DE3004382A1 - Isotopen-doppeltest der schilddruesenfunktion - Google Patents
Isotopen-doppeltest der schilddruesenfunktionInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDE3FR R F. MEYER-ROXLAU
DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. D.pL ,NC
3000 MÜNCHEN Λ !-'JCiLE-C=A--|.STPASSE
TELEFON .-.- ■■: J ι;
TELEX =:4.;;iL;r.;R .5
TELEGR -Ξ^ΞμΕΡΡΛ-^νγ
1 . Februar 19 4560
THE RADIOCHEMICAL CENTRE LIMITED White Lion Road, Amersham, Buckinghamshire, K?"7 9LL, England
Isotopen-Doppeltest der Schilddrüsenfunktion
Die Erfindung Bezieht sich auf Isotopen-Doppeltests der Schilddrüsenfunktion
.
Die hauptsächlichen Thyreoid-Hormone sind Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3), deren im Blut zirkulierende Mengen Stoffwechselprozesse
regulieren. Der Ausstoß dieser Hormone aus der Schilddrüse wird durch die Mengen an Thyreoid-stimulierendem
Hormon (TSH) gesteuert, das von der Hypophyse abgeschieden wird. Der größere Anteil an T-4 und T3 im Umlauf ist
an Protein gebunden, wobei der wichtigste Träger Thyroxinbindendes Globulin (TBG) ist. Es wurde nachgewiesen, daß die
Konzentrationen an freiem Hormon gut mit dem Schilddrüsenzustand korrelieren. Ein Ungleichgewicht der Schilddrüsenhormone
führt zu schweren Leiden bei den Patienten, aber mit einer zutreffenden Diagnose ist die Behandlung sehr wirksam.
Eine Einteilung der Patienten in solche mit Unter-, guter und Überfunktion der Schilddrüse hängt von der Messung bestimmter
Parameter in verschiedenen Kombinationen ab. Aufgrund des Auftretens von Grenzwerten und der Einflüsse, die Alter,
Schwangerschaft, Krankheit, empfängnisverhütende und andere
Arzneimittel auf Meßwerte haben können, wird mehr als ein
0^33/07 7 2
BAD ORIGINAL
Test angewandt; ein Sichverlassen auf einen einzigen Test könnte zu Fehldiagnose führen.
Die gewöhnlich angewandten Schilddrüsenfunktionstests sind Ermittlungen von T4 und TSH insgesamt oder T4 und T3 insgesamt,
je nach der klinischen Situation. Die üblichste Maßnahme zum Test auf freies T4 war der freie Thyroxin-Index (FTI),
der aus Messungen des gesamten T4 und der übrigen Bindungskapazität an TBG durch einen T3-Aufnahmetest bestimmt wird.
Bei solchen Patienten, bei denen Messungen bindender Proteine angezeigt ist, kann die Messung der T3-Aufnähme gut durch eine
solche von TBG ersetzt Werden, wodurch der FTI-Wert durch
ein T4:TBG-Verhältnis ersetzt wird.
In jeder klinischen Situation, wo zwei Parameter gemessen werden müssen, ist es offensichtlich wirtschaftlicher, wenn ein
Parameter-Doppeltest ausgearbeitet werden kann, der nur Einzeloperationen
des Pipettierens, der Inkubation, des Zentrifugierens
und des Zählens anstelle von Doppelvorgängen erfordert, wie dies für zwei unabhängige Tests der Fall wäre.
Parameter-Doppeltests werden möglich durch die Verwendung von zwei Isotopen, die in ihren γ-Energien so differieren,
daß sie gleichzeitig auf einem geeigneten γ-Zähler gezählt werden können. Isotopen-Doppelsätze sind nun im Handel erhältlich,
die die gleichzeitige Bestimmung von Folat und Vitamin
125 57 B12 durch Einsatz der Isotope Jod bzw. Kobalt ermöglichen.
Auf dem Gebiet der Schilddrüsenuntersuchung sind gleichzeitige
125 Bestimmungen von T4 und T3 durch Verwendung von J-markiertem
131
Thyroxin und ' J-markiertem Trijodthyronin durchgeführt worden
(S.P. Hayes und D.J. Goldie, Ann. Clin. Biochem. (1977)
j_4, 12-15; M.L. Brown et al., J. Nucl. Med. (1977) J_8, 300-304).
Die Anwendung dieses letzteren Isotopen-Doppeltests ist jedoch durch die verhältnismäßig kurze 8-Tages-Halbwertzeit von
J stark beschränkt.
Erfindungsgemäß wird dieser Nachteil überwunden, indem ein
Isotopen-Doppeltest auf Schilddrüsenfunktion zur Verfügung
gestellt wird, der sich dadurch auszeichnet, daß die radioaktiv markierte Version einer der zu testenden Schilddrüsen-
Isotopen-Doppeltest auf Schilddrüsenfunktion zur Verfügung
gestellt wird, der sich dadurch auszeichnet, daß die radioaktiv markierte Version einer der zu testenden Schilddrüsen-
75
komponenten mit Se markiert wird. So führt die Erfindung
komponenten mit Se markiert wird. So führt die Erfindung
gemäß einem Aspekt zu einem Verfahren zum Testen der Schilddrüsenfunktion
mit Hilfe eines Sadioimmuntests einer Probe
nach der an sich bekannten Isotopen-Doppeltechnik unter Verwendung von zwei der mit zwei verschiedenen Radionukliden
markierten Schilddrüsenkomponenten T4, T3, TSH und TBG, dadurch gekennzeichnet, daß eine der beiden Schilddrüsenkompo-
nach der an sich bekannten Isotopen-Doppeltechnik unter Verwendung von zwei der mit zwei verschiedenen Radionukliden
markierten Schilddrüsenkomponenten T4, T3, TSH und TBG, dadurch gekennzeichnet, daß eine der beiden Schilddrüsenkompo-
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nenten mit Se markiert wird.
nenten mit Se markiert wird.
Die Verwendung von Se anstelle von J zur Markierung einer der zu testenden Komponenten bringt den sehr xtfesentlichen
Vorteil einer langen Lebensdauer des Testsatzes als Ergebnis
75 75
der langen Halbwertzeit von Se Π18 Tage für Se gegenüber
8 Tagen für J) mit sich. Die Leistung eines mit Se markierten Thyroxinderivats, nämlich des Komplexes von Thyroxin und
2-<Methylseleno)-äthylamin- Se, wurde mit dem J-T4 ver-
75 125
glichen, indem der Se-T4-Ligand an die Stelle des J-T4-Liganden in einem handelsüblichen Testsatz gesetzt wurde
(The Radiochemical Centre Limited, T4 RIA (PEG) kit, IM 92). Fig. 1 veranschaulicht den Zusammenhang (Korrelationskoeffizient 0,968) zwischen den mit den beiden verschiedenen radioaktiven Liganden erzielten Werten.
(The Radiochemical Centre Limited, T4 RIA (PEG) kit, IM 92). Fig. 1 veranschaulicht den Zusammenhang (Korrelationskoeffizient 0,968) zwischen den mit den beiden verschiedenen radioaktiven Liganden erzielten Werten.
Für die Isotopen-Doppeltests können die Techniken des Radioimmuntests
angewandt werden, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Im allgemeinen werden gemischte Antiseren zu den beiden
zu testenden Schilddrüsenkomponenten und die beiden radioaktiv markierten Versionen der Schilddrüsenkomponenten in
einem einzigen Röhrchen entweder mit Proben, z.B. aus Serum, die zu testen sind, oder mit Standardgemischen inkubiert.
Wie bekannt, sollten die Mengen an zu testender Schilddrüsen-
zu testenden Schilddrüsenkomponenten und die beiden radioaktiv markierten Versionen der Schilddrüsenkomponenten in
einem einzigen Röhrchen entweder mit Proben, z.B. aus Serum, die zu testen sind, oder mit Standardgemischen inkubiert.
Wie bekannt, sollten die Mengen an zu testender Schilddrüsen-
komponente und deren markierter Version zusammen mehr als ausreichend für die Reaktion mit dem gesamten vorgelegten
Antikörper sein, so daß die Schilddrüsenkomponente und deren markierte Version um die Reaktion mit dem Antikörper
konkurrieren. Nach der Inkubation wird der Anteil der Schilddrüsenkomponente (und der markierten Version), der an den
Antikörper gebunden ist, von dem nicht gebundenen Anteil, z.B. durch Zugabe eines geeigneten, auf dem Fachgebiet zur
Fällung oder Adsorption einer oder der anderen Fraktion bekannten Materials, getrennt. Dann wird die radioaktive Konzentration
des gebundenen oder des freien, vorzugsweise aber des gebundenen Anteils gezählt. Diese Zählung kann durch zweimaligen
Durchlauf des Anteils durch einen γ-Strahlenzähler
erfolgen, wobei der Zähler auf die Erfassung von γ-Strahlung
unterschiedlicher Energie bei jedem Durchgang eingestellt ist; es wird aber wesentlich bevorzugt, einen Doppelkanalzähler
zu verwenden. Die Spitzenenergien der γ-Emission von Se finden sich bei 121, 136, 265 und 379 keV, während die Spitzen-
1 25
energien des J sich bei 31 und 65 keV finden, es ist daher einfach, einen Zähler so einzustellen, daß er zwischen
den beiden Radionukliden unterscheidet.
Die markierte Version der Schilddrüsenkomponente kann mit der unmarkierten Komponente chemisch identisch sein, wie
1 25
in dem Falle, wo T3 oder T4 mit J markiert ist, oder chemisch ähnlich sein, wie in dem Falle, wo die Komponente mit Se markiert ist. Wesentlich ist, daß die Molekülkonfiguration der markierten Version der der unmarkierten Komponente ausreichend ähnlich sein sollte, so daß die beiden Moleküle wirksam miteinander beim Radioimmuntest um die Reaktion mit Antikörper zu der Komponente konkurrieren können. Aus diesem Grunde ist es wünschenswert, den Ersatz der Jodatome beim Markieren von T3 oder T4 mit einem fremden Radionuklid zu vermeiden, sondern eher das Radionuklid an die Carbonsäure- oder Aminogruppe des Moleküls zu binden .
Bevorzugte Se-Derivate von T3 und T4 zur erfindungsgemäßen
in dem Falle, wo T3 oder T4 mit J markiert ist, oder chemisch ähnlich sein, wie in dem Falle, wo die Komponente mit Se markiert ist. Wesentlich ist, daß die Molekülkonfiguration der markierten Version der der unmarkierten Komponente ausreichend ähnlich sein sollte, so daß die beiden Moleküle wirksam miteinander beim Radioimmuntest um die Reaktion mit Antikörper zu der Komponente konkurrieren können. Aus diesem Grunde ist es wünschenswert, den Ersatz der Jodatome beim Markieren von T3 oder T4 mit einem fremden Radionuklid zu vermeiden, sondern eher das Radionuklid an die Carbonsäure- oder Aminogruppe des Moleküls zu binden .
Bevorzugte Se-Derivate von T3 und T4 zur erfindungsgemäßen
Verwendung haben die Formel
0 3.0033/^7
0 3.0033/^7
a) R1 ist OH oder eine Carboxylschutzgruppe,
R2 ist -CO-CX1X2X3
wenigstens eine der Gruppen X.., X2 und X3 ist -A (SeQ) ,
A ist ein gesättigter Alkylenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Q ist ein Alkyl- oder Alkenylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl,
ρ ist 0 oder 1,
q ist 1 oder 2,
q ist 1 oder 2,
eine der Gruppen X1, X2 und X3 kann eine Amino- oder geschützte
Aminogruppe sein,
eine oder zwei der Gruppen X1, X2 und X3 kann H sein,
M ist H oder J, oder
b) R2 ist H oder eine Aminoschutzgruppe,
R1 ist -NZ-CY1Y3Y3,
wenigstens eine der Gruppen Y1, Y2 und Y3 ist -A-(SeQ) ,
eine der Gruppen Y1, Y2 und Y3 kann -COOH oder geschütztes
Carboxyl sein,
eine oder zwei der Gruppen Y1, Y2 und Y3 kann H sein,
Z ist H oder -A-(SeQ) ,
A ist gesättigtes Alkylen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Q ist Alkyl oder Alkenyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl,
q ist 1 oder 2,
M ist H oder J.
q ist 1 oder 2,
M ist H oder J.
Nachfolgend finden sich Beispiele für Verbindungen, die für die Reaktion mit T3 oder T4 oder einem Derivat hiervon, worin
entweder die Carboxyl- oder die Aminogruppe geschützt ist, auf diese Weise verwendet werden können:
CH3SeCH3CH(NH2)COOH
CH3SeCH2CH(SeCH3)COOH
CH3C(CH2SeCH3)2COOH
(CH3SeCH2CH2)2NH
CH3SeCH2CH2COOH
CH3C(CH2SeCH3)2NH2
C6H5.CH2SeCH2CH2COOH
C6H5-CH2SeCH2CH2NH2
CH3SeCH2CH(SeCH3)COOH
CH3C(CH2SeCH3)2COOH
(CH3SeCH2CH2)2NH
CH3SeCH2CH2COOH
CH3C(CH2SeCH3)2NH2
C6H5.CH2SeCH2CH2COOH
C6H5-CH2SeCH2CH2NH2
Das Selen in diesen T3- und T4-Derivaten enthält einen künstlich hohen Anteil an Se, so daß die radioaktive Konzentration
des Derivats in angemessener Zeit mit herkömmlichen γ-Strahlungszählern gezählt werden kann.
Die Erfindung zielt auf Isotopen-Doppeltests u.a. in den folgenden Klassen:
getestete | Schilddrüsen- Variable |
mit Se markierte Variable |
T3 ; | T4 | T3 oder T4 |
T4 ; | TSH | T4 |
T4 ; | TBG | T4 |
T3 ; | TSH | T3 |
T3 ; | TBG | T3 |
bevorzugt
möglich
Die Erfindung zielt nicht nur auf die Bestimmung von T4 (oder T3) insgesamt, sondern auch von freiem T4 (oder freiem T3) in
Verbindung mit den anderen erwähnten Gebilden ab. Eine Einzeltestbestimmung von freiem T4 (oder freiem T3) ist in der eigenen
britischen Patentanmeldung 79 33 072 beschrieben. Die Bestimmung von freiem T4 in Verbindung mit TSH in einem einzigen Doppel-Isotopentest
kann bei der" Diagnose von Schilddrüsenerkrankungen besonders nützlich sein.
Die markierten T3- und T4-Derivate können nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt werden. Beispielsweise
wird Chlorameisensäureisobutylester mit N-Trifluoracetyl-T3 oder -T4 in Gegenwart eines tert.-Amins bei Raumtemperatur
unter wasserfreien Bedingungen in Lösungsmitteln, wie Dioxan und Dimethylformamid, zu dem gemischten Anhydrid umge-
f\ r* ** *■* *■*■ ^ / O Π Π Λ
setzt. Das gemischte Anhydrid wird dann bei Raumtemperatur in wässrig-organischen Medien mit dem erforderlichen Selenoamin,
Selenoaminoessigsäure oder -ester,z.B. 2- (Methylseleno)-äthylamin
oder Methylselenocystein, zu einer Amidbindung zwischen T3 oder T4 und dem Selenrest umgesetzt. Statt zur
Bildung des gemischten Anhydrids Chlorameisensäureisobutylester zu verwenden, kann die Kondensation von N-Trifluoracetyl-T3
oder -T4 entweder mit einem Selenoamin oder einer Selenoaminosäure in wasserfreien Lösungsmitteln, z.B. Dioxan
oder Dimethylformamid, mit Reagentien, wie Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) oder N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-dihydrochinolin
(EEDQ) angewandt werden. Andererseits können diese Maßnahmen unter Einsatz von DCC und EEDQ zum Kuppeln eines
T3- oder T4-Alkylesters über dessen freie Aminogruppe an eine Selenocarbonsäure oder eine Selenoaminosäure angewandt werden.
Die Abspaltung von Schutzgruppen kann nach bekannten Hydrolyseverfahren erfolgen. Endprodukte werden durch präparative
Dünnschichtchromatographie an Kieselgel isoliert.
Die zur Synthese der T3- oder T4-Derivate verwendeten Selenoamine,
Selenoaminosäuren und Selenocarbon:>äuren können nach
auf dem Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt werden. Beispielsweise werden Lösungen von Natriumalkyl-, -alkenyl-,
-cycloalkyl-, -aryl- oder -aralkylseleniden durch Umsetzen der geeigneten Halogenverbindungen mit Dinatriumdiselenid
in wasserfreiem flüssigem Ammoniak und anschließendes Spalten der so gebildeten organischen Diselenide mit metallischem
Natrium hergestellt. Die Natriumalkyl-, -alkenyl-, -cycloalkyl-, -aryl- oder -aralkylselenide werden dann weiter in
wasserfreiem flüssigem Ammoniak mit geeigneten Halogenderivaten von Aminen, Aminosäuren oder Carbonsäuren zu den gewünschten
Produkten umgesetzt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die Beispiele 1 bis 3 beziehen sich auf die Herstellung von
Se-Derivaten von T4, und die Beispiele 4 bis 6 zeigen drei verschiedene Arten von Isotopen-Doppeltests, die das Produkt
des Beispiels 1 anwenden. Beispiel 7 bezieht sich auf T3.
Sao
i) Herstellung von N-Trifluoracetyl-thyroxin
240/6 mg (0,310 mMol) Thyroxin wurden in 3 ml Trifluoressigsäureanhydrid
suspendiert und das Gemisch 4 h unter Rückfluß gerührt. Das Trifluoressigsäureanhydrid wurde durch Verdampfen
im Vakuum entfernt und der Rückstand in ca. 5 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 20 ml Wasser zu der methanolischen Lösung
bildete sich ein Niederschlag, der abzentrifugiert,
mit 3 χ 20 ml Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet wurde. Ausbeute an N-Trifluoracetyl-thyroxin ca. 200 mg.
ii) Herstellung von 2-(Methylseleno)-äthylamin- Se
Natriumselenit- Se (2,71 Ci, 21,7 Ci/mAtom) in saurer Lösung wurde mit Schwefeldioxid behandelt, um rotes Se auszufällen,
das nach dem Waschen mit Wasser in ein Reaktionsrohr überführt und im Vakuum getrocknet wurde. Ausbeute 2,48 Ci
75 75
an rotem Se. Das Se wurde in wasserfreiem flüssigem Ammoniak suspendiert und mit Natriummetall (3,1 mg, 0,135 mAtom) behandelt, um eine Lösung von Dinatriumdiselenid- Se zu bilden. Methyljodid im Überschuß (22,2 mg, 0,156 mMol) wurde zugesetzt, um Dimethyldiselenid- Se zu bilden, das durch weitere Zugabe von Natrium gespalten wurde, um Natriummethylselenid-Se zu bilden. 2-Bromäthylamin-Hydrobromid (22,8 mg, 0,111 mMol) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann gerührt wurde, bis der Ammoniak verdampft war. Der Rückstand wurde eine Zeit unter Vakuum gehalten, um flüchtige Verunreinigungen zu entfernen, in Wasser gelöst und durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Butan-1-ol, Essigsäure, Wasser 60:15:25). Der gesuchte Bereich wurde durch Autoradiographie lokalisiert und das Produkt aus dem Kieselgel gewonnen. Ausbeute an 2-(Methylseleno)-äthylamin- Se 280 mCi.
an rotem Se. Das Se wurde in wasserfreiem flüssigem Ammoniak suspendiert und mit Natriummetall (3,1 mg, 0,135 mAtom) behandelt, um eine Lösung von Dinatriumdiselenid- Se zu bilden. Methyljodid im Überschuß (22,2 mg, 0,156 mMol) wurde zugesetzt, um Dimethyldiselenid- Se zu bilden, das durch weitere Zugabe von Natrium gespalten wurde, um Natriummethylselenid-Se zu bilden. 2-Bromäthylamin-Hydrobromid (22,8 mg, 0,111 mMol) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann gerührt wurde, bis der Ammoniak verdampft war. Der Rückstand wurde eine Zeit unter Vakuum gehalten, um flüchtige Verunreinigungen zu entfernen, in Wasser gelöst und durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Butan-1-ol, Essigsäure, Wasser 60:15:25). Der gesuchte Bereich wurde durch Autoradiographie lokalisiert und das Produkt aus dem Kieselgel gewonnen. Ausbeute an 2-(Methylseleno)-äthylamin- Se 280 mCi.
73 300A382
iii) Herstellung des Thyroxin/2-(Methylseleno)-äthylamin-Se-Komplexes
Zu N-Trifluoracetyl-thyroxin (32,5 mg, 3,72 χ 10 mMol),
gelöst in trockenem Dimethylformamid (500 μΐ), wurde trocke-
_2 nes Triäthylamin (5 μΐ, 3,59 χ 10 mMol) und Chlorameisen-
_2 säureisobutylester (5 μΐ, 3,81 χ 10 mMol) gegeben. Nach
3 min wurden 125 μΐ dieses Gemischs zu einer Lösung von
2-(Methylseleno)-äthylamin-75Se (28,6 mCi, 21 Ci/mMol,
1,36 χ 10 mMol) in einem Gemisch aus Dimethylformamid (1000 μΐ), Wasser (500 μΐ) und Triäthylamin (10 μΐ) gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt, und nach dem Verdampfen der flüssigen Materialien im Vakuum wurde der Rückstand mit wässrigem Natriumhydroxid
(1,2 ml, 1,16 n) bei 70 bis 75°C 45 min behandelt. Wasser wurde verdampft und das lyophilisierte Produkt in Methanol
(500 μΐ) gelöst, bevor durch präparative Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform, Methanol, Ameisensäure (80:15:5) als Entwicklungs-Elutionsmittel gereinigt
wurde. Radioaktive Bereiche wurden autoradiographisch lokalisiert. Der Bereich bei Rf um 0,5 wurde von der Platte
entfernt und das Produkt aus dem Kieselgel durch aufeinanderfolgendes Waschen mit Ammoniumhydroxidlösung in 50%igem
wässrigem Äthanol (2 ml, n), und Wasser (4x2 ml) eluiert.
Die endgültige Lösung wurde filtriert, um Siliciumdioxidteilchen zu entfernen. Ausbeute an mit Se-markiertem
Thyroxin-Komplex 3,3 mCi. Das Reinigungsverfahren entfernt
nicht umgesetztes Thyroxin. Folglich war die spezifische Aktivität des Produkts 21 Ci/mMol.
i) Herstellung von Se-Methyl-L-selenocystein-methylester- Se
Se-Methyl-L-selenocystein-75Se (151 mg, 0,83 mMol, 26 mCi/mMol)
wurde in methanolischem Chlorwasserstoff 30 min rückflußge-
■0 3;00337:07
kocht. Methanol wurde verdampft und der Vorgang mit dem Rückstand wiederholt. Nach dem Entfernen des Methanols wurde das
lyophilisierte Produkt mit verdünnter wässriger Natriumbicarbonatlösung behandelt und der Methylester aus dem Gemisch
mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel
dann eingedampft, um Se-Methyl-L-selenocystein-methylester-
Se als öl zu ergeben.
ii) Herstellung des Thyroxin/Se-Methyl-L-selenocysteinmethylester-Se-Komplexes
Se-Methyl-L-selenocystein-methylester- Se (47 mg, 0,24 mMol,
19,4 mCi/mMol) wurde in trockenem Dioxan (10 ml) gelöst.
2 ml dieser Lösung wurden zu einem Gemisch von N-Trifluoracetyl-thyroxin
(33,5 mg, 0,0383 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (20 mg, 0,097 mMol) in trockenem Dioxan (3 ml)
gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Dioxans im Vakuum wurde
das Rohprodukt in Methanol (500 μΐ) gelöst und durch präparative
Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Äthylacetat, Methanol (4:1) als Entwicklungs-Elutionsmittel
gereinigt. Das Produkt wurde aus einer üV-absorbierenden radioaktiven Zone nahe der Lösungsmittelfront isoliert.
Ausbeute 147 \iCi an mit Se-markiertem Thyroxin-Komplex.
i) Herstellung von ß-Selenocyanatopropionsäure- Se
Rotes Se (366,7 mg, 4,46 mAtom, 0,526 mCi/mAtom) wujrde in
ca. 3 ml Wasser mit Kaliumcyanidgehalt (301,2 mg, 4,63 mMol) gelöst. Nach 1 h wurde das Gemisch filtriert und lieferte
eine Lösung von Kalium-selenocyanat- Se (2,07 mg, 3,93 mMol). ß-Propiolacton (3,09 mg, 4,27 mMol) wurde der Lösung zugesetzt,
und das Gemisch wurde 1 h gerührt, mit Salzsäure angesäuert und über Nacht stehen gelassen. Dann wurde zentrifugiert, und
die überstehende Flüssigkeit wurde mit Diäthyläther ( 2 χ 25 ml) extrahiert. Der Äther wurde aus dem Extrakt verdampft,
um 254 mg (1,43 mMol)"ß-Selenocyanatopropionsäure- Se zu
liefern.
ii) Herstellung von Benzylselenopropionsäure- Se
254 mg (1,43 mMol) $-Selenocyanatopropionsäure- Se in (2 ml) Äthanol wurde unter Rühren in ein Gemisch von Natriumborhydrid
(191 mg, 5,50 mMol) und Benzylchlorid (198 mg, 1,56 mMol) in 6 ml eiskaltem Äthanol getropft. Nach 1,5 h wurde das
Reaktionsgemisch mit 2 ml Aceton und einigen wenigen Tropfen konzentrierter Salzsäure behandelt, um überschüssiges Borhydrid
zu zerstören. Verdampfen der Lösungsmittel aus dem Gemisch lieferte ein öl, das zwischen Äther und wässriger
Natriumhydrogencarbonatlösung verteilt wurde. Die wässrige Phase wurde angesäuert und mit Äther rückextrahiert. Verdampfen
dieser Ätherphase lieferte radiochemisch reine Benzyl-
75
selenopropionsäure- Se.
selenopropionsäure- Se.
iii) Herstellung des Thyroxin-methylester/Benzylseleno-
75
propionsäure- Se-Komplexes
propionsäure- Se-Komplexes
38,5 mg (0,049 mMol) Thyroxinmethylester, 22,8 mg (0,11 mMol)
Dicyclohexylcarbodiimid und Benzylselenopropionsäure- Se
(20,8 mg, 0,086 mMol, 0,52 mCi/mMol) wurden über Nacht in
10 ml trockenem Dioxan gerührt. Das Gemisch wurde zur Trockne
eingeengt und das Produkt durch Dünnschichtchromatographie in mehreren Lösungsmittelsystemen geprüft. In allen Fällen
wurde eine radioaktive Komponente zusätzlich zu dem nichtumgesetzten Thyroxin-methylester und der Benzylselenopropionsäure-
Se nachgewiesen.
Das Produkt wurde in Dioxan wieder aufgelöst, die Lösung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dann auf
eine präparative Dünnschichtchromatographie-Kieselgelplatte
-γ-
aufgebracht. Die Platte wurde mit Chloroform, Methanol (10:1) entwickelt, und die Komponente mit Rf um 0,9 wurde
durch Eluieren der Kieselgelzone mit Äthanol isoliert. Nach Verdampfen des Äthanols wurde das Produkt IR-spektroskopisch
untersucht: Das Spektrum stimmte mit der Struktur des T4-Methylester/Benzylselenopropionsäure-Komplexes
überein. Ausbeute 7,3 μθΐ.
Isotopen-Doppeltest auf T4 und T3
a) Herstellung von Reagentien und Standards:
i) Antisera
Gemischte Antisera zu T4 und T3 wurden in geeigneten Verdünnungen in einem Barbiton/Acetat-Puffer mit
0,625 % Thiomersalat (einem gewöhnlich verwendeten Mittel zum Blockieren der Bindung von T4 an TBG)
hergestellt.
ii) Radioaktive Markierungen
Gemische aus Se-T4 (dem Komplex von T4 mit 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se,
hergestellt wie in Beispiel 1) und 125J-T3 wurden in Barbiton/Acetat-Puffer mit 0,625 %
Thiomersalat hergestellt.
iii) Standards
Humanserum-Standards mit kalibrierten Werten an T4 und T3 wurden verwendet.
b) Protokoll:
50 μΐ Serum (entweder Proben oder Standards) wurden mit
200 μΐ radioaktiven Markierungsgemischs und 200 μΐ
gemischter Antisera 1 h bei 370C inkubiert. Die Reaktion
30Ö4382
wurde beendet, und Antikörper-gebundenes T4 und T3 wurden durch Zugabe von 1 ml Polyäthylenglykol 6000 (20 Gew. /Vol.-%
in Wasser) ausgefällt. Die Reaktionsröhrchen wurden dann zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten dekantiert.
c) Doppelte Isotopenzählungs
Die Fällungen wurden auf einem Zweikanal-γ-Zähler mit
I25.
Fenstern bei 10 bis 90 keV für für 75Se gezählt.
'J und 90 bis 480 keV
Die aus dem doppelten Isotopentest erhaltenen Werte wurden mit denen verglichen, die aus zwei unabhängigen Tests unter
Verwendung der gleichen Reagentien erhalten wurden, aber mit nur einer einzigen radioaktiven Markierung, d.h. entweder
75Se-T4 oder 125J-T3 (vgl. Tabelle 1).
Vergleich des doppelten und des einfachen Isotopentests auf T4 und T3
T4 (ug/100 | ml) | T3 (ng/ml) | Einzeltest | |
Kontroll serum |
Doppeltest | Einzel test |
Doppeltest | 0,2 |
A | 2,4 | 2,5 | 0,2 | ■ 1,9 |
C | 12,3 | 13,5 | 2,0 | 2,8 |
G | 4,7 | 4,9 | 2,2 | 0,4 |
H | 1,6 | 1,5 | 0,4 | 1,5 |
J | 7,0 | 7,2 | 1,6 | |
Beispiel 5 | ||||
Doppelter Isotopentest auf T4 und TSH
a) Herstellung von Reagentien und Standards; i) TSH-Antiserum und Se-T4-Markierung
030033/07 7 2
TSH-Antiserum und Se-T4-Markierung (Komplex von T4 mit 2-(Methylseleno)-äthylamin-75Se, hergestellt
wie in Beispiel 1) wurden in geeigneten Konzentrationen in einem Barbiton/Acetat-Puffer mit 0,625 %
Thiomersalat gemischt.
125
ii) J-TSH-Markierung und T4-Antiserum
ii) J-TSH-Markierung und T4-Antiserum
1 25
J-TSH-Markierung und T4-Antiserum wurden in
geeigneten Konzentrationen in einem Barbiton/Acetat-Puffer mit 0/625 % Thiomersalat gemischt. Dieses
Reagens enthielt auch Kaninchen- und Schaf-Trägerserum,
um eine angemessene Fällung in Gegenwart des zweiten Antikörpers zu liefern.
iii) Standards
Humanserum-Standards mit kalibrierten Werten an T4 und TSH wurden verwendet.
iv) Zweiter Antikörper
Zweiter Antikörper, hervorgerufen in Esel gegen Ratten- und Schaf-Immunoglobulinfraktionen, wurde auf
eine optimierte Konzentration in Barbiton/Acetatpuffer verdünnt.
b) Protokoll
μΐ Serum (entweder Proben oder Standards) wurden mit
μΐ Reagens (i) 2 h inkubiert. Hierzu wurden 100 μΐ
Reagens (ii) gegeben und das Gemisch weitere 2 h inkubiert. μΐ des zweiten Antikörpers wurden zugesetzt, und nach
min erfolgte Zugabe von 1 ml Ammoniumsulfat (199 g/l). Die Reaktionsröhrchen wurden zentrifugiert und die überstehenden
Flüssigkeiten dekantiert.
c) Doppelte Isotopenzählung:
Fällungen wurden wie in Beispiel 4 gezählt.
ÖJ0Ö33/0772
Wieder wurden wie in Beispiel 4 die aus dem Isotopen-Doppeltest
erhaltenen Werte mit denen verglichen, die aus zwei unabhängigen Tests unter Verwendung der gleichen
Reagentien, aber mit nur einer einzigen radioaktiven
75 1 9 ζ
Markierung, entweder Se-T4 oder J-TSH erhalten wurden (vgl. Tabelle 2).
Vergleich des doppelten und des einzelnen Isotopentests auf T4 und TSH
T4 (ng/1 | 00 ml) | TSH (μΕ/ml, | r | test | |
Doppel | Einzel | MRC 68/38) | 5,6 | ||
Kontroll- | test | test | Doppel- Einzel | 7,3 | |
serum | 6,5 | 6,4 | test | 28,7 | |
B | 6,7 | 6,7 | 5,1 | 3,4 | |
C | 6,6 | 6,5 | 7,5 | 13,9 | |
D | 3,8 | 25,5 | |||
T4 A | 5,0 | 3,2 | |||
T4 C | 13,1 | ||||
Beispiel 6 | |||||
Isotopen-Doppeltest auf T4 und TBG a) Herstellung von Reagentien und Standards:
i) Bindendes Reagens
TBG-bindendes Reagens wurde hergestellt, um ein insgesamt 1%iges Schafserum und 6,4 % Esel-Zweitantikörper in
Barbitonpuffer mit 0,625 % Thiomersalat zu liefern, wobei die Schafkomponente eine optimierte Menge an
TBG-Antiserum enthielt. T4-Bindungsreagens wurde ähnlich hergestellt, um 0,2 % Schafserum mit einer optimierten
Menge an T4-Antiserum und 1,5% Esel-Zweitantikörper zu ergeben. Beide Reagentien wurden durch Zentri-
03d"Ö33/0772
fugieren getrennt, durch Suspendieren im gleichen Puffer und erneutes Zentrifugieren gewaschen und schließlich
in optimierten Konzentrationen in Barbitonpuffer mit 0,625 % Thiomersalat vereinigt.
ii) Radioaktive Markierungen
Gemische von Se-T4 (dem Komplex von T4 mit 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se,
hergestellt wie in Beispiel 1)
1 25
und J-TBG wurden in Barbitonpuffer mit 0,625 %
und J-TBG wurden in Barbitonpuffer mit 0,625 %
Thiomersalat hergestellt,
iii) Standards
iii) Standards
Humanserumstandards mit kalibrierten Werten an T4 und TBG wurden verwendet.
b) Protokoll:
50 μΐ Serum (entweder Proben oder Standards) wurden mit 500 μΐ
radioaktiven Markierungsgemischen und 1 ml Bindungsreagens 2 h inkubiert. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert und die
überstehende Flüssigkeit dekantiert.
c) Isotopendoppelζählung:
Fällungen wurden wie in Beispiel 4 gezählt.
Die aus dem Isotopen-Doppeltest erhaltenen Werte wurden mit denen verglichen, die aus zwei unabhängigen Tests
erhalten wurden, in denen ein einziges bindendes Reagens und die geeignete Markierung verwendet wurden (vgl.
Tabelle 3).
-030033/0772
- yr-
Vergleich der doppelten und einzelnen Isotopentests auf T4 und TBG
T4 (ng/1 | 7 | 00 ml) | TBG (mg/1) | ,3 | |
Serum | Doppeltest | Einzeltest | ,0 | ||
M1 | 5,4 | 6,2 | Doppeltest Einzeltest | ,0 | |
M2 | 5,9 | 7,1 | 16, | ||
M3 | 4,0 | 4,6 | 2O1 | ||
Beispiel | 12, | ||||
r3 16 | |||||
r3 20 | |||||
,3 13 | |||||
i) Herstellung von N-Trifluoracetyl-trijodthyronin
456,7 mg Trijodthyronin wurden in 20 ml Trifluoressigsäureanhydrid
suspendiert und das Gemisch 4,5 h unter Rückfluß gerührt. Das Trifluoressigsäureanhydrid wurde unter vermindertem
Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit (3 χ 25 ml) Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Ausbeute an
N-Trifluoracetyl-trijodthyronin 341,3 mg.
ii) Herstellung von Trijodthyronin/2-(Methylseleno)-äthylamin-Se-Komplex
Zu 24,0 mg (3,21 χ 10 mMol) N-Trifluoracetyl-trijodthyronin,
in 500 μΐ trockenem Dimethylformamid gelöst, wurden 5 μΐ
_2
(3,59 χ 10 mMol) trockenes Triäthylamin und 5 μΐ (3,81 χ
(3,59 χ 10 mMol) trockenes Triäthylamin und 5 μΐ (3,81 χ
-2
10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester gegeben. Nach 30 s
10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester gegeben. Nach 30 s
wurden 200 μΐ dieses Gemischs zu einer Lösung von 2-(Methylseleno)
-äthylamin- 75Se (22,9 mCi, 17,4 Ci/mMol, 1,31 χ 10~3
mMol) in einem Gemisch von 700 ml Dimethylformamid und 700 ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit 500 μΐ
Dimethylformamid verdünnt, 1 h gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Flüchtige Materialien wurden
aus dem Gemisch durch Eindampfen im Vakuum entfernt und der Rückstand mit wässrig-äthanolischem Natriumhydroxid (1 ml
030033/077?
?0Q4382
Äthanol, 2 η wässriges Natriumhydroxid, 1:1) 40 min bei 800C
behandelt. Nach Zugabe von 350 μΐ 3 η Salzsäure wurden die
Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Das lyophilisierte Produkt wurde in 350 μΐ Methanol gelöst und die Lösung auf eine
präparative Dünnschichtchromatographie-Kieselgelplatte gebracht, die mit Chloroform, Methanol, Ameisensäure (80:15:5)
entwickelt wurde. Radioaktive Zonen wurden autoradiographisch lokalisiert. Die Zone bei Rf um 0,4 wurde von der Platte entfernt
und das Produkt aus dem Kieselgel mit wässrig-äthanoli-
75 schem Ammoniumhydroxid eluiert. Ausbeute an Se-markiertem Trijodthyronin-Komplex 126 \iC±.
iii) Bindung von Trijodthyronin/2-(Methylseleno)-äthylamin-75Se-Komplex
(75Se-T3) an T3-Antiserum
T3-Antiserum (Titer für T3-Radioimmuntest 220.000) wurde auf eine 1%ige Lösung in Barbitonpuffer mit 0,625 % Thiomersalat,
pH 8,6, verdünnt. 50 μΐ 75Se-T3-Lösung (126 μΰχ/8 ml, 17,4 Ci/
mMol) wurden auf 10 ml mit dem gleichen Barbitonpuffer
zum Markierungsreagens 1 (4,5 nM-Konzentration an Se-T3) verdünnt, eine weitere 10fache Verdünnung des Markierungsreagens 1 mit Puffer lieferte das Markierungsreagens 2
■je.
(0,45 nM-Konzentration an Se-T3).
(0,45 nM-Konzentration an Se-T3).
50 μΐ harzbehandelten Serums (frei von T3) wurden mit 200 μΐ
Antiserum-Reagens und 200 μΐ Markierungsreagens (entweder 1
oder 2) inkubiert. Zur Kontrolle wurde eine ähnliche Inkuba-
1 25 tion unter Verwendung einer verdünnten Lösung von J-T3
75
anstelle der Se-T3-Markierung angesetzt. Antiserumgebundene Markierungen wurden durch Zugabe von 1 ml Polyäthylenglykol ausgefällt und dann durch Zentrifugieren abgetrennt. Überstehende Flüssigkeiten wurden dekantiert und die Fällungen gezählt.
anstelle der Se-T3-Markierung angesetzt. Antiserumgebundene Markierungen wurden durch Zugabe von 1 ml Polyäthylenglykol ausgefällt und dann durch Zentrifugieren abgetrennt. Überstehende Flüssigkeiten wurden dekantiert und die Fällungen gezählt.
Reagens: 75Se-T3 (1) 75Se-T3 (2) 125J-T3
% gebunden: 47,9 54,8 51,6
Claims (9)
- PatentansprücheVerfahren zum Testen" der Schilddrüsenfunktion mit Hilfe des Radioimmuntests einer Probe durch an sich bekannte Doppelisotopentechnik unter Verwendung von mit zwei verschiedenen Radionukliden markierten Versionen zweier der Schilddrüsenkomponenten T4, T3, TSH und TBG, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Schilddrüsenkomponenten mit Se markiert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß125 die andere der Schilddrüsenkomponenten mit J markiert wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß T3 oder T4 mit Se markiert wird, wobei markierte Derivate folgender Formel verwendet werden:CH2CHNHR2 COR1330033/0772a) R1 ist OH oder eine Carboxylschutz gruppe, R2 ist -CO-CX1X2X3 wenigstens eine der Gruppen X1, X2 und X3 ist -A (SeQ) ,ir j-A ist ein gesättigter Alkylenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ,Q ist ein Alkyl- oder Alkylenrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl,ρ ist 0 oder 1, q ist 1 oder 2, eine der Gruppen X- , X2 und X-, kann eine Amino- oder geschützte Aminogruppe sein, eine oder zwei der Gruppen X1, X2 und X3 kann H sein, M ist H oder J, oderb) R2 ist H oder eine Aminoschutzgruppe, R1 ist -NZ-CY1Y2Y3, wenigstens eine der Gruppen Y1, Y2 und Y3 ist -A-(SeQ) , eine der Gruppen Y1, Y2 und Y3 kann -COOH oder geschütztes Carboxyl sein, eine oder zwei der Gruppen Y-, Y2 und Y3 kann H sein, Z ist H oder -A-(SeQ) , A ist gesättigtes Alkylen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Q ist Alkyl oder Alkenyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl, q ist 1 oder 2, M ist H oder J.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,, daß für die Alternative a) R3 ausgewählt wird unter CH3.SeCH2.CH(NH2).CO-CH3.SeCH2-CH(SeCH3).CO-CH3.C(CH2-SeCH3).CO-CH3.SeCH2.CH2.CO-C6H5-CH2-SeCH2-CH2-CO-030033/0772
- 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß für die Alternative b) R1 ausgewählt wird unter CH3.SeCH2.CH2.NH-(CH3.SeCH2.CH2)2.N-CH3.C(CH2.SeCH3)2.NH-C6H5.CH2.SeCH2.CH2-NH-
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Test in den folgenden Klassen durchgeführt wird:getestete Schilddrüsen- mit Se markierte
Variable Variable T3 ; T4 T3 oder T4 T4 ; TSH T4 T4 ; TBG T4 T3 ; TSH T3 T3 ; TBG T3 - 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß75a) die zu testende Probe mit einer mit Se markierten125
T4-Version und einer mit J markierten T3-, TSH- oder TBG-Version und mit einem Antikörper zu T4 und einem Antikörper zu dem ausgewählten Vertreter der Gruppe T3, TSH und TBG gemischt wird, wobei die Menge an Antikörper in jedem Falle für die Reaktion mit der gesamten Schilddrüsenkomponente und deren markierter Version unzureichend ist,b) das Gemisch zur Umsetzung zwischen den Schilddrüsenkomponenten und deren markierten Versionen sowie den Antikörpern inkubiert wird,c) die Anteile der Schilddrüsenkomponenten und deren markierten Versionen, die an die Antikörper gebunden sind, von den nicht so gebundenen Anteilen getrennt,0300.33/-0772d) die radioaktiven Konzentrationen der gebundenen oder der ungebundenen Anteile gemessen unde) die Messungen zur Berechnung der Konzentrationen der Schilddrüsenkomponenten in der zu testenden Probe herangezogen werden. - 8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Schilddrüsenkomponente vor dem Zusammenmischen mit der markierten Version der Komponente mit ihrem Antikörper vorinkubiert wird.
- 9) Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe d) in einem einzigen Durchgang des Anteils durch einen Doppelkanalzähler erfolgt.030033/Q772
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