DE3587667T2

DE3587667T2 - Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der Proteinalterung.

Info

Publication number: DE3587667T2
Application number: DE89102406T
Authority: DE
Inventors: Anthony Cerami
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1984-03-19
Filing date: 1985-03-19
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2005-03-20
Also published as: JPH05172813A; JPS61501706A; CA1250587A; DE3587667D1; WO1985004169A1; EP0322402A2; EP0322402B1; US5238963A; AU583034B2; ATE97741T1; EP0322402A3; DE3574973D1; ATE48998T1; US4665192A; US5130337A; US5128360A; EP0175764A1; AU4153185A; EP0175764B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Reaktion, die zwischen Glukose und Proteinen stattfindet, und insbesondere die Untersuchung der Wirkungen dieser Reaktion auf die Struktur und Aktivität des glykosylierten Polypeptids.
Die Reaktion zwischen Glukose und Proteinen ist schon seit einiger Zeit bekannt. Ihr frühester Nachweis war das Auftreten von braunen Pigmenten während des Kochens von Lebensmittel, die 1912 durch Maillard nachgewiesen wurde, der beobachtete, daß Glukose oder andere reduzierende Zucker mit Aminosäuren reagieren, um Addukte zu bilden, die eine Reihe von Dehydratationen und Umlagerungen durchmachen, um stabile braune Pigmente zu bilden. Maillard, L.G. (1912) C.R. Acad. Sci., Band 154, Seiten 66-68.
In den der anfänglichen Entdeckung durch Maillard folgenden Jahren untersuchten Lebensmittelchemiker die vermutete Reaktion detailliert und stellten fest, daß gelagerte und wärmebehandelte Lebensmittel nichtenzymatisches Braunwerden als ein Ergebnis der Reaktion zwischen Glukose und der Polypeptidkette durchmachen, und daß die Proteine daraus resultierend vernetzt sind und eine verringerte biologische Verfügbarkeit zeigen. Finot, P.A. (1982) in Modification of Proteins, Herausgeber Feeney, R.E. und Whitaker, J.R. American Chemical Society, Band 198, Seiten 91-124, Washington, D.G. Zu diesem Zeitpunkt wurde festgestellt, daß die Pigmente, die für die Entwicklung der braunen Farbe verantwortlich sind, die sich als ein Ergebnis der Protein-Glykosylierung entwickelt, charakteristische Spektren und Fluoreszenzeigenschaften besaßen, jedoch war die chemische Struktur der Pigmente noch nicht genau aufgeklärt.
In den letzten Jahren wurde herausgefunden, daß die oben diskutierte Reaktion zwischen reduzierenden Zuckern und Lebensmittelproteinen ihre Parallele in vivo hat. Somit wurde gezeigt, daß die nichtenzymatische Reaktion zwischen Glukose und den freien Aminogruppen auf Proteinen zur Bildung eines stabilen Amino-1-desoxyketosyl-Addukts, bekannt als Amadori- Produkt, mit Hämoglobin auftritt, wobei eine Umlagerung der N-terminalen Aminosäure der u-Kette von Hämoglobin durch die Reaktion mit Glukose das als Hämoglobin A1c bekannte Addukt bildet. Von dieser Reaktion wurde auch herausgefunden, daß sie mit einer Vielzahl anderer Körperproteine, wie beispielsweise Augenlinsenproteinen (lens cristallins), Kollagen und Nervenproteinen auftritt. Siehe: Bunn, H.F., Haney, D.N., Gabbay, K.H. und Gallop, P.H. (1975) Biochem. Biophys. Res. Comm., Band 67, Seiten 103-109; Koenig, R.G., Blobstein, S.H. und Cerami, A. (1977) J. Biol. Chem., Band 252, Seiten 2992-2997; Monnier, V.M. und Cerami, A. (1983) in Maillard Reaction in Food and Nutrition, Herausgeber Waller, G.A., American Chemical Society, Band 215, Seiten 431-448; und Mannier, V.M und Cerami, A., (1982) Clinics in Endocrinology and Metabolism, Band II, Seiten 431-452. Darüberhinaus sind braune Pigmente mit Spektral- und Fluoreszenz-Eigenschaften, die jenen von Maillard-Produktem im Spätstadium ähnlich sind, in vivo in Verbindung mit einigen langlebigen Proteinen beobachtet worden, wie beispielsweise Augenlinsenproteine und Kollagen von älteren Menschen. Eine mit dem Alter zusammenhängende lineare Zunahme an Pigment wurde in menschlichem Durakollagen im Alter zwischen von 20 und 90 Jahren beobachtet. Siehe: Monnier, V.M. und Cerami, A. (1983) Biochem. Biophys. Acta, Band 760, Seiten 97-103; und Monnier, V.N., Kohn, R.R. und Cerami, A. "Accelerated Age-Related Browning of Human Collagen in Diabetes Mellitus", (1984) Proc. Nat. Acad. Sci., Band 81, Seiten 583-587. Interessanterweise kann das Altern von Kollagen in vitro durch das durch Glukose induzierte Vernetzen nachgeahmt werden; und es wird die Theorie aufgestellt, daß das Einfangen von anderen Proteinen und die Bildung der bereits erwähnten Addukte durch Kollagen durch eine Vernetzungsreaktion stattfindet, und es wird angenommen, daß sie für die beobachtete Akkumulation von Albumin und Antikörpern in der Nierenbasalmembran (kidney basement membrane) verantwortlich ist. Siehe: Brownlee, M., Pongor, S. und Cerami, A. (1983) J. Exp. Med., Band 158, Seiten 1739-1744.
Im allgemeinen ist wenig detaillierte Information bezüglich der Chemie des Maillard-Prozesses im Spätstadium erhältlich, und es ist dementsprechend schwierig gewesen, den möglichen Zusammenhang festzustellen, daß nichtenzymatisches Braunwerden zu den strukturellen und funktionellen Veränderungen in Geweben führen kann, die während des Alterungsprozesses auftreten, und dessen Auftreten mit erhöhter Geschwindigkeit bei Menschen auch beobachtet worden ist, die an Diabetes Mellitus leiden. Folglich besteht ein Bedürfnis danach, im möglichen Umfang die Struktur und Aktivität der Endprodukte einer fortgeschrittenen Protein-Glykosylierung nachzuweisen, um beim Nachweis des Auftretens von fortgeschrittener Glykosylierung zu helfen, und um als ein Untersuchungsmittel für die Entwicklung und den Test von möglichen Mitteln und entsprechenden Behandlungen zu dienen, die dazu bestimmt sind, diese Form der Proteinalterung zu verzögern oder zu verhindern.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Gegenstand der parallelen Europäischen Patentanmeldung Nr. 0175764, die die Stammanmeldung der vorliegenden Erfindung bildet (nachfolgend als "die Haupterfindung" bezeichnet), ist ein fluoreszierender Chromophor isoliert und identifiziert worden, von dem herausgefunden wurde, daß er in bestimmten braungewordenen Polypeptiden, wie beispielsweise Rinderserumalbumin und Poly-L-Lysin vorhanden ist. Der Verbindung wurde die neuartige Struktur 2-Furoyl-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol zugeordnet. Die Verbindung wurde durch Hydrolyse der braungewordenen Polypeptide, gefolgt von Alkalisierung, Extraktion in organische Lösungsmittel und anschließender Reinigung durch Kieselgelchromatographie isoliert.
Die Haupterfindung betrifft dementsprechend die Synthese dieses neuartigen Chromophors durch die nichtenzymatische Reaktion der benannten Proteine mit Glukose zur Bildung des braunen Pigments im Spätstadium, gefolgt von Säurehydrolyse, Alkalisierung, Extraktion in organische Lösungsmittel und abschließende Reinigung. Alternativ dazu kann die Verbindung durch die Reaktion von Furylglyoxal und Ammoniak synthetisiert werden.
Die neuartige Verbindung der Haupterfindung liegt aufgrund der Inkorporierung von zwei von Peptiden abgeleiteten Aminstickstoffen in seine Struktur in einem tautomerenen Zustand vor. Die Inkorporierung dieser Aminstickstoffe und zweier Glukosereste in die neuartige Verbindung lädt darauf schließen, daß sein peptidgebundener Vorläufer in die in vivo- Quervernetzung der Proteine durch Glukose einbezogen ist, die im Spätstadium des Maillard-Prozesses beobachtet wird.
Die Haupterfindung betrifft auch ein Verfahren zum Messen des Vorliegens von Endprodukten fortgeschrittener Glykosylierung in braungewordenen Proteinen, durch das Messen der Aktivität und dem Vorliegen der neuartigen Verbindung der Haupterfindung. Insbesondere kann der Aktivität der neuartigen Verbindung direkt durch die weiter unten diskutierten Analysentechniken durch die Verwendung einer geeignet markierten Menge der Verbindung gefolgt werden. Es wird in der Hauptanmeldung offenbart, daß alternativ dazu die Verbindung verwendet werden kann, um Bindungspartner oder Antikörper zu erzeugen (t0 raise), die wiederum markiert und in ein Medium eingeführt werden könnten, das ein braungewordenes zu untersuchendes Protein enthält, um in Wettbewerb um dem in der Proteinprobe vorhandenen unmarkierten Chromophor zu treten.
Somit können sowohl der fluoreszierende Chromophor der Haupterfindung als auch alle Antikörper, die daraus erzeugt werden können, in Verbindung mit verschiedenen Diagnosetechniken verwendet werden, einschließlich Immunassays, wie beispielsweise Radioimmunassay, der beispielsweise einen entweder durch radioaktive Addition, Reduktion mit Natriumborhydrid oder durch Radioiodierung markierten Chromophor verwendet.
In einem Immunassay kann eine Kontrollmenge des Chromophors, seines Antikörpers oder dergleichen mit einem Enzym, einem spezifischen Bindungspartner und/oder einem radioaktiven Element hergestellt und markiert werden, und kann dann in eine Proteinmaterial-Probe eingeführt werden, von der man annimmt, daß sie den Prozeß der Glykosylierung durchmacht.
Nachdem der markierte Chramophor oder sein/seine Bindungspartner eine Gelegenheit zur Reaktion mit dem verfügbaren Proteinmaterial gehabt haben, kann die resultierende Masse durch bekannte Nachweistechniken untersucht werden, die sich mit der Natur des gebundenen Marker ändern können.
Wenn eine radioaktive Markierung, wie beispielsweise ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S verwendet werden, können gegenwärtig verfügbare Zählverfahren verwendet werden. Wenn der Marker ein Enzym ist, kann der Nachweis durch irgendeine der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorspektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken nach dem Stand der Technik erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung schließt ein Assaysystem ein, daß in der Form eines Testkits für die quantitative Analyse des Grads nichtenzymatischer Protein-Glykosylierung hergestellt werden kann. Das System oder der Testkit kann eine markierte Komponente enthalten, die hergestellt wird durch eine der hier diskutierten radioaktiven und/oder enzymatischen Techniken, das Binden einer Komponente einer der Endprodukte fortgeschrittener Glykosylierung, wie beispielsweise der vorliegende fluoreszierende Chromophor; und ein oder mehrere zusätzliche immunchemische Reagenzien, von denen wenigstens eines ein freier oder ein immobilisierter Ligand ist, der sich entweder mit der markierten Komponente, seinem Bindungspartner, einem der nachzuweisenden Komponenten oder ihrem Bindungspartner oder ihren Bindungspartnern verbinden kann.
In Verbindung mit den hier ausgewiesenen Forschungsverfahren und Materialien kann sich die Erfindung auf potentielle Behandlungsverfahren zum Verzögern oder Verhindern der Glykosylierung von Proteinen erstrecken, durch ein Verfahren, das mit der Untersuchung der Proteinprobe auf das Vorhandensein des fluoreszierenden Chromophors 2-Furoyl-4(5)-(2-furanyl)- 1H-imidazol gemäß einem der vorher angegebenen Verfahren verbunden ist; gefolgt von der Entwicklung eines ersten Bindungspartners oder Antikörpers für den Chromophor, die anschließende Entwicklung eines zweiten Bindungspartners oder Antikörpers, der spezifisch für den ersten Bindungspartner ist, und die Verabreichung des letztgenannten Bindungspartners entweder zu dem Rest der Proteinmasse im Fall von Nahrungsmitteln oder zu dem Bereich, aus dem die Proteinprobe im Fall von lebendem Tiergewebe oder Serum entnommen wurde, in einem Versuch, die Proteinmasse am Eintritt in das letzte Stadium des Maillard-Prozesses zu hindern.
Die Identifizierung des fluoreszierenden Chromophors der Haupterfindung macht die fortgesetzte Erforschung des Maillard-Prozesses möglich und fördert Anstrengungen, andere spezifische Endprodukte fortgeschrittener Protein-Glykosylierung nachzuweisen. Der Chromophor und die verschiedenen mit seiner Isolierung und Identifizierung verbundenen Forschungsverfahren werden bei der Aufklärung der Details der chemischen Reaktionen helfen, die die Glykosylierung im Spätstadium ausmachen, und werden hoffentlich den Schlüssel zur Identifizierung von spezifischen Mitteln enthalten, die zum Verzögern oder Verhindern des Maillard-Prozesses dienen und dadurch die Lebensdauer des Proteins verlängern können. Diese Entwicklung ist insbesondere wichtig, da die durch den Maillard-Prozeß am stärksten betroffenen Proteine, wie beispielsweise Kollagen, in beträchtlichen Mengen in vielen der wichtigen Körpergeweben vorhanden sind, und dementsprechend eine deutliche Auswirkung auf das Funktionieren des Körpers mit dem Einsetzen von fortgeschrittenem Alter ausüben.
Eine zusätzliche Anwendung der vorliegenden Erfindung existiert in der Wissenschaft der Lebensmitteltechnologie, da der fluoreszierende Chromophor und die Assayverfahren, in denen er nützlich ist, verwendet werden können, um unerwünschten und möglicherweise toxischen Verderb von Lebensmitteln zu testen und nachzuweisen. Somit könnten verschiedene Lebensmittel periodisch durch die Verwendung einer der oben beschriebenen Assayverfahren untersucht werden, um mit quantitativer Genauigkeit das Einsetzen und das Ausmaß der Proteinalterung festzustellen. Eine solche Genauigkeit ist insbesondere in dem Fall möglich, wenn der fluoreszierende Chromophor der Haupterfindung in ein Radioimmunassaysystem inkorporiert ist, wie beispielsweise einem, das Radioiodierung oder die Einführung einer radioaktiven Marker durch Reduktion des Chromophors mit Natriumborhydrid verwendet.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testkit für die Verwendung in Identifizierungsverfahren für Endprodukte fortgeschrittener Glykosylierung in Proteinproben zur Verfügung zu stellen, die Glykosylierung im Spätstadium ausgesetzt sind, durch Assayverfahren, die im bevorzugten Fall den fluoreszierenden Chromophor der Haupterfindung verwenden.
Andere Aufgaben und Vorteile werden für den Durchschnittsfachmann aus einer Durchsicht der anschließenden Beschreibung offensichtlich, die mit einem Bezug auf die folgende veranschaulichende Zeichnung fort fährt.
Fig. 1 ist ein Kurvenschaubild, das die zunehmende Ultraviolettextinktion und Fluoreszenz in der Reaktion von Poly-L-Lysin mit Glukose darstellt.
Fig. 2A ist ein Kurvenschaubild, das die Absorptionsspektren der nichtenzymatisch braungewordenen Polypeptide zusammen mit Kontrollspektren der Polypeptide und dem Spektrum des isolierten Chromophors darstellt.
Fig. 2B ist ein bei 440 nm Emission aufgezeichnetes Fluoreszenz-Anregungsspektrum von braunem Poly-L-Lysin und Rinderserumalbumin, zusammen mit den jeweiligen fluoreszierenden Chromophorisolaten.
Fig. 3 ist eine Wiedergabe des magnetischen Kernresonanzspektrums des Fluores zierenden erfindungsgemäßen Chromophors, der aus braungewordenem Poly-L-Lysin isoliert wurde (CDCl&sub3;, 300 MHz, mit ¹H-NMR)
Fig. 4 ist eine Darstellung der tautomeren chemischen Struktur, von der postuliert wird, daß sie den fluoreszierenden Chromophor repräsentiert, der gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert wird.
Fig. 5A-5C beinhalten Elektronenstoßionisierungs-Massenspektren des fluoreszierenden Chromophors der Haupterfindung, wie er durch chemische in vitro-Synthese (Fig. 5A) erhalten wurde; wie er aus braunem Poly-L- Lysin (Fig. 5B) isoliert wurde; und wie er aus braunem Rinderserumalbumin (Fig. 5G) isoliert wurde.
Fig. 6 ist ein Diagramm, das mögliche Reaktionswege zwischen Vorläuferverbindungen darstellt, von denen angenommen wird, daß sie Proteinquervernetzungsstellen bilden, die in ihrer Struktur dem fluoreszierenden Chromophor ähnlich sind, der gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert wurde.
In ihrem ersten Gesichtspunkt betrifft die Haupterfindung die Isolierung und Identifizierung eines fluoreszierenden Chromophors, von dem herausgefunden wurde, daß er in Proteinen vorhanden ist, die mit Glukose inkubiert worden sind. Insbesondere zeigen solche Proteinen verschiedene physikalisch-chemische Veränderungen, einschließlich der Bildung einer braunen Farbe, Fluoreszenz und Quervernetzung. Der fluoreszierende Chromophor, der isoliert und hier als 2- Furoyl-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol identifiziert wurde, scheint eine abgespaltene Form einer Schlüsselzwischenverbindung in dem Prozeß zu repräsentieren, der ursprünglich von Maillard erkannt und ausführlich oben diskutiert wurde.
Die Verbindung 2-Furoyl-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol (nachfolgend der Kürze wegen als FFI bezeichnet) ist ein Kondensationsprodukt aus zwei Glukosemolekülen und zwei von Lysin abgeleiteten Aminogruppen in ein konjugiertes System von drei aromatischen Heterozyklen. Wie die später hier präsentierten Daten nachweisen, sind die Fluoreszenzeigenschaften des FFI in bemerkenswerter Weise jenen der nichtdialysierbaren Pigmente ähnlich, die an Albumin und Polylysin gebunden sind, die umfangreiches nichtenzymatisches Braunwerden mit Glukose durchgemacht haben. Diese Ähnlichkeit bedeutet, daß es eine nahe Analogie zwischen der Struktur des FFI und der der chromophoren Zentren gibt, die in den fluoreszierenden Pigmenten vorhanden sind. Diese Analogie bildet die Basis für die Auffassung des Erfinders, daß der fluoreszierende Chromophor der Haupterfindung als nützliches Hilfsmittel bei der weiteren Erforschung und Erklärung der chemischen Umwandlungen dienen kann, die in der Maillard-Reaktion im Spätstadium stattfinden.
Der Chromophor der Haupterfindung kann durch verschiedene Techniken isoliert und hergestellt werden. Somit und in Übereinstimmung mit den Forschungsverfahren der vorliegenden Erfindung können Proteine, wie beispielsweise Poly-L-Lysin und Rinderserumalbumin nichtenzymatisch mit Glukose über einen Zeitraum reagieren, der ausreichend ist, um das Einsetzen der Bildung von braungewordenem Protein zu erreichen, und solch ein braungewordenes Protein kann dann zuerst der Säurehydrolyse ausgesetzt werden, gefolgt von Extraktion in organisches Lösungsmittel, Alkalisierung und einer weiteren Extraktion, wobei die zweite Extraktion der Abtrennung der fluoreszierenden Komponente vom Pigmentrest dient, und abschließender chromatographischer Abtrennung.
Alternativ dazu kann der fluoreszierende Chromophor durch die Reaktion von Furylglyoxal und Ammoniak hergestellt werden. In diesem Fall kann beispielsweise 2-Furylglyoxalhydrat in einer Lösung aus Ethanol und Wasser verteilt werden und kann mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak durch tropfenweise Zugabe des letztgenannten versetzt werden. Anschließend kann das resultierende Produkt zwischen Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Diethylether-Dichlormethan abgetrennt werden. Anschließend kann das Waschen der organischen Schicht und das Trocknen mit Natriumsulfat durchgeführt werden und nach Filtration wird ein rohes Chromophorprodukt erhalten, das dann weiterer chromatographischer Trennung und Reinigung unterzogen werden kann, in ähnlicher Weise wie der Chromophor, der aus dem braungewordenem Proteinausgangsmaterial gewonnen wurde.
Der fluoreszierende Chromophor der Haupterfindung kann in einer Vielzahl von Forschungsverfahren verwendet werden, in einem Versuch, das Vorhandensein und die Aktivität von Endprodukten fortgeschrittener Glykosylierung erfindungsgemäß zu messen. Sowohl quantitative als auch qualitative Bestimmungen können durchgeführt werden, einschließlich der Darstellung des Chromophors mit verschiedenen radioaktiven oder enzymatischen Markierungen und der Einführung des so markierten Chromophors in eine Proteinmasse, um ihr Glykosylierungsstadium und ihre chemische Aktivität zu bestimmen.
Der fluoreszierende Chromophor kann durch eine Vielzahl von Techniken markiert werden, die von der Natur des zu verwendenden Forschungsverfahrens abhängen. So kann beispielsweise FFI mit Methoxyaminhydrochlorid reagieren, um das Methoximderivat zu bilden, oder kann mit Natriumborhydrid reduziert werden. Diese Darstellung, die hier weiter unten bei der chemischen Derivatisierung von FFI für die Massenspektroskopie erläutert wird, kann verwendet werden, um eine radioaktive Markierung auf der reduzierten Form des Chromophors durch die Reduktion mit einer radioaktiven Form des Natriumborhydrids anzubringen. Das resultierende reduzierte Derivat kann dann in geeigneten Analysenverfahren verwendet werden.
Andere gewöhnlicherweise für solche Analysenverfahren verwendeten Markierungen können auch mit dem Chromophor verbunden werden, und beispielsweise können radioaktive Markierungen wie beispielsweise ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S in geeigneter Weise in den Chromophor eingeführt werden.
Andere bekannte Markierungen beinhalten Enzyme und fluoreszierende Materialien. Fluoreszierende Materialien werden für den Fall als bevorzugt angesehen, in dem andere nicht-fluoreszierende Endprodukte fortgeschrittener Glykosylierung isoliert werden und für die Verwendung in Assaysystemen markiert werden sollen. In ähnlicher Weise können fluoreszierende Markierungen in dem Fall verwendet werden, in dem der Chromophor der Haupterfindung verwendet wurde, um Antikörper gegen sich zu erzeugen (to raise), wobei die Antikörper nicht fluoreszieren.
Eine Anzahl an fluoreszierenden Materialien ist bekannt und kann als Markierungen verwendet werden. Diese schliefen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin und Auramin ein. Ein spezielles markiertes Konjugat, das in Übereinstimmung hiermit entwickelt werden kann, ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, das in Ziegen hergestellt wird, und mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugiert ist.
Enzymmarker sind ebenfalls verwendbar und können durch irgendeines der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorspektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym ist mit dem ausgewählten Teilchen durch die Reaktion mit Brückenmolekülen verbunden, wie beispielsweise Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und dergleichen. Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glukuronidase, β-D-Glukosidase, β-D-Galaktosidase, Urease, Glukoseoxidase plus Peroxidase und saure Phosphatase. Es wird beispielsweise auf die U.S. Patente Nr. 3,654,090; 3,850,752; und 4,016,043 in Bezug auf ihre Offenbarung von alternativem Markierungsmaterial und Verfahren verwiesen.
Der fluoreszierende Chromophor kann verwendet werden, um Antikörper gegen sich herzustellen, die durch Standardverfahren hergestellt und isoliert werden können, einschließlich den gut bekannten Hybridomatechniken. Der oder die Antikörper können in anderen Lebewesen verwendet werden, als ob er oder sie Antigen oder Antigene wären, um Antikörper zu erzeugen. Beide Antikörperarten können verwendet werden, um das Vorhandensein und das Ausmaß fortgeschrittener Glykosylierung in Proteinmassen entweder in Lebensmitteln oder im Säugetierkörper zu bestimmen. Der Einfachheit halber wird der oder die Antikörper für den Chromophor hier als Ab&sub1; und der oder die Antikörper, die in einem anderen Lebewesen erzeugt werden, als Ab&sub2; bezeichnet.
Das Vorhandensein fortgeschrittener Glykosylierung in Proteinmassen, von denen vermutet wird, das sie dieselbe durchmachen, kann durch die gewöhnlichen immunologischen Verfahren, die für solche Bestimmungen anwendbar sind, festgestellt werden. Es sind eine Anzahl an verwendbaren Verfahren bekannt. Drei dieser Verfahren, die insbesondere verwendbar sind, verwenden entweder den mit einem nachweisbaren Marker markierten Chromophor, den mit einem nachweisbaren Marker markierten Antikörper Ab&sub1;, oder den mit einer nachweisbaren Markierung markierten Antikörper Ab&sub2;. Die Verfahren können durch die folgenden Gleichungen zusammengefaßt werden, wobei der Stern anzeigt, daß das Teilchen markiert ist, und "Ch" für Chromophor steht:
A. Ch* + Ab&sub1; = Ch*Ab&sub1;
B. Ch + Ab&sub1;* = ChAb&sub1;*
C. Ch + Ab&sub1; + Ab&sub2;* = Ch Ab&sub1; Ab&sub2;*
Die Verfahren und ihre Anwendung sind dem Durchschnittsfachmann alle bekannt und können folglich innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das "konkurrierende" Verfahren, Verfahren A, wird in den U.S. Patenten Nr. 3,654,090 und 3,850,752 beschrieben. Das Verfahren G, das "Sandwich"-Verfahren, wird in den U.S. Patenten Nr. RE 31,006 und 4,016,043 beschrieben. Noch weitere Verfahren sind bekannt, wie beispielsweise das "doppelte Antikörper"- oder das "DASP"-Verfahren.
In jedem Fall bildet die Chromophorsubstanz Komplexe mit einem oder mehreren Antikörpern oder Bindungspartnern und ein Teil des Komplexes ist mit einem nachweisbaren Marker markiert. Die Tatsache, daß ein Komplex gebildet worden ist, und sofern erwünscht dessen Menge, kann durch bekannte Verfahren nachgewiesen werden, die für den Nachweis von Markierungen verwendbar sind.
Es kann aus dem obigen gesehen werden, daß eine charakteristische Eigenschaft von Ab&sub2; ist, daß es mit Ab&sub1; reagiert. Dies liegt daran, daß Ab&sub1;, das in einem Säugetier erzeugt wurde, in einem anderen Lebewesen als ein Antigen verwendet wurde, um den Antikörper Ab&sub2; zu erzeugen. Beispielsweise kann Ab&sub2; in Ziegen (goats) erzeugt werden, wobei Ab&sub1; als ein Antigen verwendet wird. Ab&sub2; wäre daher ein Anti-Kaninchen- Antikörper, der in Ziegen erzeugt wird. Im Sinn dieser Beschreibung und der Ansprüche wird Ab&sub1; als ein Chromophorantikörper und Ab&sub2; als ein Antikörper, der mit einem Chromophorantikörper regiert oder alternativ dazu als "Anti- Antikörper" bezeichnet.
Die für diese Studien am häufigsten verwendeten Marker sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie mit ultraviolettem Licht bestrahlt werden usw.
Eine Anzahl an fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Marker verwendet werden. Diese schliefen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin und Auramin ein. Ein spezielles Nachweismaterial ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen hergestellt wird, und der mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugiert ist.
Der Chromophor oder sein/seine Bindungspartner können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann durch irgendeines der gegenwärtig verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus ¹&sup4;G, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S ausgewählt werden.
Erfindungsgemäß können kommerzielle Testkits hergestellt werden, die geeignet sind für die Verwendung entweder durch einen Facharzt oder einen Lebensmitteltechnologen zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Endprodukten fortgeschrittener Glykosylierung in einer verdächtigen Proteinprobe. Gemäß den oben diskutierten Testtechniken wird eine Art solcher Testkits wenigstens den markierten Chromophor oder seinen Bindungspartner, einen dafür spezifischen Antikörper enthalten. Eine andere wird wenigstens Ab&sub1; zusammen mit markiertem Ab&sub2; enthalten. Noch eine weitere wird wenigstens Ab&sub1; und Anleitungen enthalten, die natürlich vom ausgewählten Verfahren abhängen, z. B. dem "konkurrierendem", dem "Sandwich", dem "DASP" und dergleichen. Die Kits können auch zusätzliche Reagenzien wie Puffer, Stabilisatoren und so weiter enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt im allgemeinen einen Testkit zur Verfügung, der für den Nachweis und/oder die Bestimmung einer der Komponenten verwendet wird (außer Amadori-umgelagerte Glukose, für die Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IT, LI, NL, SE), der aus Endprodukten fortgeschrittener Glykosylierung von Polypeptiden und den dafür spezifischen Bindungspartnern ausgewählt ist, gemäß einem vorbestimmten Ablauf (protocol) (z. B. "konkurrierend", "Sandwich", "doppelter Antikörper", usw.), beinhaltend:
(a) eine markierte Komponente, die durch das Verbinden einer Komponente eines der Endprodukte fortgeschrittener Glykosylierung erhalten wurde, um eine nachweisbare Markierung darzustellen;
(b) eine oder mehrere zusätzliche Immunchemiereagenzien, von denen wenigstens ein Reagens ein Ligand oder ein immobilisierter Ligand ist, wobei der Ligand ausgewählt ist aus:
(i) einem Ligandem, der sich mit der markierten Komponente (a) verbinden kann;
(ii) einem Ligandem, der sich mit einem Bindungspartner der markierten Komponente (a) verbinden kann; (iii) einem Ligandem, der sich mit wenigstens einem der zu bestimmenden Komponente oder Komponenten verbinden kann; und
(iv) einem Ligandem, der sich mit wenigstens einem der Bindungspartner von wenigstens einem der zu bestimmenden Komponente oder Komponenten verbinden kann; und
(c) Anleitungen für die Durchführung eines Ablaufs (protocol) für den Nachweis und/oder die Bestimmung von einer oder mehreren Komponenten einer immunchemischen Reaktion zwischen dem Endprodukt fortgeschrittener Glykosylierung und einem dafür spezifischen Bindungspartner
Beispielsweise kann ein Festphasenanalysensystem oder Kit ein festes Substrat mit einer Menge eines markierten Bindungspartners für den Chromophor FFI darauf immobilisiert enthalten. Ein Überstand, der das zu analysierende Protein enthält, wird dann mit dem Substrat in Kontakt gebracht und eine Konkurrenzreaktion zwischen dem markierten Material und irgendeinem unmarkierten Bindungspartner oder Bindungspartnern in der Probe wird zur Freisetzung einer Menge des ersteren in den Überstand führen, worauf diese präzise quantitativ nachgewiesen werden kann. Die vorangehende Erläuterung eines speziellen kompetitives Assaysystems wird hier nur zu Zwecken der Verdeutlichung in Erfüllung der Verpflichtung präsentiert, eine ausführbare Offenbarung der Erfindung zu präsentieren. Es sollte verstanden werden, daß die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von diagnostischen Abläufen (protocols) innerhalb ihres Bereichs beinhaltet.
Wie oben diskutiert worden ist, dient die vorliegende Erfindung der Verwendung in potentiellen Verfahren zum Behandeln von Proteinen, die Glykosylierung durchmachen, in einem Versuch, das Fortschreiten des Maillard-Prozesses zu verzögern, wenn nicht ganz zu verhindern. Das Verfahren beinhaltet die Entwicklung eines Antikörpers für den Chromophor der Haupterfindung oder für andere isolierte Endprodukte fortgeschrittener Glykosylierung der, wenn er der glykosylierenden Proteinmasse zugegeben wird, durch seine Struktur und Reaktivität dazu dient, die fortgesetzte Glykosylierung des Proteins zu blockieren eher zu blockieren als zu erleichtern.
Beispielsweise könnte ein Antikörper oder ein zweiter Bindungspartner eines ersten Bindungspartners für FFI erzeugt worden sein, wie in der Technik eines der vorher beschriebenen Assayverfahren, der die Proteine nicht quervernetzen lädt. Auf diese Weise könnte die Verabreichung dieses nicht quervernetzenden Bindungspartners das letztendliche Unlöslichmachen und das Verfestigen des Proteins blockieren und könnte dadurch seine Vitalität und Brauchbarkeit entweder in Lebensmitteln oder in Tiergeweben verlängern. Das obige Szenario ist natürlicherweise veranschaulichend für eine Handlungsweise, die als eine Folge der Ergebnisse in Bezug auf den hier gegenwärtig offenbarten Alterungsprozeß naheliegt. Die Erfindung ist nicht auf diese Methodik beschränkt, sondern schließt diese eher in ihren Bereich ein.
Wie vorher erwähnt wurde, ist die Isolierung und Identifizierung des Chromophors der Haupterfindung mit der Ausführung einer Serie von Verfahren mit den repräsentativen Proteinen verbunden, die in vitro in den braungewordenen Zustand umgewandelt wurden. Die speziellen Verfahren und Materialien, die bei der Darstellung der Proteine verwendet wurden, und die folgende Isolierung und Analyse des Chromophors werden unten in den folgenden veranschaulichenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Darstellung und Analyse der Maillard-Produkte

Poly-L-Lysin und Rinderserumalbumin wurden als Modellpolypeptide für in vitro-Glykosylierungsstudien ausgewählt. Folglich wurde Poly-L-Lysin (1 g; Sigma, St. Louis, MO; relative Molekülmasse 50 000-70 000) in 50 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 0,5 M Na gelöst. D-Glukose (50 g) wurde zugegeben und die Lösung wurde bei 37ºC über 28 Tage inkubiert. Die Lösung wurde gründlich gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, um 1,9 g braunes Polylysin (BPL) zu erhalten. Rinderserumalbumin (5 g; Sigma, St. Louis, MO) wurde unter analogen Bedingungen umgesetzt, um 5,2 g gefriergetrocknetes braunes Rinderserumalbumin (BBSA) zu erhalten.
Ultraviolett-Spektralanalyse der braunen Polypeptide wurde durchgeführt und die Ergebnisse werden in Fig. 1 dargestellt. Das braune Poly-L-Lysin hat ein UV-Absorptionsmaximum bei 278 nm, mit einer vorstehenden Schulter mit einem Zentrum um 330-335 nm. Es wird angenommen, daß die Ausdehnung dieser Schulter in die sichtbaren Wellenlängen für die braune Farbe des Materials verantwortlich ist. Aus dem in Fig. 1 gezeigten zeitlichen Ablauf kann entnommen werden, daß die Geschwindigkeit der Farbbildung während der ersten zehn Tage der Glukoseinkubierung anstieg und anschließend abnahm, wahrscheinlich aufgrund der Sättigung der zur Verfügung stehenden Reaktionsstellen.
Das Anregungsfluoreszenzspektrum von BPL, das bei dem Emissionsmaximum von 440 nm gemessen wurde, zeigt ein größeres Anregungsmaximum bei 370 nm und ein kleineres Maximum bei 290 nm. Diese Maxima korrespondieren nicht mit den Banden im Absorptionsspektrum von UV bis zum Sichtbaren. Diese mangelnde Korrelation legt nahe, daß die Fluoreszenz in erster Linie mit einer Unterart von Maillard-Zwischenprodukten verbunden war, die für eine chemische Isolierung und Analyse ausreichend gut definiert sein könnten.

Beispiel II

Isolierung und Analyse des fluoreszierenden Produkts

BPL (1,5 g) wurde in 50 ml 6 N HCl gelöst. Die Lösung wurde durch Perfusion mit Stickstoff desoxidiert und über 10 Stunden bei 110ºC hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde bis zur Trockenheit in einem Stickstoffgasstrom bei 40ºC eingeengt und dann in 50 ml 0,1 N HCl wieder gelöst. Diese Lösung wurde fünf Mal mit 50 ml Isobutanol extrahiert und dann fünf Mal mit 20 ml Chloroform. Die organischen Extrakte wurden verworfen. Der pH der wäßrigen Phase wurde mit Ammoniumhydroxid (25%) auf 11 eingestellt und die Lösung wurde anschließend mit fünf Mal 20 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden vereinigt und in einem Stickstoffstrom eingeengt (Ausbeute: 35 mg). Dieses Material wurde wieder in 2 ml Chloroform gelöst und auf eine mit Kieselgel gefüllte 10 mm · 200 mm-Säule aufgebracht (Woelm Go., Bundesrepublik Deutschland), die bei 150ºC über Nacht aktiviert und mit Chloroform voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 20 ml Chloroform gewaschen und dann wurde das Material mit Chloroform-Methanol (1 : 1) eluiert. Die gelben Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockenheit mit Stickstoff eingeengt, um 30 mg der fluoreszierenden Verbindung zu ergeben. BBSA (5 g) wurde hydrolysiert und unter den für BPL beschriebenen Bedingungen aufgearbeitet, um 2,5 mg der fluoreszierenden Verbindung zu ergeben.
Die Hydrolyse von BPL ergab vorwiegend Lysin, Furosin und Pyridosin, basierend auf Ionenaustausch-TLG-Vergleich mit authentischen Materialien; diese sind als die größeren Abbauprodukte von E-desoxyfructosyllysin unter sauren Hydrolysebedingungen bekannt. Obwohl Fluoreszenz in den rohen Hydrolysaten der braungewordenen Polypeptide nachgewiesen werden konnte, schien es ein merkliches Quenchen durch UV- absorbierende Nebenprodukte zu geben.
Die Chromatographie auf Kationenaustauscherharz vom Arensulfonsäuretyp erwies sich als ungeeignet für die Trennung des fluoreszierenden Materials; daß es nicht sauber von diesem Harz eluiert werden konnte legt nahe, daß es hydrophob und/oder schwach basisch war. Extraktion mit organischem Lösungsmittel erwies sich als viel wirkungsvoller; somit konnte nach milder Alkalisierung der wäßrigen Hydrolysate mit Ammoniak oder Triethylamin viel der Fluoreszenz in Chloroform extrahiert werden, während der größte Teil der braunen Farbe in der wäßrigen Phase verblieb. Durch Säulenchromatographie des Chloroformextraktes auf Kieselgel war es möglich, eine einzelne größere fluoreszierende Verbindung zu reinigen; dieses Material wies einen Rf von 0,50 auf Kieselgel-TLC auf, wobei Ether-Dichlormethan (1 : 4) als Lösungsmittel verwendet wurde.
Die Fluoreszenzanregungsspektren von BPL und BBSA und des gereinigten Chromophors, der aus BPL und BBSA gewonnen wurde, werden in Fig. 2B verglichen. Die qualitative Identität dieser Spektren ist offensichtlich. Die Extinktionen im UV-Spektrum des isolierten Chromophors (Fig. 2A, Kurve 5) korrelieren in klarer Weise gut mit den Fluorszenzanregungsmaxima. Diese Daten legen nahe, daß das isolierte Material ein chromophores von Maillard abgeleitetes Hauptzentrum inkorporiert, das die hydrolytische Spaltung des braungewordenen Polypeptids ohne wesentlichen Verlust seiner chemischen Integrität überlebt hat.
Wegen des vorhergehenden spektroskopischen und chromatographischen Nachweises, der zeigt, das die isolierten Chromophore von BPL und BBSA identisch sind, wurde das leichter erhältliche von BPL abgeleitete Material hauptsächlich für die folgenden Strukturbestimmungsuntersuchungen verwendet; nachfolgende Analysen des von BBSA abgeleiteten Chromophors unter gleichen Bedingungen dienten dazu, seine Identität mit von BPL abgeleitetem und chemisch synthetisiertem Material zu beweisen.

Beispiel III

A. Spektrographische Analyse des Fluoreszenzisolats-Material und Methoden

Die isolierten Verbindungen wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel G analysiert, wobei als Lösungsmittelsystem Ether-Methylenchlorid (1 : 4) verwendet wurde. Die Punkte wurden durch ultraviolettes Licht sichtbar gemacht. HPLC-Analysen wurden auf vorgepackten Kieselgelsäulen (Porasil®, 4 mm · 300 mm, Waters Assoc., Milford, MA) mit Heptan-Acetonitril (3 : 2) als mobile Phase bei einer Geschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt, wobei ein Hewlett Packard 1084B Flüssigkeitschromatograph verwendet wurde, der mit einem Detektor für variable Wellenlänge ausgestattet war. Absorptions- und Fluoreszenzspektren wurden auf einem Hewlett Packard 8450A Diodenarray-Spektralphotometer und auf einem Perkin-Elmer 204 Spektralfluorimeter angefertigt. Die Absorptionsspektren wurden bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, angefertigt. Fluoreszenzspektren wurden bei 0,1 mg/ml im selben Puffer angefertigt. Die Säurehydrolysate wurden durch Ionenaustausch-TLC auf FIXION®-Chromatographieplatten (Chromatronix Inc., Mtn, View, CA) analysiert, wie vorher beschrieben wurde, Pongor, S., Kramer, J. und Ungar E.
(1980) J. High. Res. Chrom. 3, Seiten 93-94, wobei Furosin- und Pyridosinstandards verwendet wurden. ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem Nicolet NTC-300 Spektrometer (weite Kapillare) bei 300 MHz im Fourier-Transformationsmodus angefertigt. Die Proben wurden in CDCl&sub3; gelöst. Chemische Verschiebungen der Verbindungen werden in ppm feldabwärts von Trimethylsilan angegeben.

B. Massenspektrometrie

Ein DuPont 21-492 doppelfokussierender Magnetablenkungs-Massenspektrometer, der für möglichen chemischen Ionisationsbetrieb modifiziert war, der mit einem Varian 1400 Gaschromatographen ausgestattet war und mit einem VG 2035 Datensystem (VG Datasystems, Altringham, U.K.) verbunden war, wurde verwendet. Für Messungen mit niedriger Auflösung (R=100) wurde eine kombinierte Elektronenstoß/chemische Ionisierungs-Ionenquelle verwendet, bei einer Probentemperatur von 180ºG. Die Proben wurden auf einer keramischen Probenspitze eingeführt. Siehe Bencsath, F.A. und Field, F.H. (1981) Abstracts, 29th Annual Conference on Mass Spectrometry and A1lied Topics, Minneapolis, MN, 24.-29. Mai 1981; American Society for Mass Spectrometry, East Lansing; MI; Seite 587; oder von einer Gaschromatographiesäule (1% SE-30, sechs Fuß lang; Temperatur: 100ºC bei Probeneinspritzung, gehalten über 3 Minuten und programmiert auf einen Anstieg von 10ºC/min bis auf 250ºC).
Für Experimente mit chemischer Ionisierung wurde Isobutan als das reagierende Gas verwendet. Sein Druck in der Ionenquelle betrug etwa 0,3 Torr. Für Messungen mit hoher Auflösung (R=5000) wurde eine dafür vorgesehene (dedicated) Elektronenstoßquelle verwendet und die Proben wurden in Glaskapillar-Probengefäße eingeführt. Von 20 bis 25 Abtastungen (scans) aus drei Durchläufen wurde der Mittelwert für die Berechnung der elementaren Zusammensetzung gebildet.
Das Elektronenstoß-Massenspektrum des isolierten Chromophors zeigte ein relativ einfaches Muster, das von drei Hauptionen mit m/z 228 (100%), 181 (33%) und 95 (88%) dominiert wurde. Das Massenspektrum der chemischen Ionisierung durch Isobutan bestand im wesentlichen aus einem einzelnen Ion mit m/z 229, was einem Molekulargewicht von 228 für die Ausgangsverbindung entspricht. Die elementare Zusammensetzung der größeren Ionen wurde durch eine gemittelte hochauflösende Elektronestoß-Massenspektroskopie bestimmt, dessen Ergebnisse unten in Tabelle I präsentiert werden. Tabelle I - Hochauflösung-Elektronenstoß-Massenspektrometrie von FFI* Beobachtete Masse (m/z) Berechnete Masse M (Millimasseneinheiten) Zusammensetzung Identität Molekülion M&spplus;-Furan Furoylion * Die beobachteten Daten werden als Mittelwert + Standardabweichung des Mittelwertes angegeben (Zahl der Bestimmungen).
Die Formel des Molekülions wurde als C&sub1;&sub2;H&sub8;N&sub2;O&sub3; bestimmt. Die Formel des Fragments mit m/z 95 ist jene des Furoylkations. Das andere größere Fragment mit m/z 160 entspricht dem Verlust der Elemente des neutralen Furans vom Ausgangsion. Dieses Fragmentierungsmuster ist mit einer Struktur vereinbar, in der eine 2-Furoylgruppe und eine Gruppe mit der Formel C&sub7;H&sub5;N&sub2;Q über eine Carbonylgruppe miteinander verbunden sind.

C. Chemische Derivatisierung für die Massenspektrometrie

Derivatisierungen von FFI wurden in 1 ml konischen Septumfläschchen ausgeführt, unter Verwendung von 50 ug, von BPL abstammendem FFI als Ausgangsmaterial. Die Methoximbildung wurde durch die Zugabe von 100 ul Methoxyaminhydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) als eine 10%-ige Lösung in Pyridin und Inkubierung der Lösung bei 80ºC über eine Stunde durchgeführt. Blau, K. und Kind, G.S. (1977) Handbook of Derivatives for Chromatography, Heden; London, Bellmawr. N.J., Seiten 243-244. Die Reduktion mit Natriumborhydrid wurde durch die Zugabe von 0,5 mg festem NaBH&sub4; (Sigma, St. Louis, MO) zu 100 ul, wäßriger FFI-Suspension durchgeführt. AaO, Seiten 332-333. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde das überschüssige Reagenz mit einem Tropfen Eisessig neutralisiert. Die Lösung wurde mit einem Überschuß an Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht, bis zur Trockenheit eingeengt, und das reduzierte Derivat wurde aus dem Rest mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Monomethylierung wurde mit 100 ul Dimethylformamid-Dimethylacetal (Eastman Kodak, Rochester, NY) bei 60ºC über 2 Stunden durchgeführt. AaO, Seiten 215-216. Ein Teil des monomethylierten Derivats wurde bis zur Trockenheit eingeengt und mit 100 ul Methyliodid bei 37ºG über Nacht behandelt, um ein dimethyliertes Derivat zu ergeben.
Vom chromophoren Material wurde herausgefunden, daß es ein Monomethoximderivat durch die Reaktion mit Methoxyamin bildet, und mit Natriumborhydrid eine Reduktion unter Aufnahme von zwei Wasserstoffen durchmachte, um ein farbloses Derivat zu ergeben. Beide Derivate haben massenspektroskopische Fragmentierungsmuster, die deutlich verschieden sind von der Ausgangsverbindung. Dieses Verhalten ist vereinbar mit dem Vorliegen einer konjugierten nicht-Carbonsäure-Carbonylgruppe. Die Resultate dieser Spektralanalysen werden unten in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Hauptionen, die bei Elektronenstoß-Massenspektren von FFI und seinen chemischen Derivaten vorliegen Verbindung Hauptionen (m/z) Identität FFI (underivatisiert) von Furan Verlust (Furoylkation) FFI+Methoxyamin M&spplus; für FFI-Methoxin FFI+NaBH&sub4; Dimethylformamiddimethylacetal Monomethyl-FFI ¹ Erhalten durch Bruchstück-Ionisierungsmassenspetrometrie
Methylierungsstudien zeigten das Vorliegen von zwei nukleophilen Stellen, die unterschiedlich empfänglich für Alkylierung sind. Alkylierung mit Dimethylformamid-Dimethylacetal ergab ein neutrales Derivat, in dem ein Wasserstoff durch eine Methylgruppe ersetzt worden war. Weitere Methylierung dieses Derivats mit Methyliodid ergab ein Dimethylderivat mit chromatographischen und massenspektroskopischen Eigenschaften eines quaternären Methiodidsalzes. Wie in Tabelle II gezeigt wird, konnte das Molekülion des Dimethylderivats nur unter Bruchstück-Ionisierungsbedingungen nachgewiesen werden und nicht durch Elektronenstoßtechniken oder Techniken mit chemischer Ionisierung.

D. ¹H-NMR-Spektrum des isolierten Chromoohors

Fig. 3 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des Chromophormaterials aus BPL. Experimente mit doppelter Bestrahlung zeigten, das die Resonanzen a, c und d eine Gruppe von drei miteinander verbundenen Protonen enthält und daß die Resonanzen b, f und g eine weitere ähnliche aber verschiedene Gruppe enthält. Obwohl eine Resonanz in jeder Gruppe ungewöhnlich verbreitert war, gäbe es eine ausreichende Struktur in den anderen Resonanzen, um die Bestimmung der drei Kopplungskonstanten für jede Gruppe zu erlauben. Die H-H- Kopplungskonstanten werden unten in Tabelle 111 dargestellt. Tabelle III - H-H-Kopplungskonstanten von FFI-Furanringen Beobachtete Kopplungs-HZ
In Tabelle III kann gesehen werden, daß diese Konstanten gut in den normalen Bereich fallen, der für die Kopplungskonstanten in 2-substituierten Furanringen beobachtet werden. Somit schien es, daß zusätzlich zu der durch die Massenspektroskopiedaten angezeigten Furoylgruppe, ein weiterer chemisch davon verschiedener 2-substituierter Furanring vorhanden war. Das Abziehen einer Furoylgruppe und einer Furanylgruppe von der Molekülformel lassen die Elemente einer disubstituierten Imidazolkomponente zurück.
Das Vorliegen eines Imidazolrings würde das Vorliegen der zwei unterschiedlichen nukleophilen Zentren erklären; die Tautomerie des NH-Protons zwischen zwei ungleichen lmidazolstickstoffen, mit einer der Protonenrelaxationszeit ähnlichen Geschwindigkeit, würde die Verbreiterung der Wasserstoffresonanzen der Position 3 in den Furanringen erklären. Diese Faktoren führten zusammen mit mechanistischen Überlegungen bezüglich der Bildung des Chromophors zur Zuordnung der Struktur als 2-Furoyl-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol (FFI), deren zwei tautomere Strukturen in Fig. 4 gezeigt werden. Die Tatsache, daß das Signal für He auf dem Imidazolring durch die Tautomerie nicht verbreitert ist, kann an der zufälligen Ähnlichkeit seiner chemischen Verschiebung in den zwei Tautomeren liegen, oder an den Auswirkungen auf seine Relaxationszeit durch den benachbarten Stickstoffquadrupol.

Beispiel IV

Identität des isolierten Chromophors mit synthetischem FFI

Als letzte Bestätigung der zugeordneten Struktur wurde FFI durch ein unabhängiges chemisches Verfahren zum Vergleich mit dem aus Polypepetid stammenden Material hergestellt. Eine Literaturrecherche ergab keine früheren Berichte über 2-Furoyl-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol. Jedoch sind eine Anzahl an Diphenylanalogen, wie beispielsweise 2-Benzoyl- 4(5)-phenyl-1H-imidazol beschrieben worden. Schubert, W., Hellwig, A. und Bleichert, J.L. (1964) J. Prakt. Chem. 24, 125-131. Diese werden sehr leicht durch die Reaktion von Phenylglyoxalderivaten mit Ammoniak hergestellt.
Eine Lösung aus 2-Furylglyoxalhydrat (710 mg) in einer Mischung aus 10 ml Ethanol und 3 ml Wasser wurde tropfenweise mit 2 ml konzentriertem wäßrigem NH3 behandelt. Nach 80 Minuten wurde die braune Lösung zwischen H&sub2;O und Diethylether-Dichlormethan (1 : 1) aufgeteilt. Die organische Schicht wurde zweimal mit Wasser gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und der Rest auf Kieselgel mit Ether-CH&sub2;Cl&sub2; (6 : 94) als Eluent chromatographiert. Fraktionen, die Material enthielten, das zusammen mit FFI aus Glykosylierungsexperimenten auf TLG eluiert wurden, wurden vereinigt und konzentriert, und der Rest wurde aus Ether umkristallisiert.
Nach der Durchführung einer analogen Reaktion von Furylglyoxal mit Ammoniak in wäßrigem Ethanol wurde die bescheidene Ausbeute an FFI isoliert, die in jeder Hinsicht mit den Materialien, die von der Glykosylierung abstammen, identisch war. Folglich wurde reines FFI (82 mg, 12%) als goldgelbe Kristalle mit einem bräunlichem Schimmer erhalten: Schmelzpunkt 176-177ºC; Analyse: berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub8;N&sub2;O&sub3;: C, 63,2%; H, 3,5%; N, 12,3%; gefunden: C, 63,1%; H, 3,6%; N, 12,2%. Die spektroskopischen und chromatographischen Eigenschaften dieses Materials waren mit jenen der FFI-Proben identisch, die von BPL und BBSA abstammen. Dies wird in Fig. 5 verdeutlicht, in der die Elektronstoß-Massenspektren von synthetischem FFI, von BPL abstammendem und von BBSA abstammendem FFI verglichen werden.
Wie vorher kurz hier diskutiert wurde, sind die Fluoreszenzeigenschaften von FFI in bemerkenswerter Weise jenen der nicht-dialysierbaren Pigmente ähnlich, die an Albumin und an Polylysin gebunden sind, die umfangreiches nichtenzymatisches Braunwerden mit Glukose durchgemacht haben. Diese Ähnlichkeit legt nahe, daß es eine nahe Analogie zwischen der Struktur von FFI und jener der chromophoren Zentren gibt, die in den fluoreszierenden Pigmenten vorhanden sind. Während anschließender Säurehydrolyse konnten E-Lysylreste von den Imidazolstickstoffen durch einen internen nukleophilen Angriff ihrer freien α-Aminogruppen an den E-Positionen abgespalten werden, wobei FFI-ähnliche Materialien und Pipecolinsäure gebildet wurde.
Wie oben beschrieben wurde, wurde auf die Struktur des FFI aus Massenspektroskopie, ¹H-NMR-Spektroskopie und chemischen Derivatisierungsstudien des von Polypeptid stammenden Materials geschlossen. Diese vorläufige Strukturzuordnung wurde durch den Vergleich mit FFI bestätigt, das aus Furylglyoxal und Ammoniak auf einem Syntheseweg dargestellt wurde, der vorher bei der Synthese einer Anzahl anderer Diaryl-2-acylimidazolen verwendet wurde.
Wie alle unsymmetrisch substituierten Imidazole stellt FFI tatsächlich eine Gleichgewichtsmischung der zwei sich ineinander umwandelnden tautomeren Strukturen dar, wie in Fig 4 verdeutlicht wird. Aus diesem Grund ist das NMR-Spektrum von FFI sehr empfindlich gegenüber Säurespuren. In frisch hergestellten Lösungen von umkristallisiertem synthetischem FFI in GDCl&sub3; kann der Wechsel des NH-Protons ausreichend langsam sein, so daß die verbreiterten Peaks in Fig. 3 sich in getrennte breite Peaks für jedes Tautomer auflösen; umgekehrt führt die Zugabe einer äquimolaren Menge Trifluoressigsäure zur NMR-Lösung zur vollständigen Protonierung beider Stickstoffatome zu einer Verschmälerung der vorher breiten Resonanzen der an Kohlenstoff gebundenen Protonen zusammen mit Veränderungen in den chemischen Verschiebungen (Spektren dazu werden nicht gezeigt).
Es gibt eine Anzahl an verschiedenen Reihenfolgen, in denen zwei Glukosemoleküle und zwei Lysin-E-Aminogruppen wechselwirken könnten, um ein tetrasubstituiertes Imidazolsystem zu bilden. Drei dieser Möglichkeiten werden in Fig. 6 verdeutlicht.
Auf dem Weg A greift ein Lysin die Ketogruppe eines E- Fructosyllysin-Rests an, gefolgt von Zyklisierung mit einem zweiten Glukosemolekül. Auf dem Weg B wechselwirken zwei Fruktosyllysine unter Enolisierung und Zyklisierung. Auf dem Weg C reagiert ein Difructosyllysin mit einem zweiten Lysin, gefolgt von Zyklisierung. Die Wahrscheinlichkeit von Weg G wird durch eine vorherige Beobachtung eines Produkts der Inkubation von Glukose mit Valin nahegelegt, das zwei gebundene Zuckerreste aufwies. Koenig, R.J., Blobstein, S.H. und Cerami, A. (1977) J. Biol. Chem. 252, Seiten 2992-2997. Sowohl der Weg A als auch der Weg C, in der Fructosyllysinspezies mit einer anderen Aminogruppe wechselwirken, könnten die Bindung von Proteinen an andere Proteine erklären, die vorher nichtenzymatisches Braunwerden durchgemacht haben. Brownlee, M., Pongor, S. und Cerami, A. (1983) J. Exp. Med. 158, Seiten 1739-1744.
Die Zyklisierung zu einer tetrasubstituierten Dihydroimidazolstruktur (d . h. Imidazolinstruktur) und ihre anschließende Autoxidation zu einer quaternären Imidazolspezies erscheinen die entscheidenden Schritte bei der Bildung von FFI zu sein. Das Dihydroimidazol- Zwischenprodukt wäre ein stark elektronenreiches Zentrum und seine Autoxidation unter den Bedingungen der physiologischen Sauerstoffspannung in langlebigen (low-turnover) Proteinen kann man sich leicht vorstellen. Gegenwärtig ist es schwierig das Ausmaß oder die Geschwindigkeit abzuschätzen, bei der die anschließenden Hydratationen in vivo stattfinden würden, um eine oder beide der beobachteten Furanringe in FFI zu bilden; solche Dehydratationen könnten in den Fällen erleichtert sein, in denen das Vernetzen von Proteinen über die Imidazolbildung zur Erzeugung einer hydrophoben Mikroumgebung um die von Glukose stammenden Polyhydroxylseitenketten führen würde.
Die Identifizierung von FFI als ein spezifisches Produkt, das charakteristisch für das Spätstadium der Maillard-Reaktion ist, stellt einen Startpunkt zur Verfügung, von dem aus weitere systematische Studien dieses Prozesses fortgeführt werden können, mit dem Ziel der Identifizierung anderer vernetzender und chromogener Komponenten, die während der Reaktion gebildet werden. In der Vergangenheit waren die einzigen Verfahren, die zum Messen des Vorliegens von Maillard- Produkten in biologischen Makromolekülen verfügbar waren, direkte spektroskopische und Fluoreszenztechniken, die heterogenes Material verwendet haben. Monnier, V.M. und Cerami, A. (1981) Science , 211, Seiten 491-493. Die Messung einer spezifischen Verbindung, FFI, die von spezifischen Maillard- Zwischenverbindungen stammt, kann einen neuen Lösungsweg für die quantitative Bestimmung der primären Quervernetzungsstellen zur Verfügung stellen, die während des Alterns von Proteinen und Nukleinsäuren gebildet werden. Monnier, V.M. und Gerami, A. (1981) Science, 211, Seiten 491-493 und Bucala , R., Model, P. und Gerami, A. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., Band 81, Seiten 105-109. In der klinischen Untersuchung des Alterns und von Diabetes kann die Messung von FFI die Abschätzung des zeitlichen Mittelwerts ermöglichen, den langlebiges Strukturgewebe Glukose über lange Zeiträume (Monate bis Jahre) ausgesetzt ist, analog zur gegenwärtigen Verwendbarkeit von HbA1c- Markierungen bei der Abschätzung des der Glukose Ausgesetztseins über Zeiträume von 3-4 Wochen. Zusätzlich sollte die quantitative Bestimmung von in vivo gebildetem FFI in Verbindung mit gleichzeitigen klinischen Untersuchungen eine neuen Einblick in spezifische Rollen von Maillard-Produkten bei Komplikationen des Alterns und des Diabetes zur Verfügung stellen.
Diese Erfindung kann in anderen Formen dargestellt werden oder auf anderen Wegen ausgeführt werden, ohne sich von dessen Geist oder den wesentlichen Charakteristika zu entfernen. Die vorliegende Offenbarung wird daher als in allen Beziehungen für veranschaulichend und nicht einschränkend betrachtet, wobei der Bereich der Erfindung durch die nachfolgenden Ansprüche angegeben wird, und alle Veränderungen, die innerhalb der Bedeutung und des Äquivalenzbereichs fallen, darin umfaßt sein sollen.

Claims

1. Testkit zur Verwendung für den Nachweis und/oder die Bestimmung einer der Komponenten außer Amadoriumgelagerter Glukose, die aus Endprodukten fortgeschrittener Glykosilierung von Polypeptiden und den dafür spezifischen Bindungspartnern ausgewählt ist, gemäß einem vorbestimmten Ablauf (protocol), beinhaltend:

a. eine markierte Komponente, die durch das Verbinden einer Komponente eines der Endprodukte fortgeschrittener Glykosilierung mit einer nachweisbaren Markierung erhalten wurde;

b. eine oder mehrere zusätzliche Immunchemiereagenzien, von denen wenigstens ein Reagens ein Ligand oder ein immobilisierter Ligand ist, wobei der Ligand ausgewählt ist aus:

i. einem Liganden, der sich mit der markierten Komponente a. verbinden kann;

ii. einem Liganden, der sich mit einem Bindungspartner der markierten Komponente a. verbinden kann;

iii. einem Liganden, der sich mit wenigstens einem der zu bestimmenden Komponente oder Komponenten verbinden kann; und

iv. einem Liganden, der sich mit wenigstens einem der Bindungspartner von wenigstens einem der zu bestimmenden Komponente oder Komponenten verbinden kann; und

c. Anleitungen für die Durchführung eines Ablaufs (protocol) für den Nachweis und/oder die Bestimmung von einer oder mehreren Komponenten einer immunchemischen Reaktion zwischen dem Endprodukt fortgeschrittener Glykosilierung und einem dafür spezifischen Bindungspartner.