DE2916783A1

DE2916783A1 - Gallensaeuretest

Info

Publication number: DE2916783A1
Application number: DE19792916783
Authority: DE
Inventors: Phillip C Miller
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1978-04-26
Filing date: 1979-04-25
Publication date: 1979-10-31
Also published as: NL7902396A; CA1093962A; BE875854A; DE2916783B2; AU4563479A; JPS54149700A; GB2020014B; IT7922140A0; FR2424536A1; AU527381B2; IT1112580B; SE7903645L; DE2916783C3; GB2020014A; ES479985A1

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS.M. GRITSCHNEDER

Patentanwälte

München,

25. April 1979

Postanschrift / Postal Addreas Postfach 86O109, 8OOO München 8β

Pienzenauerstraßa

Telefon 98 32

Telegramme: Chemlndus München

Telex: CO] S23992

3504

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois, V.St.A.

Gallensäurete st

9038/^/0990

3504 -

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Erleichterung der Bestimmung einzelner Gallensäuren in biologischen Flüssigkeiten. Die Erfindung lässt sich besonders gut bei Tests anwenden, die an unextrahierten biologischen Flüssigkeiten durchgeführt werden, in welchen Gallensäuren gewöhnlich an endogene Proteine (wie Serumalbumin) gebunden sind. Das erfindungsgemässe Verfahren vermeidet eine Vorextraktion der Gallensäure von den bindenden Serumproteinen, indem gepufferte Bindungshemmstoffe zur Verdrängung der Gallensäuren von den störenden Bindungsproteinen eingesetzt werden.

Die Synthese von Gallensäuren aus Cholesterin in der Leber ist einer der wichtigsten katabolischen Vorgänge, welchen Cholesterin unterliegt. Schätzungsweise werden beim Menschen mehr als 80 % de? oiologischen Cholesterins in der Leber in verschiedene Gallensäuren und Gallensäurekonjugate umgewandelt.

Die primären Gallensäuren, d.h. Chol- und Chenodesoxycholsäure, werden durch die Leber gewöhnlich in Form der Glycin- oder Taurinkonjugate ausgeschieden und in der Gallenblase gespeichert. Obwohl einige Gallensäuren von der Gallenblase in das Blut resorbiert werden, werden die meisten mit der Galle durch den gewöhnlichen Gallengang in das Lumen des I>uodenums ausgeschieden, wo sie die Resorption des Cholesterins und die Verdauung und Resorption der Fettsäuren erleich-

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tern. Die unverbrauchten konjugierten Gallensäuren werden in den das Duodenum durchdringenden Blutgefässen resorbiert und kehren durch das Leberpfortensystem in die Leber zurück. Die im Duodenum nicht resorbierten Gallensäuren werden durch die Darmflora in sekundäre Gallensäuren, z.B. Lithochol- oder Desoxycholsäure, umgewandelt. Die sekundären Gallensäuren werden teilweise in das Blut resorbiert und gelangen durch das Leberpfortensystem zurück in die Leber, in der Lithocholsäure -weiter zu Sulfolithocholsäure metabolisiert wird. Bei gesunden Personen werden die Gallensäuren durch die Leber vom periteralen Kreislauf abgezogen und zurückgeführt. Wenn die Hepatocyten dagegen durch Infektion, Chemikalien oder mechanische Hindernisse geschädigt wurden, ist der enterohepatische Kreislauf der Gallensäuren gestört. Diese Störung kann sich durch erhöhte Gallensäurespiegel im peripheren Kreislauf bemerkbar machen.

Stoffwechselstörungen bei Lebererkrankungen oder -störungen können daher am Gehalt der Gallensäuren oder Gallensäurekonjugate im Serum erkannt werden. Bereits 1948 berichteten Sherlock und Walshe, Clin.Sci. 6, 223, dass die gesamten Serumgallensäuren bei hepatobiliären Erkrankungen zunehmen. Diese Beobachtung wurde in den darauffolgenden Jahren bestätigt. Die in Form der Kon jugate ύοώ. Cholsäure bestimmten Serumgallensäuren haben sich als das empfindlichste Indiz für Lebererkrankungen im Vergleich zu Tests auf Serumbilirubin, Proteine, die Prothrombinzeit und die Bromsulphthaleinretention erwiesen; vgl. M.G. Korman et al., J.New Engl. F. Med. 290 (1974), 1399. Demers und Hepner, Am.J.Clin. Path. 66 (1976), 831, berichten, dass Gehalte an Serumgallensäuren, insbesondere Sulfolithocholylglycin (SLCG), sehr empfindliche Indikatoren für Funktionsstörungen der Leberzellen sind. Die Feststellung der Gegenwart spezieller Gallensäuren oder ihrer

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Konjugate im Serum kann ein wertvolles Diagnosehilfsmittel bei der Beurteilung der Leberfunktion darstellen, und es wurden bereits mehrere Tests zur Bestimmung der Menge dieser Gallensäuren entwickelt.

Zu den erfolgreichsten derzeit angewendeten Tests gehören die Gasflüssigkeitschromatographie jjSandberg et al. , Lipid Res. 6 (1965), 182], ein enzymatischer Test unter Verwendung von Hydroxysteroid-Dehydrogenase {P.M. Murphy, Ann.Clin. Biochem. 9 (1972), 67J, und die Radioimmunoassay(RIA)-Methoden [Simmonds et al., Gastroenterology 65 (1973), 7O5J. Die RIA-Methoden werden aufgrund ihrer Eänpfindlichkeit, Spezifität und Zweckmässigkeit bevorzugt.

Ein Immuntest zum Nachweis und zur Bestimmung eines unbekannten Immunoreagens kann dadurch vorgenommen werden, dass man eine begrenzte Anzahl von spezifischen Bindungsstellen (Antikörpern) für ein Gemisch von markierten und unbekannten Reaktanten bereitstellt. Je grosser die Zahl der durch den Antikörper gebundenen markierten Reaktanten ist, umso geringer ist die Konzentration der in der Probe vorhandenen unbekannten Reaktanten. Für eine genaue Bestimmung ist es notwendig, dass sowohl die markierten als auch die unbekannten Reaktanten für die Reaktion mit den bereitgestellten Bindungsstellen frei sind. Diese Freiheit, eine konkurrierende Reaktion mit dem markierten Reaktanten einzugehen, wird häufig durch in der Serumprobe enthaltene andere Substanzen, gewöhnlich Proteine, wie Serumalbumin oder spezifische Bindungsproteine, behindert. Die genannten bindenden Proteine verhindern, dass sich der zu bestimmende Reaktant ausschliesslich mit dem bereitgestellten Antikörper verbindet, und beeinträchtigen daher die Genauigkeit des Tests.

Die Beseitigung des Bindungsproteinmaterials bei Serumgallen-

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säuren-Immuntests wurde durch verschiedene Extraktionsprozesse erreicht, bei welchen das störende Protein mit Hilfe geeigneter Lösungsmittel ausgefällt wird.

Es wurde auch eine Passage des Serums durch eine Säule mit Amberlite XAD-2 angewendet; vgl. Matern et al. , Clin. Chim. Acta 72 (1976), 39.

Bei allen herkömmlichen Methoden wird das Serum nicht direkt analysiert; d.h., vor dem Immuntest muss irgendein zeitraubender Extraktionsprozess vorgenommen werden.

Der. Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur direkten Bestimmung von Gallensäuren in Flüssigkeiten (Fluiden), wie Serum, Harn oder Galle, zu schaffen, welches keinen Extraktionsprozess für proteinartige oder andere störende Materialien benötigt. Insbesondere soll durch die Erfindung ein Mittel für den direkten immunologischen Test von Gallensäuren in biologischen Flüssigkeiten (insbesondere Serum) geschaffen werden, bei dem keine Extraktion der Flüssigkeitsproteine, an welche die Gallensäuren gebunden werden könnten, erforderlich ist.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einzelner Gallensäuren und ihrer Konjugate. Die Erfindung lässt sich insbesondere bei an einer unextrahierten Serumprobe durchzuführenden Tests anwenden. Speziell umfasst das erfindungsgemässe Verfahren folgende Stufen:

a) Bereitstellung eines für die zu bestimmende spezielle Gallensäure spezifischen Antiserums,

b) Vermischen der unbekannten Serumprobe mit dem Antiserum und derselben, jedoch mit einem Indikator markierten Gallensäure,

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c) Inkubieren der Mischung von Stufe b) , wodurch ermöglicht wird, dass sich jegliche Gallensäure des zu bestimmenden Typs und die markierte Gallensäure mit den Antikörpern des Antiserums verbinden,

d) Abtrennen der antikörpergebundenen Reaktanten von den ungebundenen Substanzen,

e) Messen der markiert-gebundenen Fraktion von Stufe d) zur Bestimmung des relativen Anteils der Gallensäure in der Probe durch Vergleich mit Standards und

f) als Verbesserung Durchführen des Tests in Gegenwart eines gepufferten Bindungshemmstoffs, dessen Konzentration dafür ausreicht, die Retention der Gallensäuren an in der unextrahierten Serumprobe vorhandenen bindenden Proteinen zu inhibieren.

Es folgt eine Erläuterung der bevorzugten Ausführungsform.

Die erfindungsgemässe Verbesserung des Gallenimmuntests kann zur Bestimmung der Gegenwart und Menge beliebiger Gallensäuren, wie SuIfolithocholsäure, Cholsäure, Chenodesoxycholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure oder Ursodesoxyeholsäure und Ihrer Aminosäurekon jugate, Sulfatester und Glucuronidkonjugate herangezoger, werden. Die bedeutendsten !Conjugate sind jene von Glycin und Taurin.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist auf Immuntests unabhängig von der angewendeten Markiermethode anwendbar. Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die spezielle Anwendung der Erfindung bei Radioimmunoassays, jedoch können die erfindungsgemässen Vorteile auch bei mit Enzymen oder fluoreszierend markierten Gallensäuren arbeitenden Tests verwirklicht werden.

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Beispiel

Radioimmunoassay auf Sulfolithocholylglycin

Dieses Beispiel erläutert eine Methode zur Bestimmung von Sulfolithocholylglycin (SLCG) in einer unextrahierten biologischen Flüssigkeit. Es werden folgende Reagentien verwendet:

1. Für Standardtests geeignetes SLCG-Pulver wird nach der Methode von Palmer und Bolt, J. Lipid Res. 12, 671 (1971) hergestellt. Das Pulver wird nach physikoehemischen Methoden vollständig auf seine Identität und Reinheit geprüft und dient zur Herstellung der Standards, des Traceranalogen und Immunogens. Für die Herstellung der Standards wird zuerst eine Vorratslösung von SLCG zubereitet. Eine bekannte Menge von SLCG-Pulver wird unter Verwendung von 0,08 % Ammoniak in einer Lösung von 50 ml Wasser/Äthanol gelöst. Die Vorratslösung wird dann auf die gewünschte Konzentration in einer Lösung von menschlichem Serumalbumin und Rinder-Gammaglobulin (BGG) in 0,9 %iger Kochsalzlösung verdünnt.

2. «T-SLCG-Tracer wird hergestellt, indem man zuerst durch Kopplung von SLCG an Histamin SuIf olithocholylglycylhistamin (SLCG-H) erzeugt. Das SLCG-H wird dann mit Jodogen (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) kodiert und mit Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) gereinigt.

3. SLCG-Antiserum wird gewonnen, indem man Kaninchen

mit an Rinder-Serumalbumin kovalent gebundenem SLCG unter Verwendung von wasserlöslichem üthylcarbodiimid immunisiert.

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4. Natriumsalicylat (Reagensqualität) wird yon mehreren Herstellern (J.T. Baker Chemical Co., Phillipburg, New Jersey und Mallinckrodt Chemical Co., St.Louis, Missouri) erhalten.

5. Der beim SLCG-RIA verwendete Puffer ist 0,05 m Phosphat, pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,9 % Natriumchlorid, 0,02 m Natriumsalicylat, 0,75 % Rinder-Gammaglobulin und 0,01 % Thimerosal. Der Radioimmunoassay wird wie folgt durchgeführt:

SLCG-RIA-Testverfahren

Wenn eine Gruppe unbekannter Proben analysiert wird, muss jeweils eine Standardkurve aufgestellt werden. ·

1. Alle Testreagentien werden auf Raumtemperatur gebracht.

2. Die Röhrchen werden für den Test wie folgt bezeichnet:

a) Die mit "TCT" (Gesamtzählröhrchen) markierten Röhr -

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chen) enthalten aliquote Mengen der ^vJ-SuIfolithocholylglycylhistamin-Reagenslösung. Diese Röhrchen dienen zur Bestimmung der Gesamtradioaktivität.

b) Die Röhrchen 3 und 4 dienen zur Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung (NSB), sofern diese Prüfung durchgeführt wird.

c) Die Röhrchen 5 bis 16 sind Standards, anhand welcher die Standardkurve aufgestellt wird:

Röhrchen 5 und 6, 0 μg/100 ml SLCG

Röhrchen 7 und 8, 10 μg/100 ml SLCG

Röhrchen 9 und 10, 25 μg/100 ml SLCG

Röhrchen 11 und 12, 50 μg/100 ml SLCG

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Rohrchen 13 und 14, 100 μg/100 ml SLCG Röhrchen 15 und 16, 250 μg/100 ml SLCG.

d) Die Röhrchen 17 etc. dienen für unbekannte Proben (jeweils doppelt).

3·- a) Man pipettiert 25 lil der SLCG-Standards in die passend markierten Röhrchen 5 bis 16;

b) man pipettiert 25 Wl der unbekannten Proben in die passend markierten Röhrchen beginnend mit 17»

c) man pipettiert 25 Ul SLCG-Standard, Oug/100ml, und 200 μΐ PBS-BGG-Puffer in die Röhrchen 3 und 4 (NSB).

4. Man pipettiert 200 μΐ ¹²⁵ J-SuIf olithocholylglycylhistamin-Reagenslösung in sämtliche Röhrchen,· mischt am Probenmischer 3 bis 5 Sekunden oder schüttelt das Priifröhrchengestell mit der Hand.

5. Man pipettiert vorsichtig und ohne Verzögerung 200 iil SLCG-Antiserum (Kaninchen) in sämtliche Röhrchen, mit Ausnahme der Röhrchen 1 bis 4, mischt am Probenmischer 3 TmLs 5 Sekunden oder schüttelt das Prüfröhrchengestell mit der Hand.

6. Man bedeckt sämtliche Röhrchen mit ParafilmW oder einem entsprechenden Material und inkubiert 1 Std. bei 37⁰C - 2⁰C.

7. Nach der Inkubierung pipettiert man 2 ml Polyäthylenglykollösung in sämtliche Röhrchen mit der Ausnahme der Röhrchen 1 und 2 (Gesamtzählröhrchen j TCT). Die während der Polyäthylenglykolzugabe verstreichende Gesamtzeit soll nicht mehr als 10 Min. betragen. Man mischt die Proben am Probenmischer 5 Sek. kräftig durch.

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8. Sofort (innerhall) von 15 Min. nach der Polyäthylenglykolzugabe) zentrifugiert man die Polyäthylenglykol enthaltenden Röhrchen 10 Min. bei Raumtemperatur und 1000 χ g.

9. Man entnimmt die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge (ohne den Niederschlag aufzuwirbeln), dekantiert die überstehende Lösung und wischt den Röhrchenrand mit Löschpapier ab.

10. Man zählt die in jedem Röhrchen einschliesslich TCT

(1 und 2) verbliebene Radioaktivität während jeweils mindestens 1 Minute. Nötigenfalls subtrahiert man den Hintergrund und notiert das Resultat als Netto-cpm-Wert.

11. Man berechnet die Resultate.

Typische Resultate für den SLCG-Radioimmunoassay sind aus Figur 1 ersichtlich, welche eine Standardkurve wiedergibt, die den Bereich der SLCG-Konzentration von 0 bis 250 μg/ 100 ml umfasst.

Die Reproduzierbarkeit der SLCG-RIA ist au,s Tabelle I ersichtlich, in welcher die Inter- und Intra-Test-Genauigkeit ·(precision) wiedergegeben ist. Die Genauigkeit des SLCG-RIA wird dadurch ermittelt, dass man eine Gruppe von vier Serumpror ben jeweils zehnfach an drei aufeinanderfolgenden Testan-,lässen unter Verwendung einer Material charge testet. Drei Schätzungen der Veränderlichkeit (Variabilität) werden berechnet: Inter-Test (zwischen), Intra-Test (innerhalb) und gesamte Variabilität. X ist definiert als ganzer Mittelwert (grand irean) über die drei Testanlässe.

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TABELLE I
SLCG-RIA~Intra- und -Inter-Test~Genauigkeit

Tabelle I zeigt die tatsächliche Gewinnung des gepulverten Materials aus menschlichem Serum. Die Probengruppen A, B, C und D sind abgestreifte normale menschliche Seren;
NHS Nr.118 und Nr.127 sind medizinische Volontäre.

	Probengruppe	Basis Nr.1	INTRA-TEST	Basis Nr.3	INTER-TEST	GESAMTER X	f
		*η 10**	Basis Nr.2	η ~ 10	Mittelwert der	ganzer Mittelwert	CJ
	SA-2 X	12,1 ygm/dl	η = 10	9,1 ygm/dl	Mittelwerte	η = 30	I
098	S.D.	0,9	11,1 ygm/dl	0,9	η = 3 10,8 ygm/dl	10,8 ygm/dl
ε ■	e.V..	7,7%	1,1	10,5%	l»⁵	1,6
^ ι O -3> ■	SB-2 X	44,5 ygm/dl	10,1%	41,3 ygm/dl	14,0%	14,7%
CO ° «Ο ι	S.D.	1,8	44,4 ygm/dl	2,6	43,4 ygm/dl	43,4 ygm/dl	rO CD
	CV.	4,1%	2,0	6,2%	1,8	2,5	CD -J
	SC-2 X	81,9 ygm/dl	4,5%	79,9 vigm/dl	4,2%	5,9%	CP
	S.D.	3,3	82,3 ygm/dl	2,5	81,4 ygm/dl	'81,4 ygm/dl
	c.v.·	4,1%	2,2	3,2%	1,2	2,9
	SD-2 X	147,1 ygm/dl	2,7%.	147,3'ygm/dl	1,5%	3,5%
	S.D.	6,3	147,1 ygm/dl	6,9	147,2 ygm/dl	147,1 ygm/dl
	CV.	4,3%	6,0	4,7%	0,10	6,2
		4,1%	0,08%	4,2%

TABELLE II ^ Test der SLCG-Gewlnnung

Die Genauigkeit (accuracy) des SLCG-RIA geht aus Tabelle II hervor, welche die Gewinnung
von zu normalem menschlichen Serum gegebenem SLCG wiedergibt. Die Tabelle zeigt eine gute Gewinnung von SLCG, was für eine hohe Genauigkeit spricht.

	Probe	A	0 Spike	40 μ^	Spike %	80 \ig%	% Ge	120 μg%	% Ge	Mittelwert
		B				Spike	winnung	Spike	winnung
O	Gruppe	C	9,96	47,09	92,8	81,59	89,5	108,15	81 ,8	88 %
co 00	Gruppe	D	39,11	79,84	101,8	116,31	96,5	154,31	96,0	98 %
S I	Gruppe	.118	81 ,22	119,22	95,0	147,59	83,0	186,16	87,4	88 %
-- -A O -A '-° ι*	■ Gruppe	.127	157,71	191,48	84,4	225,09	84,2	<25O		84 %
CD ' O	NHS Nr	33,8	77,5	94 %	119,1	107 %	160,2	105 %	102 %
	NHS Nr	19,1	65,3	115 %	107,0	110 %	148,0	107 %	111 %

Figur 2 veranschaulicht die Wirkung von Serumproteinen auf den SLCG-RIA. Man vergleicht zwei Standard kurven, von denen eine (1) unter Verwendung eines Puffers und die zweite (2) unter Verwendung von nach der Methode von Simmonds et al. , Gastroenterology (1973), 65, 705, hergestelltem SLCG-xreiem Serum aufgestellt wird. Das Serum wird getestet, indem man die Entfernung von HSLCG-Tracer verfolgt, um sicher zu sein, dass das Serum frei von SLCG ist. Die beiden Kurven lassen sich nicht überlagern bzw. in Deckung bringen, woraus die Hemmwirkungen bzw. Beeinträchtigungen der Serumproteine gegenüber dem SLCG-RIA hervorgehen, wenn man das SLCG' nicht von den Serumproteinen extrahiert oder befreit.

Figur 3 zeigt denselben Vergleich von zwei Standardkurven, von denen eine unter Anwendung eines Puffers und eine unter Anwendung eines gallenfreien Serums aufgestellt wurde. Dieser Vergleich wird jedoch unter Verwendung des vorgenannten SaIicylatpuffers durchgeführt. Die beiden Kurven lassen sich jetzt in Deckung bringen, woraus hervorgeht, dass Salicylat die Bindungswirkungen des Serumproteins beseitigt [J.Rudman, Clin. Invest. 36 (1957), 53O]. Die Salicylatpuffersysteme gestatten somit die direkte Durchführung des SLCG-RIA an unextrahierten Proben;

Der an normalen Versuchspersonen, die keine Nahrung zu sich nehmen, nach dem SLCG-RIA erzielte Mittelwert beträgt 0,7 mM. Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem Mittelwert von 0,6 mM für normale Versuchspersonen, welcher von Campbell, Clinica Chimica Acta 631 (1975), 248-262, nach einer Gasflüssigkeitschromatographiemethode unter Verwendung organischer Lösungsmittel und Ionenaustauschsäulen zur Extraktion des SLCG vom Serum erhalten wurde.

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Beispiel Radioimmunoassay zur Bestimmung von Cholylglycin

Dieses Beispiel zeigt, dass Cholylglycin in einer unextrahierten biologischen Flüssigkeit unter Verwendung einer mit Barbital gepuffertem ANS als Bindungshemmstoff getestet werden kann. Es werden folgende Reagentien für den Test zubereitet:

1. Cholylglycin (CG) (Sigman Chemical Co., St.Louis, Missouri) wird für Standards, Immunogen und Tracer verwendet. Dieses Pulver wird nach physikochemischen Methoden vollständig auf seine Identität und Reinheit untersucht; man stellt fest, dass es etwa 99 % reines CG ist. Die Standards werden hergestellt, indem· man eine bekannte Menge des CG-Pulvers in 50?£igem wässrigem Äthanol löst. Diese Vorratslösung wird dann in entweder einen Proteinpuffer oder einem gallensäurefreiem Serum verdünnt. Das gallensäurefreie Serum wird nach der Methode von Simmonds et al., Gastroenterology (1 973), 65, 705, hergestellt. Das Serum wird getestet, indem man die Entfernung von ^HCG-Tracer verfolgt, um sicher zu sein, dass das Serum frei von CG ist.

2. ¹²^J-CG-Tracer wird hergestellt, indem man Tyrosin kovalent an Cholylglycin zur Bildung von Cholylglycyltyrosxn (CGT) koppelt. Das CGT wird dann mit Hilfe von Chloramin-T jodiert und mit Hilfe von LH-20 Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) gereinigt.

3. Ein CG-Antiserum wird erhalten, indem man Kaninchen mit an Rindernerumalbumin kovalent gebundenem CG unter Verwendung von wasserlöslichem Äthylcarbodiimid immunisiert.

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4. 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) wird erhalten von Eastman Organic Chemicals (Rochester, New York).

5. Der beim Test verwendete Puffer ist 0,05 m Barbital pH 8,6, mit 0,4 millimolarer ANS, 0,75 g % Rinder-Gammaglobulin und 0,01 % Thimerosal.

Der Radioimmunoassay wird wie folgt durchgeführt:

CGRIA-Testverfahren

Bei der Analyse einer Gruppe unbekannter Proben wird jeweils
eine Standardkurve aufgestellt:

1. Alle Testreagentien werden auf Raumtemperatur gebracht.

2. Die Röhrchen werden für den Test wie folgt bezeichnet:

a) Die mit "TCT" (Gesamtzählröhrchen) bezeichneten Röhrchen

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enthalten aliquote Mengen der "V-Cholylglycyltyrosin-Reagenslösung. Diese Röhrchen dienen zur Bestimmung der Gesamtradioaktivität.

b) Die Röhrchen 3 und 4 dienen zur Bestimmung der nichtspezifischen Bindung (NSB), sofern diese Prüfung durchgeführt wird.

c) Die Röhrchen 5 bis 16 sind Standards, mit Hilf e welcher die Standardkurve aufgestellt wird:

Röhrchen 5 und 6, 0 pg/iOO ml CG Röhrchen 7 und 8, 25 μg/100 ml CG Röhrchen 9 und 10, 100 μg/100 ml CG Röhrchen 11 und 12, 250 μg/100 ml CG Röhrchen 13 und 14,1000 iig/iOQ ml CG Röhrchen 15 und 16,4000 μg/100 ml CG

d) Die Röhrchen 17 etc. dienen für unbekannte Proben (jeweils doppelt).

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3. a) Man pipettiert 25 ul der CG-Standards in die passend mar

kierten Röhrchen 5 bis 16;

b) man pipettiert 25 jul der unbekannten Proben in die passend markierten Röhrchen beginnend mit 17;

c) man pipettiert 25 ul CG-Standard, 0 ug/100 ml, und 200 μΐ 0,06 m Barbitalpuffer in die Röhrchen 3 und 4 (NSB).

4. Man pipettiert 200 Ul ^J-Cholylglycyltyrosin-Reagens lösung in sämtliche Röhrchen. Man vermischt sämtliche Röhrchen mit Ausnahme der Röhrchen 1 und 2 (TCT) am Probenmischer 3 bis 5 Sekunden oder .schüttelt das Prüfröhrchengestell mit der Hand.

5. Man pipettiert vorsichtig und ohne Verzögerung 200 ul CG-Antiserum (Kaninchen) in sämtliche Röhrchen, mit Ausnahme der Röhrchen 1 bis 4, mischt am Probenmischer 3 bis 5 Se-

■ künden oder schüttelt das Prüf röhrch enge stell mit der Hand.

6. Man bedeckt sämtliche Röhrchen mit Paraf ilm v_-/ oder einem entsprechenden Material und inkubiert 1 Stunde bei Raumtemperatur.

7. Nach der Inkubierung pipettiert man 2 ml Polyäthylenglykollösung in sämtliche Röhrchen mit Ausnahme der Röhrchen 1 und 2 (Gesamtzählröhrchen; TCT). Die während der PoIyäthylenglykolzugabe verstreichende Gesamtzeit soll nicht mehr als 10 Min. betragen. Man mischt die Proben am Probenmischer 5 Sek. kräftig durch.

8. Sofort (innerhalb von 15 Min. nach der Polyäthylenglykolzugabe) zentrifugiert man die Polyäthylenglykol enthaltenden Röhrchen 10 Min. bei Raumtemperatur und 1000 x g.

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10. Man zählt die in jedem Röhrchen einschliesslich TCT (1 und 2) verbliebene Radioaktivität während jeweils mindestens 1 Minute. Nötigenfalls subtrahiert man den Hintergrund und notiert das Resultat als Netto-epm-Wert.

11. Man berechnet die Resultate.

Figur 4 zeigt die Wirkung von Serumproteinen auf den CG-RIA. Man vergleicht zwei Standardkurven, von denen eine unter Verwendung eines Puffers und die zweite unter Verwendung eines CG-freien Serums (wie vorstehend beschrieben) aufgestellt wurde. Die beiden Kurven lassen sich nicht in Deckung bringen, was die Hemmwirkungen der Serumproteine gegenüber dem CG-RIA zeigt, wenn man das CG nicht extrahiert oder von den Serumproteinen befreit.

Figur 5 veranschaulicht denselben Vergleich von zwei Standardkurven, von denen eine unter Verwendung eines Puffers und die zweite unter Verwendung eines CG-freien Serums aufgestellt wurde. Dieser Vergleich wird jedoch mit dem vorstehend beschriebenen Barbital-ANS-Puffer durchgeführt (vgl. die vorgenannten Erläuterungen bezüglich "Reagentien"). Die beiden Kurven lassen sich jetzt in Deckung bringen, woraus hervorgeht, dass Salicylat die Bindungswirkung des Serumproteins gegenüber CG beseitigt (J. Rudman, Clin.Invest. 36 (1957), 530). Das Barbital-ANS-Puffersystem ermöglicht somit eine direkte Durchführung des CG-RIA an unextrahierten Proben.

Bei normalen Versuchspersonen, welche keine Nahrung zu sich

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nehmen, beträgt der nach diesem CG-RIA erzielte Mittelwert 0,43 mM. Dies steht im Einklang mit vorher publizierten normalen Werten für einen CG-RIA, bei dem eine Extraktionsmethode vorgenommen wurde (Maters, Clinicia Chimica Acta 725 (1976), 39 bis 43).

Die Reproduzierbarkeit des CG-RIA wird durch Tabelle III veranschaulicht, in welcher die Inter- und Intra-Test-Genauigkeit des CG-RIA wiedergegeben wird. Die Genauigkeit wird durch Bestimmung einer Gruppe von vier Serumsammelproben bei jeweils 1Ofacher Durchführung an drei aufeinanderfolgenden Anlassen unter Verwendung einer Mater!alcharge ermittelt. Es werden drei Schätzungen der Veränderlichkeit (Variabilität) berechnet: Inter-Test (zwischen), Intra-Test (innerhalb) und gesamte Variabilität. X ist definiert als ganzer Mittelwert über die drei Testanlässe.

Die Genauigkeit des CG-RIA wird in Tabelle IV veranschaulicht, welche eine gute Gewinnung von normalem menschlichem Serum zugesetztem CG erkennen lässt. Die gute Gewinnung zeigt eine hohe Genauigkeit an. Zur weiteren Bestätigung wird dieser Gewinnungstest unter Verwendung von Seren mit verschiedenen abnormalen Proteingehalten wiederholt (hypoalbumin, hypergammaglobulin und hypogammaglobulin). Der mit Barbital-ANS-Puffer durchgeführte CG-RIA zeigt eine gute Gewinnung mit verschiedenen Gehalten an abnormalen Proteinen, woraus hervorgeht, dass der Test für Seren mit Proteinabnormalitäten gut brauchbar ist.

Um die Brauchbarkeit des Tests für Harn und Galle nachzuweisen, werden Parallelitätsuntersuchungen durch Verdünnen mehrerer Harn- und Gallenproben durchgeführt. Die verdünnten Proben ergeben mit der Standardkurve parallel verlaufende Kurven.

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TABELLE III SLCG-RIA-Intra- und -Inter—Test-Genauigkeit

4>

	X	Basis Nr.1	INTRA-TEST	Basis Nr.3	INTER-TEST	GESAMT
	S.D.	η = 10	Basis Nr.2	η ■ - 10	Mittelwert der	ganzer Mittelwert
Probengruppe	CV.	79 ygm/dl	η = 10	75 ygm/dl	Mittelwerte	η - 30
	X	2,8	82 ygm/dl	4,4	n'« 3 79 ygm/dl	78 ygm/dl
¹CA-I	S.D.	3,6%	2,5	5,9%	3,5	4,6
	CV.	,254 ygm/dl	3,1%	231 ygm/dl	4,5%	5,8%
	X	21	238 ygm/dl	11,8	241 ygm/dl	240 ygm/dl
CB-I	S.D.	8,5%	97	5,1%	11,8	18
	cv.	1949 ygm/dl	4,1%	1015 pgm/dl	4,9%	7,4%
	X		1722 ugm/dl		1829 ygm/dl	1828 ygm/dl
CC-I	S.D.	4,6%		7,9%	114	162
	'CV.	858 ygm/dl	9,6%	753 ygm/dl	6_?2%	8,9%
			710 ygm/dl		774 ygm/dl	772 ygm/dl
CD-I	4,7%		6,1%	76	73
	1,6%	9,8%	9,3%

■fcS

CD

CD ·<! OO CO

3504

Genauigkeit

Tabelle IV zeigt die tatsächliche Gewinnung von gepulvertem Cholyglycin aus menschlichem Serum. Die Proben A, B und C sind normale menschliche Seren. Die Proben 14, 20, 21 , 22, 23, 28, 29 und 30 sind menschliche Seren mit abnormal geringen Konzentrationen von Immunoglobulin G» Die Proben 16, 17, 18, 24, 27, 33, 34, 35 und 36 sind menschliche Seren mit abnormal erhöhten Konzentrationen von Immunoglobulin G.

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TABELLE IV

Untersuchung der CG-Gewinnung

Probe 0 Spike 9,25 μqm/ml % Gewinnung

	Blindprobe	0,02
Normal	A	0,80
	B	2,37
	C	6,97
	14	0,16
	20	0,21
Hypo Ig G	21	0,15
	22	1,33
	23	0,23
	28	0,16
	29	0,17
	30	0,19
	16	0,26
Hyper Ig G	17	0,11
	18	0,08
	24	0,31
	27	0,13
	33	0,18
	34	0,83
	35	0,02
	36	3,42

9,25	100
9,3	92
11,2	95
15,43	92
9,27	98
9,58	101
10,0	106
10,03	94
9,87	104
9,39	100
9,65	102
9,30	98
9,36	98
9,10	97
8,08	86
9,25	97
8,61	92
9,19	97
9,47	97
9 ,2O	99
12,59	99

X % Gewinnung Hormal = 93 % Hyper Ig G = 96 % Hypo Ig G = 101 %

Ende der Beschreibung

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Leeseite

Claims

PATENTANSPRÜCHE

Test zum Nachweis und 2ur Bestimmung einer Gallensäure oder ihres Konjugats in einer unextrahierten Serumprobe, wobei man

a) ein gegenüber der zu testenden speziellen Gallensäure spezifisches Antiserum bereitstellt,

b) die Serumprobe mit dem Antiserum und derselben, mit einem Indikator markierten Gallensäure vermischt,

c) das Gemisch von Stufe b) inkubiert, so dass sich jegliche Gallensäure des zu testenden Typs und die markierte Gallensäure mit den Antikörpern des Antiserums verbinden können,

d) die antikörpergebundenen Reaktanten von den ungebundenen abtrennt,

e) die markierte gebundene Fraktion von Stufe d) zur Bestimmung des relativen Anteils der Gallensäure in der Probe durch Vergleich mit Standardproben misst,

f) dadurch gekennzeichnet, dass man den Test in Gegenwart eines Bindungshemmstoffs

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durchführt, wobei die Konzentration des Hemmstoffs dafür ausreicht, die Zurückhaltung der Gallensäuren durch in der unextrahierten Serumprobe vorhandene bindende Proteine zu hemmen.
2. Test nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bindungshemmstoff 8-Anilino-1 -naphthalinsulfonsäure, Natriumbarbital und/oder mindestens ein Salicylat verwendet.
3. Test nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bindungshemmstoff Natriumsalicylat verwendet.
4. Test nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende oder zu bestimmende Gallensäure Cholsäure ist.
5. Test nach Anspruch 1 bis 3₉ dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende oder zu bestimmende Gallensäure Sulfolithocholsäure ist.
6. Test zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholsäure oder ihres Konjugats in eirer unextrahierten Serumprobe, wobei man

a) ein gegenüber der zu testenden speziellen Gallensäure spezifisches Antiserum bereitstellt,

' b) die Serumprobe mit dem Antiserum und derselben, mit einem Indikator markierten Gallensäure vermischt,

c) das Gemisch von Stufe b) inkubiert, so dass sich jegliche Gallensäure des zu testenden Typs und die markierte Gallensäure mit den Antikörpern des Antiserums verbinden können,

d) die antikörpergebundenen Reaktanten von den ungebundenen abtrennt,

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e) die markierte gebundene Fraktion von Stufe d) zur Bestimmung des relativen Anteils der Gallensäure in der Probe durch Vergleich mit Standardproben misst,

f) dadurch gekennzeichnet, dass man den Test in Gegenwart von mit Barbital gepufferter 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure unter Anwendung einer dafür ausreichenden Konzentration durchführt, dass die Zurückhaltung der Cholsäure durch in der unextrahierten Serumprobe vorhandene bindende Proteine gehemmt wird.
7. Test nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Cholsäure in Form des Glycinkonjugats vorliegt.
8. Test zum Nachweis und zur Bestimmung von Sulfolithocholrsäure oder ihres Konjugats in einer unextrahierten Serumprobe, wobei man

a) ein gegenüber der zu testenden speziellen Gallensäure spezifisches Antiserum bereitstellt,

b) die Serumprobe mit dem Antiserum und derselben, mit einem Indikator markierten Gallensäure vermischt,

c) das Gemisch von Stufe b) inkubiert, so dass sich jegliche Gallensäure des zu testenden Typs und die markierte Gallen— säure mit den Antikörpern des Antiserums verbinden können,

d) die antikörper gebundenen Reaktanten von den ungebundenen abtrennt,

e) die markierte gebundene Fraktion von Stufe d) zur Bestimmung des relativen. Anteils der Gallensäure in der Probe durch Vergleich mit Standardproben misst,

f) dadurch gekennzeichnet, dass man den Test in Gegenwart von Natriumsalicylat unter Anwendung einer dafür ausreichenden Konzentration

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durchführt, dass die Zurückhaltung der Sulfolithocholsäure durch in der unextrahierten Serumprobe vorhandene bindende Proteine gehemmt wird.
9. Test nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfolithocholsäure in Form des Glycinkonjugats vorliegt.

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