DE2330159C3

DE2330159C3 - Radioaktiv markierte Sterofdderivate, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltendes Diagnostikum

Info

Publication number: DE2330159C3
Application number: DE19732330159
Authority: DE
Inventors: Otto Dr.; Nieuweboer Bob Dipl.-Ing.; Petzoldt Karl Dr.; Kerb Ulrich Dr.; Lübke Klaus Dr.; 1000 Berlin Engelfried
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Filing date: 1973-06-08
Publication date: 1976-11-18

Description

D-

worin A, B — C, D — E, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ sowie Z und X die oben angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls nach überführung in die entsprechenden Säurechloride, -azide, -azolide, -anhydride _ocj_er ©der Ester, mit einer Verbindung der allgemeinen

R^s— O

E-D

Formel VI

H-N

worin

R¹

R-R¹

(Vl)

R^s—O

_2S B—C d'e Gruppierung

— N

die oben angegebene Bedeutung hat. umsetzt.

oder

Die Erfindung betrifft Steroidderivate der allgemeinen Formel I

40

O-R⁸

R¹"

CH₂-R" CO

R¹

(D

Z ein Sauerstoffatom, zwei Wasserstoffatome oder die Gruppierung H, OH. E—D eine Einfach- oder eine Doppelbindung. F—G die Gruppierung

-CH₇-CH,- -CH=CH-

-CH₂-CH(CH,)'

-CH = C(CH₃)-

-X-N

R¹

R²

55 oder

-CH CH

CH,

sich bevorzugt in den Stellungen 6, 7. 11 oder 12 ^6o _D, .. „ . ,„,, . ,,_ .

befindet ^ "^le Gruppierung — (C H₂J_n — CO — und η eine

, ganze Zahl zwischen O und 4 bedeutet, R⁴ ein Wasser-

, stoffatom oder eine Methylgruppe, R⁵ eine Methyl-

' oder Älhylgruppe, R'¹ ein Wasserstoff-. Fluor- oder

^N, 65 Chloralom. R ein Wasserstoff-, Fluor- oder Chlor-

^₂ atom oder eine Methylgruppe, R^K ein Wasserstoffatom

___ oder eine Alkanoylgruppe mit bis /u 15 Kohlenstoff- Jen lritium- oder ^l4C-markiertcn Rest eines Amins atomen. R⁹ ein Wasserstoff;iiom. eine Methvl- oder

inc Älhinylgruppc, R¹⁰ ein Wasserstoffatom, cine viethylgruppc oder die Gruppierung —O — R⁸. i^u ein Wasserstoff- oder ein Halogenatom oder die jruppicrung — O — R⁸. R¹² ein Wassersloffatom )der die Gruppierung — O — R⁸, R^g und R¹⁰ oder I¹⁰ und R¹² gemeinsam die Gruppierung

-O

— O

1.1

R¹

R¹³, R¹* ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppc mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bedeuten.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Steroiddcrivatc 1 sowie diese enthaltende Diagnostika.

Es besteht ein stetes Bedürfnis nach genauen und hochempfindlichen Analysenmethoden für Wirkstoffe. die in äußerst kleinen Mengen vorhanden sein können, z. B. für Steroide in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Harn usw. Die Analyse soll dabei möglichst allein auf den Wirkstoff, z. B. das Steroid, ansprechen, sie soll also monospezifisch sein, d. h. durch andere Substanzen, die in der Körperflüssigkeit vorhanden sein können, nicht verfälscht werden.

Es gibt eine Vielzahl von Analysenmethoden, die auf den verschiedensten physikalisch-chemischen Verfahren beruhen, gekannt seien beispielsweise Speklrometrie, Titrimctric, Chromatographie usw. Infolge der geringen Mengen, die nachzuweisen sind oder nachgewiesen werden können, haben sich nun immunologische Testmethoden bei der Bestimmung von Wirkstoffen, z. B. von Steroiden, immer mehr durchgesetzt, weil immunologische Testmethoden, speziell radioimmunologischc Tests, auf Grund ihrer Empfindlichkeit und Spezifität anderen Testmethoden bei der Bestimmung von körpereigenen oder ähnlichen Wirkstoffen im allgemeinen überlegen sind.

Voraussetzung Tür einen radioimmunologischen Test ist, daß ein ausreichend spezifisches Antiserum zur Verfügung steht und daß die zu bestimmende Verbindung oder ein geeignetes Derivat in möglichst hoch radioaktiv markierter Form als Tracer zugänglich ist.

Die Herstellung eines spezifischen Antiserums kann relativ leicht erreicht werden, wenn das zu bestimmende Antigen selbst in der Lage ist. die Bildung von Antikörpern zu stimulieren, d. h. wenn es gleichzeitig ein Immunogen ist. Dies trifft unter anderem für alle Proteohormone zu. die in höchstgereinigter Form zur Produktion geeigneter Antiseren direkt eingesetzt werden können. Schwieriger ist es, wenn das Antigen eine niedermolekulare Verbindung, so z. B. ein Steroid, ist. das selbst nicht eine Immunantwort provoziert, also nicht immunogen ist.

In derartigen Fällen hat sich die Verknüpfung des niedermolekularen Antigens, das häufig auch als Hapten bezeichnet wird. z. B. eines Steroids, mit einem hochmolekularen Träger und die Verwendung dieses »!Conjugates« als Immunogen bewährt. Ein prinzipieller Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß die Verknüpfung des Haptens mit dem hochmolekularen Träger zu einer Verringerung der Spezifität der erhaltenen Antikörper führt, wie dies bei der Mehrzahl der zur Zeit zugänglichen Antisera der Fall ist. Die Verringerung der Spezifität äußert sich in den

Kreuzreaktionen der Antiseren mit Wirkstoffen, z. B. Steroiden, die ähnliche charakteristische funktionelle Gruppen aufweisen wie die nachzuweisenden (Steroide). Dies beruht darauf, daß die charakteristischen funktionellen Gruppen zur Verknüpfung des Haptens mit dem hochmolekularen Träger herangezogen werden, so daß die funktionellen Gruppen nicht als Determinanten bei der Stimulierung der Antikörpersynthese beteiligt sind und daher auch nicht zu der Spezifität der gebildeten Antikörper beitragen.

Auch die oben angeführte zweite Voraussetzung, die Zugänglichkeit ausreichend hoch radioaktiv markierter Tracer, ist in vielen Fällen, besonders bei den als Wirkstoffen verwendeten Steroiden, nicht erfüllt, so daß trotz einer möglichen Herstellung der Antiseren eine radioimmunologische Bestimmung dieser Steroide nicht möglich ist.

Daher bedeuten hochradioaktiv markierte Steroidderivate, die leicht zugänglich und als Tracer zu verwenden sind, einen wesentlichen Fortschritt unter den Diagnostika.

Die vorliegende Erfindung stellt nun insbesondere radioaktiv markierte Steroidderivate bereit, die den Nachteil einer geringen Aktivität nicht aufweisen, sondern eine ausreichende Aktivität besitzen. Ferner ist das Verfahren zur Herstellung der Steroidderivate in der Erfindung inbegriffen.

Die Gruppierung

R¹

-X-N

R²

kann sowohl an die Ringe A, B. C und D des Steroids als auch an die gegebenenfalls vorhandene 17-ständige Seitenkette gebunden sein. Da im allgemeinen die Steroide, zu deren Nachweis die erfindungsgemäßen Steroide dienen sollen, mindestens funktionelle Gruppen und'oder Substituenten an den Ringen A, D und oder der gegebenenfalls vorhandenen Seitenkette aufweisen, wird die Gruppierung

R¹

-X-N

vorzugsweise an den Ring B in 6- oder 7-Stellung oder an den Ring C in 11- oder 12-Stellung gebunden sein. Sollte der Ring B bzw. C ebenfalls eine funktionelle Gruppe oder einen Substituenten aufweisen, so wird die Gruppierung

R¹

-X-N

vorzugsweise an die angegebene Stellung des Rings C bzw. B gebunden sein.

Als mögliche funktionelle Gruppen oder Substi tuenten seien beispielsweise genannt: Ketogruppen π 3-, 6-, 11- und/oder 17-Stellung; freie, veresterte ode verätherte Hydroxygruppen in 1-, 3-, 6-. 11-, 16- und oder 17-Stellung; eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlen stoflatomen. vorzugsweise eine Methyl- oder Äthyl gruppe, in 1-. 2-. 6-, 7-, 10-, 13- und oder 16-Stellung

609 647 301

eine Methylengruppe in 1,2-, 6,7-, 15,16- und oder 16 17-Stellung oder Halogenatome, vorzugsweise ein Fluor- oder Chloratom, in 2-, 4-, 6-, 7-, 9-, 11- und oder 16-Stellung.

Die Ringe A, B, C und D können gesättigt oder ungesättigt sein, wobei sich anwesende Doppelbindungen, z.B. in 1(2)-, 3(4)-, 4(5)-, 5(6)-, 6(7)-, 5(10)-, 9(11)- und'oder 16(17)-Stellung befinden können.

Bevorzugte Steroide sind unter anderem Steroidderivate der allgemeinen Formel II Weitere bevorzugte Steroide sind Steroidderivate der allgemeinen Formel 111

CH₁-R"

R¹

(H) R⁴I

F\

G' OH

R"

vvo π η CO

R^r-

I ] ' R¹

-X-N

X-N

R-

R¹

-X-N

R¹

R²

in der oben angegebenen Bedeutung sich bevorzugt in der Stellung 6 und 7 befindet. F'—G' eine Einfach- oder Doppelbindung darstellt und R⁴. R\ R'\ R¹⁰. R" R^i: und Z die oben angegebene Bedeutung haben.

Ferner sind bevorzugte Steroide Steroidderivate dei allgemeinen Formel IV

die oben angegebene Bedeutung hat und sich bevorzugt in 6-, 7-. 11- oder 12-Stellung befindet. A' die Gruppierung

R-O-I

und B'—C die Gruppierung

CO

Q η

R¹"

XN

—X — N

R¹

R^:

^s° sich bevorzugt in 11- oder 12-Stellune befindet un( ebenso wie R\ R⁸ und R¹⁰ die oben aneeeebene Be deulung hat.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Steroid der allgemeinen Formel I erfolgt in"an sich bekannte Weise aus entsprechenden Steroiden der allgemeine] Formel V

Z R⁵

darstellt, in denen R⁴, R⁵, R⁸, R⁹ und R¹⁰ die oben angegebene Bedeutung haben.

—X-OH

worin A. B — C. D - E, R\ R⁵. R* und R⁷ sowie ;

und X die oben angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls nach überführung in die entsprechenden Säurechloride, -azide, -azolidc, -anhydride oder Ester durch Umsetzung mit einer Verbindung der allgemeinen Formel VI

R¹

H-N

(Vl)

R²

worin

— N

die oben angegebene Bedeutung hat.

Die Umsetzung der Steroide der allgemeinen Formel V mit den Verbindungen der allgemeinen Formel Vl kann nach Methoden erfolgen, wie sie dem Fachmann allgemein, z. B. aus der Peptidchemie, bekannt sind. Genannt seien beispielsweise folgende Verfahren:

Methode der gemischten Anhydride, die Carbodiimid-Methode, die Azid-Methode oder die Methode der aktivierten Ester. Eine allgemeine Beschreibung dieser Methoden findet sich unter anderem in H. Beyer, Lehrbuch der organischen Chemie. S. Hirzel-Verlag, Leipzig (1968).

Als Aminogruppe(n) tragende Verbindungen kommen unter anderem primäre Amine in Frage, so daß R¹ ein Wasserstoffatom und R² einen gegebenenfalls, z. B. durch eine Hydroxylfunktion oder durch heterocyclische Reste, substituierten Alkylrcst bedeutet, beispielsweise genannt seien Methyl-. Äthyl-, Benzylamin-, Tyramin, Tryptamin, Serotonin, Histamin usw.

Als Aminoverbindungen seien ferner sekundäre Amine genannt, so daß R¹ und R² einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest bedeuten, oder cyclische Amine, so daß R¹ und R² zusammen eine gegebenenfalls noch durch ein Heteroatom, wie ein Sauerstoff-. Stickstoff- oder Schwefelatom, unterbrochene Alky'enbrücke mit 4 bis 7 Atomen bedeuten, beispielsweise seien genannt: Dimethyl-, Diäthyl-, Dibutylamin, Piperidin, Piperazin. Morpholin usw.

Als Aminoverbindungen kommen auch aliphatische oder aromatische Aminosäuren in Betracht, so daß R¹ ein Wasserstoffatom und R² den übrigen Rest der Aminosäure bedeutet, beispielsweise seien genannt: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Thyrocin, L-Dopa usw.

Als Aminoverbindungen kommen auch heterocyclische Aminosäuren in Frage, so daß

R¹

—N

R²

den Rest einer heterocyclischen Aminosäure, wie z. B. Prolin, Tryptophan, Histidin usw. bedeutet

Die Ammogruppe(n) tragenden Verbindungen der Formel VI sind in hoch aktivierter Form ausreichend käuflich oder bequem herstellbar, so daß die aktivierten Steroiddcrivate der Formell leicht und kurzfristig erhalten werden können. Im allgemeinen werden die Steroidderivalc der Formel 1 nicht isoliert, sondern in Form ihrer Lösungen in den Test eingesetzt werden. Die beschriebenen Tracer der allgemeinen Formel I s sind in analoger Weise substituiert wie zur Antikörpererzeugung verwendete Steroidkonjugate. Sie können als solche bei radio-immunologischen Tests eingesetzt werden, stellen also Diagnostika dar. Im Gegensatz zu literaturbekannten Verfahren, die als

ίο Tracer das gesamte Immunogen (also ein Konjugat: Steroid - hochpolymerer Träger) verwenden und die Radioaktivität durch Jodierung einführen, haben die hier beschriebenen Tracer der allgemeinen Formel I den Vorteil, daß solche Antikörper, die gegen antigene Determinanten des Trägers gerichtet sind, keinen Einfluß auf das Testergebnis haben. Die Spezifität des Tests wird also dadurch weiter erhöht. Sie sind somit zum Nachweis und zur Bestimmung von äußerst geringen Mengen der Steroide bis zu einem Bereich von Picogramm ml geeignet.

Die Ausgangssteroide der allgemeinen Formel V können nach Verfahren, wie sie dem Fachmann allgemein bekannt sind, erhalten werden. So können beispielsweise die Verbindungen der Formel V. in denen X eine —O — CO—R³- oder— NH-CO—R³-Gruppierung darstellt, durch Umsetzung des entsprechenden Hydroxy- oder Aminosteroids mit dem cyclischen Anhydrid einer Dicarbonsäure, wie z. B. Bernsteinsäure-, Glutarsäure-, Adipinsäureanhydrid, hergestellt werden.

Beispielsmäßig sei die Herstellung der Ausgangssteroide der Formel V an Hand der folgenden neuen Verbindungen beschrieben:
A, 21.3g 6-Ketoöstradiol-diacetat -- hergestellt aus o-Ketoöstradiol-H-acetat (belgische Patentschrift 7 85 448) durch übliche Acetylierung — werden unter Reformatzky-Bedingungen mit 29 ml Bromessigsäureäthylester umgesetzt. Das Rohprodukt wird mit Silicagel gemischt, auf eine Silicagelsäule gebracht und mit Hexan — Essigestergemisch eluiert. Die nach Dünnschichtchromatographie einheitlichen Fraktionen werden eingedampft. Der Rückstand wird mit 450 ml Alkohol nach Zugabe einer Mischung von 40 m! Alkohol und 4,5 ml konz. Schwefelsäure 4 Stun-

4s den unter Rückfluß gekocht. Nach Einengen wird in Eiswasser gefällt, abfiltriert und neutral gewaschen. Nach fraktionierter Kristallisation des (9,1 g) Rohproduktes aus Essigester und Mutterlaugenchromatographie werden 4,0 g 6-Äthoxycarbonylmethyl-1.3, 5( 10).6-östratetraen-3,l 7/>-diol vom Schmelzpunkt 178 179 bis 180.5 C und 1,2 g 6-Äthoxycarbonylmethylen l,3,5(10)-östratrien-3,17/?-diol vom Schmelzpunkt 181 182 bis 183,5⁰C erhalten.

20 g 6 - Äthoxycarbonylmethyi - l,3,5(10),6 - östratetraen - 3.17,-;-diol werden in 280 ml Tetrahydrofuran und 280 ml Methanol in Gegenwart von 2 s Pd CaCO₃ (10%ig) bis zur Aufnahme von 1 mMol Wasserstoff je Millimol Substanz hydriert. Man erhall 6/< - Äthoxycarbonylmethyi - 1,3,5(10} - östratrien- 3,170-diol als schaumartige Masse. Die gleiche Verbin dung wird auch durch analoge Hydrierung vor 6 - Äthoxycarbonylmethylen - 13,5(10) - östratrien 3,17,-i-diol erhalten. Die Herstellung von 6/i-Äthoxy carbonylmethyl-1,3,5(10)-östratrien-3,170-diol laß

6s sich dadurch vereinfachen, daß das Rohprodukt de Reformatzky-Reaktion hydrolysiert, das erhalten« Hydrolysat durch fraktionierte Filtration über Silica gel von Nebenprodukten befreit und das anfallend

Gemisch von 6-Äthoxycarbonylmethyl- 1,3,5(1O)-6-östratetraen-3,17/i-diol und 6-Äthoxycarbonylmethyien-l,3,5(10)-östratrien-3,17/y-diol wie oben angegeben hydriert wird.

8,0 g 6(i - Äthoxycarbonylmethyl - 1,3,5(10) - östratrien-3,17/i-diol werden mit 180 ml n/2 Kalilauge 3 Stunden unter Rückfluß gekocht. Dann wird in Eiswasser gefallt, neutralisiert und wiederholt mit Äther ausgeschüttelt. Die Ätherauszüge werden mit verdünnter Sodalösung wiederholt ausgezogen und die Sodaauszüge mit Salzsäure angesäuert. Der Niederschlag wird abfiltriert und neutral gewaschen. Man erhält 4,14g 6/<-Carboxymethyl-l,3,5(l0)-östratrien-3,17/y-diol. Schmelzpunkt 220,5 bis 222°C (Aceton).

A₂ 1,4 g 6/i-Äthoxycarbonylmethyl-1,3,5(10)-öslratrien-3,17/i-diol — hergestellt gemäß A₁ — werden mit Cyclohexanon und Aluminiumisopropylat einer Oppenauer-Oxydation unterworfen. Nach Chromatographie an Silicagel erhält man 1,0 g 3-Hydroxy-6/f-äthoxycarbonylmethyl-l,3,5(10)-östratrien-17-on (Schmelzpunkt 137,5 bis 138° C), das durch alkalische Verseifung mit Kalilauge analog A₁ in 3-Hydroxy-6/i - carboxymethyl -1,3,5( 10) - östratrien -17 - on vom Schmelzpunkt 240 bis 242' C (Aceton) übergeführt wird.

Die gleiche Verbindung wird auch bei Durchführung der Oxydation mit Jones-Reagenz und analoger Aufarbeitung erhalten.

A₃ (a) 10,0 g S-Hydroxy-o/f-äthoxycarbonylmethyl-1,3,5(10)-östratrien-17-on hergestellt gemäß A₂ — werden mit 20 ml Acetanhydrid 20 Stunden bei Raumtemperatur in 20 ml Pyridin acetyliert. Nach Fällen in Eiswasser, Abfiltrieren und Aufnehmen des Niederschlags in Methylenchlorid. Trocknen und Eindampfen werden 11,8 g S-Acetoxy-o/i-äthoxycarbonylmethyl-1,3. 5(10)-östratrien-17-on erhalten, die mit 140 ml Essigsäure-isopropenylester in Gegenwart von 1,4 g Toluolsulfonsäure zum Sieden erhitzt und dann einer langsamen Destillation unterworfen werden. Das erkaltete Reaktionsgut wird mit Methylenchlorid verdünnt und mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet, eingedampft und ergibt 13.3 g Rohprodukt. Nach Chromatographie an Silicagel erhält man reines 3,17-Diacetoxy-6/y-äthoxycarbonylmethyl-1.3,5(10),16-östratetraen als fast farbloses öl.

5 g 3,17 - Diacetoxy - 6ft - äthoxycarbonylmcthyll,3,5(10),16-östratetraen werden in 75 ml Benzol gelöst und nach Zugabe von 3,2 g m-Chlorperbenzoesäure · 90 Minuten unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird mit Benzol verdünnt, wiederholt mit verdünnter Sodalösung ausgeschüttelt und mit Wasser neutral gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 3,17fi - Diacetoxy - 16«,17 - epoxy - bfi - äthoxycarbonylmethyl - 1,3,5(10) - östratrien. das ohne Reinigung mit 2,0 ml Perchlorsäure (70%ig) in Eisessig 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt wird. Nach Verdünnen mit Methylenchlorid wird nacheinander mit Wasser, verdünnter Sodalösung und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Anschließende Chromatographie an Silicagel ergibt 1,95 g 3,16« - Diacetoxy - 6/i - äthoxycarbonylmethyl - 1.3. 5(10)-östratrien-17-on als öl.

300mg 3,16n - Diacetoxy - 6// - äthoxycarbonylmethyl- l,3,5(10)-östratrien-17-on werden in 11 ml Methanol gelöst und bei +5"C mit 0,17 g NaBH₄ in 9 ml Methanol allmählich versetzt. Nach 20 Stunden Stehenlassen bei Raumtemperatur wird eingeengt und in salzsäurehaltiges Wasser eingerührt. Das Reduk tionsprodukt wird in Essigester aufgenommen, dii Lösung neutral gewaschen, getrocknet und einge dampft. Aus 330 mg Rohprodukt werden durch prii parativc Düiinschichtchromatographie 16«-Acctoxy 6/1 - äthoxycarbonylmethyl - 1,3,5(10) - östratrien 3,17/.'-diol vom Schmelzpunkt 170,5 bis 171.5 C um 6/i - Äthoxycarbonylmethyl - 1,3,5(10) - östratrien 3,16«.17/i-triol vom" Schmelzpunkt 192.5 bis 193 C

ίο erhalten.

100 mg des vorstehenden Rohproduktes werder mit 4 ml η 2 Kalilauge 2 Stunden unter Rückfiul. erhitzt. Dann wird in Eiswasser gegeben, neutralisier und mit Äther ausgeschüttelt. Die Ätherauszüge wer den mit verdünnter Sodalösung ausgezogen und dii Sodaauszüge mit Salzsäure angesäuert. Nach Filtration und Neutralwaschen werden 25 mg 6/i-Caiboxy methyl - 1.3.5(1O)- östratrien - 3,16α, 17/»' - triol erhalten (b) 2 g 6-Ketoöstriolacetat — hergestellt nach Bio ehem. J., 74 (1960), 430 — werden analog A₁ untei Reformatzky-Bedingungen mit 3 ml Bromessigsaure äthylcster umgesetzt und aufgearbeitet. Das Roh produkt wird hydrolysiert, das Hydrolysat von Neben produkten getrennt und hydriert. Anschließende Vor seifung mit Kalilauge und Aufarbeitung liefert 300 mi

6/i-Carboxymelhyl-1.3,5( 10)-östratricn-3,16.;, 17,-Mrioi A₄ 2.0 g 3 - Hydroxy - 6/i - äthoxycarbonylmelhyl-

1.3.5(10)-östralrien-17-on -- hergestellt gemäß A₂ werden in eine Suspension von 1,1 g Kalium-tertiär butylat in 20 ml Tetrahydrofuran, in welche zuvoi 1 Stunde lang bei -5 C Acetylen eingeleitet wurde eingetragen. Man leitet bei -5 C weitere 3 Stundei lang Acetylen ein, zersetzt dann das Rcaktionsgemisc! durch Zugabe von 65 ml 20%iger Schwefelsäure und 35 ml Wasser, saugt vom Kaliumsulfat ab, engt das Filtrat im Vakuum ein, nimmt in Methylcnchlorid auf. wäscht die Methylenchloridphasc neutral und engt sie zur Trockne ein. Der Rückstand wird au? Methylenchlorid umkristallisiert und ergibt 1.4 g

17'/-Äthinyl-6/i -carboxymethyl-1.3,5(10)- östratricn"-3,17/i-diol.

A, Ein Gemisch von 2.24 g 3.17/i-Dihydroxy-17(j-äthinyl-1.3.5(10)-östratrien-6-on hergestellt gemäßbelgischer Patentschrift 7 85 448 -.3.0 ε Natrium-

4s acetat. 1,96 g Carboxymethoxylaminheminydrochlond sicc., 54.0 ml Äthanol und 6 ml Wasser wird 1 Stunde zum Sieden erhitzt. In der Kälte werden 360 ml Äther zugegeben, dann wird dreimal mit je 60 ml an Natriumhydrogencarbonat gesättigter 5%icer

so Sodalösung extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 30 ml konz. Salzsäure angesäuert und die ausgefällte, schmierige Substanz in Essigester aufgenommen; die wäßrige Phase wird noch zweimal mit Essigester ausgeschüttelt. Die Essigesterphasen werden dreimal

mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester umkristallisiert Man erhält 3,1g ö-Carboxymethoxyimino-nn-äthinyl-l,3,5(10)-östratrien-3,17/i-diol(mit 1 Mol Kristallessigester) vom Schmelzpunkt 80 bis 88⁰C (Zers.).

Die gleiche Verbindung wird aus 17-Hydroxy-3 - acetoxy -17„ - äthinyl - 1,3,5(10) - östratnen - 6 - on. Schmelzpunkt 181,5 bis 185^rC — hergestellt aus der 3,17-Dihydroxy-Verbindung durch partielle Acetylierung — durch analoge Umsetzung erhalten.

A„ 4,4g 17/<-Acetoxy-6-oximino-1.3.5(10)-östratrien-3-ο!. Schmelzpunkt 252°C (Zers.) - hergestellt aus 6-Ketoöstradiol-diacetat gemäß Ann. 692 (66). 180 . werden mit Natrium in Isopropanol zur ent-

sprechenden Aminoverbindung reduziert. Die methanolische Lösung der Rohbase wird mit ätherischem Chlorwasserstoff versetzt. Aus dem Hydrochlorid-Rohprodukt wird nach wiederholtem Umlösen aus Methanol reines (3,17^-Dihydroxy-1,3,5(10)-östratrien-6/i-yl)-ammoniumchlorid vom Schmelzpunkt 251°C (Zers.) erhalten, von dem 100mg mit 40mg Bernsteinsäureanhydrid und 0,77 ml N-Äthylmorpholin (als 1 %ige Pyridinlösung) 20 Stunden bei Raumlemperatur umgesetzt werden. Man erhält 100 mg 6(i - 3' - Carboxypropionylamino -1,3,5( 10) - östratrien-3,17/f-diol vom Schmelzpunkt 157° C (Zers.).

A₇ 3,5 g 16«,17/i - Diacetoxy - 6 - oximinol,3,5(10)-östratrien-3-ol — hergestellt aus 6-Keto östriol-triacetat gemäß Biochem. J. 74 (1960), 430, und A₆ — werden wie unter A₆ beschrieben reduziert und zum (3,16«,17,<-Trihydroxy-l,3,5(10)-östratrien-6/<-yl)-ammoniumchlorid umgesetzt, von dem 100 mg mit 40 mg Bernsteinsäureanhydrid und 0,77 ml N-Äthylmorpholin zur Reaktion gebracht werden. Man erhält 85 mg 6/i-3'-Carboxypropionylamino· 1,3,5( 10)-östratrien-3,16«, 17/i-triol.

A₈ 2 g 6«-Hydroxyprogesteron werden in 20 ml Pyridin mit 4 g Bernsteinsäureanhydrid 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung in Eiswasser eingerührt und mit 1 η-Salzsäure angesäuert. Das schmierige Fällungsprodukt wird abgetrennt und in Methylenchlorid gelöst, die Lösung wird mit Salzsäure und Wasser gewaschen und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand (2,57 g Schaum) wird in Methanol gelöst, mit Kohle versetzt, filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Durch Verreiben des Rückstandes mit Pentan werden 2,1 g amorphes (3,20 - Dioxo - 4 - pregnen - 6« - yl) - hydrogensuccinat erhalten. UV: f_2M = 14 100.

A₉ 2,82 g Ha- Hydroxy- 17α - äthinyl - 19- nortestosteron werden mit 18 ml Pyridin und 1,35 g Bernsteinsäureanhydrid 20 Stunden auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in V/asser gegossen und mit Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die Methylenchloridauszüge werden erschöpfend mit Sodalösung (5%ig) ausgezogen und die vereinigten Sodaauszüge mit Salzsäure angesäuert, das ausgeschiedene Produkt in Methylenchlorid aufgenommen und neutral gewaschen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels verbleibt das Rohhemisuccinat als Schaum. Zur Nachreinigung wird in Methylenchlorid gelöst und wiederholt mit Sodalösung ausgezogen. Die vereinigten Sodaauszüge werden angesäuert und das schmierige ausgeschiedene Produkt in Methylenchlorid aufgenommen und neutral gewaschen. Man erhält 1,9 g (17/i-Hydroxy-3-oxo-17« - äthinyl - 4 - östren - 1 In - yl) - hydrogensuccina.t. UVIf₂₃₉ = 15 700.

A₁₀ 720 mg 6fi,17/, - Dihydroxy - 18 - methyl-Πα - äthinyl - 4 - östren - 3 - on ·■- hergestellt aus n/i-Hydroxy-lS-methyl-na-äthinyM-östren^-on durch mikrobiologische Hydroxylierung wie im folgenden Absatz beschrieben — werden analog A₄ mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt und aufgearbeitet, wobei die Reaktionsdauer auf 5 Stunden verkürzt wird. Das über das Natriumsalz gereinigte Hydrogc-nsuccinat wird mit Äther/Hexan verrieben. Nach Verdunsten des Lösungsmittels werden 430 mg (17/f-Hydroxy - 3 - oxo - 18 - methyl - 17α - äthinyl - 4 - östren-6/*-yl)-hydroGensuccinat vom Schmelzpunkt 111 bis 143°C (Zers.") erhalten. UV: ,_2}5 = 11 900.

Ein 50-1-Glasfermenter wird mit 29 1 eines flüssigen, sterilen Nährmediums folgender Zusammensetzung gefüllt: 3% Glukose, 1% corn steep, 0,2% NaNO₃, 0,1% KH₂PO₄,0,2% K₂HPO₄,0,05% MgSO₄,0,002% FeSO₄ und 0,05% KCl. Anschließend wird der Fermenter mit 11 einer 2V₂ Tage gewachsenen Vorkultur des Stammes Mucor griseocyanus i[ATCC 1207 b) beimpft. Nach einer Anwachszeit von 12 Stunden werden 6 g 17/i- Hydroxy -18 - methyl -17α - äthinyl - 4 - östren-3-on, gelöst in 75 ml Dimethylformamid, hinzugegeben. Nach weiterer 60stündigei Inkubation wird

ίο der Fermenterinhalt geerntet, filtiriert, mit Methylisobutylketon extrahiert, der Extrakt zur Trockne eingedampft und der Rückstand an Kieselgel chromatographisch gereinigt. Nach Kristallisation aus Essigester/lsopropyläther erhält man 6/<,17/i-Dihydroxy-18-methyl-17a-äthinyl-4-östren-3-on vom Schmelzpunkt 194 bis 195°C.

A_n 0,433g 6-Chlor-11«-hydroxy-17-acetoxy-1 «,2« - methylen - 4,6 - pregnadien - 3,20 - dion — hergestellt aus 6 - Chlor -17 - acetoxy -1 «,2« - methyien-4,6-pregnadien-3,20-dion durch mikrobiologische Hydroxylierung wie im folgenden Abschnitt beschrieben — werden analog A₉ mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt und aulgearbeitet. Nach Reinigung über das Natriumsalz erhält man 230 mg (6-Chlor-n-acetoxy - 3,20 - dioxo -1 «,2« - methylen - 4,6 - pregnadienlla - yl) - hydrogensuccinat als Schaum. UV: _t280 = 15 500.

Ein 50-1-Glasfermenter wird mit 29 1 eines flüssigen, sterilen Nährmediums folgender Zusammensetzung gefüllt: 3% Glukose, 1% corn steep. 0,2% NaNO₁. 0,1% KH₂PO₄,0,2% K₂HPO₄,0,0.'i% MgSO₄,0,002% FeSO₄, 0,05% KCl. Danach wird der Ansatz mil 1 1 einer 72stündigen Vorkultur von Glomerel'.a cingulata (ATCC 10 534) beimpft und nach einer 12stündigen Anwachsphase das Substrat in Form einer steril filtrierten Lösung von 6g 6-Chlor-17-acetoxy-lu, 2«,methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion in 150 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Nach 37 Stunden wird die Kulturbrühe filtriert, das Filtrat mit Methylisobutylketon extrahiert, der Extrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft und der verbliebene Rückstand an einer Kieselgelsäule chromatographisch gereinigt. Man erhält 6 - Chlor -11«- hydroxy - 17 - acetoxy-1«,2« - methylen - 4,6 - pregnadien - 3,20 - dion vom Schmelzpunkt 133 bis 136⁰C.

A12 2 g 7« - Hydroxy - 4 - androsten - 3,17 - dion — hergestellt aus4-Androsten-3,17-dion durch mikrobiologische Hydroxylierung wie im folgenden Abschnitt beschrieben — werden analog A₄ äthinyliert.

Das erhaltene 7α,17β - Dihydroxy - 17« - äthinyl-4-androsten-3-on wird analog A₉ mit 0,8 g Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt und aufgearbeitet. Man erhält (17/i - Hydroxy - 3 - oxo - 17α - äthinyl - 4 - androsten - 7« - yl) - hydrogensuccinat als Schaum.

UV: ^₂₄₀ = 16 800 (Methanol).

Vier 50-1-Glasfermenter werden mit jeweils 291 eines flüssigen Nährmediums, bestehend aus 10% flüssigem Stärkezucker und 2% corn steep, gefüllt und mit Wasserdampf sterilisiert. Anschließend werden die Fermenter mit 1 1 einer 34 Stunden gewachsenen Vorkultur des Stammes Absidia orchidis (ATCC Nr. 6811) beimpft. Nach einer Anwachszeit von 12 Stunden wird jeder Fermenter mit einer steril filtrierten Lösung von 6 g 4-Androslen-3,17-dion in 200 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 36 Stunden Kontaktzeit wird die Fermentation abgebrochen, die Kulturbrühe filtriert, das Kulturfiltrat mit Mcthylisobutylketon erschöpft und extrahiert. Die vereinig-

ten organischen Phasen werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der verbliebene Rückstand wird zweimal aus Aceton kristallisiert, wodurch mitentstandenes 6/i-Hydroxy-androstendion in der Mutterlauge verbleibt und dadurch abgetrennt werden kann. Man erhält 7«-Hydroxy-4-androsten-3,l 7-dion (3,12 g) vom Schmelzpunkt 239,8° C.

A₁₃ 5 g 6a - Fluor -11&21 - dihydroxy -16« - methyll,4-pregnadien-3,20-dion werden in 25 ml Pyridin mit 5 g Bernsteinsäureanhydrid 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen auf 20° C wird die Lösung in Eiswasser eingerührt, mit Salzsäure angesäuert und das ausgefallene Produkt abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Durch Umkristallisation aus Essigester werden 4,85 g (oa-Fluor-ll/i-hydroxy-3,20-dioxo-16«-methyl~ l,4-pregnadien-21 -yl)-hydrogensuccinat vom Schmelzpunkt 212 bis 214° C erhalten.

A_w 8,9 g l-Methyl-17/i-hydroxy-5r,(-androst-l-en-3-on werden in 53 ml Pyridin gelöst und nach Zugabe von 8,9 g Bernsteinsäureanhydrid 3,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Aufarbeitung, wie in A₁₃ beschrieben, wird (1 - Methyl - 3 - oxo - 5« - androst-1 - en-17/i-yI)-hydrogensuccinat vom Schmelzpunkt 149 bis 150° C (Essigester —Hexan) erhalten. Ausbeute: 85% der Theorie.

A₁₅ Eine Lösung von 2 g 3/i-Heptanoyloxy-5-androsten-7,17-dion-17-äthylenketal in 240 ml Methanol und 100 ml THF wird bei Raumtemperatur langsam mit 600 mg NaBH₄ versetzt und 30 Minuten unter N₂ bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit Eisessig neutralisiert, eingeengt, in Äther aufgenommen, mit gesättigter NaCl-Lösung neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird zur Ketalspaltung in der Wärme mit Essigsäure behandelt. Das erhaltene 3ß - Heptanoyloxy - 7a - hydroxy-5-androsten-17-on wird analog A, in (3/f-Heptanoyloxy -17 - oxo - 5 - androsten - 7« - yl)- hydrogensuccinat übergeführt. Ausbeute: 450 mg.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen nnden als Diagnostika Verwendung, wobei sie üblicherweise in Lösung eingesetzt werden. Zweckmäßigerweise werden sie in den Lösungen benutzt, in denen sie bei der Herstellung anfallen. Das schließt jedoch nicht aus, daß die Lösungen mit anderen Lösungsmitteln gemischt werden oder daß die erfindungsgemäßen Verbindungen nach Isolierung in anderen Lösungsmitteln aufgenommen und eingesetzt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

50 Beispiel 1

1,0 μΜοΙ 6,1-Carboxymethyl-1,3,5(10)-östratrien-3,17/i-diol und Ι,ΟμΜοΙ N-Äthylmorpholin werden bei -15 bis -20⁰C in 2 ml peroxydfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung werden 1,1 μΜοΙ Isobutylchlorcarbonat gegeben und die Lösung danach 15 bis 20Minuten bei -5 bis -10⁰C gehalten. 0,1 μΜοΙ [3,5-³H₂]-L-Tyrosin-Hydrochlorid und 0,2 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden in 150 μΐ Wasser aufgenommen und zu dem oben angegebenen Substanzgemisch gegeben. Das Reaktionsgut wird 2 bis 3 Stunden bei (FC gehalten. Anschließend wird die Reaktionslösung auf eine Kieselgelsäule gegeben und mit einem Essigester/Methanol-Gradienten eluieri. Das Eluat wird in Fraktionen zu 2 ml gesammelt. Die Identifizierung der Fraktionen, die das gebildete N - [(3,17p - Dihydroxy -1,3,5(10) - östratrien - 6/i - yl)-acetyl]-L-tyrosin-[3,5-^JH₂] enthalten, erfolgt durch Messung der Radioaktivität und der UV-Absorption.

Beispiel 2

Analog Beispiel 1 erhält man aus 17«-Äthinyl-6/i-carboxymethyl-1,3,5( 10)-östratrien-3,17,,-diol und [3,5-³H,]-L-Tyrosin-Hydrochlorid N-[(17«-Äthinyl-3,17/i - dihydroxy -1,3,5( 10) - östratrien - 6/i - yl)-acetyl]. L-tyrosin-[3,5-³H₂j.

Beispiel 3

Analog Beispiel 1 erhält man aus (17,;-Hydroxy-3 - oxo -17«- äthinyl - 4 - östren - 11 « - yl) - hydrogensuccinat und [3,5-³H₂]-L-Tyrosin-Hydrochlorid N - [17« - Äthinyl - 17/i - hydroxy - 3 - oxo - 4 - östren-11 «-yloxy-succinyO-L-tyrosin-[3,5-³H₂].

Beispiel 4

Analog Beispiel 1 erhält man aus (6-Chlor-17-aceloxy - 3,20 - dioxo - U,2« - methylen - 4,6 - pregnadienll«-yl)-hydrogensuccinat und [3.5-'H₂]-L-Tyrosin-Hydrochlorid N - [ 17« - Acetoxy - 6 - chlor -1 .,.2·, - methylen - 3,20 - dioxo - 4,6 - pregnadien - 11«- yloxysuccinyl]-L-tyrosin-[3,5-³H₂].

Beispiel 5

2 μΜοΙ 6/ί - (3 - Carboxypropionyl - umino)-1,3,5(10)-östratrien-3,17,;-diol und 2 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden bei -10 bis -15 C in 3 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung werden 2,2 μΜοΙ Äthylchlorcarbonat gegeben und die Lösung danach 10 bis 15 Minuten bei -5°C gehalten. 0.2 μΜοΙ [2,3-³H₂]-L-Phenylalanin werden in 220 _;Λ 10~³η-NaOH aufgenommen und zu dem oben angegebenen Substanzgemisch gegeben. Das Reaktionsgut wird über Nacht bei etwa +4⁰C gehalten, und das gebildet N - [(3,17/i - Dihydroxy -1,3,5(10) - östratrien - 6,; - y])-aminosuccinyl] - L - phenylalanin - [2,3 - ³H₂] wird durch Chromatographie auf einer Kieselgelsäulc mit einem Essigester/Methanol-Gradienten eluiert. Die entsprechenden Fraktionen werden durch UV-Absorption und Messung der Radioaktivität identifiziert.

Beispiel 6

Analog Beispiel 5 erhält man aus (l-Methyl-3-oxo-5« - androst - 1 - en - 1 7/i - yl) - hydrogensuccinat und [2,3 - ³H₂] - L - Phenylalanin N-[I- Methyl - 3 - oxo-5a - androst - 1 - en - 17/i - yloxysuccinyl] - l - phenylalanin-[2.3-³H₂].

Beispiel 7

1,5 μΜο! 3 - Hydroxy - 6/i - carboxymcthyll,3,5(10)-östratrien-17-on und 1,6 μΜοΙ Triäthylamin werden bei -15 bis -20° C in 3 ml peroxydfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung werden 1,6 μΜοΙ Isobutylchlorcarbonat gegeben und die Lösung danach 5 Minuten bei —5 bis -6⁰C gehalten. 0,2 μΜοΙ [2,5-³H₂]-Histamin-Dihydrochlorid und 0,4 μΜοΙ Triäthylamin werden in 200 μΐ Wasser aufgenommen und zu dem oben angegebenen Substanzgemisch gegeben. Das Reaktionsgut wird 2 Stunden bei 0 bis -5⁰C gehalten. Anschließend wird das gebildete N-[(3-Hydroxy- 17-oxo-1,3,5(10)-östratrien-6/i-yl)-acetyl]-histamin-[2,5-³H₂], wie vorstehend beschrieben, durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule in Lösung erhalten.

Beispiel 8

Analog Beispiel 7 erhält man aus (17/i-Hydroxy-3 - oxo -18 - methyl - 17« - äthinyl - 4 - östren - 6/i - yl)-hydrogensuccinat und [2,5-³H₂]-Histamin-Dihydrochlorid N - [ 17« - Äthinyl -1 Iß - hydroxy -18 - methy 1-

3 - oxo - 4 - östren - 6ß - yloxy - succinyl] - histamin-[2,5-³H₂].

Beispiel 9

1 μΜοΙ 6/f - Carboxymethyl - 1,3,5(10) - östratrien-3,16u,17/i-triol und 1 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden bei -15 bis -20⁰C in 2 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Zu dieser Lösung werden 1 μΜοΙ Isobutylchlorcarbonat gegeben und die Lösung danach 5 Minuten bei -5° C gehalten. 0,1 μΜο1[υ-¹⁴σ]-ΡΓθΗηΜΐα0,1 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden in 100 μΐ Wasser aufgenommen und zu dem oben angegebenen Substanzgemisch gegeben. Das Reaktionsgut wird über Nacht bei 0⁰C gehalten. Das gebildete N-[(3,16_fi,17/i-Trihydroxy -1,3,5(10) - östratrien - 6ß - yl) - acetyl] - prolin-[U-¹⁴C] wird anschließend, wie oben beschrieben, in Lösung erhalten.

Beispiel 10

Analog Beispiel 9 erhält man aus (3,20-Dioxo-

4 - pregnen - 6a - yl) - hydrogensuccinat und [U-¹⁴C]-Prolin N - [3,20 - Dioxo - 4 - pregnen - 6<< - yloxy - succinyl]-prolin-[u-¹⁴C].

Beispiel 11

Analog Beispiel 9 erhält man aus (3/i-Heptanoyloxy-17 - oxo - 5 - androsten - Ta · yl) - hydrogensuccinat und [u - ¹⁴C] - Prolin N - [3β - Heptanoyloxy - 17 - oxo-5-androsten-7«-yloxy-succinyl]-prolin-[u-¹⁴C].

Beispiel 12

2 μΜοΙ 6 - Carboxymethoxyimino - 17« - äthinyll,3,5(10)-östratrien-3,17/>-diol und 2 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden bei — 20 bis — 25° C in 3 ml peroxydfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung werden 1,9 μΜοΙ Isobutylchlorcarbonat gegeben und die Lösung danach 5 bis 8 Minuten bei -5°C gehalten. 0,3 μΜοΙ [1,2-³H₂]-Dopamin-Hydrochlorid und 0,3 Mol N-Äthylmorpholin werden in 200 μΐ Wasser aufgenommen und zu dem oben angegebenen Substanzgemisch gegeben. Das Reaktionsgut wird 4 Stunden bei -5° C gehalten und anschließend das gebildete N-[(17«-Äthinyl-3,17/i-dihydroxy -1,3,5(10) - östratrien - 6 - yliden) - aminooxyacetyl]-dopamin-[l,2-³H₂], wie in den verangehenden Beispielen beschrieben, erhalten.

Beispiel 13

Analog Beispiel 12 erhält man aus (6«-Fluor-l 1/i-hydroxy-3,20-dioxo-16u-methyl-1,4-pregnadien -21 -yl)-hydrogensuccinat und [1,2-³H₂]-Dopamin-Hydrochiorid N - [6a - Fluor - 1 Iß - hydroxy - 16α - raethyl-3,20 - dioxo -1,4 - pregnadien - 21 - yl - oxysuccinyl]-dopamin-[ 1,2-³H₂].

Beispiel 14

Ι,ΟμΜοΙ 6ß - (3 - Carboxypropionyl) - amino-1,3,5(10) - östratrien - 3,16a,17/? - triol und 1,1 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden bei —15 bis —20° C in

2 ml peroxydfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung werden 1,0 μΜοΙ Isobutylchlorcarbonat gegeben und die Lösung danach 5 bis 10 Minuten bei -5⁰C gehalten. 0,1 μΜοΙ [4,5-³H₂]-L-Leucin und 0,1 μΜοΙ N-Äthylmorpholin werden in 100 μΐ Wasser aufgenommen and zu dem oben angegebenen Substanzgemisch gegeben. Das Reaktionsgut wird 5 bis 6 Stunden bei 0 bis -5⁰C gehalten. Anschließend wird das gebildete N-[(3,16a,17/*-Trihydroxy-1,3,5 (10) - östratrien - 6ß - yl) - aminosucciny 1] - L - leucin-[4,5-³H₂] durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, wie oben beschrieben, in Lösung erhalten.

Beispiel 15

Analog Beispiel 14 erhält man aus (17/i-Hydroxy-

3 - oxo -1 Ta - äthinyl - 4 - androsten - la - yl) - hydrogensuccinat und [3,5-³H₂]-L-Leucin N-[17<-.-Äthinyl- 17β - hydroxy - 3 - oxo - 4- androsten - 7α - y loxysuccinyl]-L-leucin-[3,5-³H₂].

Beispiel	Spezifische	Ausbeute	Radioaktne
	Aklhi'at		Konzentralion
1	40 Ci/mMol	30%	0,20 mCi/ml
2	40Ci, mMol	32%	0,21 mCi/ml
3	40 Ci/mMol	41%	0,27 mCi/ml
4	40 Ci/mMol	39%	0,26 mCi/ml
5	15 Ci/mMol	52%	0,20 mCi/ml
6	15 Ci/mMol	48%	0,!8mCi/ml
7	18 Ci/mMol	40%	0,18mCi/ml
8	18 Ci/mMol	38%	0,17mCi/ml
9	225 mCi/mMol	20%	0,56 μα/ίτι!
10	225 mCi/mMol	31%	1,16 μα/ml
11	225 mCi/mMol	34%	1,28 μΟ/πιΙ
12	12 Ci/mMol	10%	0,05 mCi/ml
13	12 Ci/mMol	12%	0,07 mCi/ml
14	44 Ci/mMol	34%	0,19mCi/ml
15	44 Ci/mMol	39%	0,29 mCi/ml

Claims

Patentansprüche:

1. Radioaktiv markierte S'eroidderivate der allgemeinen Formel I

R^s

R¹

X-N

J
\

(D

R²

worin

-X-N

R¹

R²

sich bevorzugt in den Stellungen 6, 7, 11 oder 12
befindet, X R-\ — O—CO—R³, =N—O—R³
oder —NH-CO—R³, A die Gruppierung

R⁸—O

D—

Ε —D

—N

R¹

R²

den Tritium- oder ¹⁴C-markierten Rest eines Amins
oder einer Aminosäure, B—C die Gruppierung

oder

Z ein Sauerstoffatom, zwei Wasserstoffatome oder die Gruppierung H. OH, E—D eine Einfach- oder eine Doppelbindung, F-G die Gruppierung

-CH₂-CH₂- -CH=CH-
-CH₂-CH(CH₃)- -CH=C(CH₃)-
oder

-CH

CH-

CH₂

R³ die Gruppierung — (CH₂)„ — CO — und η eine ganze Zahl zwischen O und 4, R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R⁵ eine Methyloder Äthylgruppe, R⁶ ein Wasserstoff-, Fluor- oder Chloratom, R⁷ ein Wasserstoff-, Fluor- oder Chloratom oder eine Methylgruppe, R⁸ ein Wasserstcffatom oder eine Alkanoylgruppe mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen, R⁹ ein Wasserstoffatom, eine Methyl- oder eine Äthinylgruppe, R¹⁰ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder die Gruppierung — O—R⁸, R¹¹ ein Wasserstoff- oder ein Halogenatom oder die Gruppierung — O — R⁸, R¹² ein Wasserstoffatom oder die Gruppierung — O —R⁸, R⁹ und R¹⁰ oder R¹⁰ und R¹² gemeinsam die Gruppierung

-O

R¹

1-1

R^u, R¹⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bedeuten.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel II

R¹

worin

R¹

-X-N

die oben angegebene Bedeutung hat und sich bevor-

ugt in 6-, 7-, 11- oder 12-Stellung befindet. A' die 3ruppierung

R⁴

R⁸—O

R⁸—O-

und B'—C die Gruppierung

"(O

darstellt, in denen R⁴, R⁵, R⁸, R⁹ und R¹⁰ die oben ₄o angegebene Bedeutung haben.

3. Verbindungen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel 111

45

R²

—X—N

R¹

R²

5 S

to

in der oben angegebenen Bedeutung sich bevorzugt in der Stellung 6 oder 7 befindet, F'—G' eine Einfach- oder Doppelbindung darstellt und R⁴, R⁵, R^h, R¹⁰, R¹¹, R¹² und Z die oben angegebene Bedeutung haben.

4. Verbindungen nach Anspruch !,gekennzeichnet durch die allgemeine Formel IV

X-N

R¹

R²

(IV)

— X —N

R¹

R²

sich bevorzugt in 11- oder 12-Stellung befindet und ebenso wie R⁷, R⁸ und R¹⁰ die oben angegebene Bedeutung hat.

5. N - [(3,17/i - Dihydroxy -1,3,5(10) ·■ östratrien-6/i-yl)-acetyl]-L-tyrosin-[3,5-³H₂]

6. N - [(17a - Äthinyl - 3,17/ΐ - dihydroxy - 1,3. 5(10) - östratrien - 6ß - yl) - acetyl] - ι. - tyrosin-[3,5-³H₂].

7. N -[17α - Äthinyl - Π β - hydroxy - 3 - oxo-4 - östren - 11α - yloxy - succinyl] - L - tyrosin-[3,5-³H₂].

8. N-[17H-AcCtOXy-O-ChIOr- la,2«-methylen-3,20 - dioxo - 4,6 - pregnadien -\\<i- yloxy - succinyl] L-tyrosin-[3,5-³H₂].

9. N - [(3,17β - Dihydroxy -1,3,5( 10) - östratrien-6/i-yl)-aminosuccinyl]-L-phenylalanin-[2,3-³H₂].

10. N-[I- Methyl - 3 - oxo - 5a - androst -1 - en-17/i-yloxysuccinyl]-L-phenylalanin-[2,3-³H₂].

11. N - [(3 - Hydroxy -17 - oxo -1,3,5( 10) - östratrien-6/*-yl)-acetyl]-histamin-[2,5-³H₂].

12. N-[17u-Äthinyl-170-hydroxy-18-methyl· 3 - oxo - 4 - östren - 6ß - yloxysuccinyl] - histamin-[2,5-¹H₂].

13. N-[(3,16«, 17/i-Trihydroxy-1,3,5(10)-östratrien-6/i-yl)-acetyl]-prolin-[u-^uC].

14. N - [3,20 - Dioxo - 4 - pregnen - 6n - yloxysuccinyl]-prolin-[u-¹⁴C].

15. N-[3/i-Heptanoyloxy-17-oxo-5-androsten-7«-yloxysuccinyl]-prolin-[u-¹⁴C].

16. N - [(3,16a, 1Ίβ - Trihydroxy -1,3,5( 10) - östratrien -6^- ylj-aminosuccinyl]- L- leucin -[4,5 -³H₂].

17. N - [17<i - Äthinyl - 17/i - hydroxy - 3 - oxo-4-androsten-7a-yloxysuccinyl]-L-leucin-[3,5-^JH₂].

18. Diagnostikum, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 bis 17 als Reagens.

19. Verfahren zur Herstellung der Steroidderivate der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise

entsprechende Steroide der allgemeinen Forme! V oder einer Aminosäure, X eine der folgenden

Gruppen:

^R _R3 _o —CO-R\ =N —O —R¹ oder

— NH — CO — R³, A die Gruppierung

X-OH

(V)