DE3129705A1

DE3129705A1 - Mit dichlortriazinylaminofluorescein markierte verbindungen von biologischem interesse

Info

Publication number: DE3129705A1
Application number: DE19813129705
Authority: DE
Inventors: Michael Ernest 60073 Round Lake Ill. Jolley; Stephen Denham 60048 Libertyville Ill. Stroupe; Chao-Huei Jeffrey 60031 Gurnee Ill. Wang
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1980-07-30
Filing date: 1981-07-28
Publication date: 1982-05-27
Also published as: IT8123207A0; GB2081257B; AU7203681A; JPS5758695A; AU554360B2; SE8104227L; BE889788A; CA1160626A; DE3129705C2; IT1137630B; GB2081257A; FR2487835A1; FR2487835B1

Description

Die Erfindung betrifft fluoreszierende Verbindungen,die sich be: verschiedenen Immunofluoreszenz-Verfahren, als besonders wertvoll zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von kleinen Molekülen von biologischem Interesse in Körperflüssigkeiten erwiesen haben. Zu den niedermolekularen Substanzen, .eren Nachweis oder Überwachung erwünscht ist, gehören zu therapeutischen Zwecken verabreichte Arzneistoffe, Drogen mit Missbrauchsmöglichkeiten und verschiedene andere Verbindungen, die für die Diagnose von Krankheiten oder zur Therapieüberwachung von Interesse sind.

Die Verbindungen der Erfindung können in einer Reih·; von Immui ofluoreszenz-Verfahren eingesetzt werden. Besonders ;ignen sie sich für ein Verfahren, das als Fluoreszen?polarisa*;ionsimmuntest bezeichnet wirl. Der Fluoreszenzpolarisationsimmuntest vereinigt die Spezi'"ität eines Immuntests mit der Geschwindigkeit und der BequemLichkeit eines homogenen Verfahrens. Wenn ein Fluoreszenzkonjugat an einen Antikörper gebunden ist, wird linear polarisiertes Licht, das zur Erregung des Fluoreszenzkon jugats verwendet wird, in stark polarisierter Form emittiert, da der Fluorophor im Zeitraum zwischen der Absorption und der Emission des Lichts am Rotieren gehindert wird. Ist andererseits das Fluoreszenzkonjugat nicht an einen Antikörper gebunden, so verläuft die Rotation wesentlich rascher, die Moleküle werden willkürlich orientiert und das emittierte Licht wird depolarisiert. Die Fluoreszenzpolarisation gibt somit ein direktes Mass für gebundenes und freies Fluoreszenzkonjugat in einem kompetitiven Bindungsimmuntest. Das Fluoreszenzkonjugat konkurriert mit der zu untersuchenden Verbindung in der Patientenprobe um die Antikörperbindungsstellen. Je grosser die Konzentration der zu bestimmenden Verbindung ist, desto grosser ist der Anteil des nicht an Antikörper gebundenen Fluoreszenzkonjugats. Somit wird auch ein grösserer Anteil an depolarisiertem Licht emittiert. Die präzise Beziehung zwischen der Analyt-

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konzentration und der Polarisation wird durch AufstelJen einer Eichkurve bestätigt. Man setzt Eichpräparate mit bekannten Analytmengen ein und stellt die entsprechende Polarisation fest. Bei Untersuchung einer unbekannten Probe kann deren Konzentration durch Interpolation zwischen den Eichpräparaten ermittelt werden.

Fluoreszenzkon.; jgat von Derivaten geringen Molekulargewichts sind an sich bekannt. Die US-PS 3 998 9^3 beschreibt die Herstellung von fluoreszierend markiertem Insulin unter Verwendung von Fluor sceinisothiocyanat (FITC) und von fluoreszierend markiertem Mori hin :nter Verwendung von 4-Aminofluoresceinhydrochlorid.

Die erfindungsgemäs.-en Derivate sind mit Dichlortriazinylaminofluorsscein, da3 allgemein als DTAF bezeichnet wird, markiert. Bei DTAF hande] . es sich um das Reaktionsprodukt aus Aminofluor3scein und Cya urchlorid. Blakeslee et al., Journal of Immunological M-tho-s, Bd. 13 (1976), S. 305 bis 320 beschreiben DTAF als wirksames 1 eagens zur Konjugation von Fluorescein an Immunoglobuline (IgO mit- einem Molekulargewicht von mindestens 160 000.

Erfi ldungsgemäs 3 wi.-d DTAF dazu verwendet, verschiedenen Verbindungen von biologischem Interesse Fluoreszenz zu verleihen. Diese markierten V ;rbi-düngen lassen sich durch folgende allgemeine Formel w'uederge yen

,Cl

- 5 - BAD ORIGINAL

3793 - ⁶ "

worin X einen Rest von biologischem Interesse mit < inem Molekulargewicht von weniger als 2000 bedeutet, de·¹ mindestens einen reaktiven Substituenten aus der Gruppe primäres und sekundäres Amin und Hydroxyl aufweist, der an ein Kohlenstoffatom des Triazinrings gebunden ist, und Z 4-Aminofluorescein oder 5-Aminofluorescein, das über die 4-Amirio- bzw. 5-Aminogruppe an das Kohlenstoffatom in der 2-Stel]ung des Triazin-.rings gebunden ist, bedeutet.

DTAF lässt sich leicht gemäss Blakeslee et al., a.a.O., herstellen. Das Isomere I von DTAF wird aus 5-Aminofluorescein hergestellt. Das Isomere T.I erhält man aus ^-Aminofluorescein.

Die Konjugation der beiden Isomeren von DTAF an zu untersuchende Verbindungen wird im allgemeinen durchgeführt, indem man äquimolare Mengen an DTAF und einer Verbindung mit einer reak-. tiven Amingruppe (primär oder sekundär) oder einer Hydroxylgrupp in einem geeigneter Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, löst. Handelt es sich bei dem reaktiven Amin um ein Salz, wird das Reaktionsgemisch mit einer geeigneten Base versetzt, um die freie Base des reaktiven Amins zu erhalten. Nach beendeter Umsetzung kann das Konjugat entweder dünnschiehtchromatographisch oder säulenchromatographisch gereinigt werden.

Die erfindungsgemäss eingesetzten Verbindungen von biologischem Interesse müssen mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe aufweisen', über die eine Umsetzung und Verknüpfung mit einem Kohlenstoffatom des Triazinrings möglich ist. Diese reaktive Gruppe kann bereits von Natur aus in den biologisch aktiven Verbindungen vorhanden sein, wie bei Chinidin, Procainamid, Thyroxin und Aminoglycosid-Antibiotika. Es besteht aber auch die Möglichkeit, diese Gruppen durch Derivatbildung in die Verbindungen einzuführen. Beispiele

_ 6 - BADORJGINAL

für biolt fische ^irerbIndungen, bei denen die Bildung von Aminoderivater vor der Herstellung der DTAF-K mjugate erforderlich ist, sind Theophyllin·, 2-Propyl-pen(.ansäure, Phenobarbital, Phenytoie, Primidon, Disopyraraj d , Digox^;n, Chloramp lenicol, Acety'ls&licylsäure, Acetaminophen, Carbam>zepin, Desi.^ramin und Nortriptylin,

Nachstehend sind Strukturformeln für besonders bevorzugte dungender Erfindung wiedergegeben. .

8-Aminomethyltheophyllin » DTAF ei '

-N

CH₂NH

2-Äthyl«>5~aminopentansäure - DTAF

CHCH₂CH₂CH₂NH

■=* 7 -

BAD ORIGINAL

ο ι

2-Propyl-5-aminopentam iure - DTAF

OH

HO-C-CHCH₂CH₂CH₂Nh

CH₂CH₂CH₃

Die Beispiele erläutern die Erfindung. ITAF kann dabei die beiden möglichen Isomeren bedeuten, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1 Gentamicin - DTAF

200 mg Gentamicinsulfat werden in 1 ml d ;stilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit etwa 0,8 ml 1,0 η Natriumhydroxidlösung auf 9,0 eingestellt. Sodann werden ¹O mf DTAF i 1 1,5 ml Methanol gelöst und "unter Rühren zu der Cent?micinlosung getropft. Nach 1-stündiger Umsetzungszeit wird das Reaktionsgemisch auf eine mit DEAE-Cellulose mittlerer K?shzahl gepackte Säule gegeben. Das gebildete Gentamicin-DTAF wird mit 0,1 η Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 eluiert.

Beispiel. 2 Tobramycin - DTAF

250 mg Tobramycin werden in 2 ml 0,1 m (arbonatpuffer vom pH-Wert 9,0 gelöst. 20 mg DTAF werden in 1 ml Methanol gelöst und zu 1 ml der Tobramycinlösung gegeben. Nach etwa 5 Minuten wird

BAD ORIGINAI

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das Reaktionsgemjsch an einer mit 20 ml DEAE-Cellulose gepackten Säule, die mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden ist, gereinigt. Das Reaktionsprodukt wird mit dem gleichen Puffer eluiert.

Beispiel 3 Amikacin - DTAF

24 mg-Amikacin werden in 0,2 ml Wasser gelöst. 4,5 mg DTAF werden in 0.2 ml Methanol suspendiert. Diese Suspension wird unter Rühren zu der Amikacinlösung gegeben. Die kleinen DTAF-Teilchen gehen ra:ch in Lösung, so dass das Reakti Dnsgemisch nicht gerührt werden braucht. Nach 30 Minuten wir·! das Reaktionsgemisch auf eine mit 17 ml DEAE-Cellulose- gepackt e Säule, die mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,1 äquilibriert worden ist, aufge- setzt. Das Reaktionsprodukt wird mit dem gleichen Puffer eluiert. ·

Beispiel 4 Desäthyl-N-acetyl-procainamid - DTAF

1,79 g p-Acetamidobenzoesäure und 1,15 g N-Hydroxysuccinimid werden in 15 ml Pyridin gelöst. Anschliess.end werden'2,3 g Ν,Ν'-DicyolQhexylcarbodiimid zugesetzt und gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden in einem Kühlschrank gekühlt und sodann filtriert. Die Kristalle werden mit etwa 2 tnl Aceton gespült. Sodann wird das vereinigte Pyridin-Aceton-Filtrat'mit 0,88 g N-Äthyläthylendiamin versetzt. Das,Gemisch wird 2 Stunden gerührt und sodann etwa 24 Stunden in einem Kühlschrank gekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden filtriert und mit Aceton gespült. Die Kristalle (2,0 g) werden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10 eingestellt. Der weisse Niederschlag wird abfiltriert und im Kxsikkator getrocknet. Das DTAF-Konjugat wird durch Löeen von äquimolaren Mengen an Desäthyl-N-acetylprocainamid und DTAF in Methanol gebildet. Die Umsetzung ist in etwa

„ 9 _

I Um V f VW

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10 Minuten beendet. Das Produkt wird dünnschichtchrornatographisc] an Kiesulgel unter Verwendung von Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 5 N-p-Acetamidobenzoyläthylendiamin - DTAF

Das Verfahren von Beispiel 4 wird unter Veri-jendung von 0,9 g Sthylendiamin anstelle von N-Äthyläthylendiamin wiederholt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde gerührt und sodann 1 1/2 Stunden gekühlt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Aceton gespült. Das DTAF-Konjugat wird gemäss Beispiel H hergestellt, wobei Methanol als Laufmittel verwendet wird.

Beispiel 6 N-p-Acetamidobenzoyl-N ^f-äthyl-N'-aminoacetyläthylendiamin - DTAF

1,25 g Desäthyl-N-acetylprocainamid von Beispiel k und 0,8 g Chloracatylchlorid werden in 25 ml Aceton gelöst und 2 Stunden unter Rickfluss erwärmt. Sodann wird das Gemisch filtriert. Der nach den Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhaltene gelbe Rückstand und 0,75 g Natriumjodid werden in 20 ml Aceton gelöst und 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird die "Lösung fLl triert. Demnach dem Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhaltene rote Rückstand wird in 20 ml Methanol gelcst. Die Lösung wird mit 20 ml konzentriertem Ammoniak versetzt und 1 1/2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlung wi^d das Gemisch 2 mal mit je 20 ml Chloroform extrahiert^ Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das DTAF-Konjugat wird gemäss Beispiel 4 hergestellt. Bei der dünnschichtchromatographischen Reinigung wird Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel verwendet.

Beispiel 7 Aminoprimidon - DTAF

1,1 g Primidon werden in 10 ml konzentrierter Schwefelsäure ge-

- 10 -

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löst. Das Reaktionsgemisch wird langsam unter Kühlen mit einer Lösung von 1 ml konzentrierter Salpetersaure in 2 ml konzentrierter Schwefe] säure versetzt.. Sodann wird das Gemisch ^5 * " Minuten :>ei Raumtemperatur geschüttelt und über 50 ml Eis gegossene Die gebildeten p-Nitroprimidon-Kristalle werden abfiltriere und mit Wasser gespült. Die Kristalle (1,17 g) vom Fc 225 bis 228°C werden in 200 ml heissem Äthanol gelöst= 1,5 g Eispulve" und 100 ml Wasser werden zugesetzt. Das Gemisch wird bis zum Sieden erhitzt, mit 2 ml konzentrierter Salzsäure ver» · setzt und 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das heisse Gemisch wird filtriert» Der nach dem Eindampfen ies Filtrats erhaltene Rückstand wird in 100-prozentigem Äthanol gelöst und durch Zusatz von Diäthyläther ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert= Man erhält 0,8 g braune hygroskopische Kristalle. Das DTAF-Konjugat wird durch Lösen von 5 mg DTAF und 5 mg der braunen Kristalle in 0,5 ml Methanol gebildet. Die Reaktion ist in 10 Minuten beendet. Das Konjugat wird dünnschichtchromato·= graphisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol" (3s1) als Laufmittel gereinigt. Die endgültige Reinigung wird dünnschiehtchromatographisch unter Verwendung von Chloroform/ Methanol (2s1) durchgeführt.

Beispiel 8
2~Äthyl-5-atniriopentansäure - DTAF

7j5 g .e^~5-Valerolactam werden unter einer Atmosphäre aus tro.cke» nem Stickstoff in 60 ml wasserfrei em Tetrahydrofuran gelöst. Das Reaktionsgefäss wird tropfenweise mit, 90 ml einer 1 „6 m Lösung von n-Butyllithium in Hexar versetzt und mit einem Trocken eis/Aceton-Bad gekühlt.. Nach Zusatz des gesamten n-Butyllithium-s wird das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gekühlt, 30 Minut η unter Rückfluss erwärmt und wieder auf Raumtemperatur gekühlt ι sämtliche Arbeitsgänge unter wasserfreiem Stickstoff). Sodann x^ird der Reaktionskolben unter Kühlung in einem Eisbad langsam mit 8,0 g 1-Bromäthan versetzt. Das Gemisch wird 16

BAD ORIGINAL

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StundenbeL Tauintemperatur gerührt. Sodann werden langsam 100 ml Wasser zubegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Rau temperatur gerührt. Die organische Phase wird abgetr'nnt. Die wässrige Phase wird mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und über Natriumsulfat getrocl· net. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man ein dunkles Öl, das beim Stehenlassen auskristallisiert. Nach Umkristal] sieren aus Petroläther erhält man 3,8 g Produkt. 2,8g dieses Produkts wurden 6 Stunden in 25 ml 6 η Salzsäure unter Rückfluss erwärmt. Nach dem Abdampfen des Wassers erhält man ein dunkles, dickes öl. Das DTAF-Konjugat wird gebildet, indem man äquimolare Mengen an 2-A'thyl-5-aminopentansäure und DTAF Ln Methanol löst. Die Reaktion ist in etwa 10 Minuten beendet. Das Produkt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 9 D-Thyroxin - DTAF

5 mg DTAF werden in 0,5 ml Methanol gelöst. 5 mg D-Tnyroxin werden zugegeben. Anschliessend wird Dimethylsulfoxid zugetropft, bis eine klare Lösung entsteht. Hierauf werden 2 Tropfen Triäthylamin zugesetzt. Nach etwa 16 Stunden wird ein Konjugat gebildet. Das Produkt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unt'3r Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 10 L-Thyroxin - DTAF

Dieses Konjugat wird geoiäss Beispiel 9 hergestellt, wobei aber L-Thyroxin verwendet wird.

Beispiel 11

3,3*,5-Trijod-L-thyronin - DTAF

Dieses Konjugat wird gemäss Beispiel 9 hergestellt, wobei man

- 12 - !AB

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aber 3,3',5-Trijod-L-thyronin verwendet,

Beispiel 12 S-Atninodibenzocycloheptan - DTAF

Die nachstehend angegebenen Bestandteile werden in 50 ml Methanol gelöst: 8,00 g Ammoniumacetat, 63O mg Natriumcyanoborhydrid und 2,10 g 10 ,1 i-Dihydro-SH-dibenzOj/T'ajdTcyclohepten-S-on. Die Lösung wird 24 Stunden unter Rückfluss erwärmt und sodann zur Trockne eingedampft. Der verbleibende gelbbraune Rückstand wird in 25 ml 2 η Salzsäure gelöst und 2 mal mit je 25 ml Dichlormethan extrahiert. Sodann wird die wässrige Phase mit 6 η Natriumhydroxidlösung bis zum Erreichen eines pH-Werts von IM versetzt. Es bildet sich ein braunes öl. Die Lösung fcird 16 Stunden in einem Gefrierschrank gekühlt. Der nach dem Abdampfen des gesamten Wassers erhaltene Rückstand wird in Methanoi, aufgenommen und filtriert. Nach dem Eindampfen des Filtrats erhält man einen weissen Rückstand. Das DTAF-Konjugat wird gebildet, indem man äquimolare Mengen an DTAF und an dem weissen Rückstand in Methanol list. Das Produkt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 13 Dibenzosuberonhydrazon - DTAF

10 g 10,11~Dihydro-5H-dibenzo_/_~~a,ji7cyclohepten-5=on und 18 g Dimethylhydrazin werden 24 Stunden in 100-prozentigem Äthanol unter Rückfluss erwärmt. Sodann werden 100 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Die gelbe Lösung wird mit Diäthyläther extrahiert, bis die Extrakte farblos sind. Die vereinigten Ä'ther·=- extrakte werden mit 25 ml 2 η Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wird sodann über Natriumsulfat getrocknet urd eingedampft. Als Rückstand erhält man Dibenzosuberondimethylhydrazon als dickflüssiges, orangefarbenes Öl. Dieses Produkt (2,0 g) wird

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O UCI/UJ

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12 Stunden mit 3 g Hydrazin in 10 ml 100-prozentigem Äthanol unter Rückfluss erwärmt. Das Reaktionsgemis^h wird sodann über 10 ml Eiswasser gegossen und 2 mal- mit je 2'5 ml Di-äthyläther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhält Dibenzosuberonhydrazon als gelbes Öl. Das DTAF-Konjugat wird gemäss Beispiel 12 hergestellt, wobei man Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel· verwendet.

Beispiel 14

5-( (>^-Aminopropyliden)-5H-dibenzo/~a,d7iO , 11-dihydrocyclopenten DTAF

Gemäss R.D. Hoffsomer, D. Taub und N.L. Wendler, Journal of Or ganic Chemistry, Bd. 27 (1962), S. 4134 bis 4137 werden 5-(f-Brompropyliden)-5H-dibenzo_/_ a,_d/ 10 ,11-dihydrocyclohepten und dessen Vorstufe 5-Cyclopropyl-5-hydroxy-5H-dibenzoV~a,d7~10,11-dihydrocyclohepten hergestellt. Es wird das Verfahren (b) zur Herstellung des Endprodukts, d.h. 5-(/"-Brompropyliden)-5H-dibenzo_/_ a,d/ 10 ,11-dihydrocyclohepten, eingehalten, wobei die Brompropylidenverbindung anstelle der Chlorpropylidenverbindung verwendet wird. Das DTAF-Konjugat wird gebildet, indem man äquimolare Mengen an DTAF und Amin in Methanol löst. Sodann wird überschüssiges Triäthylamin zugegeben. Die Umsetzung ist in 30 Minuten beendet. Das Reaktionsprodukt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol (2:1) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 15 N-Aminoacetyliminostilben - DTAF

6,0 g Iminodibenzyl werden in 30 ml Chloroform gelöst. Sodann, werden 6 ml Chloracetylchlorid zugegeben. Das Gemisch wird 45 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Nach Zusatz von 60 ml Wasser wird das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Chloroformphase wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrock-

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net. Der nach dem Eindampfen zur Trockne erhaltene Rückstand wird in 25 ml Aceton /gelöst und mit einer Lösung von 4,5 g Natriumiodid in 25 ml Aceton versetzt» Das Gemisch wird 30 Minuten unter Rückfluss erwärmte- Nach Zusatz von 100 ml Wasser wird das . · Reaktiorsprodukt 2 mal mit je 50 ml Chloroform extrahiert und .-sodann : ur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml Methanol gelöst, fach Zusatz von 60 ml konzentriertem Ammoniak wird da:; Gemisch 1 .'.tunde unter Rückfluss erwärmt. Die Lösung wird zur Trockne .eingedampft. Der Rückstand wird jn 100 ml Chloroform aufgenonnen- und 2 mal mit je 30 ml 2 η Salzsäure gewaschen. Die organjsehe Phase wird über Natriumsu■fat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das DTAF-Konjugat wird hergestellt, indem man 5 mg DTAF und 5 mg des Amins in 0,5 ml Methanol löst= Das Konjugat bildet sich in 10 Minuten. Es ttfird gemäss Beispiel 1 2 gereinigt»

Beispiel 16 N-Aminoacetyldesipramin - DTAF

1 j 33 g Desipramin-hydrochlorid und 0,80 g Chloracetylchlorid werden in 25 ml Chloroform gelöst. Nach 2-stündigem Erwärmen unter Rückfluss wird das Chloroforn abgedampft. Der Rückstand wird in 25 ml Aceton gelöst,, 0,75 l Natriumiodid werden zugegeben, DLe Lösung wird 30'Minuten unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird die Lösung abfiltriert. Das ausgefallene Salz wird mit Aceton gespült. Der nach dem Eindampfen des Acetonfiltrats erhaltene Rückstand wird in 20 ml Methanol aufgenommen. Nach Zusatz von 20 ml konzentriertem Ammoniak ,wird die Lösung 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird das Reaktionsgemisch mal mit je 25 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Konjugat wird hergestellt, indem man je 5 mg DTAF und Amin in 0,5 ml Methanol löst. Zur Lösung des Niederschlags werden etwa 5 Tropfen Dimethylsulfoxid zugesetzt. Die Umsetzung ist innerhalb von 10 Minuten beendet. Die Reinigung wird gemäss

_ ₁₅ BAD ORIGINAL

O I ΔΌ I UO

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Beispiel 12 unter Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel vorgenommen.

Beispiel 17 8-Aminocnethylthe-ophyllin - DTAF

10 mg DTAF und 5 mg 8-Aminomethyltheophyllin werden in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Nach 5 Minuten ist die Reaktion beendet. Das Konjugat wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 18 8-Aminomethyltheophyllin - DTAF

Man verfährt wie in Beispiel 17, verwendet aber 8-Aminoäthyltheo phyllin anstelle des Methylderivats.

Beispiel 19 Chinidin - DTAF

5 mg DTAF und 5 mg wasserfreies Chinidin werden in 0,5 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden ist die Umsetzung beende'. Das Konjugat wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt.

Wie vorstehend erwähnt, lassen sich erfii dungsgemäss hergestellt fluoreszierend markierte Tracer in einer Reihe von Immuntestverfahren einsetzen. Die nachstehenden Beispiele erläutern die Eignung von derartigen Tracern bei Fluoreszenzpolarisationstests.

In sämtlichen Beispielen wird das gleiche Grundverfahren angewendet:

BAD ORIGINAL

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1) Ein geringes Volumen an Standard oder Testserum wird in ein Teströhrchen gegeben und mit Puffer, verdünnt;

2) ein geringes Volumen an konzentriertem Fluoreszenz-Tracer mit einem Gehalt an einem oberflächenaktiven Mittel wird sodann zu jedem Röhrchen gegeben;

3) schliesslich wird ein Volumenteil verdünntes Antiserum zugesetzt;

4) das Reaktionsfemisch wird bei Raumtemperatur inkubier⁴-.

Beispiel 20 ■ ·

2-Propyl-pentansäure-Test

2-fithyl-5-aminopentansäure-DTAF-Konjugat

Materialien

1) Puffer: 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,01 Prozent (Gew./Vol.) Natriumazid und 0,01 Prozent (Gew./Vol.) Rinder-^globtflin (BGG).

2) Tracer: 2-Äthyl-5-aminopentansäure-DTAF-Konjugat 50 χ 10 m in 0,1 m Tris-hydrochlorid-puffer vom pH-Wert 7,8 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 0,01 Prozent (Gew-ZVol.) Rinder-/^globulin und 0,01 Prozent (Gew^Vol.) Natriimazid.

3) Antikörper: Schaf-Antiserum gegen 2^,VxopYlr-p-en%ainsäuxe, mit Puffer im Verhältnis 1:3,75 verdünnt.

4) Standards oder unbekannte Probe i: Humanserum (oder andere biologische Flüssigkeiten) mit hinein Gehalt an 2-Propyl-pentansäure in Konzentrationen von 0 bis

5) "luoreszenzpolarimeter'. Gerät mit dem die Polarisation der

_Q

Fluoreszenz einer 1 χ 10 m Fluoresceinlösung auf + 0,001· PolarLsations€;inheiten abgelesen werden kann.

Versuchs >eschreibung

1) 0,75 ;il Standard oder unbekannte Probe werden in 12 X 75 mm Kultu: röhrchen (Küvetten) für einmaligen Gebrauch gegeben.

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Dies wird durchgeführt, indem man 20 ^l Standard oder unbekannte Probe zunächst in einen Vorverdünriungsbehälter pipettiert und anschliessend 500 ^l Puffer zugibt. Sodann werden 20^1 der verdünnten Probe in das 12 χ 75-Kulturröhrchen pipettiert und hierauf 400 ^yI Puffer zugegeben.

2) 40 ^l Tracer und 800 ^l Puffer werden in die Küvette gegeben.

3) 40 ul Antiserum und 800 ^uI Puffer werden in die Küvette gegeb Der Küvetteninhalt wird vermischt und etwa 15 Minuten bei Rau temperatur inkubiert.

4) Die Fluoreszenzpolarisa.tion wird abgelesen. Typische Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

2-Propyl- pentansäure-Konzentration (,ug/ml)	Polarisation
0	0,217
12,5	0,186
25	0,165
50	0,132
100	0,099
150	0,081

Die Polarisation ändert sich in regelmässiger Weise mit variierender Konzentration der 2-*-Propyl-pentansäure, ί·ο dass eine kurve aufgestellt werden kann. Unbekannte Proben verden in gleicher Weise behandelt. Aus der Polarisation der Fluoreszenz der unbekannten Probe kann die Valproasäurek inzentration in der unbekannten Probe durch Vergleich mit der '.i.chkurve bestimmt werden.

Beispiel 21 Gentamicin-Test Materialien

1) Puffer: (vgl. 2-Propyl-pentansäure-Test) """ "

-...·· BAD ORIGINAL

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2) Tracer: Gentamicin-DTAF in einer Konzentration von 100 naiiomolar in Tris-hydrochlori'l-puffer vom pH-Wert 7 _}5 mit einem Gehalt an 0,125 Prozent Nutriumdodecylsulfat, 0,01 Prozent Natriumazid und 0,01 Prozent Rinder-^-globulin.

3) Antikörper: Kaninchen- oder Schaf-An.t i seren gegen Gentamicin, in geeigneter Weise mit Puffer verdüm t„

4) Standards oder¹ unbekannte Proben: Humanserum (oder andere biologische Flüssigkeiten) mit einem Gehalt an Gentamicin=

5) Fluoreszenzpolarimeter: (vgl., 2-Propyl-pentansäure-Test).

Versuchsbeschreibung

1) 1,8 ^uI Standard oder unbekannte Probe werden in 12 χ 75 nm Kulturröhrchen (Küvette) für den einmaligen Gebrauch gegeben.. Hierzu werden 20 ^uI Probe pipettiert und mit 200 ^l Puffer versetzt. Sodann werden 20 ^l der verdünnten Probe in die Küvette pipettierto Hierauf werden -200 ^l Puffer in die Küvette zugegeben.

2) 4O_xUl Tracer und 1000 jdl Puffer werden in die Küvette gegeben.

3) 40^1 Antikörper und 1000 ;ul Puffer werden zugesetzt« Der Inhalt der Küvette wird vermischt und etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert„

4) Die Fluoreszenzpolarisation wird im Anschluss an die Inkubationszeit abgelesene Typische Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II	Polarisation	BAD ORIGINAL
Gentamicin-Konzentration	0,178
0	0,158
0,5	0,140
1,0	0,115
2,0	0,090
4,0	0,074
8,0

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I ί. \J I \J

3793 . - 20 -

Die sich in regelmässiger Weise verändernde Polarisation erlaubt die Aufstellung einer Eichkurve. Unbekannte Proben werden in identischer Weise untersucht. Der Gehal; an Gentamicin wird durch Vergleich mit der Eichkurve bestimmt. Der Gentamicin-DTAF-Tracer. ist somit ein wertvolles Hilfsmittel zur Bestimmung der Gentamicin-Konzentration in biologischen Proben.

Beispiel 22

N-Acetylprocainamid-Test Materialien

1) Puffer: (vgl. 2-Propyl-pentansäure-Test)

2) Tracer: Desäthyl-N-acetylprocainamid-DTAF-Konjugat in eine

_Q

Konzentration von 50 χ 10 m in einer 5,75-prozentige η (Gew-ZVol.) Lösung von Natriumtoluolsulfonat.

3) Antiserum: Kaninchen-Antiserum gegen N-Acetylprocainamid, im Verhältnis 1:6 in Puffer verdünnt.

4) Standards oder unbekannte Proben: Humanserum (oder andere biologische Flüssigkeiten).

5) Fluoreszenzpolarimeter: (vgl. 2-Propyl-penansäure-Test).

Versuchsbeschreibung

1) 0,48^1 Standard oder unbekannte Probe werden¹ Ln eine "Küvette gebracht, indem man 10 _μ3 der Probe in einen Vorverdünnungsbehälter pipettiert und mit 200 _ul Puffer verdünnt 10 μΐ der verdünnten Probe werden sodann in die Küvette pipettiert. Hierauf werden 200^1 Puffer zugesetzt.

2) 40 ^l Tracer und 1000 ^l Puffer werden in die Küvette gegeben.

3) 40^il Antiserum und 1000/il Puffer werden sodann in die Küvette gegeben. Der Küvetteninhalt wird gemischt und sodann etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

4) Die Fluoreszenzpolarisatipn wird im Anschluß an die 15-minütige Inkubationsdauer abgelesen. Typische Ergebnisse

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für N-Acetylprocainamid sind in Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle	III
N-Acetylprocainamid (ug/ml)	Polarisation
0	0,239
1	0,218
2	0,209
4	0,190
8	0,173
16	0,158 .

Aus den Daten von Tabelle III lässt sich eine Eich) urve aufstellen. Unbekannte Proben werden in identischer Weise bestimmt. Ihre Konzentration lässt sich mit Hilfe der Eichkurve ermitteln. Somit ist das Desäthyl-N-acetylprocainamid-DTAF-Konjugat ein wertvolles Hilfsmittel zur Bestimmung von N-Acetylprocainamid in biologischen Flüssigkeiten.

Ende der Beschreibung

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Claims

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3793

ABBOTT LABORATORtES
Ncrth Chicago, Illinois 60064

Mit Dichlortria inylaminofluorescein markierte Verbindungen ν η biologischem Interesse

Patentansprüche

1.JFluoraszierence Verbindungen der allgemeinen Formel

in der X ein R st von biologischem Interesse mit einem Molekulargewicht ν η weniger als ?000 ist und als real· tiven Substituenten ein primäre oder sekundäre Amingruppe oder eine Hydroxylgruppe aufweist, über 'lie er an ein Kohlenstoffatom des Triazinrin s gebunden ist, und Z ^-Aminofluorescein oder

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3793

5-Aminofluorescein bedeutet, das über die 4-Amino- bzw. 5-Aminogruppe an das Kohlenstoffatom in der 2-Steliung des
Triazinrings gebunden ist.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Arninop;lycosid-Antibiot5kum ist.

3- Verbindungen nach Anspruch ?, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Aminoglycos:i d um Gentamicin handelt.

4. Verbindungen nacii Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Aminoglycosid um Tobramyci ι handelt.

5. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Aminoglycosid um Amikacin mndelt.

6. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X Aminophenobarbital ist.

7. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gek nnzeichnet, dass X Desäthyl-N-acetylprocainamid ist.

8. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X N-p-Acetamidobehzoyläthylendiamin ist.

9- Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X N-Acetamidobenzoyl-N'-äthyl-N'-aminoace yläthylendiamin ist

10. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X p-Aminoprimidon ist.

11. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 2-Äthyl-5-aminopentansäure ist.

12. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X D-Thyroxin ist.

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13- Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X L-Thyroxin ist.

■14. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 2-Propyl-5-aminopentansäure ist.

15. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 3,3',5-Trijod-L-thyronin ist.

16. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurci gekennzeichnet, dass X 2-(2-Aminoäthyl)-5,5-diphenylhydantoin ist.

17. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 8-Aminomethyltheophyllin ist.

18. Verbildungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 8-(2-Aminoäthyl)-theophyllin ist.

19- Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X Chinidin ist.'

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