FR2487835A1

FR2487835A1 - Marquage de composes biologiquement interessants par la dichlorotriazinyl-aminofluoresceine

Info

Publication number: FR2487835A1
Application number: FR8114768A
Authority: FR
Inventors: Chao-Huei Jeffrey Wang; Stephen Denham Stroupe; Michael Ernest Jolley
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1980-07-30
Filing date: 1981-07-29
Publication date: 1982-02-05
Also published as: CA1160626A; JPS5758695A; AU554360B2; BE889788A; DE3129705C2; AU7203681A; DE3129705A1; GB2081257B; GB2081257A; SE8104227L; IT1137630B; FR2487835B1; IT8123207A0

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LE MARQUAGE D'UN COMPOSE BIOLOGIQUEMENT INTERESSANT PAR LA DICHLOROTRIAZINY-AMINOFLUORESCEINE. LE COMPOSE MARQUE FLUORESCENT SELON L'INVENTION REPOND A LA FORMULE GENERALE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE X REPRESENTE UN RESTE BIOLOGIQUEMENT INTERESSANT AYANT UN POIDS MOLECULAIRE DE MOINS DE 2000 ET AU MOINS UN SUBSTITUANT REACTIF CHOISI PARMI LES GROUPES AMINO PRIMAIRES ET SECONDAIRES ET HYDROXYLE, PAR LEQUEL IL SE FIXE A L'ATOME DE CARBONE 2 DU NOYAU TRIAZINE; ET Z EST CHOISI PARMI LA 4-AMINO-FLUORESCEINE ET LA 5-AMINO-FLUORESCEINE FIXEES PAR LE RESTE 4-AMINO OU 5-AMINO, RESPECTIVEMENT, AU CARBONE 2 DU NOYAU TRIAZINE. APPLICATIONS: DETECTIONS, CONTROLES ET DOSAGES PAR POLARIMETRIE DE FLUORESCENCE.

Description

1 - La présente invention concerne d'une manière générale des composés

fluorescents qui se sont révélés particulièrement intéressants dans divers procédés d'immunofluorescence pour déceler et déterminer des quantités de petites molécules biologiquement intéressantes dans les humeurs de l'organisme. Les substances de

bas poids moléculaire que l'on souhaite déceler ou contrôler compren-

nent des médicaments administrés à des fins thérapeutiques, des médicaments ayant une capacité potentielle connue d'emploi abusif, et divers autres composés qui sont intéressants dans le diagnostic

des maladies ou la thérapie de contr8le.

Bien que les composés de l'invention puissent être utilisés dans diverses techniques d'immunofluorescence, ils sont

particulièrement utiles dans un procédé dénommé détermination immuno-

logique par polarisation de fluorescence. Une détermination immuno-

logique par polarisation de fluorescence combine la spécificité d'une détermination immunologique avec la vitesse et la commodité d'une méthode homogène. Lorsqu'un composé de conjugaison fluorescent est fixé à un anticorps, la lumière polarisée linéairement qui est

utilisée pour exciter le conjugué fluorescent reste fortement pola-

risée par émission parce que le fluorophore est limité en rotation entre les instants d'absorption et d'absorption de la lumière. D'autre part, lorsque le conjugué fluorescent n'est pas fixé par un anticorps, sa rotation est beaucoup plus rapide, les molécules sont davantage

orientées de manière statistique, et la lumière émise est dépolarisée.

La polarisation de fluorescence fournit donc une mesure directe du conjugué fluorescent fixé et libre dans un essai de détermination immunologique par fixationcompétitive. Le conjugué fluorescent tend à se fixer sur les sites de fixation de l'anticorps avec le composé intéressant dans l'échantillon du patient. Plus la concentration du composé déterminé est grande> plus grande est la fraction du conjugué fluorescent non fixé par l'anticorps et, par conséquent, plus grand est le degré auquel la lumière dépolarisée est émise. La relation

précise entre la concentration de l'analyte et la polarisation est éta-

blie en traçant une courbe d'étalonnage. On lit les produits d'étalon-

nage avec des quantités connues d'analyte et on enregistre la pola-

risation. Lorsqu'on lit un composé inconnu, sa concentration est

estimée par interpolation entre les standards.

Les conjugués fluorescents de dérivés de composés de

bas poids moléculaire ne sont pas uniques. Le.rte des Eitats-

Unis d'Amérique n 3.998A943 (19767 décri de ?ni re spécifiOue

la préparation d'insuline marquée flucrascentn utdlisat liisothio-

cyanate de fluorescéine (FITC) et de:.orphJ i'.rque fiurescó3?e

utilisaz-c le chilorhydrate de 4-aaino-fiuorescei.ne.

Les dérivés fluoresceats de I invenrtion sont it éus avec la dichlorotriazinylaminof luores cine, couramment deaorm- D F. La DTAF est le produit de réaction de l'aminofluoresce.ne et Ae chlorure cyanurique. Dans un article du Jorn.al of Immunoiog"cat Methods, 13, pages 305-320 (1976), Blakesic-e t zol. decrivent' la DTAF comme un réactif efficace pour conjugie-r la ú1uorscine aux

immunoglobulines (IgG) ayant des peids molécuiaires d'au moins I60.000.

La présente invention concerne l'utilisation de la DTAF pour conférer la fluorescence à une grande variété de composés biologiquement intéressants qui, lorsqu'ils sont marqués, peuvent âtre caractérisés par la formule

X N

_/. dans laquelle X représente un reste biologiquement intéressant ayant un poids moléculaire de moins de 2.000 et ayant au moins un substituant réactif choisi parmi les groupes amino primaires et secondaires et hydroxyle, par lequel ils se fixent a l'atome de

carbone du noyau triazine; et Z est choisi parmi la 4-amino-fluores-

céine et la 5-amino-fluorescéine fixées par le reste 4-amino ou -amino, respectivement,au carbone 2 du noyau triazine. La DTiF peut ttre facilement préparée selon la technique adoptée par Blakeslee et col. (cidessus). L'isomère I de la DTAF est préparé à partir de la 5-aminofluorescéine, l'isomère II dérive

de la 4-amino-fluorescéine.

La conjugaison de l'un ou l'autre isomère de la DTAF à des composés intéressants peut être généralement effectuée en dissolvant des quantités molaires égales de DTAF et d'un composé ayant un groupe amino (primaire ou secondaire) ou hydroxyle réactif dans un solvant approprié, tel que l'eau, le méthanol, le diméthyl- formamide ou le diméthylsulfoxyde. Si l'amine réactive est un sel, on ajoute une base convenable au mélange de réaction pour former la base libre de l'amine réactive. Lorsque la réaction est terminée, on peut purifer les conjugués en utilisant la chromatographie sur couche

mince ou sur colonne.

Les composés biologiquement intéressants utilisés selon l'invention doivent avoir au moins un groupe amino primaire ou secondaire ou un groupe hydroxyle par lequel ils peuvent réagir et se fixer sur un atome de carbone du noyau triazine. Le groupe réactif doit être inhérent dans les composés biologiquement actifs comme il

l'est dans la quinidine, la procalnamide, la thyroxine et les anti-

biotiques du type aminoglucosides, ou bien il peut être introduit dans le composé par formation d'un dérivé. Des exemples de composés biologiques qui nécessitent la formation de dérivés amino avant que l'on puisse préparer les conjugués de DTAF comprennent la théophylline, l'acide valproIque, le phénobarbital, la phénytoine, la primidone, la disopyramide, la digoxine, le chloramphénicol, l'aspirine,

l'acétaminophène, la carbamazépine, la désipramine et la nortriptyline.

Les structures illustrant les composés préférés de l'invention comprennent les suivantes: 8-aminométhylthéophylline-DTAF OH cl

0 N NN

CH3CH2 N

CH2NH /

H N <3F A

CH3C2 Acide 2-éthyl-5-aminopentanoique-DTAF Cl N N

HO-C/0 N

" CHCH2CH2CH N'

CH3C 22

Acide 2-propyl-5-aminopentanoique-DTAF Ci -N N)-NH

O, N'

0. si 0;

HO-C-CCHH2CH CH2NI

CH2CH2CH3

CH 2CH2CH3

OH I/ -, Les exemples suivants illustrent la préparation de conjugués spécifiques de DTAF selon l'invention. On notera que, dans les exemnples suivants, la DTAF peut Etre l'un ou l'autre des

isomères, sauf indication spéciale.

et

EXEMPLE 1

Gentamicine-DTAF On dissout 200 mg de sulfate de gentamicine dans 1 ml d'eau distillée. On ajuste le pH à 9,0 par environ 0,8 ml d'hydroxyde de sodium 1,OM. On dissout 20 mg de DTAF dans 1,5 ml de méthanol, on ajoute goutte a goutte à la solution de gentamicine en agitant et on laisse réagir pendant 1 h. On ajoute le mélange de réaction à une colonne de DEAE-cellulose de granulométrie moyenne et on élue

la gentamicine-DT4F résultante par le tampon au phosphate O,1M à pH 8,0.

EXEMPLE 2

Tobramycine-DTAF On dissout 250 mg de tobramycine dans 2 ml de tampon au carbonate O,1M à pH 9,0. On dissout 20 mg de DTAF dans 1 ml de méthanol et on ajoute a 1 ml de la solution de tobramycine. Après environ 5 min, on purifie le mélange de réaction par application sur une colonne de 20 ml de DEAE-cellulose et on équilibre avec le tampon au phosphate 0,1M à pH 8,0. On élue le produit de réaction

avec le même tampon.

EXEMPLE 3

Amikacine-DTAF On dissout 24 mg d'amikacine dans 0,2 ml d'eau et on met en suspension 4,5 mg de DTAF dans 0,2 ml de méthanol. On ajoute la suspension méthanolique de DTAF à la solution d'amikacine en agitant. Les petites particules de DTAF se dissolvent rapidement, de sorte que le mélange de réaction n'est pas agité. Après 30 min,

on applique le mélange de réaction sur une colonne de 17 ml de DEAE-

cellulose équilibrée avec le tampon au phosphate 0,1M à pH 8,1. Le

produit de réaction est élué avec le même tampon.

EXEMPLE 5

Déséthyl-N-acétyl-procainamide-DTAF On dissout 1,79 g d'acide paraacétamidobenzoique et 1,15 g de N-hydroxysuccinimide dans 15 ml de pyridine. On ajoute ensuite 2,3 g de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide et on dissout. On refroidit le mélange de réaction au réfrigérateur pendant 2 h et

ensuite on filtre, On rince les cristaux avec environ 2 ml d'acétone.

On ajoute 0,88 g de N-éthyl6thylènediaminc au liltrat combiné pyridine-

acétone. On agite le mélange pendant 2 haet ensuite on refroidit au réfrigérateur pendant environ 24 h. On filtre les cristaux résulants et on les rince à l'acétone. On obtient 20 g de cristaux que l'on dissout dans 50 mi d'eau distillée et cri ajuste la solution à pH 10 par une solution d'hydroxyde de sodil SE;, O- sépare par filtration un précipité blanc et on sèche dans un exsiccateur. Le aonjugué de DTAF est formé en dissolvant des quantité molaires égales de déséthyl-N-acédylprocaïnamide et de DTAF dans le méthanol., La réaction est terminée en environ 10 îi;. On effectue la porification par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant

un mélange chloroforme-acêtone (1:1) comme solvant de développement.

EXEMPLE 5

N-p-Acétamidobenzoyléthylènediaminie-DTAF On répète le mode opératoire de l'exemple 4 en utilisant 0,9 g d'éthylènediamine au lieu de Néthyléthylènediamine. On agite le mélange de réaction pendant 1 h et on le refroidit pendant 1 h min. On filtre le précipité et on le rince à l'acétone. On prépare le conjugué de DTAP de la même manière qu'à l'exemple 4,

mais en utilisant le méthanol comme solvant de développement.

EXEMPLE 6

N-p-Acétamidobenzoyl-N'-éthyl-N'-aminoacétyléthylènediamine-DTAF On dissout 1,25 g de déséthyl-N-acétylprocainamide de l'exemple 4 et 0,8 g de chlorure de chloroacétyle dans 25 mi d'acétone et on chauffe au reflux pendant 2 h. Après reflux, on filtre le mélange et on évapore le filtrat à siccité, On dissout le résidu jaune du filtrat et 0,75 g d'iodure de sodium dans 20 ml d'acétone et on chauffe au reflux pendant 1 h. On filtre la solution et on évapore le filtrat à siccité. On dissout le résidu rouge dans

ml de méthanol. On ajoute a la solution 20 ml d'hydroxyde d'ammo-

nium concentré et on chauffe au reflux pendant 1 h 30 min. Après refroidissement, on extrait le mélange deux fois par 20 ml de chloroforme. On sèche les extraits combinés sur sulfate de sodium, on filtre et on évapore. On prépare le conjugué de DTAF de la même manière qu'à l'exemple 4 et on le purifie par chromatographie sur

couche mince (chloroforme-acétone (1:1)).

EXEMPLE 7

Amino-primidone-DTAF On dissout 1,1 g de primidone dans 10 ml d'acide sulfurique concentré. On ajoute lentement au mélange de réaction sans refroidir une autre solution de 1 ml d'acide nitrique concentré et 2 ml d'acide sulfurique concentré. On agite ensuite le mélange à la température ambiante pendant 45 min et on verse le mélange de

réaction sur 50 ml de glace et on filtre les cristaux de para-nitro-

primidone et on rince à l'eau. On obtient 1,17 g de cristaux, F. 225-

2280C, que l'on dissout dans 200 ml d'éthanol chaud. On ajoute 1,5 g

de poudre de fer et 100 ml d'eau. On chauffe le mélange à l'ébul-

lition, on ajoute 2 ml d'acide chlorhydrique concentré et on chauffe le mélange au reflux pendant 2 h. On filtre le mélange à chaud et on évapore le filtrat à siccité. On dissout le résidu dans l'éthanol à 100% et on précipite par addition d'éther éthylique. On filere le précipité pour obtenir 0,8 g de cristaux hygroscopiques bruns. On forme le conjugué de DTAF en dissolvant 5 mg de DTAF et 5 mg des cristaux bruns dans 0,5 ml de méthanol. La réaction est terminée en 10 min et on purifie le conjugué par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant comme solvant de développement le mélange chloroforme-méthanol (3:1). La purification finale est effectuée par chromatographie sur couche mince en utilisant le

mélange chloroforme-méthanol (2:1).

EXEMPLE 8

Acide 2-éthyl-5-aminopentanoique-DTAF On dissout 7,5 g de delta-5valérolactame dans 60 ml de tétrahydrofuranne sec sous atmosphère d'azote sec et on ajoute, goutte à goutte,au ballon de réaction 90 ml de nbutyllithium 1,6M

dans l'hexane et on refroidit dans un bain de neige carbonique-

acêtone. Après avoir ajouté tout le n-butyllithium, on agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 1 h, on chauffe au reflux pendant 30 min et on refroidit à la température ambiante (toujours sous atmosphère d'azote sec). On ajoute lentement au ballon de réaction 8,0 g de l-bromoéthane en refroidissant le ballon au

bain de glace. On agite ensuite le mélange pendant 16 h à la tempé-

rature ambiante et ensuite on ajoute lentement 100 ml d'eau. On agite ce mélange à la température ambiante pendant 30 min et on sépare la couche organique. On extrait la couche aqueuse par 50 ml d'éther éthylique, on combine les couches organiques et on sèche sur sulfate de sodium. On évapore le solvant pour obtenir une huile foncée qui cristallise au repos et que l'on rcristallise dans l'éther de pétrole pour obtenir 3,8 g de produit. On chauffe au reflux 2,8 g de ce produit dans 25 mil d'acide chlorhydrique 6N pendant 6 h. On évapore l'eau pour obtenir une huile épaisse foncée. On forme

le conjugué de DTAF en dissolvant des quantités équimolaires d'acide.

2-éthyl-5-aminopentanoique et de DTAF dans le méthanol. La réaction

est terminée en environ 10 min. On purifie le produit par chromato-

graphie sur couche mince de gel de silice avec le mélange chloroforme-

méthanol (3:1) comme solvant de développement.

EXEMPLE 10

D-Thyroxine-DTAF On dissout 5 mg de DTAF dans 0,5 ml de méthanol. On ajoute 5 mg de D-thyroxine et ensuite on ajoute goutte à goutte du

diméthylsulfoxyde jusqu'à ce qu'il se forme une solution transparente.

On ajoute deux gouttes de triéthylamine et un conjugué se forme après environ 16 h. On purifie le produit par chromatographie sur gel de silice en utilisant le mélange chloroforme-méthanol (3:1)

conmie solvant de développement.

EXEMPLE 11

L-Thvroxine-DTAF On prépare ce conjugué en suivant le mode opératoire

de l'exemple 10, mais en utilisant la L-thyroxine.

EXEMPLE 12

3,3' 5-Triiodo-L-thyronine-DTAF On prépare ce conjugué en suivant le mode opératoire

de l'exemple 10, mais en utilisant la 3,3',5-triiodo-L-thyronine.

EXEMPLE 13

5-Amino-dibenzocycloheptane-DTAF On dissout les ingrédients suivants dans 50 ml de méthanol: 8,00 g d'acétate d'ammonium, 630 mg de cyanoborohydrure

de sodium et 2,10 g de 10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cycloheptène-5-

one. On chauffe la solution au reflux pendant 24 h et ensuite on évapore à siccité. Il reste un résidu marron que l'on dissout dans ml d'acide cblorhydrique 2N et on extrait deux fois par 25 ml de dichlorométhane. On ajoute à la phase aqueuse de l'hydroxyde de sodium 6N jusqu'à ce que le pH atteigne 14. Il commence à se former une huile brune et on refroidit la solution au congélateur pendant 16 h. On évapore toute l'eau et on reprend le résidu dans le méthanol

et on filtre. On évapore le filtrat pour obtenir un résidu blanc.

On forme le conjugué de DTAF en dissolvant des quantités équimolaires de DTAF et du résidu blanc dans le méthanol. On purifie le produit par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant

le mélange chloroforme-acétone (1:1) comme solvant de développement.

EXEMPLE 14

Dibenzosubéronehydrazone-DTAF

On chauffe au reflux 10 g de 10,11-dihydro-5H-dibenzo-

[a,d]cycloheptène-5-one et 18 g de diméthylhydrazine pendant 24 h dans l'éthanol à 100%. On ajoute 100 ml d'eau distillîe et on extrait la solution jaune par l'éther éthylique jusqu'à ce que les extraits soient incolores. On lave les extraits éthérés combinés avec 25 ml d'acide chlorhydrique 2N. On sèche ensuite la phase organique sur sulfate de sodium et on l'évapore. Le résidu est une huile orangée épaisse, la dibenzosubéronediméthylhydrazone. On chauffe au reflux 2,0 g de ce produit pendant 12 h avec 3 g d'hydrazine dans 10 ml d'éthanol à 100%. On verse le mélange de réaction sur 10 ml d'eau glacée,puis on extrait deux fois par 25 ml d'éther étiylique. On sèche les extraits éthérés combinés sur sulfate de sodium et on évapore à siccité pour ober.ir unz huile jaune. la dibenzosubéronehydrazone. On prépare le conjugué de DIAF de la mtnie maniere qu'à l'exemple 13, mais en Utilisant le m.lange chloroLormeméthanol (3:1) comme solvant du dLveoppement.

EYSI.LE 15

- (?-:-Am% ir.op1 i d n e) -5H - diden z oa d]-t102!-dhydrc2 pt lsM.ae DTAF

On prépare le 5-(boopopy ne-5-iezo[ad-

, 1-dihydro-cycólheptène et son prêcurS.ur le 5-cyclopropyi-5-

hydroes-5H-dibenzo [addihydroyclohep ene.par le mode opêratozre décrit dans Journal Organic Chemistry. volume 27. prags 4134-4137 (1962) par R.D. Hoffsomer. D. Taua et N.L. wendler. Orn suit le mode opératoire (b) pour la preparation du produit final, le -(y-bromzprop3lidène)-SH-dibenzo [a:d] -lO!l-dihydrocycloheptène,

en remplaçant ie com.posé chorcprcpylidène par le conmposé bromo-

propylidène. On forme le conjugué de DTAF en dissolvant des quantités équimolaires de DTAF et de l'amine dans le méthanol. On ajoute un excès de triéthylamine et la réaction est terminée en 30 min. On purifie le produit de réaction par chromatographie sur couche mince de gui de silice en utilisant le mélange chloroforme-méthanol (2:1)

conme solvant de développement.

EXEbkLE 16 N-AminoacétyliminostiibAne-DTAF

On dissout 6,0 g d'iminodibenzyle dans 30 ml de chloro-

forme. On ajoute 6 mi de chlorure de chloroacétyle et on chauffe le mélange au reflux pendant 45 min. On ajoute 60 ml d'eau et on agite le mélange pendant 30 min à la température ambiante. On sépare la couche chloroformique et on sèche sur sulfate de sodium et on évapore à siccité. On dissout le résidu dans 25 ml d'acétone et on ajoute une solution de 4, 5 g d'iodure de sodium dans 25 ml d'acétone. On chauffe ce mglange au reflux pendant 30 min, on ajoute 100 ml d'eau,

et on extrait le produit de réaction deux fois par 50 ml de chloro-

forme et on évapore à siccité. On dissout le résidu dans 40 ml de méthanol. On ajoute 60 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré et on chauffe le mélange au reflux pendant 1 h. On évapore la solution à siccité et on reprend le résidu dans 100 ml de chloroforme et on lave deux fois par 30 ml d'acide chlorhydrique 2N. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium et on évapore à siccité. On prépare le conjugué de DTAF en dissolvant 5 mg de DTAF et 5 mg de l'amine dans 0,5 ml de méthanol. Le conjugué se forme en 10 min et on le

purifie de la meme manière qu'à l'exemple 13.

EXEMPLE 17

N-Aminoacétyldésipramine-DTAF On dissout 1,33 g de chlorhydrate de désipramine et 0,80 g de chlorure de chloroacétyle dans 25 ml de chloroforme. On chauffe au reflux pendant 2 h, ensuite on évapore le chloroforme. On dissout le résidu dans 25 ml d'acétone. On ajoute 0,75 g d'iodure de sodium et on chauffe la solution au reflux pendant 30 min. On filtre la solution et on rince le sel précipité à l'acétone. On évapore le

filtrat acétonique et on reprend le résidu dans 20 ml de méthanol.

On ajoute 20 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré et on chauffe la solution au reflux pendant 1 h. On extrait le mélange de réaction trois fois par 25 ml de chloroforme et on sèche les extraits combinés sur sulfate de sodium, on filtre et on évapore. On prépare le conjugué

en dissolvant 5 mg de DTAF et 5 mg de l'amine dans O,5 ml de miéthanol.

On ajoute environ cinq gouttes de diméthylsulfoxyde pour dissoudre le précipité. La réaction est terminée en 10 min et on purifie le produit en utilisant le mode opératoire de l'exemple 13 avec le

mélange chloroforme-méthanol (3:1) comme solvant de développement.

EXEMPLE 18

-8-Aminométhyl-théophylline-DTAF

On dissout 10 mg de DTAF et 5 mg de 8-aminométhyl-théo-

phylline dans 0>5 ml de diméthylsulfoxyde. Après 5 min, la réaction est terminée et on purifie le conjugué par chromatographie sur

couche mince de gel de silice en utilisant le mélange chloroforme-

acetone (1:1) comme solvant de développement.

EXEMPLE 19

8_ fminoéthyl-théophvyl1ine-DAiF On utilise le mêma mode opératoire qu'à l'exemple 18

en remplaçant le dérivé méthylé par la 8-aminoéthyl-théophylline.

EXEMPLE 20

Quinidine-DTAF On dissout 5 mg de DTAF et 5 mg de quinidine anhydre

dans 0,5 ml de diméthylformamide. Après 16 h, la réaction est ter-

minée et on purifie le conjugué par chromatographie sur couche mince de gel de silice en utilisant le mélange chloroforme-méthanol (3:1)

comme solvant de développement.

Comme mentionné ci-dessus, on peut utiliser les traceurs marqués fluorescents préparés selon l'invention dans divers modes opératoires de détermination immunologique. Les déterminations suivantes illustrent le caractère approprié de l'échantillonnage

représentatif de ces traceurs dans les déterminations par polarisa-

tion de fluorescence.

Dans tous les exemples, on suit le même mode opératoire de base: 1) on introduit dans un tube à essais un faible volume de sérum standard ou d'essai et on dilue par le tampon; 2) on ajoute ensuite dans chaque tube un faible volume du traceur fluorescent concentré contenant un tensioactif; 3) on ajoute enfin un volume d'antisérum dilué;et

4) on fait incuber le mélange de réaction à la tempé-

rature ambiante.

EXEMPLE 21

Détermination de l'acide valproique, conjugué acide 2-éthyl-5-amino-

pentanoique-DTAF Matériel nécessaire: 1) Tampon: phosphate 0,1M, pH 7,5, contenant 0,01%

(poids/volume) d'azide de sodium et 0,01% (poids/volume) de y-globu-

line de boeuf (BGG).

2) Traceur: conjugué acide 2-éthyl-5-aminopentanoique-

-g DTAF 50 x 10 9M dans le tampon chlorhydrate de tris O,lM, pH 7,8, contenant 0,1% (poids/volume) de dodécylsulfate de sodium, 0,01% (poids/volume) de y-globuline de boeuf et 0,01% (poids/volume) d'azide de sodium. 3) Anticorps: antisérum de mouton anti-acide valproique

dilué dans le tampon dans le rapport 1:3,75.

4) Echantillons standards ou inconnus: sérum humain (ou autre humeur biologique) contenant de l'acide valproique dans

la gamme de concentrations de O à 150/ug/ml.

) Polarimètre de fluorescence: instrument capable de lire la polarisation de fluorescence d'une solution de fluorescéine

1 x 10-9M à t 0,001 unité de polarisation.

Mode opératoire: 1) On place 0,75/ul de l'échantillon standard ou inconnu dans un tube de culture à jeter de 12 x 75 mm A cet effet, on pipette

/ul de l'échantillon standard ou inconnu dans un récipient de pré-

dilution,puis 500 /ul de tampon. Ensuite, on pipette 20/ul d'échantillon

dilué dans le tube de culture de 12 x 75,puis 400 /ul de tampon.

2) On ajoute dans la cuvette 40/ul de traceur et 800 /ul

de tampon.

3) On ajoute dans la cuvette 40/ul d'antisérum et 800 /ul de tampon. On mélange le contenu de la cuvette et on fait incuber

pendant environ 15 min à la température ambiante.

4) On lit la polarisation de fluorescence. Le tableau I

ci-dessous donne des résultats caractéristiques.

TABLEAU I

Concentration de l'acide valproique (/ug/ml) Polarisation

O 0,217

12,5 0,186

0,165

0,099

0,081

i4 La polarisation varie de manière régulière avec la concentration de l'acide valproque. ce qui pernmet de tracer une

courbe d'ëtalonnage. Les dchanLiîlotls _rconnus sont trait,és de-

manière identique; à partir de la poar iton de fuorscence de l'échantillon inconnu, on peut détermiier i: concentration de i-acide valproique dans l'échantillon incoinu en se reoran a la courbe d'étalonnage.

EXEMPLE

Détermination de la <gntamicine Meteriei:

1) Taiipo- (voir détermination de l'acide valprolque).

2) Traceur: conjugué gentamicine-DTAF 100 nM dans un

tampon au chlorhydrate de tris, pH 7,5, contenant 0,125% de dodécyl-

sulfate de sodium, 0,01% d'azide de sodium et 0,01% de ?-globu-line

de boeuf.

3) Anticorps antisérums de lapin ou Je mouton anti-

gentamicine dilués de aière convenable dans le tampon.

4) Echantillons standards ou inconnus: sérum humain

(ou autre humeur biologique) contenant de la gentamicine.

5) Polarimètre de fluorescence. (voir détermirnation

de l'acide valproique).

Mode opératoire: 1) On place 1,8 /ul de l'échantillon standard ou inconnu dans un tube de culture à jeter de 12 x 75 mm (cuvette). A cet effet, on pipette 20/ul de l'échantillon, puis 200/ul de tampon. On pipette ensuite 20/ul de l'échantillon dilué dans la cuvette, puis 200/ul

de tampon.

2) On ajoute dans la cuvette 40/ul de traceur et 1000 ul

de tampon.

3) On ajoute 40,ul de l'anticorps et 1000 /ul de tampon, on mélange le contenu de la cuvette et on la fait incuber pendant

environ 15 min à la température ambiante.

4) On lit la polarisation de fluorescence après

l'incubation. Le tableau II ci-dessous donne des résultats caracté-

ristiques obtenus.

TABLEAU II

Concentration de la gentamine (/ua/ml) Polarisation

0 0,178

0,5 0,158

1,0 0,140

2,0 0,115

4,0 0,090

8,0 0,074

La polarisation varie de manière régulière, ce qui permet de tracer une courbe d'étalonnage. Les échantillons inconnus sont traités de manière identique et on détermine la teneur en gentamicine en se reportant à la courbe d'étalonnage. Le présent

exemple illustre l'intérêt du traceur gentamicine-DTAF pour déter-

miner la concentration de gentamicine dans des échantillons biolo-

giques.

EXEMPLE 23

Détermination du N-acétyl-procainamide Matériel nécessaire:

1) Tampon: (voir détermination de l'acide valproIque).

2) Traceur: conjugué déséthyl-N-acétyl-procalnamide-DTAP à une concentration de 50 x 10 M dans une solution à 5,75% (poids/

volume) de toluènesulfonate de sodium.

3) Antisérum: antisérum de lapin anti-N-acétyl-procaina-

mide dilué dans le tampon dans le rapport 1:6.

4) Echantillons standards ou inconnus: sérum humain

(ou autre humeur biologique).

) Polarimètre de fluorescence: (voir détermination de

l'acide valproIque).

Mode opératoire: 1) On place 0>48/ul d'échantillon standard ou inconnu dans une cuvette en pipettant 10/ul de l'échantillon dans un récipient de prédi3ution et en mélangeant avec 200/ul de tampon. On pipette ensuite 10/ul de l'échantillon dilué dans la cuvette puis 200/ul

de tampon.

2) On ajoute dans la cuvette 40/ul de traceur et 1000 ut I

de tampon.

3) On ajoute ensuite dans la cuvette 40/ul d'antisérum et 1000/ul de tampon. On mélange le contenu de la cuvette et on fait incuber à la température ambiante pendant environ 15 min. 3) On lit la polarisation de fluorescence après la période d'incubation de 15 min. Le tableau III cidessous illustre

* des résultats caractéristiques pour le N-acétyl-procainamide.

TABLEAU III

N-Acétyl-procalnamide (/ug/ml) Polarisation

0 0,239

1 0,218

2 0,209

4 0,190

8 0,173

16 0,158

On peut tracer une courbe d'étalonnage à partir des données du tableau IIIci-dessus. Les échantillons inconnus sont traités de manière identique aux échantillons standards et on peut les quantifier en se reportant à la courbe d'étalonnage, ce qui illustre l'intérêt du conjugué déséthyl-N-acétyl-procainamide-DTAF pour la détermination du N-acétylprocalnamide dans les humeurs

biologiques.

Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans

sortir du cadre de l'invention.

R E V E N D I CA TI ONS

1. Composé biologiquement intéressant rendu fluorescent par marquage par la dichlorotriazinyl-amrinofluorescéine, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale ci Nx _

4 2/ôN

N.... -z LEZ dans laquelle X représente un reste biologiquement intéressant ayant un poids moléculaire de moins de 2.000 et au moins un substituant réactif choisi parmi les groupes amino primaires et secondaires et hydroxyle, par lequel il se fixe à l'atome de carbone 2 du noyau

triazine; et Z est choisi parmi la 4-amino-fluorescéine et la 5-amino-

fluorescéine fixées par le reste 4-amino ou 5-amino, respectivement,

au carbone 2 du noyau triazine.

2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est un antibiotique du type aminoglucoside.

3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce

que l'aminoglucoside est la gentamicine.

4. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce

que l'aminoglucoside est la tobramycine.

5. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce

que l'aminoglucoside est l'amikacine.

6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est l'amino-phénobarbital.

7. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est le déséthyl-N-acétylprocainamide.

8. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est la N-para-acétamidobenzoyléthylènediamine.

9. Composé selon la revendication 1t caractérisé en ce que X est la N-acé tamidobenzoyl-N -éhyl- ' -a!inoacétyiéthrlèned: 10. Composé selcon la revendication 1, caractérisa en ce

que X est la para-aminoprimidone.

11. Composé selon la revend.ceation 1, caractérisé en ce

que X est l'acide 2-éthyl-5-aminopenanoique.

12. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est la D-thyroxine.

13. Composé selon la revendicazion 1, caractérisé en ce

que X est la L-thyroxine.

14. Composé selon 1.a r-veno.ication 1, caractérisé an ce

que X esc l:acide 2-propyl-5-aminopentanoique.

, Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est la 3,3',5-triiodo-L-thyrornine.

16. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

q ue X est la -(2-aminoétnyl)-55,-diphénylhydantoTne.

17. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est la 8-aminométhyl-théophylline.

18. CQrpos4 selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est la 8-(2-aminoéthyl)-thiophylline.

19. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que X est la quinidine.

iLamine.