DE68919366T2

DE68919366T2 - Spaltbare linker zur reduzierung der akkumulierung von immunokonjugaten in nicht-zielorganen.

Info

Publication number: DE68919366T2
Application number: DE68919366T
Authority: DE
Inventors: Paul Abrams; David Anderson; Alan Fritzberg; John Reno; Ananthachari Srinivasan
Original assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-29
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2009-09-30
Also published as: EP0436664A4; EP0436664B1; EP0436664A1; DE68919366D1; WO1990003188A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Verminderung der Akkumulation von diagnostischen und therapeutischen Wirkstoffen in Nicht- Zielorganen, welche an sowohl Nicht-Zielorte als auch Zielorte in Form von Immunkonjugaten befördert werden. In den Immunkonjugaten werden Linker verwendet, welche infolge bestimmter Bedingungen im Nicht-Zielorgan gespalten werden, einschließlich enzymatische Aktivität oder einer Änderung in der Umgebung, z. B. pH, einem Redoxpaar, oder reduzierenden Bedingungen.

Hintergrund der Erfindung

Es bestand ein beträchtliches Interesse in der Entwicklung von Konjugaten mit an zielaffine Proteine, wie beispielsweise Antikörper, angehefteten unterschiedlichen diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffen. Jüngste Anstrengungen waren auf die Konjugatbildung von diagnostischen, zytotoxischen oder antineoplastischen Wirkstoffen mit spezifischen Antikörpern, wie beispielsweise monoklonalen Antikörpern gerichtet, um Konjugate zu erzeugen, welche selektiv Tumorzellen ansteuern, aber normales Gewebe auslassen.
Eine große Zahl unterschiedlicher Klassen von aktiven Wirkstoffen wurde in Betracht gezogen, einschließlich diagnostischer Radioisotope, β- und α- Strahlen aussendender therapeutischer Radioisotope, Toxine pflanzlichen und bakteriellen Ursprungs und eine Vielzahl antineoplastischer Medikamente, darunter interkalierende Substanzen, Antimetabolite, alkylierende Stoffe und Antibiotika.
Trotz der mit der Anheftung von aktiven Wirkstoffen an zielaffine Proteine erzielten Vorteile, blieben Probleme bestehen, welche mit der Lokalierung der Konjugate auf den Nicht-Zielorganen verbunden sind. Zielaffine Proteine, wie beispielsweise Antikörper reagieren selten vollständig spezifisch auf das gewünschte Zielgewebe und Konjugate mit zielaffinen Proteinen siedeln sich daher häufig auf Nicht-Zielgewebe an, vermittelst solcher Mechanismen wie Bindungen über eine Kreuzreaktion, unspezifische Aufnahme, oder bei Exkretionsvorgängen.
So besteht beispielsweise ein Problem bei der Verabreichung von für bildgebende Verfahren bei der Diagnose verwendeten Radioimmunkonjugaten, insbesondere bei einem Immunkonjugat mit einem Radionuklid als bildgebendem Wirkstoff und einem Antikörperfragment darin, daß nämlich die Radioaktivität die Neigung aufweist, sich unspezifisch in der Niere anzusammeln. Dies führt dazu, daß die Nierengegend häufig auf dem Bildschirmen erscheint. Hilfreich für eine größere Schärfe von diagnostischen Bildern wäre daher ein Mittel zur selektiven Entfernung der in der Nierengegend angesiedelten Immunkonjugate, ohne Abnahme der Radioaktivität an der Zielstelle. Desweiteren setzt sich auch ein Immunkonjugat mit einem therapeutischen Radionuklid und einem Antikörperfragment als zielaffinem Protein im allgemeinen in der Niere fest, wo es möglicherweise eine für die Niere unerwünschte Toxizität entfaltet und dadurch den therapeutischen Nutzen des Immunkonjugates herabsetzt. Die Niere kann somit in der Tat das für die Toxizität bestimmende Organ sein, indem sie die Verabreichung größerer, wirksamerer Dosen des Radionuklids nicht zuläßt.
Andere Probleme können dann auftauchen, wenn ein Immunkonjugat dazu neigt, sich in der Leber festzusetzen. Die Leber nimmt einen großen Bereich des Abdomens ein und die Festsetzung von diagnostischen Immunkonjugaten in der Leber kann andere Zielorte, wo die Immunkonjugate sich auch festsetzen können überdecken und somit die Anzeige von durch Metastasen hervorgerufener Läsionen verhindern. Wenn sich ein therapeutisches Immunkonjugat in der Leber festsetzt ist das Lebergewebe der toxischen Wirkung des therapeutischen Wirkstoffs ausgesetzt.
Unter den Maßnahmen zur Entfernung von unter in vivo Bedingungen nicht an Zielgewebe gebundenen Radionuklidchelaten war die Verabreichung von Immunkonjugaten mit an Antikörper über bestimmte Linker angehefteten Radionuklidchelaten, wobei die Linker möglicherweise unter im Körper herrschenden Bedingungen gespalten werden. Unter diesen möglicherweise verstoffwechselbaren" Linkern sind Linkermoleküle, welche Thioharnstoffgruppen, Peptide, Ester oder Disulfide enthalten. Siehe z. B. Quadri et al., (J. of Nuc. Med., Vol. 27, No. 6, 959, Abstract No. 337, Juni 1986), Haseman et al. (J. Nucl. Med. 12 : 455-460 [1986]), and Meares et al. (Int. J. Cancer [Suppl.] UI.S., Vol. 2, 99-102 [1988]).
Die Entfernung des Radioisotops aus dem Wirtskörper (welche auf der Spaltung des Linkers zur Abtrennung des Chelats vom Antikörper beruhen soll) wurde untersucht. Im Vergleich mit Immunkonjugaten mit nicht spaltbaren Linkern war die Entfernung der Radionuklide aus dem Körper im allgemeinen bis zu einem gewissen Grad beschleunigt. Bei Durchführung von Vergleichsversuchen stellte sich heraus, daß die Disulfidbindungen im allgemeinen einer Spaltung unter in vivo Bedingungen unzugänglicher waren als die anderen oben beschriebenen Verbindungen. In der Tat wurde gefunden, daß herkömmliche Disulfidlinker sich in vielen Fällen als zu labil erwiesen, wobei die Chelate aus den Antikörpern so schnell freigesetzt wurden, daß ungenügende Mengen an Immunkonjugat die Ziel stelle erreichten. Bei Verwendung spaltbarer Linker zur Freisetzung von Chelaten aus Immunkonjugaten verbleibt daher ein großer Spielraum für Verbesserungen.
Es besteht nach wie vor ein Bedürfnis nach Verfahren, welche die Festsetzung von Konjugaten aus zielaffinen Proteinen mit diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffen auf Nicht-Zielgeweben verringern. Die Entfernung dieser Wirkstoffe von Nicht-Zielorganen verbessert die Schärfe diagnostischer Bilder und vermindert das Risiko, daß Nicht-Zielgewebe zytotoxischen Wirkstoffen ausgesetzt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die mit der Rückhaltung von Konjugaten mit zielaffinen Proteinen (z. B. Immunkonjugaten) auf Nicht-Zielorganen einhergehenden Probleme können mit einem Verfahren verringert werden, welches die auf dem Nicht-Zielorgan angesiedelten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffe entfernt. Nicht- Zielorgane für die Festsetzung eines Immunkonjugats sind häufig die Leber und Ausscheidungsorgane, d. h. die Niere und Gallenwege, welche es in den Darm ausschütten.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verabreichung an einen menschlichen oder Säugetier-Wirt zur Verfügung, welche ein Konjugat mit einem über einen Linker an ein zielaffines Protein angehefteten Effektorteil enthält und ein Mittel zur Abspaltung, welches bewirkt, daß der Linker im Wirt an einem oder mehreren Orten, welche keine Zielorte sind, abgespalten wird. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einem Verfahren zur selektiven Verminderung der Anhäufung eines Effektorteils (d. h. eines diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffs) verwendet werden. Somit wird also eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, welche selektiv die angesammelten Effektorteile von Nicht-Zielgewebe entfernt, indem es den den Effektorteil des Konjugats an das zielaffine Protein bindenden Linker spaltet. Dies erlaubt die Eliminierung des zuvor an Nicht-Zielgewebe gebundenen Effektorteils aus dem Wirtkörper, während der entsprechende Verbleib des Effektorteils an Zielorten bewirkt wird. Das Mittel zur Spaltung kann die Abspaltung des Linkers mittels selektiver Veränderungen der Gewebs- oder Zellumgebung des Nicht-Zielgewebes, wo sich Immunkonjugat angesammelt hat, bewirken, beispielsweise über Änderung des pH's, einer reduzierenden oder oxidierenden Umgebung, oder indem er einem Enzym ausgesetzt wird. Die Veränderung der im Nicht-Zielgewebe auftretenden Bedingungen beschleunigt die Abspaltung des vorgesehenen besonderen Linkers. Beispiele für Mittel zur Spaltung sind unter anderem Enzyme, Verbindungen, welche das pH erhöhen oder senken oder Reduktionsmittel.
Das Gleichgewicht, in dem sich der Linker an der Spaltstelle befindet, verändert sich in Richtung auf eine Spaltung, verbunden mit einer induzierten Veränderung des Gewebs- oder Zellmilieus in einem oder mehreren Nicht- Zielorganen. Die Spaltung des Linkers, welcher erfindungsgemäß den Effektorteil an das zielaffine Protein des Konjugats bindet, erlaubt die selektive Entfernung des Effektorteils aus Nicht-Zielorganen. Es sind auch Konjugate mit diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffen vorgesehen, welche über Linker an zielaffine Proteine gebunden sind, welche unter den an einem bestimmten Nicht-Zielort vorkommenden oder induzierten Bedingungen gespalten werden können.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verabreichung an einen menschlichen oder Säugetier-Wirt zur Verfügung, welche ein Konjugat mit einem über einen Linker an ein zielaffines Protein angehefteten Effektorteil enthält und ein Mittel zur Abspaltung, welches bewirkt, daß der Linker im Wirt an einem oder mehreren Orten, welche keine Zielorte sind, abgespalten wird. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einem Verfahren zur Verminderung der Anhäufung eines Effektorteils in Nicht- Zielorganen verwendet werden, indem ein Konjugat mit einem an ein zielaffines Protein über einen Linker angehefteten Effektorteil an einen menschlichen oder Säugetier-Wirt verabreicht wird, wobei der Linker selektiv an einem oder mehreren Nicht-Zielorten im Wirt gespalten wird. Ein erfindungsgemäß vorgesehener, abspaltbarer Linker wird infolge zuvor festgelegter Milieuzustände oder vorherbestimmter Änderungen der Milieuzustände abgespalten, wodurch eine selektive Spaltung der Linkergruppen erfolgt, welche dem Zustand oder der Zustandsänderung dieses Gewebs- oder Zellmilieus ausgesetzt sind. Durch Verabreichung eines geeigneten Mittels zur Spaltung können solche Zustandsänderungen induziert werden. Der Linker verbindet einen Effektorteil mit einem zielaffinen Molekül, gewöhnlich Peptiden oder Proteinen. Der Effektorteil ist ein diagnostischer oder therapeutischer Wirkstoff. Beispiele für diagnostische Wirkstoffe sind diagnostisch einsetzbare Radionuklide, Kontrastmittel für kernmagnetische Resonanz, Röntgenkontrastmittel und andere bildgebende Wirkstoffe. Therapeutische Wirkstoffe sind u. a. therapeutisch eingesetzte Radionuklide und Medikamente, wie beispielsweise zytotoxisch wirksame Medikamente (einschließlich Medikamenten gegen Krebs). Die Art des vorgesehenen therapeutischen Wirkstoffs kann gemäß dem Krankheitsbefund des Patienten variieren. Radionuklide können in Form eines stabilen Komplexes, wie beispielsweise eines Chelatkomplexes vorliegen. Vorzugsweise ist das Chelat ein Molekül, welches bei Verabreichung in seiner freien Form schnell in den Harn ausgeschieden wird.
Unter in vivo-Bedingungen bindet sich das zielaffine Molekül an einen erwünschten Zielort. Das zielaffine Molekül kann sich an einen Rezeptor, ein Substrat, eine Antigendeterminante oder an eine andere Bindungsstelle auf einer Zielzelle oder einem Zielgewebe binden. Beispiele für zielaffine Proteine sind u. a. Antikörper, Enzyme (beispielsweise Enzyme der Fibrinolyse), Modifikatoren für biologische Antwort (beispielsweise Interleukine, Interferone, Erythropoietin oder koloniestimulierende Faktoren), Peptidhormone sowie Fragmente von diesen.
Diese Proteine können modifiziert sein, um beispielsweise Varianten oder Fragmente dieser Proteine zu bilden, solange die erwünschte biologische Eigenschaft (d. h., die Fähigkeit an den Zielort zu binden) erhalten bleibt. Die Proteine können unter Verwendung verschiedener Techniken des Genetic Engineerings oder des Protein Engineerings modifiziert werden. Eine andere Art von Modifikation erfolgt über die chemische Modifizierung zielaffiner Proteine, um eine Veränderung des isoelektrischen Punkts des erhaltenen "ladungsmodifizierten" Proteins zu bewirken, wie dies in der parallelen US- Anmeldung mit der Nummer 157,273 mit dem Titel "Alteration of Pharmacokinetics of Proteins by Charge Modification" beschrieben wird. Die Serumhalbwertzeit, die biologische Verteilung, die Immunogenität und andere Eigenschaften von zielaffinen Proteinen können mittels Modifizierung der Ladung des Proteins verändert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das zielaffine Protein ein monoklonaler Antikörper oder ein monoklonales Antikörperfragment. Es wurde eine Anzahl monoklonaler Antikörper (MAk's) entwickelt, welche an einen spezifischen Zelltyp binden, einschließlich MAk's, welche für tumorassoziierte Antigene im Menschen spezifisch sind. Unter der Vielzahl solcher einsetzbarer MAk's sind Anti-TAC, oder andere gegen den Interleukin- 2-Rezeptor gerichtete Antikörper; die gegen das mit menschlichem Melanom assoziierte Proteoglycan von 250 Kilodalton gerichteten 9.2.27 und NR-ML05; das gegen das pancarzinom-Glycoprotein von 37 bis 40 Kilodalton gerichtete NR-LU-10; und das gegen das bisher noch nicht identifizierte tumorassoziierte Antigen gerichtete OVB3. Aus Genetic Engineering- oder Protein Engineering- Verfahren stammende Antikörper können ebenfalls verwendet werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper können ein ganzes Molekül, ein Fragment davon oder ein funktionelles Äquivalent davon sein. Beispiele für Antikörper-Fragmente sind F(ab')&sub2;, Fab', Fab und Fv-Fragmente, welche nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden können oder mittels Genetic Engineering oder Protein Engineering. Gentechnisch hergestellte und als Einzel-Domänen-Antikörper bezeichnete AK's können gleichfalls Verwendung finden.
Zielaffine Proteine dienen dazu, den Effektorteil an einen gewünschten Zielort unter in vivo-Bedingungen zu überführen. Ein Beispiel für solch einen Zielort ist ein Tumor. Zielaffine Proteine sind indes selten vollständig spezifisch gegenüber dem Zielgewebe und ein Teil eines verabreichten Konjugats verteilt sich mittels solcher Mechanismen wie Kreuzreaktionsbindung und unspezifischer Aufnahme auf ein oder mehrere Nicht-Zielgewebe, einschließlich der Aufnahme in exkretorische Organe wie Leber und Niere. Das Konjugat, welches sich auf einem Nicht-Zielgewebe verteilt, enthält den Effektorteil, welcher entweder an das zielaffine Protein gebunden ist, oder ein Abbauprodukt davon (beispielsweise ein Polypeptid-Fragment des Proteins).
Die Gegenwart eines an einem Nicht-Zielort angesiedelten therapeutischen Effektorteils kann unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen und die therapeutische Wirkung des Immunokonjugats herabsetzen. Ist der Effektorteil beispielsweise ein zytotoxisches Medikament oder ein zytotoxisches Radionuklid, dann kann die vorhandene Konzentration des auf normalem Nicht-Zielgewebe angesiedelten Effektorteils sich äußerst toxisch gegenüber diesem Gewebe verhalten.
Falls der belegte Nicht-Zielort die Niere ist, was oft der Fall ist, wenn ein Antikörperfragment oder ein anderes relativ kleines Protein als zielaffines Protein verwendet wird, dann könnte die Gegenwart eines Strahlung aussendenden Isotops in hohen Konzentrationen eine dosisabhängige Toxizität hervorrufen. Wenn darüber hinaus das zielaffine Protein ein an Menschen verabreichter ganzer Maus-Antikörper oder ein Serum-Protein ist, setzt sich das Konjugat oft in der Leber fest. Das Lebergewebe wird somit den zytotoxischen Wirkungen des therapeutischen Effektorteils ausgesetzt.
Die Gegenwart von Konjugaten mit diagnostischen Effektorteilen an Nicht- Zielorten kann die Genauigkeit diagnostischer Verfahren mindern. Beispielsweise können Nicht-Zielorgane mit einem darin gebundenen Effektorteil den Nachweis von Zielorten während diagnostischer bildgebender Verfahren verhindern. Dies trifft insbesondere auf relativ große Nicht- Zielorgane, wie beispielsweise die Leber zu.
Erfindungsgemäß können die mit der Anhäufung der Konjugate an Nicht- Zielorten assoziierten Probleme vermindert werden, indem der Effektorteil des Konjugats vom zielaffinen Protein durch Spaltung des das Konjugat zusammenhaltenden Linkers abgetrennt wird. Die Spaltung des Linkers erfolgt vorzugsweise am Nicht-Zielort und läßt den Effektorteil in relativ hoher Konzentration am Zielort zurück. Als Ergebnis wird im Nicht-Ziel- oder Ausscheidungsorgan der Effektorteil ausgeschieden und das zielaffine Protein oder dessen Abbauprodukte kontinuierlich zurückgehalten. Dies bewirkt eine Abnahme der zytotoxischen Wirkungen im Nicht-Zielorgan, wenn der Effektorteil ein zytotoxischer Wirkstoff ist oder eine Aufhellung des Hintergrunds, wenn der Effektorteil ein Wirkstoff in einem bildgebenden Verfahren ist.
Erfindungsgemäß weist ein Konjugat mit einem besonderen zielaffinen Protein auch einen Linker auf, über welchen ein Effektorteil an das Protein angeheftet wird, wobei der Linker bei den vorliegenden oder an einem oder mehreren Nicht-Zielorten, in welchem sich die zielaffinen Proteine ansammeln, spaltbar ist. Somit wird ein bestimmter Linker anhand der Verteilungseigenschaften der besonderen zielaffinen Proteinkomponente des Konjugats zur Verwendung ausgewählt. Die Nicht-Zielorte, an welchen sich ein besonderes zielaffines Protein ansammelt werden bestimmt und dementsprechend ein Linker ausgewählt.
Die Anhäufungsmuster bestimmter Typen zielaffiner Proteine (beispielsweise bestimmte Typen von Antikörpern und deren Fragmenten) auf Nicht- Zielorganen sind, wie oben bereits dargelegt, bekannt. Die Verteilungsmuster anderer zielaffiner Proteine können unter Einsatz herkömmlicher Verfahren ermittelt werden, z. B. über in vivo-Untersuchungen in Tieren und Menschen. Die problematische Ansiedlung auf Nicht-Zielorganen kann auch während klinischer Versuche ermittelt werden. Sodann wird ein zu verwendender Linker ausgewählt, wobei der Linker unter Bedingungen spaltbar ist, die vorliegen oder doch an einem oder mehreren der Nicht-Zielorte, an welchem das betreffende zielaffine Protein sich ansammelt, induziert werden können. Die Bedingungen am Nicht-Zielort, welche die Spaltung des Linkers begünstigen, können das pH, Enzyme, Reduktionsmittel oder andere mit dem speziellen Nicht-Zielort assoziierte Zustände sein.
Wahlweise können die Bedingungen, unter denen sich der Linker spaltet, am Nicht-Zielort induziert werden. Ein Verfahren, mit welchem die am Nicht- Zielorgan vorliegenden Bedingungen verändert werden können, besteht darin, einem Patienten ein spaltendes Mittel zu verabreichen, welches die am Nicht- Zielort vorliegenden Bedingungen ändert und damit die Spaltung eines Linkers begünstigt, wobei der für den Einsatz ausgesuchte Linker unter den neuen, von dem Mittel induzierten Bedingungen spaltbar ist. Das verabreichte spaltende Mittel kann beispielsweise ein Reduktionsmittel, ein Oxidationsmittel, ein Enzym oder eine Verbindung sein, welche das pH am Nicht-Zielort ändert. Das spaltende Mittel kann zur Spaltung des Linkers direkt auf diesen einwirken, beispielsweise wenn das spaltende Mittel einen Enzym ist und der Linker als Enzymsubstrat dient. Andere spaltende Mittel ändern die an einem oder mehreren Nicht-Zielorten vorliegenden Bedingungen (beispielsweise das pH), wobei der Linker unter den neuen Bedingungen gespalten wird.
In Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie dem speziellen zielaffinen Protein im Konjugat, können die einem menschlichen oder tierischen Wirt verabreichten Konjugate an eine Zelloberfläche binden oder das Konjugat kann in eine Zelle eingeschleust werden. Bestimmte Linker können intrazellulär gespalten werden, beispielsweise werden sie von intrazellulären Enzymen oder von dem sauren pH, welchem der Linker während des Transports in die Zelle in den Endosomen ausgesetzt ist, gespalten. Von Konjugaten innerhalb einer Zelle (einschließlich Nicht-Zielzellen) freigesetzte Radionuklide oder Chelate von Radionukliden können in den Blutkreislauf des Wirts zurückkehren und anschließend aus dem Körper ausgeschieden werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das spaltende Mittel eine Verbindung, welche das pH am Nicht-Zielort absenkt, im allgemeinen auf einen sauren pH-Wert. Wenn die Nicht-Zielorgane die Nieren sind, kann der Harn mittels herkömmlicher Verfahren angesäuert werden, unter Verabreichung von jeder der Vielzahl der Substanzen, welche dafür bekannt sind, daß sie den pH-Wert des Harns absenken (der normalerweise einen pH- Wert in der Nähe des Neutralpunkts aufweist, d. h., einen pH-Wert von ca. 6 bis 8). Ein Beispiel für ein den Harn ansäuerndes Mittel, welches als Spaltmittel verwendet werden kann, ist intravenös verabreichtes Ammoniumchlorid. Falls erwünscht, können zwei oder mehrere unterschiedliche ansäuernde Mittel verwendet werden. Beispielsweise kann, wie weiter unten beschrieben, Methenaminmandelsäure zur weiteren Absenkung des pH-Wertes angesäuerten Harns verabreicht werden. Wenn ein harnansäuerndes Mittel als Spaltmittel verwendet werden soll, wird zur Bildung des zu verabreichenden Konjugats ein bei einem sauren pH einer Spaltung unterliegender Linker verwendet. Der im Sauren spaltbare Linker wird im sauren Milieu von Niere/Harn gespalten und nicht angegriffen, wenn er im Blutkreislauf zirkuliert.
Jeder der Vertreter aus einer Vielzahl von im sauren spaltbarer Linker kann verwendet werden. Der pH-Wert, auf den das pH des Harns zur Abspaltung des Linkers abgesenkt werden muß, variiert entsprechend dem speziell eingesetzten Linker. Beispiele für solche Linker werden in den US- Patentschriften mit den Nummern 4,569,789 und 4,631,190 und von Blattler u. a. in Biochemistry, 24 : 1517-1524 (1985) beschrieben. Eine andere Art von bei saurem pH spaltbaren Linkern (einschließlich in schwach saurem pH) wird in der parallelen, am 02. Dezember 1987 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Nummer 127,656 und dem Titel "Cleavable Immunoconjugates for the Delivery and Release of Agents in Native Form" beschrieben. Die in der USSN 127,656 beschriebenen Linker weisen die folgende Formel auf:
worin bedeuten:
Q: einen chemisch reaktiven Rest (d. h. ein konjugiertes System auf dem Protein);
W: eine Methylen-Methylenoxy- oder Methylencarbonyl-Gruppe oder eine Kombination davon;
n: 0 bis 10;
Y: O, S oder NR', wobei R' eine Alkylgruppe von 6 oder weniger C- Atomen ist;
n': 1 bis 2; und
X: H, eine Alkylgruppe mit 6 C-Atomen oder weniger, oder eine Alkoxygruppe von 6 C-Atomen oder weniger.
Ein Effektorteil mit einer verfügbaren nukleophilen Gruppe wird mit dem Linker reagieren gelassen, worauf der Effektorteil über Addition an die C-C- Doppelbindung des Linker-Ringsystems kovalent an den Linker gebunden wird. Beispiele für verfügbare nukleophile Gruppen umfassen freie Sulfhydryl-, freie Amino- und freie Hydroxylgruppen. Falls der Effektorteil natürlicherweise keine verfügbare nukleophile Gruppe aufweist, kann zur Erlangung einer solchen Gruppe diese ansynthetisiert (oder mit herkömmlichen verfügbaren Derivatisierungsmitteln derivatisiert) werden.
Das konjugierte System Q des Proteins ist eine Gruppe, welche mit einer Gruppe auf einem zielaffinen Protein zur Anbindung des Linkers reagiert.
Konjugierte Systeme auf Proteinen werden weiter unten erörtert. Unter Verwendung dieser Linker gebildete Konjugate werden durch die folgende Formel wiedergegeben:
worin bedeuten:
A: einen Antikörper, ein anderes zielaffines Protein oder ein Fragment davon;
Z: den Effektorteil und die anderen Zeichen wie oben beschrieben.
Die Linker in diesen Konjugaten lassen sich bei schwachsaurem pH abspalten (d. h., sie werden wirksam bei einem pH-Wert von ca. 5 gespalten). Die Spaltung des Linkers sorgt für die Freisetzung des Effektorteils in seiner nativen Form (d. h. ohne den daran angehefteten Linker).
Ester enthaltende Linker können auch in Verbindung mit die Senkung des pH- Wertes von Harn bewirkenden spaltenden Mitteln eingesetzt werden. Die Aktivität der Esterasen in der Niere wird bei saurem pH erhöht und daher werden die Linker in Konjugaten, welche in den Nieren angesiedelt sind, besser gespalten, wenn ein den Harn ansäuerndes Mittel verabreicht wird.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das spaltende Mittel eine Verbindung, welche den pH-Wert am Nicht-Zielort anhebt, im allgemeinen auf einen basischen pH. Wenn die Nicht-Zielorgane die Nieren sind, kann der pH- Wert des Harns mit Verfahren wie beispielsweise intravenöser Verabreichung eines Salzes der Ascorbinsäure (z. B. Natriumascorbat) oder einem Bicarbonat wie beispielsweise Ntriumbicarbonat angehoben werden. Die Verabreichung dieser Verbindungen als spaltende Mittel wirkt sich im wesentlichen nur auf den pH-Wert des Harns aus, weil die Pufferkapazität des Blutes jede pH-Wert- Änderung innerhalb eines engen Bereichs einregelt. Auch die selektive Basenausscheidung im Harn dient der Regulierung des pH-Wertes. Der vorgesehene Linker ist ein Linker, welcher einer Spaltung bei alkalischen Bedingungen unterliegt. Nach intravenöser Verabreichung dieser spaltenden Mittel erhält man als Ergebnis eines in der Niere angesiedelten Immunkonjugats mit einem im basischen Milieu abspaltbaren Linker die Ausscheidung des in der Niere angesiedelten Effektorteils, ohne eine wesentliche Spaltung der zirkulierenden Immunkonjugate oder der am Zielort befindlichen Immunkonjugate. Bei basischem pH spaltbare Linker sind u. a. Linker mit Disulfidbindungen oder Estern.
Unter in vivo-Bedingungen können auch Linker mit Estergruppen der Spaltung durch natürlich vorkommende Esterasen unterliegen. Einige esterhaltige Linker können auch durch zirkulierende Plasmaesterasen (beispielsweise Cholinesterase) gespalten werden. So können beispielsweise Linker von esterhaltigen Molekülen abstammen, welche einer Hydrolyse im Plasma unterliegen und bestimmte Derivate von Glykolainiden (2-Hydroxyacetamid), wie sie von Bundgard und Nielsen in J. Med. Chem. 30 (3), 451-454, 1987 beschrieben werden, einschließen. Diese Moleküle können zur Verwendung als Linker modifiziert werden, beispielsweise durch Anheften von Gruppen, welche mit Effektorteilen und zielaffinen Proteinen an den Molekülenden reagieren. Beispiele solcher Linker werden in der folgenden Formel wiedergegeben:
worin bedeuten:
R: eine für die Anheftung eines Effektorteils an den Linker verwendbares konjugiertes System;
R&sub1;: Wasserstoff oder eine niedere Alkyl- oder substituierte niedere Alkylgruppe;
Q: ein konjugiertes System eines Proteins;
q: 0 bis 5; und
n: mindestens 2, vorzugsweise 2 bis 5.
Die niederen Alkylgruppen weisen im wesentlichen 1 bis 6 C-Atome auf. Geeignete Substituenten an den Alkylgruppen können u. a. Hydroxyl- oder Amingruppen sein. Die Wahl von q hängt teilweise vom Effektorteil ab und davon, ob eine lange Methylenkette (d. h. ein höherer Wert für q) während der Reaktion des besonderen Effektorteils mit dem Linker die Gefahr für eine sterische Hinderung herabsetzt. Wenn der Effektorteil und der Linker als einzelne Moleküle synthetisiert werden, kann q eine kleinere ganze Zahl sein.
Ein Konjugat mit einem empfindlich auf Plasmaesterase reagierenden Linker kann lokal in den Bereich des Zielortes injiziert oder in das Lymphsystem verabreicht werden. Sich im Kreislauf verbreitende Konjugate können an ihrer Estergruppe von Esterasen des Plasmas gespalten werden und der Effektorteil aus dem Körper über renale oder hepatische Ausscheidung entfernt werden. Lokal oder in das Lymphsystem verabreichte Konjugate können Linker umfassen, die vollständig gespalten werden (d. h., sehr labil sind). Alternativ dazu kann ein Estergruppen enthaltender Linker, der im Blutkreislauf nicht genügend gespalten wird, an einem Nicht-Zielorgan einer Spaltung durch Esterasen unterliegen (beispielsweise Estrasen in der Niere oder Leber). Solche Linker enthaltende Konjugate können intravenös verabreicht werden, da die relative Stabilität des Linkers im Serum dem intakten Konjugat das Erreichen der Zielzellen unter in vivo-Bedingungen ermöglicht.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden von Glykolamiden stammende Linker zur Bildung von erfindungsgemäßen Konjugaten verwendet, wobei die Linker Ester enthalten und genügend stabil für eine intravenöse Verabreichung an Patienten sind. Beispiele für solche Linker weist die nachstehende allgemeine Formel auf:
worin Q eine das Protein bindende Gruppe darstellt, m Werte zwischen 1 und 6 annimmt, vorzugsweise 1 oder 2, n mindestens 2 ist (vorzugsweise 2 bis 5), q Werte von 0 bis 5 (wie zuvor beschrieben) annimmt und p Werte von 1 bis 4, vorzugsweise 1 oder 2. R gibt eine Gruppe wieder, welche mit einem Effektorteil reagiert, um den Linker daran zu binden. Jeder Vertreter für R' wird unabhängig ausgewählt aus Wasserstoff und einer niederen Alkylgruppe, in welcher mindestens ein (vorzugsweise ein oder zwei) R'-Substituenten niedere Alkylgruppen sind, welche jeweils zwischen 1 und 6 C-Atomen enthalten, vorzugsweise 1 bis 2 C-Atome. Alternativ können der Linker und der Effektorteil als ein einziges Molekül chemisch synthetisiert werden, in welchem Fall R den an den Linker gebundenen Effektorteil darstellt. Zu den Effektorteilen, welche über solche Linker an ein zielaffines Protein gebunden sein können, gehören die Metallchelat-Radionuklide oder andere, unten beschriebene radioaktiv markierte Moleküle.
Diese Linker unterliegen an der von dem Pfeil angezeigten Stelle einer Spaltung. Wenn diese Linker enthaltenden Konjugate sich in der Leber oder Niere ansiedeln, dann spalten in diesen Organen vorkommende Esterasen den Linker, wodurch der Effektorteil zur Ausscheidung aus dem Körper freigesetzt wird. Falls erwünscht, kann ein spaltendes Mittel, welches den pH-Wert des Harns auf basisches Niveau anhebt, an den Wirt verabreicht werden, um die Spaltung des Linkers in der Niere zu beschleunigen. Alternativ kann ein den Harn ansäuerndes Mittel verabreicht werden, um die enzymatische Aktivität der Esterasen in der Niere zu erhöhen.
Ein weiteres Beispiel eines erfindungsgemäßen einsetzbaren, einen Ester enthaltenden Linkers ist ein Linker der Formel:
in welcher m 0 oder 1, q 1 bis 3 und n mindestens 2 (vorzugsweise 2 bis 5) sind. R gibt eine für die Anheftung eines Effektorteils an den Linker verwendbare Bindungsgruppe wieder. Q steht für eine das Protein bindende Gruppe, welche eine funktionelle Gruppe darstellt, welche mit einem Protein zu dessen Bindung an den Linker reagiert. Weitere Protein bindende Gruppen werden weiter unten beschrieben. Der Linker ist labiler, wenn q 1 ist, als wenn mehr als eine Methylengruppe zwischen die beiden Estergruppen zu liegen kommt, jedoch sind diese Linker zur intravenösen Verabreichung von solche Linker enthaltenden Konjugaten im allgemeinen genügend stabil.
Wie oben erörtert, sind Konjugate mit an Antikörper über bestimmte esterhaltigen Linker gebundenen Radionuklid-Chelaten in vivo verabreicht worden und die Ausscheidung der Chelate wurde aufgezeigt (siehe z. B. oben in Quadri u. a., Haseman u. a. und Mears u. a.). Es verbleibt jedoch noch großer Spielraum für Verbesserungen des Chelatanteils, welcher unter Einwirkung von Esterasen auf die von diesen Autoren beschriebenen besonderen Linker freigesetzt werden. Gemäß vorliegender Erfindung wird ein den pH-Wert an einem Nicht-Zielort auf basisches Niveau anhebendes spaltendes Mittel verabreicht, um den Prozentsatz dieser oder anderer Ester enthaltenden Linker, welche zur Freisetzung der Effektorteile aus dem Nicht- Zielorgan gespalten werden, zu erhöhen. Die oben beschriebenen spaltenden Mittel, welche den pH-Wert des Harns erhöhen, können verabreicht werden, um die Abspaltung der Linker von in den Nieren angesiedelten Konjugaten zu beschleunigen.
Alternativ können den Harn ansäuernde Wirkstoffe verabreicht werden, um die Aktivität von Esterasen in der Niere zu erhöhen.
Ein Linker mit einer Disulfidbindung kann zusammen mit einem spaltenden Mittel verwendet werden, welches eine Verbindung ist, die das pH in einem Nicht-Zielorgan anhebt. Wahlweise kann das spaltende Mittel auch ein Reduktionsmittel sein. Verbindungen, welche den pH-Wert des Harns auf basisches Niveau anheben, wurden bereits oben erörtert und können verwendet werden, wenn Nieren die Nicht-Zielorgane sind.
Ist das Nicht-Zielorgan die Leber, dann kann ein Linker verwendet werden, welcher in einem stark reduzierenden Milieu abgespalten wird, um die in der Leber angesiedelten Effektorteile zu entfernen. So spaltet beispielsweise die relativ hohe Konzentration des natürlich in der Leber vorkommenden Reduktionsmittels Glutathion Linker mit labilen Disulfidbindungen.
Alternativ bewirkt die Verabreichung eines spaltenden Mittels, welches ein Reduktionsmittel ist, wie beispielsweise Glutathion, Cystein, N-Acethylcystein oder deren Derivate, die Spaltung eines eine Disulfidbindung enthaltenden Linkers vorzugsweise in den Nieren und/oder der Leber, in Abhängigkeit von der Verteilung des jeweiligen Reduktionsmittels und der Art der Verabreichung. Intravenös verabreichte Reduktionsmittel können sich in den Nieren ansammeln, während oral verabreichte Reduktionsmittel, wie beispielsweise N-Acethylcystein sich zunächst in der Leber anreichern, aber auch in den Nieren.
Die Disulfidbindung sollte genügend stabil sein, um zu gewährleisten, daß das intakte Konjugat in vivo den gewünschten Zielort erreicht, jedoch auch labil genug, um im Nicht-Zielorgan von einem Reduktionsmittel gespalten werden zu können. Die Stabilität eines Disulfid-Linkers läßt sich gegebenenfalls erhöhen, indem man eine oder mehrere "hindernde Gruppen" (beispielsweise u. a. Methyl- oder Phenylgruppen) an den Linker in der Nähe der Disulfidbindung anbringt.
Sterisch gehinderte oder stabilisierte Disulfid-Linker sind von Blakey und Thorpe eingesetzt worden (Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals, Band 1, Nr. 1, 1-17 [1988]), um die A-Kette von Ricin (einem toxischen Protein) an einen ganzen Antikörper zu binden. Die hindernden Gruppen können in die Linker-Kette insertiert oder an die Kette angeheftete Substituenten sein. Linker mit sterisch gehinderten Disulfiden lassen sich durch die folgende Formel darstellen:
in welcher n jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet, vorzugsweise von 1 bis 4; Q eine Protein-Konjugatgruppe ist und R&sub1; entweder ein Phenylring (eine hindernde Gruppe) oder
ist, in welcher R&sub2; eine Methylgruppe oder ein Phenylring ist (hindernde Gruppe), R&sub3; ein Phenylring und m eine ganze Zahl von 0 bis 1.
Beispielsweise kann u. a. ein sterisch gehinderter Disulfid-Linker eine der folgenden Strukturen aufweisen:
in denen n Werte von 1 bis 4 annehmen kann. Die Phenyl- und Methylgruppen erhöhen die Stabilität der Disulfidbindung. Das sterisch gehinderte Disulfid sorgt für eine bessere Serumstabilität des Konjugats und erlaubt somit eine selektivere Spaltung in Nicht-Zielorganen, wo sich die Bedingungen verändern und/oder verabreichte Wirkstoffe ansammeln können.
Linker, die von einem natürlicherweise in einem Nicht-Zielorgan vorkommenden Enzym gespalten werden können, können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispiele dafür sind die oben beschriebenen, mittels Esterase spaltbaren Linker. Alternativ kann ein Enzym als spaltender Wirkstoff an den Wirt verabreicht werden. Das Enzym kann eines sein, welches im Wirt natürlicherweise nicht vorkommt. Jedes Enzym ist geeignet, welches den Gehalt an in einem oder mehreren Nicht-Zielorganen angesiedeltem Effektorteil verringert, indem es zur Freisetzung des Effektorteils einen Linker spaltet. Beispielsweise kann ein Enzym verwendet werden, das aus dem Körper über die Nieren entfernt wird. Das an den Patienten verabreichte Konjugat enthält einen von dem Enzym spaltbaren Linker und die Abspaltung des Linkers erfolgt somit in den Nieren.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das spaltende Mittel ein proteolytisches Enzym (d. h. eine Protease) und der Linker ist ein Oligopeptid, der als Substrat für das Enzym dient (d. h., er wird von dem proteolytischen Enzym gespalten). Die Protease sollte kein Enzym sein, welches für den Wirt schädlich ist, indem es essentielle Proteine im Wirt abbaut, beispielsweise im Blutkreislauf des Wirts.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Konjugat der folgenden Formel zur Verfügung:
R--L--P
in welcher R einen Effektorteil darstellt, P ein zielaffines Protein oder eine das Protein bindende Gruppe und L einen Oligopeptid-Linker, welcher von einer Serin-Protease nicht menschlichen Ursprungs gespalten wird.
Ein verwendbares proteolytisches Enzym ist eine Serin-Protease, welche Substrate mit einem verfügbaren Histidin-Rest spaltet (d. h., ein in einer Position befindlicher Histidin-Rest, welcher die Bindung der Serin-Protease an das Substrat ermöglicht). Dieses Enzym nicht menschlichen Ursprungs ist eine Mutante von Subtilisin, welche mittels der Protein Engineering-Technik hergestellt wurde.
Die Serin-Protease-Mutante wurde erhalten, indem ein Histidin-Rest in Subtilisin (Aminosäure Nr. 64) gegen einen Alanin-Rest ausgetauscht wurde. Dieser Histidin-Rest bildet zusammen mit Serin in Position 221 und Asparginsäure in Position 32 das aktive Zentrum des Subtilisins. Die Serin- Protease-Mutante erfordert für seine enzymatische Aktivität einen in einem Substrat verfügbaren Histidin-Rest. Gegenüber normalen Subtilisin-Substraten ist die Enzym-Mutante inaktiv, spaltet aber ein Polypeptid (oder Fragment davon) an der Amidbindung, welche zu einem Histidin-Rest um einen Rest in Richtung auf das C-terminale Ende versetzt ist, sofern sich diese Bindung nicht zwischen zwei Prolinresten befindet.
Erfindungsgemäß weist ein in Verbindung mit dieser Serin-Protease-Mutante verwendeter Oligopeptid-Linker einen Histidin-Rest in einer Position auf, welche bewirkt, daß der Linker als Substrat erkannt und von der Protease gespalten wird. Es ist davon auszugehen, daß das Enzym aus dem Körper über die Nieren entfernt wird und ein wesentlich höherer Prozentsatz des Linkers von in Nieren angesiedelten Konjugaten gespalten wird, als bei Konjugaten, welche sich an einem Zielort, wie beispielsweise einen Tumor ansiedeln.
Der Linker hat mindestens eine Länge von 10 Aminosäure-Resten, enthält keine Prolin-Reste, bildet keine Sekundärstruktur aus und hat zwei oder drei Histidin-Reste über ungefähr drei oder mehr Aminosäure-Reste voneinander getrennt. Ein Beispiel für einen geeigneten Linker ist ein Oligopeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Thr-Val-Asn-His-Tyr-Arg-Thr-Val-Asn-His-Tyr-Arg-
Konjugatgruppen, eine zur Reaktion mit einem Effektorteil und die andere zur Reaktion mit einem Protein, können an entgegengesetzten Enden des Linkers angeheftet sein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine anorganische Redox-Reaktion zur Freisetzung eines Effektorteils eingesetzt. Wenn ein Konjugat mit bestimmten an ein zielaffines Protein angehefteten Radionukliden aus Metallchelaten sich in den Nieren ansiedelt, kann ein den pH-Wert des Harns erhöhendes spaltendes Mittel verabreicht werden, um die Freisetzung des Radionuklidmetalls aus dem Chelat zu beschleunigen. Die Freisetzung des Radionuklidmetalls erfolgt über die Spaltung der Bindungen zwischen dem Radionuklidmetall und den Donoratomen im Chelat. Man glaubt, daß eine Oxidation diese Bindungen spaltet und die in den Nieren induzierten basischen Bedingungen durch die Verabreichung des spaltenden Mittels diesen Oxidationsvorgang beschleunigen.
Die Wirksamkeit dieses Verfahrens zur Freisetzung des Effektorteils hängt von Faktoren wie dem Oxidationspotential des Radionuklids und der chemischen Struktur des Chelats ab. Ein Beispiel dieser Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Chelat, in welchem ein aus ¹&sup8;&sup8;Re und ¹&sup8;&sup6;Re ausgewähltes Radionuklidmetall an vier Donoratome gebunden wird (drei N-Donoratome und ein S-Donoratom) in einem "N&sub3;S"-Chelat der folgenden Struktur:
in welcher M ein Radionuklid des Rheniums (beispielsweise ¹&sup8;&sup8;Re oder ¹&sup8;&sup6;Re) ist, Q eine das Protein bindende Gruppe, n eine ganze Zahl von 2 bis 4, wobei jede X-Gruppe unabhängig voneinander aus Sauerstoff (d. h. = =O) und H&sub2; ausgewählt ist. Der Substituent -(CH&sub2;)n-Q kann, wie oben gezeigt, eher an eines der C-Atome als an das N-Atom gebunden sein. Diese N&sub3;S- Chelatverbindung wird weiter unten näher beschrieben.
Bei Erhöhung der Anzahl der "X"-Substituenten, welche Sauerstoff sind, nimmt im allgemeinen die Stabilität des Chelates zu (d. h., die Stabilität der die Radionuklide im Chelat haltenden Bindungen). Die Zahl der "X"- Substituenten, welche Sauerstoff sind, sollte so gewählt werden, daß das Chelat einerseits genügend stabil ist, um Radionuklide an den Zielort zu befördern, aber andererseits genügend labil, um die Freisetzung des Radionuklids am Nicht-Zielort zu gewährleisten. Vorzugsweise sind nur einer oder zwei X- Substituenten Sauerstoff.
Wenn Konjugate mit solchen Chelaten sich in den Nieren ansiedeln, wird eines der oben beschriebenen spaltenden Mittel, welche den pH-Wert des Harns auf ein basisches Niveau angeben, dem Wirt verabreicht. Die basischen pH- Bedingungen begünstigen die Freisetzung des Radionuklids aus dem Chelat. In dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung bedeutet "Spaltung des Linkers" die Spaltung der kovalenten Bindungen zwischen dem Radionuklid- Metall und den Donoratomen des Chelats. Infolge Oxidation werden die Bindungen gespalten, was im basischen pH-Bereich beschleunigt wird. Das Metall des Radionuklids wird dadurch freigesetzt und aus dem Körpers des Wirts entfernt.
Der Verlust von ¹&sup8;&sup6;Re oder ¹&sup8;&sup8;Re aus radioaktiv markierten Antikörpern (Antikörper mit einem daran angehefteten Rhenium-Radionuklid-Metall- Chelatkomplex) bei erhöhtem pH wurde beobachtet. Während er bei einem pH-Wert von 7,4 noch stabil ist, erfolgt daher bei Behandlung mit einem Carbonatpuffer bei pH 10 ein Verlust an radiaktivem Rhenium. Ein größerer Effekt wurde mit Re-186/-188 als mit Tc-99m erzielt, was mit dem größeren Oxidationspotential des reduzierten Rheniums im Vergleich mit Techrietium übereinstimmt. Die Verwendung von Chelaten mit Triamidthiolat (N&sub3;S) ergab einen größeren Verlust an Rhenium bei einem niedrigeren (aber immer noch basischen) pH-Wert als bei Chelaten mit Diamiddithiolat (N&sub2;S&sub2;). Vergleiche bei gleichhohem pH-Wert zeigten eine schnellere Freisetzung von Rhenium aus den N&sub3;S-Chelaten.
Bei einem pH-Wert von 7,4 in Gegenwart von phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurde ein langsamer Verlust von Rhenium aus radioaktiv markierten Antikörpern beobachtet. Dieser Verlust wurde von Serum, Serumalbumin und dem Chelatbildner DTPA drastisch vermindert. Diese Stabilisatoren legen die Vermutung nahe, daß Spurenmetalle die Oxidation des Rheniums zu Perrhenat (welches keine stabilen Komplexe bildet) katalysiert, da die Chelierung von Metallen, wie beispielsweise Eisen mittels DPA oder anderen Stabilisatoren den Oxidationsvorgang stört.
Perrhenat wird, selbst in einem größeren Ausmaß als Tc-99m-Pertechnetat, vor allem im Harn ausgeschieden. Somit kann erwartet werden, daß Re-186/-188 als Perrhenat in der Niere freigesetzt wird, um primär im Harn ausgeschieden zu werden.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein Linker ausgewählt werden, der selektiv im Nicht-Zielorgan spaltbar ist, d. h. der Linker wird unter den vorliegenden (oder vom spaltenden Mittel induzierten) Bedingungen im Nicht-Zielorgan in größerem Ausmaß als in Zielgeweben gespalten. Wird beispielsweise ein in basischem Milieu spaltbarer Linker verwendet, dann begünstigt der zur Anhebung des pH-Wertes im Harn verabreichte Wirkstoff die selektive Spaltung des Linkers in den Nieren. Der Wirkstoff hebt den pH-Wert am betreffenden Zielort vorzugsweise nicht an, so daß der Effektorteil an den Zielort gebunden bleibt.
"Selektive Spaltung" im Nicht-Zielgewebe bedeutet, daß der Linker nur an einem oder mehreren Nicht-Zielgeweben, oder zumindest in einem größeren Ausmaß im Vergleich mit dem Zielgewebe gespalten wird. Eine solche selektive Spaltung ist besonders dann erwünscht, wenn es von Bedeutung ist, daß der Effektorteil an das zielaffine Protein am Zielort angeheftet bleibt (wenn der Effektorteil beispielsweise ein diagnostisches Mittel ist).
Alternativ dazu kann die Spaltung des Linkers sowohl am Nicht-Zielort als auch am Zielort erwünscht sein, wenn ein besonderer therapeutischer Effektorteil dann biologisch aktiver ist, wenn er vom zielaffinen Protein abgelöst wird. Während therapeutische Radionuklide ohne Aufnahme in die Zielzellen einen zytotoxischen Effekt ausüben, können bestimmte Wirkstoffe (beispielsweise Arzneistoffe) therapeutisch effektiver sein, wenn sie vom zielaffinen Protein losgelöst werden (infolge Freisetzung an sich, so daß das Arzneimittel in seiner nativen Form vorliegt, oder infolge der folgenden Internalisation).
In solchen Fällen kann ein Linker ausgesucht werden, welcher sowohl an den Zielorten als auch in einem Nicht-Zielorgan unter Bedingungen spaltbar ist, welche vorliegen oder induziert werden können. Beispielsweise kann ein im Sauren spaltbarer Linker verwendet werden, welcher im saueren Milieu an einem Zielort in einer Tumorzelle abgespalten wird, so daß ein therapeutisches Mittel von einem Antikörper am Zielort freigesetzt wird. Somit braucht das Immunkonjugat zu seiner Wirksamkeit nicht an jede Zelle gebunden oder internalisiert zu werden. Wird das Immunkonjugat internalisiert, dann entläßt alternativ dazu das saure Milieu des Rezeptosoms/Endosoms/Lyosoms den Effektorteil in die Zelle. Die Spaltung des Linkers in den Nieren (Nicht- Zielorgane) kann, wie oben beschrieben, durch Ansäuern des Patientenharns vervollständigt werden.
Jeder der oben beschriebenen spaltbaren Linker kann zur Anheftung einer Vielzahl von Effektorteilen an zielaffine Proteine verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Effektorteil ein diagnostisches Mittel. Jedes geeignete- bekannte diagnostische Mittel kann verwendet werden, einschließlich aber nicht ausschließlich den diagnostischen Radionukliden, wie beispielsweise &sup9;&sup9;mTc, &sup9;&sup7;Ru, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²³I, &sup7;&sup6;Br, ²&sup0;³Pb, ¹&sup8;F oder &sup6;&sup4;Cu; Kontrastmittel bei der Bildgebung durch kernmagnetische Resonanz; Röntgenkontrastmittel und andere diagnostische bildgebende Mittel. Diese Wirkstoffe sind mit externen Mitteln (d. h. nichtinvasiven Mitteln) nachweisbar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Effektorteil ein therapeutisches Mittel. Geeignete therapeutische Mittel sind therapeutisch wirksame Radioisotope und therapeutische Arzneimittel (einschließlich aber nicht ausschließlich Mittel gegen Krebs).
Die therapeutischen Radioisotope sind u. a.: ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup8;&sup6;Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹&sup0;&sup9;Pd, &sup6;&sup7;Cu, ¹³¹J, ²¹¹At, ¹&sup0;&sup5;Rh, ¹&sup9;&sup8;Au, ¹&sup9;&sup9;Au und &sup7;&sup7;Br. Beispiele für zytotoxische oder
antineoplastische Arzneimittel sind Methotrexat, Pyrimidin-Analoge, wie beispielsweise Fluorouracil und Desoxyuridin, Cytosinarabinosid, Purin- Analoge, wie beispielsweise Thioguanin, Mercaptopurin und Azathiopurin, Vincaalkaloide, wie beispielsweise Vincristin und Vinblastin, Actinomycin D, Daunorubicin, Doxorubicin und andere Antracyclinderivate, Bleomycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Platin-Derivate und Stickstoffiost-Verbindungen, wie beispielsweise L-Phenylalanin-Lest und Cyclophosphamid.
Die Radionuklide (sowohl diagnostische als auch therapeutische) werden im allgemeinen über ein bindendes Molekül gebunden. Das Radionuklid kann beispielsweise in Form eines stabilen Komplexes, wie beispielsweise ein Chelat vorliegen, welches nach bekannten Verfahren hergestellt werden kann. Eine weitere Art eines bindenden Moleküls ist ein kleines Molekül, an welches ein Radionuklid über eine einzelne kovalente Bindung stabil gebunden werden kann.
Eine Anzahl von Chelat-Bildnern (oder davon abstammende Radionuklid- Metallchelate) können an zielaffine Proteine unter Verwendung der oben beschriebenen spaltbaren Linker angeheftet werden. Unter den bekannten Chelat-Bildnern befinden sich die Diamiddimercaptid (N&sub2;S&sub2;)-Verbindungen, welche dazu verwendet werden, mit verschiedenen Metall-Radionukliden mit diagnostischer oder therapeutischer Verwendung einen Chelat-Komplex zu bilden (siehe europäische Patentanmeldung, veröffentlicht unter der Nummer 188,256 oder US-Patente mit den Nummern 4,444,690 und 4,670,545). Als N&sub3;S-Chelat-Bildner bekannte Verbindungen können ebenfalls Verwendung finden (siehe Fritzberg u. a. J. Nucl. Med. 27 : 1(1986) und europäische Patentanmeldung, veröffentlicht unter der Nummer 173,424). Ein weiterer bekannter Chelat-Bildner ist Diethylentriaminpentaessigsäure (UFPA), welches von Fritzberg in J. Nuc. Med. Tech., Band 12, Nr. 4, Dezember 1984 und in dem US-Patent mit der Nummer 4,652,440 beschrieben ist. Weitere Radionuklid-Metallchelat-Verbindungen werden in den US-Patenten mit den Nummern 4,287,362; 4,421,735 und 4,678,667 beschrieben. Andere Chelat- Bildner mit einer Vielzahl chemischer Strukturen sind bekannt und können an die zielaffinen Proteine über einen der oben beschriebenen Linker angeheftet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Chelat-Bildner insgesamt mindestens vier aus Stickstoff und Schwefel ausgewählte Donoratome Donoratome sind solche Atome, die zu den Radionuklid-Metallen zur Bildung des Chelats Bindungen ausbilden. Ein Beispiel für einen solchen Chelat-Bildner ist ein "N&sub2;S&sub2;,,-Chelat-Bildner mit zwei Stickstoff- und zwei Schwefel- Donoratomen, wie beispielsweise eine Verbindung der folgenden Formel:
in welcher n eine Zahl von 1 bis 4 (vorzugsweise 2) ist, Z eine bindende Gruppe (zur Reaktion mit einem erfindungsgemäßen spaltbaren Linker), R jeweils unabhängig voneinander ausgewählt ist aus = =O und H&sub2; und T eine Schutzgruppe für den Schwefel ist.
Verbindungen dieser Formel sind u. a. in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 188,256 und in der parallelen US- Anmeldung mit der Nummer 065,017, eingereicht am 19. Juni 1987, mit dem Titel "Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy" beschrieben.
T bedeutet jede brauchbare Schutzgruppe für Schwefel und kann jeweils die gleiche oder eine unterschiedliche Schutzgruppe sein. Zusammen mit dem Schwefelatom, an welche sie gebunden ist, bedeutet jedes T eine eine Hemithioacetal-Gruppe bildende Schutzgruppe der Formel:
in welcher R³ eine niedere Alkylgruppe, vorzugsweise mit zwei bis fünf C- Atomen und R&sup4; eine niedere Alkylgruppe, vorzugsweise mit einem bis drei C- Atomen sind. Alternativ können R³ und R&sup4; zusammen mit dem in der Formel gezeigten C-Atom und O-Atom einen nichtaromatischen Ring bilden, vorzugsweise mit drei bis sieben C-Atomen zusätzlich zu den in der Formel gezeigten Kohlenstoff- und Sauerstoffatomen. R&sup5; bedeutet H oder eine niedrige Alkylgruppe, wobei die Akylgruppe vorzugsweise ein bis drei C-Atome umfaßt. Beispiele für solche bevorzugten Hemithioacetale sind u. a.:
Tetrahydrofuranyl
2-Methyl-tetrahydrofuranyl
Tetrahydropyranyl
Ethoxyethyl
2-Methyl-tetrahydropyranyl
Andere Hemithioacetal-Schutzgruppen für Schwefel lassen sich aus Zuckern, wie beispielsweise Monosacchariden ableiten. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Schutzgruppe für Schwefel ein Monosaccharid mit fünf oder sechs Kohlenstoffatomen, oder ein Derivat davon. Die Verwendung dieser Schutzgruppen für Schwefel erhöht die Wasserlöslichkeit der Chelat-Bildner. In den folgenden Formeln werden Beispiele für solche Schutzgruppen wiedergegeben, worin das Schwefel-Donoratom des Chelat-Bildners, an welches die Schutzgruppe angeheftet ist, ebenfalls gezeigt wird:
von D-Glucose stammend
von D-Galactose stammend
von L-Rhamnose stammend
von D-Xylose stammend
Der N&sub2;S&sub2;-Chelat-Bildner kann vor oder nach seiner Anheftung an das zielaffine Protein radioaktiv markiert werden, um ein Radionuklid-Metall-Chelat der folgenden Formel zu bilden:
in welcher M ein Radionuklid-Metall oder ein Oxid davon bedeutet und die anderen Symbole die oben wiedergegebene Bedeutung haben.
Ein weiteres Beispiel für einen einsetzbaren Chelat-Bildner ist eine "N&sub3;S"- Verbindung mit drei N-Donoratomen und einem S-Donoratom, so z. B. eine Verbindung der folgenden Formel:
in welcher bedeuten:
T: eine Schutzgruppe für den Schwefel (wobei S-T, wie oben für die N&sub2;S&sub2;- Verbindungen beschrieben, vorzugsweise eine Hemithioacetal-Gruppe darstellt);
R: jeweils unabhängig voneinander H&sub2; oder = = O;
R': jeweils unabhängig voneinander einen Substituenten, ausgewählt aus Wasserstoff, eine Nicht-Alkylseitenkette einer Aminosäure, außer Cystein, Alkyl, geminales Dialkyl und -(CH&sub2;)n-Z;
Z: -COOH oder eine bindende Gruppe (zur Reaktion mit einem der oben beschriebenen spaltbaren Linker);
m: 0 oder 1, vorausgesetzt, daß mindestens ein m den Wert 1 annimmt;
n: eine ganze Zahl von 1 bis 4; und
R'': Wasserstoff, (CH&sub2;)n-Z oder eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren daran substituierten polaren Gruppen;
wobei die Verbindung mindestens eine (CH&sub2;)n-Z-Gruppe ausweist.
Die radioaktive Markierung des N&sub3;S-Chelat-Bildners ergibt ein Radionuklid- Metall-Chelat der folgenden Formel:
in welcher M für ein Radionuklid-Metall oder ein Oxid davon steht und die anderen Symbole die oben beschriebene Bedeutung haben.
Verfahren zur Synthese verschiedener N&sub3;S-Chelat-Bildner sind bekannt (siehe beispielsweise europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 173,424 und US-Patentanmeldung mit der Nummer 172,004, eingereicht am 23. März 1988 mit dem Titel "Metal-Radionuclide-Labeled Proteins and Glycoproteins for Diagnosis and Therapy").
Andere Chelat-Bildner können unterschiedliche Kombinationen von Donoratomen aufweisen. Solche Verbindungen sind u. a. N&sub2;S&sub4;-, N&sub2;S&sub3;- und N&sub3;S&sub3;-Chelat-Bildner.
Zur Bildung der entsprechenden Chelate werden die Chelat-Bildner mit einem geeigneten Radionuklid radioaktiv markiert. Der Schritt mit der radioaktiven Markierung kann entweder vor oder nach der Anheftung der Verbindung an ein zielaffines Protein über einen spaltbaren Linker erfolgen, in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Struktur des Chelat-Bildners und den Reaktionsbedingungen bei der radioaktiven Markierung. Zur radioaktiven Markierung des Chelat-Bildners werden herkömmliche Verfahren eingesetzt.
Beispielsweise werden Pertechnetat (&sup9;&sup9;mTcO&sub4;&supmin;) oder Perrhenat (¹&sup8;&sup6; oder ¹&sup8;&sup8;ReO&sub4;&supmin;) allgemein mit einem Chelat-Bildner in Gegenwart eines Reduktionsmittels (z. B. ein Eisen-II)- oder Zinn (II)-Salz, Dithionit oder elektrolytisch erzeugte reduzierende Elektronen) in Kontakt gebracht, um das Radionuklid zu reduzieren und es so in einen Zustand für eine Oxidation zu bringen, bei welchem eine Chelierung erfolgen kann. Alternativ dazu können das Pertechnetat oder das Perrhenat in Gegenwart eines relativ labilen Komplexierungsmittels, wie beispielsweise Gluconsäure oder Zitronensäure zur Ausbildung eines Zwischenkomplexes (&sup9;&sup9;mTc-Gluconat oder ¹&sup8;&sup8;Re-Citrat) reduziert werden. Werden die Zwischenkomplexe mit dem Chelat-Bildner unter geeigneten Reaktionsbedingungen (einschließlich Erhitzen) in Kontakt gebracht, wird das Radionuklid-Metall auf den Chelat-Bildner übertragen, wodurch ein stabiles Radionuklid-Metall-Chelat entsteht.
Chelate mit ²¹²Pb, ²¹²Bi und ¹&sup9;&sup9;Pd können durch Zusammengeben der geeigneten Salze des Radionuklids mit dem Chelat-Bildner und anschließender Inkubation der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur oder bei höheren Temperaturen hergestellt werden. Blei-, Wismuth-, Palladium- und Kupfer- Radioisotope müssen nicht notwendigerweise vor der Chelierung mit einem Reduktionsmittel behandelt werden, da solche Isotope schon in einer für die Chelatbildung geeigneten Oxidationsstufe vorliegen. Je nach dem besonderen Radionuklid und dem verwendeten Chelat-Bildner können die spezifischen Reaktionsbedingungen für die radioaktive Markierung etwas variieren.
Beispiele für einige Vertreter aus der Vielzahl der möglichen Kombinationen von Radionukiid-Metall-Chelat-Effektorteil und spaltbaren Linkern im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Formeln I bis III wiedergegeben:
in welcher Q eine Protein bindende Gruppe, n eine ganze Zahl von 1 bis 3, M ein Radionukiid-Metall oder ein Oxid davon, einschließlich aber nicht ausschließlich der Oxide von &sup9;&sup9;mTc, ¹&sup8;&sup8;Re oder ¹&sup8;&sup6;Re, darstellen und der esterhaltige Linker unter in vivo-Bedingungen an der durch den Pfeil gekennzeichneten Stelle gespalten werden kann.
in welcher Q eine Protein bindende Gruppe, M ein Radionuklid-Metall oder ein Oxid davon, einschließlich aber nicht ausschließlich der Oxide von &sup9;&sup9;mTc, ¹&sup8;&sup8;Re oder ¹&sup8;&sup6;R darstellen und der Linker eine sterisch gehinderte
Disulfidbindung enthält. Der Linker kann eine zweite hindernde Gruppe (beispielsweise eine Phenylgruppe) enthalten.
in welcher Q eine Protein bindende Gruppe, M ein Radionuklid-Metall oder ein Oxid davon, einschließlich aber nicht ausschließlich der Oxide von &sup9;&sup9;mTc, ¹&sup8;&sup8;Re oder ¹&sup8;&sup6;Re darstellen und der Ester enthaltende Linker unter in vivo- Bedingungen an der durch den Pfeil gekennzeichneten Stelle gespalten werden kann.
Andere Chelate können anstelle der in den Formeln I bis III wiedergegebenen Chelate substituiert sein. Zusätzlich können die anderen weiter oben wiedergegebenen spaltbaren Linker (beispielsweise die Peptid-Linker, die durch Säure spaltbaren Linker, andere Ester enthaltende Linker, usw.) an das Radionuklid-Metall-Chelat angeheftet werden.
Andere einsetzbare, das Radionuklid bindende Moleküle sind die in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Nummer 039,155, eingereicht am 16. April 1987, beschriebenen Vinylgruppen enthaltenden Verbindungen. Typische Vertreter für die in der USSN 039,155 offenbarten radioaktiv halogenierten kleinen Moleküle sind die folgenden Verbindungen:
worin das radioaktive Halogen *X an der C=C-Doppelbindung entweder in der Cis-, Trans- oder (nicht gezeigten) geminalen Stellung bezüglich des Substituenten Z ansubstituiert ist. Das ganzzahlige "n" ist vorzugsweise 1 bis 3. Z bezeichnet eine chemisch-reaktive bindende Gruppe, welche dafür verwendet wird, diese Effektorteile an einen erfindungsgemäßen spaltbaren Linker anzubinden.
Radioaktiv- Halogene sind die folgenden Radioisotope: Jod, insbesonders J-123, J-125 und J-131; Brom, insbesondere Br-75, Br-76 und Br-77; Fluor, insbesondere F-18; und Astat, insbesondere At-211. Bevorzugte radioaktiv markierte Halogene *X für Zwecke der diagnostischen Bildgebung sind J-131 und insbesondere J-123 für Abbildungen mit Gammakameras; und für die Bildgebung mittels Positronentomographie: F-18, Br-75 und Br-76. Für die klinische Strahlentherapie sind die radioaktiv markierten Halogene *X J-131, Br-77 und At-211 bevorzugt.
Andere bindende Moleküle, welche radioaktiv markierte Halogene in meta- oder para-Stellung an ein Phenylringsystem binden, werden in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 203,764 beschrieben. Diese Verbindungen lassen sich durch die folgende Formel wiedergeben:
*X - Ar - R
in welcher *X ein Radioisotop des Jods, Broms, Fluors oder Astats ist; Ar ein aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem;
R eine chemische Bindung oder ein Substituent mit 1 bis 12 geradkettigen C- Atomen, der Ar nicht im Hinblick auf eine elektrophile Substitution aktiviert, wie dies bei einer Hydroxy- oder Amino-Substitution des Rings der Fall ist, wenn an die Bindung oder den Substituenten eine zur Anbindung geeignete funktionelle Gruppe angeheftet ist. *J-P-Jodphenylverbindungen, in welchen *J ein radioaktiv markiertes Jod ist, können unter Anwendung der in der EP 203,764 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, in welcher Schrift allgemein die Substitution der metallorganischen Gruppen Sn(n-Bu)&sub3; oder SnMe&sub3; auf einer halogenhaltigen aromatischen Verbindung behandelt wird. Anstelle der metallorganischen Gruppe wird sodann ein Radioisotop eines Halogens mittels Halogen induzierter Metallabspaltung ansubstituiert. Beispiele von radioaktiv markierten halogenierten Molekülen, welche nach einem solchen Verfahren herstellbar sind, sind in den folgenden Formeln angegeben:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, Z eine bindende Gruppe und *X ein Radioisotop eines Halogens.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendeten Linker werden im allgemeinen synthetisiert oder derivatisiert, um so an einem Ende eine funktionelle Gruppe aufzuweisen, welche mit einem Effektorteil zur Anbindung des Effektorteils an den Linker reagiert. Im allgemeinen weist der Linker eine zweite funktionelle Gruppe auf (eine Protein-bindende Gruppe, oft am anderen Ende des Linkers), welche mit einem Protein zur Anbindung des Linkers an das Protein reagiert. Alternativ dazu können der Linker und der Effektorteil (oder eine Vorstufe davon) eher als ein einzelnes Molekül synthetisiert werden (beispielsweise die obigen Moleküle der Formeln I bis III), als daß sie als getrennte, später zusammenzusetzende Moleküle synthetisiert werden. Vorstufen von Effektorteilen vor der radioaktiven Markierung sind Chelat-Bildner oder andere komplexbildende Moleküle. Gemäß der Art des an den Linker anzuheftenden Effektorteils variiert die funktionelle Gruppe. Die Verfahren für eine chemische Synthese variieren in Abhängigkeit von der chemischen Struktur des Effektor-Linker-Moleküls.
Während gewisse der oben beschriebenen Linker an jedem Ende eine zur Bindung befähigte Gruppe aufweisen, braucht dies nicht immer der Fall zu sein. Beispielsweise kann der Linker und der Effektorteil als einzelnes Molekül synthetisiert sein, in welchem Fall dann der Linker nicht notwendigerweise ein konjugiertes System zur Reaktion mit dem Effektorteil zur Anbindung des Linkers aufweisen muß. Läßt man einen Linker mit einem zielaffinen Protein und einem Effektorteil zur Ausbildung eines erfindungsgemäßen Konjugats reagieren, dann werden die verbindenden Gruppen in den obigen Formeln für den Linker von einem zielaffinen Protein am einen Ende und einem Effektorteil am anderen Linkerende ersetzt. Nur ein Teil der bindenden Gruppe oder Gruppen verbleibt zwischen den drei Komponenten im Konjugat. Eine ein Protein bindende Gruppe ist eine funktionelle Gruppe, welche mit einer Gruppe auf einem Protein reagiert, unter Bedingungen, bei denen die biologische Aktivität des Proteins erhalten bleibt. Bindende Gruppen für Proteine sind u. a. Ester, einschließlich Carboxylester der Formel COOR (worin OR eine Abgangsgruppe ist), Imidester, Imidatester, phenolische Ester, substituierte phenolische Ester und Thiophenylester, Acceptorgruppen für die Michael-Addition (z. B. Maleimide), freie Amine, Hydrazine, Thiole, Carboxylat- und Isothiocyanatgruppen. Unter den bevorzugten, erfindungsgemäß verwendbaren bindenden Gruppen für Proteine sind:
2,3,5,6-Tetrafluorphenylester
Thiophenylester
und 2,3,5,6-Tetrafluorphenylthioester
Proteine enthalten eine Vielzahl funktioneller Gruppen (z. B. Carboxylsäure- Gruppen [COOH] oder freie Aminogruppen [-NH&sub2;]), welche für die Reaktion mit einer geeigneten bindenden Gruppe auf einem Linker-Molekül zur Verfügung stehen, um den Linker an das Protein zu binden. Beispielsweise reagieren zur Ausbildung von Amidbindungen Carboxylsäureester mit den freien (Epsilon)-Aminogruppen des Lysinrests auf einem Protein. Alternativ können das zielaffine Protein und/oder der Linker derivatisiert werden, um so weitere reaktive funktionelle Gruppen zu erhalten oder anzuheften. Die Derivatisierung kann über chemische Behandlung des Proteins erfolgen, z. B. einer oxidativen Spaltung des Zuckerrestes auf einem Glykolprotein-Antikörper mit Periodat zur Bildung freier Aldehydgruppen. Die freien Aldehydgruppen auf dem Antikörper können mit freien Amino- oder Hydrazin-Gruppen auf einem Linker zur Anbindung des Linkers an den Antikörper reagieren (siehe US 4,671,958). Verfahren zur Bildung freier Sulfhydryl-Gruppen auf Antikörpern oder Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt (siehe US 4,659,839). Die freien Sulfhydryl-Gruppen kann man mit einer Maleimidgruppe auf den verbindenden Gruppen reagieren lassen.
Erfindungsgemäß werden Konjugate mit einem an einen spaltbaren Linker angehefteten Effektorteil, wobei der Linker seinerseits an ein zielaffines Protein angeheftet ist, an einen menschlichen oder tierischen Wirt je nach dem Effektorteil für diagnostische oder therapeutische Zwecke verabreicht. In Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Art des Zielorts kann das Konjugat intravenös, intraperitoneal, in das Lymphsystem, lokal oder auf andere geeignete Weise verabreicht werden. Die zu verabreichende Menge variiert in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie der Art des Effektorteils (z. B. seiner Wirksamkeit und ob er ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel ist) und der Affinität des zielaffinen Proteins zu dem jeweiligen Wirt-Zielort. Geeignete Dosierungen können mittels konventioneller Verfahren ermittelt werden, z. B. über Tierversuche und klinische Erprobungen am Menschen.
Wenn auch ein spaltendes Mittel zur Spaltung des Linkers an den Patienten verabreicht werden soll, läßt man im allgemeinen eine genügend lange Zeit verstreichen, um vor Verabreichung des spaltenden Mittels die Festsetzung des Konjugats an dem (den) Zielort(en) und Nicht-Zielort(en) zu gewährleisten. Für diagnostische Verfahren wird die Ermittlung der Verteilung des diagnostischen Mittels durch konventionelle Verfahren (z. B. NMR, Röntgenstrahlen oder Scannen des Patienten mit einer Gammakamera) vorzugsweise solange hinausgeschoben, bis das die Spaltung des Linkers beschleunigende Mittel verabreicht ist und die Nicht-Zielzellen im wesentlichen frei von bildgebendem Mittel sind. Das spaltende Mittel wird in einer Menge verabreicht, welche ausreicht, den an einem oder mehreren Nicht-Zielorten angesiedelten Gehalt des Effektorteils zu vermindern. Die zu verabreichende Menge variiert in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie dem speziellen Linker und dem einzusetzenden spaltenden Mittel (z. B. bis zu welchem Ausmaß der Linker gespalten wird), dem Gehalt am Effektorteil und dem Nicht-Zielort usw . .
Bei Amoniumbicarbonat (einem spaltenden Mittel, welches das pH des Harns erhöht) wird eine Menge verabreicht, welche ausreicht, den pH-Wert des Harns auf ca. 8,5 bis 9 anzuheben. Bei relativ stabilen Linkern kann ein höherer pH-Wert erwünscht sein. Dies kann dadurch erfolgen, daß man einem Patienten intravenös eine wäßrige Lösung verabreicht, NaHCO&sub3; der Infusionslösung zusetzt und den pH-Wert des Harns mißt. Es wird solange NaHCO&sub3; zugesetzt, bis der pH-Wert auf dem gewünschten Stand bleibt.
Verfahren zur Änderung und Überwachung des pH-Werts von Harn sind bekannt. Ein ähnliches Verfahren wird bei der Behandlung hoher Methotrexat- Dosen mit Citrovorum-Faktor-Rescue in Patienten eingesetzt.
Ein Harn-ansäuerndes Mittel (z. B. Ammoniumchlorid) kann gleichfalls verabreicht werden, bis der erwünschte pH-Wert im Harn erreicht ist. Ein Medikament wie Mandelamin® kann oral verabreicht werden, um den pH- Wert, falls erwünscht, weiter herabzusenken. Mandelamin®, auch als Methenaminmandelat (die chemische Verbindung von Mandelsäure mit Methenamin) bezeichnet, ist ein bekanntes antibakterielles Mittel für Harn. Das Medikament wird über die Nieren ausgeschieden und sammelt sich im Harn an. In saurem Harn spaltet sich Mandelamin® in Ammoniak, Formaldehyd und Mandelsäure, was ein weiteres Ansäuern zur Folge hat.
Ein Beispiel für ein Reduktionsmittel, welches als spaltendes Mittel verabreicht werden kann, ist N-Acetylcystein. Von diesem Mittel ist bekannt, daß es sich in der Leber ansammelt und für solche medizinische Zwecke eingesetzt wird, wie der Verringerung eines Leberschadens infolge einer Überdosis Acetaminophen. Ein kleinerer Teil der oral verabreichten Dosis kann sich in den Nieren ansammeln.
Die Verringerung der Menge des an Nicht-Zielorte gebundenen Effektorteils, was man bei Einsatz des erfindungsgemaßen Verfahrens erhält, kann die Verabreichung höherer Dosen an therapeutischen Mitteln möglich machen. Durch Verabreichung höherer Dosen, welche dann möglich sind, wenn das therapeutische Mittel aus Nicht-Zielorganen entfernt werden kann, läßt sich somit eine erhöhte therapeutische Wirksamkeit erreichen. Als Ergebnis ist auch eine verbesserte Auflösung in diagnostischen Verfahren zu erwarten, wenn die bildgebenden Mittel aus Nicht-Zielgeweben bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens entfernbar sind.
Die Verwendung bedingt spaltbarer Linker zur Verminderung der Ansammlung eines Zielprotein-Effektor-Konjugats in Nicht-Zielorganen ist im allgemeinen äußerst wirksam, wenn die Anhäufung im Nicht-Zielorgan auf den Anteil des zielaffinen Proteins am Konjugat zurückzuführen ist. Bestimmte Effektorteile haben Verteilungseigenschaften, die unter in vivo-Bedingungen eine Anhäufung am Nicht-Zielort ergibt. In solchen Fällen kann nicht erwartet werden, daß die Freisetzung des Effektorteils vom zielaffinen Protein in einer Entfernung des Effektorteils aus dem Körper resultiert, da Nicht-Zielorte existieren, an welchen sich natürlicherweise der Effektorteil allein anläuft.
Unter den Effektorteilen, welche sich nach Freisetzung von einem zielaffinen Protein in Nicht-Zielorganen anhäufen, sind bestimmte Toxine aus Proteinen, welche sich in der Leber ansammeln. Von einigen Chelaten weiß man, daß sie eine Affinität gegenüber Knochen oder anderem Nicht-Zielorten unter in vivo- Bedingungen aufweisen. Wenn der Effektorteil ein Radionuklid-Metall in einem Chelat ist, dann erweist sich ein wichtiger Erfolg der vorliegenden Erfindung dadurch, daß Chelat-Bildner für Radionuklid-Metalle, wie beispielsweise Tc-99m, Re-186, Re-188, Ru-97, Rh-105 usw. verwendet werden, welche Komplexe bilden, die nicht von Leber und Nieren zurückgehalten werden. Während viele Tc-99m-Komplexe bis zu einem gewissen Grad in diesen Organen zurückgehalten werden, sind die oben beschriebenen N&sub2;S&sub2;- und N&sub3;S-Chelat-Bildner insofern besonders nützlich, als sie nicht zurückgehalten werden und über einen von den Nieren vermittelten Transport ausgeschieden werden.

Claims

1. Zusammensetzung zur Verabreichung an einen menschlichen oder Säugetier-Wirt, enthaltend ein Konjugat mit einem über einen Linker an ein Zielprotein angehefteten Effektorteil und einem Mittel zur Abspaltung, welches bewirkt, daß der Linker im Wirt an einem oder mehreren Orten, welche keine Zielorte sind, abgespalten wird.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Orte, welche keine Zielorte darstellen, die Nieren sind.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in welcher das Mittel zur Abspaltung eine Verbindung ist, welche das pH des Wirtsurins auf einen sauren pH- Wert anhebt und bei dem der Linker im sauren pH abgespalten wird.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, in welcher der Linker eine Estergruppe umfaßt, welche bei saurem pH mit Esterasen in der Niere abgespalten wird.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in welcher das Mittel zur Abspaltung eine Verbindung ist, welche das pH des Wirtsurins auf einen basischen pH-Wert anhebt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in welcher der Linker mindestens eine Ester- oder eine gehinderte Disulfidbindung aufweist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in welcher der Effektorteil ein Radionuklidmetall ist und der Linker eine Verbindung umfaßt, welche das Radionuklidmetall zur Bildung eines Chelats bindet, wobei die Bindungen zwischen dem Radionuklidmetall und Donoratomen im Chelat gegenüber oxidativer Spaltung bei basischem pH zugänglicher gemacht sind.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in welcher das Mittel zur Abspaltung ein Enzym ist, welches sich nach Verabreichung an den Wirt in den Wirtsnieren ansammelt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher das Mittel zur Abspaltung ein Reduktionsmittel ist, der Linker eine gehinderte Disulfidbindung umfaßt, der Ort, welcher keinen Zielort darstellt, die Leber und/oder Nieren sind und sich das Reduktionsmittel nach Verabreichung an mindestens einem der Orte, welche keine Zielorte darstellen, ansammelt.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher das Zielprotein ausgewählt ist aus der Gruppe Antikörper, Hormone, Enzyme, Modifikatoren biologischer Antworten und Fragmente daraus.

11. Konjugat der Formel:

R-L-P

in welchem R ein Effektorteil ist, P ein Zielprotein darstellt oder eine Protein-Konjugat-Gruppe, welche zur Reaktion mit einer auf einem Protein sitzenden Gruppe unter Bedingungen befähigt ist, welche die biologische Aktivität des Proteins aufrechterhalten und L einen Oligopeptid-Linker mit einer Länge von mindestens 10 Aminosäuren darstellt, welcher keine Prolin-Reste enthält, keine Sekundärstruktur ausbildet und zwei oder drei Histidine über drei oder mehr Reste voneinander getrennt umfaßt und welcher mittels einer Serinprotease nicht menschlichen Ursprungs gespalten wird.

12. Konjugat der Formel:

worin R ein Effektorteil ist, P ein Zielprotein darstellt oder eine Protein- Konjugat-Gruppe, welche eine funktionelle Gruppe ist, die zur Reaktion mit einer auf einem Protein befindlichen Gruppe befähigt ist unter Bedingungen, welche die biologische Aktivität des Proteins aufrechterhalten, R&sub1; eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder substituierte Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, q 0 bis 5 und n 2 bis 5 ist.

13. Konjugat der Formel:

worin R ein Effektorteil ist, P ein Zielprotein darstellt oder eine Protein- Konjugat-Gruppe, welche eine funktionelle Gruppe ist, die zur Reaktion mit einer auf einem Protein befindlichen Gruppe befähigt ist unter Bedingungen, welche die biologische Aktivität des Proteins aufrechterhalten;

m eine Zahl von 1 bis 6,

n eine Zahl von 2 bis 5,

q eine Zahl von 0 bis 5 und

p eine Zahl von 1 bis 4

ist und R' jeweils unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe Wasserstoff und Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei mindestens ein R'-Substituent eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

14. Konjugat nach den Ansprüchen 11, 12 oder 13, in welchem der Effektorteil ein diagnostisches oder therapeutisches Radionuklid umfaßt und P eine Protein-Konjugat-Gruppe ausgewählt aus der Gruppe Carboxylester, Imidester, Imidatester, Phenolester, substituierter Phenolester, Akzeptorgruppen vom Typ Michael, Maleimide, Amine, Hydrazine, Hydrazide, Thiole, Carboxylate und Isothiocyanate ist.