DE2741677A1

DE2741677A1 - Folsaeurederivate, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2741677A1
Application number: DE19772741677
Authority: DE
Inventors: Anandrao S Akerkar; Herman Rutner
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1976-09-29
Filing date: 1977-09-16
Publication date: 1978-03-30
Also published as: US4276280A; SE7710791L; FR2366291B3; GB1581075A; IT1087384B; FR2366291A1; AU2911077A; JPS5353696A; CA1137977A; BE859064A

Description

7 18 Ου'/ Hr

BEGTON, DICKINSON and COMPANY, Rutherford, New Jersey / USA

■b'olsäurederivate, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung

Die Erfindung betrifft Derivate der Polsäure (Pteroyl-glutaminsäure) und insbesondere radiomarkierte Derivate von Polsäure, Zwischenprodukte zu der Herstellung solcher radiomarkierter Derivate, die Untersuchung von Polaten mit derartigen Derivaten und ein Verfahren zur Herstellung solcher Polate.

Bei etwa einem drittel aller schwangeren Prauen in der Welt, einer großen Mehrheit von Alkoholikern, der Mehrzahl von Menschen, die eine Diät von frischen, nicht gekochten Prüchten, frischen, nicht gekochten Gemüsen oder frischen Obstsäften leben, bei vielen Leuten mit strukturellen oder funktioneilen Schädigungen iji oberen Drittel der Eingeweide bzw. des Dünndarms (einschließlich von Patienten mit tropischem oder nicht tropisch bedingtem Sprue oder einer weiten Vielzahl von MaI-absorptions-Syndromen) sowie in vielen anderen Situationen, tritt ein Folat- (Folsäure) -mangel auf. Die Messung des Polatgehaltes von sowohl dem Serum als auch den roten Blutkörperchen bildet die direkteste und verläßlichste Methode zur Bestimmung eines Polatmangels; diese Untersuchungen sollten bei

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jedem Patienten durchgeführt werden, der an einer megaloblastischen Anämie leidet, sowie an jedem Patienten, der eine Anämie, Hypersegmentierung von Granulocyten-Nuclei und einen gleichzeitigen Eisenmangel aufweist.

Stellt man einen geringen Serum-Folatgehalt fest, so bedeutet dies, daß die letzte Nahrung des Patienten einen unter dem normalen liegenden Folatgehalt aufwies und/oder daß in der letzten Zeit sein Absorptionsvermögen für Folat unter der Norm lag, gibt jedoch keinen Beweis dafür, daß der Patient an einer Polatschwäche des Gewebes leidet oder sie entwickelt, die eine Polattherapie erforderlich macht. Ein geringer Folatgehalt der roten Blutkörperchen kann entweder bedeuten, daß eine Polatschwäche des Gewebes aufgrund eines Polatmangels vorliegt, der eine Polattherapie erforderlich macht oder, daß der Patient einen primären Vitamin B^-Mangel aufweist, wodurch die Fähigkeit der Zellen, Folat aufzunehmen, blockiert wird; für den letzteren Fall wäre eine Behandlung mit Vitamin B₁P eine geeignetere Therapie als die Behandlung mit Folsäure. Aus diesen Gründen ist es günstig, den Folatgehalt der roten Blutkörperchen zusätzlich zum Serumfolatgehalt zu bestimmen und so definitiv festzustellen, ob die Diagnose ein Folatmangel ist, dessen geeignete Behandlung mit Folsäure erfolgen kann.

Endogenes Folat wird durch eine konkurrierende Bindungstechnik gemessen, unter Einbeziehung der Fähigkeit des nicht markierten Folatsim Serum oder in anderen Medien mit markierter Folsäure um ein spezifisches Folatbindemittel zu konkurrieren, das in geeigneten Konzentraten vorhanden ist, nämlich in Quellen wie Kuhmilch, Schweinenieren usw., wodurch die Bindung von markierter Folsäure inhibiert wird. Als Ergebnis der konkurrierenden Inhibierung verringert sich das Verhältnis von gebundener markierter Folsäure zur freien markierten Folsäure mit steigender Konzentration von nicht markiertem Folat. Daher erhält man

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die Konzentration an Polat in einer unbekannten Probe, z.B. im Blut eines Patienten, durch Vergleich der erhaltenen Inhibierung mit der durch bekannte Polatmengen erzielten, beispielsweise in Porm einer Standardkurve. Bei der markierten Polsäure, die gewöhnlich zur Untersuchung verwendet wird, handelt es sich um eine radiomarkierte Polsäure, wie mit Tritium radiomarkierte Polsäure, und es besteht ein Bedürfnis nach verbesserten radiomarkierten Verbindungen zur Bewertung der Polate in der Radiountersuchungstechnik.

Erfindungsgemäß werden Derivate von Polsäure geschaffen, in denen die a-Carboxylgruppe mit einer Aminoverbindung mit einem aromatischen oder heterocyclischen Ringsubstituenten substituiert ist, der zur Radiomarkierung geeignet ist.

Insbesondere werden erfindungsgemäß neue Polsäurederivate mit der folgenden Strukturformel

//- CH_n - NH -

CH_n

ί Y

= O

bereitgestellt, worin Y die Bedeutung von - H, einem Kation, das ein Alkalimetall, Ammoniak oder Amin ist, oder niedrig- Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise Methyl oder

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Äthyl) hat; i ein nicht markiertes oder radiomarkiertes Amin- oder Aminosäurederivat mit einem phenolischen, aromatischen oder heterocyclischen Ring, geeignet zur Radiomarkierung ist und vorzugsweise eines der folgenden Derivate darstellt: CH₉ - CH - COOR₀

I ³

NH -

OII

CH₂ - CH-

R₁ J

R,

OH

II

XH₀ - CHo -NH-

-NH- CH - COOR

1 ^ \^ ^^R2 R,

NH

CH₂ - CH - COOR₃

*■■

HO

CH-CH - COOR ² I 3

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worin R. und R₂ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Nitro, niedrig-Alkoxy (1 bis 6 Kohlenstoffatome), niedrig-Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoffatome) oder ein radioaktives Isotop von Jod darstellen, wobei mindestens einer der Reste R. und R₂ Wasserstoff ist, falls der Rest nicht markiert ist und mindestens einer der Reste R₁ und Rp ein radioaktives Isotop von Jod ist, falls die Gruppe radiomarkiert ist und R-z Wasserstoff, niedrig-Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoff atome, vorzugsweise Methyl oder Äthyl), ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder ein Amin darstellt.

Bei dem radioaktiven Isotop des Jods handelt es sich vorzugsweise um I¹²⁵, I¹³¹ oder I¹²⁵.

Die bevorzugten radiomarkierten Verbindungen sind radiojodierte Derivate, worin Y und R, die Bedeutung von - H haben, da derartige Derivate im Hinblick auf die Lipohilität, Polarität, Löslichkeit und Hydrophilität der folsäure ähnlich sind, wobei substituierte und unsubstituierte lyrosyl- und Histidylderivate besonders bevorzugt sind. Derartige bevorzugte Verbindungen sind im allgemeinen mono-radiojodiert.

Für den Fall, daß in den vorstehenden Verbindungen X optisch aktive Isomere aufweist, kann X in den L-, D- oder DL-Formen vorliegen, wobei die L-Form besonders bevorzugt ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellt man her durch Kondensation von Folsäure mit dem entsprechenden Amin- oder Aminosäurederivat, mit einem geeigneten Kondensationsmittel, in einem Lösungsmittelsystem, worauf man das α-substituierte Derivat abtrennt. Die radiojodierten Verbindungen können durch Radiojodierung des α-substituierten Derivats nach einem in der Fachwelt bekannten bzw. üblichen Verfahren hergestellt werden.

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-S-

Insbesondere kondensiert man die Polsäure mit dem entsprechenden Amin oder Aminosäurederivat, z.B. tyrosin oder substituierten Tyrosin in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, das üblicherweise für die Herstellung von Peptiden verwendet wird. Als Beispiele für derartige Mittel seien genannt: 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder sein Hydrochloridsalz; Dicyclohexylcarbodiimid; 1-Äthyl-3-(4-morpholinyl)-carbodiimid oder sein HCl-SaIz; 1-Isopropyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder sein HCl-SaIz; 1-Cyclohexyl^-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder sein HCl-SaIz. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf derartige Kondensationsmittel beschränkt; die Wahl eines geeigneten Kondensationsmittels liegt für den Fachmann unter Berücksichtigung der in der vorliegenden Beschreibung gegebenen Lehre im Rahmen seines Könnens.

Man führt die Kondensation in einem geeigneten Lösungsmittel für die Polsäure und das entsprechende Derivat durch. Beim bevorzugten Lösungsmittelsystem handelt es sich um ein Gemisch von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dimethy1sulfoxid, Dimethylacetamid und dergleichen. Das bevorzugte System besteht aus Pyridin und Wasser. In einigen Fällen ist es möglich, ein Gemisch von Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel in Kombination mit einer geeigneten Base, wie Pyridin, Triäthylamin, N-Methylmorpholin usw. zu verwenden. Die Wahl eines geeigneten Lösungsmittelsystems ergibt sich für den Fachmann unter Berücksichtigung der hier enthaltenen Lehre aus seinem Wissen.

Man führt die Kondensation im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 0 bis 65⁰C, vorzugsweise von etwa 5 bis 30 C, durch. Der pH-Wert liegt im allgemeinen bei etwa 5 bis 10, vorzugsweise bei etwa 7 bis 9.

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Das Reaktionsgemisch enthält nicht umgesetzte Polsäure, disubstituierte Folsäure, α-substituierte Folsäure und /"-substituierte Folsäure. Erfindungsgemäß wird das disubstituierte Derivat selektiv aus einer wäßrigen Lösung des Gemisches durch geeignete Einstellung des pH-Werts, im allgemeinen auf einen Wert von 8 bis 12, vorzugsweise von 8,5 bis 10, entfernt.

Nach Abtrennung des disubstituierten Derivats wird das gewünschte α-substituierte Produkt selektiv aus dem Gemisch durch geeignete Einstellung des pH-Werts im allgemeinen auf einen Wert von etwa 2 bis 5, vorzugsweise 2,5 bis 3, ausgefällt

Das abgetrennte α-substituierte Derivat kann anschließend in üblicher Weise unter Bildung der erfindungsgemäßen radiojodierten Derivate radiojodiert werden. Alternativ kann das entsprechende Amin oder Aminosäurederivat vor der Kondensation mit der Folsäure radiojodiert werden, wobei eine Radio;} odierung anschließend an die Kondensation nicht mehr nötig ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei bevorzugten Zwischenprodukten zur Herstellung der radiojodierten Derivate um solche, worin einer der Reste R₁ und R₂ Wasserstoff ist und der andere Fluor, Chlor, Brom, Nitro, niedrig-Alkyl oder niedrig-Alkoxy darstellt, wodurch bei der anschließenden Radiojodierung ein mono-radiojodiertes Derivat erhalten wird. Alternativ handelt es sich bei einer bevorzugten Arbeitsweise bei dem mit Folsäure zu kondensierenden Derivat um ein Amin oder ein Aminosäurederivat,in dem einer der Reste R₁ und R2 ein radioaktives Isotop von Jod ist und der andere Fluor, Brom, Chlor, niedrig-Alkoxy, niedrig-Alkyl oder Nitro darstellt.

Gemäß einer alternativen Verfahrensweise zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen führt man die Folsäure in Anwesenheit eines geeigneten Kondensationsmittels, wie Dicyclo-

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hexylcarbodiimid in das Anhydrid über, worauf man das Anhydrid mit dem entsprechenden Amin oder Aminosäurederivat kondensiert.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

A. Ein Gemisch von 230 mg L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid, 440 mg Pteroylglutaminsäure und 250 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid wurde in 10 ml Pyridin-Wasser (1:1) gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur und 16 Stunden bei 4⁰O gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 10 ml 0,55<>-iger Natriumbicarbonatlösung verdünnt und filtriert. Das FiItrat wurde unter Verwendung von 0,5 n-HCl-Lösung auf den pH-Wert 2,5 angesäuert. Der feste (x-(Pteroylglutamyl)-Irtyrosin-methylester wurde filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet; F = 255 - 56° (Zers.) log t 4,44 und 283 nm (0,1 n-Na0H) R_f 0,46 (Papierchromatographie, 0,5% NaHCO₅).

B. Ein Gemisch von 243 mg DL-3-Fluortyrosinmethylester-hydrochlorid, 443 mg Pteroylglutaminsäure und 255 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropylj-carbodiimid-hydrochlorid wurde 2 Stunden bei O⁰C und anschließend 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 15 ml 0,4%-iger Natriumbicarbonatlösung verdünnt und filtriert. Der Feststoff wurde verworfen. Das Filtrat wurde angesäuert und der abgeschiedene feste <x-(Pteroylglutamyl)-DIr-3-fluortyrosinmethylester wurde filtriert, mit 50 ml kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet; F > 300⁰C, log t 4,44 bei 282 nm (0,1 n-Na0H); R_f = 0,46 (Papierchromatographie, 0,5# NaHCO₅).

Die Arbeitsweise des Beispiels 1B wurde ebenfalls mit DL-3-Fluortyrosinäthylester, Tyramin, Histidinmethylester und Histamin unter Bildung der entsprechenden FoIsäurederivate wiederholt.

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Beispiel 2

A. Stickstoffgas wurde durch ein Gemisch von 300 mg a-(Pteroylglutamyl)-L-tyrosinmethylester und 3 ml 0,2 n-Natriumhydroxidlösung geblasen. Nach einigen Minuten wurde die Lösung filtriert und mit 1 η-Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Der abgeschiedene Peststoff α-(Pteroylglutamyl)-L-tyrosin wurde filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet; F = 275 285° (Zers.); UV: log S 4,43 bei 283 nm; R_f = 0,58 (Papierchromatographie, 0,5 1° NaHCO₅).

B. 3 ml 0,2 η-Natriumhydroxid wurden zu 312 mg a-(Pteroylglutamyl)-DIr-(3-fluortyrosinmethylester) in Anwesenheit von Stickstoffgas gefügt. Das Gemisch wurde rasch angesäuert und mit 10 ml kaltem Wasser verdünnt. Der Feststoff a-(Pteroylglutamyl)-DL-3-fluortyrosin wurde filtriert und getrocknet; P > 300⁰C; UV: log ί 4,42 bei 282 nm; R_f = 0,59 (Papierchromatographie unter Verwendung von 0,5# NaHCO,).

Diese Arbeitsweise wurde mit a-(Pteroylglutamyl)-L-histidinmethylester unter Bildung des entsprechenden Histidylderivats der Polsäure wiederholt.

Beispiel 3

A. Man führt eine Jodierung von 60 Mg a-(Pteroylglutamyl)-L-tyrosin, hergestellt nach der Arbeitsweise von Beispiel 2A, mit 10 mC ¹²^I beim pH-Wert 7,4 nach der Methode von Hunter und Greenwood bei einem Verhältnis von Substrat zu Jod von 20:1 durch. Nicht umgesetztes Jod wird durch Leiten durch ein quaternäres-Amin-Anionenaustauscherharz in der Chloridform entfernt. Das co-absorbierte Produkt wird eluiert und enthält 8,5 mC in den zwei Jodierungsprodukten, a-(Pteroylglutamyl)-3-jodtyrosin und a-(Pteroylglutamyl)-3,5-dijodtyrosin, die in dem Verhältnis 7:1 gebildet wurden. Es wurden auch einige Fragmente der Folsäure gebildet. Die Trennung der mono- und dijodierten Produkte wurde durch Säulenchormatographie

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-Vf*

an Cellulose bewirkt.

Diese Arbeitsweise wurde mit α-(Pteroylglutamyl)-L-tyrosin wiederholt. Das Verhältnis von mono- und dijodierten Produkten betrug 8:1.

B. Man führte eine Jodierung von 21,5/Ug a-(Pteroylglutamyl)-DL-3-fluortyrosin, hergestellt nach der Arbeitsweise von Beispiel 2B, mit 5 mC ¹²⁵I bei einem pH-Wert 7,4 nach der Methode von Hunter Greenwood bei einem Substrat zu Jod-Verhältnis von 20:1 durch. Nicht umgesetztes Jod wurde Leiten durch ein quaternäres-Amin-Anionenaustauscherharz in der Chloridform entfernt. Die co-absorbierte Form wurde mit einem Gemisch von Tetrahydrofuran und Chlorwasserstoffsäure eluiert und enthielt 4,3 mC des mono-jodierten Produkts a-(Pteroylglutamyl)-DIr-3-fluor-5-jodtyrosin. Das reine Produkt wurde von den Fragmenten durch Leiten durch eine Cellulosesäule abgetrennt.

Die Arbeitsweise wurde mit a-(Pteroylglutamyl)-L-histamin und a-(Pteroylglutamyl)-L-histidin, hergestellt nach der Arbeitsweise des Beispiels 2B, wiederholt.

Die erfindungsgemäßen radiojodierten Derivate können als markiertes Antigen bei der Radiountersuchung von Folsäure verwendet werden. Eine Radiountersuchungsmethode, die angewendet werden kann, wird beispielsweise von Givas et al, Clin. Chem., Vol. 21, S. 427 - 428 (März 1975) für mit Tritium markierte Folsäure wie folgt beschrieben:

Zu 50 Mikroliter Serum in einem beweglichen Glasrohr in 1,5 ml Lysinpuffer (pH = 9,2 - 0,2) wird unter sorgfältigem Vermischen die berechnete Menge des radiojodierten Derivats gemäß der Erfindung gefügt. Das Folat-bindende Protein wird anschließend in ausreichender Menge zur Erzielung einer 50 - 10jt-igen Bindung des radiojodierten Derivats in Abwesenheit des nicht-markierten Mittels zugefügt und das Gemisch wird 30 Minuten bei 25⁰C in-

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kubiert. Die Konkurrenz zwischen der radiojodierten Verbindung und der nicht-markierten 5-Methyltetrahydrofolsäure um die Proteinbindungsstellen bestimmt die Menge an im Gleichgewicht vorhandenem radiojodiertem Verbindungs-Antikörperkomplex. Die Abtrennung der gebundenen von der freien radiojodierten Verbindung wird mittels der Technik mit mit Dextran überzogener Aktivkohle durchgeführt, die zu einer selektiven Bindung der freien markierten und nicht-markierten Verbindung an der überzogenen Aktivkohle führt, die anschließend abzentrifugiert wird. Die überstehende Phase wird abdekantiert und in einem Gamma-Zähler gezählt.

Die radiojodierten FoIsäurederivate gemäß der Erfindung stellen gegenüber bisher verwendeter mit Tritium markierter Folsäure auf dem Gebiet der Radiountersuchung von Folsäure aus folgenden Gründen eine Verbesserung dar:

1. Anstelle der kostspieligen und komplizierten Flüssig-Scintillationszählgeräte, die für die mit Tritium markierten Verbindungen benötigt werden, kann ein kostengünstiger Rohrzähler ("well counter") verwendet werden.

2. Es werden keine flüssigen Scintillationsflüseigkeiten und speziellen Gefäße benötigt.

3. Ee wird weder ein interner noch ein externer Standard wie im Falle der mit Tritium markierten Folsäure benötigt.

4. Die Leistungsfähigkeit der Zählung ist vor allen Dingen in wäßrigen Medien größer.

Insbesondere können radiojodierte FoIsäurederivate mit einer höheren spezifischen Aktivität versehen werden, als mit Tritium markierte Folsäure. Die relativ geringe spezifische Aktivität und die geringe Zählwirksamkeit von mit Tritium markierter

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- yer-

Folsäure beschränken deren Handelswert.

Darüberhinaus wird bei den erfindungsgemäßen radiokodierten Derivaten, in denen der Aminosäureteil in der sauren Form anstelle der Eeterfonn vorliegt, die Polarität, Löslichkeit und Hydrophilität der Verbindung stark erhöht, wodurch derartige Derivate bei physiologischen pH-Werten in Wasser löslich sind. Die Verbindungen können in wäßrigen Medien jodiert werden, besitzen eine Seitenkette, die hinsichtlich ihrer Polarität mit der Folsäure fast vergleichbar ist, zeigen eine überlegene Bindung an das bindende Protein und weise eine geringere Neigung zur Absorption an Glasflächen oder lipophilen Flächen, wie an Untersuchungsröhrchen aus Kunststoff, auf.

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Claims

-yr- Patentansprüche

1. Eine Verbindung der allgemeinen Formel NH.

- X

- CH

CH₂

I CII,

C=O

I Y

worin Y die Bedeutung von -H, niedrig-Alkyl oder einem Kation aus der Gruppe von Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Aminen und Ammoniak hat; X aus der Gruppe von Resten der folgenden Strukturformel

-CII- COOR,

OH

(a)

8098 13/0800 ORIGINAL INSPECTED

Ψ-

N R

CII - CH₀ -NH-2 2

H ² (c)

NH -QH- COOR ^N|^H"

³ _N~ CH₂- CH - COOR.

worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig von einander- Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Nitro, niedrig-Alkoxy, niedrig-Alkyl oder radioaktive Isotope von Jod bedeuten, wobei mindestens einer der Reste R. und R₂ Wasserstoff ist, falls der andere ein radioaktives Isotop von Jod darstellt und worin R, Wasserstoff, niedrig-Alkyl, ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder ein Amin darstellt.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die Strukturformel (a) aufweist.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die Strukturformel (b) aufweist.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die Strukturformel (c) aufweist.

5. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die Strukturformel (d)

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aufweist.

6. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die Strukturformel (e) aufweist.

7. Verbindung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Ύ Wasserstoff ist.

8. Verbindung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R, Wasserstoff ist.

9. Verbindung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mindestens einer der Reste R₁ und Rp ein radioaktives Isotop von Jod ist.

10. Verbindung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin einer der Reste R₁ und Rp ein radioaktives Isotop von Jod ist und der andere sich von einem radioaktiven Isotop des Jode unterscheidet.

11. Radiojodiertes α-(Pteroylglutamyl)-L-tyrosin.

12. α-(Pteroylglutamyl)-DL-3-fluor-5-ⁱ²⁵I-tyrosin.

13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Lösung folsäure mit Aminen oder Aminosäurederivaten entsprechend der Definition von X. in Anspruch 1 kondensiert, den pH-Wert der Lösung auf etwa 8 bis 12 zur Ausfällung und Abtrennung der disubstituierten Derivate einstellt und anschließend den pH-Wert auf etwa 2 bis 5 zur Ausfällung und Abtrennung eines a-mono-subetituierten Derivats der Folsäure gemäß Anspruch 1 einstellt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man

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die Kondensation mit einem Peptid-Kondensationsmittel bei
einem pH-Wert von 5 bis 10 durchführt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14« dadurch gekennzeichnet, daß man von einer Verbindung ausgeht, worin X die Strukturformel (a) aufweist, H₁ Wasserstoff ist und R₂ sich von
einem radioaktiven Isotop des Jods unterscheidet.

16. Verfahren gemäß Anspruch 13» 14 oder 15» dadurch gekennzeichnet, daß man von einer Verbindung ausgeht, worin Rp Wasserstoff ist.

17. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin mindestens einer der Reste R₁ oder Rp ein radioaktives Isotop von Jod darstellt, als Tracer bei der Radiountersuchung von Folaten, wobei die das Folat enthaltende
Probe mit einem Folatreceptor und dem Folattracer inkubiert wird.

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