgebracht und mit CH&sub3;OH eluiert. Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin- 2-carboxamido])amin kristallisierte aus den Röhrchen mit der entsprechenden Fraktion nach 72 Stunden als ultrafeine, haarartige Kristalle aus (0,75 g, 1,14 mMol, 63 % Ausbeute). ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard),δ 2,96 (t, J = 6,62 Hz, 6 H), 3,62 (g, J = 6,98 Hz, 6 H), 7,19 (d, J = 7,72 Hz, 3 H), 7,46 (d, J = 8,09 Hz, 3 H), 7,57 (t, J = 7,72 Hz, 3 H), 8,15 (d, J = 8,82, 3 H), 8,45 (d, J = 8,45 Hz, 3 H), 9,68 (t, J = 5,88 Hz, 3 H). ¹³C NMR, 37,49, 53,69, 111,37, 117,40, 118,65, 129,16, 129,30, 136,31, 137,46, 147,42, 153,45, 163,74. MS für C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub3;N&sub7;O&sub6; = 659,17 g/Mol, (M&spplus;H Grundpeak) 660, 458, 244, 215, 171, 144, 93. Beispiel 7
    • N,N',N"-Tris-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)-1,4,7-triazacyclononan
  • Ein Gemisch, umfassend 2-Carboxy-8-hydroxychinolin, hergestellt entsprechend Beispiel 4 (0,38 g, 1,98 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (0,23 g, 1,98 mMol) in DMF (5,5 ml) wurde 20 Minuten gerührt, bevor 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid.HCl (0,38 g, 1,98 mMol) zugegeben wurde. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde 1,4,7-Triazacyclononan (0,08 g, 0,62 mMol) (hergestellt nach dem Verfahren von Atkins et al., Organic Syntheses, Bd. 58, 1978, S. 86-97, John Wiley and Sons, New York) in DMF (2,0 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch 7 Tage gerührt. Das DMF wurde unter Vakuum abgedampft und der erhaltene Rückstand in CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml) gelöst und mit H&sub2;O (3 x 60 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde dann mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der rohe Rückstand wurde über eine Sephadex LH-20-Säule (Bett -550 g) chromatographiert und mit Methanol eluiert. 0,06 g (15 %) N,N',N"-Tris-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)-1,4,7-triazacyclononan wurde als weißer Feststoff gewonnen; Massenspektrum m/e 643 (M+H)&spplus;. Beispiel 8
    • N¹,N&sup4;,N&sup7;-(Tris-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido))diethylentriamin
  • 2-Carboxy-8-hydroxychinolin, hergestellt entsprechend Beispiel 4 (1,00 g, 5,3 mMol), Säure wurde in 100 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst. Zu der gerührten Lösung wurden N-Hydroxysuccinimid (0,66 g, 5,7 mMol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,16 g, 5,7 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde mit einem Septum dicht verschlossen und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene 1,3-Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde von der Lösung durch Filtration entfernt. Zu der erhaltenen gelben Lösung wurde Diethylentriamin (0,18 g, 1,8 mMol) durch das Septum zugegeben und die Lösung 48 Stunden gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingeengt und in 400 ml Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatphase wurde mit H&sub2;O (1 l) gewaschen, bis kein N-Hydroxysuccinimid mehr durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden konnte (Kieselsäure, 85:15 CH&sub2;Cl&sub2;:CH&sub3;OH). Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wurde in 275 ml CH&sub3;OH gelöst und auf eine 750 g Sephadex LH-20-Säule aufgebracht und mit CH&sub3;OH eluiert. Das gewünschte Produkt wurde isoliert durch Entfernen des Lösungsmittels von den Röhrchen mit der entsprechenden Fraktion und durch TLC bestätigt (0,45 g, 0,729 mMol), 41 % Ausbeute).
    • Beispiel 9 N¹,N&sup7;-Bis-(tert.-butoxycarbonyl)diethylentriamin
  • Zu einer im Eisbad gekühlten Lösung von THF (100 ml) wurden Diethylentriamin (5,44 g, 52,73 mMol) und Triethylamin (15,97 g, 157,84 mMol) gegeben. Eine Lösung von BOC-ON (2-(tert.- Butoxycarbonyloxyimino)-2-phenylacetonitril) (26,0 g, 105,6 mMol) in 500 ml THF wurde innerhalb von 45 Minuten zu der obigen Lösung zugetropft. Nach 2-stündigem Rühren im Eisbad und eine Stunde bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das verbleibende gelb-grüne Öl wurde in Ethylacetat (350 ml) gelöst und mit kaltem (5ºC) 5 %igem wässrigem NaOH (5 x 200 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Das Volumen des Öls wurde mit 20 % MeOH/80 % CH&sub2;Cl&sub2; verdoppelt und über Silicagel chromatographiert. Die Fraktionen wurden durch TLC untersucht (10 % MeOH/90 % CH&sub2;Cl&sub2;, Kieselsäure, Ninhydrin). Die Fraktionen des Produkts wurden zusammengegeben und im Vakuum zu einem klaren Gummi getrocknet und ergaben 11,5 g N¹,N&sup7;-Bis-(tert.-butoxycarbonyl)diethylentriamin. Eine Langzeithochvakuumbehandlung des Gummis ergab einen weißen, kristallinen Feststoff, Fp. 69-710C. ¹H NMR (CDCl&sub3;, TMS interner Standard), δ 1,44 (s, 18H), 1,65 (bs, 2H), 2,71-2,75 (t, J = 5,75 Hz, 4H), 3,19-3,25 (g, J = 5,70 Hz, 4H), 5,07 (bs, 1H). ¹³C NMR, δ 28,19, 40,21, 48,74, 79,15, 156,13. MS für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub9;N&sub3;O&sub4; = 303,4008 g/Mol, direkte chemische Ionisierung; m/e 304 (M&spplus;, Grundpeak), 248, 192, 173, 130. IR (CDCl&sub3;), 3454m, 2980s, 2933m, 1707s, 1505s, 1455m, 1392m, 1367s, 1270m, 1249m, 1170s, 1046m.
    • Beispiel 10 N-(tert.-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidyl-ester
  • N-tert.-BOC-para-Nitro-L-phenylalanin (4,53 g, 14,59 mMol) wurde in 150 ml Ethylacetat gelöst und zu dieser Lösung wurde N- Hydroxysuccinimid (2,00 g, 17,39 mMol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (3,53 g, 17,11 mMol) gegeben. Der Reaktionskolben wurde mit einem Septum dicht verschlossen und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene 1,3-Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Der weiße Feststoff wurde zweimal aus 2-Propanol (600 ml) umkristallisiert und ergab den N-(tert.-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin-N- hydroxysuccinimidyl-ester als weißen kristallinen Feststoff (4,92 g, 12,07 mMol, 82 % Ausbeute). Fp. 178-79ºC. ¹H NMR /CDCl&sub3;, TMS interner Standard),δ 1,44 (s, 9H), 2,89 (s, 4H), 3,25-3,50 (m, 2H), 5,01 (bs, 1H), 7,49 (d, J = 9,00 Hz, 2H), 8,19 (d, J = 9,00 Hz, 2H). MS für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;N&sub3;O&sub8; = 407,3792 g/Mol, direkte chemische Ionisierung; m/e 425 ((M+NH&sub3;)&spplus;, Grundpeak), 408, 396, 352, 308, 265, 254, 163, 133.
    • Beispiel 11 N&sup4;-[1-Oxo-(2-aminoethyl-(N-tert.-butoxycarbonyl))-2-(4-nitrobenzyl)]-N¹,N&sup7;-bis(tert.-butoxycarbonyl)diethylentriamin
  • N-(tert.-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidyl-ester, hergestellt nach Beispiel 10 (3,0 g, 7,43 mMol), wurde in 150 ml trockenem THF gelöst und zu dieser Lösung N¹,N&sup7;-Bis(tert.-butoxycarbonyl)diethylentriamin, hergestellt nach Beispiel 9 (1,85 g, 6,09 mMol), zugegeben. Der Kolben wurde mit einem Septum dicht verschlossen und 50 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der N-Hydroxysuccinimidniederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne zu einem klaren Gummi eingedampft. Der Gummi wurde in 25 ml Methanol gelöst und auf eine Sephadex LH-20-Säule (Gewicht des Bettes 750 g, 100 % Methanol, 5 ml/min.) aufgebracht. Das gewünschte Material war die erste austretende Spezies, wie durch TLC (Kieselsäure, 40 % EtOAc/60 % CH&sub2;Cl&sub2;, Rf = 0,2) nachgewiesen wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockne eingeengt und ergaben einen klaren Gummi. Das Material wurde in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und auf eine Kieselsäuresäule zur weiteren Reinigung aufgebracht (100 g, 60 mesh Kieselsäure, 95 % CH&sub2;-Cl&sub2;, 15 % MeOH, 10 ml/min.). Mit dem gleichen TLC-System wurden die entsprechenden Fraktionen (nachgewiesen und) zusammengegeben und ergaben einen klaren amorphen Feststoff, Fp. 60-62ºC (3,0 g, 5,04 mMol, 82 % Ausbeute). ¹H NMR (CDCl&sub3;, TMS interner Standard), δ 1,38 (s, 9H), 1,42 (s, 18H), 3,30 (m, 4H), 3,28 (m, 2H), 3,35 (m, 4H), 4,98 (bs, 1H), 7,43 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,17 (d, J = 9 Hz, 2H). MS für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub5;N&sub5;O&sub9; = 595,6916 g/Mol, direkte chemische Ionisierung (NH&sub3;); m/e 596 ((M+H)&spplus;, Grundpeak), 540, 496, 484, 440, 384.
    • Beispiel 12 N&sup4;-[1-Oxo-2-aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]diethylentriamin-tristrifluoracetat-salz
  • N&sup4;-[1-Oxo-(2-aminoethyl-(N-tert.-butoxycarbonyl))-2-(4- nitrobenzyl)]-N¹,N&sup7;-bis (tert.-butoxycarbonyl)diethylentriamin, hergestellt nach Beispiel 11 (1,0 g, 1,67 mMol), wurde in 15 ml Trifluoressigsäure unter Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und im Vakuum zu einem hellgelben amorphen Feststoff eingeengt. Der Feststoff wurde erneut in Trifluoressigsäure gelöst und das obige Verfahren wiederholt, um eine vollständige Entfernung der tert.-Butoxycarbonylschutzgruppe sicherzustellen. Der Feststoff wurde in 20 ml H&sub2;O gelöst und gefriergetrocknet und ergab einen hellgelben Feststoff (1,21 g, 1,61 mMol, 95 % Ausbeute). ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard) δ 3,10-3,70 (m, 10H), 4,63 (s, 1H), 7,57 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,98 (bs, 1H), 8,07 (bs, 1H), 8,22 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,42 (bs, 1H). MS für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub5;N&sub5;O&sub1;&sub1;F&sub1;&sub2; = 751,436, freies Amin 295,1332, m/e 296 (M&spplus;, freies Kation, Grundpeak), 278, 266, 223, 182, 140, 104.
    • Beispiel 13 N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]diethylentriamin-tetrahydrochlorid-salz
  • Nach diesem Beispiel wurde das Tetrahydrochlorid-salz eines bifunktionellen TREN (N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]diethylentriamin-tetrahydrochlorid-salz) hergestellt. N&sup4;-[1-Oxo- 2-aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)-diethylentriamin-tris-trifluoracetat-salz, hergestellt nach Beispiel 12 (1,15 g, 1,53 mMol), wurde in 25 ml trockenem THF gelöst und in einen im Eisbad gekühlten Kolben, der mit einem Rückflußkühler versehen war, und unter Argonatmosphäre überführt. Als die Lösung Eisbadtemperatur erreicht hatte, wurde 1,0 M Boran-THF (22 ml, 0,304 g, 36,8 mMol) durch das Septum zugegeben und eine Stunde bei 0ºC gerührt. Die Lösung wurde dann 5,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und erneut auf 0ºC gekühlt. Zu dieser Lösung wurden 20 ml trockenes Methanol zugegeben. Diese Stufe wurde mit Vorsicht durchgeführt aufgrund der Entwicklung von großen Gasmengen. Als die Gasentwicklung aus der Lösung beendet war, wurde wasserfreies HCl eine Minute durch das Septum geleitet und die Lösung dann eine Stunde unter Rückfluß erhitzt. Der Kolben konnte sich auf Raumtemperatur abkühlen und wurde im Vakuum zu einem hellgelben Feststoff eingeengt. Dieses Material wurde in einer minimalen Menge Methanol gelöst und auf eine Sephadex LH-20-Säule aufgebracht (750 g, 100 % Methanol, 3 ml/min.) . Das gewünschte Produkt wurde als erstes eluiert, die Fraktionen durch TLC bestimmt (Kieselsäure, 40 % NH&sub4;OH/60 % absolutes Ethanol, Ninhydrin). Die entsprechenden Fraktionen wurden zusammengegeben und im Vakuum zur Trockne eingedampft und ergaben das N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]diethylentriamin-tetrahydrochlorid-salz als hellgelben amorphen Feststoff. (0,45 g, 1,05 mMol, 65 % Ausbeute). ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard), δ 2,21-2,46 (m, 2H), 2,78-3,01 (m, 8H), 3,15-3,25 (m, 2H), 4,03 (bs, 1H), 7,66 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,20 (d, J = 9,0 Hz, 2H) . MS für C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub3;N&sub5;O&sub2; 4HCl = 427,20, freies Amin 281,15, m/e 282 (M&spplus;, freie Base, Grundpeak) 265, 252, 239, 146, 126, 114, 104. Beispiel 14
    • N&sup4;-[2-Aminoehtyl-2-(4-nitrobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin-2- carboxamido)diethylentriamin
  • 2-Carboxy-8-hydroxychinolin (0,985 g, 5,21 mMol), hergestellt nach Beispiel 4, wurde in 100 ml trockenem THF gelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren N-Hydroxysuccinimid (0,650 g, 5,65 mMol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,150 g, 5,57 mMol) gegeben. Das Reaktionsgefäß wurde mit einem Septum dicht verschlossen und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene 1,3- Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde von der Lösung durch Filtrieren entfernt. Zu der erhaltenen gelben Lösung wurd [2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)diethylentriamin-tetrahydrochlorid, hergestellt nach Beispiel 13 (0,250 g, 0,58 mMol) und 1 ml Triethylamin zugegeben und die Lösung 48 Stunden gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingeengt und in 400 ml Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatphase wurde mit H&sub2;O (1 l) gewaschen, bis kein N-Hydroxysuccinimid durch Dünnschichtchromatographie (Kieselsäure, 90 % CH&sub2;Cl&sub2;/10 % Methanol) nachgewiesen werden konnte. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wurde in 175 ml Methanol gelöst und auf eine Sephadex LH-20-Säule (Gewicht des Bettes 750 g, 100 % Methanol, 3 ml/min.) aufgebracht. Die Fraktionen wurden mit dem obigen TLC-System untersucht und die entsprechenden Fraktionen zusammengegeben und im Vakuum zur Trockne eingeengt und ergaben N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)-tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxyamido)diethylentriamin als hellgelbes amorphes Pulver (0,300 g, 0,37 mMol, 64 % Ausbeute). ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard, 70ºC, δ 2,98-3,12 (M, 2H), 3,28-3,37 (dd, J = 15,0 Hz (geminal), J = 3,0 Hz Ia-b), 2H), 3,49-3,63 (m, 4H), 3,64-3,75 (m, 4H), 4,50 (s, 1H), 7,13 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 7,30 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,52 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 7,72 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,98 (d, J = 9 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,34 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 9,29 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 9,60 (t, J = 6,0 Hz, 2H). MS für C&sub4;&sub2;H&sub3;&sub8;N&sub7;O&sub6;NO&sub2; = 794,8220 g/Mol, direkte chemische Ionisierung (NH&sub3;); m/e 795 ((M+H)&spplus;, Grundpeak), 765, 721, 706, 607, 581, 458, 446, 336. ¹³C NMR (sehr dichte Dubletts waren bei vielen Peaks zu sehen durch Rotomer-Sperren) 37,152, 37,412, 48,996, 53,673, 59,218, 111,090, 116,985, 118,37, 122,237, 128,798, 128,87, 129,099, 129,296, 136,125, 136,214, 137,061, 145,364, 146,952, 147,301, 147,362, 153,344, 163,230, 163,627. Beispiel 15
    • N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-aminobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin- 2-carboxamido))diethylentiramin-dihydrochlorid-salz
  • N-[2-Aminoethyl-2-(4-nitrobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido))diethylentriamin-dihydrochlorid-salz (0,030 g, 0,03 mMol), hergestellt nach Beispiel 14, wurde in 25 ml CH&sub3;CN gelöst. Zu dieser Lösung wurde Triethylamin (250 ul, 181,5 mg, 1,78 mMol) und trockene Ameisensäure (100 ul, 122,0 mg, 2,65 mMol) zugegeben. Pd auf Aktivkohle (10 mg 10 Gew.% Pd auf C) wurde zu der Lösung zugegeben, die Suspension dann 2,5 Stunden unter Argonatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Die Suspension konnte sich dann auf Raumtemperatur abkühlen. Der Pd-auf-Kohle-Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Der Feststoff wurde in 100 ml 1N HCl suspendiert und 5 Minuten geschüttelt und die Suspension im Volumen auf 5 ml reduziert und dann durch Lyophilisieren isoliert und ergab das N&sup4;-[2-Aminoethyl-2- (4-aminobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido))diethylentriamin-dihydrochlorid-salz als amorphen hellbraunen Feststoff (0,024 g, 0,028 mMol, 95 %). MS für C&sub4;&sub3;H&sub3;&sub8;N&sub7;O&sub6;NH&sub2; = 764,8390, direkte chemische Isolierung (NH&sub3;); m/e 765 ((M+H)&spplus;, Grundpeak), 563, 458, 429, 383, 350, 320, 305. Beispiel 16
    • N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-isothiocyanatobenzyl)]tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)diethylentriamin-hydrochlorid-salz
  • N&sup4;-[2-Aminoethyl-2-(4-aminobenzyl)-tris-N-(8-hydrochinolin-2-carboxamido))diethylentriamin-hydrochlorid-salz (35,0 mg, 0,041 mMol), hergestellt nach Beispiel 15, wurde in 20 ml absolutem Ethanol gelöst. Zu dieser Lösung wurde Thiophosgen (6,4 ul, 9,6 mg, 0,082 mMol) zugegeben. Der Reaktionskolben wurde mit einem Septum verschlossen und unter Argonatmosphäre gebracht. Die Lösung wurde 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt das gewünschte Produkt als hellbraunen amorphen Feststoff (0,030 g, 0,037 mMol, 91 %). MS für C&sub4;&sub3;H&sub3;&sub8;O&sub6;N&sub7; NCS.HCl = 806,8942 g/Mol +HCl = 843,3551 g/Mol, positives Bombardement mit schnellen Atomen, m/e 807 (M&spplus;, Grundpeak-Stammkation), 837, 765, 718, 458, 244, 215, 185, 144. Beispiel 17
    • Tris-N-(2-aminoethyl)-[8-hydroxychinolin-5-sulfonato-2-carboxamido])amin
  • 2-Carboxy-5-sulfonato-8-hydroxychinolin (0,500 g, 1,85 mMol) wurde in 100 ml trockenem DMF gelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren N-Hydroxysuccinimid (0,225 g, 1,95 mMol) und 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid (0,405 g, 1,96 mMol) gegeben. Das Reaktionsgefäß wurde mit einem Septum dicht verschlossen und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene 1,3-Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde von der Lösung durch Filtrieren entfernt. Zu der erhaltenen gelben Lösung wurde Tris(2-aminoethyl)amin (0,090 g, 0,619 mMol) durch das Septum zugegeben und die Lösung 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingeengt und zweimal aus H&sub2;O umkristallisiert und ergab das gewünschte Produkt als mikrokristallinen weißen Feststoff (0,365 g, 0,405 mMol, 65 %). Das gewünschte Produkt besaß eine verbesserte Löslichkeit in wässrigen Lösungen. ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, TMS interner Standard), δ 2,63 (m, 6H), 2,92 (m, 6H), 7,15 (d, J = 9,0 Hz, 3H), 8,03 (d, J = 9,1 Hz, 3H), 8,24 (d, J = 9,1 Hz, 3H).
    • Beispiel 18 Indium-Komplex von Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin-2- carboxamido]amin
  • Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin-2-carboxamido/)amin (0,100 g, 0,151 mMol), hergestellt nach Beispiel 6, wurde unter Erhitzen in CH&sub3;CN (etwa 225 ml) gelöst unter Bildung einer unter Rückfluß siedenden gesättigten Lösung; zu dieser Lösung wurde Triethylamin (85 ul, 0,065 g, 0,604 mMol) zugegeben. InCl&sub3; (0,035 g, 0,159 mMol) wurde in 35 ml CH&sub3;CN gelöst und dann zu der unter Rückfluß siedenden Tris-N-(2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin-2-carboxamido])amin/Triethylaminlösung tropfenweise zugegeben. Die Lösung konnte wieder auf Raumtemperatur zurückkehren und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und ergab Tris-N- (2-aminoethyl-[8-hydroxychinolin-2-carboxamido]) amin-indium als leuchtend gelb-orangefarbenen Feststoff. MS für C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub7;O&sub6;In = 770,9902 g/Mol, positives Bombardement mit schnellen Atomen, m/e 772 ( (M+H)&spplus;, Grundpeak-Kation), 660, 558, 458, 369, 329, 299.
    • Beispiel 19 Konjugat zwischen N&sup4;-(2-Aminoethyl-2-(4-isothiocyanatobenzyl))tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)diethylentriamin und einem monoclonalen Antikörper
  • Ein monoclonaler IgG&sub1; Mäuseantikörper spezifisch für das carcinoembryone Antigen (CEA) (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) wurde in 0,1 M Phosphat/0,1 M Bicarbonat-Puffer, pH 8,5 dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde in drei gleiche Teile aufgeteilt. Zu jedem Anteil wurde eine Lösung von N&sup4;-(2-Aminoethyl- 2-(4-isothiocyanatobenzyl))tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamido)diethylentriamin als Hydrochlorid-salz in DMSO zugegeben, so daß der erste Anteil ein Molverhältnis Chelator:Antikörper von 100:1, der zweite Anteil ein Molverhältnis von 40:1 und der dritte Anteil ein Molverhältnis von 5:1 erreichte. Alle drei Anteile wurden dann 5 Stunden nach der Zugabe von ausreichend DMS, um eine homogene Lösung zu erhalten, bei 37ºC inkubiert. Die erhaltenen Lösungen wurden auf Raumtemperatur gekühlt und zentrifugiert, um etwaige ausgefallene Substanzen zu entfernen. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils 48 Stunden gegen eine 0,05 M-Lösung von DTPA in 0,05 M Citratpuffer dialysiert und dann 4 Tage gegen mehrfach ausgewechselten 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, und schließlich gegen 0,1 M Borat/0,1 M Citratpuffer, pH 10,5.
    • Beispiel 20 Indium-111-Komplex von N&sup4;-(2-Aminoethyl-2-(4-isothiocyanatobenzyl))tris-N-(8-hydroxychinolin-2-carboxamid)diethylentriamin und CEA/Antikörper-Konjugat
  • Die Fähigkeit jeder der drei Antikörper/Chelator-Zubereitungen, die nach Beispiel 19 hergestellt worden waren, spezifisch Indium-111 zu binden, wurde durch Instant-Dünnschichtchromatographie nach einer Beschickung mit DTPA bestimmt, wie angegeben von Meares et al., Anal. Biochem., 142, 68 (1984). So wurden 500 uCi Indium-111-chlorid (New England Nuclear, Billerica, MA) zu 100 ul jeder der drei Antikörper/Chelator-Konjugat-Lösungen zugegeben, die 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Ein 20 ul-Anteil jeder Lösung wurde dann entfernt und mit 5 ul einer 0,05 M- Lösung von DTPA, pH 6,0, vermischt. Dieses Gemisch wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf mit Silicagel imprägnierte Glasfaser-ITLC-Streifen (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) aufgebracht, die in normaler Salzlösung entwickelt wurden. Unter diesen Bedingungen verbleibt Indium-111, das spezifisch an Chelatorstellen auf dem Antikörper-Chelator-Konjugat gebunden ist, am Ursprung, während nicht gebundenes Indium-111 und schwach gebundenes Indium-111, das durch DTPA von dem Protein entfernt wird, mit der Lösungsmittelfront eluiert wird. Die Indium-111- Aktivität, die am Ursprung des ITLC-Streifens verbleibt, ist somit ein Hinweis für eine stabile spezifische Bindung an Antikörper-gebundene Chelatorstellen. Ein nicht behandelter Anteil des gleichen Anti-CEA-Antikörpers, d.h. einem Anteil, der nicht mit einem Chelator konjugiert worden ist, wurde als Vergleichsversuch mituntersucht. Die erhaltenen Daten gehen aus der Tabelle 1 hervor. TABELLE 1 % des aufgebrachten ¹¹¹In am Ursprung des ITLC-Streifens Zubereitung nicht konjugierter Antikörper (Vergleich) Konjugat
  • Diese Daten zeigen, daß Konjugate zwischen dem Isothiocyanat-Chelator nach der Erfindung und dem Anti-CEA-Antikörper gebildet wurden und daß das Ausmaß der Substitution in Beziehung stand zu dem Molverhältnis von Chelator zu Antikörper, das bei der Kupplungsreaktion angewandt wurde. Die Daten zeigen ferner, daß diese Konjugate in der Lage waren, spezifisch Indium-111 bei einem großen Überschuß an DTPA zu binden.
  • Aus den obigen Beispielen geht für den Fachmann deutlich hervor, daß die Konjugate und Verfahren nach der Erfindung geeignet sind zur Abbildung von lokalisierten Konzentrationen an Antigenen durch externes Photoscanning, wie es beschrieben ist von Goldenberg et al. Bei einem solchen Verfahren wird das Konjugat in einen Patienten eingeführt und der Körper des Patienten auf die Konzentration des Konjugats abgetastet (scanned). Es sollte auch deutlich sein, daß die erfindungsgemäßen Konjugate für diagnostische in vitro-Verfahren angewandt werden können, wie Immunoassays oder Nucleinsäurehybridisierungsassays. Bei diagnostischen Verfahren, wie Sandwich-Hybridisierungsverfahren, sind erfindungsgemäße Konjugate, umfassend Indikatoren, geeignet zum Nachweis des Vorhandenseins von Analyten. Konjugate und Verfahren nach der Erfindung sind auch geeignet für therapeutische Verfahren, bei denen ein Antikörper/Metallionen-Konjugat, bei dem das Metallion cytotoxische Strahlung emittiert, in einen Patienten eingeführt wird, so daß die cytotoxische Strahlung direkt auf die Tumoren einwirken kann, während die toxischen Wirkungen auf gesundes Gewebe minimal gehalten werden. Die erfindungsgemäße Chelatierungsmittel können auch geeignet sein für therapeutische in vivo-Methoden sowohl zur Verabreichung als auch zur Entfernung von radioaktiven und nicht radioaktiven Metallionen. Folglich sollen nur solche Begrenzungen für die Erfindung zutreffen, wie sie in den folgenden Ansprüchen angegeben sind.

Claims (11)

1. Verbindung, gekennzeichnet durch die Struktur
in der D ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CO- und -CH&sub2;- und wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus
Wasserstoff, Halogen, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfo-trialkyl-ammonium-Salzen, Phenol, Phosphat, C&sub1;-C&sub3;-Carbonsäuren, Carboxamid, Sulfonamid, Phosphonsäure und Sulfat, wobei n 3 oder 4 ist und
wobei A ein lineares, cyclisches oder dreigabeliges Tri- oder Tetraamin ist, wobei die Amin-Stickstoffatome verbunden sind durch Alkan, Cycloalkan oder o-substituierte Phenyl- Ringsubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amin- Stickstoffatomen, wobei die Amin-Stickstoffatome so angeordnet sind, daß alle vorhandenen Oxim-Einheiten in der Lage sind, ein einziges zentrales Metallatom zu binden, wobei A gegebenenfalls an einem Methylen-Kohlenstoffatom substituiert sein kann durch die Gruppe
wobei X meta oder para steht und Nitro oder eine mit dem Substrat reaktive Einheit ist und
wobei m 0 bis 10 ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
3. Substrat-Konjugat der Formel
in der D ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CO- und -CH&sub2;- und wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus
Wasserstoff, Halogen, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfo-trialkyl-ammonium-Salzen, Phenol, Phosphat, C&sub1;-C&sub3;-Carbonsäuren, Carboxamid, Sulfonamid, Phosphonsäure und Sulfat, wobei n 3 oder 4 ist und
wobei A ein lineares, cyclisches oder dreigabeliges Tri- oder Tetraamin ist, wobei die Amin-Stickstoffatoine verbunden sind durch Alkan, Cycloalkan oder o-substituierte Phenyl- Ringsubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amin-Stickstoffatomen, wobei die Amin-Stickstoffatome so angeordnet sind, daß alle vorhandenen Oxim-Einheiten in der Lage sind, ein einziges zentrales Metallatom zu binden, wobei A gegebenenfalls an einem Methylen-Kohlenstoffatom substituiert sein kann durch die Gruppe
wobei Q ein Substratmolekül ist
wobei X meta oder para steht und der Rest einer mit dem Substrat reaktiven Einheit ist und
wobei m 0 bis 10 ist.
4. Substrat-Konjugat nach Anspruch 3, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
substituiert an einem Methylen-Kohlenstoffatom durch die Gruppe
5. Substrat-Konjugat nach Anspruch 3, wobei Q ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus Proteinen, Glycoproteinen, Peptiden, Polyaininosäuren, Lipiden, Kohlenhydraten, Polysacchariden, Nucleosiden, Nucleotiden, Nucleinsäuren, Arzneimitteln, Inhibitoren und intakten Zellen.
6. Substrat-Metallionen-Konjugat der Formel
in der D ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CO- und -CH&sub2;- und wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus
Wasserstoff, Halogen, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfo-trialkyl-ammonium-Salzen, Phenol, Phosphat, C&sub1;-C&sub3;-Carbonsäuren, Carboxamid, Sulfonainid, Phosphonsäure und Sulfat, wobei n 3 oder 4 ist und
wobei A ein lineares, cyclisches oder dreigabeliges Tri- oder Tetraamin ist, wobei die Amin-Stickstoffatome verbunden sind durch Alkan, Cycloalkan oder o-substituierte Phenyl- Ringsubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amin- Stickstoffatomen, wobei die Amin-Stickstoffatome so angeordnet sind, daß alle vorhandenen Oxim-Einheiten in der Lage sind, ein einziges zentrales Metallatom zu binden, wobei A an einem Methylen-Kohlenstoffatom substituiert ist durch die Gruppe
wobei Q ein Substrat-Molekül ist,
wobei X meta oder para steht und der Rest einer mit dem Substrat reaktiven Einheit ist und
wobei m 0 bis 10 ist.
7. Substrat-Metallionen-Konjugat nach Anspruch 6, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
substituiert an einem Methylen-Kohlenstoffatom durch die Gruppe
8. Metallionen-Konjugat der Formel
in der D ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CO- und -CH&sub2;- und wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus
Wasserstoff, Halogen, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Nitro, Nitroso, Sulfonat, Sulfo-trialkyl-ammonium-Salzen, Phenol, Phosphat, C&sub1;-C&sub3;-Carbonsäuren, Carboxamid, Sulfonamid, Phosphonsäure und Sulfat, wobei n 3 oder 4 ist und
wobei A ein lineares, cyclisches oder dreigabeliges Tri- oder Tetraamin ist, wobei die Amin-Stickstoffatome verbunden sind durch Alkan, Cycloalkan oder o-substituierte Phenyl- Ringsubstituenten mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen zwischen Amin- Stickstoffatomen, wobei die Amin-Stickstoffatome so angeordnet sind, daß alle vorhandenen Oxim-Einheiten in der Lage sind, ein einziges zentrales Metallatom zu binden, wobei A gegebenenfalls an einem Methylen-Kohlenstoffatom substituiert sein kann durch die Gruppe
wobei X meta oder para steht und Nitro oder eine mit dem Substrat reaktive Einheit ist und
wobei m 0 bis 10 ist.
9. Verbindung, gekennzeichnet durch die Struktur
wobei m 0 bis 10 ist,
wobei p 0 oder 1 ist,
wobei g 0 oder 1 ist,
wobei r 0 oder 1 ist,
wobei s 2, 3 oder 4 ist,
wobei t 2, 3 oder 4 ist,
wobei u 0, 1, 2 oder 3 ist,
wobei v 0, 1, 2 oder 3 ist,
wobei u + v 1, 2 oder 3 ist,
wobei S&sub1;, S&sub2;, S&sub3;, S&sub4;, S&sub5;, und S&sub6; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
wobei y 1 bis 5 ist und S&sub7; Aryl oder C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl ist und aromatische metallbindende Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei S&sub8; und S&sub9; gleich oder verschieden sind und C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl oder Aryl bedeuten,
wobei X meta oder para steht und Nitro oder eine mit dem Substrat reaktive Einheit ist.
10. Verbindung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Formel
wobei m 0 bis 10 ist,
wobei s 2, 3 oder 4 ist,
wobei t 2, 3 oder 4 ist,
wobei u 0, 1, 2 oder 3 ist,
wobei v 0, 1, 2 oder 3 ist und
wobei u + v 1, 2 oder 3 ist und
wobei X meta oder para steht und Nitro oder eine mit dem Substrat reaktive Einheit ist.
11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
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