DE2743446B2

DE2743446B2 - Histaminderivate des Digoxins und ihre Verwendung zum Messen des Digoxingehaltes einer Serumprobe

Info

Publication number: DE2743446B2
Application number: DE19772743446
Authority: DE
Inventors: Kent Ft.Collings Col. Painter (V.St.A.)
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1977-03-28
Filing date: 1977-09-27
Publication date: 1979-06-21
Also published as: JPS53119873A; DE2743446A1; CA1092093A; GB1544159A; CH604164A5; DE2743446C3

Description

worin X und X¹ gleich oder verschieden sind und aus H, '²⁵J oder ¹³¹J bestehen und Z Maleoyl, Fumaroyl, Phthaloyl oder eine Gruppe der Formel

R¹ R²

20

-C-(CHAC-C(CH₂J_n- C-

R³ R⁴

ist, wobei R¹, R², R³ und R⁴ jeweils für Wasserstoff oder (Ci-Cs)-Alkyl stehen, unter der Voraussetzung, daß R¹ und R² unter Bildung eines (Cj-Cs)-Cycloalkyl- oder (C4—Ce)-Cycloalkenylrestes, der gegebenenfalls in dem Teil des Rings, der durch R¹ und R² gebildet wird, durch eine oder mehrere (Ci — CsJ-Alkylgruppen substituiert ist, verbunden sein können, η und n', die gleich oder verschieden sein können, 0,1 oder 2 bedeuten, und Y für

OH

steht.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z Succinyl bedeutet und entweder einer oder beide der Substituenten X und X^{1 125}J darstellt.

3. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1, bei denen wenigstens einer der Substituenten X und X¹ für ¹²⁵J oder '³¹J steht, zur Radioimmunoassay von Digoxin.

Die Erfindung betrifft Histaminderivate des Digoxins gemäß Anspruch I und ihre Verwendung zum Messen des Digoxingehaltes einer Serumprobe.

Digoxin ist das Hauptherzglycosid, das zur Behandlung von Herzkrankheiten verwendet wird. Die Grenze zwischen einer wirksamen Digitalisierung und der Toxizität ist sehr eng gezogen.

Ein kongestives Herzversagen ist nach wie vor

unabhängig davon, ob es das Ergebnis einer absoluten oder relativen Herzfehlfunktion ist, die Hauptindikation für eine Therapie mit Digitalisglycosiden. Das Ausmaß der Verbesserung der Kreislaufdynamik, die auf die inotrope Wirkung dieser Mittel zurückgeht, ist jedoch von den Bedingungen abhängig, unter denen die Dekompensation erfolgt Die Glycoside sind dann sehr wirksam, wenn das Herzversagen auf eine chronische Muskelfehlfunktion oder auf bestimmte Druck- und Volumenüberlaslungen auf die Ventrikel zurückgeht, wie beispielsweise im Falle von Myocardiopathien, artherosklerotischen Herzkrankheiten, systemischen Hypertensionen sowie einer Vielzahl von angeborenen und erworbenen Herzklappenschäden. Digitalis hat sich als weniger geeignet erwiesen, wenn die Herzdekompensation auf eine aktive Myocarditis zurückzuführen ist.

Digoxin wird hauptsächlich durch Nieren Ia unverändertem Zustand ausgeschieden. In Patienten mit einer normalen Nierenfunktion beträgt die gemessene durchschnittliche Halbwertszeit von mit Tritium markiertem Digoxin i,6 Tage. Nimmt die Nierenfunktion ab, dann wird die Digoxinhalbwertszeit im Körper verlängert Die Serumdigoxinkonzentration und die therapeutische Wirkung von Digoxin hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, beispielsweise der Methodologie, dem Zeitpunkt der Entnahme der Nachdosis, der Dosis, der Wirksamkeit und Bioverfügbarkeit, von schlechten Absorptionen, abnormalen Schilddrüscnfunktionen, abnormalem Stoffwechsel, ferner von dem Alter, Typ der Herzkrankheit sowie der Nierenfunktion. Geeignete Serum- und Myocarddigoxingehalte wurden 6 Stunden nach der Verabreichung des Wirkstoffs gefunden.

Die klinische Verwendung von Digoxin ist von einem schmerzhaften Zunehmen von toxischen Manifestationen begleitet, wobei die ernsthaftesten aus Arrhythmien und Reizleitungsstörungen bestehen. Viele Faktoren, wie eine hohe Dosierung, eine verminderte Ausscheidung infolge einer Nierenerkrankung, ein hohes Alter sowie eine Hypothyreose, tragen zur Entwicklung dfir Digoxintoxizität bei. Der wichtigste Faktor ist jedoch die Anreicherung von übermäßigen Mengen an Digoxin im Körper, insbesondere in Myocardium. Faktoren, welche die Empfindlichkeit des Myocardiums gegenüber den toxischen Wirkungen von Digitalis erhöhen, sind eine Myocardischämie oder -krankheit, eine ein Elektrolytungleichgewicht infolge geringer Mengen an Kalium oder Magnesium im Serum oder infolge hoher Kalziummengen im Serum, ferner an Sauerstoffmangel sowie Alkalose. Der therapeutische B?^reich für Digoxin ist sehr eng (0,5 bis 2,0 ng/ml). Im allgemeinen sind die mit'leren Digoxinkonzentrationen, die in Patienten mit toxischen Manifestationen beobachtet werden, um ungefähr das Zweifache höher als die Konzentrationen von Patienten ohne Toxizität. Trotz der erheblich verschiedenen mittleren Gehalte wurden jedoch Überlappungen beobachtet. Es ist darauf hinzuweisen, daß kein willkürlicher Gehalt ausgewählt werden kann, bei dem man einen deutlichen Unterschied zwischen toxischen und nichttoxischen Serumdigoxinkonzentrationen machen kann. Es ist daran zu erinnern, daß die Digoxintoxizität das Ergebnis einer Wechselwirkung vieler Faktoren ist, wobei jeder dieser Faktoren in einer jeweiligen klinischen Situation besondere Aufmerksamkeit erfordert.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zum Messen des Digoxingehaltes einer Serumprobe geschaffen, welches darin besteht, (a) mit Digoxinantikörper

überzogenen Rohren eine Mischung aus einer Tracermenge aus einem radioaktiv markierten Histaminderivat von Digoxigenin und einer Serumprobe zuzuführen, (b) die Mischung zum Verbinden des Digoxin in der Probe und des radioaktiv markierten Derivats mit dem Digoxinantikörper zu bebrüten, (c) das gebundene markierte Digoxin von dem freien Digoxin abzutrennen und (d) die Radioaktivität zu messen.

Vorzugsweise wird zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens als Histaminderivat eine neue Verbindung der Formel

CH₂CH₂NH-Z-OY

eingesetzt, worin X und X¹ gleich oder verschieden sind und aus Wasserstoff, ⁱ²⁵j oder "'j ausgewählt sind, unter der Voraussetzung, daß wenigstens einer der Substituenten X und X¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoff besitzt, Z für Succinyl, Maleoyl, Fumaroyl, Phthaloyl oder einen Rest der Formel

R¹ R²

— C — (CH₂),C — C(CH₂)_n — C —

R³ R⁴

steht, worin R¹, R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und aus Wasserstoff oder niederem Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie Metny!, Ätbvl oder Propyl, ausgewählt sind, unter der Voraussetzung, daß R¹ und R² miteinander mit den zwei Kohlenstoffatomen, mit denen sie verknüpft sind, unter Bildung eines Cycloalkyl- oder Cycloalkenylrestes verbunden sein können, der 4 bis 6 Kernkohlenstoffatome aufweist (beispielsweise Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl), wobei ein derartiger Rest gegebenenfalls eine oder mehrere (Ci — C5)-Alkylsubstituenten (zusätzlich zu R³ und/oder R⁴) aufweisen kann, und π 0,1 oder 2 ist, und Y der Rest ist, der auf Digoxigenin zurückgeht und folgende Strukturformel aufweist:

OH

38 55 208, »The Journal of Clinical Investigation« 47, 1035-1042 (1968), die US-PS 38 10 886, »New England Journal of Medicine« 281,1212-1216 (1969), die US-PS

39 25 355 und die DE-PS 23 31 922.

Die bisher bekannten Radioimmunoassays von Digoxin sind mit Nachteilen behaftet, die im Zusammenhang mit dem eingesetzten radioaktiven Tracer stehen. Die weiter oben beschriebene Radioimmunoassay, die unter Einsatz von mit Tritium markiertem Digoxin als

ίο radioaktiven Tracer arbeitet (Smith, Butler und Haber, »New England Journal of Medicine« 281, 1212-1216 [1969]) ist mit Nachteilen behaftet, die der Verwendung von mit Tritium markierten Tracern zueigen sind, wobei eine geringe spezifische Aktivität (I) i5 und die Verwendung von Flüssigkeitsszintillationszählgeriten erwähnt seien. Die bekannte Radioimmunoassay unter Verwendung von mit radioaktivem Jod markierten Digoxin- oder Digoxigeninderivaten als radioaktive Tracer sind empfindlich gegenüber einer Serumveränderung (A η g g a r d et al, »New England Journal of Medicine« 287, 935 [1972] and Burnett et a!., »Clinical Chemistry« 19,725 [1973]). insbesondere bedingt die Verwendung von mit radioaktivem Jod markierten Digoxigenin-3-succinyItyrosin bei der Durchführung einer Radioimmunoassay irrtümlich hohe oder niedrige Digoxinwerte in Folge einer Zwischenprobeserum-(Plasma)-Veränderung (Cerceo und Elloso, »ClinicalChemistry 18«,539-543[1972]).
Der kleine Unterschied zwischen den therapeutischen und toxischen Blutgehalten von Digoxin erfordert eine extrem genaue Methode zur Messung von Digoxingehalten im Serum. Diese Notwendigkeit wird hauptsächlich durch die Radioimmunoassay erfüllt Um jedoch die volle Wirkung der Radioimmunoassay auszunützen,

j5 muß ein Röntgenstrahlen oder y-Strahlen emittierender radioaktiv markierter Tracer mit einer hohen spezifischen Aktivität, der nicht durch Veränderungen in der Probenzusammensetzung beeinflußt wird, in eine einfache Assaymethode integriert werden.

Die erfindungsgemäßen mit radioa!.ti«em Jod markierten Histaminderivate gemäß vorliegender Erfindung sind Röntgenstrahlen aussendende Substanzen mit hoher spezifischer Aktivität. Werden sie zur Durchführung einer RIA-Methode unter Einsatz eines y-Zählers eingesetzt, dann geben sie in reproduzierbarer Weise genau die Digoxingehalte im Serum und im Plasma trotz normaler Veränderungen von Probe zu Probe an, die sonst falsche Ergebnisse liefern würden, falls andere mit radioaktivem Jod markierte Tracer verwendet werden.

Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verbindungen nach einem Verfahren hergestellt werden, welches darin besteht, (a) eine Umsetzung zwischen Histamin oder einem Histaminderivat der Formel

Ferner werden durch die Erfindung neue Zwischenprodukte zur Verfügung gestellt, die zur Herstellung von Verbindungen der vorstehend angegebenen Formel (I) geeignet sind. Diese Zwischenprodukte sind Verbindungen der vorstehend angegebenen Formel (I), wobei jedoch X und X¹ jeweils für Wasserstoff stehen.

Zur Radioimmunoassay von Digoxin wurden verschiedene mit radioaktivem Jod markierte Aminosäurederivate von Digoxigenin und von Digoxin entwickelt. Erwähnt seien in diesem Zusammenhang die US-PS b0

CH₂CH₂NH₂

worin X und X¹ die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen oder jeweils für Wasserstoff stehen können, und eine Verbindung der Formel

R5_z-O-Y

wobei Z und Y die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und R⁵ eine austretende Gruppe ist.

durchzuführen oder (b) eine Reaktion zwischen Digoxigenin und einer Verbindung der Formel

ch₂ch₂nhz-r⁶

n/

auszuführen, wobei X und X¹ die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen oder jeweils für Sauerstoff stehen können, Z die angegebene Bedeutung besitzt, und R⁶ eine austretende Gruppe ist, wobei in dem Falle, daß X und X¹ in dem Reaktionsprodukt jeweils für Wasserstoff stehen, das Reaktionsprodukt zur Einführung eines ¹²⁵J- oder eines ^13lJ-SubEtituenten einer Jodierungsreaktion mit einem radioaktiven Jod unterzogen wird. Beispielsweise können die Verbindungen aus Digoxigenin durch Herstellung eines Halbesters einer Dicarbonsäure mit der3-Hydroxygruppe von Digoxigenin, beispielsweise Digoxigenin-3-hemisuccinat, einer bekannten Verbindung, und anschließende Umsetzung des erhaltenen Halbesters mit Histamin zur Gewinnung des Histaminderivats der Formel (1) herges;ellt werden, wobei jedoch sowohl X als auch X¹ für Wasserstoff stehen. Dann können entweder X oder X¹ oder diese beiden Substituenten durch ¹²⁵J oder ¹³¹J ersetzt werden.

Die als Zwischenester verwendeten Digoxigeninhalbester können nach verschiedenen bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise einer Methode, die von Oliver et al, (The Journal of Clinical Investigation 47, 1035—1042 [1969]) dazu verwendet wird, Digitoxigenin-S-hemisuccinat herzustellen. Die dabei verwendete Acylierungsreaktion ist bekannt. Es ist darauf hinzuweisen, daß die vorstehend beschriebene Methode im allgemeinen auf cyclische Anhydride, wie Glutaraldehyd, Maleinsäureanhydrid und Phthalsäureanhydrid, anwendbar sind. Einige der dabei erhaltenen Produkte sind bekannt.

Die Histaminderivate der Formel (I) können aus den Digoxigenin-3-halbestern nach folgenden drei Alternativmethoden hergestellt werden: (1) durch die gemischte Anhydridmethode, die von E r 1 a η g e r et al. in Journal of Biological Chemistry 228, 713 (1957) beschrieben wird, (2) nach der Methode des wasserlöslichen Carbodiimide, die in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert wird, oder (3) durch Verwendung von

N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-li-dihydrochinolin
(EEDQ)₁VgI. Belleaii und Malek, »Journal of the American Chemical Society 90«, 1651 -1652 [1968]).

Diese Reaktionen können in einer Vielzahl von Lösungsmitteln durchgeführt werden, beispielsweise in Wasser, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und Diäthylsulfonat, sowie bei Temperaturen zwischen ungefähr - 20 und ungefähr 60°C.

Die Histaminamide der Digoxigenin-3-halbester können mit einem der verschiedenen Jodisotope markiert werden, wobei man auf verschiedene Methoden zurückgreifen kann, beispielsweise (1) auf die Chloramin-T-Methode, die zuerst von H u η t e r und Greenwood in »Nature« 194, 495 (1962) beschrieben worden ist, oder (2) auf die Jodmonochlorid-Methode von C e s k a et al., beschrieben in »Acta Endocrinlogica« 64,111 (1970). Durch Veränderung des Konzentrationsverhältnisses Jod zu Substrat können entweder ein oder zwei Jodaiome selektiv in den Imidazolring in die 2- oder 4-Position oder sowohl in die 2- als auch in div! 4-Position eingeführ; werden. Es ist nicht erforderlich.

den genauen Prozentsatz an erhaltenem mono- und dijodierten Material zu wissen, so lange die Aktivität konstant ist Jedes Jodisotop, beispielsweise '²⁵J oder '³¹J, kann zur Durchführung dieser Jodierungsmethoden eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Digoxigenin-3-succinylhistamin

Eine Mischung aus 500 mg Digoxigenin-3-hemisuccinat,500 mg Histamin und 500 mg l-Äthyl-3-(3-dimethylaminoprcpyl)carbodiimidhydrochlorid (Äthyl CDI) in einer Mischung aus Äthanol und Wasser wird bei Zimmertemperalur während einer Zeitspanne von 24 Stunden gerührt Eine Konzentrierung der Mischung und eine anschließende Filtration liefern ein Produkt, das bei der Umkristallisation aus wäßrigem Äthanol im wesentlichen reines Digoxigenin-3-succinylhistamin mit einem F. von 212 bis 214°C (Zersetzung) liefert. Das Produkt zeigt bei der Dünnsc^.chtchromatographie einen einzigen positiven Dinitrob.jnzolflecken. Die UV-Analyse zeigt log E 4,26 bei 211 nm. Die IR-, NMR- und Stickstoffanalyse (Molekülformel C32H45N3O7, berechnet 7,2%, gefunden 7,0%) stimmen mit der Strvr.turzuordnung überein.

Beispiel 2 Digoxigenin-S-succinyM'- oder -.T-

Die jodierung von 5 μg Digoxigenin-3-succinylhistamin mit 5 mci '²⁵J erfolgt nach der Methode von H u η t e r und Greenwood, veröffentlich in »Nature« 194, 495 (1962). Die Abtrennung des Produktes von nichtumgesetztem Jod und nichtumgesetztem Digoxigenin-3-succinylhistamin erfolgt durch Durchleiten durch eine Säule, die mit einem vernetzten Dextrangel (G-15-Sephadex®) gefüllt ist Die Dünnschichtchromatographie zeigt, daß das gereinigte Produkt, und zwar Digoxigenin-S-succinyM'- oder -2'-¹²⁵-jodhistamin, eine radiochemische Reinheit von mehr als 98% aufweist

Eine Veränderung des Verhältnisses Jod zu Substrat hat wechselnde Mengen an gebildetem Digoxigenin-3-succinyl-4'- oder -2'-^|25jodhistamin sowie Digoxigenin-3-succinyl-2',4'-di^l25jodhistamin zur Folge.

Beispiel 3
Digoxigenin-3-phthaloylhistamin

Eine Mischung aus 500 mg Digoxigenin-3-hemiphthalat, 500 mg Histamin und 500 mg l-Äthyi-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid in einer Mischung aus Äthanol und Wasser wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 24 Stunden gerührt Ein Konzentrieren der Mischung sowie eine Filtration liefern Digoxige.iin-3-phthaloylhistamin.

Beispiel 4
Digoxigenin-^-phthaloyM- oder -2'-^l25jodhistamin

Die Jydierung von 5 g Digoxigenin-3-phthaloylhistamin mit 5 mci ¹²⁵J erfolgt nach der Methode von Hunter und Greenwood, veröffentlicht in »Nature« 194, 495 (1962). Das Produkt wird von nichtumgesetztem Jod und nichtumgesetztem Digoxigenin-3-phthaloylhisiamin durch Durchleiten durch eine Säule, die mit vernetztem Dextrangel gefüllt ist, abgetrennt, wobei Digoxigenin-3-phthaloyl-4'- oder

-2'-^l25jodhisiamin erhalten wird. Eine Veränderung des Die folgende Gleichung erläutert zusammen mit der

Verhältnisses Jod zu Substrat ergibt wechselnde Tabelle I das Verfahren, das zur Herstellung der

Mengen an Digoxigenin-3-phthaloyl-4'- oder -2'-¹²⁵JOd- vorstehend beschriebenen sowie weiterer Histaminderi-

histamin und DigoxigeninO-phthaloyl^Vi'-di^jod- vate angewendet werden kann:

histamin. ■>

HO

IK) Z

N ■ ('11,CII₂NH Z O Y

N -, CH₂CH₂NH Z O Y N ''"1('-"I)

N-CH₂CH₂NHZ O Y

(¹¹¹I)'-⁵! N '-⁵I ('-"I) Digoxigenin

Anhydrid Histamin Alhyl-CDI

Na''M (oder Nn¹¹¹J) ('hloramin-1

Beispiel Nr.

O O

-CCH-= CH C-

O CH., C)

-CCH₂CH₂CH-C-

— CCH₂GCH₃I₂CH₂ — C -

CH₃ O ,—/ O

P < > II - c — c -

Beispiel Nr.

Il

ii

-c -— O —

\ jj
C-

—-C-

Die vorliegende Erfindung kann zur Durchführung verschiedener Radioassaytypen für Digoxin angewendet werden. Bei der Radioimmunoassay (RIA) konkurriert radioaktiv markiertes exogenes Antigen mit nicht markiertem endogenen Antigen bezüglich der Bindestellen an einem spezifischen Antikörper. Wird ein Antigen mit einer hohen spezifischen Aktivität (Ci/

to mMol) verwendet, dann ist eine geringere Masse an radioaktivem Antigen zur Durchführung der Umsetzung mit dem Antikörper erforderlich, wodurch die Empfindlichkeit der Assay erhöht wird. Die Bestimmung der Menge an Radioaktivität, die mit dem Antigen/Antikörper-Komplex assoziiert ist ermöglicht eine quantitative Messung. Infolge dieser einzigartigen Affinitätsreaktion zwischen Antigen und Antikörper in Kombination mit einer Analyse unter Verwendung

eines radioaktiven Tracers ermöglichen RIA-Methoden eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität.

Bei der Assay wird eine Methode unter Einsatz eines behandelten Rohres angewendet. Polypropylenassayrohre mit einer Abmessung von 8 χ 50 mm werden mit > einem Antikörper zu in Kaninchen erzeugtem Digoxin behandelt. Bei der Durchführung dieser Assay werden mit radioaktivem Jod markiertes Digoxin sowie Digoxin aus ^n Patientenproben in dem behandelten Rohr bebrütet. Markiertes und endogenes Digoxin konkurrie- in ren um die Bindestellen an dem Antikörper. Der Anligen/Antikörper-Komplex wird von freiem Antigen durch Absaugen und Auswaschen aus dem Assayrohr abgetrennt. Die Radioaktivitätsmenge, die an das Assayrohr gebunden zurückbleibt, wird mit dem Wert r> für bekannte Digoxinstandards verglichen. Digoxin in der Patientenprobe kann dann berechnet werden.
Nachfolgend wird die Assaymethode näher erläutert: 20 μΙ Serum mit unbekanntem Digoxingehalt und Ί weitere Standards, die eine bekannte Menge Digoxin ." enthalten, sowie 980 μΙ Assaypuffer (phosphatgepufferte Salzlösung mit einem pH von 7), die 2 pg des mit radioaktivem Jod markierten Derivats gemäß vorliegender Erfindung enthält, werden Kunststoffrohren zugeführt, die mit Digoxin-spezifischen Antikörpern überzogen sind (Science 158,1570 [ 1967]). Die Mischung in einem jeden Rohr wird durch Wirbeln und dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei 37°C bebrütet. Die mit Antikörper überzogenen Rohre werden dann ausgesaugt und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Konkurrenz zwischen endogenem Digoxin und dem mit radioaktivem Jod markiertem Digoxigeninprodukt gemäß Beispiel 2 bezüglich Antikörperbindestellen bestimmt die Menge an mit radioaktivem Jod markierter Verbindung, die mit dem mn Antikörper überzogenem Rohr verbunden wird. Die gewaschenen mit Antikörper überzogenen Rohre werden auf ihre Reströntgenstrahlen untersucht. Die Werte (Zählungen), die unter Verwendung der Standards erhalten werden, werden zur Aufzeichnung einer Standardkurve verwendet. Der aus dem Serum erhaltene Wert wird auf der .Standardkurve aufgetragen, wodurch der Gehalt an Digoxin in dem getesteten Serum ermittelt wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Digoxigeninderivat der Formel H

CH₂CH₂N-Z-O-Y

IO

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