DE69328945T2

DE69328945T2 - Pyridiniumderivate

Info

Publication number: DE69328945T2
Application number: DE69328945T
Authority: DE
Inventors: Toshikazu Hochi; Kazuharu Ienaga; Nakamura
Original assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-03-25
Filing date: 1993-03-25
Publication date: 2000-11-30
Anticipated expiration: 2013-03-26
Also published as: ES2149786T3; JP2000321273A; JP3483826B2; PT563797E; DK0563797T3; JP3113440B2; JPH0673057A; US5338850A; ATE194343T1; EP0563797B1; EP0563797A1; DE69328945D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Pyridiniumderivate, einen Antikörper hergestellt aus solchen Derivaten wie ein Hapten, ihre Anwendung für die Diagnose von Diabetes, diabetischen Komplikationen, Altern, altersbedingten Krankheiten usw., und ihre Verwendung für die Auswertung der Auswirkungen von Pharmazeutika, die wirksam sind gegen solche Diabetes-verwandten Krankheiten, Altern und Krankheiten bedingt durch dieses.
1968 wurde Glycosylhämoglobin (HbAlc), welches eine der weniger wichtigen Komponenten von Hämoglobin ist, in vivo nachgewiesen und es wurde gefunden, daß es in Patienten, die an Diabetes leiden, ansteigt. Mit dies als ein Impuls haben die biologische Bedeutung der Maillard-Reaktion und insbesondere die Beziehung zwischen Altern und Diabetes öffentliche Aufmerksamkeit erhalten.
Die Maillard-Reaktion kann in eine erste Stufe eingeordnet werden, worin eine Schiff-Base gebildet wird aus einer Aminogruppe eines Proteins und einer Aldehydgruppe eines reduzierten Zuckers und stabilisiert wird als ein Ergebnis einer Amadori-Umlagerung, und in eine zweite Stufe, in der das Obige nach einer langen Reihe von Reaktionen umgewandelt wird zu Produkten einer zweiten Stufe der Maillard-Reaktion, welche charakteristisch bezüglich Fluoreszenz, Farbänderung zu braun und molekularer Vernetzung sind. Die Fluoreszenz, welche bekannt ist als eine der charakteritischen Änderungen in den Produkten der zweiten Stufe der Maillard-Reaktion, ist signifikant höher in diabetischen Patienten als in gesunden und normalen Personen und von der vorgeschlagen wird, daß sie eine Korrelation mit dem Beginn von diabetischen Komplikationen wie diabetischer Nephrose, Arteriosklerose, nervöser Störung, Retinalkrankheiten, Katarakt usw. hat.
Jedoch sind grundlegende Strukturen für diese Produkte der zweiten Stufe der Maillard-Reaktion noch nicht geklärt worden. Folglich gab es viele zweideutige Punkte hinsichtlich der Mechanismen für die nichtenzymatische Verzuckerung und Vernetzung von Proteinen hervorgerufen durch Altern und Diabetes.
Die jetzigen Erfinder haben kontinuierliche Studien der Mechanismen von nichtenzymatischer Verzuckerung und der Vernetzung von Proteinen ausgeführt und als ein Ergebnis davon neue Pyridiniumderivate gefunden, die sich beziehen auf die grundlegenden Strukturen der Produkte der zweiten Stufe der Maillard-Reaktion, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Pyridiniumderivate, einen Antikörper hergestellt aus solchen Derivaten wie ein Hapten, ihre Verwendung für die Diagnose von Diabetes, diabetischen Komplikationen, Altern, altersbedingten Krankheiten usw.. und ihre Verwendung für die Auswertung der Auswirkungen von Pharmazeutika für Diabetes-verwandte Krankheiten, Altern, Krankheiten bedingt durch dieses usw. anzubieten.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Pyridiniumderivat bereit dargestellt durch die allgemeine Formel (I) oder (II)
worin R und R', die gleich oder unterschiedlich sein können, lineare, verzweigte oder zyklische C&sub1;&submin;&sub6; Alkylgruppen, wahlweise substituiert durch eine Aminogruppe, eine geschützte Aminogruppe und/oder eine Carboxylgruppe, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon sind.
In Bezug auf die Schutzgruppen für eine Aminogruppe können diejenigen, welche üblicherweise in der Peptidsynthese usw. verwendet werden, verwendet werden. Diese sind z. B. Acetyl, Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl, p-Methoxyphenylazobenzyloxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl, tert-Amyloxycarbonyl, p-Biphenylisopropyloxycarbonyl, Diisopropylmethyloxycarbonyl und Formyl.
Die Pyridiniumderivate der vorliegenden Erfindung schließen ein Salze der Verbindungen dargestellt durch die allgemeinen Formeln (I) oder (II). Solche Salze sind z. B. Salze mit Alkalimetallen wie Natrium, Kalium und Lithium, Erdalkalimetallen wie Magnesium, Kalzium und Barium, und anderen Metallen wie Aluminium. Weitere Beispiele sind Additionssalze mit Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Bromwasserstoffsäure und Trifluoressigsäure; und Salze mit Ammoniak oder mit organischen Basen wie organischen Aminen. Diese Salze können durch übliche Methoden hergestellt werden aus Pyridiniumderivaten der vorliegenden Erfindung in freier Form und umgekehrt.
Wenn Stereoisomere wie cis-trans-Isomere, optische Isomere und Konformationsisomere existieren bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung, schließt die vorliegende Erfindung jegliche dieser Isomere ein.
Ein Beispiel für Herstellungsmethoden für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist unten gegeben.
Eine Verbindung der Formel R-NH&sub2; oder R'-NH&sub2; (worin R und R' dieselben Gruppen wie hier oben beschrieben sind) wird zu einer Hexose wie Glucose, Fructose, Galactose oder Mannose oder einem Oligosaccharid bestehend aus mindestens einer Hexose gegeben, was die Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stellt. Es gibt keine besondere Einschränkung für die Reaktionsbedingungen wie Reaktionstemperatur, Reaktionszeit, pH usw., aber sie können passend ermittelt werden. Zum Beispiel kann die Reaktion durch Erhitzen beschleunigt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt als solche wurden durch übliche Methoden gereinigt wie Destillation, Chromatographie, Umkristallisierung usw. und identifiziert durch NMR, Massenanalyse, Fluoreszenzspektrum usw..
Es ist möglich, die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einem Trägerprotein (carrier protein) wie Rinderserumalbumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH) und dgl. zu verbinden durch Verwenden von wasserlöslichem Carbodiimid in Übereinstimmung mit üblichen Kupplungsreaktionen, um einen Antikörper auf eine Art herzustellen, die als solche bekannt ist. Der Antikörper kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung erkennen, was für seine Herstellung in vitro verwendet wurde, und er kann auch das verzuckerte Protein, das in vitro hergestellt wurde, und das vernetzte Protein in der Basalmembran des Glomerulus von Modellratten, die an diabetischer Nephrose leiden, welche durch Streptozotocin induziert wurde, immunochemisch unterdrücken.
Unter den Verbindungen der vorliegenden Erfindung dargestellt durch die allgemeinen Formeln (I) oder (II) können Pyridiniumderivate, worin R und R' Alkyl mit Amino- und/oder Carboxylgruppen sind, einfach mit einem Trägerprotein usw. wie Haptenen verbunden werden und sind besonders nützlich für die Herstellung von Antikörpern. Als Träger für die Verbindung mit einem Hapten für die Herstellung von Antikörpern, können die üblichen wie ein Protein (z. B. Serumalbumin, KLH) und Polymere (z. B. Polylysin) verwendet werden. Unter den Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind diejenigen Verbindungen, die strukturell eng mit den Produkten der zweiten Stufe der Maillard-Reaktion hinsichtlich ihrer chemischen Struktur verwandt sind, in der Praxis aufgrund ihrer möglichen Verwendung, die im folgenden beschrieben wird, bevorzugt.
Folglich ist es möglich, die Diagnose von Diabetes, diabetischen Komplikationen (z. B. diabetische Nephrose, diabetische Arteriosklerose, diabetische nervöse Störung, diabetischem Katarakt, diabetische Netzhautkrankheiten, kurze Blutgefäßstörungen verursacht durch Diabetes usw.), Altern und Krankheiten bedingt durch dieses auszuführen unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung als ein Indikator. Zudem ist es möglich, eine Auswertung von pharmazeutischen Auswirkungen in den Testsystemen in vitro und/oder in vivo auszuführen unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung als ein Indikator. Außerdem kann der Antikörper, der von der Verbindung der vorliegenden Erfindung als ein Hapten hergestellt wurde, immunochemisch und immunohistochemisch in der oben erwähnten Diagnose und Auswertung verwendet werden und er ist äußerst nützlich.
Die vorliegende Erfindung ist detaillierter durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Pentylamin (25 ml) und 38,7 g Glucose wurden in 1 Liter von 250 mM Phosphatpuffer (pH: 7,4) gelöst und 3 Wochen bei 37ºC stehengelassen.
Die Reaktionslösung wurde zweimal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und die daraus resultierende wäßrige Schicht auf eine Amberlite XAD-2 Säule gegeben, gefolgt durch ein gründliches Waschen mit Wasser. Die Fraktion, die mit Methanol enthaltend 10% Essigsäure eluiert wurde, wurde konzentriert, das Konzentrat wurde in Wasser gelöst und die Lösung wurde mit Ethylacetat wieder gewaschen. Diese wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, mit n-Butanol extrahiert und der Extrakt wurde auf eine Amberlite XAD-2 Säule gegeben. Essigsäure (20%) wurde durch die Säule fließen gelassen und die Fraktionen, die fluoreszierende Substanzen enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Säule mit umgekehrten Phasen gegeben, gewaschen und mit einer Mischung von Methanol und Trifluoressigsäure eluiert, was 1,8 g eines Öls ergab. Das Öl wurde durch Trennung mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt und ergab 450 mg Verbindung 1, 350 mg Verbindung 2, 50 mg Verbindung 3 und 30 mg Verbindung 4 in getrennten Fraktionen. Jede dieser wurde in ihr Hydrochlorid umgewandelt.

Beispiel 2

Alpha-Acetyllysinhydrochlorid (44,9 g) wurde mit 36 g Glucose umgesetzt durch 6-wöchiges Stehenlassen bei 37ºC in Übereinstimmung mit der Methode von Beispiel 1. Die Reaktionslösung wurde nicht konzentriert, sondern nur zu einem Sulfonationentauscherharz gegeben, gut mit Wasser gewaschen und mit 2 N wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die Fraktion wurde konzentriert, getrennt/gereinigt durch Verwenden des gleichen Harzes (worin eine Mischung von Methanol und Trifluoressigsäure verwendet wurde) und zu Hydrochloriden umgewandelt, was 37 mg einer blaßgelben Verbindung 5 mit sirupösem Charakter, 26 mg Verbindung 6 und einige mg der Verbindungen 7 und 8 ergab.
Die gleichen Verfahren wie oben wurden ausgeführt unter Verwendung von gamma-Aminobuttersäure und β-Alanin, was die Verbindungen 9 bis 17 ergab.

Beispiel 3

Anstatt Glucose wurde Fructose mit Pentylamin vermischt und die gleichen Verfahren wie oben wurden angewandt. Als ein Ergebnis dieser Reaktion wurden die Verbindungen 1 bis 4 ähnlich wie in Beispiel 1 erhalten.
Die physikalischen Eigenschaften der resultierenden Verbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:

Verbindung 1:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- dipentyl-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 463 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 427.

Verbindung 2:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- dipentyl-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 379 nm, Ex = 464 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 427.

Verbindung 3:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-dipentyl-1,2,3,4- tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 464 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 367.

Verbindung 4:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-dipentyl-1,2,3,4- tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 462 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 367.

Verbindung 5:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- di[6-(N-acetyl-L-norleucyl)]-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 379 nm, Ex = 461 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 629.

Verbindung 6:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- di[6-(N-acetyl-L-norleucyl)]-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 377 nm, Ex = 461 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 629.

Verbindung 7:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-di[6-(N-acetyl-L- norleucyl)]-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 379 nm, Ex = 461 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 569.

Verbindung 8:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-di[6-(N-acetyl-L- norleucyl)]-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 378 nm, Ex = 462 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 569.

Verbindung 9:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- di(3-carboxypropyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 464 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 443.

Verbindung 10:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- di(3-carboxypropyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 379 nm, Ex = 463 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 443.

Verbindung 11:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-di(3-carboxypropyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 462 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 383.

Verbindung 12:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-di(3-carboxypropyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 463 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 383.

Verbindung 13:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- di(2-carboxyethyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 379 nm, Ex = 463 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 429.

Verbindung 14:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]}-1,7- di(2-carboxyethyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 379 nm, Ex = 464 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 429.

Verbindung 15:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]}-1,7-di(2-carboxyethyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 380 nm, Ex = 463 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 369.

Verbindung 16:

(3R,4S)-3,4-Dihydroxy-5-{1-[(1R)-1,2-dihydroxyethyl)}-1,7-di(2-carboxyethyl)-1,2,3,4-tetrahydro-[1,7]-naphthylidium

Fluoreszenzspektrum: Em = 378 nm, Ex = 462 nm
Massenanalyse (SIMS, Glycerin): M&spplus; (m/z) = 369.

Verbindung 17:

Epimer der Verbindung 9 in Bezug auf Kohlenstoffatom 3.

Tabellen 1 bis 3 zeigen einige Beispiele der analytischen Ergebnisse der ¹H-NMR (400 MHz, CD&sub3;OD) und ¹³C-NMR (100 MHz, CD&sub3;OD) Spektren. TMS wurde als ein interner Standard verwendet und die Zuweisung im ¹³C-NMR basiert auf den Resultaten der Messungen von "C-H COSY" und "COLOC". Die Werte in den Klammern sind Kopplungskoeffizienten. Nebenbei bemerkt, die Zuweisungen, die mit !, !!, * und ** markiert sind, können durch einander ersetzt werden. Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4 Tabelle 5

Beispiel 4

Verbindungen 5 und 6 der vorliegenden Erfindung werden mit einem Trägerprotein verbunden unter Verwendung von wasserlöslichem Carbodiimid in Übereinstimmung mit den üblichen Kupplungsreaktionen, um Antikörper unter Verwendung der Verbindungen 5 und 6 als Haptene herzustellen. Die Herstellung des Antikörpers wurde in Kaninchen ausgeführt durch eine Methode, die üblicherweise verwendet wird. Der hergestellte Antikörper konnte die Verbindung der vorliegenden Erfindung in vitro erkennen und konnte auch das verzuckerte Protein in vitro und das verknüpfte Protein in der Basalmembran des Glomerulus der Modellratten, die an diabetischer Nephrose induziert durch Streptozotocin leiden, immunochemisch unterdrücken.
Von den Verbindungen 5 und 6 der vorliegenden Erfindung wird gedacht, daß sie in enger Beziehung zu den Produkten der zweiten Stufe der Maillard- Reaktion hinsichtlich der chemischen Strukturen stehen und daher in der Praxis besonders nützlich für diagnostische Zwecke usw. sind.

Claims

1. Ein Pyridiniumderivat dargestellt durch die allgemeine Formel (I) oder (II)

worin R und R', die gleich oder unterschiedlich sein können, lineare, verzweigte oder zyklische C&sub1;&submin;&sub6; Alkylgruppen, wahlweise substituiert durch eine Aminogruppe, eine geschützte Aminogruppe und/oder eine Carboxylgruppe, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon sind.

2. Ein Verfahren für die Herstellung eines Pyridiniumderivats dargestellt durch die allgemeine Formel (I) oder (II)

worin R und R', die gleich oder unterschiedlich sein können, lineare, verzweigte oder zyklische C&sub1;&submin;&sub6; Alkylgruppen, wahlweise substituiert durch eine Aminogruppe, eine geschützte Aminogruppe und/oder eine Carboxylgruppe, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon sind, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Mischen einer Verbindung der Formel R-NH&sub2; oder R'-NH&sub2; (worin R und R' die gleiche Bedeutung wie oben definiert haben) und einer Hexose oder eines Oligosaccharids bestehend aus der Hexose und Stehenlassen der Mischung für eine geeignete Zeit.

3. Verwendung eines Pyridiniumderivats nach Anspruch 1 als ein Indikator für die in vitro Diagnose von Diabetes, diabetischen Komplikationen, Altern und altersbedingten Krankheiten.

4. Verwendung eines Pyridiniumderivats nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Diagnostikums, welches geeignet ist für die Diagnose von Diabetes, diabetischen Komplikationen, Altern und altersbedingten Krankheiten von Männern.

5. Verwendung eines Pyridiniumderivats nach Anspruch 1 als ein Hapten für die Herstellung eines Antikörpers in einer Weise die per se bekannt ist.

6. Ein Antikörper erhältlich durch Verwenden eines Pyridiniumderivats nach Anspruch 1 in einem Verfahren, welches per se bekannt ist, wobei der Antikörper geeignet ist als Indikator für die Diagnose von Diabetes, diabetischen Komplikationen, Altern und altersbedingten Krankheiten, und für die Auswertung von Auswirkungen von Pharmazeutika, wie Therapeutika für Diabetes, für diabetische Komplikationen, Präventivwirkstoffe für Altern und Therapeutika für altersbedingte Krankheiten.